セルラーゼの製造方法
【課題】
セルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を製造し、さらに得られた２糖類含有溶液を含む培地で糸状菌を培養することにより、セルラーゼを製造することを課題とする。
【解決手段】
（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
セルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を製造し、さらに得られた２糖類含有溶液を含む培地で糸状菌を培養することにより、セルラーゼを製造することを課題とする。
【解決手段】
（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２糖類含有溶液を製造する工程を含むセルラーゼの製造方法に関する。詳しくは、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加後、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程を含み、製造した２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌にセルラーゼを製造する工程に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマなどの糸状菌は、培養液中に数十種類の分解機構の異なるセルラーゼ成分を大量に分泌生産する微生物である。またトリコデルマ属細菌の産生するセルラーゼ成分は、特にリグノセルロースなどの結晶性の高いセルロース加水分解に有効であることが知られている。したがって、近年のセルロースから培養原料である糖を得る工程、すなわち糖化工程において、このトリコデルマ属細菌のセルラーゼが頻繁に使用されている。
【０００３】
セルラーゼの生産は、トリコデルマなどの糸状菌を固体及び液体培養することにより行われている。セルラーゼを糸状菌によって効率的に製造するためには、セルラーゼ生産を誘導する適切な誘導物質を含む培地に糸状菌を培養する必要がある。こうしたセルラーゼ誘導物質としては、セルロース（固体）、ラクトース、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース、ソルボースなどが知られている。
【０００４】
セルロースは、安価な炭素源であり、かつセルラーゼ誘導物質でもあるが、固体であるため直接的なセルラーゼ誘導物質としては作用しない。したがって、セルロースによる糸状菌セルラーゼの誘導には高濃度のセルロースを含む培地を使用する必要があった。
【０００５】
ソルボースは、２糖類より安価な単糖であり、かつセルラーゼ誘導物質であるが、ソルボース単体では誘導効果が低く、ラクトースやセルロースとともに添加する必要があった（非特許文献１）。したがって、糸状菌は高濃度のセルロースやラクトースを含む培地で培養する必要があった。
【０００６】
ラクトースは、比較的安価な水溶性の２糖類であるが、セルラーゼ誘導効果が低いため、高濃度で含む培地を使用する必要があった（非特許文献１）。また、同じ２糖類であるソホロースおよびゲンチオビオースは、セルロースあるいはラクトースより強力なセルラーゼ誘導物質であり、少量でセルラーゼ誘導効果を得ることができることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、ソホロースおよびゲンチオビオースは、非常に高価であるため、工業的なセルラーゼ製造には使用できないといった課題があった。
【０００７】
ソホロースなどのセルラーゼ誘導効果の高い２糖類を得る方法として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の生産するβ−グルコシダーゼを使用し、グルコースの縮合反応による製造する方法が開示されており、トリコデルマ属のセルラーゼ製造に使用できることが開示されている（特許文献１）。しかし、アスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼは、酵素活性が低く、熱安定性も低いため、縮合反応では、酵素活性を増強するためにβ−グルコシダーゼの使用量が多いといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−２１１８８３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｙ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４４，１０６−１１１．１９９５参照
【非特許文献２】Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｔ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，３７５−３８５．１９７１参照
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、従来の方法よりも酵素使用量を削減し、かつ効率よくセルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を製造し、得られた２糖類含有溶液を含む培地で糸状菌を培養することにより、セルラーゼを効率よく製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の［１］〜［１０］で構成される。
【００１２】
［１］セルラーゼの製造方法であって、（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【００１３】
［２］好熱性菌由来β−グルコシダーゼが好熱性菌由来組換えβ−グルコシダーゼであることを特徴とする、［１］記載のセルラーゼの製造方法。
【００１４】
［３］好熱性菌由来β−グルコシダーゼがパイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）またはサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）由来であることを特徴とする、［１］または［２］記載のセルラーゼの製造方法。
【００１５】
［４］好熱性菌由来β−グルコシダーゼが配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１６】
［５］前記（１）工程が、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で添加し、４０〜１２０℃で保温することによる縮合反応であることを特徴とする、［１］から［４］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１７】
［６］さらに（３）前記（１）工程で得られた２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する工程を含む、［１］から［５］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１８】
［７］前記（３）工程が２糖類含有溶液から限外濾過膜により好熱性菌由来β−グルコシダーゼを回収する工程である、［６］に記載のセルラーゼの製造方法。
【００１９】
［８］回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼを、前記（１）工程に再利用することを特徴とする、［６］または［７］に記載のセルラーゼの製造方法。
【００２０】
［９］糸状菌がトリコデルマ・リーセイであることを特徴とする、［１］から［８］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００２１】
［１０］前記（２）工程が糸状菌を連続培養する工程である、［１］から［９］いずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来技術に比べて少ない酵素量で高いセルラーゼ誘導効果を有する２糖類含有溶液を効率的に製造することが可能となる。また製造した２糖類含有溶液を含む培地に糸状菌を培養することで高いセルラーゼ誘導効果を得ることが可能である。以上の効果により、糸状菌を使用したセルラーゼ製造コストを低減させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、好熱性菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子を挿入する位置と、挿入するｐＥＴ３０ａベクターのマップである。
【図２】図２は、本発明で用いられる膜分離型の連続培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
セルロースとは、グルコースがβ-１、４結合した糖ポリマーを含むものを指す。すなわち本発明におけるセルロースとは、セルロース純度の高いアビセル、αセルロース、パルプなどから、セルロース含有バイオマス、すなわち、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、などの草本系バイオマス、また樹木などの木質系バイオマスなどを含む。特に後者のセルロース含有バイオマスにおいては、セルロースに加え、ヘミセルロース、リグニンなども含んでなる。
【００２５】
セルラーゼとは、前記セルロースあるいはセルロース含有バイオマスの分解に触媒する酵素群の総称である。すなわち、本発明のセルラーゼとは、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ガラクターゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどの酵素、あるいはこれら酵素の混合物を指す。
【００２６】
そして本発明は、後述する糸状菌が産生するセルラーゼを製造することを目的としている。なお、糸状菌由来のセルラーゼを製造する場合、糸状菌培養液に産生されるセルラーゼを回収することで達成されるが、一般的に糸状菌培養液にはセルラーゼと併せてセルラーゼとは異なる複数種の酵素も培養液中に産生されるため、本発明の製造対象物はセルラーゼを主成分とする酵素混合物であってもよい。セルラーゼを主成分とする酵素混合物に含まれる酵素種としては、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼを含んでなる。
【００２７】
以下、本発明の詳細について工程順に説明する。
【００２８】
本発明は、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程を含むことを特徴としている。ここでいうグルコース含有溶液とは、グルコースを主成分とする溶液のことであり、グルコース以外の単糖、２糖類、オリゴ糖類などを含んでいてもよい。したがって、本発明で使用するグルコース含有溶液は、純度の高いグルコース試薬を使用してもよいし、糖蜜、廃糖蜜、セルロース糖化液などグルコース以外の成分を含んでなる糖液を原料として使用してもよい。
【００２９】
本発明で使用するグルコース含有溶液に含まれるグルコース濃度は、１００〜９００ｇ／ｌの濃度で含まれていることが好ましく、より好ましくは、４００〜８００ｇ／ｌである。本発明のグルコース含有溶液は、グルコースを５０〜８５℃に加温しながら水溶液に溶解することにより調整することができる。
【００３０】
本発明で使用するグルコース含有溶液のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ３．０〜８．０の範囲であることが好ましく、より好ましくは、ｐＨ４．５〜５．５の範囲である。こうしたｐＨ範囲にあるグルコース含有溶液調製には、酸またはアルカリを使用することができるが、緩衝液を使用することが好ましい。使用する緩衝液は、前記ｐＨ範囲に調製可能な溶液であれば限定されないが、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示できる。
【００３１】
本発明では、前記グルコース含有溶液に含まれるグルコースを好熱性菌由来β−グルコシダーゼにより縮合して、２糖類含有溶液を製造することを特徴としている。
【００３２】
β−グルコシダーゼによる縮合反応とは、β−グルコシダーゼの触媒作用により、グルコースの縮合反応により種々の２糖類を合成する反応を指す。すなわち、本発明の縮合反応では、少なくとも、グルコースから、２糖類であるセロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、ソホロースを合成する反応を指す。βーグルコシダーゼの縮合活性は、８００ｇ／ｌの試薬グルコースのみを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、反応溶液と等量の適当に希釈した酵素液を加え５０℃、２０時間反応させたときに生成する２糖類総量から下記（式１）にてβ−グルコシダーゼ縮合活性を算出することでその活性を定義することができる。
【００３３】
（式１）（２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する酵素量）＝０．０００１５／１ｍｇ・ｍｌ−１の２糖類を生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００３４】
また好熱性菌とは、５０℃以上で生育可能な微生物群の総称であり、本発明においては８０℃以上で生育する微生物であることが好ましい。該好熱性菌としては、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、スルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、などを例示することができる。
【００３５】
カルディビルグラ属の微生物としては、カルディビルグラ・マキリンジェンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ）が例示され、高温酸性温泉、火山の硫気噴気口などから単離することができる。
【００３６】
サーモスファエラ属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、サーモスファエラ・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３７】
スルホロバス属に属する微生物としては、好熱好酸菌の１種であり、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離されている微生物であり、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ） 、スルフォロバス・トウコウダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ）、スルフォロバス・メタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ）、スルフォロバス・シバタ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ ）が例示され、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離される。
【００３８】
サーモプラズマ属に属する微生物としては、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が例示され、温泉、ボタ山、その他硫黄環境から単離される。
【００３９】
フェルビドバクテリウム属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、フェルビドバクテリウム・ノドサム（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００４０】
バシラス属に属する微生物としては、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が例示され、温泉、深海底水孔周辺から単離される。
【００４１】
クロストリジウム属に属する微生物としては、クロストリジウム・スポロジェネス (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ)、クロストリジウム・サーモセラム (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ)が例示され、温泉から単離される。
【００４２】
サーマス属に属する微生物としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が例示され、温泉、噴気孔から単離される。
【００４３】
ピクロフィラス属に属する微生物としては、ピクロフィラス・オシマエ（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｏｓｈｉｍａｅ）、ピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ）が例示され、噴気孔から単離される。
【００４４】
パイロコッカス属の微生物としては、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、パイロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・ホエイセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｓｅｉ）が例示され、深海の熱水噴出孔、油田などから単離される。
【００４５】
本発明では縮合反応に使用するβ−グルコシダーゼの使用量を減らして、高いセルラーゼ誘導効果を有する２糖類含有溶液を製造するため、上記に例示されるような好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼが用いられる。また、本発明においては好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼであれば特に制限はないが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく用いられる。また、本発明において好ましく用いられるパイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来のβ−グルコシダーゼは特に限定されないが、好ましい具体例として、パイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ（配列番号２）またはサーモプラズマ・ボルカニウム由来のβ−グルコシダーゼ（配列番号４）が挙げられる。なお本発明においては、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を有する範囲であれば、該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたものであっても好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼとして使用することができ、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するものが使用される。なお、アミノ酸配列同一性についてはＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて判定することができる。
【００４６】
本発明で使用される好熱性菌由来β−グルコシダーゼは特に制限されず、前記好熱性菌を培養し、好熱性菌培養液あるいは好熱性菌体内に産生するβ−グルコシダーゼを単離、回収、精製して得られたものであっても、異種宿主を使用して生産した組換えβ−グルコシダーゼであってもよいが、組換えβ−グルコシダーゼが好ましく使用される。また、本発明で使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼは、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ縮合活性を有する範囲であれば、β−グルコシダーゼを主成分とするタンパク質混合物であってもよい。
【００４７】
本発明で好ましく使用される好熱性菌由来の組換えβ−グルコシダーゼは、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を、適切な発現プロモーターの下流に連結し、また適切な発現ベクターに組み込み、異種宿主に対して遺伝子組換えを行い、得られた異種宿主を培養することで組換えβ−グルコシダーゼを得ることができる。好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼを生産するための異種宿主としては、特に限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｆｕｍｉｃｏｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を例示することができ、中でも大腸菌、トリコデルマ属、アスペルギルス属、バシラス属が好ましく用いられる。
【００４８】
本発明の２糖類含有溶液製造工程における好熱性菌由来β−グルコシダーゼ濃度は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲で添加することが好ましい。ここで使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼは、一般的に酵素が変性あるいは失活していない状態のもののことを指す。β−グルコシダーゼの濃度が、上記濃度範囲未満であると、縮合反応の効率が低くなる場合があり、また、上記濃度範囲を超えても縮合反応の効率は向上しない。
【００４９】
縮合反応の温度条件は、４０〜１２０℃の温度範囲で行うことが好ましい。４０℃未満であると、縮合反応効率が低下する場合があり、一方、１２０℃を超える温度であると、β−グルコシダーゼの活性が低下するため反応効率が低下する場合がある。
【００５０】
縮合反応で使用される好熱性菌由来β−グルコシダーゼ縮合活性は、前記（式１）の活性測定方法で測定した場合、β−グルコシダーゼ濃度１ｍｇ／ｍｌで、０．５〜１２．５Ｕ／ｍｌのβ−グルコシダーゼ縮合活性を有することが好ましい。すなわち、好熱性菌由来β−グルコシダーゼ濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でのβ−グルコシダーゼ縮合活性は、０．０５〜２５０Ｕ／ｍｌであることが好ましい。好熱性菌由来β−グルコシダーゼの縮合活性が左記の数値範囲より外れてしまうと、十分な縮合反応が見られない場合がある。
【００５１】
縮合反応の反応時間は、使用するβ−グルコシダーゼ濃度、またはグルコース含有溶液のグルコース濃度等によって最適な反応時間は変化するため特に限定されるものではないが、操作性の観点から、３０分から４８時間の範囲で設定されることが好ましく、さらに好ましくは、２時間から２４時間の範囲である。
【００５２】
縮合反応を行う反応装置は特に限定されないが、グルコース含有溶液を一定温度に保温でき、またグルコース含有溶液を攪拌する装置を備えたものであることが好ましい。
【００５３】
上記工程により得られる２糖類含有溶液とは、少なくともその成分として、セルラーゼ生産を誘導する２糖類を含んでなる水溶液であり、２糖類含有溶液に含まれる２糖類としては、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、セロビオースなどを例示することができる。こうした２糖類の内、ソホロースまたはゲンチオビオースを多く含んでいることが好ましい。また、こうした２糖類の組成は特に限定されないが、好ましくは２種以上の２糖類を含んでなる水溶液であり、さらに好ましくは、ソホロース、ゲンチオビオースの２種を含んでいることが好ましい。
【００５４】
前記２糖類含有溶液はβ−グルコシダーゼを含んでいる。次のセルラーゼ製造工程に使用する際にはβ−グルコシダーゼを含んだままであってもよいが、好熱性菌由来β−グルコシダーゼが除去されていることが好ましい。なお、本発明においては好熱性菌由来β−グルコシダーゼを失活させる場合もβ−グルコシダーゼが除去されたと見なす。２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する方法については特に限定はないが、本発明においては限外濾過膜を使用する方法が好ましく用いられる。
【００５５】
２糖類含有溶液から限外濾過膜を使用してβ−グルコシダーゼを除去するとは、２糖類含有溶液を、限外濾過膜に通じて濾過し、好熱性菌由来β−グルコシダーゼを限外濾過膜で阻止分離し、膜側画分として好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去し、限外濾過膜の透過液として、好熱性菌由来β−グルコシダーゼが除去された２糖類含有溶液を得ることを意味する。
【００５６】
限外濾過膜とは、本発明で使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼを阻止できる分画分子量を有していれば特に制限はないが、好熱性菌由来β−グルコシダーゼの分子量の観点から分画分子量が５０００〜３００００の範囲にあるものが好ましく使用できる。また、本発明における限外濾過膜の構造としては、中空糸膜、平膜、スパイラル膜、チューブラー膜を使用することができるが、これらの構造に限定されない。また、本発明における限外濾過膜の膜素材は、酢酸セルロース系ポリマー、芳香族ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、耐久性・対汚性の観点で、ポリエーテルスルホンであることが好ましい。
【００５７】
限外濾過膜の濾過方法としては、遠心濾過法、加圧濾過法、減圧濾過法を使用することができ、２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを阻止分離できれば特に制限はない。
【００５８】
２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する際に限外濾過膜を使用する利点として、限外濾過膜で除去した好熱性菌由来β−グルコシダーゼをグルコース含有溶液に添加して縮合反応に再利用できることが挙げられる。このような回収再利用の回数は特に限定されず、経済的に好ましい範囲でその回数を設定することができる。また再利用時において、回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼの活性が充分でない場合、その不足分の好熱性菌由来β−グルコシダーゼを新たに添加し、縮合反応を行ってもよい。
【００５９】
次に、２糖類含有溶液を用いて糸状菌のセルラーゼを製造する工程について説明する。本発明で使用する糸状菌とは、鞭毛菌類、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類、不完全菌のすべてを含み、特に、菌体が糸状を呈し、分生子と呼ばれる無性胞子を形成して増殖する糸状菌を指す。具体的には、モナスカス属(Ｇｅｎｕｓ Ｍｏｎａｓｃｕｓ)、ペニシリウム属(Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)、セファロスポリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクレモニウム属(Ｇｅｎｕｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)、ムコール属(Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒ)、リゾプス属(Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、フザリウム属(Ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ)、エメリセラ属(Ｇｅｎｕｓ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ) トリコデルマ属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クラビセプス属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、フミコラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、カワラタケ属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、オオウズラタケ（Ｇｅｎｕｓ Ｆｏｍｉｔｏｐｕｓｉｓ）、ファネロカエテ属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）に属する微生物を例示することができる。ペリコニア属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ）、ニグロスポラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）に属する糸状菌が好ましい例として挙げられる。
【００６０】
また本発明で用いられる糸状菌のより好ましい例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ファネロカエテ・ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロカエテ・クリソスポディウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｄｉｕｍ）、さらに好ましい例としてトリコデルマ・リーセイが挙げられる。
【００６１】
さらにトリコデルマ・リーセイにおいては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＰＣ３−７）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）が例示される。
【００６２】
なお、前記糸状菌に対し、突然変異処理、または遺伝子組換えなどの操作により生物機能を改変または向上させた糸状菌を使用することもできる。
【００６３】
本発明では、前記２糖類含有溶液を糸状菌の培地に添加することで、セルラーゼの製造を行う。糸状菌の培養に使用する培地成分は、セルラーゼ誘導物質として前記２糖類含有溶液に含まれる２糖類の他に、糸状菌の生育およびセルラーゼの産生に必要な炭素源、窒素源、無機塩、金属塩、ビタミン、などの成分を含んでいれば限定されるものではない。また必要であれば消泡剤、界面活性剤などを含んでいてもよい。また、セルラーゼ誘導物質の供給源としては、前記２糖類含有溶液だけでなく、別途セルラーゼ誘導物質を用意し、これを併用してもよい。また、特に炭素源としてグルコースを使用する場合、前記２糖類含有溶液中に含まれるグルコースであってもよいし、あるいは別途グルコースを用意し、これを培地に添加してもよいが、糸状菌培地に含まれるグルコース濃度が高すぎると糸状菌によるセルラーゼ生産性の低下を招く可能性があるため、糸状菌培地に含まれるグルコース濃度を１０ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましい。なお糸状菌の中でも、本発明において好ましく用いられる例のひとつであるトリコデルマ・リーセイの培養に使用する培地としては、Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９、７３９−７４３、１９８７年（Ｔｕｒｋｅｒら）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．６４、５８８−５９７、１９８６年（Ｍｃｌｅａｎら）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２８、４１−５０、１９８６年（Ｗｅｂｂら）に開示してある培地を使用することができる。
【００６４】
２糖類含有溶液を糸状菌培地に対してあらかじめ添加しておく、あるいは糸状菌培養期間中に糸状菌培養液に添加することで糸状菌のセルラーゼ生産を誘導・促進することができる。糸状菌培地または培養液に対する２糖類含有溶液の添加量は、所望のセルラーゼ誘導効果が得られれば特に限定されないが、糸状菌培地または培養液に含まれる２糖類含量が０．００１〜１ｇ／Ｌの範囲となるように２糖類含有溶液を添加することで、セルラーゼの生産性を高めることができるため好ましい。なお２糖類含有溶液は、糸状菌培地または培養液に添加する前に滅菌操作を施しておくことが好ましい。滅菌操作としては、特に限定されないが、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌などを使用することができる。
【００６５】
糸状菌はこうした培地に植菌し、所定時間保温することで、培養することができる。糸状菌は、胞子または分生子の状態で培地に植菌してもよく、また菌糸または菌体の状態で植菌してもよい。また保温する温度は、使用する糸状菌の生育に適した温度を設定すれば良く、特にトリコデルマ属を使用する場合は、２５℃〜３０℃の範囲で設定すればよい。また培養する日数は、目的とするセルラーゼ生産が十分に行える日数であれば、特に限定されない。
【００６６】
また、糸状菌の培養方法として、バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養などがあり特に限定されるものではないが、生産性の観点から連続培養であることが好ましい。糸状菌の連続培養方法としては、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養方法が好ましく例示される。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
（参考例１） ２糖類含有溶液中の２糖類総量の測定
以下参考例１として２糖類含有溶液中の２糖類総量の測定方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の測定条件により高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。
【００６９】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、移動相：０．５ｍｏｌ／ｌLほう酸カリウム緩衝液 ｐH８．７（流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ）、反応液：１ｗ／ｖ％アルギニン、３ｗ/vほう酸（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、検出方法：蛍光（Ｅｘ．３２０ｍｍ、Ｅｍ．４３０ｍｍ）、温度：１５０℃。
【００７０】
（参考例２） ２糖類含有溶液中のグルコース濃度の測定
以下参考例２として２糖類含有溶液中のグルコース濃度の測定方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の測定条件により高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。
【００７１】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、移動相：０．５ｍｏｌ／ｌほう酸カリウム緩衝液 ｐH７．７（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、反応液：１ｗ／ｖ％アルギニン、３ｗ/vほう酸（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、検出方法：蛍光（Ｅｘ．３２０ｍｍ、Ｅｍ．４３０ｍｍ）、温度：１５０℃。
【００７２】
（参考例３） β−グルコシダーゼ縮合活性の測定
１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐH５．０）、８００ｇ／ｌの試薬グルコースのみから成る反応液に１ｍｌの適当に希釈した酵素液を加え５０℃、２０時間反応させた後、沸水中で酵素反応を停止し、氷水中で急冷した。次に参考例１記載の方法で２糖類を定性・定量した。さらに、得られた２糖類生成量をもとに、２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する量をβ−グルコシダーゼ縮合活性１単位（１Ｕ、ユニット）と定義し、次の（式１）に従ってβ−グルコシダーゼの縮合活性を測定した。
【００７３】
（式１）（２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する酵素量）＝０．０００１５／１ｍｇ・ｍｌ−１の２糖類を生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００７４】
（参考例４） セルラーゼ活性の測定
本発明でセルラーゼの生産性を評価する指標となる、セルラーゼ活性（Ｕ、ユニット）は次の方法で測定した。１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐH５．０）、５０ｍｇのワットマンＮｏ．１ろ紙から成る反応液に０．５ｍｌの適当に希釈した糸状菌の培養液を加え５０℃、６０分間反応させた後、３ｍｌのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、２０ｍｌの脱イオン水を加え５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を算出した。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。セルラーゼ活性１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量により定義し、次の（式２）によって計算した。
【００７５】
（式２）セルラーゼ活性（１Ｕ）＝０．３７／２．０ｍｇのグルコースを生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００７６】
（参考例５） トリコデルマ・リーセイの培養
以下参考例５としてトリコデルマ・リーセイの培養方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の培養方法により培養を実施した。
【００７７】
供試菌として、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ Ｃ−３０）株（ＡＴＣＣ５６７６５）を使用した。まず供試菌をポテトデキストロース寒天斜面培地上で２５℃、７日間培養した。寒天培地表面に生育した胞子を０．８５％生理食塩水３ｍｌに懸濁し、ｍｉｒａｃｌｏｔｈ(コスモ・バイオ社製)でろ過することにより胞子を回収した。回収した胞子を表１の培地１００ｍｌが入った三角フラスコに１０μｌ植菌し、２８℃で所定期間トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０を培養した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
（参考例６） ２糖類生成効率の算出
酵素添加量当たりの２糖類の生成効率を下記（式３）にて算出した。
（式３）２糖類生成効率＝縮合反応によって生成する２糖類総量（ｇ／ｌ）／縮合反応に添加したβ−グルコシダーゼ濃度（ｇ／ｌ）。
【００８１】
（比較例１）アスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼを使用した縮合反応による２糖類含有溶液の製造
以下比較例として、常温菌であるアスペルギルス・ニガー由来のβ−グルコシダーゼ（ＡｎＢＧＬ）を用いて２糖類含有溶液を製造した。反応条件は、特開平５−２１１８８３号公報の実施例記載方法に準じて、以下の条件で実施した。
【００８２】
グルコース含有溶液は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。ＡｎＢＧＬはノボザイム１８８（シグマ社製）を使用し、脱塩カラムにより精製した。８０％グルコース含有溶液に、ＡｎＢＧＬを最終濃度２４ｇ／ｌとなるように添加し、５０℃で２０時間反応を行って２糖類含有溶液を製造した。２糖類総量と２糖類生成効率を表３に示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
（比較例２）２糖類含有溶液（比較例１）を使用したセルラーゼの製造
比較例１で得られた２糖類含有溶液を使用して、セルラーゼの生産が可能か検討した。比較例１で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定し、その結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
（実施例１）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）の調製
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、パイロコッカス属に属するパイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を選定した。
【００８７】
ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーＡＥ０１０１６７で登録されているパイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子として、配列番号１記載の配列の５’末端にＮｃｏＩ、３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を付加したＤＮＡ配列を全合成した。全合成した遺伝子は、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３０ａのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結した（図１）。連結したベクターは、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、カナマイシンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて選抜し、形質転換されたＪＭ１０９株より作成したベクターｐＥＴ−ＰｆＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析により連結された遺伝子配列を確認した。ｐＥＴ−ＰｆＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株をカナマイシン含有ＬＢ培地１０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、カナマイシン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液は、金属キレートレジンを用い精製を行った。精製した無細胞抽出液を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に透析した。透析の結果得られたタンパク質溶液は、９５〜９８％の精製純度を示しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドが確認できた。このタンパク質溶液を、パイロコッカス・フリオサス由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）として使用した。
【００８８】
前記操作で得られたＰｆＢＧＬのβ−グルコシダーゼ縮合活性は、０．１ｍｇ／ｍｌで１Ｕであった。
【００８９】
（実施例２）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造
実施例１で得られたパイロコッカス・フリオサス由来β−グルコシダーゼを使用して２糖類含有溶液を製造した。
【００９０】
グルコース含有溶液（１０ｍｌ）は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。得られたグルコース含有溶液に、ＰｆＢＧＬを０．０１ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌとなるように添加した。ＰｆＢＧＬを添加したグルコース含有溶液は、２０℃、４０℃、６０℃、８０℃、１００℃、１２０℃の各温度で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、反応生成物を限外濾過膜（日本ミリポア社ポリエーテルスルホン製、１０ｋＤａ）を使用して遠心分離し、ＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として除去し、９．７ｍｌの透過液を得た。
【００９１】
次に限外濾過膜の透過液として得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表５の通りであり、縮合反応温度の範囲としては４０℃以上が好ましいことが示された。一方、１２０℃であっても十分量の２糖類を含む２糖類含有溶液を製造できることが確認できた。また、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度は、０．１ｇ／ｌ以上が好ましく、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度が２０ｇ／ｌを超えると２糖類含有溶液中の２糖類が減少することが確認できた。すなわち、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度は、０．１〜２０ｇ／ｌの範囲で添加することで、効率的な２糖類含有溶液の製造ができることが示された。
【００９２】
【表５】
【００９３】
また、反応温度４０〜１２０℃、ＰｆＢＧＬ添加量０．１〜２０ｇ／ｌの反応条件におけるＰｆＢＧＬの２糖類生成効率は表６の通りであり、好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、ＰｆＢＧＬを縮合反応に使用した場合では、比較例１（表３）と比べて、極めて高い２糖類生成効率を得られることが判明した。
【００９４】
【表６】
【００９５】
（実施例３）２糖類含有溶液（実施例２）を使用したセルラーゼの製造１
実施例２において、反応温度８０℃、ＰｆＢＧＬ濃度１ｇ／ｌの条件で得られた２糖類含有溶液を使用したセルラーゼの製造を実施した。
【００９６】
実施例２で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌを使用して、トリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表７の通りであり、実施例２で得られた２糖類含有溶液を使用することで、大量のセルラーゼを製造することができることが示された。また、比較例１のアスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼよりも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用することで、少ない酵素量で高いセルラーゼ生産性を得ることが可能であることが示された。
【００９７】
【表７】
【００９８】
（実施例４）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造２
縮合反応の条件は、実施例２と同様の方法で実施したが、限外濾過膜によるＰｆＢＧＬの除去は行わず、以下の手順で実施した。
【００９９】
グルコース含有溶液は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。得られたグルコース含有溶液に、ＰｆＢＧＬを０．０１ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌとなるように添加した。ＰｆＢＧＬを添加したグルコース含有溶液は、２０℃、４０℃、６０℃、８０℃、１００℃、１２０℃の各温度で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、２糖類含有溶液として使用した。
【０１００】
得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果を表８に示す。限外濾過膜によりＰｆＢＧＬ除去しない場合では、２糖類総量に大きな差があることが示され、ＰｆＢＧＬを除去せずにしておくと、２糖類含有溶液中の２糖類総量が大きく減少することが確認された。すなわち、縮合反応終了後に、使用した好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去することが好ましいことが示された。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
また実施例２と同様に、２糖類生成効率を算出した結果は表９に示す通りであり、実施例２の結果（表６）と比べると２糖類生成効率が低いものの、比較例１の２糖類生成効率よりは高く、ここでも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用した方が効率的に２糖類含有溶液を製造できることが示された。
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
（実施例５） 好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）の縮合反応への再利用
前記実施例２〜４の結果により、２糖類含有溶液よりＰｆＢＧＬを限外濾過膜で除去する方がより多くの２糖類を製造することができ、またセルラーゼ誘導効果も高いことが確認できた。そこで、この限外濾過膜で除去、回収されたＰｆＢＧＬを再度、縮合反応に再利用できないか以下手順で検討を行った。
【０１０５】
８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）に最終濃度が１ｇ／ｌになるようにＰｆＢＧＬを添加し、８０℃で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、反応生成物１０ｍｌを限外濾過膜で遠心分離し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液１として、膜画分０．２ｍｌをＰｆＢＧＬとして回収した。回収したＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを、８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）を用いた縮合反応に再度使用し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液２として、膜画分０．２ｍｌをＰｆＢＧＬとして回収した。再回収したＰｆＢＧＬ０．２ｍｌは８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）に添加後縮合反応に使用し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液３として、ＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として回収した。２糖類含有溶液１〜３を参考例１の方法で測定した結果は表１０の通りであり、限外濾過膜で回収（除去）したＰｆＢＧＬを、縮合反応に再利用できることが確認できた。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
さらに、２糖類含有溶液１〜３を使用してセルラーゼ製造を検討した。前記２糖類含有溶液１〜３を０．２ｍｌ含む表１の培地１００ｍｌ培地に、トリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表１１の通りであり、ＰｆＢＧＬの再利用によって得られた２糖類含有溶液２または３を使用してもセルラーゼの効率的な製造が可能であることが示された。
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
（実施例６）好熱性菌由来β−グルコシダーゼの調製２
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、サーモプラズマ・ボルカニウム由来のβ−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を選定した。
【０１１０】
ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーＢＡ００００１１で登録されているサーモプラズマ・ボルカニウム由来β−グルコシダーゼ遺伝子として、配列番号３記載の配列の５’末端にＮｃｏＩ、３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を付加したＤＮＡ配列を全合成した。全合成した遺伝子は、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３０ａのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結した。連結したベクターは、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、カナマイシンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて選抜し、形質転換されたＪＭ１０９株より作成したベクターｐＥＴ−ＴｖＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析により連結された遺伝子配列を確認した。ｐＥＴ−ＴｖＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬＰ株を作製した。ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株をカナマイシン含有ＬＢ培地１０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、カナマイシン含有ＬＢ培地１ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液は、金属キレートレジンを用い精製を行った。精製した無細胞抽出液を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に透析した。透析の結果得られたタンパク質溶液は、９５〜９８％の精製純度を示しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドが確認できた。このタンパク質溶液を、サーモプラズマ属由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）として使用した。
【０１１１】
前記操作で得られたＴｖＢＧＬのβ−グルコシダーゼ活性は、０．１ｍｇ／ｍｌで０．７Ｕであった。
【０１１２】
（実施例７）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、実施例６で得られたサーモプラズマ・ボルカニウム由来β−グルコシダーゼを使用し、実施例２と同様に２糖類含有溶液を製造した。限外濾過膜により、ＴｖＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として除去し、９．７ｍｌの透過液を得た。
【０１１３】
次に限外濾過膜の透過液として得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表１２に示す通りであり、縮合反応温度の範囲としては４０℃以上が好ましいことが示された。一方、１２０℃であっても十分量の２糖類を含む２糖類含有溶液を製造できることが示された。また、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度は、０．１ｇ／ｌ以上が好ましく、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度が２０ｇ／Ｌを超えると、２糖類含有溶液中の２糖類が減少することが確認示された。すなわち、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度は、０．１〜２０ｇ／ｌの範囲で添加することで、効率的な２糖類含有溶液の製造ができることが示された。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
また、反応温度４０〜１２０℃、ＴｖＢＧＬ添加量０．１〜２０ｇ／ｌの反応条件におけるＴｖＢＧＬの２糖類生成効率は表１３の通りであり、好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、ＴｖＢＧＬを縮合反応に使用した場合では、比較例１（表３）と比べて、極めて高い２糖類生成効率を得られることが示された。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
（実施例８）２糖類含有溶液（実施例７）を使用したセルラーゼの製造１
実施例７において、反応温度８０℃、ＴｖＢＧＬ濃度１ｇ／ｌの条件で得られた２糖類含有溶液を使用したセルラーゼの製造を実施した。
【０１１８】
実施例７で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定し、その結果は表１４の通りであり、実施例７で得られた２糖類含有溶液を使用することで、大量のセルラーゼを製造することができることが判明した。また、比較例１のアスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼよりも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用することで、少ない酵素量で高いセルラーゼ生産性を得ることが可能であることが示された。
【０１１９】
【表１４】
【０１２０】
（実施例９）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造２
縮合反応の条件は、実施例８と同様の方法で実施したが、限外濾過膜によるＴｖＢＧＬの除去は行わず、実施例４と同様の手順で実施した。得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表１５の通りであり、実施例４の結果と同様に、縮合反応終了後に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去することが好ましいことが示された。
【０１２１】
【表１５】
【０１２２】
次に実施例７と同様に、２糖類生成効率を算出した結果は表１６の通りであり、実施例７の結果（表１３）と比べると、２糖類生成効率が低いことが確認された。しかしながら、比較例１の２糖類生成効率よりは高く、ここでも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用した方が、効率的に２糖類含有溶液を製造できることが確認された。
【０１２３】
【表１６】
【０１２４】
（実施例１０） 好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）の縮合反応への再利用
実施例５と同様に限外濾過膜で除去、回収されたＴｖＢＧＬを再度、縮合反応に再利用できないか検討を行った。限外濾過膜で回収されたＴｖＢＧＬ０．２ｍｌ全量を再利用に使用し、透過液（２糖類含有溶液１〜３）９．７ｍｌを得た。２糖類含有溶液１〜３を参考例１の方法で測定した結果は表１７の通りであり、限外濾過膜で回収（除去）したＴｖＢＧＬを、縮合反応に再利用できることが確認できた。
【０１２５】
【表１７】
【０１２６】
さらに、２糖類含有溶液１〜３を使用してセルラーゼ製造を検討した。２糖類含有溶液１〜３を０．２ｍｌ含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表１８の通りであり、ＴｖＢＧＬの再利用によって得られた２糖類含有溶液２または３を使用してもセルラーゼの効率的な製造が可能であることが示された。
【０１２７】
【表１８】
【０１２８】
（実施例１１）連続培養によるセルラーゼの製造
本発明のセルラーゼの製造方法における連続培養での実施例として、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養装置を使用した実施例を以下に示す。
【０１２９】
連続培養装置としては、特開２００９−３９０７４号公報に記載の装置（図２）を使用した。セルラーゼの分泌生産能力を有する糸状菌として前記実施例と同様のトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ Ｃ−３０株を用いた。
【０１３０】
培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、特開２００９−３９０７４号公報に記載のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。該多孔性膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
培養反応槽容量：１．０（ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：２８（℃）
・培養反応槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・膜分離槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１３１】
まず、ポテトデキストロース寒天培地で固体静地培養したＲｕｔ Ｃ−３０株の胞子を、試験管で表１に示す１００ｍｌの培地で３日間（２８℃）振とう培養した（前培養）。前培養液を、図２に示す連続培養装置の１．０Ｌの培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整と温度調整を行い、７２時間培養を行った。
【０１３２】
前培養完了後、実施例３で使用した２糖類含有溶液を５００倍になるように希釈し、希釈した２糖類含有溶液を含む表１の培地を作成した。この培地を連続供給し、培養液循環ポンプ１１によって培養反応槽１と膜分離槽１２の間を培養液の循環を行い、連続培養装置の培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続培養による生産されたセルラーゼの製造を行った。連続培養試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、培養反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、濾液中の生産されたセルラーゼの生産量を測定した。濾液はすべて回収し、この濾液中に含まれるセルラーゼ活性を表１９に示した。１４４時間の培養試験を行った結果、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養装置を用いることにより、セルラーゼの連続培養による製造が可能であることを確認することができた。
【０１３３】
（実施例１２）バッチ培養によるセルラーゼの製造
糸状菌を用いた培養形態として最も典型的なバッチ培養を２リットル容のジャーファーメンターを用いて行い、セルラーゼの生産性を評価した。培地には表１に示す増殖培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。運転条件は、次の通りである。
・培養反応槽容量（培養液量）：１．０（ｌ）
・温度調整：２８（℃）
・培養反応槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整。
【０１３４】
まず、ポテトデキストロース寒天培地で固体静地培養したＲｕｔ Ｃ−３０株の胞子を、試験管で表１に示す１００ｍｌの培地で３日間（２８℃）振とう培養した（前培養）。前培養液を、図２に示す連続培養装置の１．０Ｌの培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整と温度調整を行い、バッチ培養を実施した。バッチ培養の結果を、実施例１１の連続培養試験で得られたセルラーゼ生産性と比較して表１９に示す。
【０１３５】
【表１９】
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、セルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を安価に製造し、得られた２糖類含有溶液を糸状菌のセルラーゼ製造に利用することができる。さらにセルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を安価に製造することにより、セルラーゼ生産コストを低減させることができる。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 培養反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２糖類含有溶液を製造する工程を含むセルラーゼの製造方法に関する。詳しくは、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加後、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程を含み、製造した２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌にセルラーゼを製造する工程に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリコデルマなどの糸状菌は、培養液中に数十種類の分解機構の異なるセルラーゼ成分を大量に分泌生産する微生物である。またトリコデルマ属細菌の産生するセルラーゼ成分は、特にリグノセルロースなどの結晶性の高いセルロース加水分解に有効であることが知られている。したがって、近年のセルロースから培養原料である糖を得る工程、すなわち糖化工程において、このトリコデルマ属細菌のセルラーゼが頻繁に使用されている。
【０００３】
セルラーゼの生産は、トリコデルマなどの糸状菌を固体及び液体培養することにより行われている。セルラーゼを糸状菌によって効率的に製造するためには、セルラーゼ生産を誘導する適切な誘導物質を含む培地に糸状菌を培養する必要がある。こうしたセルラーゼ誘導物質としては、セルロース（固体）、ラクトース、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース、ソルボースなどが知られている。
【０００４】
セルロースは、安価な炭素源であり、かつセルラーゼ誘導物質でもあるが、固体であるため直接的なセルラーゼ誘導物質としては作用しない。したがって、セルロースによる糸状菌セルラーゼの誘導には高濃度のセルロースを含む培地を使用する必要があった。
【０００５】
ソルボースは、２糖類より安価な単糖であり、かつセルラーゼ誘導物質であるが、ソルボース単体では誘導効果が低く、ラクトースやセルロースとともに添加する必要があった（非特許文献１）。したがって、糸状菌は高濃度のセルロースやラクトースを含む培地で培養する必要があった。
【０００６】
ラクトースは、比較的安価な水溶性の２糖類であるが、セルラーゼ誘導効果が低いため、高濃度で含む培地を使用する必要があった（非特許文献１）。また、同じ２糖類であるソホロースおよびゲンチオビオースは、セルロースあるいはラクトースより強力なセルラーゼ誘導物質であり、少量でセルラーゼ誘導効果を得ることができることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、ソホロースおよびゲンチオビオースは、非常に高価であるため、工業的なセルラーゼ製造には使用できないといった課題があった。
【０００７】
ソホロースなどのセルラーゼ誘導効果の高い２糖類を得る方法として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の生産するβ−グルコシダーゼを使用し、グルコースの縮合反応による製造する方法が開示されており、トリコデルマ属のセルラーゼ製造に使用できることが開示されている（特許文献１）。しかし、アスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼは、酵素活性が低く、熱安定性も低いため、縮合反応では、酵素活性を増強するためにβ−グルコシダーゼの使用量が多いといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−２１１８８３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｋａｗａ Ｙ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４４，１０６−１１１．１９９５参照
【非特許文献２】Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｔ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，３７５−３８５．１９７１参照
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、従来の方法よりも酵素使用量を削減し、かつ効率よくセルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を製造し、得られた２糖類含有溶液を含む培地で糸状菌を培養することにより、セルラーゼを効率よく製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の［１］〜［１０］で構成される。
【００１２】
［１］セルラーゼの製造方法であって、（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【００１３】
［２］好熱性菌由来β−グルコシダーゼが好熱性菌由来組換えβ−グルコシダーゼであることを特徴とする、［１］記載のセルラーゼの製造方法。
【００１４】
［３］好熱性菌由来β−グルコシダーゼがパイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）またはサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）由来であることを特徴とする、［１］または［２］記載のセルラーゼの製造方法。
【００１５】
［４］好熱性菌由来β−グルコシダーゼが配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１６】
［５］前記（１）工程が、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で添加し、４０〜１２０℃で保温することによる縮合反応であることを特徴とする、［１］から［４］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１７】
［６］さらに（３）前記（１）工程で得られた２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する工程を含む、［１］から［５］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００１８】
［７］前記（３）工程が２糖類含有溶液から限外濾過膜により好熱性菌由来β−グルコシダーゼを回収する工程である、［６］に記載のセルラーゼの製造方法。
【００１９】
［８］回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼを、前記（１）工程に再利用することを特徴とする、［６］または［７］に記載のセルラーゼの製造方法。
【００２０】
［９］糸状菌がトリコデルマ・リーセイであることを特徴とする、［１］から［８］のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【００２１】
［１０］前記（２）工程が糸状菌を連続培養する工程である、［１］から［９］いずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、従来技術に比べて少ない酵素量で高いセルラーゼ誘導効果を有する２糖類含有溶液を効率的に製造することが可能となる。また製造した２糖類含有溶液を含む培地に糸状菌を培養することで高いセルラーゼ誘導効果を得ることが可能である。以上の効果により、糸状菌を使用したセルラーゼ製造コストを低減させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、好熱性菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子を挿入する位置と、挿入するｐＥＴ３０ａベクターのマップである。
【図２】図２は、本発明で用いられる膜分離型の連続培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
セルロースとは、グルコースがβ-１、４結合した糖ポリマーを含むものを指す。すなわち本発明におけるセルロースとは、セルロース純度の高いアビセル、αセルロース、パルプなどから、セルロース含有バイオマス、すなわち、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、などの草本系バイオマス、また樹木などの木質系バイオマスなどを含む。特に後者のセルロース含有バイオマスにおいては、セルロースに加え、ヘミセルロース、リグニンなども含んでなる。
【００２５】
セルラーゼとは、前記セルロースあるいはセルロース含有バイオマスの分解に触媒する酵素群の総称である。すなわち、本発明のセルラーゼとは、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ガラクターゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどの酵素、あるいはこれら酵素の混合物を指す。
【００２６】
そして本発明は、後述する糸状菌が産生するセルラーゼを製造することを目的としている。なお、糸状菌由来のセルラーゼを製造する場合、糸状菌培養液に産生されるセルラーゼを回収することで達成されるが、一般的に糸状菌培養液にはセルラーゼと併せてセルラーゼとは異なる複数種の酵素も培養液中に産生されるため、本発明の製造対象物はセルラーゼを主成分とする酵素混合物であってもよい。セルラーゼを主成分とする酵素混合物に含まれる酵素種としては、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼを含んでなる。
【００２７】
以下、本発明の詳細について工程順に説明する。
【００２８】
本発明は、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程を含むことを特徴としている。ここでいうグルコース含有溶液とは、グルコースを主成分とする溶液のことであり、グルコース以外の単糖、２糖類、オリゴ糖類などを含んでいてもよい。したがって、本発明で使用するグルコース含有溶液は、純度の高いグルコース試薬を使用してもよいし、糖蜜、廃糖蜜、セルロース糖化液などグルコース以外の成分を含んでなる糖液を原料として使用してもよい。
【００２９】
本発明で使用するグルコース含有溶液に含まれるグルコース濃度は、１００〜９００ｇ／ｌの濃度で含まれていることが好ましく、より好ましくは、４００〜８００ｇ／ｌである。本発明のグルコース含有溶液は、グルコースを５０〜８５℃に加温しながら水溶液に溶解することにより調整することができる。
【００３０】
本発明で使用するグルコース含有溶液のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ３．０〜８．０の範囲であることが好ましく、より好ましくは、ｐＨ４．５〜５．５の範囲である。こうしたｐＨ範囲にあるグルコース含有溶液調製には、酸またはアルカリを使用することができるが、緩衝液を使用することが好ましい。使用する緩衝液は、前記ｐＨ範囲に調製可能な溶液であれば限定されないが、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示できる。
【００３１】
本発明では、前記グルコース含有溶液に含まれるグルコースを好熱性菌由来β−グルコシダーゼにより縮合して、２糖類含有溶液を製造することを特徴としている。
【００３２】
β−グルコシダーゼによる縮合反応とは、β−グルコシダーゼの触媒作用により、グルコースの縮合反応により種々の２糖類を合成する反応を指す。すなわち、本発明の縮合反応では、少なくとも、グルコースから、２糖類であるセロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、ソホロースを合成する反応を指す。βーグルコシダーゼの縮合活性は、８００ｇ／ｌの試薬グルコースのみを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、反応溶液と等量の適当に希釈した酵素液を加え５０℃、２０時間反応させたときに生成する２糖類総量から下記（式１）にてβ−グルコシダーゼ縮合活性を算出することでその活性を定義することができる。
【００３３】
（式１）（２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する酵素量）＝０．０００１５／１ｍｇ・ｍｌ−１の２糖類を生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００３４】
また好熱性菌とは、５０℃以上で生育可能な微生物群の総称であり、本発明においては８０℃以上で生育する微生物であることが好ましい。該好熱性菌としては、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、スルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、などを例示することができる。
【００３５】
カルディビルグラ属の微生物としては、カルディビルグラ・マキリンジェンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ）が例示され、高温酸性温泉、火山の硫気噴気口などから単離することができる。
【００３６】
サーモスファエラ属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、サーモスファエラ・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００３７】
スルホロバス属に属する微生物としては、好熱好酸菌の１種であり、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離されている微生物であり、スルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ） 、スルフォロバス・トウコウダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ）、スルフォロバス・メタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ）、スルフォロバス・シバタ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ ）が例示され、温泉、火山、噴気孔、硫黄孔から単離される。
【００３８】
サーモプラズマ属に属する微生物としては、サーモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）が例示され、温泉、ボタ山、その他硫黄環境から単離される。
【００３９】
フェルビドバクテリウム属に属する微生物としては、９０℃以上の極度の高温環境に分布する好熱菌の１種であり、海底火山、深海底熱水孔周辺から単離される微生物であり、フェルビドバクテリウム・ノドサム（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）が例示され、９０℃以上の極度の高温環境（海底火山、深海底水孔周辺など）から単離される。
【００４０】
バシラス属に属する微生物としては、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が例示され、温泉、深海底水孔周辺から単離される。
【００４１】
クロストリジウム属に属する微生物としては、クロストリジウム・スポロジェネス (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ)、クロストリジウム・サーモセラム (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ)が例示され、温泉から単離される。
【００４２】
サーマス属に属する微生物としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が例示され、温泉、噴気孔から単離される。
【００４３】
ピクロフィラス属に属する微生物としては、ピクロフィラス・オシマエ（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｏｓｈｉｍａｅ）、ピクロフィラス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ）が例示され、噴気孔から単離される。
【００４４】
パイロコッカス属の微生物としては、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、パイロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・ホエイセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｓｅｉ）が例示され、深海の熱水噴出孔、油田などから単離される。
【００４５】
本発明では縮合反応に使用するβ−グルコシダーゼの使用量を減らして、高いセルラーゼ誘導効果を有する２糖類含有溶液を製造するため、上記に例示されるような好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼが用いられる。また、本発明においては好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼであれば特に制限はないが、パイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく用いられる。また、本発明において好ましく用いられるパイロコッカス属またはサーモプラズマ属由来のβ−グルコシダーゼは特に限定されないが、好ましい具体例として、パイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ（配列番号２）またはサーモプラズマ・ボルカニウム由来のβ−グルコシダーゼ（配列番号４）が挙げられる。なお本発明においては、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を有する範囲であれば、該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたものであっても好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼとして使用することができ、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するものが使用される。なお、アミノ酸配列同一性についてはＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて判定することができる。
【００４６】
本発明で使用される好熱性菌由来β−グルコシダーゼは特に制限されず、前記好熱性菌を培養し、好熱性菌培養液あるいは好熱性菌体内に産生するβ−グルコシダーゼを単離、回収、精製して得られたものであっても、異種宿主を使用して生産した組換えβ−グルコシダーゼであってもよいが、組換えβ−グルコシダーゼが好ましく使用される。また、本発明で使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼは、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ縮合活性を有する範囲であれば、β−グルコシダーゼを主成分とするタンパク質混合物であってもよい。
【００４７】
本発明で好ましく使用される好熱性菌由来の組換えβ−グルコシダーゼは、好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を、適切な発現プロモーターの下流に連結し、また適切な発現ベクターに組み込み、異種宿主に対して遺伝子組換えを行い、得られた異種宿主を培養することで組換えβ−グルコシダーゼを得ることができる。好熱性菌由来のβ−グルコシダーゼを生産するための異種宿主としては、特に限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｆｕｍｉｃｏｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を例示することができ、中でも大腸菌、トリコデルマ属、アスペルギルス属、バシラス属が好ましく用いられる。
【００４８】
本発明の２糖類含有溶液製造工程における好熱性菌由来β−グルコシダーゼ濃度は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲で添加することが好ましい。ここで使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼは、一般的に酵素が変性あるいは失活していない状態のもののことを指す。β−グルコシダーゼの濃度が、上記濃度範囲未満であると、縮合反応の効率が低くなる場合があり、また、上記濃度範囲を超えても縮合反応の効率は向上しない。
【００４９】
縮合反応の温度条件は、４０〜１２０℃の温度範囲で行うことが好ましい。４０℃未満であると、縮合反応効率が低下する場合があり、一方、１２０℃を超える温度であると、β−グルコシダーゼの活性が低下するため反応効率が低下する場合がある。
【００５０】
縮合反応で使用される好熱性菌由来β−グルコシダーゼ縮合活性は、前記（式１）の活性測定方法で測定した場合、β−グルコシダーゼ濃度１ｍｇ／ｍｌで、０．５〜１２．５Ｕ／ｍｌのβ−グルコシダーゼ縮合活性を有することが好ましい。すなわち、好熱性菌由来β−グルコシダーゼ濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でのβ−グルコシダーゼ縮合活性は、０．０５〜２５０Ｕ／ｍｌであることが好ましい。好熱性菌由来β−グルコシダーゼの縮合活性が左記の数値範囲より外れてしまうと、十分な縮合反応が見られない場合がある。
【００５１】
縮合反応の反応時間は、使用するβ−グルコシダーゼ濃度、またはグルコース含有溶液のグルコース濃度等によって最適な反応時間は変化するため特に限定されるものではないが、操作性の観点から、３０分から４８時間の範囲で設定されることが好ましく、さらに好ましくは、２時間から２４時間の範囲である。
【００５２】
縮合反応を行う反応装置は特に限定されないが、グルコース含有溶液を一定温度に保温でき、またグルコース含有溶液を攪拌する装置を備えたものであることが好ましい。
【００５３】
上記工程により得られる２糖類含有溶液とは、少なくともその成分として、セルラーゼ生産を誘導する２糖類を含んでなる水溶液であり、２糖類含有溶液に含まれる２糖類としては、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、セロビオースなどを例示することができる。こうした２糖類の内、ソホロースまたはゲンチオビオースを多く含んでいることが好ましい。また、こうした２糖類の組成は特に限定されないが、好ましくは２種以上の２糖類を含んでなる水溶液であり、さらに好ましくは、ソホロース、ゲンチオビオースの２種を含んでいることが好ましい。
【００５４】
前記２糖類含有溶液はβ−グルコシダーゼを含んでいる。次のセルラーゼ製造工程に使用する際にはβ−グルコシダーゼを含んだままであってもよいが、好熱性菌由来β−グルコシダーゼが除去されていることが好ましい。なお、本発明においては好熱性菌由来β−グルコシダーゼを失活させる場合もβ−グルコシダーゼが除去されたと見なす。２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する方法については特に限定はないが、本発明においては限外濾過膜を使用する方法が好ましく用いられる。
【００５５】
２糖類含有溶液から限外濾過膜を使用してβ−グルコシダーゼを除去するとは、２糖類含有溶液を、限外濾過膜に通じて濾過し、好熱性菌由来β−グルコシダーゼを限外濾過膜で阻止分離し、膜側画分として好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去し、限外濾過膜の透過液として、好熱性菌由来β−グルコシダーゼが除去された２糖類含有溶液を得ることを意味する。
【００５６】
限外濾過膜とは、本発明で使用する好熱性菌由来β−グルコシダーゼを阻止できる分画分子量を有していれば特に制限はないが、好熱性菌由来β−グルコシダーゼの分子量の観点から分画分子量が５０００〜３００００の範囲にあるものが好ましく使用できる。また、本発明における限外濾過膜の構造としては、中空糸膜、平膜、スパイラル膜、チューブラー膜を使用することができるが、これらの構造に限定されない。また、本発明における限外濾過膜の膜素材は、酢酸セルロース系ポリマー、芳香族ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、耐久性・対汚性の観点で、ポリエーテルスルホンであることが好ましい。
【００５７】
限外濾過膜の濾過方法としては、遠心濾過法、加圧濾過法、減圧濾過法を使用することができ、２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを阻止分離できれば特に制限はない。
【００５８】
２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する際に限外濾過膜を使用する利点として、限外濾過膜で除去した好熱性菌由来β−グルコシダーゼをグルコース含有溶液に添加して縮合反応に再利用できることが挙げられる。このような回収再利用の回数は特に限定されず、経済的に好ましい範囲でその回数を設定することができる。また再利用時において、回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼの活性が充分でない場合、その不足分の好熱性菌由来β−グルコシダーゼを新たに添加し、縮合反応を行ってもよい。
【００５９】
次に、２糖類含有溶液を用いて糸状菌のセルラーゼを製造する工程について説明する。本発明で使用する糸状菌とは、鞭毛菌類、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類、不完全菌のすべてを含み、特に、菌体が糸状を呈し、分生子と呼ばれる無性胞子を形成して増殖する糸状菌を指す。具体的には、モナスカス属(Ｇｅｎｕｓ Ｍｏｎａｓｃｕｓ)、ペニシリウム属(Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)、セファロスポリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクレモニウム属(Ｇｅｎｕｓ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ)、ムコール属(Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒ)、リゾプス属(Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、フザリウム属(Ｇｅｎｕｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ)、エメリセラ属(Ｇｅｎｕｓ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ) トリコデルマ属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クラビセプス属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、フミコラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、カワラタケ属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、オオウズラタケ（Ｇｅｎｕｓ Ｆｏｍｉｔｏｐｕｓｉｓ）、ファネロカエテ属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）に属する微生物を例示することができる。ペリコニア属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ）、ニグロスポラ属（Ｇｅｎｕｓ Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ）に属する糸状菌が好ましい例として挙げられる。
【００６０】
また本発明で用いられる糸状菌のより好ましい例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ファネロカエテ・ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロカエテ・クリソスポディウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｄｉｕｍ）、さらに好ましい例としてトリコデルマ・リーセイが挙げられる。
【００６１】
さらにトリコデルマ・リーセイにおいては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＰＣ３−７）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ９１２３）が例示される。
【００６２】
なお、前記糸状菌に対し、突然変異処理、または遺伝子組換えなどの操作により生物機能を改変または向上させた糸状菌を使用することもできる。
【００６３】
本発明では、前記２糖類含有溶液を糸状菌の培地に添加することで、セルラーゼの製造を行う。糸状菌の培養に使用する培地成分は、セルラーゼ誘導物質として前記２糖類含有溶液に含まれる２糖類の他に、糸状菌の生育およびセルラーゼの産生に必要な炭素源、窒素源、無機塩、金属塩、ビタミン、などの成分を含んでいれば限定されるものではない。また必要であれば消泡剤、界面活性剤などを含んでいてもよい。また、セルラーゼ誘導物質の供給源としては、前記２糖類含有溶液だけでなく、別途セルラーゼ誘導物質を用意し、これを併用してもよい。また、特に炭素源としてグルコースを使用する場合、前記２糖類含有溶液中に含まれるグルコースであってもよいし、あるいは別途グルコースを用意し、これを培地に添加してもよいが、糸状菌培地に含まれるグルコース濃度が高すぎると糸状菌によるセルラーゼ生産性の低下を招く可能性があるため、糸状菌培地に含まれるグルコース濃度を１０ｇ／Ｌ以下に維持することが好ましい。なお糸状菌の中でも、本発明において好ましく用いられる例のひとつであるトリコデルマ・リーセイの培養に使用する培地としては、Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９、７３９−７４３、１９８７年（Ｔｕｒｋｅｒら）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．６４、５８８−５９７、１９８６年（Ｍｃｌｅａｎら）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２８、４１−５０、１９８６年（Ｗｅｂｂら）に開示してある培地を使用することができる。
【００６４】
２糖類含有溶液を糸状菌培地に対してあらかじめ添加しておく、あるいは糸状菌培養期間中に糸状菌培養液に添加することで糸状菌のセルラーゼ生産を誘導・促進することができる。糸状菌培地または培養液に対する２糖類含有溶液の添加量は、所望のセルラーゼ誘導効果が得られれば特に限定されないが、糸状菌培地または培養液に含まれる２糖類含量が０．００１〜１ｇ／Ｌの範囲となるように２糖類含有溶液を添加することで、セルラーゼの生産性を高めることができるため好ましい。なお２糖類含有溶液は、糸状菌培地または培養液に添加する前に滅菌操作を施しておくことが好ましい。滅菌操作としては、特に限定されないが、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌などを使用することができる。
【００６５】
糸状菌はこうした培地に植菌し、所定時間保温することで、培養することができる。糸状菌は、胞子または分生子の状態で培地に植菌してもよく、また菌糸または菌体の状態で植菌してもよい。また保温する温度は、使用する糸状菌の生育に適した温度を設定すれば良く、特にトリコデルマ属を使用する場合は、２５℃〜３０℃の範囲で設定すればよい。また培養する日数は、目的とするセルラーゼ生産が十分に行える日数であれば、特に限定されない。
【００６６】
また、糸状菌の培養方法として、バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養などがあり特に限定されるものではないが、生産性の観点から連続培養であることが好ましい。糸状菌の連続培養方法としては、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養方法が好ましく例示される。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
（参考例１） ２糖類含有溶液中の２糖類総量の測定
以下参考例１として２糖類含有溶液中の２糖類総量の測定方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の測定条件により高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。
【００６９】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、移動相：０．５ｍｏｌ／ｌLほう酸カリウム緩衝液 ｐH８．７（流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ）、反応液：１ｗ／ｖ％アルギニン、３ｗ/vほう酸（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、検出方法：蛍光（Ｅｘ．３２０ｍｍ、Ｅｍ．４３０ｍｍ）、温度：１５０℃。
【００７０】
（参考例２） ２糖類含有溶液中のグルコース濃度の測定
以下参考例２として２糖類含有溶液中のグルコース濃度の測定方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の測定条件により高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。
【００７１】
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、移動相：０．５ｍｏｌ／ｌほう酸カリウム緩衝液 ｐH７．７（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、反応液：１ｗ／ｖ％アルギニン、３ｗ/vほう酸（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、検出方法：蛍光（Ｅｘ．３２０ｍｍ、Ｅｍ．４３０ｍｍ）、温度：１５０℃。
【００７２】
（参考例３） β−グルコシダーゼ縮合活性の測定
１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐH５．０）、８００ｇ／ｌの試薬グルコースのみから成る反応液に１ｍｌの適当に希釈した酵素液を加え５０℃、２０時間反応させた後、沸水中で酵素反応を停止し、氷水中で急冷した。次に参考例１記載の方法で２糖類を定性・定量した。さらに、得られた２糖類生成量をもとに、２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する量をβ−グルコシダーゼ縮合活性１単位（１Ｕ、ユニット）と定義し、次の（式１）に従ってβ−グルコシダーゼの縮合活性を測定した。
【００７３】
（式１）（２０時間に１ｍｇ／ｍｌの２糖類を生成する酵素量）＝０．０００１５／１ｍｇ・ｍｌ−１の２糖類を生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００７４】
（参考例４） セルラーゼ活性の測定
本発明でセルラーゼの生産性を評価する指標となる、セルラーゼ活性（Ｕ、ユニット）は次の方法で測定した。１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐH５．０）、５０ｍｇのワットマンＮｏ．１ろ紙から成る反応液に０．５ｍｌの適当に希釈した糸状菌の培養液を加え５０℃、６０分間反応させた後、３ｍｌのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、２０ｍｌの脱イオン水を加え５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を算出した。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。セルラーゼ活性１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量により定義し、次の（式２）によって計算した。
【００７５】
（式２）セルラーゼ活性（１Ｕ）＝０．３７／２．０ｍｇのグルコースを生成するのに必要な酵素濃度（Ｕ／ｍｌ）。
【００７６】
（参考例５） トリコデルマ・リーセイの培養
以下参考例５としてトリコデルマ・リーセイの培養方法を記載する。本発明では、特に記載がないものに関しては、以下の培養方法により培養を実施した。
【００７７】
供試菌として、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ Ｃ−３０）株（ＡＴＣＣ５６７６５）を使用した。まず供試菌をポテトデキストロース寒天斜面培地上で２５℃、７日間培養した。寒天培地表面に生育した胞子を０．８５％生理食塩水３ｍｌに懸濁し、ｍｉｒａｃｌｏｔｈ(コスモ・バイオ社製)でろ過することにより胞子を回収した。回収した胞子を表１の培地１００ｍｌが入った三角フラスコに１０μｌ植菌し、２８℃で所定期間トリコデルマ・リーセイＲｕｔ Ｃ−３０を培養した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
【表２】
【００８０】
（参考例６） ２糖類生成効率の算出
酵素添加量当たりの２糖類の生成効率を下記（式３）にて算出した。
（式３）２糖類生成効率＝縮合反応によって生成する２糖類総量（ｇ／ｌ）／縮合反応に添加したβ−グルコシダーゼ濃度（ｇ／ｌ）。
【００８１】
（比較例１）アスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼを使用した縮合反応による２糖類含有溶液の製造
以下比較例として、常温菌であるアスペルギルス・ニガー由来のβ−グルコシダーゼ（ＡｎＢＧＬ）を用いて２糖類含有溶液を製造した。反応条件は、特開平５−２１１８８３号公報の実施例記載方法に準じて、以下の条件で実施した。
【００８２】
グルコース含有溶液は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。ＡｎＢＧＬはノボザイム１８８（シグマ社製）を使用し、脱塩カラムにより精製した。８０％グルコース含有溶液に、ＡｎＢＧＬを最終濃度２４ｇ／ｌとなるように添加し、５０℃で２０時間反応を行って２糖類含有溶液を製造した。２糖類総量と２糖類生成効率を表３に示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
（比較例２）２糖類含有溶液（比較例１）を使用したセルラーゼの製造
比較例１で得られた２糖類含有溶液を使用して、セルラーゼの生産が可能か検討した。比較例１で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定し、その結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
（実施例１）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）の調製
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、パイロコッカス属に属するパイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を選定した。
【００８７】
ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーＡＥ０１０１６７で登録されているパイロコッカス・フリオサス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子として、配列番号１記載の配列の５’末端にＮｃｏＩ、３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を付加したＤＮＡ配列を全合成した。全合成した遺伝子は、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３０ａのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結した（図１）。連結したベクターは、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、カナマイシンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて選抜し、形質転換されたＪＭ１０９株より作成したベクターｐＥＴ−ＰｆＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析により連結された遺伝子配列を確認した。ｐＥＴ−ＰｆＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１−ＰｆＢＧＬ株をカナマイシン含有ＬＢ培地１０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、カナマイシン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液は、金属キレートレジンを用い精製を行った。精製した無細胞抽出液を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に透析した。透析の結果得られたタンパク質溶液は、９５〜９８％の精製純度を示しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドが確認できた。このタンパク質溶液を、パイロコッカス・フリオサス由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）として使用した。
【００８８】
前記操作で得られたＰｆＢＧＬのβ−グルコシダーゼ縮合活性は、０．１ｍｇ／ｍｌで１Ｕであった。
【００８９】
（実施例２）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造
実施例１で得られたパイロコッカス・フリオサス由来β−グルコシダーゼを使用して２糖類含有溶液を製造した。
【００９０】
グルコース含有溶液（１０ｍｌ）は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。得られたグルコース含有溶液に、ＰｆＢＧＬを０．０１ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌとなるように添加した。ＰｆＢＧＬを添加したグルコース含有溶液は、２０℃、４０℃、６０℃、８０℃、１００℃、１２０℃の各温度で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、反応生成物を限外濾過膜（日本ミリポア社ポリエーテルスルホン製、１０ｋＤａ）を使用して遠心分離し、ＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として除去し、９．７ｍｌの透過液を得た。
【００９１】
次に限外濾過膜の透過液として得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表５の通りであり、縮合反応温度の範囲としては４０℃以上が好ましいことが示された。一方、１２０℃であっても十分量の２糖類を含む２糖類含有溶液を製造できることが確認できた。また、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度は、０．１ｇ／ｌ以上が好ましく、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度が２０ｇ／ｌを超えると２糖類含有溶液中の２糖類が減少することが確認できた。すなわち、縮合反応に添加するＰｆＢＧＬ濃度は、０．１〜２０ｇ／ｌの範囲で添加することで、効率的な２糖類含有溶液の製造ができることが示された。
【００９２】
【表５】
【００９３】
また、反応温度４０〜１２０℃、ＰｆＢＧＬ添加量０．１〜２０ｇ／ｌの反応条件におけるＰｆＢＧＬの２糖類生成効率は表６の通りであり、好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、ＰｆＢＧＬを縮合反応に使用した場合では、比較例１（表３）と比べて、極めて高い２糖類生成効率を得られることが判明した。
【００９４】
【表６】
【００９５】
（実施例３）２糖類含有溶液（実施例２）を使用したセルラーゼの製造１
実施例２において、反応温度８０℃、ＰｆＢＧＬ濃度１ｇ／ｌの条件で得られた２糖類含有溶液を使用したセルラーゼの製造を実施した。
【００９６】
実施例２で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌを使用して、トリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表７の通りであり、実施例２で得られた２糖類含有溶液を使用することで、大量のセルラーゼを製造することができることが示された。また、比較例１のアスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼよりも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用することで、少ない酵素量で高いセルラーゼ生産性を得ることが可能であることが示された。
【００９７】
【表７】
【００９８】
（実施例４）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造２
縮合反応の条件は、実施例２と同様の方法で実施したが、限外濾過膜によるＰｆＢＧＬの除去は行わず、以下の手順で実施した。
【００９９】
グルコース含有溶液は、試薬グルコースを８０％となるように５０ｍＭ酢酸緩衝液に加温しながら溶解させることで調製した。得られたグルコース含有溶液に、ＰｆＢＧＬを０．０１ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌとなるように添加した。ＰｆＢＧＬを添加したグルコース含有溶液は、２０℃、４０℃、６０℃、８０℃、１００℃、１２０℃の各温度で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、２糖類含有溶液として使用した。
【０１００】
得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果を表８に示す。限外濾過膜によりＰｆＢＧＬ除去しない場合では、２糖類総量に大きな差があることが示され、ＰｆＢＧＬを除去せずにしておくと、２糖類含有溶液中の２糖類総量が大きく減少することが確認された。すなわち、縮合反応終了後に、使用した好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去することが好ましいことが示された。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
また実施例２と同様に、２糖類生成効率を算出した結果は表９に示す通りであり、実施例２の結果（表６）と比べると２糖類生成効率が低いものの、比較例１の２糖類生成効率よりは高く、ここでも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用した方が効率的に２糖類含有溶液を製造できることが示された。
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
（実施例５） 好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＰｆＢＧＬ）の縮合反応への再利用
前記実施例２〜４の結果により、２糖類含有溶液よりＰｆＢＧＬを限外濾過膜で除去する方がより多くの２糖類を製造することができ、またセルラーゼ誘導効果も高いことが確認できた。そこで、この限外濾過膜で除去、回収されたＰｆＢＧＬを再度、縮合反応に再利用できないか以下手順で検討を行った。
【０１０５】
８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）に最終濃度が１ｇ／ｌになるようにＰｆＢＧＬを添加し、８０℃で２０時間反応を行った。縮合反応後氷上で急冷し、反応生成物１０ｍｌを限外濾過膜で遠心分離し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液１として、膜画分０．２ｍｌをＰｆＢＧＬとして回収した。回収したＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを、８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）を用いた縮合反応に再度使用し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液２として、膜画分０．２ｍｌをＰｆＢＧＬとして回収した。再回収したＰｆＢＧＬ０．２ｍｌは８０％グルコース含有溶液（１０ｍｌ）に添加後縮合反応に使用し、透過液９．７ｍｌを２糖類含有溶液３として、ＰｆＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として回収した。２糖類含有溶液１〜３を参考例１の方法で測定した結果は表１０の通りであり、限外濾過膜で回収（除去）したＰｆＢＧＬを、縮合反応に再利用できることが確認できた。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
さらに、２糖類含有溶液１〜３を使用してセルラーゼ製造を検討した。前記２糖類含有溶液１〜３を０．２ｍｌ含む表１の培地１００ｍｌ培地に、トリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表１１の通りであり、ＰｆＢＧＬの再利用によって得られた２糖類含有溶液２または３を使用してもセルラーゼの効率的な製造が可能であることが示された。
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
（実施例６）好熱性菌由来β−グルコシダーゼの調製２
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、サーモプラズマ・ボルカニウム由来のβ−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を選定した。
【０１１０】
ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションナンバーＢＡ００００１１で登録されているサーモプラズマ・ボルカニウム由来β−グルコシダーゼ遺伝子として、配列番号３記載の配列の５’末端にＮｃｏＩ、３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を付加したＤＮＡ配列を全合成した。全合成した遺伝子は、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３０ａのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結した。連結したベクターは、ＪＭ１０９（タカラバイオ）に形質転換した。スクリーニングは、カナマイシンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて選抜し、形質転換されたＪＭ１０９株より作成したベクターｐＥＴ−ＴｖＢＧＬをミニプレップキット（キアゲン）により単離し、塩基配列解析により連結された遺伝子配列を確認した。ｐＥＴ−ＴｖＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬＰ株を作製した。ＢＬ２１−ＴｖＢＧＬ株をカナマイシン含有ＬＢ培地１０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、カナマイシン含有ＬＢ培地１ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、トリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液は、金属キレートレジンを用い精製を行った。精製した無細胞抽出液を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に透析した。透析の結果得られたタンパク質溶液は、９５〜９８％の精製純度を示しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでシングルバンドが確認できた。このタンパク質溶液を、サーモプラズマ属由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）として使用した。
【０１１１】
前記操作で得られたＴｖＢＧＬのβ−グルコシダーゼ活性は、０．１ｍｇ／ｍｌで０．７Ｕであった。
【０１１２】
（実施例７）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造
好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、実施例６で得られたサーモプラズマ・ボルカニウム由来β−グルコシダーゼを使用し、実施例２と同様に２糖類含有溶液を製造した。限外濾過膜により、ＴｖＢＧＬ０．２ｍｌを膜画分として除去し、９．７ｍｌの透過液を得た。
【０１１３】
次に限外濾過膜の透過液として得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表１２に示す通りであり、縮合反応温度の範囲としては４０℃以上が好ましいことが示された。一方、１２０℃であっても十分量の２糖類を含む２糖類含有溶液を製造できることが示された。また、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度は、０．１ｇ／ｌ以上が好ましく、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度が２０ｇ／Ｌを超えると、２糖類含有溶液中の２糖類が減少することが確認示された。すなわち、縮合反応に添加するＴｖＢＧＬ濃度は、０．１〜２０ｇ／ｌの範囲で添加することで、効率的な２糖類含有溶液の製造ができることが示された。
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
また、反応温度４０〜１２０℃、ＴｖＢＧＬ添加量０．１〜２０ｇ／ｌの反応条件におけるＴｖＢＧＬの２糖類生成効率は表１３の通りであり、好熱性菌由来β−グルコシダーゼとして、ＴｖＢＧＬを縮合反応に使用した場合では、比較例１（表３）と比べて、極めて高い２糖類生成効率を得られることが示された。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
（実施例８）２糖類含有溶液（実施例７）を使用したセルラーゼの製造１
実施例７において、反応温度８０℃、ＴｖＢＧＬ濃度１ｇ／ｌの条件で得られた２糖類含有溶液を使用したセルラーゼの製造を実施した。
【０１１８】
実施例７で得られた２糖類含有溶液０．２ｍｌを含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定し、その結果は表１４の通りであり、実施例７で得られた２糖類含有溶液を使用することで、大量のセルラーゼを製造することができることが判明した。また、比較例１のアスペルギルス・ニガー由来β−グルコシダーゼよりも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用することで、少ない酵素量で高いセルラーゼ生産性を得ることが可能であることが示された。
【０１１９】
【表１４】
【０１２０】
（実施例９）好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）を使用した２糖類含有溶液の製造２
縮合反応の条件は、実施例８と同様の方法で実施したが、限外濾過膜によるＴｖＢＧＬの除去は行わず、実施例４と同様の手順で実施した。得られた２糖類含有溶液中の２糖類総量を参考例１記載の方法で測定した結果は表１５の通りであり、実施例４の結果と同様に、縮合反応終了後に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去することが好ましいことが示された。
【０１２１】
【表１５】
【０１２２】
次に実施例７と同様に、２糖類生成効率を算出した結果は表１６の通りであり、実施例７の結果（表１３）と比べると、２糖類生成効率が低いことが確認された。しかしながら、比較例１の２糖類生成効率よりは高く、ここでも好熱性菌由来β−グルコシダーゼを使用した方が、効率的に２糖類含有溶液を製造できることが確認された。
【０１２３】
【表１６】
【０１２４】
（実施例１０） 好熱性菌由来β−グルコシダーゼ（ＴｖＢＧＬ）の縮合反応への再利用
実施例５と同様に限外濾過膜で除去、回収されたＴｖＢＧＬを再度、縮合反応に再利用できないか検討を行った。限外濾過膜で回収されたＴｖＢＧＬ０．２ｍｌ全量を再利用に使用し、透過液（２糖類含有溶液１〜３）９．７ｍｌを得た。２糖類含有溶液１〜３を参考例１の方法で測定した結果は表１７の通りであり、限外濾過膜で回収（除去）したＴｖＢＧＬを、縮合反応に再利用できることが確認できた。
【０１２５】
【表１７】
【０１２６】
さらに、２糖類含有溶液１〜３を使用してセルラーゼ製造を検討した。２糖類含有溶液１〜３を０．２ｍｌ含む表１の培地１００ｍｌにトリコデルマ・リーセイを参考例５記載の方法で植菌した。培養３日目、５日目、７日目における培養液中のセルラーゼ活性を参考例４の方法で測定した結果は表１８の通りであり、ＴｖＢＧＬの再利用によって得られた２糖類含有溶液２または３を使用してもセルラーゼの効率的な製造が可能であることが示された。
【０１２７】
【表１８】
【０１２８】
（実施例１１）連続培養によるセルラーゼの製造
本発明のセルラーゼの製造方法における連続培養での実施例として、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養装置を使用した実施例を以下に示す。
【０１２９】
連続培養装置としては、特開２００９−３９０７４号公報に記載の装置（図２）を使用した。セルラーゼの分泌生産能力を有する糸状菌として前記実施例と同様のトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ Ｃ−３０株を用いた。
【０１３０】
培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、特開２００９−３９０７４号公報に記載のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。該多孔性膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
培養反応槽容量：１．０（ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：２８（℃）
・培養反応槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・膜分離槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１３１】
まず、ポテトデキストロース寒天培地で固体静地培養したＲｕｔ Ｃ−３０株の胞子を、試験管で表１に示す１００ｍｌの培地で３日間（２８℃）振とう培養した（前培養）。前培養液を、図２に示す連続培養装置の１．０Ｌの培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整と温度調整を行い、７２時間培養を行った。
【０１３２】
前培養完了後、実施例３で使用した２糖類含有溶液を５００倍になるように希釈し、希釈した２糖類含有溶液を含む表１の培地を作成した。この培地を連続供給し、培養液循環ポンプ１１によって培養反応槽１と膜分離槽１２の間を培養液の循環を行い、連続培養装置の培養液量が２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続培養による生産されたセルラーゼの製造を行った。連続培養試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、培養反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、濾液中の生産されたセルラーゼの生産量を測定した。濾液はすべて回収し、この濾液中に含まれるセルラーゼ活性を表１９に示した。１４４時間の培養試験を行った結果、特開２００９−３９０７４号公報に記載の連続培養装置を用いることにより、セルラーゼの連続培養による製造が可能であることを確認することができた。
【０１３３】
（実施例１２）バッチ培養によるセルラーゼの製造
糸状菌を用いた培養形態として最も典型的なバッチ培養を２リットル容のジャーファーメンターを用いて行い、セルラーゼの生産性を評価した。培地には表１に示す増殖培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。運転条件は、次の通りである。
・培養反応槽容量（培養液量）：１．０（ｌ）
・温度調整：２８（℃）
・培養反応槽通気量：１．０（ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整。
【０１３４】
まず、ポテトデキストロース寒天培地で固体静地培養したＲｕｔ Ｃ−３０株の胞子を、試験管で表１に示す１００ｍｌの培地で３日間（２８℃）振とう培養した（前培養）。前培養液を、図２に示す連続培養装置の１．０Ｌの培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機５によって６００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整と温度調整を行い、バッチ培養を実施した。バッチ培養の結果を、実施例１１の連続培養試験で得られたセルラーゼ生産性と比較して表１９に示す。
【０１３５】
【表１９】
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、セルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を安価に製造し、得られた２糖類含有溶液を糸状菌のセルラーゼ製造に利用することができる。さらにセルラーゼ誘導効果の高い２糖類含有溶液を安価に製造することにより、セルラーゼ生産コストを低減させることができる。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 培養反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼの製造方法であって、（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【請求項２】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼが好熱性菌由来組換えβ−グルコシダーゼであることを特徴とする、請求項１記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼがパイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）またはサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）由来であることを特徴とする、請求項１または２記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼが配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項５】
前記（１）工程が、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で添加し、４０〜１２０℃で保温することによる縮合反応であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項６】
さらに（３）前記（１）工程で得られた２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項７】
前記（３）工程が２糖類含有溶液から限外濾過膜により好熱性菌由来β−グルコシダーゼを回収する工程である、請求項６に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項８】
回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼを、前記（１）工程に再利用することを特徴とする、請求項６または７に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項９】
糸状菌がトリコデルマ・リーセイであることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項１０】
前記（２）工程が糸状菌を連続培養する工程である、請求項１から９いずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項１】
セルラーゼの製造方法であって、（１）グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および（２）２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
【請求項２】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼが好熱性菌由来組換えβ−グルコシダーゼであることを特徴とする、請求項１記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼがパイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）またはサーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）由来であることを特徴とする、請求項１または２記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】
好熱性菌由来β−グルコシダーゼが配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項５】
前記（１）工程が、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で添加し、４０〜１２０℃で保温することによる縮合反応であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項６】
さらに（３）前記（１）工程で得られた２糖類含有溶液から好熱性菌由来β−グルコシダーゼを除去する工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項７】
前記（３）工程が２糖類含有溶液から限外濾過膜により好熱性菌由来β−グルコシダーゼを回収する工程である、請求項６に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項８】
回収された好熱性菌由来β−グルコシダーゼを、前記（１）工程に再利用することを特徴とする、請求項６または７に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項９】
糸状菌がトリコデルマ・リーセイであることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項１０】
前記（２）工程が糸状菌を連続培養する工程である、請求項１から９いずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２２７０３２（Ｐ２０１０−２２７０３２Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７８９７８（Ｐ２００９−７８９７８）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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