セルラーゼ活性を有するポリペプチド
本発明は、ＣＢＨ ＩＩキメラ融合ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、およびポリペプチドを生成するための宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の優先権主張＞
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、２００９年４月６日に出願された米国仮出願第６１／１６６，９９３号、および２００９年５月１３日に出願された米国仮出願第６１／１７７，８８２号を参照して取り込むものとする。
【０００２】
＜連邦支援の研究に関する記載＞
アメリカ政府は、国立衛生研究所によって与えられる研究費番号ＧＭ０６８６６４およびＡＲＯ−ＵＳ Ａｒｍｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｒｒｉｓ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒによって与えられる研究費番号ＤＤＡＤ１９−０３−０Ｄ−０００４に従って、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、分子生物工学および分子生物デザイン、並びに改変タンパク質および改変核酸に関する。
【背景技術】
【０００４】
バイオマス変換工程におけるセルラーゼ混合物の性能は、セルロース基質の物理的な状態および組成に加えて、安定性、生成阻害、多様なセルラーゼ成分間の相乗効果、非生産的な吸着に対する生産的な結合、およびｐＨ依存性を含む多くの酵素特性に依存する。多様な適用および原料に対して酵素の形態を最適化するため、セルロース加水分解に多変量的な特性を付与し、多様なセルラーゼから選択することが望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、セルラーゼ活性があり、野生型タンパク質と比較して、高い熱安定性および活性がある組み換え型ポリペプチドを提供する。本発明は、長時間の加水分解試験において、ＣＢＨ ＩＩのＣ末端（例えば天然タンパク質配列に応じてアミノ酸約３１０−３１５であり、例えば配列番号２および４を参照とする）で、ＣｙｓからＳｅｒへの突然変異があるキメラおよび天然酵素が、天然酵素と比較してより確実なセルロース加水分解を提供することを示す。
【０００６】
本発明は、配列ＧＥＣＤＧ（配列番号２の３１２−３１６）を含有するモチーフ中のＣ末端領域にＣ→Ｓ置換を含む組み換えポリペプチドであって、該変異体が、野生型セロビオヒドラーゼと比較して高い熱安定性およびセルラーゼ活性があるものを提供する。例えば、本発明は高い熱安定性およびセルラーゼ活性があるポリペプチドであって、Ｃ３１４Ｓを含有する配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１０Ｓを含有する配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１２Ｓを含有する配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１４Ｓを含有する配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１５Ｓを含有する配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１３Ｓを含有する配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１３Ｓを含有する配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４０７Ｓを含有する配列番号６５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３９４Ｓを含有する配列番号６６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４０７Ｓを含有する配列番号７６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３９４Ｓを含有する配列番号７７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含むか；Ｃ４１２Ｓを含有する配列番号７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；上記ポリペプチドは、セルラーゼ活性があり、それに相当するＣｙｓ→Ｓｅｒの突然変異が欠如している親（野生型）タンパク質と比較して熱安定性が改良されている。
【０００７】
本発明は、組み換えにより生成されたか、合成されたか、他の非天然的な製造方法により生成された、いずれかの実質的に精製されたポリペプチドも提供する。該ポリペプチドは、Ｃ→Ｓ置換の存在位置を除く、以下に示す１−１０、１０−２０または２０−３０の保存的な配列のアミノ酸置換基を含む：Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【０００８】
本発明は、（ａ）位置３１４にＳｅｒがある配列番号２と少なくとも８５％以上の一致があるポリペプチドであり、前記ポリペプチドはセルラーゼ活性がある；（ｂ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号４と少なくとも７０％以上の一致があるポリペプチドであり、前記ポリペプチドはセルラーゼ活性がある；（ｃ）（ｉ）位置３１０にＳｅｒがある配列番号１２、（ｉｉ）位置３１２にＳｅｒがある配列番号１３、（ｉｉｉ）位置３１４にＳｅｒがある配列番号１４、（ｉｖ）位置３１５にＳｅｒがある配列番号１５、（ｖ）位置３１３にＳｅｒがある配列番号１６、（ｖｉ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号１７、（ｖｉｉ）位置３１３にＳｅｒがある配列番号１９、（ｖｉｉｉ）位置３１２にＳｅｒがある配列番号２１、（ｉｘ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号２２からなる群から選択される配列と７０％以上の一致があるポリペプチドであり、それぞれ上記ポリペプチドは、セルラーゼ活性がある；（ｄ）２つの異なるセロビオヒドラーゼポリペプチドからの少なくとも２つのドメインを含むキメラポリペプチドであり、ドメインはＮからＣ末端までに：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）を含み；断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約１から約ｘ１までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ１から約ｘ２までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ２から約ｘ３までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ３から約ｘ４までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片５は、配列番号２（“１”）、配列番号４（「２」）または配列番号（「３」）のアミノ酸残基約ｘ４から約ｘ５までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ５から約ｘ６までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片７は、配列番号２（「１」）または、配列番号４（「２」）のアミノ酸残基約ｘ６から約ｘ７までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片８は、配列番号２（「１」）または配列番号４（「２」）のアミノ酸残基約ｘ７から約ｘ８までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７であるか、配列番号４または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６である；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３または２２４であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５または３１６であるか、配列番号４の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１８；およびｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６の配列であり、キメラポリペプチドは、配列番号２の位置３１４または配列番号４の位置３１１でＳｅｒであり、キメラポリペプチドは配列番号２，４もしくは６を含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドと比較してセルラーゼ活性、改良した熱安定性および／またはｐＨの安定性があるものからなる群から選択される配列を含む組換え型ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号１２−６２または６３の配列からなる組換え型ポリペプチドも提供する。
【００１０】
本発明は、また上記いずれかのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明は、本発明の実質的に精製された形態、または細胞溶解物の一部としてポリペプチドを含む酵素製剤も提供する。
【００１２】
本発明は、またセルロースを含むバイオマスの処理方法を提供し、該方法は本開示のポリペプチドまたは酵素液とバイオマスの接触工程を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】候補遺伝子たるＣＢＨ ＩＩの親遺伝子の酵母発現培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ａ）ゲルレーン（左から右）：１−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ、２−空ベクター、３−Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ、４−Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、５−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（二重）、６−Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、７−Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ、８−空ベクター（二重）、９−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（三重）。ゲルの下部の数字は、２時間、５０℃でのＰＡＳＣ加水分解試験後に、反応物中に存在する還元糖の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。その後、ＢＳＡを標準としたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる比較は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ発現レベル５−１０ｍｇ／Ｌの評価を可能とした。（Ｂ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＢＨ ＩＩ発現培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。ＣＢＨ ＩＩバンドが、ちょうど６０ｋＤａ分子量基準値未満で現れた。レーンは、左から右に向かって、１−野生型Ｈ． ｊｅｃｏ、２−Ｈ． ｊｅｃｏ Ｂ７Ｐ３、３−Ｈ． ｊｅｃｏ Ｃ３１１Ｓ、４−野生型Ｃ． ｔｈｅｒ、５−野生型Ｈ． ｉｎｓｏ、６−Ｈ． ｉｎｓｏ Ｂ７Ｐ３、７−Ｈ． ｉｎｓｏ Ｃ３１４Ｓである。数値は、５０℃、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８の条件下で、ＰＡＳＣ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて１００分間インキュベーションした際に生じるμｇグルコース等量／ＳＤＣＡＡを発現する培養上清等量の１ｍＬ当たりのｍＬ反応容量を示す。レーン１−４に関する値は、加えられた濃縮培養上清の容積の２倍に修正するため、２で除算する。かかる修正を省略すると、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素に関する特異的活性値が低下するように思われる。
【図２】ＣＢＨ ＩＩキメラライブラリーブロックの限度を示す図である。（Ａ）色分けされたブロックを用いたＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインのリボンダイアグラムを示す。ＣＢＨ ＩＩ酵素は、セロビオ由来のイソファゴミングリコシダーゼ阻害剤と複合体を形成する。（Ｂ）２次構造要素、ジスルフィド結合および黒矢印によって示されるブロックの区別を示す、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ触媒ドメインの直線図である。（Ｃ）組み換えに応じて分解することができる接続部分（４．５Ａ範囲内の側鎖重原子）を示す側鎖接続マップである。分解された接触部の大半は、連続したブロックの間に生じる。
【図３】２３個の分泌／活性型および１５個の非分泌／不活性型のサンプルセットのキメラに関して分割した接続部（Ｅ）の数および最も近い親（ｍ）からの突然変異の数を示す図である。
【図４】親ＣＢＨ ＩＩ酵素および３つの熱安定性のあるキメラに関するｐＨの関数として、ｐＨ５．０で基準化した特異的活性を示す図である。提示するデータは、２つの測定の平均であり、ＨＪＰｌｕｓおよびＨ． ｊｅｃｏに関するエラーバーは、２つの独立した試験の値を示す。１６時間反応物において、３００μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃での１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム／１２．５リン酸ナトリウム緩衝剤中において示すようなｐＨである。
【図５】親および広範囲にわたる温度での熱安定性のあるキメラに関する長期セルロース加水分解分析の結果を示す図である。エラーバーは、ＨＪＰｌｕｓおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ酵素の３つの測定に関する標準誤差を示す。ｐＨ４．８における５０ｍＭ酢酸ナトリウム中の１００μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣの４０時間反応物である。
【図６】６３℃で１２時間インキュベーションした後、検証するためのキメラセットに関する標準化した残留活性を示す図である。５０℃で２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ４．８中、２時間の分析においてＰＡＳＣを基質として用いて測定された濃縮培養上清におけるＣＢＨ ＩＩ酵素に関する残留活性を示す。
【図７】親およびキメラＣＢＨ ＩＩ酵素発現ベクターＹｅｐ３５２／ＰＧＫ９１−１―ｒｓｓに関するマップを示す図である。図示のベクターは、野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｅ１６ａ（ＣＢＨ ＩＩ酵素）遺伝子を含む。キメラおよび親ＣＢＨ ＩＩ酵素の双方に関して、ｓｓ Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ｋｅｘ２部位に続くＣＢＤ／リンカーアミノ酸の配列は、以下の通りである：ASCSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYS (配列番号8)。
【図８】ＣＢＨ ＩＩ親および５１個のＣＢＨ ＩＩキメラに関する観測されたか、予測されるＴ５０値である。線は線形回帰モデル式を示す（Ｔａｂｌｅ７におけるパラメーター）。親ＣＢＨ ＩＩのＴ５０値は、正方形で示す。
【図９】アビセルに対する、温度によるＣＢＨ ＩＩ特異的活性を示す図であり、（ａ）ＣＢＨ ＩＩ親およびキメラの特異的活性である。（ｂ）ＣＢＨ ＩＩ親、Ｃ３１１Ｓ突然変異体およびＢ７Ｐ３単一ブロック置換キメラの特異的活性である。アビセル濃度１５ｍｇ／ｍＬを用いた５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中で１６時間、反応を行った。（ｃ）温度の関数としてアビセルに対するＣＢＨ ＩＩ親、単一点突然変異体および単一阻害置換キメラ活性（μｇ／グルコース／ｍＬ反応）である。１５０分間、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８条件下、アビセル濃度１５ｍｇ／ｍＬを用いて、反応を行った。ＣＢＨ ＩＩ酵母培養上清を、５５℃でほぼ等量の還元糖産物の濃度を達成するため投与した。提示されるデータは、それぞれの温度点に関して二重の活性値を示すエラーバーと２つの独立した測定の平均である。
【図１０】親１であるＨ．ｉｎｓｏｌｅｎｓおよび親３であるＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからのブロック７ＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列の配置である。矢印は、復帰突然変異における残基変異を示す。
【図１１】２１１１１３３１キメラ点突然変異に関するＴ５０値を示す図である。値は、２つの独立した二重試験の平均値として示され、エラーバーは点突然変異に関する二重試験のそれぞれのＴ５０値を示す。試験温度の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下、１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）と５０℃で１００分間のインキュベーションによって測定された。
【図１２】Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親ＣＢＨ ＩＩ、Ｓｅｒ単一点突然変異およびＢ７Ｐ３ブロック置換キメラに関するＴ５０値を示す図である。３つの独立した測定の平均、エラーバーとして示した値は、それぞれのＣＢＨ ＩＩに関する１つの標準偏差を示す。不活性化は、試験される温度５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下で、１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌのリン酸、膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）と５０℃で、１００分間のインキュベーションによって測定された。
【図１３】Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＭと融合した）およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから非相同的に分泌されたＣＢＨ ＩＩキメラ３１３１１１１２，１３２３１１１１および野生型ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインに関するＴ５０値を示す。２つの独立した試験の測定値をエラーバーを用いて示す。不活性化は、試験される温度５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下で１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌリン酸、膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を用いて５０℃で１００分インキュベーションすることによって測定された。
【図１４】ＣＢＨ ＩＩ組み換え型ブロックの接合部位を示す図である。（ａ）新規非親残基の組み合わせが可能な場合（結合した球体）、ブロックの間の部位は、通常、その表面が曝露されており、潜在的に溶媒が接合部位をスクリーンすることを可能とする。（ｂ）接合部位（Ｂ５−Ｂ６）の例は、バックボーン（位Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓに配置図）、の保存、表面上の可変的な残留物ならびに残基１７３および２５３（矢印）における新規な埋没した疎水性の対の比較的稀有な可能性を示す。（ｃ）Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（図中、黒色で示す）からのブロック１−４は、基質結合と関連する移動が、Ｂ３部位（黄色）において観測される（矢印）にも関わらず、同属のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓブロック（色分けされた図）と大きな偏差なく適合する。（ｄ）Ｂ６、Ｂ７接点（矢印）での挿入欠失が構造変化を要するが、同属のブロック５−８も同様である。
【図１５】Ｃ３１４Ｓ突然変異体およびその安定性への効果の構造分析を示す図である。（ａ）微細構造のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ構造（１ｏｃｎ）の水素の位置を、図１に示した。（ｂ）類似したセリン構造の再構成された結合構造を、ＰｙＭＯＬ（http: (//) www .pymol . org）でモデル化した。ＳＨＡＲＰＥＮ２モデリング・プラットフォーム（全ての原子ロゼッタエネルギー機能を有する）において、側鎖を最適化することで、Ｃｙｓ３１４およびＳｅｒ３１４の双方が、Ｐｒｏ３３９のカルボニルの水素結合に寄与し、Ｇｌｙ３１６のアミドから水素結合を受容することを示唆した。セリンの優れた水素結合性能は、セリンを含む変異体のより高い安定性に影響し得る。他の説明は、補助的な位置を示すものである。特に、１ｏｃｎからのＣｙｓ位置は、側鎖が顕著に曲がり（即ち、Ｎ−Ｃ−Ｃα−Ｃβからの不適切な上反角が、標準位置から６°である）、Ｐｒｏカルボニルからの距離が増加した、立体構造種を示す。図内の文字の後でない数値は、水素結合距離（オングストローム）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書および特許請求の範囲で使用する、単数形“ある（ａ，ａｎ）”、および“この（ｔｈｅ）”の語は、明確に記載しない限り、複数の指示物を含む。従って、例えば「ドメイン」の用語は複数のドメイン、「タンパク質」の用語は１つ以上のタンパク質を含む。
【００１５】
また「または」の用語は、他に記載されない限り「および／または」を意味する。同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ， ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓおよびｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、同じ意味で用いられ、制限することは意図しない。
【００１６】
さらに様々な実施形態の記載においては、「含む」の用語を使用し、当業者は、いくつかの特定の場合、実施形態が或いは「実質的になる」または「なる」の言語を使用して記載されていると理解するであろう。
【００１７】
ここに記載されたものと同様または対応する方法および材料を、開示の方法および組成物の実施に使用することができ、ここでは、例示的な方法、装置および材料を開示するものである。
【００１８】
他に規定がない限り、ここに使用される全ての専門的且つ化学的な用語は、一般的にこの開示が属する分野の当業者に理解されるものと同様の意味を有する。したがって、本出願にわたって使用される以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００１９】
最近の研究は、研究室レベルのバイオマス変換過程において、中等温度好性の対照物と比較して、好熱性菌からのセルラーゼが熱安定性に優れ、その高い安定性により、適温または高温状態における長期の活性保持を有することを示してきた。菌のセルラーゼについては、４０ｇ／Ｌまでの上清濃度で、高度に活性があり、菌宿主、例えばＨｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（アナモルフ・トリコデルマ・リーゼイ）に発現することができることため、高い関心が寄せられている。不都合にも、熱安定性のある菌セルラーゼを発現する試料は、その数が少ない。。加工性のセロビオヒドラーゼクラスＩＩ（ＣＢＨ ＩＩ）酵素の場合、１０個未満の天然熱安定遺伝子配列が、ＣＡＺｙデータベースに掲載されている。
【００２０】
ここに十分に記載するように、再帰的キメラポリペプチドの生成ならびに特定の安定したドメインおよび最終的な特定のアミノ酸の分析により、熱安定性に付与、活性化の改善がみられた。
【００２１】
以下により詳細に記載するように、本発明は、少なくとも一部において、セルロースの加水分解に触媒作用を生じる新規酵素の生成および発現に基づくものである。一つの実施形態において、高温条件下でセルロースを加水分解するように改変された新規ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、アミノ酸置換基を特定の残基で含むように変えられたセロビオヒドラーゼの変異体を含む。これらの変異体については以下でより詳細に記載されているが、本発明のポリペプチドは１つ以上の修飾されたアミノ酸を含んでもよいことが理解される。修飾されたアミノ酸の存在は、例えば（ａ）ポリペプチド半減期の長期化、（ｂ）熱安定性および（ｃ）基質の補充の増加において有利である。アミノ酸は、例えば、共翻訳中または翻訳後において、組み換え生産（例えば、哺乳類細胞での発現中の、Ｎ――Ｘ――Ｓ／ＴモチーフのＮ−結合型グリコシル化）の際に修飾されるか、合成手段によってによって修飾される。従って、「突然変異」、「変異体」または「修飾された」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、親のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞から選択されるか、由来するか、ある場合においては異なるか、変化した、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を意味する。突然変異体もしくは修飾されたタンパク質または酵素は、必然的でないが、通常、突然変異体のポリヌクレオチドまたは遺伝子から発現する。
【００２２】
「突然変異」は、突然変異タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を生じる、あらゆる工程または機構を意味する。これは、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列が変化するあらゆる突然変異、および、かかる突然変異から起因する細胞におけるあらゆる検出可能な変化を含む。通常、突然変異は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列での、単一または複数のヌクレオチド残基の点変異、欠失または挿入によって生じる。突然変異は、タンパク質をコードする遺伝子の領域内で生じるポリヌクレオチドの変性、ならびにタンパク質コード配列外、例えば、調節またはプロモーター配列（これらに限定しない）領域の変性を含む。遺伝子内における突然変異は、「サイレント」であってもよく、即ち発現に応じてアミノ酸変性に反映されず、遺伝子の「配列保存的な」変異体をなってもよい。これは、通常、１個のアミノ酸が１種を超えるコドンに対応する場合において生じる。
【００２３】
修飾されたアミノ酸の非制限的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えばファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸等が挙げられる。アミノ酸の修飾について、当業者を導くのに参照し得る文献が存在する。プロトコールの例は、ＷａｌｋｅｒのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９８）（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ、ニュージャージー州）のＣＤ−ＲＯＭから取得可能である。
【００２４】
本発明には、修飾したセロビオヒドラーゼポリペプチドを生成・分離する組み換え法を記載する。組み換え生成に加えて、固相技術を用いた直接的なペプチド合成（例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co, San Francisco);およびMerrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154）によって、ポリペプチドを生成することができる。ペプチド合成は、手動または自動の方法を用いて実施することができる。自動合成は、例えばアプライドバイオシステムズ４３１Ａペプチド合成装置（パーキンエルマー、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、製造業者の提供する説明書に従って実施することができる。
【００２５】
「セロビオヒドラーゼＩＩ」または「ＣＢＨ ＩＩ酵素」は、細菌類および菌類において多岐にわたるセルラーゼファミリー６タンパク質における酵素を意味する。酵素は、セルロースの加水分解に用いられる。
【００２６】
「セルラーゼ活性」は、セルロースを加水分解できる酵素を意味する。セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する菌類、細菌類および原生動物によって生成される酵素ファミリーを指す。しかしながら、他の種類の生物、例えば植物および動物によって生成されるセルラーゼもある。この群のＥＣ番号は、ＥＣ３．２．１．４である。触媒作用に基づく、５つの一般的な種類のセルラーゼが存在する：エンドセルラーゼ；エキソセルラーゼであり、この部類内には２つの主な種類のエキソセルラーゼ（またはセロビオヒドラーゼ、省略してＣＢＨ）があり、１つの種類は還元端から進むように働き、もう１つの種類はセルロースの非還元末端から進むように働く；セロビアーゼまたはβグルコシダーゼ加水分解；酸化セルラーゼ；および、水の代わりにリン酸を用いてセルロース単量体へと分解するセルロースホスホリラーゼ。多くの菌のセルラーゼは、２つのドメイン；フレキシブルなリンカーによって結合している触媒ドメインおよびセルロース結合ドメインを有する。本発明のある実施形態において、セルラーゼ活性は、ＣＢＨ活性である。ここに記載の配列は、いくつかの場合において、セルロース結合ドメインおよび触媒ドメインの双方、または触媒ドメインのみを含む。いくつかの場合において、触媒ドメイン配列のみを提供する場合、配列番号８で示されるようなセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）が、直接又はリンカーを通して、触媒ドメインに機能的に連結し得ること（コード配列の一部とするか、後に融合するか）が認識されている。
【００２７】
ここに用いられる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、同じ意味で用いられており、１つ以上の化学基礎単位の鎖であり、化学結合であり、ペプチド結合と称するものによって共に連結されている複数アミノ酸を含む。「酵素」は、高度にまたは低度に特異的に１つ以上の化学または生化学反応を触媒または促進するあらゆる物質であり、好ましくは完全にまたは大半がタンパク質から構成されるものを意味する。「天然」または「野生型」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、自然に産出されるタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を意味する。
【００２８】
「アミノ酸配列」は、アミノ酸のポリマー（タンパク質、ポリペプチド等）またはアミノ酸ポリマーを示す特徴となる文字列（ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔｒｉｎｇ）である。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」の用語は、ここでは交換可能に同じ意味で使用される。「アミノ酸」は、中心の炭素原子が水素原子、カルボン酸基（ここに「カルボキシル炭素原子」として指す炭素原子）、アミノ基（ここに「網の窒素原子」として指す窒素原子）および側鎖基であるＲの基に結合する構造を有する」分子である。アミノ酸をペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に取り入れる場合、１つのアミノ酸をもう１つのアミノ酸に結合させる脱水反応において、１つ以上のそのカルボン酸基の原子が欠失する。そのため、タンパク質に取り入れられたアミノ酸は「アミノ酸残基」と表される。
【００２９】
一定のタンパク質の特定のアミノ酸配列（即ち、アミノ基末端からカルボキシ基末端まで表示される場合のポリペプチドの「一次構造」）は、コーディング部位のｍＲＮＡのヌクレオチド配列によって決定され、同様に遺伝情報、特にゲノムＤＮＡ（細胞小器官ＤＮＡ、例えばミトコンドリアまたは葉緑体ＤＮＡを含む）によって特定される。従って、遺伝子の配列を決定することは、対応するポリペプチドの一次配列、より詳細には、遺伝子またはポリヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドまたはタンパク質の役割または活性の予見を可能とする。
【００３０】
特定の配列の「保存的アミノ酸置換」または単なる「保存的な変異体」は、アミノ酸配列と実質的に同一である１つ以上のアミノ酸または一連のアミノ酸の置換を示す。当業者は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加または化学的に類似のアミノ酸との置換が起こる「保存的な変異体」を生じる、コード化配列における単一のアミノ酸または一定の割合のアミノ酸の変化、付加または欠失保存的を認識するであろう。
【００３１】
機能的に同類のアミノ酸の保存的置換を示す表は、従来技術において既知である。例えば、ある保存的置換基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）を含む。他の保存的置換基は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含む。他の保存的置換基は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む。また他の保存的置換基は、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）を含む。他の保存的置換基はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）を含む。他の保存的置換基は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）を含む。
【００３２】
従って、列挙されたポリペプチド配列（例えば配列番号２，４，６および１２−７８）の「保存的アミノ酸置換基」は、同じ保存的置換基のアミノ酸から保存的に選択され、ポリペプチド配列のアミノ酸の割合としては、通常１０％未満で含む。従って、本発明のポリペプチドの多様な保存的置換変異体は、同じ保存的置換基の多様な保存的置換変異体において、１００，７５，５０，２５または１０個の置換を含み得る。
【００３３】
核酸分子のコード化された活性を変えない配列の付加、例えば非機能的付加または非コード配列は、塩基性の核酸の保存的変異体であると理解されている。酵素の「活性」は、その反応を触媒する能力、即ち「機能」の測定値であり、反応生成物が生成される速度として表すことができる。例えば、酵素活性は、時間当たり、または酵素の単位（例えば濃度または重量）当たりについて、生成される生成物の量、または親和性、または解離定数に関して表すことができる。ここに同様の意味で用いられる「セロビオヒドラーゼ活性またはセルラーゼ活性」、「セロビオヒドラーゼまたはセルラーゼの生物学的活性」または「セロビオヒドラーゼまたはセルラーゼの機能的活性」は、特定の実施形態においては、タンパク質、セルラーゼ活性を有するポリペプチドであり、標準の技術によって生体内または生体外で決定される、セロセルロース基質へのビオヒドラーゼ活性によって及ぼす活性を指す。
【００３４】
当業者は、開示される、機能的に同一の構造を有する核酸構造の多くの保存的変異体を理解するであろう。例えば、上記のように、遺伝子のコーディングの縮退のため、「サイレント置換」（即ち、核酸配列の置換であり、コードされたポリペプチドには変異を生じない）は、アミノ酸をコードする各々の核酸配列の特徴を包含する。同様に、アミノ酸配列における１つまたは数個のアミノ酸の「保存的アミノ酸置換」は、高い相同性の特徴を有する異なるアミノ酸と置換され、また開示の構造と高い相同性を有することが容易に同定される。それぞれ開示の配列の、このような保存的変異体は、ここに提供するポリペプチドの特性である。
【００３５】
「保存的変異体」は、タンパク質または酵素の全体の構造および機能を変えることなく、アミノ酸残基を変化させた、タンパク質または酵素であり、同様の特性、極性または非極性、サイズ、形状、電荷等（これらに限定されない）を有するアミノ酸への置換を包含する。保存的なものとして示されるアミノ酸以外は、タンパク質または酵素において異なっていてもよく、あらゆる２つの同様の機能のタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は、異なっていてもよく、配列図によって決定されるように、例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であってもよい。本明細書において、「配列類似性」は、ヌクレオチドまたはタンパク質配列が連関する範囲を意味する。２つの配列の類似範囲は、配列類似性のパーセントおよび／または保守性に基づくことができる。ここに「配列相同性」は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の範囲に差異がないことを意味する。「配列のアラインメント」は、最大限の一致を達成するため（アミノ酸配列の場合保存性）、類似性の程度を評価することを目的とする２つ以上の配列を揃える工程を意味する。配列を揃えて、類似性／相同性を評価するための数々の方法は、従来技術、例えばＣｌｕｓｔｅｒ法において既知であり、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ（Lipman and Pearson, 1985; Pearson and Lipman, 1988）に基づくものが知られる。このプログラム全てを使用して、最も高い配列相同性を生じるものが好ましい設定といえる。
【００３６】
特定のポリペプチドの非保存的な修飾としては、保存的置換を特徴としないあらゆるアミノ酸の置換が挙げられる。例えば、上記の６つの群の範囲を超えるあらゆる置換が挙げられる。これらは、塩基性または酸性のアミノ酸から中性のアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎからＶａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）、芳香族アミノ酸から塩基性または酸性アミノ酸（例えば、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐからＡｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎ）への置換、またはアミノ酸とその類似するアミノ酸との置換ではない、あらゆる他の置換を含有する。塩基性側鎖としては、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性側鎖としては、アスパラギンサン（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；電荷を有さない極性側鎖としては、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）；非極性側鎖としては、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）；β岐側鎖としては、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香性の側鎖としては、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）が挙げられる。
【００３７】
「親」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、あらゆる他のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞に由来するか、あらゆる方法、装置または技術を用いて生成され、親そのものが天然か、突然変異体である任意のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞である。親ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、親タンパク質または酵素をコードする。
【００３８】
ＣＢＨ ＩＩポリペプチドの変異体を提供することに加えて、１）第１の親鎖から分離され、アミノ酸置換基を含むように修飾された変異体ドメイン；および２）第２の親鎖から分離され、新規活性またはドメインを補足する活性を含有するために非修飾または修飾のいずれかから分離されたドメインを含むキメラポリペプチド；が提供される。本発明のキメラポリペプチドの技術にかかる方法をここに開示する。
【００３９】
本発明は、野生型、または親タンパク質と比較して高い熱安定性を有するセルラーゼおよびセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）ＩＩ変異体、突然変異体およびキメラを開示し、野生型タンパク質は配列番号２，４または６からなる。変異体は、配列ＧＥＸＤＧのモチーフを有するＣ末端領域であって、セリンを含有し、前記Ｘは、Ｃ、ＡまたはＧ（配列番号１０７）であり、Ｘは、セリン、セルラーゼ活性を含む変異体と置換され、ポリペプチドは配列ＧＥＸＤＧ（配列番号１０７）においてセリンを欠如している野生型セルラーゼと比較して高い熱安定性を有する。一つの実施形態において、変異体は多くのセルラーゼおよびセロビオヒドラーゼＩＩタンパク質において見出されるモチーフＧＥＣＤＧ（以下により完全に記載する）において少なくともＣｙｓ→Ｓｅｒの突然変異（例えば、配列番号２のアミノ酸３１２−３１６を参照のこと）を含み、熱安定性または活性を向上させた付加突然変異を含んでいてもよい。セルラーゼ間の相同性は、非常に低くてもよい。上記セリン置換基は、配列番号１０７のモチーフ（例えば、ポリペプチドが配列番号２または４と少なくとも６０％以上の相同性がある）を有するあらゆるセルラーゼに適用できる。
【００４０】
例えば、本発明は高い熱安定性およびセルラーゼ活性を有し、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性がある配列を提供し、前記ポリペプチドは、セルラーゼ活性およびその相当するＣｙｓ→Ｓｅｒ突然変異を欠如している親（野生型）タンパク質と比較して高い熱安定性を有する。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明は上記ポリペプチドを提供するが、それらはさらに配列番号６４の配置として同定される少なくとも１つの付加的な突然変異を含み、配列番号６４は位置４１３でＰｒｏ、位置２３１でＳｅｒまたはＴｈｒ、位置３０５でＳｅｒまたはＴｈｒ、位置４１０でＧｌｎまたはＡｓｎ、位置８２でＧｌｕ、または上記のあらゆる組み合わせ置換を包含する。同様の置換は、アミノ酸配列の配列番号２，４，６，１２−６３および６５−７８と、配列番号６４の配列の配置として同定する。
【００４２】
本発明は、組み換えにより生成されたか、合成されたか、非天然的に生成されたか、のいずれの実質的に生成されたポリペプチドをも提供するものであり、該ポリペプチドは、Ｃ→Ｓ置換位置を除き、下記の１−１０、１０−２０または２０−３０の位置の同定された配列の保存アミノ酸置換を有する：
Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【００４３】
「分離されたポリペプチド」は、自然に伴う他の混入物、例えばたんぱく質、脂質およびポリヌクレオチドから抽出されたポリペプチドを指す。用語は、それら天然に分泌された環境または発現系（例えば宿主細胞または生体外合成）から除去されたか、精製されたポリペプチドを包含する。
【００４４】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチドの種類が主成分として存在する組成物（即ち、モルまたは重量に基づいて、ポリペプチドがあらゆる他の各々の高分子成分より組成物において多量に存在する）を指し、対象となる成分がモルまたは％重量によって示される高分子成分の少なくとも約５０パーセントを含む場合、一般的に実質的に精製された組成物とする。概して、実質的に純粋なポリペプチド組成物は、モルまたは重量％で組成物中に存在する全ての高分子成分の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上含まれる。いくつかの実施形態において、目的の成分は、実質的に均質となるまで精製され（即ち、混入物成分は従来の検出法によって組成物中に検出されない）、組成物は実質的に単一の高分子成分からなる。溶媒の種類、低分子成分（＜５００ダルトン）および基本的なイオン成分は、高分子成分としては考慮されない。
【００４５】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される、規定された配列を指す。参照配列は、例えば、遺伝子全長またはポリペプチド配列全長の断片のような、より長鎖の配列のサブセットとしてもよい。概して、参照配列の長さは、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも２５ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも５０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、または核酸またはポリペプチドの全長とすることができる。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列の間で類似の配列（即ち、完全な配列の一部）を含み、（２）２つの配列の間で異なる配列をさらに含むため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の比較は、配列類似性の局部領域を同定し、比較するため、典型的に２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較領域」にわたって比較することによって実施される。
【００４６】
「配列相同性」は、２つのアミノ酸配列が、比較領域にわたって実質的に相同性（即ち、アミノ酸−アミノ酸比較に基づく相同性）があることを意味する。「配列類似性」の用語は、同じ生物物理学的な特徴を共有する同様のアミノ酸を指す。「配列相同性のパーセンテージ」または「配列類似性のパーセンテージ」の用語は、２つの最適に配置された配列を比較領域にわたって比較し、適合する位置を計数するため、相同性残基（または同一残基）が双方のポリペプチド配列存在する位置を計数し、比較領域（即ち、領域サイズ）における適合する位置の数を総数で除算し、配列の一致のパーセンテージ（または配列類似性のパーセンテージ）を算出し、結果を１００で乗算して、得ることができる。ポリヌクレオチド配列に関して、配列の相同性および類似性の用語は、タンパク質配列に関して記載されるそれと同様に、比較領域にわたって、２つのポリヌクレオチド配列が同一（ヌクレオチド−ヌクレオチド比較に基づく）である「配列相同性のパーセンテージ」の意味を有する。このように、ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセンテージ（またはポリヌクレオチド配列の類似性のパーセンテージ、例えば、分析アルゴリズムに基づいたサイレント置換または他の置換）も算出することができる。最大の相関性は、ここに記載の１つ以上の配列アルゴリズム（または当業者が利用できる他のアルゴリズム）の使用、または目視によって決定することができる。
【００４７】
ポリペプチドに適用する場合、実質的な相同性または実質的な類似性の用語は、最適な配列を有する場合の２つのペプチド配列が、初期条件のギャップ重量（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムや、目視等において、配列の相同性または類似性を共有することを意味する。同様に、二つの核酸において、実質的相同性または実質的類似性の用語は、最適な配列を有する場合の２つの核酸配列が、初期状態のギャップ重量を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムやまたは目視等において、配列相同性または類似性を共有することを意味する。
【００４８】
配列相同性または配列類似性のパーセンテージを決定するために適切なアルゴリズムの１つの例は、Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載されたＦＡＳＴアルゴリズムである。またW. R. Pearson, (1996) Methods Enzymology 266:227-258を参照してもよい。相同性または類似性のパーセンテージを算出するため、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントにおいて使用するのに好ましいパラメーターは、以下の様に最適化される：BL50 Matrix 15: -5, k-tuple=2; joining penalty=40, optimization=28 ; gap penalty -12, gap length penalty=-2;およびwidth=16。
【００４９】
実用的なアルゴリズムの他の例として、ＰＩＬＥＵＰが挙げられる。ＰＩＬＥＵＰは、進行する対となる配置（アライメント）を使用して、連関する配列群からの多重配列アライメントを作成することにより、配列群の相関性および配列相同性と配列類似性のパーセンテージを示す。それは、進行するアライメントを形成するためのクラスター関係を示す、樹状図または系統樹もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle, (1987) J. Moｌ. Evol. 35:351-360の進行アライメント法を簡略化したもの使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151- 153, 1989に記載された方法に類似の方法である。プログラムは、最高３００の配列を配置（アライン）することができ、それぞれ最長５０００のヌクレオチドまたはアミノ酸を配置することができる。多重アラインメント法は、２つの最も相同性のある配列対のアライメントから始まり、２つのアラインされた配列のクラスターを生成する。その後、該クラスターは、次に最も関連した配列またはクラスター配列のクラスターにアラインする。２つのクラスターの配列は、２つの個々の配列の対アライメントの単純な延長によって配置される。最終的なアライメントは、一連の前進的な対アライメントによって達成される。プログラムは、配列比較領域における、特定の配列およびそのアミノ酸もしくはヌクレオチドの連携を設計すること、およびプログラムパラメーターを設計することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用することで、参照配列を以下のパラメーターを使用した関連の他の試験配列と比較し、パーセント配列相同性のパーセンテージ（または配列類似性のパーセンテージ）を決定した。：初期状態のギャップ重量（３．００）、初期状態のギャップ長さ（０．１０）および重量化した末端のギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン７．０から得られる。
【００５０】
多数のＤＮＡおよびアミノ酸配列に適したアルゴリズムの他の例としては、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムが挙げられる。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列群間の複数の対比較を実行し、それらを多重のアライメント配列の相同性に基づいて組み立てる。ギャップオープンおよびギャップエクステンションのペナルティーは、それぞれ１０および０．０５であった。アミノ酸アライメントに関して、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムをタンパク質重量マトリックスとして使用することができる。
【００５１】
上記のように、セロビオヒドラーゼおよびセルラーゼファミリーのメンバーは、配列アライメントおよびＧＥＣＤＧモチーフへの置換（例えば、配列番号２のアミノ酸３１２−３１６を参照のこと）によって同定することができる。修飾されたポリペプチドは、有利な活性を導入するように修飾されたものを同定するため、その後以下に記載されるような様々な温度および条件で、その活性を分析される。典型的な配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号であり、参照によりここに援用される配列から見出すことができる。
【００５２】
【表１】
【００５３】
さらに他の実施形態において、改良した熱安定性のある多様なセルラーゼポリペプチドファミリーは、Ｃ→Ｓ、Ｇ→ＳまたはＡ→Ｓ置換を有する以下の表に示すものを含む。さらに、以下の表に一致する置換、セルラーゼ活性および熱安定性のあるものを有する、以下いずれかの配列と８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列の一致を有するポリペプチドも本発明に包含される。
下表は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと高い相同性を有するタンパク質配列に関するアミノ酸の枠内（ｆｒａｍｅ ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ Ｃｙｓ３１１のアライメントをしめす。残基３１１に想到する位置を下線太文字で示す。この試験において検討された組み換え型Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＰ． ｃｈｒｙｓ ＣＢＨＩＩの配列は、Ｈ． ｉｎｓｏおよびＰ． ｃｈｒｙｓとして示す。２５０個のうち、最も相同性のある配列の５４個は、重複しているため省略した（即ち、構造研究のための点突然変異体または＞９５％一致するイソタイプ）。セルラーゼに関する受入番号が同定され、相当する配列が、ここに参考文献によって受入番号から直接複製されるように、本発明に組み込む。受入番号と関連する配列が、配列番号７９−１０６として参照される。太字下線部の残基（例えばＣ、ＡまたはＧ）は、Ｓに置換される。配列番号は、下記の配列中の数値による：
【００５４】
【表２】
【００５５】
開示の目的のため、親セルラーゼより少なくとも約４℃または少なくとも約９℃高いＴ５０、例えば約４℃から約３０℃高い、もしくはその間のあらゆる値のＴ５０を有するセロビオヒドラーゼ、または約９℃から約３０℃高い、もしくはその間のあらゆる値のＴ５０を有するセロビオヒドラーゼの場合、親セロビオヒドラーゼと比較したとき、開示のポリペプチドは、相当する親ポリペプチドに関して改良された熱安定性を示す。Ｔ５０は、１５分間のプレインキュベーション後、修飾された酵素または天然の酵素が、その残留活性の５０％を保持する温度であり、以下の実施例または従来技術における詳細な分析によって測定される。
【００５６】
開示の修飾されたセロビオヒドラーゼまたはセルラーゼは、相当する親セロビオヒドラーゼ（例えば配列番号２，４または６）より約４℃から約３０℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約５℃から約２０℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約８℃から約１５℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約９℃から約１５℃高いか、もしくはその間の範囲にあるＴ５０を有していてもよい。例えば、修飾されたセルラーゼは、相当する親セロビオヒドラーゼのものより少なくとも約４，５，６，７，８，９，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８または３０℃高いＴ５０を有することがあり得る。
【００５７】
ここに同定される変異体も、セロビオヒドラーゼを生成するために使用することができる。例えば、ＳＣＨＥＭＡは、何百もの活性β−ラクタマーゼおよび活性シトクロームＰ４５０の酵素キメラのファミリーを形成するため、前もって使用されてきた。ＳＣＨＥＭＡは、ブロックが異なる親同士で交換されたときに分解されるアミノ酸側鎖接触のライブラリー平均数である＜Ｅ＞を最小化する、接触したアミノ酸の「ブロック」の境を規定するため、タンパク質構造データを使用する。β−ラクタマーゼキメラが折り畳まれ、活性を有する可能性が、その配列のＥの値に反比例することが示された。突然変異のライブラリー平均数＜ｍ＞に対する＜Ｅ＞を最小化するようなブロック境界を同定するため、ＲＡＳＰＰ（最短距離問題としての組み換え）アルゴリズムが使用された。３つの親からの８つのブロック（３８＝６，５６１通りの配列）を含む、β−ラクタマーゼの収集物を特徴とする５００個までの２０％を超える固有のキメラは、触媒活性を有する。同様の方法により、２，３００の新規の、触媒活性がある酵素を含む３つの親からの８ブロックのシトクロームＰ４５０キメラファミリーを生成した。これら２つの収集物からのキメラは、最も近い親から、それぞれ平均して６６および７２の多数のアミノ酸配列の突然変異を有することを特徴とする。したがって、ＳＣＨＥＭＡ／ＲＡＳＰＰは、著しい配列多様性、およびかなりの部分の機能メンバーを有するキメラファミリーの設計を可能とした。
【００５８】
ＳＣＨＥＭＡキメラの熱安定性が、配列の小さいサンプルからの配列安定性データに基づいて予測されることが、示されてきた。１８４のシトクロームＰ４５０キメラの熱安定性に関する直線回帰モデルは、ＳＣＨＥＭＡブロックが、熱安定性に付加的な寄与をすることを示した。３００を超えるキメラが、このモデルによって熱安定性であると予測され、試験された全４４が最も安定した親と比較して、より高い安定性を有した。わずか３５の熱安定性試験の使用によって、最も熱安定性のあるキメラを予測することができた。さらに、熱安定性のあるＰ４５０キメラは、キメラ形成がさらなる実用的な酵素特性を導くことができることを証明する、固有の活性および特性プロフィールを示した。ここでＳＣＨＥＭＡ組換え型のＣＢＨ ＩＩ酵素は、高温で、長期間にわたって、幅広い範囲のｐＨ条件下のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）において、活性を有するキメラセルラーゼを生じることができる。
【００５９】
ここに記載の方法を使用して、セロビオヒドラーゼ活性を有する多くのキメラポリペプチドを、野生型親ＣＢＨ ＩＩタンパク質と比較して、改良した特性を有するものとして産生した。
【００６０】
新規ＣＢＨ ＩＩ酵素の多様なファミリーが、３つの菌のＣＢＨ ＩＩ酵素からの配列のブロックを交換することによって作成された。このセットから採取された４８のキメラ配列のうちの２３個は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって活性形状で分泌され、５つは６３℃で最も安定な親より長い半減期を有する。この４８のメンバーのサンプルセットが、存在し得る全６，５６１配列の１％未満であるので、このキメラの収集物は、１００もの活性型、熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩ酵素、ＣＡＺｙデータベースにおけるより少数化された約２０の菌ＣＢＨ ＩＩ酵素を有することが予測される。
【００６１】
熱安定性を促進するブロックを同定するためにサンプルセット配列安定性データを使用する方法は、第２のＣＢＨ ＩＩ検証セットにおける全１０個の触媒活性キメラが、最も安定な親である好熱性菌Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓからの天然の熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩより熱安定性であることにより検証された。したがって、本発明は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから触媒活性を有する形態で発現する全３３の新規ＣＢＨ ＩＩ酵素を生じ、そのうち１５は、それらが生成される最も安定な親より熱安定性である。これら１５の熱安定性のある酵素は、互いにおよび、それらに最も近い天然相同物から、それぞれおよそ９４および５８アミノ酸の位置で異なる。
【００６２】
組み合わせたサンプルおよび検証セットにおけるＣＢＨ ＩＩキメラの熱安定性の分析は、同じキメラに存在する場合Ｂ１Ｐ１、Ｂ６Ｐ３、Ｂ７Ｐ３およびＢ８Ｐ２として同定された４つの熱安定のあるブロックが、熱安定性に累積的に寄与することを示す。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩと比較してより熱安定性のある５つのサンプルセットキメラのうちの４つは、２つまたは３つの安定性のあるブロックを含む（Ｔａｂｌｅ１）。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素より比較的安定な全ての検証セットの１０個の活性型メンバーは、すべてＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素より安定しているが、３つまたは４つの安定性のあるブロックを含有するこの群において、最も熱安定性のある６つのキメラのうちの５つで、少なくとも２つの安定性のあるブロックを含有する。
【００６３】
本発明は、安定性ブロックが組みかえられ、新規の、高い安定性を有する活性型セルラーゼが生成されることを示す。安定性回帰モデルは、ＣＢＨ ＩＩ ＳＣＨＥＭＡライブラリーが親酵素の最も安定なものと比較しても、より安定が２．０２６のキメラを有することを予測する。これらのキメラは多様であり、生来のセルラーゼと明確に区別できる：それらは親から８から７２箇所の突然変異（平均５０箇所）、キメラ間では平均６３箇所の突然変異を有して多様化される。このセットから計３３個の遺伝子がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて合成され、発現される：これらキメラＣＢＨ ＩＩの全てについて、６３℃またはＴ５０での不活性化の半減期が測定され、いずれも好熱性菌Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来の最も安定な親セルラーゼと比較しても、より安定であることが見出された。８個のみのブロックのキメラを作成して配列の複雑化を減少させることで、配列安定性モデルの生成および単一の高い安定性のある配列ブロックの同定が可能となる。このブロックにおける１０個のみのアミノ酸置換の試験をすることによって、単一の高い安定化効果のある置換を同定した。キメラおよび生来のＰ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素にわたってＣ３１３Ｓ（配列番号６；Ｃ３１４Ｓ、配列番号２；Ｃ３１１Ｓ、配列番号４）の置換による非常に大きな安定性効果が観測され、この位置のあらゆる残基のＳｅｒへの突然変異が、それが導入されたあらゆるセルラーゼ６ファミリーを安定化させることを示す。
【００６４】
組み換えにおける接触分離の数を最小化することは（図２Ｃ）、ブロックがそれぞれ独立してタンパク質全体の安定性を高める、分離されたユニットに近い状態となることを可能としこれにより、累積的またはさらに付加的なキメラの熱安定性向上効果につながる。このＣＢＨ ＩＩ酵素の組み換えに関して、ＳＣＨＥＭＡは前記の接触分離を最小化するのに効果的であった：Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩ結晶構造において規定されるブロックの間の接触は計３０３ヶ所あり、ＣＢＨ ＩＩ ＳＣＨＥＭＡライブラリーのデザインによると、潜在的な接所分離は３３ヶ所のみであった。ＣＢＨ ＩＩ酵素の親が、そのサブドメインに明らかな構造上の特徴を有さず、且つ、８つのブロックのうちの４つのみ（１，５，７および８）が小型の構造ユニットまたはモジュール様の構造を示す場合、接触分離が低値であることはブロックの数が下位構造区分の数を超える場合においてＳＣＨＥＭＡ／ＲＡＳＰＰアルゴリズムが効果的であることを示した。β−ラクタマーゼおよびシトクロームＰ４５０キメラに関して前もって観測されるように、低いＥ値により、キメラの折り畳みおよび活性が予測可能である。ここでは使用しないが、この関係は、高い割合の活性型メンバーを含むキメラサンプルセットを設計するのに有用である。
【００６５】
本発明において、キメラを用いて、ｐＨの安定性をＣＢＨ ＩＩ酵素において改良できるかを検討した。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの特異的活性は、ｐＨが最適値５を超えて上昇するにつれて急激に減少し、一方、安定性のあるブロックを最も産業的に関連のあるＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素上に置換することによって作成されるＨＪプラスは、高いｐＨで顕著にその活性を保持する（図４）。熱安定性のある１１１１３１３２および１３３１１３３２キメラ、またＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩセルラーゼ親は、ＨＪプラスと比較してより幅広いｐＨ／活性特性を有する。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの制限されたｐＨ／活性特性は、いくつかのカルボキシルカルボン酸対の脱プロトン化に起因し、ｐＨ６を超えるタンパク質を不安定化する。ＨＪプラスのブロック７における親３の置換は、カルボキシルカルボン酸対である（ブロック８の）Ｄ２７７およびＤ３１６の間のカルボキシルカルボン酸の対を解除し、アスパラギンサン２７７をヒスチジンに変更する。正荷電のヒスチジンとＤ２７７を置換することは、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと比較してより高いｐＨで、ＨＪプラスが活性を保持することを可能とし、非酸性ｐＨにおける電荷斥力の不安定化を予防することができる。残存する２つの熱安定性のあるキメラならびにＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ親ＣＢＨ ＩＩ酵素のより幅広いｐＨ／活性特性は、ＨＪプラスおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩのＥ５７−Ｅ１１９カルボキシルカルボン酸の対に相応する位置での酸残基の欠如によるものであろう。
【００６６】
ＨＪプラスは、比較的高い特異的活性および高い熱安定性の双方を示す。図５は、これらの特性の長期にわたる加水分解実験における優れた機能を示す：ＨＪプラスは、親ＣＢＨ ＩＩ酵素と比較して７−１５℃高い温度でセルロースを加水分解し、最適温度において、全ての親と比較して著しく向上した長期活性を示した（Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの１．７倍）。ＨＪプラスキメラの特異的活性がＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ親のものより低い場合、この向上した長期活性は、ＨＪプラスの熱安定性に由来し、最適な加水分解温度での比較的長い反応時間にわたる活性を保持できる。
【００６７】
他の２つの熱安定性のあるキメラは、ＨＪプラスの幅広い温度範囲を共有した。この観測は、上昇した温度ｔ１／２と最高動作温度の間の正の相関を支持し、６，５６１のＣＢＨ ＩＩキメラ配列中の多くの熱安定性キメラもセルロースを高い温度で分解できることを示唆する。高い温度での非結晶性ＰＡＳＣ基質を加水分解するこの特性が、熱安定性のある菌ＣＢＨ ＩＩキメラの潜在的有用性をよく予見させる。一方、結晶基質およびリグニン含有基質の比較的困難な研究は、この新規ＣＢＨ ＩＩ酵素グループのバイオマス分解への応用に関して、より完全な評価を可能とする。
【００６８】
バイオマス変換工程の大半は、高いレベルのセルロース加水分解を達成するため、菌セルラーゼの混合物（主にＣＢＨ ＩＩ、セロビオヒドラーゼクラスＩ（ＣＢＨ Ｉ）、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ）を使用する。熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの多様な群を生成することは、酵素混合物を特定の応用および貯蔵のために調製し、最適化することができる、安定で、且つ活性の高いセルラーゼのストックを作成する第１工程である。
【００６９】
「ペプチド断片」は、比較的大きなポリペプチドまたはタンパク質の一部分もしくは断片を指す。ペプチド断片は、それ自身、機能活性を有する必要性がないが、いくつかの場合において、ペプチド断片は、生物学的活性を有するポリペプチドドメインに相当する。安定性に関するペプチド断片は、ペプチド断片を有しないポリペプチドと比較して、安定性、機能または折り畳み度合いを促進するポリペプチドにおいて見出されるペプチド断片である。不安定性にペプチド断片は、ポリペプチド内に存在する場合、安定性、機能または折り畳み度合いを欠く原因として同定されるペプチド断片である。
【００７０】
「融合」、「作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」および「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」は、２つの明白なドメインまたはペプチド断片の化学的または物理学的な結合を幅広く指すため、ここに同じ意味で用いられて使用することができ、作動可能に結合している場合、それぞれのドメインまたはペプチドの断片は、望ましい活性を有する機能的なポリペプチドを提供する。ドメインまたはペプチド断片は、それらが機能的であるようにリンカーペプチドによって結合していてもよく、他の中間体または化学結合によって融合することができる。例えば、２つのドメインは、同じコード配列の一部であってもよく、ポリヌクレオチドは、単一のｍＲＮＡに転写されるようにコード化され、双方のドメインを含む単一のポリペプチドに翻訳されるように、同じ「フレーム」内に存在する。或いは、両方のドメインを各々のポリペプチドとして別々に発現させ、化学的手法により互いに融合させてもよい。具体的には、コーディングドメインは、「フレーム」内で直接的に結合するか、またはペプチドリンカーを間に挟んで隔離されており、単一のポリヌクレオチドをコーディングする形態とする。ペプチドリンカーおよびペプチドのコード配列は、従来技術において既知である。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、ヌクレオチドの多量体型を指す。ある場合において、ポリヌクレオチドは、由来生物の天然に生じるゲノムにおいて、それが隣接する２つのコード配列（１つは５’末端側、もう１つは３’末端側で隣接する）のいずれかには直接隣接しないものを指す。従って、前記用語は、例えばベクター；独立して複製するプラスミドまたはウイルス；原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組み換え型ＤＮＡ、または他の配列から独立して別の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在するものを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾されたいずれかのヌクレオチドであってもよい。ここに使用されるポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域が混合しているＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖領域および二本鎖領域が混合しているＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域が混同したＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドの用語は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ（生物、即ちウイルスのＲＮＡゲノム）並びにゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡにコード化されたｍＲＮＡを包含する。
【００７２】
「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド断片」または「ポリヌクレオチド断片」は、比較的大きなポリヌクレオチド分子の一部を指す。ポリヌクレオチド断片は、タンパク質の機能ドメインをコードする必要はないが、タンパク質の機能ドメインをコードすることもあろう。ポリヌクレオチド断片は、約６ヌクレオチド以上の長さ（例えば、６−２０，２０−５０，５０−１００，１００−２００，２００−３００，３００−４００ヌクレオチド以上の長さ）としてもよい。安定性に関するペプチド断片は、安定性に関するポリヌクレオチド断片によってコードされてもよく、ペプチド断片は、ペプチド断片を欠如するポリペプチドと比較して、ポリペプチドの安定性、機能または折り畳み度合いを促進する。
【００７３】
「キメラ」は、少なくとも２つの異なる親タンパク質の少なくとも２つの断片の組み合わせを指す。当業者に理解されるように、それが関連のある特定の配列であって、そのものが物理的に核酸でないものであれば、実際、断片はそれぞれの親から由来する必要はない。例えば、キメラ菌クラスＩＩセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ ＩＩセルラーゼ）は、２つの異なる親ＣＢＨ ＩＩポリペプチドからの少なくとも２つの断片を有する。２つの断片は、セルラーゼ活性を有する新規ポリペプチドを生じるように結合している。即ち、タンパク質は、いずれかの親タンパク質の全長に一致する配列を有する場合、キメラとはいない。キメラポリペプチドは、２つ以上の異なる親タンパク質からの２つ以上の断片を含む。例えば、それぞれ最終的なキメラまたはキメラのライブラリーにつき、２，３，４，５−１０，１０−２０以上の親がある。それぞれの親ポリペプチドの断片は、非常に短いか、非常に長いこともあり、断片はタンパク質の全長の１〜９０％、９５％、９８％または９９％範囲の連続した長さのアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、最短の長さは１０アミノ酸である。ある実施形態においては、２つの親タンパクについて単一のクロスオーバー点が定義される。クロスオーバーの位置は、一方の親のアミノ酸断片が終結し、他方の親のアミノ酸断片が始まるところに規定される。従って、単純なキメラは、クロスオーバー位置前の断片が第１の親、クロスオーバー点後の断片が第２の親に属する場所にクロスオーバー位置がある。ある実施形態において、キメラは複数の交差位置を有する。例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１−３０個、またはこれを超えるクロスオーバー位置を有する。該クロスオーバーの位置および命名は、いずれも以下に記載するように規定する。２つのクロスオーバー位置および２つの親がある実施形態において、第１の親からの第１の連続断片に続いて、第２の親からの第２の連続断片が続き、これに第１の親由来の第３の連続断片が続く。「連続」とは、顕著な中断断片が存在しないことを示す。これら連続断片は、連続したアミノ酸配列を形成するために結合する。例えば、２つのクロスオーバー１００および１５０を有するＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ（以下「１」とする）およびＨ． ｊｅｃｏｒｉ（以下「２」とする）由来のＣＢＨ ＩＩキメラは、１からの最初の１００個のアミノ酸に、２から次の５０個のアミノ酸が続き、さらにこれに１から残りのアミノ酸が続く形態をとり得て、１つの連続したアミノ酸の鎖として全てが結合している。或いは、ＣＢＨ ＩＩキメラは、２から最初の１００アミノ酸、１から次の５０アミノ酸、次いで２由来の残りに順に続く形態をとってもよい。当業者に理解されるように、キメラの変異体は、本来の配列として同程度に存在し得る。従って、それが変異体キメラの場合、１００％でないそれぞれの断片が、最終キメラ内に存在すべきである。残基の付加、あるいは残基の除去または変性によって変更できる量は、変異体の用語が定義されるのと同様に定義される。当然、当業者に理解されるように、上記のものは、アミノ酸のみでなく、アミノ酸をコードする核酸にも応用することができる。
【００７４】
本発明は、特定の変異体に加えて、ＣＢＨ ＩＩキメラの作成に使用可能な変異体を示す。誘導されたＳＣＨＥＭＡ組み換え型ライブラリーは、セロビオヒドラーゼ酵素の生成に使用され、特に良く研究されたこの多様な酵素ファミリーのメンバー、具体的には下記のセロビオヒドラーゼＩＩ酵素に基づく。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓは親「１」（配列番号２）、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａは親「２」（配列番号４）およびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍは親「３」（配列番号６）。ＳＣＨＥＭＡは、タンパク質の構造一体性に影響を及ぼさずに組みかえることができる、相応するタンパク質の断片の位置を予測する計算方法である（Meyre et al. (2003) Protein Sci., 12: 1686-1693）。この計算は、ＣＢＨ ＩＩ親タンパク質の同定された７つの組み換え点に関してなされ、これにより各ポリペプチドが８つの断片を含むＣＢＨ ＩＩキメラポリペプチドのライブラリーの作成を可能とした。高い安定性を有するキメラは、配列安定性データの線形回帰、または折り畳まれたタンパク質対折り畳まれていないタンパク質のＭＳＡコンセンサス依存分析によって、全体的な安定性への各断片の付加的寄与を決定することで同定できる。ＳＣＨＥＭＡ組換えは、耐性配列の交換が行われても、重要な機能的残基の保存により、キメラが生物学的機能を保持し、高い配列の多様性を示す。
【００７５】
従って、ここに様々な実施形態によって示すように、本発明は、親ドメインのキメラを含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドであり、上記のように、親鎖または結果として生じるキメラのコード配列が、Ｃ→Ｓ置換を含むように修飾することができるものを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、異なる親ＣＢＨ ＩＩタンパク質からのＮ末端からＣ末端までの複数のドメインを有するキメラを含む：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１アミノ酸残基；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２アミノ酸残基；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３アミノ酸残基；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４アミノ酸残基；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５アミノ酸残基；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６アミノ酸残基；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７アミノ酸残基；および断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８アミノ酸残基を含み；
ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４または配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８または配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７または配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４または配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１または配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６または配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１６を含み；ｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４または配列番号６を有する。
【００７６】
以下のドメインの参照を用いて、Ｔａｂｌｅ１に示すように、多くのキメラ構造が作成された。
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩに関して測定された６４．８ＣのＴ５０値を予測するＴ５０値を有する１，５８８ＣＢＨ ＩＩキメラ配列。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
【表７】
【００８２】
上記表において、それぞれの桁は、キメラＣＢＨ ＩＩポリペプチドのドメインを指す。数字は、ドメインが由来する親鎖を示す。例えば、配列１２１１１１３１を有するキメラＣＢＨ ＩＩキメラポリペプチドは、ポリペプチドがＮ末端からＣ末端に向かって：配列番号２（「１」）のアミノ酸配列約１からｘ１に結合した配列番号４（「２」）のアミノ酸配列約ｘ１からＸ２、これに結合した配列番号６（「３」）のアミノ酸配列約ｘ２からｘ３、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ３からｘ４、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ４からｘ５、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ５からｘ６、これに結合した配列番号６（「３」）のアミノ酸配列約ｘ６からｘ７、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ７からｘ８（例えばＣ末端）を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＣＢＨ ＩＩポリペプチドは、以下からなる群から選択されるキメラ断片構造を有する。
【００８４】
【表８】
【００８５】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２，４または６の野生型ポリペプチドと比較して改良した熱安定性を有する。ポリペプチドの活性は、実施例に記載されているように、１つの、または組み合わされた任意の基質を用いて測定することができる。当業者にとって明白であるように、実施例に記載されたものに例示される化合物のクラスの他の化合物を試験することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、参照配列のアミノ酸配列に様々な変更を加えた形態であってもよい。この変更は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠如または挿入であってもよい。この変更が置換である場合、変更は保存、非保存の置換、または保存、非保存の組み合された置換の組み合わせである。例えば、キメラは、配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置でＣ→Ｓ置換を含むことができる。
【００８７】
従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮ末端からＣ末端において一般的な構造を含むことができる：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；ならびに断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８アミノ酸残基を含み、１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有する；
【００８８】
従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までの一般的な構造を含むことができ、ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４または配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８または配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７または配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４または配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１または配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６または配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１６を含み；ｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４または配列番号６を有し、キメラは以下のＴａｂｌｅ１のようなアルゴリズムを有し、キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１に相当するＣ→Ｓ置換を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換される置換基の数は２，３，４，５，６，８，９，１０個またはこれを超える数となり得る（例えば、１０−２０，２１−３０，３１−４０および同類のアミノ酸置換）。
【００９０】
いくつかの実施形態において、機能的なＣＢＨ ＩＩポリペプチドは、例えば実施例に記載の基質に対して、高い熱安定性を有すると共に、セルラーゼ活性を有することができ、また参照するセロビオヒドラーゼまたはその断片に一致する一定のレベルのアミノ酸を有することもできる。参照とする酵素またはその断片は、野生型（例えば天然発生）または改変された酵素由来のもとを使用できる。従って、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への一般的な構造を含むことができる：
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８のアミノ酸残基で少なくとも５０−１００％一致がある配列を含み；
ｘ１は、配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７、配列番号４もしくは配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は、配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４、配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１９，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１９，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は、配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７、配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は、配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４、配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は、配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１、配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は、配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６、配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１８；ｘ８は、ポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が、配列番号２、配列番号４または配列番号６を有するものであり、キメラは以下に記載された表１のようなアルゴリズムを有し、キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置にＣ→Ｓ置換を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドのそれぞれの断片は、それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６の（断片１）、（断片２）、（断片３）、（断片４）、（断片５）、（断片６）、（断片７）および（断片８）を参照とする断片と比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える配列の一致を有することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異体は、配列番号２，４または６の野生型ポリペプチドと比較して改良した熱安定性を有するものであり；キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置のＣ→Ｓ置換を含む。
【００９３】
ここに記載のキメラ酵素は、様々な形態、例えば溶解物、粗抽出液または精製物として調製することができる。ポリペプチドは、適切な溶液に溶解することができて；粉末、例えばアセトン粉末（安定剤存在下、または不存在下で）として調製することができるか、凍結乾燥物として調製することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは単離されたポリペプチドであることができる。
【００９４】
いくつかの実施形態においてポリペプチドは、アレイの形態とすることができる。酵素は、溶解した状態で、例えばミクロタイタープレートのウェル内の溶液としたり、または基質上に固相化したりすることができる。基質としては、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミドならびにその共重合体、およびそのグラフトから構成することができる、固体基質または多孔性基質（例えば膜）が挙げられる。固体サポートは、無機、例えばガラス、二酸化ケイ素、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくはプラチナ等の金属としてもよい。基質の構造は、ビーズ、球体、粒子、顆粒剤、ジェル、膜または面の形態としてもよい。面は平ら、実質的に平らまたは非平面とすることができる。固体サポートは、多孔性であっても無孔であってもよく、膨張性であっても非膨張性であってもよい。固体サポートは、ウェル、くぼみ、または他の容器、入れ物の構成とでき、その特性および場所を変えることもできる。複数のサポートは、試薬のロボットデリバリー、または検出法および／または計測器がアドレス可能な、多様な箇所のアレイ上に構成することができる。
【００９５】
本発明は、ここに開示した改変ＣＢＨ ＩＩポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組み換え型ポリヌクレオチドのため、遺伝子発現を制御する１つ以上の異種の調節または制御配列に作動可能なように結合することができる。ＣＢＨ ＩＩキメラをコード化する異種ポリヌクレオチドを含む発現構造は、ポリペプチドを発現するため、適切な宿主細胞内に導入することができる。
【００９６】
ＣＢＨ ＩＩキメラ酵素の特定の配列の知識を有する場合（例えばキメラＣＢＨ ＩＩの断片構造）、ポリヌクレオチド配列は、
形成されるＣＢＨ ＩＩキメラ酵素のアミノ酸配列は、当業者にとって自明の形状となるであろう。様々なアミノ酸に相当するコドンの知識とポリペプチドのアミノ酸配列の知識とを組み合わせれば、当業者は、本発明のポリヌクペプチドをコード化する異なるポリヌクレオチドを作成することが可能である。従って、本発明は、コドンの組み合わせを選択することによって、いくつかの可能性のある構成のポリヌクレオチドの変異体を想起させるものであり、そのような変異体はすべて、ここに記載のポリペプチドとして、ここに明確に開示されているものと理解されるべきである。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ここに記載のポリペプチドをコード化するが、参照するキメラポリペプチドのＣＢＨ ＩＩ変異体をコード化し、上記のようにＣ→Ｓ置換（例えば、ポリペプチドまたはキメラは、配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置のＣ→Ｓ置換を含む）を有するポリペプチドと、ヌクレオチドレベルで、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列の一致を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するため、様々な方法にて処理することができる。ベクターへの挿入前に単離されたポリヌクレオチドを処理する工程は、発現ベクターによっては、必要とされ、、または必須とされる。組み換えＤＮＡ法を用いて、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、従来技術において周知である。この技術に対する教示は、Sambrook et al . , 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007に提供されている。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に関する制御配列に機能的に関連している。いくつかの実施形態において、制御配列は、細胞外または細胞内のポリペプチドをコード化し、宿主細胞に相同性または異種性のいずれかの遺伝子から得られる適当なプロモーター配列とすることができる。細菌宿主細胞に対して、本発明の核酸構造の転写を誘導するのに適切なプロモーターとしては、大腸菌ラクトースオペロン、枯草菌ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスメガテイルムキシロースを用いる遺伝子（例えばRygus et al., (1991) Appl . Microbiol. Biotechnol. 35:594-599; Meinhardt et al., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol . 30:343-350）、原核生物βラクタマーゼ遺伝子（Villa- Kamaroff et al., (1978) Proc . Natl Acad. Sci . USA 75: 3727-3731）ならびにｔａｃプロモーター（DeBoerその他, (1983) Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25）が挙げられる。様々な適切なプロモーターが、Scientific American, 1980, 242:74-94の"Useful proteins from recombinant bacteria";およびSambrookその他の文献に記載されている。
【０１００】
いくつかの実施形態において、制御配列はまた適切な転写停止（ターミネーター）配列であり、宿主細胞によって転写を停止することが認識される配列としてもよい。停止配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の３’末端に作動可能に結合している。選択した宿主細胞において機能的なあらゆるターミネーターが使用可能である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、制御配列は、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の５’末端に作動可能に結合される。選択した宿主細胞において機能的なあらゆるリーダー配列が使用可能である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコード化するシグナルペプチドコード領域としてもよく、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へ誘導する。核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に分泌されたポリペプチドをコード化するコード領域の断片と翻訳リーディングフレーム内の、天然に結合したシグナルペプチドコード領域を含むことができる。或いは、コード配列の５’末端は、コード配列とは異質のコード領域のシグナルペプチドを含むことができる。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない部分において、異質のシグナルペプチド領域が必要とされる。細菌の宿主細胞に関する効果的なシグナルペプチドのコード領域は、バチルス属ＮＣＩＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモファイルスαアミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス・スブチリシン、バチルス・リケニフォルミス・βラクタマーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコードとしてもよい。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, (1993) Microbiol Rev 57: 109-137に記載されている。
【０１０３】
さらに、本発明は、導入される宿主の種類に応じて、形成されたＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む組み換え型発現ベクター、および、例えばプロモーターおよびターミネーター、複写原点等のうちの１つ以上の、発現制御領域について示す。発現ベクター作成において、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に結合するようにベクター内に局在する。
【０１０４】
組み換え型発現ベクターは、有効に組み換え型ＤＮＡ方法の対象として使用可能であり、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすあらゆるベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）を使用できる。通常、ベクターの選択肢は、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存する。ベクターとしては、線状または閉鎖環状プラスミドを使用してもよい。
【０１０５】
発現ベクターとしては、独立した複製ベクター、即ち染色体複製から独立して複製される染色体外のものとして存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外の要素、ミニ染色体または人口染色体が使用可能である。ベクターは、自己再生を確実にするためのあらゆる手段を含むことができる。或いは、ベクターは宿主細胞内に導入されたとき、ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものを含むことができる。さらに宿主細胞のゲノム内に導入するため、全ＤＮＡを共に含む単一のベクター、プラスミドまたは２つ以上のベクターまたはプラスミドまたはトランスポゾンが使用可能である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の選択を容易とする、１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーは、殺生物性またはウイルス抵抗性、重金属抵抗性、独立栄養体への原栄養性、等を与える遺伝子産物である。細菌性の選択可能なマーカーの例は、枯草菌もしくはバチルス・リケニフォルミスからのｄａｌ遺伝子、抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）への抵抗性またはテトラサイクリンへの抵抗性を与えるマーカーである。他の実用的なマーカーは、当業者にとって明白であろう。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明はＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞中におけるポリペプチドの発現に関する１つ以上の制御配列に作動可能に結合されるものを含む。本発明の発現ベクターによってコード化されるポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、従来技術において周知であり、大腸菌および巨大菌等の細菌細胞；酵母細胞、ＣＨＯ細胞等の真核生物細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびボーズ・メラノーマ細胞等の動物細胞；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の適切な宿主細胞は、当業者にとって明白であろう。上記宿主細胞への適切な培養培地および成長条件は、従来技術において周知である。
【０１０８】
本発明のＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドは、従来技術において周知の方法を用いて作成することができる。ポリヌクレオチドは、例えばSambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007に提供されるような組み換え技術によって合成することができる。酵素をコード化するポリヌクレオチドまたは増幅のためのプライマーについても、既知の合成方法、例えばBeaucage et al., (1981) Tet Lett 22:1859-69に記載のホスホラミダイト法、またはMatthes et al., (1984) EMBO J. 3:801-05に記載の方法のような、標準的な固相法によって調製可能であり、通常、これらの方法は、自動化合成法として実施される。さらに実質的なあらゆる核酸は、様々な商業的供給源、例えばThe Midland Certified Reagent Company（テキサス州ミッドランド）、The Great American Gene Company（カリフォルニア州ラモナ）、ExpressGen Inc.（イリノイ州シカゴ）、Operon Technologies Inc.（カリフォルニア州アラメダ）等の多様な供給原から入手可能である。
【０１０９】
宿主細胞内に発現する改変酵素は、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、クロマトグラフィーおよび親和性分離（例えば、基質に結合した抗体）等の既知の技術のタンパク質精製手段を用いて、細胞および／または培養培地から回収することができる。細菌、例えば大腸菌からのタンパク質を溶解するために適切な溶液および高効率抽出液が、ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ社から商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＢＴＭとして市販されている。
【０１１０】
ポリペプチドの分離に関するクロマトグラフィー技術は、とりわけ逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件が、実際の荷電、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存することは、当業者にとって明白である。
【０１１１】
キメラポリペプチドの組み換えおよび合成に係るＳＣＨＥＭＡの開示は、本明細書およびOteyその他, (2006), PLoS Biol. 4(5): ell2; Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693；２００８年２月１日に出願された米国特許出願番号第１２／０２４，５１５号；２００８年２月７日に出願された米国特許出願番号第１２／０２７，８８５号の実施例に記載されており、その内容の全てをここに参照して取り込む。
【０１１２】
上記のように、ポリペプチドは、様々な応用、例えばとりわけ生物燃料生成、セルロースの分解等に使用することができる。
【０１１３】
以下の実施例は、本発明についての付加的な説明をするものであり、前記開示または添付の特許請求の範囲に制限するものではない。
【実施例】
【０１１４】
＜ＣＢＨ ＩＩ発現プラスミドの作成＞
酵母発現ベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αｓｓ内で、ＣＢＨ ＩＩ酵素をコード化する親およびキメラ遺伝子をクローン化した（図６）。親およびキメラＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインをコード化するＤＮＡ配列を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドンバイアスで、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（ＤＮＡ２．０）およびＤＮＡ２．０を用いた合成により設計した。ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメイン遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで切断して、ベクター中のＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位の間にライゲーションし、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に形質転換した。ＣＢＨ ＩＩ遺伝子は、プライマーＣＢＨ２Ｌ(5'- GCTGAACGTGTCATCGGTTAC-3' (配列番号９)およびＲＳＱ３０８０(5'- GCAACACCTGGCAATTCCTTACC-3' (配列番号１０))を用いて配列決定した。Ｃ末端Ｈｉｓ６親およびキメラＣＢＨ ＩＩ構造は、ＣＢＨ ＩＩ遺伝子を前方プライマーCBH2LPCR (5'' -GCTGAACGTGTCATCGTTACTTAG-3' (配列番号１１))と、Ｈｉｓ６オーバーハングと終止コドンを伴う適切なＣＢＨ ＩＩ遺伝子に相補的な逆方向プライマーを増幅することによって作成された。ＰＣＲ産物は、上記のようにライゲーションされ、形質変換され、配列決定された。
【０１１５】
＜Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＣＢＨ ＩＩ酵素の発現＞
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌ＹＤＲ４８３Ｗ ＢＹ４７４２ （Ｍａｔα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｌｙｓ２Δ０ ｕｒａ３Δ０ ΔＫＲＥ２、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４０１４３１７）は、ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＩＩ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してコンピテント化され、プラスミドＤＮＡを用いて形質転換され、合成ウラシルを欠く寒天培地上に播種された。コロニーは、２０μｇ／ｍＬトリプトファンを添加した５ｍＬ合成デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地（２０ｇ／Ｌデキストロース、６．７ｇ／Ｌデフコ酵母窒素塩基、５ｇ／Ｌバクトカザミノ酸、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．５６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）に入れ、一晩、３０℃、２５０ｒｐｍで培養した。５ｍＬ培養物は、２５０ｍＬチューンエアーフラスコ（Ｓｈｅｌｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の４０ｍＬ ＳＤＣＡＡで希釈し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間振盪した。培養物を遠心分離し、清をｔ１／２分析のため、３０ｋＤａ ＰＥＳ膜を取り付けたＡｍｉｃｏｎ限外ろ過膜を使用して、５００μＬにまで濃縮した。濃縮した上清は、１ｍＭフェニルメチルスルホニルおよび０．０２％ＮａＮ３に供した。Ｈｉｓ６タグを付けたＣＢＨ ＩＩタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元のプロトコールに従って精製し、次いで、タンパク質をＺｅｂａ−Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中に交換した。精製されたタンパク質濃度を、基準としてＢＳＡとＰｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質試薬を使用して測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、濃縮された培養上清２０μＬまたは精製されたＣＢＨ ＩＩ酵素約５μｇのいずれかを、７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上に加え、シンプリーブルーセーフステイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによって実行した。ＣＢＨ ＩＩ上清または精製されたタンパク質は、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、１時間、３７℃、製造元のプロトコールに従って処理した。濃縮された酵母培養上清中のＣＢＨ ＩＩ酵素活性は、３７．５μＬの濃縮された培養上清を３７．５μＬ ＰＡＳＣに添加し、２時間５０℃でインキュベーションして測定した。形成された還元糖等価物は、以下のようなソモギ・ネルソン分析によって測定した。
【０１１６】
＜半減期、特異的活性、ｐＨ活性および長期セルロース加水分解の測定値＞
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。基質へのＣＢＨ ＩＩ酵素活性を向上させるため、ＰＡＳＣを１０ｇ／Ｌの濃度で５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中の１０ｍｇ／ｍＬＡ． ｎｉｇｅｒエンドヌークレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃で１時間プレインキュベーションした。エンドグルカナーゼを、９５℃まで加熱し、１５分間処理することで不活性化し、ＰＡＳＣを２回、５０mＭ酢酸緩衝剤を用いて洗浄し、脱イオン水中に１０ｇ／Ｌとなるように再懸濁した。
【０１１７】
ＣＢＨ ＩＩ酵素ｔ１／２は、以下に記載するように、処理されたＰＡＳＣとインキュベーションした後、濃縮したＣＢＨ ＩＩ発現培養上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ソモギ・ネルソン還元糖分析で測定されたＡ５２０が０．５となる濃度でｐＨ４．８）に添加することによって測定した。３７．５μＬのＣＢＨ ＩＩ酵素／緩衝剤の混合物を、６３℃の水浴で不活性化した。不活性化後、３７．５μＬのエンドグルカナーゼ処理したＰＡＳＣを添加し、２時間、５０℃の条件下で加水分解をで実施した。反応上清は、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳプレート（ミリポア）を通してろ過した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて得られたソモギ・ネルソン分析ｌｏｇ（Ａ５２０）値を、バックグラウンドの吸光度について修正処理を施し、マイクロソフト・エクセルを使用して、時間軸に対してプロットすることで、線形回帰から得られるＣＢＨ ＩＩ酵素の半減期のデータを得た。
【０１１８】
特異的活性測定のため、精製ＣＢＨ ＩＩ酵素をＰＡＳＣに添加し、ＰＡＳＣの最終反応量が５ｇ／Ｌで、ＣＢＨ ＩＩ 酵素濃度が３ｍｇ／ｇであり、酢酸ナトリウム濃度２５ｍＭ、ｐＨ４．８のＰＡＳＣを得た。５０℃水浴中でのインキュベーションを２時間行い、還元糖濃度を測定した。ｐＨ／活性特性の測定のため、精製ＣＢＨ ＩＩ酵素を、７５μＬ反応容積中の濃度３００μｇ／ｇのＰＡＳＣに添加した。反応は、１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム／１２．５ｍＭリン酸ナトリウムの緩衝液中で、５０℃で１６時間実施し、還元糖濃度を測定した。長時間のセルロース加水分解測定は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、２０ｍＭ ＮａＣｌの、１ｇ／Ｌ濃度の処理済みＰＡＳＣ３００μＬを用いて行った。精製ＣＢＨ ＩＩ酵素を、１００μｇ／ｇの濃度でＰＡＳＣに添加し、還元糖測定の４０時間前に水浴中にて反応させた。
【０１１９】
ＣＢＨ ＩＩ酵素をコードする５つの親遺伝子候補を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドンバイアスを用いて合成した。５つ全ては、１−８９残基がセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）、弾性リンカー領域およびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ触媒ドメインの５つのＮ末端残基に相当する、Ｎ末端コード配列を含む。Ｈｕｍｉｃｏｌ ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣｈａｅｔｏｍｉｕｎ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの２つのＣＢＨ ＩＩ酵素候補は、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌによる３つの他のものより比較的高いレベルで、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから分泌された（図１）。３つのわずかに発現されている候補の親に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンドは、認識困難なため、濃縮培養上清における活性分析は、活性型セルラーゼの存在を確認するため、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）とインキュベートされたものを用いて実施された。図１に示す形成された還元糖からの値は、Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ＣＢＨ ＩＩ以外の全ての酵素に関して、濃縮Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養上清における活性型ＣＢＨ ＩＩの存在が確認された。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ配列は、最も産業的に関連したＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａからの菌ＣＢＨ ＩＩ酵素と組み合わせて選択した。触媒ドメインのそれぞれの配列の一致は、６４％（１：２）、６６％（２：３）および８２％（１：３）であり、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓは親１、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａは親２、Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍは親３とする。これらそれぞれの触媒ドメインは、３６０，３５８，３５９アミノ酸残基を含む。
【０１２０】
産業使用のためにセルラーゼを生成するのに最も頻繁に使用される生命体である糸状菌Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａにおける異種タンパク質発現は、酵母と比較して非常に困難である。組換え型セルラーゼ活性を減少することが報告されている、高度なグリコシル化を最小限にするため、組換え型ＣＢＨ ＩＩ遺伝子をグリコシル化機能を欠損させたｄＫＲＥ２ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で発現させた。該株は、野生株と比較して、より短いマンノースオリゴマーがＮ−結合型およびＯ−結合型の両方のグリコシル化サイトに結合すると考えられ、これは野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａのＣＢＨ ＩＩ 酵素のグリコシル化に極めて類似している、高マンノース構造を取り除くためのＥｎｄｏＨ処理を伴う条件、および伴わない条件において、ＣＢＨ ＩＩタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を行ったところ、ＥｎｄｏＨ処理によっては、前記菌から分泌された酵素の電気泳動的な可動性が上昇しないことが判明し、野生型Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌が組換え型タンパク質のグリコシル化部位に結合する分岐型マンノース部分を欠くことを確認した。
【０１２１】
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓの高分解性の構造（ｐｄｂ）ＳＣＨＥＭＡのテンプレートとして使用して、組み換えに応じて引離される接触を同定した。ＲＡＳＰＰは、それぞれ１５未満の＜Ｅ＞を有する４つの候補ライブラリーを返した。全ての候補ライブラリーは、以前作成されたキメラライブラリーより低い＜Ｅ＞を示し、折り畳まれた活性型キメラの許容可能な部分は、比較的高い＜ｍ＞を有して得られることが示された。キメラ配列の多様性は、最も大きな＜ｍ＞＝５０を導くようなブロックの境界を選択すると、最大となった。この設計のためのブロックは、図２Ｂに例示され、Ｔａｂｌｅ２に詳細に示される。
Ｔａｂｌｅ２：親ＣＢＨ ＩＩ酵素触媒ドメインのためのＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列アライメント。ブロック２，４，６および８は、ボックスおよびグレーの斜線で示す。ブロック１，３，５および７は、されていない（Ｈ． ｉｎｓｏ：配列番号２、Ｈ． Ｊｅｃｏ：配列番号４およびＣ． Ｔｈｅｒ．：配列番号６）。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインは、８つの螺旋がバレル周縁を規定し、７つの平行のβシートが活性部位を形成するα／βバレル構造を有する（図２Ａ）。２つの延長したループは、活性部位上にルーフを形成し、加水分解中に基質セルロース鎖が通過する通路を形成する。７つのブロック境界のうちの５つは、２次構造の要素の間に収まり、ブロック４は連続的なα螺旋の中央部分から開始し、終結する（図２Ａ、２Ｂ）。ブロック間の側鎖接触の大多数は、初期構造において調節可能なブロック間に生じる（図２Ｃ）。
【０１２４】
４８個のキメラ遺伝子のサンプルセットは、１つの親由来の５つのブロックと、残り２つのうちの１つまたは両方の親由来の３つのブロックを有する、１６個のキメラの３セットとして設計された（Ｔａｂｌｅ３）；それぞれの親の表記がそれぞれのブロックの位置で等しくなるように、配列を選択した。相当する遺伝子を合成し、発現させた。
Ｔａｂｌｅ３：サンプルセットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの配列
【０１２５】
【表１０】
【０１２６】
４８個のサンプルセットのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのうち２３個の濃縮培養上清は、ＰＡＳＣに対して加水分解活性を示した。これらの結果は、６，５６１個のＣＢＨ ＩＩキメラ配列のうち数千（例えば、Ｔａｂｌｅ１を参照のこと）が活性型酵素をコード化することを示す。２３の活性型ＣＢＨ ＩＩサンプルセットのキメラは、顕著な配列多様性を示し、最も近い親の配列と、少なくとも２３および３６、５４および１２３相当のアミノ酸置換を有する。それらの平均突然変異レベル＜ｍ＞は３６である。
【０１２７】
Ｍｅｙｅｒらが、Ｅ、ｍおよびキメラが折り畳まれて活性を有する確率の間の相関を見出したように、同類の相互関係が、サンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラに関して存在するかの分析を実施した。ＰＡＳＣ活性の分析によって測定されるように、濃縮発現培養上清におけるＣＢＨ ＩＩ酵素活性の値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるＣＢＨ ＩＩバンドの強度に相関した（図１）。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ親と同様に、活性はいくつかのＣＢＨ ＩＩキメラに関して検出できないゲルバンドで検出できる。ゲルバンドは示したが、活性を欠失するＣＢＨ ＩＩキメラの存在が観察された。ＣＢＨ ＩＩキメラが活性型の形状で分泌される確率は、Ｅおよびｍの双方に逆相関した。
【０１２８】
熱不活性の半減期（ｔ１／２）は、６３℃における親および活性型キメラのＣＢＨ ＩＩ酵素の濃縮培養上清について測定された。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのＣＢＨ ＩＩ親の半減期は、それぞれ９５，２，２５分であった。活性型サンプルセットのキメラは、１分未満から３，０００超の幅広い半減期を示した。２３個の活性キメラのうちの５つは、最も熱安定のある親であるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩを超える半減期を有した。
【０１２９】
ＣＢＨ ＩＩキメラの半減期のための予測定量的モデルの作成を試みる際、５つの異なる線形回帰データのモデリングアルゴリズムを使用した（表４）。それぞれのアルゴリズムを使用して、それぞれのサンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラおよび親のｌｏｇ（ｔ１／２）のブロック組成物に関するモデルを作成した。これらのモデルは、ブロックのｌｏｇ（ｔ１／２）への寄与を定量化した、熱安定性重量値を構築した。全て５つのモデリングアルゴリズムについて、この工程が、２つのランダムに選択された配列を省略して１，０００回繰り返され、それぞれのアルゴリズムは、２４個のブロックそれぞれに１，０００重量値を示した。それぞれのブロックの熱安定性重量値について、平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。それぞれのモデルアルゴリズムの予測精度は、それぞれのモデルが省略された配列のｔ１／２をどれだけ正確に予測できるかで評価した。１，０００アルゴリズムの繰り返しについての測定値および予測値の間の相関を、モデルアルゴリズムの相互検証スコアとする。５つのモデル全てについての相互検証スコア（Ｘ−ｖａｌ）は、０．０５７以下であり（Ｔａｂｌｅ４）、線形回帰モデリングが、この小さな２３個のキメラｔ１／２データセットの定量的ＣＢＨ ＩＩキメラの半減期予測については適応できないことを示した。
Ｔａｂｌｅ４：５つの線形回帰アルゴリズムのＣＢＨ ＩＩ酵素キメラのブロック安定性スコアへの使用のための相互検証値。アルゴリズムの省略：リッジ回帰（ＲＲ）、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）、サポートベクターマシン回帰（ＳＶＭＲ）、リニアプログラミング・サポートベクターマシン回帰（ＬＰＳＶＭＲ）およびリニアプログラミングブースティング回帰（ＬＰＢｏｏｓｔＲ）。
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】
線形回帰モデリングを使用して、ブロックを質的に安定、不安定または中立に分類した。それぞれのブロックのキメラの熱安定性への影響は、それぞれの回帰アルゴリズムによって測定される熱安定性への寄与を提示するスコアリングを使用して評価した。それぞれのアルゴリズムに関して、中立から１ＳＤを超える熱安定性重量値を有するブロックは、「＋１」として記録し、中立から１ＳＤ以内の熱安定性重量値を有するブロックは０とし、中立から１ＳＤを超えて低い熱安定性重量値を有するブロックは、「−１」として記録した。それぞれのブロックに関する「安定性スコア」は、それぞれ５つのモデルからの１，０、−１の安定性スコアを合計することによって得た。Ｔａｂｌｅ５は、それぞれのブロックに関するスコアを概説する。ブロックＩ／親１（Ｂ１Ｐ１）、Ｂ６Ｐ３、Ｂ７Ｐ３およびＢ８Ｐ２は、比較的高い安定性効果を有するものとして同定された、一方、Ｂ１Ｐ３、Ｂ２Ｐ１、Ｂ３Ｐ２、Ｂ６Ｐ２、Ｂ７Ｐ１、Ｂ７Ｐ２およびＢ８Ｐ３は、最も強くブロックを不安定化することを見出した。
Ｔａｂｌｅ５：５つの線形回帰アリゴリズム１によって生じたサンプルセットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラに関する質的なブロック分類。スコア＋１は、熱安定性重量を有するブロック（キメラの熱安定性へのブロック寄与に関する無次元測定）であり、中立から１ＳＤを超えるもの（安定性）を示し、スコア０は、中立から１ＳＤ内の重量値であるブロックを示し、−１は中性から１ＳＤ超低い重量値を有するブロックを示す（不安定性）。
【０１３２】
【表１２】
【０１３３】
ＣＢＨ ＩＩ酵素キメラをコードする第２セットの遺伝子を合成し、予測された安定ブロックを評価して、最も安定な親より熱安定のあるセルラーゼを同定した。この検証セットに含まれる２４個のキメラ（Ｔａｂｌｅ６）は、最も不安定であると予測される７つのブロックが全くなく、４つの最も安定なブロックに富んでいた。後者のブロックの発現は、安定なスコアに偏っていた。さらに「ＨＪＰｌｕｓ」１２２２２３３２キメラは、予測された最も安定なブロックをＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素内（親２）に置換することによって作成された。
Ｔａｂｌｅ６：２４個の検証セットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの配列中の９つは、活性型で発現した。
【０１３４】
【表１３】
【０１３５】
２４個の検証のセットのキメラの９つのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現培地の濃縮上清は、ＨＪＰｌｕｓキメラと同様に、ＰＡＳＣに対して活性を示した（Ｔａｂｌｅ６）。活性が検出されていない１５個のキメラのうちの９つは、ブロックＢ４Ｐ２を有した。初期のサンプルセットのＢ４Ｐ２を含有する１６個のキメラのうち１つのみが、ＰＡＳＣに対して活性を示した。キメラセットおよびＨＪＰｌｕｓの両方を合計して、２６個のキメラのうち２つのみが活性化していて、この特定のブロックがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける活性化セルラーゼの発現を阻害することを示した。
【０１３６】
検証セットからの１０個の機能的キメラＣＢＨ ＩＩ酵素の安定性を評価した。安定酵素は既に５０時間を越える半減期を有したため、６３℃、１２時間の熱不活性化後のＰＡＳＣに対する残留加水分解活性を、測定の予備的評価として使用した。この１２時間のインキュベーションによって、サンプルセットの最も熱安定性のあるキメラである１１１１３１３２の活性において、測定可能な減少が生じ、不活性型の熱安定性のあるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩを完全に不活性化した。全１０個の機能的な検証セットのキメラは、それらの活性として最も安定な親であるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩより多い活性を保持していた。
【０１３７】
精製された酵素を使用する選択された熱安定性のあるキメラの活性を分析した。親ＣＢＨ ＩＩ酵素および３つの熱安定性のあるキメラ（最も熱安定性のあるサンプルセットのキメラ１１１１３１３２、最も熱安定性のある検証セットのキメラ１３３１１３３２）およびＨＪプラスキメラ１２２２２３３２を、Ｃ末端Ｈｉｓ６精製タグとともに発現させ、精製した。活性試験中のＣＢＨ ＩＩ酵素の熱不活性化を最小限にするため、２時間（比較的短い時間）、５０℃、ｐＨ４．８でのＰＡＳＣ基質とのインキュベーションを実施した。Ｔａｂｌｅ３に示すように、親およびキメラＣＢＨ ＩＩの特異的活性は、最も活性のあるＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａからの親ＣＢＨ ＩＩ酵素のうちの４つの要素内にあった。ＨＪプラスの特異的活性は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ以外の全ての被験のＣＢＨ ＩＩ酵素を超えていた。
【０１３８】
幅広い範囲のｐＨ／活性特性により、ＣＢＨ ＩＩキメラの広範囲にわたる潜在的なセルロース加水分解条件下での使用を可能とするためには、セルラーゼ活性のｐＨ依存性が重要である。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩは、最適化された活性をｐＨの範囲４から６で有することが観測され、一方この範囲外ではその活性が著しく現象することが観察されてきた（文献１６）。図４は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩ酵素ならびに全３つの精製された熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラが、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩのものより相当広いｐＨ／活性特性を有することを示した。Ｌｉｕらは、Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩに対してｐＨ４を最適条件として報告したが、ここでの組み換え型酵素の最適なｐＨは、７付近であった。天然Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩは、約ｐＨ９で最大活性、ｐＨ４で最大活性の約６０％を示す幅広いｐＨ／活性特性を有する。同様の幅広い特性が、組み換え型酵素について観測された。ＨＪプラスキメラは、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと比較してより幅広いｐＨ／活性特性を有し、他の２つの親ＣＢＨ ＩＩ酵素と同様のｐＨ依存性を示した。
【０１３９】
高温での活性の達成と、長いタイムインターバルを超えた活性の維持は、改変した高安定性ＣＢＨ ＩＩ酵素を実現するための２つの初期目標である。セルロース加水分解における熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラの性能を、温度範囲全体で、４０時間のインターバルで試験した。図５に示すように、３つ全ての熱安定性キメラは、親ＣＢＨ ＩＩ酵素より比較的高い温度でＰＡＳＣに活性を有した。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩは、５７℃長ではＰＡＳＣを加水分解せず、安定なＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素は６３℃超ではＰＡＳＣを全く加水分解しなかったが、キメラは７０℃で活性を保持した。。長時間のセルロース加水分解分析におけるＨＪプラスの活性は、各々の最適な温度における全ての親の活性を上回った。
【０１４０】
ＣＢＨ ＩＩライブラリーは、いくつかの理由により、崩壊の可能性が比較的低い。ＣＢＨ ＩＩ親配列の高い相同性に加えて、ＣＢＨ ＩＩ折り畳みバレルの立体的構造は、組み換えによって分離することができる長範囲の接触の数を制限する。ブロック間の接触（４．５オングストローム範囲内の重原子）は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ構造１ｏｃｎに由来する接触マップ全体の２７％（５０３／１８３１）のみを含む。残基の組み合わせに係る接触は、キメラにおいてのみ計数可能であり、ブロック内の総計は２３％まで減少した（６８／２９４）。さらに、これら相互作用のほとんどは、タンパク質の表面上の残基間に生じ、溶媒スクリーニングの可能性は、さらに残基間の相互作用の飛躍的な分離の可能性を減少させる（図１４ａ）。１つの例外として、位置１７６−位置２５６間の埋没した相互作用が、図１４ｂに示す。この部位で、Ｂ６Ｐ２と、Ｂ５Ｐ１またはＢ５Ｐ３のいずれかとを有するキメラは、Ｍｅｔ１７３：Ｔｒｐ２５３の対を有する（親のＭｅｔ１７６：Ｐｈｅ２５６の対、またはＬｅｕ１７３：Ｔｒｐ２５３の対と比較して大きなアミノ酸）。しかしながら、親の結晶学的なモデルの精査により、Ｔｒｐ２５３側に位置するタンパク質バックボーン部の可動性や、Ｍｅｔ側鎖の内因的な可撓性のため、この部位における立体衝突は生じにくいと考えられる。特に、１つの特徴的なキメラは、このパターン（１３３３３２３２）に適合し、回帰モデル適合性（６８℃）よれば、親（６７℃）よりも安定である。
【０１４１】
カップリングを生じる他のメカニズムは、ブロック構造の相違であるが、これはブロック接点での新規の残基対の存在に依存するものではない。そのかわり、親配列の相違により、内因性ブロック構造は、モジュール・ブロックの移動を妨げて、多様化することができる。ＣＢＨ ＩＩライブラリーの場合、親の対の高い配列相同性の値（８２％、６６％および６４％）において、構造の偏差は軽度とすることができる（＜１オングストロームＲＭＳＤ）。この可能性は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの結晶学的な構造を比較することによって、評価することができる（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩは結晶構造を欠如しているが、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓと８２％の相同性がある）。それぞれの親からの構造による配列ブロック（１ｏｃｎおよび１ｃｂ２）において、αカーボンＲＭＳＤ値は低くなる（０．５，０．５，０．６，０．５，０．３，０．７，０．３および０．４Ａ ＲＭＳＤ）。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ上に重ねられたＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａブロックを、補足図５ｃに示す。背景に依存した効果を確認するため、対立する宿主構造上にそれぞれアラインされたブロックをスプライシングして、シリコ構造（ｓｉｌｉｃｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の組み換えを実行した。ブロック６および７の間にＡｓｎを挿入して（図１４Ｄ）Ｂ７Ｐ２（１１１１１１２１）を使用した場合、軽度の衝突（２．６５オングストローム）を除き、全ての単一ブロック置換キメラ（例えば１１１１２１１１または２２１２２２２２）に関する衝突しない構造モデルを作成することが可能である（αカーボン＞３オングストローム間隔）。
【０１４２】
様々なブロック／断片のキメラの安定性への寄与を決定するためにさらなる実験を実施し、熱安定性および／またはｐＨ安定性を改良した。ＣＢＨ ＩＩ酵素をコードする親およびキメラ遺伝子を、酵母発現ベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αｓｓ内にクローン化し、合成デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地中で発現させた。アビセル活性分析のため、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培養上清は、１ｍＭフェニルメチルスルホニルおよび０．０２％ＮａＮ３溶液にして、濃縮せずに使用した。濃縮ＳＤＣＡＡ酵母培養上清中のＣＢＨ ＩＩ酵素活性を、３７．５μＬのＰＡＳＣおよび２２５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８に添加することで濃縮培養上清を希釈し、２時間、５０℃でインキュベーションして測定した。形成した還元糖の等量を、ソモギ・ネルソン分析によって測定した。
【０１４３】
ＣＢＨ ＩＩ酵素のＴ５０値を、エンドヌークレアーゼ処理したＰＡＳＣとインキュベーションした後、濃縮したＣＢＨ ＩＩのＳＤＣＡＡ発現培養上清を５０ｍM酢酸ナトリウムに添加し、ソモギ・ネルソン還元糖分析の測定値Ａ５２０が０．５となる濃度でｐＨ４．８となるように調整して測定した。２００μＬのＣＢＨ ＩＩ酵素／緩衝剤混合物を、適温で１０分間、水浴中にてインキュベートした。インキュベーション後、３７．５μＬのエンドグルカナーゼ処理されたＰＡＳＣおよび６２．５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を添加し、５０℃で２時間加水分解を実施した。酵素の半分の活性が欠如したときのインキュベーション温度を、ソモギ・ネルソン分析のＡ５２０値の対温度プロットの線形補間より算出した。
【０１４４】
長時間のアビセルＰＨ１０１（Ｆｌｕｋａ）加水分解の測定のため、０．３μｇの精製されたＣＢＨ ＩＩを、水浴に配置されたＰＣＲチューブ内で、２７０μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）において３ｍｇのアビセルとともに１６時間インキュベートした。チューブを室温の水浴中で１０分間冷却し、１０００ｇで１０分間遠心分離し、収集した上清を還元糖分析に供した。
【０１４５】
ＹＰＤ発現培養上清中のＣＢＨ ＩＩ活性の評価のため、２ｍＬ〜４０ｍＬの上清を、コニカルチューブにて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）に懸濁された３３ｍｇ／ｍＬのアビセル８００μＬに添加された。ＣＢＨ ＩＩは、アビセルと４℃、１時間で結合し、２０００ｇ、２分間遠心分離し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で２回洗浄された。２回洗浄した後、ＣＢＨ ＩＩと結合したアビセルを、２．７５ｍＬ酢酸ナトリウム緩衝剤中に再懸濁し、２７０μＬの分量で分注して、５０℃で２．５時間インキュベートした。遠心分離および上清還元糖の分析は、上記のように実施した。
【０１４６】
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａにおける線形回帰パッケージを使用して、ＣＢＨ ＩＩキメラＴ５０データを１７パラメーターに適合し、相互検証分析を行った。ブロック効果は、親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ）を基準として、親２および３からのそれぞれ８つのブロックの置換を示す１６パラメーターを用いて、報告された。
【０１４７】
１０分間のインキュベーションにより酵素が５０％の活性を欠如する温度として規定されるＴ５０値は、３つの親セロビオヒドラーゼについて決定した。前の実験からの３３個の活性型ＣＢＨ ＩＩキメラおよび質的に安定なモデルが最も熱安定性があると予測したうちの１８個のさらなるキメラ（即ち不安定と予測されたブロックは一切含まれず、安定性ブロックと予測された４つのうち３つまたは４つが含まれる）についてＴ５０値を測定した。全５１個のキメラ配列を表８に列挙した。以前に分泌されないと分類された全ての熱安定性と予測されるキメラの再培養および再濃縮により、Ｔ５０測定のため、十分量の１２１１２１３２，１３１１１１３２および１３３２２３３２ＣＢＨ ＩＩを得ることを可能とした。キメラおよび親のＣＢＨ ＩＩに関するＴ５０値の完全なセットをが、Ｔａｂｌｅ８に示す。全ての前記ＣＢＨ ＩＩのアミノ酸配列を、Ｔａｂｌｅ７に記載する。試験された全３１個の熱安定性と予測されたキメラは、最も熱安定性のある親酵素（６４．８℃）より２度高いＴ５０値を有する。Ｔａｂｌｅは、熱安定を向上させるため、Ｓｅｒに変異することができるブロック／ドメイン７におけるＣｙｓ残基も同定する。従って、本発明は、以下の配列のあらゆるポリペプチドを提供し、下線／イタリック体／太字のＣｙｓはＳｅｒ残基と置換され、結果として生じたポリペプチドは、野生型酵素と比較して、高い熱安定性を有する。
Ｔａｂｌｅ７：ＣＢＨ ＩＩ親およびキメラ触媒ドメインのためのアミノ酸配列が、Ｔａｂｌｅ８に示される。
Ｔａｂｌｅは、Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩに関する触媒ドメインも含む。全ての組み換え型ＣＢＨ ＩＩは、天然Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩからのＮ末端ＣＢＭおよびリンカーCSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPP PGSTTTRVPPVGSGTATYS （配列番号８）を共有する。
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
【表１５】
【０１５０】
【表１６】
【０１５１】
【表１７】
【０１５２】
【表１８】
【０１５３】
【表１９】
【０１５４】
【表２０】
【０１５５】
【表２１】
【０１５６】
【表２２】
【０１５７】
Ｔａｂｌｅ８：
親ＣＢＨ ＩＩに関する２つの独立した二重のＴ５０値（℃）、２３個の初めのサンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラおよび予測される熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラ。この研究のために合成された１８個のキメラは、星印の後に記載される。
【０１５８】
【表２３】
【０１５９】
線形回帰の配列安定性データへの適応は、Ｒ２＝０．８８で観測されたＴ５０値に適合する１０−パラメーターモデルを生じた。トレーニングセット外の回帰モデルの予測性能をよりよく推定するため、１１の折り畳み構造の相互検証をＲ２が０．５７となるように実施し、２つの外れ値を取り除き（１１３１３１２１および２２２２２２２２）、相互検証Ｒ２を０．７６へと増加させた。回帰モデルは、最も安定な親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を基準状態Ｔ５０として使用して、ｐ値≦０．１を有する９つのさらなる項を含む。モデルパラメーター（Ｔａｂｌｅ９）は、親３からのブロック７の単一のブロックが、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩと比較してキメラの熱安定性に最も強く寄与することを示す。Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩからのこのブロックは、それを含むキメラの熱安定性を約８．５℃上昇させる。ｐ値≦０．１の８つの残りのブロックのうち２つによる熱安定性の上昇は、１．２℃および２．７℃と小さかったが、他の６つはその安定性を減少させた。
Ｔａｂｌｅ９：Ｔ５０線状回帰モデルパラメーターおよびｐ値。図１の回帰適合線を算出するために使用されたｐ＜０．１のパラメーター値を太字体で示す。ブロック効果は、親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ）を基準状態として、親２および３からのそれぞれ８つのブロックの置換を示す１６パラメーターを用いて報告された。
【０１６０】
【表２４】
【０１６１】
Ｂ７Ｐ１およびＢ７Ｐ３配列のアライメント（図１０）は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ酵素において、ブロック７の５６個のアミノ酸のうち、１０箇所で相違する。最も高いＴ５０値を有する２１３１１１３１のキメラのバックボーンにおいて、Ｂ７Ｐ３のそれぞれの残基（親の断片７（配列番号６））は、Ｂ７Ｐ１において相当する残基に個々に変異され、それぞれの点突然変異体についてＴ５０値が得られた。突然変異体Ｓ３１３Ｃは、キメラの熱安定性を著しく変化させた：この単一の突然変異体は２１３１１１３１のＴ５０を約１０℃減少させた（図１１）。
【０１６２】
復帰突然変異の効果を異なる背景において研究するため、Ｃ３１３Ｓ置換をコードするＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親ＣＢＨ ＩＩ遺伝子（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓにおいてＣ３１４Ｓ、およびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａにおいてＣ３１１Ｓ）を作成し、発現させ、酵素のＴ５０値を測定した。安定性のＢ７Ｐ３を野生型Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの酵素内に置換したキメラ、１１１１１１３１および２２２２２２３２の安定性についても定量化した。Ｂ７Ｐ３ブロック置換およびＣｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異体は、親ＣＢＨ ＩＩを著しく安定化させた；最も大きな効果は、Ｃ３１１Ｓ置換を含むＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩへのＴ５０における８℃までの上昇であった。またＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異は、Ｂ７Ｐ３を含まない２つのキメラである、３１３１１１１２および１３２３１１１１ならびに組み換え型の親のセットでない相同するＣＢＨ ＩＩ（Ｐｈａｎｅｒｏａｃｈｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから）において試験した。Ｐ． ｃｈｙｒｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩの触媒ドメインは、親ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインに５５−５６％のみの相同性がある。これら全ての酵素は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ置換によって安定化された；Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩは１０℃と高い安定化を見せた（図１３）。
【０１６３】
同等のＣ３１３Ｓ突然変異を含む８つの熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラおよび親の酵素は、Ｈｉｓ６のタグを付け、精製することで、特異的活性を測定できた。Ｔａｂｌｅ１０Ａに示すように、特異的活性は、５０℃で非結晶性セルロース（ＰＡＳＣ）について観測されるように、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体を含むこれらキメラおよび天然酵素について、野生型親のものと同等であった。従って、高い熱安定性は、特異的活性の代償として現れるものではない。
Ｔａｂｌｅ１０Ａ：天然、点突然変異体および選択される熱安定性のあるキメラＣＢＨ ＩＩに関する特異的活性値（μｇグルコース還元糖等価／（μｇ ＣＢＨ ＩＩ酵素×ｍｉｎ×１０））。エラーバーは、標準誤差を示し、標準誤差は３つの複製に関する標準偏差／ｓｑｒｔ（ｎ）として定義される。２時間の反応、３ｍｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８。
【０１６４】
【表２５】
【０１６５】
Ｔａｂｌｅ１０Ｂ：Ｈ． ｊｅｃｒｏｉｎａおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ野生型、Ｃ３１３Ｓ点突然変異体およびＢ７Ｐ３ブロック置換ＣＢＨ ＩＩに関する合成（ＳＤＣＡＡ）および豊富な（ＹＰＤ）発現培養培地上清の双方における全活性。示す値は、セルラーゼ活性分析に添加される発現培養上清ＣＢＨ ＩＩ等価のｍＬ当たりのμｇグルコース／ｍＬセルラーゼ活性分析値である。ＳＤＣＡＡ培養については、濃縮されたＳＤＣＡＡ培養上清が使用され、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）において５０℃で１００分間のリン酸膨潤セルロース（１ｍｇ／ｍＬ）に対する活性が測定された。ＹＰＤ上清ＣＢＨ ＩＩは、アビセルに結合させることによって濃縮し、５０ｍM酢酸ナトリウム（pＨ４．８）において５５℃で１５０分間、アビセル（１５ｍｇ／ｍＬ）に対する活性を測定した。
【０１６６】
【表２６】
【０１６７】
これらの８つの熱安定性のある同一のキメラ（最も安定な親よりＴ５０が２−１０℃高い）は、その後結晶性セルロースへの活性に関して、１６時間のインキュベーションの間、親酵素がほとんど活性を示さない温度を含む幅広い温度範囲で試験した。図９ａは、８つの試験された熱安定性のあるキメラのうちの７つが、６０−６５℃でアビセルに対して最大の活性を示す、８つのキメラ全てについて、７０℃（試験中の最高温度）で、活性を保持していることを示した。対照的に、３つの親ＣＢＨ ＩＩは、５０℃で最大の活性を示したが、７０℃で完全にまたはほぼ完全に不活性となった。さらに高い最適活性温度を有する７つのキメラは、あらゆる親ＣＢＨ ＩＩ酵素と比較して非常の多量のアビセルを加水分解した。図９ｂに示すように、同様の挙動が、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異を含むＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親においても観測された。Ｃｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異は、アビセル加水分解およびＰ． ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩにおける最高反応温度を上昇させた。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ親におけるＰ３Ｂ７ブロック置換により、反応温度およびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩの加水分解は上昇したが、上昇した最高反応温度は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ酵素による全体的なセルロース加水分解を向上させるものではなかった。
【０１６８】
ｃｅｒｅｖｉｓａｅ発現宿主からの野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの分泌が低い（＜１ｍｇ／Ｌ）ことが観測された。野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素におけるＣ３１１Ｓ突然変異は、ＣＢＨ ＩＩの全分泌量の活性を著しく上昇させた（表１１）。豊富な培地（ＹＰＤ）における活性の上昇は１０倍であるが、合成（ＳＤＣＡＡ）培地において、Ｃ３１１ＳおよびＢ７Ｐ３置換は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ全分泌活性を２倍に上昇させる。他の２つの親ＣＢＨ ＩＩと比較して高いレベルで発現しているＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ親について、Ｂ７Ｐ３ブロック置換は活性を減少させたが、Ｃ３１４Ｓ突然変異は、活性を１．５倍まで上昇させた。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ野生型およびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異の全てが同様の特異的活性を有するため（図１０）、全分泌セルラーゼ活性の上昇は、機能的酵素のより優れた分泌の結果である。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ異種タンパク質分布とタンパク質の安定性との間の相互関係が観測され、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異ＣＢＨ ＩＩの上昇した分泌が、それらの最も高い安定性に反映し得ることを示唆した。
Ｔａｂｌｅ１１：天然、点突然変異体および選択される熱安定性のあるキメラＣＢＨ ＩＩに関する特異的活性値（μｇグルコース還元糖等価／（μｇ ＣＢＨ ＩＩ酵素×ｍｉｎ×１０２））。エラーバーは、３つの複製に関する標準誤差を示し、標準誤差は標準偏差／ｓｑｒｔ（ｎ）を規定する。２時間の反応、３μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８。
【０１６９】
【表２７】
【０１７０】
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異をモデル化するため、微細構造のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ １ｏｃｎ結晶構造を使用した。第１に、水素結合ネットワークをＲＥＤＵＣＥで最適化した。Ｃ３１４はＰｒｏ３３９のカルボニル基と水素結合を形成することを予測した。この予測を検証するため、側鎖パッケージングを、モデリング・プラットフォームＳＨＡＲＰＥＮを用いて最適化した。Ｓｅｒ３１４は、より強い水素結合、およびより有利な結合構造が生じるように、Ｃｙｓ３１４と同様の相互作用を奏することが予測された。
【０１７１】
数々の効果は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異が、天然ＣＢＨ ＩＩおよびキメラを含む幅広いＣＢＨ ＩＩを安定化することができる理由を説明することができる。ＣｙｓおよびＳｅｒは同様であり（等比体積でない）、他の代価物と比較して、これら２つのアミノ酸は配列アライメントをこの位置で抑制する。この残基への水素結合パートナーは、バックボーン要素（Ｇｌｙ３１６のアミドおよびＰｒｏ３３９のカルボニル）であり、従ってあまり第３者のアミノ酸変異体に依存しそうにない。さらにこのポケットに直接隣接した側鎖（Ａｓｎ２８３、Ｐｒｏ３３９、Ｐｈｅ３４５）が、研究された全４つの天然ＣＢＨ ＩＩセルラーゼにおいて保存されている。
【０１７２】
微細構造（１．３オングストローム）のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ結晶構造（ｐｄｂ挿入１ｏｃｎ６）は、Ｃｙｓ３１４が水素結合ネットワークの一部であることを示した（図１５）。Ｃｙｓと比較して高いＳｅｒの水素結合性能は、安定化における比較的強い水素結合相互作用を奏することを示す。結晶構造においても、立体構造の観点からＳｅｒが好適に使用し得ることを示す。特に、Ｃｙｓ側鎖が元来の結合角度を有するとき、ＣｙｓがＰｒｏ３３９のカルボニルに押しつけられるように挿入されることで、６°の角度はなくなるが、望まれざる立体構造の相互作用を生じた。
【０１７３】
Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと最も多くの一致を共有する１９６個のタンパク質配列のアライメント。最も一致のある配列の２５０のうちの５４については、重複しているためアライメントから排除した（即ち、構造研究のための点突然変異体または９５％超で一致するアイソフォーム）。Ｓｅｒ３１１に対するバイアスがある：１５８個の配列はＳｅｒ、２０個はＡｌａ、１０個はＣｙｓ、５つは欠失、３つはＧｌｙを有する。しかしながら、４２個の他の配置があり、最も多くの選択肢は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａのアミノ酸の選択肢の２倍を超えて生じる。
【０１７４】
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異の高い安定化効果は、この位置でのＳｅｒが、天然セルラーゼの熱安定性の全体的な指標となる可能性を向上させる。しかしながら、この位置にＣｙｓを有することを特徴とするＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩのＴ５０値が６４．８℃であるが、これはＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩ（６４．０℃）より高く、Ｓｅｒが安定化決定の唯一の要因ではないことを示している。
【０１７５】
熱安定性だけが、産業用セルラーゼの重要な特徴ではない。特異的活性、セルロース結合に与える変化、発現に対する効果、および生成阻害は、全て同様に重要である。キメラおよび本明細書のデータは、組換えにより、短時間（例えば２時間）で測定されたセルロース加水分解分析において、特異的活性を損なうことなく向上した熱安定性を奏する、ＣＢＨ ＩＩキメラを得ることを示す。同様の現象が、熱安定性のあるＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異を含むＣＢＨ ＩＩに関してもみられた。長時間の加水分解分析において、いくつかのＣＢＨ ＩＩキメラ、および３つの被験Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異ＣＢＨ ＩＩについて、天然ＣＢＨ ＩＩと比較してより多くセルロースを加水分解することを発見した。この優れた性能は、酵素が高温でより長時間で機能し続けることを可能とする高い熱安定性とともに、親ＣＢＨ ＩＩに匹敵する特異的活性を有することに起因すると考えられる。これらの分析は、等量の精製された親、キメラおよびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体酵素で実施されたため、観測された高温での加水分解の向上は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現宿主からの分泌量の増加によるものではない。熱安定性のあるキメラおよびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体は、従って、セルロース分解のための酵素製剤に有用な要素であることが証明し得る。
【０１７６】
様々な特定の実施形態が示され、記載される一方で、この発明の思考と範囲から逸脱することなく、様々な変化がされることが理解される。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の優先権主張＞
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、２００９年４月６日に出願された米国仮出願第６１／１６６，９９３号、および２００９年５月１３日に出願された米国仮出願第６１／１７７，８８２号を参照して取り込むものとする。
【０００２】
＜連邦支援の研究に関する記載＞
アメリカ政府は、国立衛生研究所によって与えられる研究費番号ＧＭ０６８６６４およびＡＲＯ−ＵＳ Ａｒｍｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｒｒｉｓ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒによって与えられる研究費番号ＤＤＡＤ１９−０３−０Ｄ−０００４に従って、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、分子生物工学および分子生物デザイン、並びに改変タンパク質および改変核酸に関する。
【背景技術】
【０００４】
バイオマス変換工程におけるセルラーゼ混合物の性能は、セルロース基質の物理的な状態および組成に加えて、安定性、生成阻害、多様なセルラーゼ成分間の相乗効果、非生産的な吸着に対する生産的な結合、およびｐＨ依存性を含む多くの酵素特性に依存する。多様な適用および原料に対して酵素の形態を最適化するため、セルロース加水分解に多変量的な特性を付与し、多様なセルラーゼから選択することが望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、セルラーゼ活性があり、野生型タンパク質と比較して、高い熱安定性および活性がある組み換え型ポリペプチドを提供する。本発明は、長時間の加水分解試験において、ＣＢＨ ＩＩのＣ末端（例えば天然タンパク質配列に応じてアミノ酸約３１０−３１５であり、例えば配列番号２および４を参照とする）で、ＣｙｓからＳｅｒへの突然変異があるキメラおよび天然酵素が、天然酵素と比較してより確実なセルロース加水分解を提供することを示す。
【０００６】
本発明は、配列ＧＥＣＤＧ（配列番号２の３１２−３１６）を含有するモチーフ中のＣ末端領域にＣ→Ｓ置換を含む組み換えポリペプチドであって、該変異体が、野生型セロビオヒドラーゼと比較して高い熱安定性およびセルラーゼ活性があるものを提供する。例えば、本発明は高い熱安定性およびセルラーゼ活性があるポリペプチドであって、Ｃ３１４Ｓを含有する配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１０Ｓを含有する配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１２Ｓを含有する配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１４Ｓを含有する配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１５Ｓを含有する配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１３Ｓを含有する配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１３Ｓを含有する配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３１１Ｓを含有する配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４０７Ｓを含有する配列番号６５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３９４Ｓを含有する配列番号６６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号６９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４００Ｓを含有する配列番号７５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ４０７Ｓを含有する配列番号７６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；Ｃ３９４Ｓを含有する配列番号７７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含むか；Ｃ４１２Ｓを含有する配列番号７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の一致があるものを含み；上記ポリペプチドは、セルラーゼ活性があり、それに相当するＣｙｓ→Ｓｅｒの突然変異が欠如している親（野生型）タンパク質と比較して熱安定性が改良されている。
【０００７】
本発明は、組み換えにより生成されたか、合成されたか、他の非天然的な製造方法により生成された、いずれかの実質的に精製されたポリペプチドも提供する。該ポリペプチドは、Ｃ→Ｓ置換の存在位置を除く、以下に示す１−１０、１０−２０または２０−３０の保存的な配列のアミノ酸置換基を含む：Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【０００８】
本発明は、（ａ）位置３１４にＳｅｒがある配列番号２と少なくとも８５％以上の一致があるポリペプチドであり、前記ポリペプチドはセルラーゼ活性がある；（ｂ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号４と少なくとも７０％以上の一致があるポリペプチドであり、前記ポリペプチドはセルラーゼ活性がある；（ｃ）（ｉ）位置３１０にＳｅｒがある配列番号１２、（ｉｉ）位置３１２にＳｅｒがある配列番号１３、（ｉｉｉ）位置３１４にＳｅｒがある配列番号１４、（ｉｖ）位置３１５にＳｅｒがある配列番号１５、（ｖ）位置３１３にＳｅｒがある配列番号１６、（ｖｉ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号１７、（ｖｉｉ）位置３１３にＳｅｒがある配列番号１９、（ｖｉｉｉ）位置３１２にＳｅｒがある配列番号２１、（ｉｘ）位置３１１にＳｅｒがある配列番号２２からなる群から選択される配列と７０％以上の一致があるポリペプチドであり、それぞれ上記ポリペプチドは、セルラーゼ活性がある；（ｄ）２つの異なるセロビオヒドラーゼポリペプチドからの少なくとも２つのドメインを含むキメラポリペプチドであり、ドメインはＮからＣ末端までに：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）を含み；断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約１から約ｘ１までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ１から約ｘ２までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ２から約ｘ３までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ３から約ｘ４までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片５は、配列番号２（“１”）、配列番号４（「２」）または配列番号（「３」）のアミノ酸残基約ｘ４から約ｘ５までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）のアミノ酸残基約ｘ５から約ｘ６までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片７は、配列番号２（「１」）または、配列番号４（「２」）のアミノ酸残基約ｘ６から約ｘ７までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；断片８は、配列番号２（「１」）または配列番号４（「２」）のアミノ酸残基約ｘ７から約ｘ８までと少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み；ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７であるか、配列番号４または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６である；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３または２２４であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０であるか、配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５または３１６であるか、配列番号４の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１８；およびｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６の配列であり、キメラポリペプチドは、配列番号２の位置３１４または配列番号４の位置３１１でＳｅｒであり、キメラポリペプチドは配列番号２，４もしくは６を含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドと比較してセルラーゼ活性、改良した熱安定性および／またはｐＨの安定性があるものからなる群から選択される配列を含む組換え型ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号１２−６２または６３の配列からなる組換え型ポリペプチドも提供する。
【００１０】
本発明は、また上記いずれかのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明は、本発明の実質的に精製された形態、または細胞溶解物の一部としてポリペプチドを含む酵素製剤も提供する。
【００１２】
本発明は、またセルロースを含むバイオマスの処理方法を提供し、該方法は本開示のポリペプチドまたは酵素液とバイオマスの接触工程を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】候補遺伝子たるＣＢＨ ＩＩの親遺伝子の酵母発現培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ａ）ゲルレーン（左から右）：１−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ、２−空ベクター、３−Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ、４−Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、５−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（二重）、６−Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、７−Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｌ、８−空ベクター（二重）、９−Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（三重）。ゲルの下部の数字は、２時間、５０℃でのＰＡＳＣ加水分解試験後に、反応物中に存在する還元糖の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。その後、ＢＳＡを標準としたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる比較は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ発現レベル５−１０ｍｇ／Ｌの評価を可能とした。（Ｂ）Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＢＨ ＩＩ発現培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。ＣＢＨ ＩＩバンドが、ちょうど６０ｋＤａ分子量基準値未満で現れた。レーンは、左から右に向かって、１−野生型Ｈ． ｊｅｃｏ、２−Ｈ． ｊｅｃｏ Ｂ７Ｐ３、３−Ｈ． ｊｅｃｏ Ｃ３１１Ｓ、４−野生型Ｃ． ｔｈｅｒ、５−野生型Ｈ． ｉｎｓｏ、６−Ｈ． ｉｎｓｏ Ｂ７Ｐ３、７−Ｈ． ｉｎｓｏ Ｃ３１４Ｓである。数値は、５０℃、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８の条件下で、ＰＡＳＣ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて１００分間インキュベーションした際に生じるμｇグルコース等量／ＳＤＣＡＡを発現する培養上清等量の１ｍＬ当たりのｍＬ反応容量を示す。レーン１−４に関する値は、加えられた濃縮培養上清の容積の２倍に修正するため、２で除算する。かかる修正を省略すると、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素に関する特異的活性値が低下するように思われる。
【図２】ＣＢＨ ＩＩキメラライブラリーブロックの限度を示す図である。（Ａ）色分けされたブロックを用いたＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインのリボンダイアグラムを示す。ＣＢＨ ＩＩ酵素は、セロビオ由来のイソファゴミングリコシダーゼ阻害剤と複合体を形成する。（Ｂ）２次構造要素、ジスルフィド結合および黒矢印によって示されるブロックの区別を示す、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ触媒ドメインの直線図である。（Ｃ）組み換えに応じて分解することができる接続部分（４．５Ａ範囲内の側鎖重原子）を示す側鎖接続マップである。分解された接触部の大半は、連続したブロックの間に生じる。
【図３】２３個の分泌／活性型および１５個の非分泌／不活性型のサンプルセットのキメラに関して分割した接続部（Ｅ）の数および最も近い親（ｍ）からの突然変異の数を示す図である。
【図４】親ＣＢＨ ＩＩ酵素および３つの熱安定性のあるキメラに関するｐＨの関数として、ｐＨ５．０で基準化した特異的活性を示す図である。提示するデータは、２つの測定の平均であり、ＨＪＰｌｕｓおよびＨ． ｊｅｃｏに関するエラーバーは、２つの独立した試験の値を示す。１６時間反応物において、３００μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃での１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム／１２．５リン酸ナトリウム緩衝剤中において示すようなｐＨである。
【図５】親および広範囲にわたる温度での熱安定性のあるキメラに関する長期セルロース加水分解分析の結果を示す図である。エラーバーは、ＨＪＰｌｕｓおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ酵素の３つの測定に関する標準誤差を示す。ｐＨ４．８における５０ｍＭ酢酸ナトリウム中の１００μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣの４０時間反応物である。
【図６】６３℃で１２時間インキュベーションした後、検証するためのキメラセットに関する標準化した残留活性を示す図である。５０℃で２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ４．８中、２時間の分析においてＰＡＳＣを基質として用いて測定された濃縮培養上清におけるＣＢＨ ＩＩ酵素に関する残留活性を示す。
【図７】親およびキメラＣＢＨ ＩＩ酵素発現ベクターＹｅｐ３５２／ＰＧＫ９１−１―ｒｓｓに関するマップを示す図である。図示のベクターは、野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｅ１６ａ（ＣＢＨ ＩＩ酵素）遺伝子を含む。キメラおよび親ＣＢＨ ＩＩ酵素の双方に関して、ｓｓ Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ｋｅｘ２部位に続くＣＢＤ／リンカーアミノ酸の配列は、以下の通りである：ASCSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYS (配列番号8)。
【図８】ＣＢＨ ＩＩ親および５１個のＣＢＨ ＩＩキメラに関する観測されたか、予測されるＴ５０値である。線は線形回帰モデル式を示す（Ｔａｂｌｅ７におけるパラメーター）。親ＣＢＨ ＩＩのＴ５０値は、正方形で示す。
【図９】アビセルに対する、温度によるＣＢＨ ＩＩ特異的活性を示す図であり、（ａ）ＣＢＨ ＩＩ親およびキメラの特異的活性である。（ｂ）ＣＢＨ ＩＩ親、Ｃ３１１Ｓ突然変異体およびＢ７Ｐ３単一ブロック置換キメラの特異的活性である。アビセル濃度１５ｍｇ／ｍＬを用いた５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中で１６時間、反応を行った。（ｃ）温度の関数としてアビセルに対するＣＢＨ ＩＩ親、単一点突然変異体および単一阻害置換キメラ活性（μｇ／グルコース／ｍＬ反応）である。１５０分間、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８条件下、アビセル濃度１５ｍｇ／ｍＬを用いて、反応を行った。ＣＢＨ ＩＩ酵母培養上清を、５５℃でほぼ等量の還元糖産物の濃度を達成するため投与した。提示されるデータは、それぞれの温度点に関して二重の活性値を示すエラーバーと２つの独立した測定の平均である。
【図１０】親１であるＨ．ｉｎｓｏｌｅｎｓおよび親３であるＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからのブロック７ＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列の配置である。矢印は、復帰突然変異における残基変異を示す。
【図１１】２１１１１３３１キメラ点突然変異に関するＴ５０値を示す図である。値は、２つの独立した二重試験の平均値として示され、エラーバーは点突然変異に関する二重試験のそれぞれのＴ５０値を示す。試験温度の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下、１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）と５０℃で１００分間のインキュベーションによって測定された。
【図１２】Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親ＣＢＨ ＩＩ、Ｓｅｒ単一点突然変異およびＢ７Ｐ３ブロック置換キメラに関するＴ５０値を示す図である。３つの独立した測定の平均、エラーバーとして示した値は、それぞれのＣＢＨ ＩＩに関する１つの標準偏差を示す。不活性化は、試験される温度５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下で、１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌのリン酸、膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）と５０℃で、１００分間のインキュベーションによって測定された。
【図１３】Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＭと融合した）およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから非相同的に分泌されたＣＢＨ ＩＩキメラ３１３１１１１２，１３２３１１１１および野生型ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインに関するＴ５０値を示す。２つの独立した試験の測定値をエラーバーを用いて示す。不活性化は、試験される温度５０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、ｐＨ４．８条件下で１０分間実施された。残留活性は、上記緩衝剤中、１ｇ／Ｌリン酸、膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を用いて５０℃で１００分インキュベーションすることによって測定された。
【図１４】ＣＢＨ ＩＩ組み換え型ブロックの接合部位を示す図である。（ａ）新規非親残基の組み合わせが可能な場合（結合した球体）、ブロックの間の部位は、通常、その表面が曝露されており、潜在的に溶媒が接合部位をスクリーンすることを可能とする。（ｂ）接合部位（Ｂ５−Ｂ６）の例は、バックボーン（位Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓに配置図）、の保存、表面上の可変的な残留物ならびに残基１７３および２５３（矢印）における新規な埋没した疎水性の対の比較的稀有な可能性を示す。（ｃ）Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ（図中、黒色で示す）からのブロック１−４は、基質結合と関連する移動が、Ｂ３部位（黄色）において観測される（矢印）にも関わらず、同属のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓブロック（色分けされた図）と大きな偏差なく適合する。（ｄ）Ｂ６、Ｂ７接点（矢印）での挿入欠失が構造変化を要するが、同属のブロック５−８も同様である。
【図１５】Ｃ３１４Ｓ突然変異体およびその安定性への効果の構造分析を示す図である。（ａ）微細構造のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ構造（１ｏｃｎ）の水素の位置を、図１に示した。（ｂ）類似したセリン構造の再構成された結合構造を、ＰｙＭＯＬ（http: (//) www .pymol . org）でモデル化した。ＳＨＡＲＰＥＮ２モデリング・プラットフォーム（全ての原子ロゼッタエネルギー機能を有する）において、側鎖を最適化することで、Ｃｙｓ３１４およびＳｅｒ３１４の双方が、Ｐｒｏ３３９のカルボニルの水素結合に寄与し、Ｇｌｙ３１６のアミドから水素結合を受容することを示唆した。セリンの優れた水素結合性能は、セリンを含む変異体のより高い安定性に影響し得る。他の説明は、補助的な位置を示すものである。特に、１ｏｃｎからのＣｙｓ位置は、側鎖が顕著に曲がり（即ち、Ｎ−Ｃ−Ｃα−Ｃβからの不適切な上反角が、標準位置から６°である）、Ｐｒｏカルボニルからの距離が増加した、立体構造種を示す。図内の文字の後でない数値は、水素結合距離（オングストローム）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書および特許請求の範囲で使用する、単数形“ある（ａ，ａｎ）”、および“この（ｔｈｅ）”の語は、明確に記載しない限り、複数の指示物を含む。従って、例えば「ドメイン」の用語は複数のドメイン、「タンパク質」の用語は１つ以上のタンパク質を含む。
【００１５】
また「または」の用語は、他に記載されない限り「および／または」を意味する。同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ， ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓおよびｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、同じ意味で用いられ、制限することは意図しない。
【００１６】
さらに様々な実施形態の記載においては、「含む」の用語を使用し、当業者は、いくつかの特定の場合、実施形態が或いは「実質的になる」または「なる」の言語を使用して記載されていると理解するであろう。
【００１７】
ここに記載されたものと同様または対応する方法および材料を、開示の方法および組成物の実施に使用することができ、ここでは、例示的な方法、装置および材料を開示するものである。
【００１８】
他に規定がない限り、ここに使用される全ての専門的且つ化学的な用語は、一般的にこの開示が属する分野の当業者に理解されるものと同様の意味を有する。したがって、本出願にわたって使用される以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００１９】
最近の研究は、研究室レベルのバイオマス変換過程において、中等温度好性の対照物と比較して、好熱性菌からのセルラーゼが熱安定性に優れ、その高い安定性により、適温または高温状態における長期の活性保持を有することを示してきた。菌のセルラーゼについては、４０ｇ／Ｌまでの上清濃度で、高度に活性があり、菌宿主、例えばＨｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（アナモルフ・トリコデルマ・リーゼイ）に発現することができることため、高い関心が寄せられている。不都合にも、熱安定性のある菌セルラーゼを発現する試料は、その数が少ない。。加工性のセロビオヒドラーゼクラスＩＩ（ＣＢＨ ＩＩ）酵素の場合、１０個未満の天然熱安定遺伝子配列が、ＣＡＺｙデータベースに掲載されている。
【００２０】
ここに十分に記載するように、再帰的キメラポリペプチドの生成ならびに特定の安定したドメインおよび最終的な特定のアミノ酸の分析により、熱安定性に付与、活性化の改善がみられた。
【００２１】
以下により詳細に記載するように、本発明は、少なくとも一部において、セルロースの加水分解に触媒作用を生じる新規酵素の生成および発現に基づくものである。一つの実施形態において、高温条件下でセルロースを加水分解するように改変された新規ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、アミノ酸置換基を特定の残基で含むように変えられたセロビオヒドラーゼの変異体を含む。これらの変異体については以下でより詳細に記載されているが、本発明のポリペプチドは１つ以上の修飾されたアミノ酸を含んでもよいことが理解される。修飾されたアミノ酸の存在は、例えば（ａ）ポリペプチド半減期の長期化、（ｂ）熱安定性および（ｃ）基質の補充の増加において有利である。アミノ酸は、例えば、共翻訳中または翻訳後において、組み換え生産（例えば、哺乳類細胞での発現中の、Ｎ――Ｘ――Ｓ／ＴモチーフのＮ−結合型グリコシル化）の際に修飾されるか、合成手段によってによって修飾される。従って、「突然変異」、「変異体」または「修飾された」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、親のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞から選択されるか、由来するか、ある場合においては異なるか、変化した、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を意味する。突然変異体もしくは修飾されたタンパク質または酵素は、必然的でないが、通常、突然変異体のポリヌクレオチドまたは遺伝子から発現する。
【００２２】
「突然変異」は、突然変異タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を生じる、あらゆる工程または機構を意味する。これは、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列が変化するあらゆる突然変異、および、かかる突然変異から起因する細胞におけるあらゆる検出可能な変化を含む。通常、突然変異は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列での、単一または複数のヌクレオチド残基の点変異、欠失または挿入によって生じる。突然変異は、タンパク質をコードする遺伝子の領域内で生じるポリヌクレオチドの変性、ならびにタンパク質コード配列外、例えば、調節またはプロモーター配列（これらに限定しない）領域の変性を含む。遺伝子内における突然変異は、「サイレント」であってもよく、即ち発現に応じてアミノ酸変性に反映されず、遺伝子の「配列保存的な」変異体をなってもよい。これは、通常、１個のアミノ酸が１種を超えるコドンに対応する場合において生じる。
【００２３】
修飾されたアミノ酸の非制限的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えばファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸等が挙げられる。アミノ酸の修飾について、当業者を導くのに参照し得る文献が存在する。プロトコールの例は、ＷａｌｋｅｒのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９８）（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ、ニュージャージー州）のＣＤ−ＲＯＭから取得可能である。
【００２４】
本発明には、修飾したセロビオヒドラーゼポリペプチドを生成・分離する組み換え法を記載する。組み換え生成に加えて、固相技術を用いた直接的なペプチド合成（例えば、Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co, San Francisco);およびMerrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154）によって、ポリペプチドを生成することができる。ペプチド合成は、手動または自動の方法を用いて実施することができる。自動合成は、例えばアプライドバイオシステムズ４３１Ａペプチド合成装置（パーキンエルマー、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、製造業者の提供する説明書に従って実施することができる。
【００２５】
「セロビオヒドラーゼＩＩ」または「ＣＢＨ ＩＩ酵素」は、細菌類および菌類において多岐にわたるセルラーゼファミリー６タンパク質における酵素を意味する。酵素は、セルロースの加水分解に用いられる。
【００２６】
「セルラーゼ活性」は、セルロースを加水分解できる酵素を意味する。セルラーゼは、セルロースの加水分解を触媒する菌類、細菌類および原生動物によって生成される酵素ファミリーを指す。しかしながら、他の種類の生物、例えば植物および動物によって生成されるセルラーゼもある。この群のＥＣ番号は、ＥＣ３．２．１．４である。触媒作用に基づく、５つの一般的な種類のセルラーゼが存在する：エンドセルラーゼ；エキソセルラーゼであり、この部類内には２つの主な種類のエキソセルラーゼ（またはセロビオヒドラーゼ、省略してＣＢＨ）があり、１つの種類は還元端から進むように働き、もう１つの種類はセルロースの非還元末端から進むように働く；セロビアーゼまたはβグルコシダーゼ加水分解；酸化セルラーゼ；および、水の代わりにリン酸を用いてセルロース単量体へと分解するセルロースホスホリラーゼ。多くの菌のセルラーゼは、２つのドメイン；フレキシブルなリンカーによって結合している触媒ドメインおよびセルロース結合ドメインを有する。本発明のある実施形態において、セルラーゼ活性は、ＣＢＨ活性である。ここに記載の配列は、いくつかの場合において、セルロース結合ドメインおよび触媒ドメインの双方、または触媒ドメインのみを含む。いくつかの場合において、触媒ドメイン配列のみを提供する場合、配列番号８で示されるようなセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）が、直接又はリンカーを通して、触媒ドメインに機能的に連結し得ること（コード配列の一部とするか、後に融合するか）が認識されている。
【００２７】
ここに用いられる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、同じ意味で用いられており、１つ以上の化学基礎単位の鎖であり、化学結合であり、ペプチド結合と称するものによって共に連結されている複数アミノ酸を含む。「酵素」は、高度にまたは低度に特異的に１つ以上の化学または生化学反応を触媒または促進するあらゆる物質であり、好ましくは完全にまたは大半がタンパク質から構成されるものを意味する。「天然」または「野生型」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、自然に産出されるタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞を意味する。
【００２８】
「アミノ酸配列」は、アミノ酸のポリマー（タンパク質、ポリペプチド等）またはアミノ酸ポリマーを示す特徴となる文字列（ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔｒｉｎｇ）である。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」の用語は、ここでは交換可能に同じ意味で使用される。「アミノ酸」は、中心の炭素原子が水素原子、カルボン酸基（ここに「カルボキシル炭素原子」として指す炭素原子）、アミノ基（ここに「網の窒素原子」として指す窒素原子）および側鎖基であるＲの基に結合する構造を有する」分子である。アミノ酸をペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に取り入れる場合、１つのアミノ酸をもう１つのアミノ酸に結合させる脱水反応において、１つ以上のそのカルボン酸基の原子が欠失する。そのため、タンパク質に取り入れられたアミノ酸は「アミノ酸残基」と表される。
【００２９】
一定のタンパク質の特定のアミノ酸配列（即ち、アミノ基末端からカルボキシ基末端まで表示される場合のポリペプチドの「一次構造」）は、コーディング部位のｍＲＮＡのヌクレオチド配列によって決定され、同様に遺伝情報、特にゲノムＤＮＡ（細胞小器官ＤＮＡ、例えばミトコンドリアまたは葉緑体ＤＮＡを含む）によって特定される。従って、遺伝子の配列を決定することは、対応するポリペプチドの一次配列、より詳細には、遺伝子またはポリヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドまたはタンパク質の役割または活性の予見を可能とする。
【００３０】
特定の配列の「保存的アミノ酸置換」または単なる「保存的な変異体」は、アミノ酸配列と実質的に同一である１つ以上のアミノ酸または一連のアミノ酸の置換を示す。当業者は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加または化学的に類似のアミノ酸との置換が起こる「保存的な変異体」を生じる、コード化配列における単一のアミノ酸または一定の割合のアミノ酸の変化、付加または欠失保存的を認識するであろう。
【００３１】
機能的に同類のアミノ酸の保存的置換を示す表は、従来技術において既知である。例えば、ある保存的置換基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）を含む。他の保存的置換基は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含む。他の保存的置換基は、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む。また他の保存的置換基は、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）を含む。他の保存的置換基はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）を含む。他の保存的置換基は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）を含む。
【００３２】
従って、列挙されたポリペプチド配列（例えば配列番号２，４，６および１２−７８）の「保存的アミノ酸置換基」は、同じ保存的置換基のアミノ酸から保存的に選択され、ポリペプチド配列のアミノ酸の割合としては、通常１０％未満で含む。従って、本発明のポリペプチドの多様な保存的置換変異体は、同じ保存的置換基の多様な保存的置換変異体において、１００，７５，５０，２５または１０個の置換を含み得る。
【００３３】
核酸分子のコード化された活性を変えない配列の付加、例えば非機能的付加または非コード配列は、塩基性の核酸の保存的変異体であると理解されている。酵素の「活性」は、その反応を触媒する能力、即ち「機能」の測定値であり、反応生成物が生成される速度として表すことができる。例えば、酵素活性は、時間当たり、または酵素の単位（例えば濃度または重量）当たりについて、生成される生成物の量、または親和性、または解離定数に関して表すことができる。ここに同様の意味で用いられる「セロビオヒドラーゼ活性またはセルラーゼ活性」、「セロビオヒドラーゼまたはセルラーゼの生物学的活性」または「セロビオヒドラーゼまたはセルラーゼの機能的活性」は、特定の実施形態においては、タンパク質、セルラーゼ活性を有するポリペプチドであり、標準の技術によって生体内または生体外で決定される、セロセルロース基質へのビオヒドラーゼ活性によって及ぼす活性を指す。
【００３４】
当業者は、開示される、機能的に同一の構造を有する核酸構造の多くの保存的変異体を理解するであろう。例えば、上記のように、遺伝子のコーディングの縮退のため、「サイレント置換」（即ち、核酸配列の置換であり、コードされたポリペプチドには変異を生じない）は、アミノ酸をコードする各々の核酸配列の特徴を包含する。同様に、アミノ酸配列における１つまたは数個のアミノ酸の「保存的アミノ酸置換」は、高い相同性の特徴を有する異なるアミノ酸と置換され、また開示の構造と高い相同性を有することが容易に同定される。それぞれ開示の配列の、このような保存的変異体は、ここに提供するポリペプチドの特性である。
【００３５】
「保存的変異体」は、タンパク質または酵素の全体の構造および機能を変えることなく、アミノ酸残基を変化させた、タンパク質または酵素であり、同様の特性、極性または非極性、サイズ、形状、電荷等（これらに限定されない）を有するアミノ酸への置換を包含する。保存的なものとして示されるアミノ酸以外は、タンパク質または酵素において異なっていてもよく、あらゆる２つの同様の機能のタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は、異なっていてもよく、配列図によって決定されるように、例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であってもよい。本明細書において、「配列類似性」は、ヌクレオチドまたはタンパク質配列が連関する範囲を意味する。２つの配列の類似範囲は、配列類似性のパーセントおよび／または保守性に基づくことができる。ここに「配列相同性」は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の範囲に差異がないことを意味する。「配列のアラインメント」は、最大限の一致を達成するため（アミノ酸配列の場合保存性）、類似性の程度を評価することを目的とする２つ以上の配列を揃える工程を意味する。配列を揃えて、類似性／相同性を評価するための数々の方法は、従来技術、例えばＣｌｕｓｔｅｒ法において既知であり、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ（Lipman and Pearson, 1985; Pearson and Lipman, 1988）に基づくものが知られる。このプログラム全てを使用して、最も高い配列相同性を生じるものが好ましい設定といえる。
【００３６】
特定のポリペプチドの非保存的な修飾としては、保存的置換を特徴としないあらゆるアミノ酸の置換が挙げられる。例えば、上記の６つの群の範囲を超えるあらゆる置換が挙げられる。これらは、塩基性または酸性のアミノ酸から中性のアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎからＶａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）、芳香族アミノ酸から塩基性または酸性アミノ酸（例えば、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐからＡｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎ）への置換、またはアミノ酸とその類似するアミノ酸との置換ではない、あらゆる他の置換を含有する。塩基性側鎖としては、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性側鎖としては、アスパラギンサン（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；電荷を有さない極性側鎖としては、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）；非極性側鎖としては、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）；β岐側鎖としては、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香性の側鎖としては、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）が挙げられる。
【００３７】
「親」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞は、あらゆる他のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞に由来するか、あらゆる方法、装置または技術を用いて生成され、親そのものが天然か、突然変異体である任意のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子または細胞である。親ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、親タンパク質または酵素をコードする。
【００３８】
ＣＢＨ ＩＩポリペプチドの変異体を提供することに加えて、１）第１の親鎖から分離され、アミノ酸置換基を含むように修飾された変異体ドメイン；および２）第２の親鎖から分離され、新規活性またはドメインを補足する活性を含有するために非修飾または修飾のいずれかから分離されたドメインを含むキメラポリペプチド；が提供される。本発明のキメラポリペプチドの技術にかかる方法をここに開示する。
【００３９】
本発明は、野生型、または親タンパク質と比較して高い熱安定性を有するセルラーゼおよびセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）ＩＩ変異体、突然変異体およびキメラを開示し、野生型タンパク質は配列番号２，４または６からなる。変異体は、配列ＧＥＸＤＧのモチーフを有するＣ末端領域であって、セリンを含有し、前記Ｘは、Ｃ、ＡまたはＧ（配列番号１０７）であり、Ｘは、セリン、セルラーゼ活性を含む変異体と置換され、ポリペプチドは配列ＧＥＸＤＧ（配列番号１０７）においてセリンを欠如している野生型セルラーゼと比較して高い熱安定性を有する。一つの実施形態において、変異体は多くのセルラーゼおよびセロビオヒドラーゼＩＩタンパク質において見出されるモチーフＧＥＣＤＧ（以下により完全に記載する）において少なくともＣｙｓ→Ｓｅｒの突然変異（例えば、配列番号２のアミノ酸３１２−３１６を参照のこと）を含み、熱安定性または活性を向上させた付加突然変異を含んでいてもよい。セルラーゼ間の相同性は、非常に低くてもよい。上記セリン置換基は、配列番号１０７のモチーフ（例えば、ポリペプチドが配列番号２または４と少なくとも６０％以上の相同性がある）を有するあらゆるセルラーゼに適用できる。
【００４０】
例えば、本発明は高い熱安定性およびセルラーゼ活性を有し、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性がある配列を提供し、前記ポリペプチドは、セルラーゼ活性およびその相当するＣｙｓ→Ｓｅｒ突然変異を欠如している親（野生型）タンパク質と比較して高い熱安定性を有する。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明は上記ポリペプチドを提供するが、それらはさらに配列番号６４の配置として同定される少なくとも１つの付加的な突然変異を含み、配列番号６４は位置４１３でＰｒｏ、位置２３１でＳｅｒまたはＴｈｒ、位置３０５でＳｅｒまたはＴｈｒ、位置４１０でＧｌｎまたはＡｓｎ、位置８２でＧｌｕ、または上記のあらゆる組み合わせ置換を包含する。同様の置換は、アミノ酸配列の配列番号２，４，６，１２−６３および６５−７８と、配列番号６４の配列の配置として同定する。
【００４２】
本発明は、組み換えにより生成されたか、合成されたか、非天然的に生成されたか、のいずれの実質的に生成されたポリペプチドをも提供するものであり、該ポリペプチドは、Ｃ→Ｓ置換位置を除き、下記の１−１０、１０−２０または２０−３０の位置の同定された配列の保存アミノ酸置換を有する：
Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【００４３】
「分離されたポリペプチド」は、自然に伴う他の混入物、例えばたんぱく質、脂質およびポリヌクレオチドから抽出されたポリペプチドを指す。用語は、それら天然に分泌された環境または発現系（例えば宿主細胞または生体外合成）から除去されたか、精製されたポリペプチドを包含する。
【００４４】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチドの種類が主成分として存在する組成物（即ち、モルまたは重量に基づいて、ポリペプチドがあらゆる他の各々の高分子成分より組成物において多量に存在する）を指し、対象となる成分がモルまたは％重量によって示される高分子成分の少なくとも約５０パーセントを含む場合、一般的に実質的に精製された組成物とする。概して、実質的に純粋なポリペプチド組成物は、モルまたは重量％で組成物中に存在する全ての高分子成分の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上含まれる。いくつかの実施形態において、目的の成分は、実質的に均質となるまで精製され（即ち、混入物成分は従来の検出法によって組成物中に検出されない）、組成物は実質的に単一の高分子成分からなる。溶媒の種類、低分子成分（＜５００ダルトン）および基本的なイオン成分は、高分子成分としては考慮されない。
【００４５】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される、規定された配列を指す。参照配列は、例えば、遺伝子全長またはポリペプチド配列全長の断片のような、より長鎖の配列のサブセットとしてもよい。概して、参照配列の長さは、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも２５ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも５０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、または核酸またはポリペプチドの全長とすることができる。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列の間で類似の配列（即ち、完全な配列の一部）を含み、（２）２つの配列の間で異なる配列をさらに含むため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の比較は、配列類似性の局部領域を同定し、比較するため、典型的に２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較領域」にわたって比較することによって実施される。
【００４６】
「配列相同性」は、２つのアミノ酸配列が、比較領域にわたって実質的に相同性（即ち、アミノ酸−アミノ酸比較に基づく相同性）があることを意味する。「配列類似性」の用語は、同じ生物物理学的な特徴を共有する同様のアミノ酸を指す。「配列相同性のパーセンテージ」または「配列類似性のパーセンテージ」の用語は、２つの最適に配置された配列を比較領域にわたって比較し、適合する位置を計数するため、相同性残基（または同一残基）が双方のポリペプチド配列存在する位置を計数し、比較領域（即ち、領域サイズ）における適合する位置の数を総数で除算し、配列の一致のパーセンテージ（または配列類似性のパーセンテージ）を算出し、結果を１００で乗算して、得ることができる。ポリヌクレオチド配列に関して、配列の相同性および類似性の用語は、タンパク質配列に関して記載されるそれと同様に、比較領域にわたって、２つのポリヌクレオチド配列が同一（ヌクレオチド−ヌクレオチド比較に基づく）である「配列相同性のパーセンテージ」の意味を有する。このように、ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセンテージ（またはポリヌクレオチド配列の類似性のパーセンテージ、例えば、分析アルゴリズムに基づいたサイレント置換または他の置換）も算出することができる。最大の相関性は、ここに記載の１つ以上の配列アルゴリズム（または当業者が利用できる他のアルゴリズム）の使用、または目視によって決定することができる。
【００４７】
ポリペプチドに適用する場合、実質的な相同性または実質的な類似性の用語は、最適な配列を有する場合の２つのペプチド配列が、初期条件のギャップ重量（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムや、目視等において、配列の相同性または類似性を共有することを意味する。同様に、二つの核酸において、実質的相同性または実質的類似性の用語は、最適な配列を有する場合の２つの核酸配列が、初期状態のギャップ重量を用いたＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのプログラムやまたは目視等において、配列相同性または類似性を共有することを意味する。
【００４８】
配列相同性または配列類似性のパーセンテージを決定するために適切なアルゴリズムの１つの例は、Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載されたＦＡＳＴアルゴリズムである。またW. R. Pearson, (1996) Methods Enzymology 266:227-258を参照してもよい。相同性または類似性のパーセンテージを算出するため、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントにおいて使用するのに好ましいパラメーターは、以下の様に最適化される：BL50 Matrix 15: -5, k-tuple=2; joining penalty=40, optimization=28 ; gap penalty -12, gap length penalty=-2;およびwidth=16。
【００４９】
実用的なアルゴリズムの他の例として、ＰＩＬＥＵＰが挙げられる。ＰＩＬＥＵＰは、進行する対となる配置（アライメント）を使用して、連関する配列群からの多重配列アライメントを作成することにより、配列群の相関性および配列相同性と配列類似性のパーセンテージを示す。それは、進行するアライメントを形成するためのクラスター関係を示す、樹状図または系統樹もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle, (1987) J. Moｌ. Evol. 35:351-360の進行アライメント法を簡略化したもの使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151- 153, 1989に記載された方法に類似の方法である。プログラムは、最高３００の配列を配置（アライン）することができ、それぞれ最長５０００のヌクレオチドまたはアミノ酸を配置することができる。多重アラインメント法は、２つの最も相同性のある配列対のアライメントから始まり、２つのアラインされた配列のクラスターを生成する。その後、該クラスターは、次に最も関連した配列またはクラスター配列のクラスターにアラインする。２つのクラスターの配列は、２つの個々の配列の対アライメントの単純な延長によって配置される。最終的なアライメントは、一連の前進的な対アライメントによって達成される。プログラムは、配列比較領域における、特定の配列およびそのアミノ酸もしくはヌクレオチドの連携を設計すること、およびプログラムパラメーターを設計することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用することで、参照配列を以下のパラメーターを使用した関連の他の試験配列と比較し、パーセント配列相同性のパーセンテージ（または配列類似性のパーセンテージ）を決定した。：初期状態のギャップ重量（３．００）、初期状態のギャップ長さ（０．１０）および重量化した末端のギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン７．０から得られる。
【００５０】
多数のＤＮＡおよびアミノ酸配列に適したアルゴリズムの他の例としては、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムが挙げられる。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列群間の複数の対比較を実行し、それらを多重のアライメント配列の相同性に基づいて組み立てる。ギャップオープンおよびギャップエクステンションのペナルティーは、それぞれ１０および０．０５であった。アミノ酸アライメントに関して、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムをタンパク質重量マトリックスとして使用することができる。
【００５１】
上記のように、セロビオヒドラーゼおよびセルラーゼファミリーのメンバーは、配列アライメントおよびＧＥＣＤＧモチーフへの置換（例えば、配列番号２のアミノ酸３１２−３１６を参照のこと）によって同定することができる。修飾されたポリペプチドは、有利な活性を導入するように修飾されたものを同定するため、その後以下に記載されるような様々な温度および条件で、その活性を分析される。典型的な配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号であり、参照によりここに援用される配列から見出すことができる。
【００５２】
【表１】
【００５３】
さらに他の実施形態において、改良した熱安定性のある多様なセルラーゼポリペプチドファミリーは、Ｃ→Ｓ、Ｇ→ＳまたはＡ→Ｓ置換を有する以下の表に示すものを含む。さらに、以下の表に一致する置換、セルラーゼ活性および熱安定性のあるものを有する、以下いずれかの配列と８５％、９０％、９５％、９８％または９９％配列の一致を有するポリペプチドも本発明に包含される。
下表は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと高い相同性を有するタンパク質配列に関するアミノ酸の枠内（ｆｒａｍｅ ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ Ｃｙｓ３１１のアライメントをしめす。残基３１１に想到する位置を下線太文字で示す。この試験において検討された組み換え型Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＰ． ｃｈｒｙｓ ＣＢＨＩＩの配列は、Ｈ． ｉｎｓｏおよびＰ． ｃｈｒｙｓとして示す。２５０個のうち、最も相同性のある配列の５４個は、重複しているため省略した（即ち、構造研究のための点突然変異体または＞９５％一致するイソタイプ）。セルラーゼに関する受入番号が同定され、相当する配列が、ここに参考文献によって受入番号から直接複製されるように、本発明に組み込む。受入番号と関連する配列が、配列番号７９−１０６として参照される。太字下線部の残基（例えばＣ、ＡまたはＧ）は、Ｓに置換される。配列番号は、下記の配列中の数値による：
【００５４】
【表２】
【００５５】
開示の目的のため、親セルラーゼより少なくとも約４℃または少なくとも約９℃高いＴ５０、例えば約４℃から約３０℃高い、もしくはその間のあらゆる値のＴ５０を有するセロビオヒドラーゼ、または約９℃から約３０℃高い、もしくはその間のあらゆる値のＴ５０を有するセロビオヒドラーゼの場合、親セロビオヒドラーゼと比較したとき、開示のポリペプチドは、相当する親ポリペプチドに関して改良された熱安定性を示す。Ｔ５０は、１５分間のプレインキュベーション後、修飾された酵素または天然の酵素が、その残留活性の５０％を保持する温度であり、以下の実施例または従来技術における詳細な分析によって測定される。
【００５６】
開示の修飾されたセロビオヒドラーゼまたはセルラーゼは、相当する親セロビオヒドラーゼ（例えば配列番号２，４または６）より約４℃から約３０℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約５℃から約２０℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約８℃から約１５℃高いか、もしくはその間の範囲にあり、約９℃から約１５℃高いか、もしくはその間の範囲にあるＴ５０を有していてもよい。例えば、修飾されたセルラーゼは、相当する親セロビオヒドラーゼのものより少なくとも約４，５，６，７，８，９，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８または３０℃高いＴ５０を有することがあり得る。
【００５７】
ここに同定される変異体も、セロビオヒドラーゼを生成するために使用することができる。例えば、ＳＣＨＥＭＡは、何百もの活性β−ラクタマーゼおよび活性シトクロームＰ４５０の酵素キメラのファミリーを形成するため、前もって使用されてきた。ＳＣＨＥＭＡは、ブロックが異なる親同士で交換されたときに分解されるアミノ酸側鎖接触のライブラリー平均数である＜Ｅ＞を最小化する、接触したアミノ酸の「ブロック」の境を規定するため、タンパク質構造データを使用する。β−ラクタマーゼキメラが折り畳まれ、活性を有する可能性が、その配列のＥの値に反比例することが示された。突然変異のライブラリー平均数＜ｍ＞に対する＜Ｅ＞を最小化するようなブロック境界を同定するため、ＲＡＳＰＰ（最短距離問題としての組み換え）アルゴリズムが使用された。３つの親からの８つのブロック（３８＝６，５６１通りの配列）を含む、β−ラクタマーゼの収集物を特徴とする５００個までの２０％を超える固有のキメラは、触媒活性を有する。同様の方法により、２，３００の新規の、触媒活性がある酵素を含む３つの親からの８ブロックのシトクロームＰ４５０キメラファミリーを生成した。これら２つの収集物からのキメラは、最も近い親から、それぞれ平均して６６および７２の多数のアミノ酸配列の突然変異を有することを特徴とする。したがって、ＳＣＨＥＭＡ／ＲＡＳＰＰは、著しい配列多様性、およびかなりの部分の機能メンバーを有するキメラファミリーの設計を可能とした。
【００５８】
ＳＣＨＥＭＡキメラの熱安定性が、配列の小さいサンプルからの配列安定性データに基づいて予測されることが、示されてきた。１８４のシトクロームＰ４５０キメラの熱安定性に関する直線回帰モデルは、ＳＣＨＥＭＡブロックが、熱安定性に付加的な寄与をすることを示した。３００を超えるキメラが、このモデルによって熱安定性であると予測され、試験された全４４が最も安定した親と比較して、より高い安定性を有した。わずか３５の熱安定性試験の使用によって、最も熱安定性のあるキメラを予測することができた。さらに、熱安定性のあるＰ４５０キメラは、キメラ形成がさらなる実用的な酵素特性を導くことができることを証明する、固有の活性および特性プロフィールを示した。ここでＳＣＨＥＭＡ組換え型のＣＢＨ ＩＩ酵素は、高温で、長期間にわたって、幅広い範囲のｐＨ条件下のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）において、活性を有するキメラセルラーゼを生じることができる。
【００５９】
ここに記載の方法を使用して、セロビオヒドラーゼ活性を有する多くのキメラポリペプチドを、野生型親ＣＢＨ ＩＩタンパク質と比較して、改良した特性を有するものとして産生した。
【００６０】
新規ＣＢＨ ＩＩ酵素の多様なファミリーが、３つの菌のＣＢＨ ＩＩ酵素からの配列のブロックを交換することによって作成された。このセットから採取された４８のキメラ配列のうちの２３個は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって活性形状で分泌され、５つは６３℃で最も安定な親より長い半減期を有する。この４８のメンバーのサンプルセットが、存在し得る全６，５６１配列の１％未満であるので、このキメラの収集物は、１００もの活性型、熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩ酵素、ＣＡＺｙデータベースにおけるより少数化された約２０の菌ＣＢＨ ＩＩ酵素を有することが予測される。
【００６１】
熱安定性を促進するブロックを同定するためにサンプルセット配列安定性データを使用する方法は、第２のＣＢＨ ＩＩ検証セットにおける全１０個の触媒活性キメラが、最も安定な親である好熱性菌Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓからの天然の熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩより熱安定性であることにより検証された。したがって、本発明は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから触媒活性を有する形態で発現する全３３の新規ＣＢＨ ＩＩ酵素を生じ、そのうち１５は、それらが生成される最も安定な親より熱安定性である。これら１５の熱安定性のある酵素は、互いにおよび、それらに最も近い天然相同物から、それぞれおよそ９４および５８アミノ酸の位置で異なる。
【００６２】
組み合わせたサンプルおよび検証セットにおけるＣＢＨ ＩＩキメラの熱安定性の分析は、同じキメラに存在する場合Ｂ１Ｐ１、Ｂ６Ｐ３、Ｂ７Ｐ３およびＢ８Ｐ２として同定された４つの熱安定のあるブロックが、熱安定性に累積的に寄与することを示す。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩと比較してより熱安定性のある５つのサンプルセットキメラのうちの４つは、２つまたは３つの安定性のあるブロックを含む（Ｔａｂｌｅ１）。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素より比較的安定な全ての検証セットの１０個の活性型メンバーは、すべてＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素より安定しているが、３つまたは４つの安定性のあるブロックを含有するこの群において、最も熱安定性のある６つのキメラのうちの５つで、少なくとも２つの安定性のあるブロックを含有する。
【００６３】
本発明は、安定性ブロックが組みかえられ、新規の、高い安定性を有する活性型セルラーゼが生成されることを示す。安定性回帰モデルは、ＣＢＨ ＩＩ ＳＣＨＥＭＡライブラリーが親酵素の最も安定なものと比較しても、より安定が２．０２６のキメラを有することを予測する。これらのキメラは多様であり、生来のセルラーゼと明確に区別できる：それらは親から８から７２箇所の突然変異（平均５０箇所）、キメラ間では平均６３箇所の突然変異を有して多様化される。このセットから計３３個の遺伝子がＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて合成され、発現される：これらキメラＣＢＨ ＩＩの全てについて、６３℃またはＴ５０での不活性化の半減期が測定され、いずれも好熱性菌Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来の最も安定な親セルラーゼと比較しても、より安定であることが見出された。８個のみのブロックのキメラを作成して配列の複雑化を減少させることで、配列安定性モデルの生成および単一の高い安定性のある配列ブロックの同定が可能となる。このブロックにおける１０個のみのアミノ酸置換の試験をすることによって、単一の高い安定化効果のある置換を同定した。キメラおよび生来のＰ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素にわたってＣ３１３Ｓ（配列番号６；Ｃ３１４Ｓ、配列番号２；Ｃ３１１Ｓ、配列番号４）の置換による非常に大きな安定性効果が観測され、この位置のあらゆる残基のＳｅｒへの突然変異が、それが導入されたあらゆるセルラーゼ６ファミリーを安定化させることを示す。
【００６４】
組み換えにおける接触分離の数を最小化することは（図２Ｃ）、ブロックがそれぞれ独立してタンパク質全体の安定性を高める、分離されたユニットに近い状態となることを可能としこれにより、累積的またはさらに付加的なキメラの熱安定性向上効果につながる。このＣＢＨ ＩＩ酵素の組み換えに関して、ＳＣＨＥＭＡは前記の接触分離を最小化するのに効果的であった：Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩ結晶構造において規定されるブロックの間の接触は計３０３ヶ所あり、ＣＢＨ ＩＩ ＳＣＨＥＭＡライブラリーのデザインによると、潜在的な接所分離は３３ヶ所のみであった。ＣＢＨ ＩＩ酵素の親が、そのサブドメインに明らかな構造上の特徴を有さず、且つ、８つのブロックのうちの４つのみ（１，５，７および８）が小型の構造ユニットまたはモジュール様の構造を示す場合、接触分離が低値であることはブロックの数が下位構造区分の数を超える場合においてＳＣＨＥＭＡ／ＲＡＳＰＰアルゴリズムが効果的であることを示した。β−ラクタマーゼおよびシトクロームＰ４５０キメラに関して前もって観測されるように、低いＥ値により、キメラの折り畳みおよび活性が予測可能である。ここでは使用しないが、この関係は、高い割合の活性型メンバーを含むキメラサンプルセットを設計するのに有用である。
【００６５】
本発明において、キメラを用いて、ｐＨの安定性をＣＢＨ ＩＩ酵素において改良できるかを検討した。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの特異的活性は、ｐＨが最適値５を超えて上昇するにつれて急激に減少し、一方、安定性のあるブロックを最も産業的に関連のあるＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素上に置換することによって作成されるＨＪプラスは、高いｐＨで顕著にその活性を保持する（図４）。熱安定性のある１１１１３１３２および１３３１１３３２キメラ、またＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩセルラーゼ親は、ＨＪプラスと比較してより幅広いｐＨ／活性特性を有する。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの制限されたｐＨ／活性特性は、いくつかのカルボキシルカルボン酸対の脱プロトン化に起因し、ｐＨ６を超えるタンパク質を不安定化する。ＨＪプラスのブロック７における親３の置換は、カルボキシルカルボン酸対である（ブロック８の）Ｄ２７７およびＤ３１６の間のカルボキシルカルボン酸の対を解除し、アスパラギンサン２７７をヒスチジンに変更する。正荷電のヒスチジンとＤ２７７を置換することは、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと比較してより高いｐＨで、ＨＪプラスが活性を保持することを可能とし、非酸性ｐＨにおける電荷斥力の不安定化を予防することができる。残存する２つの熱安定性のあるキメラならびにＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ親ＣＢＨ ＩＩ酵素のより幅広いｐＨ／活性特性は、ＨＪプラスおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩのＥ５７−Ｅ１１９カルボキシルカルボン酸の対に相応する位置での酸残基の欠如によるものであろう。
【００６６】
ＨＪプラスは、比較的高い特異的活性および高い熱安定性の双方を示す。図５は、これらの特性の長期にわたる加水分解実験における優れた機能を示す：ＨＪプラスは、親ＣＢＨ ＩＩ酵素と比較して７−１５℃高い温度でセルロースを加水分解し、最適温度において、全ての親と比較して著しく向上した長期活性を示した（Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの１．７倍）。ＨＪプラスキメラの特異的活性がＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ親のものより低い場合、この向上した長期活性は、ＨＪプラスの熱安定性に由来し、最適な加水分解温度での比較的長い反応時間にわたる活性を保持できる。
【００６７】
他の２つの熱安定性のあるキメラは、ＨＪプラスの幅広い温度範囲を共有した。この観測は、上昇した温度ｔ１／２と最高動作温度の間の正の相関を支持し、６，５６１のＣＢＨ ＩＩキメラ配列中の多くの熱安定性キメラもセルロースを高い温度で分解できることを示唆する。高い温度での非結晶性ＰＡＳＣ基質を加水分解するこの特性が、熱安定性のある菌ＣＢＨ ＩＩキメラの潜在的有用性をよく予見させる。一方、結晶基質およびリグニン含有基質の比較的困難な研究は、この新規ＣＢＨ ＩＩ酵素グループのバイオマス分解への応用に関して、より完全な評価を可能とする。
【００６８】
バイオマス変換工程の大半は、高いレベルのセルロース加水分解を達成するため、菌セルラーゼの混合物（主にＣＢＨ ＩＩ、セロビオヒドラーゼクラスＩ（ＣＢＨ Ｉ）、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ）を使用する。熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの多様な群を生成することは、酵素混合物を特定の応用および貯蔵のために調製し、最適化することができる、安定で、且つ活性の高いセルラーゼのストックを作成する第１工程である。
【００６９】
「ペプチド断片」は、比較的大きなポリペプチドまたはタンパク質の一部分もしくは断片を指す。ペプチド断片は、それ自身、機能活性を有する必要性がないが、いくつかの場合において、ペプチド断片は、生物学的活性を有するポリペプチドドメインに相当する。安定性に関するペプチド断片は、ペプチド断片を有しないポリペプチドと比較して、安定性、機能または折り畳み度合いを促進するポリペプチドにおいて見出されるペプチド断片である。不安定性にペプチド断片は、ポリペプチド内に存在する場合、安定性、機能または折り畳み度合いを欠く原因として同定されるペプチド断片である。
【００７０】
「融合」、「作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」および「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」は、２つの明白なドメインまたはペプチド断片の化学的または物理学的な結合を幅広く指すため、ここに同じ意味で用いられて使用することができ、作動可能に結合している場合、それぞれのドメインまたはペプチドの断片は、望ましい活性を有する機能的なポリペプチドを提供する。ドメインまたはペプチド断片は、それらが機能的であるようにリンカーペプチドによって結合していてもよく、他の中間体または化学結合によって融合することができる。例えば、２つのドメインは、同じコード配列の一部であってもよく、ポリヌクレオチドは、単一のｍＲＮＡに転写されるようにコード化され、双方のドメインを含む単一のポリペプチドに翻訳されるように、同じ「フレーム」内に存在する。或いは、両方のドメインを各々のポリペプチドとして別々に発現させ、化学的手法により互いに融合させてもよい。具体的には、コーディングドメインは、「フレーム」内で直接的に結合するか、またはペプチドリンカーを間に挟んで隔離されており、単一のポリヌクレオチドをコーディングする形態とする。ペプチドリンカーおよびペプチドのコード配列は、従来技術において既知である。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、ヌクレオチドの多量体型を指す。ある場合において、ポリヌクレオチドは、由来生物の天然に生じるゲノムにおいて、それが隣接する２つのコード配列（１つは５’末端側、もう１つは３’末端側で隣接する）のいずれかには直接隣接しないものを指す。従って、前記用語は、例えばベクター；独立して複製するプラスミドまたはウイルス；原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組み換え型ＤＮＡ、または他の配列から独立して別の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在するものを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾されたいずれかのヌクレオチドであってもよい。ここに使用されるポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域が混合しているＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖領域および二本鎖領域が混合しているＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域が混同したＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドの用語は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ（生物、即ちウイルスのＲＮＡゲノム）並びにゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡにコード化されたｍＲＮＡを包含する。
【００７２】
「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド断片」または「ポリヌクレオチド断片」は、比較的大きなポリヌクレオチド分子の一部を指す。ポリヌクレオチド断片は、タンパク質の機能ドメインをコードする必要はないが、タンパク質の機能ドメインをコードすることもあろう。ポリヌクレオチド断片は、約６ヌクレオチド以上の長さ（例えば、６−２０，２０−５０，５０−１００，１００−２００，２００−３００，３００−４００ヌクレオチド以上の長さ）としてもよい。安定性に関するペプチド断片は、安定性に関するポリヌクレオチド断片によってコードされてもよく、ペプチド断片は、ペプチド断片を欠如するポリペプチドと比較して、ポリペプチドの安定性、機能または折り畳み度合いを促進する。
【００７３】
「キメラ」は、少なくとも２つの異なる親タンパク質の少なくとも２つの断片の組み合わせを指す。当業者に理解されるように、それが関連のある特定の配列であって、そのものが物理的に核酸でないものであれば、実際、断片はそれぞれの親から由来する必要はない。例えば、キメラ菌クラスＩＩセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ ＩＩセルラーゼ）は、２つの異なる親ＣＢＨ ＩＩポリペプチドからの少なくとも２つの断片を有する。２つの断片は、セルラーゼ活性を有する新規ポリペプチドを生じるように結合している。即ち、タンパク質は、いずれかの親タンパク質の全長に一致する配列を有する場合、キメラとはいない。キメラポリペプチドは、２つ以上の異なる親タンパク質からの２つ以上の断片を含む。例えば、それぞれ最終的なキメラまたはキメラのライブラリーにつき、２，３，４，５−１０，１０−２０以上の親がある。それぞれの親ポリペプチドの断片は、非常に短いか、非常に長いこともあり、断片はタンパク質の全長の１〜９０％、９５％、９８％または９９％範囲の連続した長さのアミノ酸配列を有し得る。ある実施形態において、最短の長さは１０アミノ酸である。ある実施形態においては、２つの親タンパクについて単一のクロスオーバー点が定義される。クロスオーバーの位置は、一方の親のアミノ酸断片が終結し、他方の親のアミノ酸断片が始まるところに規定される。従って、単純なキメラは、クロスオーバー位置前の断片が第１の親、クロスオーバー点後の断片が第２の親に属する場所にクロスオーバー位置がある。ある実施形態において、キメラは複数の交差位置を有する。例えば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１−３０個、またはこれを超えるクロスオーバー位置を有する。該クロスオーバーの位置および命名は、いずれも以下に記載するように規定する。２つのクロスオーバー位置および２つの親がある実施形態において、第１の親からの第１の連続断片に続いて、第２の親からの第２の連続断片が続き、これに第１の親由来の第３の連続断片が続く。「連続」とは、顕著な中断断片が存在しないことを示す。これら連続断片は、連続したアミノ酸配列を形成するために結合する。例えば、２つのクロスオーバー１００および１５０を有するＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ（以下「１」とする）およびＨ． ｊｅｃｏｒｉ（以下「２」とする）由来のＣＢＨ ＩＩキメラは、１からの最初の１００個のアミノ酸に、２から次の５０個のアミノ酸が続き、さらにこれに１から残りのアミノ酸が続く形態をとり得て、１つの連続したアミノ酸の鎖として全てが結合している。或いは、ＣＢＨ ＩＩキメラは、２から最初の１００アミノ酸、１から次の５０アミノ酸、次いで２由来の残りに順に続く形態をとってもよい。当業者に理解されるように、キメラの変異体は、本来の配列として同程度に存在し得る。従って、それが変異体キメラの場合、１００％でないそれぞれの断片が、最終キメラ内に存在すべきである。残基の付加、あるいは残基の除去または変性によって変更できる量は、変異体の用語が定義されるのと同様に定義される。当然、当業者に理解されるように、上記のものは、アミノ酸のみでなく、アミノ酸をコードする核酸にも応用することができる。
【００７４】
本発明は、特定の変異体に加えて、ＣＢＨ ＩＩキメラの作成に使用可能な変異体を示す。誘導されたＳＣＨＥＭＡ組み換え型ライブラリーは、セロビオヒドラーゼ酵素の生成に使用され、特に良く研究されたこの多様な酵素ファミリーのメンバー、具体的には下記のセロビオヒドラーゼＩＩ酵素に基づく。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓは親「１」（配列番号２）、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａは親「２」（配列番号４）およびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍは親「３」（配列番号６）。ＳＣＨＥＭＡは、タンパク質の構造一体性に影響を及ぼさずに組みかえることができる、相応するタンパク質の断片の位置を予測する計算方法である（Meyre et al. (2003) Protein Sci., 12: 1686-1693）。この計算は、ＣＢＨ ＩＩ親タンパク質の同定された７つの組み換え点に関してなされ、これにより各ポリペプチドが８つの断片を含むＣＢＨ ＩＩキメラポリペプチドのライブラリーの作成を可能とした。高い安定性を有するキメラは、配列安定性データの線形回帰、または折り畳まれたタンパク質対折り畳まれていないタンパク質のＭＳＡコンセンサス依存分析によって、全体的な安定性への各断片の付加的寄与を決定することで同定できる。ＳＣＨＥＭＡ組換えは、耐性配列の交換が行われても、重要な機能的残基の保存により、キメラが生物学的機能を保持し、高い配列の多様性を示す。
【００７５】
従って、ここに様々な実施形態によって示すように、本発明は、親ドメインのキメラを含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドであり、上記のように、親鎖または結果として生じるキメラのコード配列が、Ｃ→Ｓ置換を含むように修飾することができるものを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、異なる親ＣＢＨ ＩＩタンパク質からのＮ末端からＣ末端までの複数のドメインを有するキメラを含む：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１アミノ酸残基；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２アミノ酸残基；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３アミノ酸残基；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４アミノ酸残基；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５アミノ酸残基；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６アミノ酸残基；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７アミノ酸残基；および断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８アミノ酸残基を含み；
ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４または配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８または配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７または配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４または配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１または配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６または配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１６を含み；ｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４または配列番号６を有する。
【００７６】
以下のドメインの参照を用いて、Ｔａｂｌｅ１に示すように、多くのキメラ構造が作成された。
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩに関して測定された６４．８ＣのＴ５０値を予測するＴ５０値を有する１，５８８ＣＢＨ ＩＩキメラ配列。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
【表７】
【００８２】
上記表において、それぞれの桁は、キメラＣＢＨ ＩＩポリペプチドのドメインを指す。数字は、ドメインが由来する親鎖を示す。例えば、配列１２１１１１３１を有するキメラＣＢＨ ＩＩキメラポリペプチドは、ポリペプチドがＮ末端からＣ末端に向かって：配列番号２（「１」）のアミノ酸配列約１からｘ１に結合した配列番号４（「２」）のアミノ酸配列約ｘ１からＸ２、これに結合した配列番号６（「３」）のアミノ酸配列約ｘ２からｘ３、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ３からｘ４、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ４からｘ５、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ５からｘ６、これに結合した配列番号６（「３」）のアミノ酸配列約ｘ６からｘ７、これに結合した配列番号２のアミノ酸配列約ｘ７からｘ８（例えばＣ末端）を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＣＢＨ ＩＩポリペプチドは、以下からなる群から選択されるキメラ断片構造を有する。
【００８４】
【表８】
【００８５】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２，４または６の野生型ポリペプチドと比較して改良した熱安定性を有する。ポリペプチドの活性は、実施例に記載されているように、１つの、または組み合わされた任意の基質を用いて測定することができる。当業者にとって明白であるように、実施例に記載されたものに例示される化合物のクラスの他の化合物を試験することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、参照配列のアミノ酸配列に様々な変更を加えた形態であってもよい。この変更は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠如または挿入であってもよい。この変更が置換である場合、変更は保存、非保存の置換、または保存、非保存の組み合された置換の組み合わせである。例えば、キメラは、配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置でＣ→Ｓ置換を含むことができる。
【００８７】
従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＮ末端からＣ末端において一般的な構造を含むことができる：（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７アミノ酸残基および１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有し；ならびに断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８アミノ酸残基を含み、１−１０個の保存されたアミノ酸の置換を有する；
【００８８】
従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までの一般的な構造を含むことができ、ｘ１は配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７または配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４または配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８または配列番号４もしくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７または配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４または配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１または配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６または配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１６を含み；ｘ８はポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が配列番号２、配列番号４または配列番号６を有し、キメラは以下のＴａｂｌｅ１のようなアルゴリズムを有し、キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１に相当するＣ→Ｓ置換を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換される置換基の数は２，３，４，５，６，８，９，１０個またはこれを超える数となり得る（例えば、１０−２０，２１−３０，３１−４０および同類のアミノ酸置換）。
【００９０】
いくつかの実施形態において、機能的なＣＢＨ ＩＩポリペプチドは、例えば実施例に記載の基質に対して、高い熱安定性を有すると共に、セルラーゼ活性を有することができ、また参照するセロビオヒドラーゼまたはその断片に一致する一定のレベルのアミノ酸を有することもできる。参照とする酵素またはその断片は、野生型（例えば天然発生）または改変された酵素由来のもとを使用できる。従って、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への一般的な構造を含むことができる：
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７のアミノ酸残基少なくとも５０−１００％の一致がある配列を含み、断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）、配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８のアミノ酸残基で少なくとも５０−１００％一致がある配列を含み；
ｘ１は、配列番号２の残基４３，４４，４５，４６，４７、配列番号４もしくは配列番号６の残基４２，４３，４４，４５，４６；ｘ２は、配列番号２の残基７０，７１，７２，７３，７４、配列番号４もしくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４；ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１９，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８、配列番号４もしくは配列番号６の残基１１９，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６；ｘ４は、配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６，１５７、配列番号４もしくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６；ｘ５は、配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３，２２４、配列番号４もしくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２，２２３；ｘ６は、配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０，２６１、配列番号４もしくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９，２６０；ｘ７は、配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５，３１６、配列番号４もしくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５，３１８；ｘ８は、ポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基が、配列番号２、配列番号４または配列番号６を有するものであり、キメラは以下に記載された表１のようなアルゴリズムを有し、キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置にＣ→Ｓ置換を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドのそれぞれの断片は、それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６の（断片１）、（断片２）、（断片３）、（断片４）、（断片５）、（断片６）、（断片７）および（断片８）を参照とする断片と比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える配列の一致を有することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異体は、配列番号２，４または６の野生型ポリペプチドと比較して改良した熱安定性を有するものであり；キメラは配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置のＣ→Ｓ置換を含む。
【００９３】
ここに記載のキメラ酵素は、様々な形態、例えば溶解物、粗抽出液または精製物として調製することができる。ポリペプチドは、適切な溶液に溶解することができて；粉末、例えばアセトン粉末（安定剤存在下、または不存在下で）として調製することができるか、凍結乾燥物として調製することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは単離されたポリペプチドであることができる。
【００９４】
いくつかの実施形態においてポリペプチドは、アレイの形態とすることができる。酵素は、溶解した状態で、例えばミクロタイタープレートのウェル内の溶液としたり、または基質上に固相化したりすることができる。基質としては、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミドならびにその共重合体、およびそのグラフトから構成することができる、固体基質または多孔性基質（例えば膜）が挙げられる。固体サポートは、無機、例えばガラス、二酸化ケイ素、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくはプラチナ等の金属としてもよい。基質の構造は、ビーズ、球体、粒子、顆粒剤、ジェル、膜または面の形態としてもよい。面は平ら、実質的に平らまたは非平面とすることができる。固体サポートは、多孔性であっても無孔であってもよく、膨張性であっても非膨張性であってもよい。固体サポートは、ウェル、くぼみ、または他の容器、入れ物の構成とでき、その特性および場所を変えることもできる。複数のサポートは、試薬のロボットデリバリー、または検出法および／または計測器がアドレス可能な、多様な箇所のアレイ上に構成することができる。
【００９５】
本発明は、ここに開示した改変ＣＢＨ ＩＩポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組み換え型ポリヌクレオチドのため、遺伝子発現を制御する１つ以上の異種の調節または制御配列に作動可能なように結合することができる。ＣＢＨ ＩＩキメラをコード化する異種ポリヌクレオチドを含む発現構造は、ポリペプチドを発現するため、適切な宿主細胞内に導入することができる。
【００９６】
ＣＢＨ ＩＩキメラ酵素の特定の配列の知識を有する場合（例えばキメラＣＢＨ ＩＩの断片構造）、ポリヌクレオチド配列は、
形成されるＣＢＨ ＩＩキメラ酵素のアミノ酸配列は、当業者にとって自明の形状となるであろう。様々なアミノ酸に相当するコドンの知識とポリペプチドのアミノ酸配列の知識とを組み合わせれば、当業者は、本発明のポリヌクペプチドをコード化する異なるポリヌクレオチドを作成することが可能である。従って、本発明は、コドンの組み合わせを選択することによって、いくつかの可能性のある構成のポリヌクレオチドの変異体を想起させるものであり、そのような変異体はすべて、ここに記載のポリペプチドとして、ここに明確に開示されているものと理解されるべきである。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ここに記載のポリペプチドをコード化するが、参照するキメラポリペプチドのＣＢＨ ＩＩ変異体をコード化し、上記のようにＣ→Ｓ置換（例えば、ポリペプチドまたはキメラは、配列番号２のＣ３１４または配列番号４のＣ３１１の位置のＣ→Ｓ置換を含む）を有するポリペプチドと、ヌクレオチドレベルで、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列の一致を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドをコード化する分離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するため、様々な方法にて処理することができる。ベクターへの挿入前に単離されたポリヌクレオチドを処理する工程は、発現ベクターによっては、必要とされ、、または必須とされる。組み換えＤＮＡ法を用いて、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、従来技術において周知である。この技術に対する教示は、Sambrook et al . , 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007に提供されている。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に関する制御配列に機能的に関連している。いくつかの実施形態において、制御配列は、細胞外または細胞内のポリペプチドをコード化し、宿主細胞に相同性または異種性のいずれかの遺伝子から得られる適当なプロモーター配列とすることができる。細菌宿主細胞に対して、本発明の核酸構造の転写を誘導するのに適切なプロモーターとしては、大腸菌ラクトースオペロン、枯草菌ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスメガテイルムキシロースを用いる遺伝子（例えばRygus et al., (1991) Appl . Microbiol. Biotechnol. 35:594-599; Meinhardt et al., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol . 30:343-350）、原核生物βラクタマーゼ遺伝子（Villa- Kamaroff et al., (1978) Proc . Natl Acad. Sci . USA 75: 3727-3731）ならびにｔａｃプロモーター（DeBoerその他, (1983) Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25）が挙げられる。様々な適切なプロモーターが、Scientific American, 1980, 242:74-94の"Useful proteins from recombinant bacteria";およびSambrookその他の文献に記載されている。
【０１００】
いくつかの実施形態において、制御配列はまた適切な転写停止（ターミネーター）配列であり、宿主細胞によって転写を停止することが認識される配列としてもよい。停止配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の３’末端に作動可能に結合している。選択した宿主細胞において機能的なあらゆるターミネーターが使用可能である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、制御配列は、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の５’末端に作動可能に結合される。選択した宿主細胞において機能的なあらゆるリーダー配列が使用可能である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコード化するシグナルペプチドコード領域としてもよく、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へ誘導する。核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に分泌されたポリペプチドをコード化するコード領域の断片と翻訳リーディングフレーム内の、天然に結合したシグナルペプチドコード領域を含むことができる。或いは、コード配列の５’末端は、コード配列とは異質のコード領域のシグナルペプチドを含むことができる。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない部分において、異質のシグナルペプチド領域が必要とされる。細菌の宿主細胞に関する効果的なシグナルペプチドのコード領域は、バチルス属ＮＣＩＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモファイルスαアミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス・スブチリシン、バチルス・リケニフォルミス・βラクタマーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコードとしてもよい。さらなるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, (1993) Microbiol Rev 57: 109-137に記載されている。
【０１０３】
さらに、本発明は、導入される宿主の種類に応じて、形成されたＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む組み換え型発現ベクター、および、例えばプロモーターおよびターミネーター、複写原点等のうちの１つ以上の、発現制御領域について示す。発現ベクター作成において、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に結合するようにベクター内に局在する。
【０１０４】
組み換え型発現ベクターは、有効に組み換え型ＤＮＡ方法の対象として使用可能であり、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすあらゆるベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）を使用できる。通常、ベクターの選択肢は、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存する。ベクターとしては、線状または閉鎖環状プラスミドを使用してもよい。
【０１０５】
発現ベクターとしては、独立した複製ベクター、即ち染色体複製から独立して複製される染色体外のものとして存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外の要素、ミニ染色体または人口染色体が使用可能である。ベクターは、自己再生を確実にするためのあらゆる手段を含むことができる。或いは、ベクターは宿主細胞内に導入されたとき、ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものを含むことができる。さらに宿主細胞のゲノム内に導入するため、全ＤＮＡを共に含む単一のベクター、プラスミドまたは２つ以上のベクターまたはプラスミドまたはトランスポゾンが使用可能である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の選択を容易とする、１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーは、殺生物性またはウイルス抵抗性、重金属抵抗性、独立栄養体への原栄養性、等を与える遺伝子産物である。細菌性の選択可能なマーカーの例は、枯草菌もしくはバチルス・リケニフォルミスからのｄａｌ遺伝子、抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）への抵抗性またはテトラサイクリンへの抵抗性を与えるマーカーである。他の実用的なマーカーは、当業者にとって明白であろう。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明はＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞中におけるポリペプチドの発現に関する１つ以上の制御配列に作動可能に結合されるものを含む。本発明の発現ベクターによってコード化されるポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、従来技術において周知であり、大腸菌および巨大菌等の細菌細胞；酵母細胞、ＣＨＯ細胞等の真核生物細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびボーズ・メラノーマ細胞等の動物細胞；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の適切な宿主細胞は、当業者にとって明白であろう。上記宿主細胞への適切な培養培地および成長条件は、従来技術において周知である。
【０１０８】
本発明のＣＢＨ ＩＩ変異体またはキメラポリペプチドは、従来技術において周知の方法を用いて作成することができる。ポリヌクレオチドは、例えばSambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007に提供されるような組み換え技術によって合成することができる。酵素をコード化するポリヌクレオチドまたは増幅のためのプライマーについても、既知の合成方法、例えばBeaucage et al., (1981) Tet Lett 22:1859-69に記載のホスホラミダイト法、またはMatthes et al., (1984) EMBO J. 3:801-05に記載の方法のような、標準的な固相法によって調製可能であり、通常、これらの方法は、自動化合成法として実施される。さらに実質的なあらゆる核酸は、様々な商業的供給源、例えばThe Midland Certified Reagent Company（テキサス州ミッドランド）、The Great American Gene Company（カリフォルニア州ラモナ）、ExpressGen Inc.（イリノイ州シカゴ）、Operon Technologies Inc.（カリフォルニア州アラメダ）等の多様な供給原から入手可能である。
【０１０９】
宿主細胞内に発現する改変酵素は、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、クロマトグラフィーおよび親和性分離（例えば、基質に結合した抗体）等の既知の技術のタンパク質精製手段を用いて、細胞および／または培養培地から回収することができる。細菌、例えば大腸菌からのタンパク質を溶解するために適切な溶液および高効率抽出液が、ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ社から商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＢＴＭとして市販されている。
【０１１０】
ポリペプチドの分離に関するクロマトグラフィー技術は、とりわけ逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーを含む。特定の酵素を精製するための条件が、実際の荷電、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存することは、当業者にとって明白である。
【０１１１】
キメラポリペプチドの組み換えおよび合成に係るＳＣＨＥＭＡの開示は、本明細書およびOteyその他, (2006), PLoS Biol. 4(5): ell2; Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693；２００８年２月１日に出願された米国特許出願番号第１２／０２４，５１５号；２００８年２月７日に出願された米国特許出願番号第１２／０２７，８８５号の実施例に記載されており、その内容の全てをここに参照して取り込む。
【０１１２】
上記のように、ポリペプチドは、様々な応用、例えばとりわけ生物燃料生成、セルロースの分解等に使用することができる。
【０１１３】
以下の実施例は、本発明についての付加的な説明をするものであり、前記開示または添付の特許請求の範囲に制限するものではない。
【実施例】
【０１１４】
＜ＣＢＨ ＩＩ発現プラスミドの作成＞
酵母発現ベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αｓｓ内で、ＣＢＨ ＩＩ酵素をコード化する親およびキメラ遺伝子をクローン化した（図６）。親およびキメラＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインをコード化するＤＮＡ配列を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドンバイアスで、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（ＤＮＡ２．０）およびＤＮＡ２．０を用いた合成により設計した。ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメイン遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで切断して、ベクター中のＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位の間にライゲーションし、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に形質転換した。ＣＢＨ ＩＩ遺伝子は、プライマーＣＢＨ２Ｌ(5'- GCTGAACGTGTCATCGGTTAC-3' (配列番号９)およびＲＳＱ３０８０(5'- GCAACACCTGGCAATTCCTTACC-3' (配列番号１０))を用いて配列決定した。Ｃ末端Ｈｉｓ６親およびキメラＣＢＨ ＩＩ構造は、ＣＢＨ ＩＩ遺伝子を前方プライマーCBH2LPCR (5'' -GCTGAACGTGTCATCGTTACTTAG-3' (配列番号１１))と、Ｈｉｓ６オーバーハングと終止コドンを伴う適切なＣＢＨ ＩＩ遺伝子に相補的な逆方向プライマーを増幅することによって作成された。ＰＣＲ産物は、上記のようにライゲーションされ、形質変換され、配列決定された。
【０１１５】
＜Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＣＢＨ ＩＩ酵素の発現＞
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌ＹＤＲ４８３Ｗ ＢＹ４７４２ （Ｍａｔα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｌｙｓ２Δ０ ｕｒａ３Δ０ ΔＫＲＥ２、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４０１４３１７）は、ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＩＩ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してコンピテント化され、プラスミドＤＮＡを用いて形質転換され、合成ウラシルを欠く寒天培地上に播種された。コロニーは、２０μｇ／ｍＬトリプトファンを添加した５ｍＬ合成デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地（２０ｇ／Ｌデキストロース、６．７ｇ／Ｌデフコ酵母窒素塩基、５ｇ／Ｌバクトカザミノ酸、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．５６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）に入れ、一晩、３０℃、２５０ｒｐｍで培養した。５ｍＬ培養物は、２５０ｍＬチューンエアーフラスコ（Ｓｈｅｌｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の４０ｍＬ ＳＤＣＡＡで希釈し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間振盪した。培養物を遠心分離し、清をｔ１／２分析のため、３０ｋＤａ ＰＥＳ膜を取り付けたＡｍｉｃｏｎ限外ろ過膜を使用して、５００μＬにまで濃縮した。濃縮した上清は、１ｍＭフェニルメチルスルホニルおよび０．０２％ＮａＮ３に供した。Ｈｉｓ６タグを付けたＣＢＨ ＩＩタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元のプロトコールに従って精製し、次いで、タンパク質をＺｅｂａ−Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中に交換した。精製されたタンパク質濃度を、基準としてＢＳＡとＰｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質試薬を使用して測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、濃縮された培養上清２０μＬまたは精製されたＣＢＨ ＩＩ酵素約５μｇのいずれかを、７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上に加え、シンプリーブルーセーフステイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによって実行した。ＣＢＨ ＩＩ上清または精製されたタンパク質は、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、１時間、３７℃、製造元のプロトコールに従って処理した。濃縮された酵母培養上清中のＣＢＨ ＩＩ酵素活性は、３７．５μＬの濃縮された培養上清を３７．５μＬ ＰＡＳＣに添加し、２時間５０℃でインキュベーションして測定した。形成された還元糖等価物は、以下のようなソモギ・ネルソン分析によって測定した。
【０１１６】
＜半減期、特異的活性、ｐＨ活性および長期セルロース加水分解の測定値＞
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。基質へのＣＢＨ ＩＩ酵素活性を向上させるため、ＰＡＳＣを１０ｇ／Ｌの濃度で５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中の１０ｍｇ／ｍＬＡ． ｎｉｇｅｒエンドヌークレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃で１時間プレインキュベーションした。エンドグルカナーゼを、９５℃まで加熱し、１５分間処理することで不活性化し、ＰＡＳＣを２回、５０mＭ酢酸緩衝剤を用いて洗浄し、脱イオン水中に１０ｇ／Ｌとなるように再懸濁した。
【０１１７】
ＣＢＨ ＩＩ酵素ｔ１／２は、以下に記載するように、処理されたＰＡＳＣとインキュベーションした後、濃縮したＣＢＨ ＩＩ発現培養上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ソモギ・ネルソン還元糖分析で測定されたＡ５２０が０．５となる濃度でｐＨ４．８）に添加することによって測定した。３７．５μＬのＣＢＨ ＩＩ酵素／緩衝剤の混合物を、６３℃の水浴で不活性化した。不活性化後、３７．５μＬのエンドグルカナーゼ処理したＰＡＳＣを添加し、２時間、５０℃の条件下で加水分解をで実施した。反応上清は、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳプレート（ミリポア）を通してろ過した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて得られたソモギ・ネルソン分析ｌｏｇ（Ａ５２０）値を、バックグラウンドの吸光度について修正処理を施し、マイクロソフト・エクセルを使用して、時間軸に対してプロットすることで、線形回帰から得られるＣＢＨ ＩＩ酵素の半減期のデータを得た。
【０１１８】
特異的活性測定のため、精製ＣＢＨ ＩＩ酵素をＰＡＳＣに添加し、ＰＡＳＣの最終反応量が５ｇ／Ｌで、ＣＢＨ ＩＩ 酵素濃度が３ｍｇ／ｇであり、酢酸ナトリウム濃度２５ｍＭ、ｐＨ４．８のＰＡＳＣを得た。５０℃水浴中でのインキュベーションを２時間行い、還元糖濃度を測定した。ｐＨ／活性特性の測定のため、精製ＣＢＨ ＩＩ酵素を、７５μＬ反応容積中の濃度３００μｇ／ｇのＰＡＳＣに添加した。反応は、１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム／１２．５ｍＭリン酸ナトリウムの緩衝液中で、５０℃で１６時間実施し、還元糖濃度を測定した。長時間のセルロース加水分解測定は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、２０ｍＭ ＮａＣｌの、１ｇ／Ｌ濃度の処理済みＰＡＳＣ３００μＬを用いて行った。精製ＣＢＨ ＩＩ酵素を、１００μｇ／ｇの濃度でＰＡＳＣに添加し、還元糖測定の４０時間前に水浴中にて反応させた。
【０１１９】
ＣＢＨ ＩＩ酵素をコードする５つの親遺伝子候補を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドンバイアスを用いて合成した。５つ全ては、１−８９残基がセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）、弾性リンカー領域およびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ触媒ドメインの５つのＮ末端残基に相当する、Ｎ末端コード配列を含む。Ｈｕｍｉｃｏｌ ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣｈａｅｔｏｍｉｕｎ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからの２つのＣＢＨ ＩＩ酵素候補は、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｌによる３つの他のものより比較的高いレベルで、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから分泌された（図１）。３つのわずかに発現されている候補の親に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンドは、認識困難なため、濃縮培養上清における活性分析は、活性型セルラーゼの存在を確認するため、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）とインキュベートされたものを用いて実施された。図１に示す形成された還元糖からの値は、Ｔ． ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ＣＢＨ ＩＩ以外の全ての酵素に関して、濃縮Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養上清における活性型ＣＢＨ ＩＩの存在が確認された。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ配列は、最も産業的に関連したＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａからの菌ＣＢＨ ＩＩ酵素と組み合わせて選択した。触媒ドメインのそれぞれの配列の一致は、６４％（１：２）、６６％（２：３）および８２％（１：３）であり、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓは親１、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａは親２、Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍは親３とする。これらそれぞれの触媒ドメインは、３６０，３５８，３５９アミノ酸残基を含む。
【０１２０】
産業使用のためにセルラーゼを生成するのに最も頻繁に使用される生命体である糸状菌Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａにおける異種タンパク質発現は、酵母と比較して非常に困難である。組換え型セルラーゼ活性を減少することが報告されている、高度なグリコシル化を最小限にするため、組換え型ＣＢＨ ＩＩ遺伝子をグリコシル化機能を欠損させたｄＫＲＥ２ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株で発現させた。該株は、野生株と比較して、より短いマンノースオリゴマーがＮ−結合型およびＯ−結合型の両方のグリコシル化サイトに結合すると考えられ、これは野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａのＣＢＨ ＩＩ 酵素のグリコシル化に極めて類似している、高マンノース構造を取り除くためのＥｎｄｏＨ処理を伴う条件、および伴わない条件において、ＣＢＨ ＩＩタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を行ったところ、ＥｎｄｏＨ処理によっては、前記菌から分泌された酵素の電気泳動的な可動性が上昇しないことが判明し、野生型Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌が組換え型タンパク質のグリコシル化部位に結合する分岐型マンノース部分を欠くことを確認した。
【０１２１】
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓの高分解性の構造（ｐｄｂ）ＳＣＨＥＭＡのテンプレートとして使用して、組み換えに応じて引離される接触を同定した。ＲＡＳＰＰは、それぞれ１５未満の＜Ｅ＞を有する４つの候補ライブラリーを返した。全ての候補ライブラリーは、以前作成されたキメラライブラリーより低い＜Ｅ＞を示し、折り畳まれた活性型キメラの許容可能な部分は、比較的高い＜ｍ＞を有して得られることが示された。キメラ配列の多様性は、最も大きな＜ｍ＞＝５０を導くようなブロックの境界を選択すると、最大となった。この設計のためのブロックは、図２Ｂに例示され、Ｔａｂｌｅ２に詳細に示される。
Ｔａｂｌｅ２：親ＣＢＨ ＩＩ酵素触媒ドメインのためのＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列アライメント。ブロック２，４，６および８は、ボックスおよびグレーの斜線で示す。ブロック１，３，５および７は、されていない（Ｈ． ｉｎｓｏ：配列番号２、Ｈ． Ｊｅｃｏ：配列番号４およびＣ． Ｔｈｅｒ．：配列番号６）。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインは、８つの螺旋がバレル周縁を規定し、７つの平行のβシートが活性部位を形成するα／βバレル構造を有する（図２Ａ）。２つの延長したループは、活性部位上にルーフを形成し、加水分解中に基質セルロース鎖が通過する通路を形成する。７つのブロック境界のうちの５つは、２次構造の要素の間に収まり、ブロック４は連続的なα螺旋の中央部分から開始し、終結する（図２Ａ、２Ｂ）。ブロック間の側鎖接触の大多数は、初期構造において調節可能なブロック間に生じる（図２Ｃ）。
【０１２４】
４８個のキメラ遺伝子のサンプルセットは、１つの親由来の５つのブロックと、残り２つのうちの１つまたは両方の親由来の３つのブロックを有する、１６個のキメラの３セットとして設計された（Ｔａｂｌｅ３）；それぞれの親の表記がそれぞれのブロックの位置で等しくなるように、配列を選択した。相当する遺伝子を合成し、発現させた。
Ｔａｂｌｅ３：サンプルセットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの配列
【０１２５】
【表１０】
【０１２６】
４８個のサンプルセットのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのうち２３個の濃縮培養上清は、ＰＡＳＣに対して加水分解活性を示した。これらの結果は、６，５６１個のＣＢＨ ＩＩキメラ配列のうち数千（例えば、Ｔａｂｌｅ１を参照のこと）が活性型酵素をコード化することを示す。２３の活性型ＣＢＨ ＩＩサンプルセットのキメラは、顕著な配列多様性を示し、最も近い親の配列と、少なくとも２３および３６、５４および１２３相当のアミノ酸置換を有する。それらの平均突然変異レベル＜ｍ＞は３６である。
【０１２７】
Ｍｅｙｅｒらが、Ｅ、ｍおよびキメラが折り畳まれて活性を有する確率の間の相関を見出したように、同類の相互関係が、サンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラに関して存在するかの分析を実施した。ＰＡＳＣ活性の分析によって測定されるように、濃縮発現培養上清におけるＣＢＨ ＩＩ酵素活性の値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるＣＢＨ ＩＩバンドの強度に相関した（図１）。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ親と同様に、活性はいくつかのＣＢＨ ＩＩキメラに関して検出できないゲルバンドで検出できる。ゲルバンドは示したが、活性を欠失するＣＢＨ ＩＩキメラの存在が観察された。ＣＢＨ ＩＩキメラが活性型の形状で分泌される確率は、Ｅおよびｍの双方に逆相関した。
【０１２８】
熱不活性の半減期（ｔ１／２）は、６３℃における親および活性型キメラのＣＢＨ ＩＩ酵素の濃縮培養上清について測定された。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのＣＢＨ ＩＩ親の半減期は、それぞれ９５，２，２５分であった。活性型サンプルセットのキメラは、１分未満から３，０００超の幅広い半減期を示した。２３個の活性キメラのうちの５つは、最も熱安定のある親であるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩを超える半減期を有した。
【０１２９】
ＣＢＨ ＩＩキメラの半減期のための予測定量的モデルの作成を試みる際、５つの異なる線形回帰データのモデリングアルゴリズムを使用した（表４）。それぞれのアルゴリズムを使用して、それぞれのサンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラおよび親のｌｏｇ（ｔ１／２）のブロック組成物に関するモデルを作成した。これらのモデルは、ブロックのｌｏｇ（ｔ１／２）への寄与を定量化した、熱安定性重量値を構築した。全て５つのモデリングアルゴリズムについて、この工程が、２つのランダムに選択された配列を省略して１，０００回繰り返され、それぞれのアルゴリズムは、２４個のブロックそれぞれに１，０００重量値を示した。それぞれのブロックの熱安定性重量値について、平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。それぞれのモデルアルゴリズムの予測精度は、それぞれのモデルが省略された配列のｔ１／２をどれだけ正確に予測できるかで評価した。１，０００アルゴリズムの繰り返しについての測定値および予測値の間の相関を、モデルアルゴリズムの相互検証スコアとする。５つのモデル全てについての相互検証スコア（Ｘ−ｖａｌ）は、０．０５７以下であり（Ｔａｂｌｅ４）、線形回帰モデリングが、この小さな２３個のキメラｔ１／２データセットの定量的ＣＢＨ ＩＩキメラの半減期予測については適応できないことを示した。
Ｔａｂｌｅ４：５つの線形回帰アルゴリズムのＣＢＨ ＩＩ酵素キメラのブロック安定性スコアへの使用のための相互検証値。アルゴリズムの省略：リッジ回帰（ＲＲ）、部分最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）、サポートベクターマシン回帰（ＳＶＭＲ）、リニアプログラミング・サポートベクターマシン回帰（ＬＰＳＶＭＲ）およびリニアプログラミングブースティング回帰（ＬＰＢｏｏｓｔＲ）。
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】
線形回帰モデリングを使用して、ブロックを質的に安定、不安定または中立に分類した。それぞれのブロックのキメラの熱安定性への影響は、それぞれの回帰アルゴリズムによって測定される熱安定性への寄与を提示するスコアリングを使用して評価した。それぞれのアルゴリズムに関して、中立から１ＳＤを超える熱安定性重量値を有するブロックは、「＋１」として記録し、中立から１ＳＤ以内の熱安定性重量値を有するブロックは０とし、中立から１ＳＤを超えて低い熱安定性重量値を有するブロックは、「−１」として記録した。それぞれのブロックに関する「安定性スコア」は、それぞれ５つのモデルからの１，０、−１の安定性スコアを合計することによって得た。Ｔａｂｌｅ５は、それぞれのブロックに関するスコアを概説する。ブロックＩ／親１（Ｂ１Ｐ１）、Ｂ６Ｐ３、Ｂ７Ｐ３およびＢ８Ｐ２は、比較的高い安定性効果を有するものとして同定された、一方、Ｂ１Ｐ３、Ｂ２Ｐ１、Ｂ３Ｐ２、Ｂ６Ｐ２、Ｂ７Ｐ１、Ｂ７Ｐ２およびＢ８Ｐ３は、最も強くブロックを不安定化することを見出した。
Ｔａｂｌｅ５：５つの線形回帰アリゴリズム１によって生じたサンプルセットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラに関する質的なブロック分類。スコア＋１は、熱安定性重量を有するブロック（キメラの熱安定性へのブロック寄与に関する無次元測定）であり、中立から１ＳＤを超えるもの（安定性）を示し、スコア０は、中立から１ＳＤ内の重量値であるブロックを示し、−１は中性から１ＳＤ超低い重量値を有するブロックを示す（不安定性）。
【０１３２】
【表１２】
【０１３３】
ＣＢＨ ＩＩ酵素キメラをコードする第２セットの遺伝子を合成し、予測された安定ブロックを評価して、最も安定な親より熱安定のあるセルラーゼを同定した。この検証セットに含まれる２４個のキメラ（Ｔａｂｌｅ６）は、最も不安定であると予測される７つのブロックが全くなく、４つの最も安定なブロックに富んでいた。後者のブロックの発現は、安定なスコアに偏っていた。さらに「ＨＪＰｌｕｓ」１２２２２３３２キメラは、予測された最も安定なブロックをＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素内（親２）に置換することによって作成された。
Ｔａｂｌｅ６：２４個の検証セットＣＢＨ ＩＩ酵素キメラの配列中の９つは、活性型で発現した。
【０１３４】
【表１３】
【０１３５】
２４個の検証のセットのキメラの９つのＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現培地の濃縮上清は、ＨＪＰｌｕｓキメラと同様に、ＰＡＳＣに対して活性を示した（Ｔａｂｌｅ６）。活性が検出されていない１５個のキメラのうちの９つは、ブロックＢ４Ｐ２を有した。初期のサンプルセットのＢ４Ｐ２を含有する１６個のキメラのうち１つのみが、ＰＡＳＣに対して活性を示した。キメラセットおよびＨＪＰｌｕｓの両方を合計して、２６個のキメラのうち２つのみが活性化していて、この特定のブロックがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける活性化セルラーゼの発現を阻害することを示した。
【０１３６】
検証セットからの１０個の機能的キメラＣＢＨ ＩＩ酵素の安定性を評価した。安定酵素は既に５０時間を越える半減期を有したため、６３℃、１２時間の熱不活性化後のＰＡＳＣに対する残留加水分解活性を、測定の予備的評価として使用した。この１２時間のインキュベーションによって、サンプルセットの最も熱安定性のあるキメラである１１１１３１３２の活性において、測定可能な減少が生じ、不活性型の熱安定性のあるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ親ＣＢＨ ＩＩを完全に不活性化した。全１０個の機能的な検証セットのキメラは、それらの活性として最も安定な親であるＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩより多い活性を保持していた。
【０１３７】
精製された酵素を使用する選択された熱安定性のあるキメラの活性を分析した。親ＣＢＨ ＩＩ酵素および３つの熱安定性のあるキメラ（最も熱安定性のあるサンプルセットのキメラ１１１１３１３２、最も熱安定性のある検証セットのキメラ１３３１１３３２）およびＨＪプラスキメラ１２２２２３３２を、Ｃ末端Ｈｉｓ６精製タグとともに発現させ、精製した。活性試験中のＣＢＨ ＩＩ酵素の熱不活性化を最小限にするため、２時間（比較的短い時間）、５０℃、ｐＨ４．８でのＰＡＳＣ基質とのインキュベーションを実施した。Ｔａｂｌｅ３に示すように、親およびキメラＣＢＨ ＩＩの特異的活性は、最も活性のあるＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａからの親ＣＢＨ ＩＩ酵素のうちの４つの要素内にあった。ＨＪプラスの特異的活性は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ以外の全ての被験のＣＢＨ ＩＩ酵素を超えていた。
【０１３８】
幅広い範囲のｐＨ／活性特性により、ＣＢＨ ＩＩキメラの広範囲にわたる潜在的なセルロース加水分解条件下での使用を可能とするためには、セルラーゼ活性のｐＨ依存性が重要である。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩは、最適化された活性をｐＨの範囲４から６で有することが観測され、一方この範囲外ではその活性が著しく現象することが観察されてきた（文献１６）。図４は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩ酵素ならびに全３つの精製された熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラが、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩのものより相当広いｐＨ／活性特性を有することを示した。Ｌｉｕらは、Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩに対してｐＨ４を最適条件として報告したが、ここでの組み換え型酵素の最適なｐＨは、７付近であった。天然Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩは、約ｐＨ９で最大活性、ｐＨ４で最大活性の約６０％を示す幅広いｐＨ／活性特性を有する。同様の幅広い特性が、組み換え型酵素について観測された。ＨＪプラスキメラは、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと比較してより幅広いｐＨ／活性特性を有し、他の２つの親ＣＢＨ ＩＩ酵素と同様のｐＨ依存性を示した。
【０１３９】
高温での活性の達成と、長いタイムインターバルを超えた活性の維持は、改変した高安定性ＣＢＨ ＩＩ酵素を実現するための２つの初期目標である。セルロース加水分解における熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラの性能を、温度範囲全体で、４０時間のインターバルで試験した。図５に示すように、３つ全ての熱安定性キメラは、親ＣＢＨ ＩＩ酵素より比較的高い温度でＰＡＳＣに活性を有した。Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩは、５７℃長ではＰＡＳＣを加水分解せず、安定なＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ酵素は６３℃超ではＰＡＳＣを全く加水分解しなかったが、キメラは７０℃で活性を保持した。。長時間のセルロース加水分解分析におけるＨＪプラスの活性は、各々の最適な温度における全ての親の活性を上回った。
【０１４０】
ＣＢＨ ＩＩライブラリーは、いくつかの理由により、崩壊の可能性が比較的低い。ＣＢＨ ＩＩ親配列の高い相同性に加えて、ＣＢＨ ＩＩ折り畳みバレルの立体的構造は、組み換えによって分離することができる長範囲の接触の数を制限する。ブロック間の接触（４．５オングストローム範囲内の重原子）は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ構造１ｏｃｎに由来する接触マップ全体の２７％（５０３／１８３１）のみを含む。残基の組み合わせに係る接触は、キメラにおいてのみ計数可能であり、ブロック内の総計は２３％まで減少した（６８／２９４）。さらに、これら相互作用のほとんどは、タンパク質の表面上の残基間に生じ、溶媒スクリーニングの可能性は、さらに残基間の相互作用の飛躍的な分離の可能性を減少させる（図１４ａ）。１つの例外として、位置１７６−位置２５６間の埋没した相互作用が、図１４ｂに示す。この部位で、Ｂ６Ｐ２と、Ｂ５Ｐ１またはＢ５Ｐ３のいずれかとを有するキメラは、Ｍｅｔ１７３：Ｔｒｐ２５３の対を有する（親のＭｅｔ１７６：Ｐｈｅ２５６の対、またはＬｅｕ１７３：Ｔｒｐ２５３の対と比較して大きなアミノ酸）。しかしながら、親の結晶学的なモデルの精査により、Ｔｒｐ２５３側に位置するタンパク質バックボーン部の可動性や、Ｍｅｔ側鎖の内因的な可撓性のため、この部位における立体衝突は生じにくいと考えられる。特に、１つの特徴的なキメラは、このパターン（１３３３３２３２）に適合し、回帰モデル適合性（６８℃）よれば、親（６７℃）よりも安定である。
【０１４１】
カップリングを生じる他のメカニズムは、ブロック構造の相違であるが、これはブロック接点での新規の残基対の存在に依存するものではない。そのかわり、親配列の相違により、内因性ブロック構造は、モジュール・ブロックの移動を妨げて、多様化することができる。ＣＢＨ ＩＩライブラリーの場合、親の対の高い配列相同性の値（８２％、６６％および６４％）において、構造の偏差は軽度とすることができる（＜１オングストロームＲＭＳＤ）。この可能性は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの結晶学的な構造を比較することによって、評価することができる（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩは結晶構造を欠如しているが、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓと８２％の相同性がある）。それぞれの親からの構造による配列ブロック（１ｏｃｎおよび１ｃｂ２）において、αカーボンＲＭＳＤ値は低くなる（０．５，０．５，０．６，０．５，０．３，０．７，０．３および０．４Ａ ＲＭＳＤ）。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ上に重ねられたＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａブロックを、補足図５ｃに示す。背景に依存した効果を確認するため、対立する宿主構造上にそれぞれアラインされたブロックをスプライシングして、シリコ構造（ｓｉｌｉｃｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の組み換えを実行した。ブロック６および７の間にＡｓｎを挿入して（図１４Ｄ）Ｂ７Ｐ２（１１１１１１２１）を使用した場合、軽度の衝突（２．６５オングストローム）を除き、全ての単一ブロック置換キメラ（例えば１１１１２１１１または２２１２２２２２）に関する衝突しない構造モデルを作成することが可能である（αカーボン＞３オングストローム間隔）。
【０１４２】
様々なブロック／断片のキメラの安定性への寄与を決定するためにさらなる実験を実施し、熱安定性および／またはｐＨ安定性を改良した。ＣＢＨ ＩＩ酵素をコードする親およびキメラ遺伝子を、酵母発現ベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αｓｓ内にクローン化し、合成デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地中で発現させた。アビセル活性分析のため、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培養上清は、１ｍＭフェニルメチルスルホニルおよび０．０２％ＮａＮ３溶液にして、濃縮せずに使用した。濃縮ＳＤＣＡＡ酵母培養上清中のＣＢＨ ＩＩ酵素活性を、３７．５μＬのＰＡＳＣおよび２２５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８に添加することで濃縮培養上清を希釈し、２時間、５０℃でインキュベーションして測定した。形成した還元糖の等量を、ソモギ・ネルソン分析によって測定した。
【０１４３】
ＣＢＨ ＩＩ酵素のＴ５０値を、エンドヌークレアーゼ処理したＰＡＳＣとインキュベーションした後、濃縮したＣＢＨ ＩＩのＳＤＣＡＡ発現培養上清を５０ｍM酢酸ナトリウムに添加し、ソモギ・ネルソン還元糖分析の測定値Ａ５２０が０．５となる濃度でｐＨ４．８となるように調整して測定した。２００μＬのＣＢＨ ＩＩ酵素／緩衝剤混合物を、適温で１０分間、水浴中にてインキュベートした。インキュベーション後、３７．５μＬのエンドグルカナーゼ処理されたＰＡＳＣおよび６２．５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液を添加し、５０℃で２時間加水分解を実施した。酵素の半分の活性が欠如したときのインキュベーション温度を、ソモギ・ネルソン分析のＡ５２０値の対温度プロットの線形補間より算出した。
【０１４４】
長時間のアビセルＰＨ１０１（Ｆｌｕｋａ）加水分解の測定のため、０．３μｇの精製されたＣＢＨ ＩＩを、水浴に配置されたＰＣＲチューブ内で、２７０μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）において３ｍｇのアビセルとともに１６時間インキュベートした。チューブを室温の水浴中で１０分間冷却し、１０００ｇで１０分間遠心分離し、収集した上清を還元糖分析に供した。
【０１４５】
ＹＰＤ発現培養上清中のＣＢＨ ＩＩ活性の評価のため、２ｍＬ〜４０ｍＬの上清を、コニカルチューブにて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）に懸濁された３３ｍｇ／ｍＬのアビセル８００μＬに添加された。ＣＢＨ ＩＩは、アビセルと４℃、１時間で結合し、２０００ｇ、２分間遠心分離し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で２回洗浄された。２回洗浄した後、ＣＢＨ ＩＩと結合したアビセルを、２．７５ｍＬ酢酸ナトリウム緩衝剤中に再懸濁し、２７０μＬの分量で分注して、５０℃で２．５時間インキュベートした。遠心分離および上清還元糖の分析は、上記のように実施した。
【０１４６】
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａにおける線形回帰パッケージを使用して、ＣＢＨ ＩＩキメラＴ５０データを１７パラメーターに適合し、相互検証分析を行った。ブロック効果は、親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ）を基準として、親２および３からのそれぞれ８つのブロックの置換を示す１６パラメーターを用いて、報告された。
【０１４７】
１０分間のインキュベーションにより酵素が５０％の活性を欠如する温度として規定されるＴ５０値は、３つの親セロビオヒドラーゼについて決定した。前の実験からの３３個の活性型ＣＢＨ ＩＩキメラおよび質的に安定なモデルが最も熱安定性があると予測したうちの１８個のさらなるキメラ（即ち不安定と予測されたブロックは一切含まれず、安定性ブロックと予測された４つのうち３つまたは４つが含まれる）についてＴ５０値を測定した。全５１個のキメラ配列を表８に列挙した。以前に分泌されないと分類された全ての熱安定性と予測されるキメラの再培養および再濃縮により、Ｔ５０測定のため、十分量の１２１１２１３２，１３１１１１３２および１３３２２３３２ＣＢＨ ＩＩを得ることを可能とした。キメラおよび親のＣＢＨ ＩＩに関するＴ５０値の完全なセットをが、Ｔａｂｌｅ８に示す。全ての前記ＣＢＨ ＩＩのアミノ酸配列を、Ｔａｂｌｅ７に記載する。試験された全３１個の熱安定性と予測されたキメラは、最も熱安定性のある親酵素（６４．８℃）より２度高いＴ５０値を有する。Ｔａｂｌｅは、熱安定を向上させるため、Ｓｅｒに変異することができるブロック／ドメイン７におけるＣｙｓ残基も同定する。従って、本発明は、以下の配列のあらゆるポリペプチドを提供し、下線／イタリック体／太字のＣｙｓはＳｅｒ残基と置換され、結果として生じたポリペプチドは、野生型酵素と比較して、高い熱安定性を有する。
Ｔａｂｌｅ７：ＣＢＨ ＩＩ親およびキメラ触媒ドメインのためのアミノ酸配列が、Ｔａｂｌｅ８に示される。
Ｔａｂｌｅは、Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩに関する触媒ドメインも含む。全ての組み換え型ＣＢＨ ＩＩは、天然Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩからのＮ末端ＣＢＭおよびリンカーCSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPP PGSTTTRVPPVGSGTATYS （配列番号８）を共有する。
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
【表１５】
【０１５０】
【表１６】
【０１５１】
【表１７】
【０１５２】
【表１８】
【０１５３】
【表１９】
【０１５４】
【表２０】
【０１５５】
【表２１】
【０１５６】
【表２２】
【０１５７】
Ｔａｂｌｅ８：
親ＣＢＨ ＩＩに関する２つの独立した二重のＴ５０値（℃）、２３個の初めのサンプルセットＣＢＨ ＩＩキメラおよび予測される熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラ。この研究のために合成された１８個のキメラは、星印の後に記載される。
【０１５８】
【表２３】
【０１５９】
線形回帰の配列安定性データへの適応は、Ｒ２＝０．８８で観測されたＴ５０値に適合する１０−パラメーターモデルを生じた。トレーニングセット外の回帰モデルの予測性能をよりよく推定するため、１１の折り畳み構造の相互検証をＲ２が０．５７となるように実施し、２つの外れ値を取り除き（１１３１３１２１および２２２２２２２２）、相互検証Ｒ２を０．７６へと増加させた。回帰モデルは、最も安定な親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を基準状態Ｔ５０として使用して、ｐ値≦０．１を有する９つのさらなる項を含む。モデルパラメーター（Ｔａｂｌｅ９）は、親３からのブロック７の単一のブロックが、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩと比較してキメラの熱安定性に最も強く寄与することを示す。Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩからのこのブロックは、それを含むキメラの熱安定性を約８．５℃上昇させる。ｐ値≦０．１の８つの残りのブロックのうち２つによる熱安定性の上昇は、１．２℃および２．７℃と小さかったが、他の６つはその安定性を減少させた。
Ｔａｂｌｅ９：Ｔ５０線状回帰モデルパラメーターおよびｐ値。図１の回帰適合線を算出するために使用されたｐ＜０．１のパラメーター値を太字体で示す。ブロック効果は、親１（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ）を基準状態として、親２および３からのそれぞれ８つのブロックの置換を示す１６パラメーターを用いて報告された。
【０１６０】
【表２４】
【０１６１】
Ｂ７Ｐ１およびＢ７Ｐ３配列のアライメント（図１０）は、Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ酵素において、ブロック７の５６個のアミノ酸のうち、１０箇所で相違する。最も高いＴ５０値を有する２１３１１１３１のキメラのバックボーンにおいて、Ｂ７Ｐ３のそれぞれの残基（親の断片７（配列番号６））は、Ｂ７Ｐ１において相当する残基に個々に変異され、それぞれの点突然変異体についてＴ５０値が得られた。突然変異体Ｓ３１３Ｃは、キメラの熱安定性を著しく変化させた：この単一の突然変異体は２１３１１１３１のＴ５０を約１０℃減少させた（図１１）。
【０１６２】
復帰突然変異の効果を異なる背景において研究するため、Ｃ３１３Ｓ置換をコードするＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親ＣＢＨ ＩＩ遺伝子（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓにおいてＣ３１４Ｓ、およびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａにおいてＣ３１１Ｓ）を作成し、発現させ、酵素のＴ５０値を測定した。安定性のＢ７Ｐ３を野生型Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの酵素内に置換したキメラ、１１１１１１３１および２２２２２２３２の安定性についても定量化した。Ｂ７Ｐ３ブロック置換およびＣｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異体は、親ＣＢＨ ＩＩを著しく安定化させた；最も大きな効果は、Ｃ３１１Ｓ置換を含むＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩへのＴ５０における８℃までの上昇であった。またＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異は、Ｂ７Ｐ３を含まない２つのキメラである、３１３１１１１２および１３２３１１１１ならびに組み換え型の親のセットでない相同するＣＢＨ ＩＩ（Ｐｈａｎｅｒｏａｃｈｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍから）において試験した。Ｐ． ｃｈｙｒｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩの触媒ドメインは、親ＣＢＨ ＩＩ触媒ドメインに５５−５６％のみの相同性がある。これら全ての酵素は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ置換によって安定化された；Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩは１０℃と高い安定化を見せた（図１３）。
【０１６３】
同等のＣ３１３Ｓ突然変異を含む８つの熱安定性のあるＣＢＨ ＩＩキメラおよび親の酵素は、Ｈｉｓ６のタグを付け、精製することで、特異的活性を測定できた。Ｔａｂｌｅ１０Ａに示すように、特異的活性は、５０℃で非結晶性セルロース（ＰＡＳＣ）について観測されるように、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体を含むこれらキメラおよび天然酵素について、野生型親のものと同等であった。従って、高い熱安定性は、特異的活性の代償として現れるものではない。
Ｔａｂｌｅ１０Ａ：天然、点突然変異体および選択される熱安定性のあるキメラＣＢＨ ＩＩに関する特異的活性値（μｇグルコース還元糖等価／（μｇ ＣＢＨ ＩＩ酵素×ｍｉｎ×１０））。エラーバーは、標準誤差を示し、標準誤差は３つの複製に関する標準偏差／ｓｑｒｔ（ｎ）として定義される。２時間の反応、３ｍｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８。
【０１６４】
【表２５】
【０１６５】
Ｔａｂｌｅ１０Ｂ：Ｈ． ｊｅｃｒｏｉｎａおよびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ野生型、Ｃ３１３Ｓ点突然変異体およびＢ７Ｐ３ブロック置換ＣＢＨ ＩＩに関する合成（ＳＤＣＡＡ）および豊富な（ＹＰＤ）発現培養培地上清の双方における全活性。示す値は、セルラーゼ活性分析に添加される発現培養上清ＣＢＨ ＩＩ等価のｍＬ当たりのμｇグルコース／ｍＬセルラーゼ活性分析値である。ＳＤＣＡＡ培養については、濃縮されたＳＤＣＡＡ培養上清が使用され、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）において５０℃で１００分間のリン酸膨潤セルロース（１ｍｇ／ｍＬ）に対する活性が測定された。ＹＰＤ上清ＣＢＨ ＩＩは、アビセルに結合させることによって濃縮し、５０ｍM酢酸ナトリウム（pＨ４．８）において５５℃で１５０分間、アビセル（１５ｍｇ／ｍＬ）に対する活性を測定した。
【０１６６】
【表２６】
【０１６７】
これらの８つの熱安定性のある同一のキメラ（最も安定な親よりＴ５０が２−１０℃高い）は、その後結晶性セルロースへの活性に関して、１６時間のインキュベーションの間、親酵素がほとんど活性を示さない温度を含む幅広い温度範囲で試験した。図９ａは、８つの試験された熱安定性のあるキメラのうちの７つが、６０−６５℃でアビセルに対して最大の活性を示す、８つのキメラ全てについて、７０℃（試験中の最高温度）で、活性を保持していることを示した。対照的に、３つの親ＣＢＨ ＩＩは、５０℃で最大の活性を示したが、７０℃で完全にまたはほぼ完全に不活性となった。さらに高い最適活性温度を有する７つのキメラは、あらゆる親ＣＢＨ ＩＩ酵素と比較して非常の多量のアビセルを加水分解した。図９ｂに示すように、同様の挙動が、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異を含むＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａの親においても観測された。Ｃｙｓ−Ｓｅｒ点突然変異は、アビセル加水分解およびＰ． ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ ＣＢＨ ＩＩにおける最高反応温度を上昇させた。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ親におけるＰ３Ｂ７ブロック置換により、反応温度およびＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩの加水分解は上昇したが、上昇した最高反応温度は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ酵素による全体的なセルロース加水分解を向上させるものではなかった。
【０１６８】
ｃｅｒｅｖｉｓａｅ発現宿主からの野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩの分泌が低い（＜１ｍｇ／Ｌ）ことが観測された。野生型Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ酵素におけるＣ３１１Ｓ突然変異は、ＣＢＨ ＩＩの全分泌量の活性を著しく上昇させた（表１１）。豊富な培地（ＹＰＤ）における活性の上昇は１０倍であるが、合成（ＳＤＣＡＡ）培地において、Ｃ３１１ＳおよびＢ７Ｐ３置換は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩ全分泌活性を２倍に上昇させる。他の２つの親ＣＢＨ ＩＩと比較して高いレベルで発現しているＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ親について、Ｂ７Ｐ３ブロック置換は活性を減少させたが、Ｃ３１４Ｓ突然変異は、活性を１．５倍まで上昇させた。Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓおよびＨ． ｊｅｃｏｒｉｎａ野生型およびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異の全てが同様の特異的活性を有するため（図１０）、全分泌セルラーゼ活性の上昇は、機能的酵素のより優れた分泌の結果である。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ異種タンパク質分布とタンパク質の安定性との間の相互関係が観測され、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異ＣＢＨ ＩＩの上昇した分泌が、それらの最も高い安定性に反映し得ることを示唆した。
Ｔａｂｌｅ１１：天然、点突然変異体および選択される熱安定性のあるキメラＣＢＨ ＩＩに関する特異的活性値（μｇグルコース還元糖等価／（μｇ ＣＢＨ ＩＩ酵素×ｍｉｎ×１０２））。エラーバーは、３つの複製に関する標準誤差を示し、標準誤差は標準偏差／ｓｑｒｔ（ｎ）を規定する。２時間の反応、３μｇ酵素／ｇ ＰＡＳＣ、５０℃、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８。
【０１６９】
【表２７】
【０１７０】
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異をモデル化するため、微細構造のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩ １ｏｃｎ結晶構造を使用した。第１に、水素結合ネットワークをＲＥＤＵＣＥで最適化した。Ｃ３１４はＰｒｏ３３９のカルボニル基と水素結合を形成することを予測した。この予測を検証するため、側鎖パッケージングを、モデリング・プラットフォームＳＨＡＲＰＥＮを用いて最適化した。Ｓｅｒ３１４は、より強い水素結合、およびより有利な結合構造が生じるように、Ｃｙｓ３１４と同様の相互作用を奏することが予測された。
【０１７１】
数々の効果は、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異が、天然ＣＢＨ ＩＩおよびキメラを含む幅広いＣＢＨ ＩＩを安定化することができる理由を説明することができる。ＣｙｓおよびＳｅｒは同様であり（等比体積でない）、他の代価物と比較して、これら２つのアミノ酸は配列アライメントをこの位置で抑制する。この残基への水素結合パートナーは、バックボーン要素（Ｇｌｙ３１６のアミドおよびＰｒｏ３３９のカルボニル）であり、従ってあまり第３者のアミノ酸変異体に依存しそうにない。さらにこのポケットに直接隣接した側鎖（Ａｓｎ２８３、Ｐｒｏ３３９、Ｐｈｅ３４５）が、研究された全４つの天然ＣＢＨ ＩＩセルラーゼにおいて保存されている。
【０１７２】
微細構造（１．３オングストローム）のＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ結晶構造（ｐｄｂ挿入１ｏｃｎ６）は、Ｃｙｓ３１４が水素結合ネットワークの一部であることを示した（図１５）。Ｃｙｓと比較して高いＳｅｒの水素結合性能は、安定化における比較的強い水素結合相互作用を奏することを示す。結晶構造においても、立体構造の観点からＳｅｒが好適に使用し得ることを示す。特に、Ｃｙｓ側鎖が元来の結合角度を有するとき、ＣｙｓがＰｒｏ３３９のカルボニルに押しつけられるように挿入されることで、６°の角度はなくなるが、望まれざる立体構造の相互作用を生じた。
【０１７３】
Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ ＩＩと最も多くの一致を共有する１９６個のタンパク質配列のアライメント。最も一致のある配列の２５０のうちの５４については、重複しているためアライメントから排除した（即ち、構造研究のための点突然変異体または９５％超で一致するアイソフォーム）。Ｓｅｒ３１１に対するバイアスがある：１５８個の配列はＳｅｒ、２０個はＡｌａ、１０個はＣｙｓ、５つは欠失、３つはＧｌｙを有する。しかしながら、４２個の他の配置があり、最も多くの選択肢は、Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａのアミノ酸の選択肢の２倍を超えて生じる。
【０１７４】
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異の高い安定化効果は、この位置でのＳｅｒが、天然セルラーゼの熱安定性の全体的な指標となる可能性を向上させる。しかしながら、この位置にＣｙｓを有することを特徴とするＨ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＣＢＨ ＩＩのＴ５０値が６４．８℃であるが、これはＣ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ ＩＩ（６４．０℃）より高く、Ｓｅｒが安定化決定の唯一の要因ではないことを示している。
【０１７５】
熱安定性だけが、産業用セルラーゼの重要な特徴ではない。特異的活性、セルロース結合に与える変化、発現に対する効果、および生成阻害は、全て同様に重要である。キメラおよび本明細書のデータは、組換えにより、短時間（例えば２時間）で測定されたセルロース加水分解分析において、特異的活性を損なうことなく向上した熱安定性を奏する、ＣＢＨ ＩＩキメラを得ることを示す。同様の現象が、熱安定性のあるＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異を含むＣＢＨ ＩＩに関してもみられた。長時間の加水分解分析において、いくつかのＣＢＨ ＩＩキメラ、および３つの被験Ｃｙｓ−Ｓｅｒ突然変異ＣＢＨ ＩＩについて、天然ＣＢＨ ＩＩと比較してより多くセルロースを加水分解することを発見した。この優れた性能は、酵素が高温でより長時間で機能し続けることを可能とする高い熱安定性とともに、親ＣＢＨ ＩＩに匹敵する特異的活性を有することに起因すると考えられる。これらの分析は、等量の精製された親、キメラおよびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体酵素で実施されたため、観測された高温での加水分解の向上は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現宿主からの分泌量の増加によるものではない。熱安定性のあるキメラおよびＣｙｓ−Ｓｅｒ突然変異体は、従って、セルロース分解のための酵素製剤に有用な要素であることが証明し得る。
【０１７６】
様々な特定の実施形態が示され、記載される一方で、この発明の思考と範囲から逸脱することなく、様々な変化がされることが理解される。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＥＸＤＧを有するモチーフのＣ末端にセリンを含み、ＸはＣ、ＡまたはＧであり（配列番号１０７）、Ｘはセリンと置換され、変異体は、セルラーゼ活性を有し、ポリペプチドは、配列ＧＥＸＤＧ（配列番号１０７）においてセリンを欠如する野生型セルラーゼと比して高い熱安定性を有する、組み換え型ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性一致があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４１２Ｓを含む配列番号７８と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、前記ポリペプチドは、それらに相当するＣｙｓ→Ｓｅｒ突然変異を欠如する親（野生型）タンパク質と比して、同等のセルラーゼ活性および高い熱安定性を有する、請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項３】
以下に示すＣ→Ｓ置換位置以外で、１−１０，１０−２０または２０−３０の保存的なアミノ酸の置換を有する、以下に示される配列を含む、組換え型ポリペプチド：Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【請求項４】
（ａ）配列番号２と少なくとも８５％以上の相同性があり、位置３１４にＳｅｒを有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４と少なくとも７０％以上の相同性があり、位置３１１にＳｅｒを有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号１２で位置３１０にＳｅｒがある配列；（ｉｉ）配列番号１３で位置３１２にＳｅｒがある配列；（ｉｉｉ）配列番号１４で位置３１４にＳｅｒがある配列；（ｉｖ）配列番号１５で位置３１５にＳｅｒがある配列；（ｖ）配列番号１６で位置３１３にＳｅｒがある配列；（ｖｉ）配列番号１７で位置３１１にＳｅｒがある配列；（ｖｉｉ）配列番号１９で位置３１３にＳｅｒがある配列；（ｖｉｉｉ）配列番号２１で位置３１２にＳｅｒがある配列；（ｉｘ）配列番号２２で位置３１１にＳｅｒがある配列からなる群から選択される配列と、少なくとも７０％以上の相同性があり、位置３１４でＳｅｒを有するポリペプチド；
（ｄ）２つの異なる親のセロビオヒドラーゼポリペプチド由来の少なくとも２つのドメインを含むキメラポリペプチドであり、ドメインはＮ末端側からＣ末端にかけて（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）を含み；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；
ｘ１は、配列番号２の残基４３，４４，４５，４６若しくは４７、または配列番号４若しくは配列番号６の残基４２，４３，４４，４５若しくは４６であり、ｘ２は、配列番号２の残基７０，７１，７２，７３若しくは７４、または配列番号４若しくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３若しくは７４であり、ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７若しくは１１８、または配列番号４若しくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５若しくは１１６であり、ｘ４は、配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６若しくは１５７、または配列番号４若しくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５３，１５３，１５４若しくは１５５であり、ｘ５は、配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３若しくは２２４、または配列番号４若しくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２若しくは２２３であり、ｘ６は、配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０若しくは２６１、または配列番号４若しくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９若しくは２６０であり、ｘ７は、配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５若しくは３１６、または配列番号４若しくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５または３１８であり；ｘ８は、配列番号２、配列番号４または配列番号６を有するポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基であり、
前記キメラポリペプチドが、配列番号２の位置３１４または配列番号４の位置３１１にＳｅｒを含み、配列番号２，４または６を含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドと比して、セルラーゼ活性および高い熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される配列を有する、
請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項５】
前記断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片８は、配列番号２の位置３１４、配列番号４の位置３１１または配列番号６の位置３１３を除く、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含む、請求項４に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項６】
前記キメラポリペプチドは、配列番号１２−６２および６３からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性がある、請求項４に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、配列番号７９−１０５または１０６と少なくとも８５％の相同性を有し、配列番号１０７の配列のＸの位置にセリンを有する配列を含む、請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドを含む酵素液。
【請求項１３】
請求項１０に記載の宿主細胞によって生成されるポリペプチドを含む酵素液。
【請求項１４】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドとバイオマスとの接触を備える、セルロース含有バイオマスの処理方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の酵素液とバイオマスとの接触を備える、セルロース含有バイオマスの処理方法。
【請求項１】
配列ＧＥＸＤＧを有するモチーフのＣ末端にセリンを含み、ＸはＣ、ＡまたはＧであり（配列番号１０７）、Ｘはセリンと置換され、変異体は、セルラーゼ活性を有し、ポリペプチドは、配列ＧＥＸＤＧ（配列番号１０７）においてセリンを欠如する野生型セルラーゼと比して高い熱安定性を有する、組み換え型ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性一致があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、Ｃ４１２Ｓを含む配列番号７８と少なくとも８５%、９０％、９５％、９８％、９９％の相同性があり、前記ポリペプチドは、それらに相当するＣｙｓ→Ｓｅｒ突然変異を欠如する親（野生型）タンパク質と比して、同等のセルラーゼ活性および高い熱安定性を有する、請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項３】
以下に示すＣ→Ｓ置換位置以外で、１−１０，１０−２０または２０−３０の保存的なアミノ酸の置換を有する、以下に示される配列を含む、組換え型ポリペプチド：Ｃ３１４Ｓを含む配列番号２；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号４；Ｃ３１０Ｓを含む配列番号１２；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１４Ｓを含む配列番号１４；Ｃ３１５Ｓを含む配列番号１５；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１６；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号１７；Ｃ３１３Ｓを含む配列番号１９；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号２１；Ｃ３１２Ｓを含む配列番号１３；Ｃ３１１Ｓを含む配列番号２２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６４；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号６５；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号６６；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６７；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６８；Ｃ４００Ｓを含む配列番号６９；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７０；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７１；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７２；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７３；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７４；Ｃ４００Ｓを含む配列番号７５；Ｃ４０７Ｓを含む配列番号７６；Ｃ３９４Ｓを含む配列番号７７；またはＣ４１２Ｓを含む配列番号７８。
【請求項４】
（ａ）配列番号２と少なくとも８５％以上の相同性があり、位置３１４にＳｅｒを有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４と少なくとも７０％以上の相同性があり、位置３１１にＳｅｒを有し、セルラーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号１２で位置３１０にＳｅｒがある配列；（ｉｉ）配列番号１３で位置３１２にＳｅｒがある配列；（ｉｉｉ）配列番号１４で位置３１４にＳｅｒがある配列；（ｉｖ）配列番号１５で位置３１５にＳｅｒがある配列；（ｖ）配列番号１６で位置３１３にＳｅｒがある配列；（ｖｉ）配列番号１７で位置３１１にＳｅｒがある配列；（ｖｉｉ）配列番号１９で位置３１３にＳｅｒがある配列；（ｖｉｉｉ）配列番号２１で位置３１２にＳｅｒがある配列；（ｉｘ）配列番号２２で位置３１１にＳｅｒがある配列からなる群から選択される配列と、少なくとも７０％以上の相同性があり、位置３１４でＳｅｒを有するポリペプチド；
（ｄ）２つの異なる親のセロビオヒドラーゼポリペプチド由来の少なくとも２つのドメインを含むキメラポリペプチドであり、ドメインはＮ末端側からＣ末端にかけて（断片１）−（断片２）−（断片３）−（断片４）−（断片５）−（断片６）−（断片７）−（断片８）を含み；
断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；断片８は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８までと少なくとも５０−１００％の相同性がある配列を含み；
ｘ１は、配列番号２の残基４３，４４，４５，４６若しくは４７、または配列番号４若しくは配列番号６の残基４２，４３，４４，４５若しくは４６であり、ｘ２は、配列番号２の残基７０，７１，７２，７３若しくは７４、または配列番号４若しくは配列番号６の残基６８，６９，７０，７１，７２，７３若しくは７４であり、ｘ３は、配列番号２の残基１１３，１１４，１１５，１１６，１１７若しくは１１８、または配列番号４若しくは配列番号６の残基１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５若しくは１１６であり、ｘ４は、配列番号２の残基１５３，１５４，１５５，１５６若しくは１５７、または配列番号４若しくは配列番号６の残基１４９，１５０，１５１，１５３，１５３，１５４若しくは１５５であり、ｘ５は、配列番号２の残基２２０，２２１，２２２，２２３若しくは２２４、または配列番号４若しくは配列番号６の残基２１６，２１７，２１８，２１９，２２０，２２１，２２２若しくは２２３であり、ｘ６は、配列番号２の残基２５６，２５７，２５８，２５９，２６０若しくは２６１、または配列番号４若しくは配列番号６の残基２５３，２５４，２５５，２５６，２５７，２５８，２５９若しくは２６０であり、ｘ７は、配列番号２の残基３１２，３１３，３１４，３１５若しくは３１６、または配列番号４若しくは配列番号６の残基３０９，３１０，３１１，３１２，３１３，３１４，３１５または３１８であり；ｘ８は、配列番号２、配列番号４または配列番号６を有するポリペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸残基であり、
前記キメラポリペプチドが、配列番号２の位置３１４または配列番号４の位置３１１にＳｅｒを含み、配列番号２，４または６を含むＣＢＨ ＩＩポリペプチドと比して、セルラーゼ活性および高い熱安定性および／またはｐＨ安定性を有する、ポリペプチド；
からなる群から選択される配列を有する、
請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項５】
前記断片１は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約１から約ｘ１までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片２は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ１から約ｘ２までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片３は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ２から約ｘ３までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片４は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ３から約ｘ４までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片５は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ４から約ｘ５までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片６は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ５から約ｘ６までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片７は、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ６から約ｘ７までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含み、前記断片８は、配列番号２の位置３１４、配列番号４の位置３１１または配列番号６の位置３１３を除く、配列番号２（「１」）、配列番号４（「２」）または配列番号６（「３」）の約ｘ７から約ｘ８までのアミノ酸残基および１−１０の保存的なアミノ酸の置換を含む、請求項４に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項６】
前記キメラポリペプチドは、配列番号１２−６２および６３からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性がある、請求項４に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、配列番号７９−１０５または１０６と少なくとも８５％の相同性を有し、配列番号１０７の配列のＸの位置にセリンを有する配列を含む、請求項１に記載の組み換え型ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドを含む酵素液。
【請求項１３】
請求項１０に記載の宿主細胞によって生成されるポリペプチドを含む酵素液。
【請求項１４】
請求項１，２，３，４または７に記載のポリペプチドとバイオマスとの接触を備える、セルロース含有バイオマスの処理方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の酵素液とバイオマスとの接触を備える、セルロース含有バイオマスの処理方法。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ−Ｄ】
【図１５】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ−Ｄ】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５２２５２１（Ｐ２０１２−５２２５２１Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３７８０（Ｐ２０１２−５０３７８０）
【出願日】平成２２年４月６日（２０１０．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０１３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８０５８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（３０１０５９５７０）カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月６日（２０１０．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０１３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８０５８
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（３０１０５９５７０）カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー (14)
【Ｆターム（参考）】
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