セルロース含有材料の処理方法及びその利用
【課題】イオン液体を用いてセルロースをより分解するのにより実用的なセルロース含有材料の処理方法を提供する。
【解決手段】前記セルロース含有材料とカチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を接触させて、セルロース含有材料を処理する。
【解決手段】前記セルロース含有材料とカチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを、前記セルロース含有材料中に前記疎水性イオン液体を接触させて、セルロース含有材料を処理する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有材料の処理方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを糖化して各種用途に用いるための効率的な方法が探索されている。こうした方法の一つとして、イオン液体の利用が着目されている。イオン液体は、常温で液体であり、そのイオン性により、セルロースを可溶化することが報告されている。例えば、クロライド系のイオン液体に１００℃程度の条件下でセルロースを可溶化させる性質が見出されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
さらに、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで糖化する試みもなされているが、イオン液体中ではセルラーゼが不活性化されるという報告がなされている（非特許文献２，３）。イオン液体で可溶化したセルロースを水などの親水性溶媒で洗浄し、その後、イオン液体可溶化セルロースを水に投入することで、初めてセルラーゼで分解できることも報告されている（非特許文献４）。さらに、イオン液体でセルロースを膨潤化し、その後イオン液体を除去した後に、酵素処理を行うという手法も試みられている（特許文献２、非特許文献５）。
【０００４】
こうした中、親水性イオン液体でセルロースを膨潤させた後、膨潤させたセルロースを含む親水性イオン液体にセルラーゼ水溶液を投入することで、イオン液体存在下であってもセルロースを糖化できることが開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０６４０１号公報
【特許文献２】米国特許公開2008/0227162号明細書
【特許文献３】特開２００９−２０３４５４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】R D. Rogerら、J. Am. Chem. Soc. 124(18),4974-4975, 2002
【非特許文献２】大野ら、Polym. Prep. Jpn., 55(1), 2090, 2006
【非特許文献３】R D. Rogerら、Green Chem., 5, 443-447, 2003
【非特許文献４】C A. Schallら、Biotechnol. Bioeng., 95(5), 904-910,2006
【非特許文献５】Ｑ. Liら，Bioresour Technol., Vol.100, p3570-3575, 2009
【発明の概要】
【０００７】
以上の先行技術のうち、特許文献３以外は、いずれも、セルロースの糖化に先立つセルロースの前処理に対するイオン液体の利用に留まっている。すなわち、イオン液体で前処理したセルロースを、効率的にセルラーゼによって分解する技術については開示されていない。一方、特許文献３に開示の技術によれば、構造が緩和されたセルロースを含む親水性イオン液体の存在下で、セルラーゼを作用させることができるため、イオン液体による前処理工程と、セルラーゼによるセルロースの分解糖化工程とを、効率的にあるいは連続的に行い得る。
【０００８】
しかしながら、特許文献３の記載の方法では、糖化の際、親水性イオン液体と水とが相互に混ざり合ってしまう。このため、この混合液からセルロースの低分子化物を回収する工程や、この混合液からイオン液体を回収して再利用する工程等において多くのプロセスやエネルギーが必要になってしまうという問題があった。
【０００９】
そこで、本発明は、イオン液体を用いたセルロースの糖化にあたり、イオン液体やセルロースの分解産物の回収に効率的に行いうる、セルロース含有材料の処理方法等を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、イオン液体で前処理したセルロースを効率的に酵素分解することについて種々検討した結果、ある種の疎水性イオン液体とセルロースとの親和性が高いこと、及びこの疎水性イオン液体に水を添加すると、セルロースが疎水性イオン液体相と水相との界面に局在することを見出した。また、この水相にセルラーゼを含有させることで、界面に局在するセルラーゼの糖化分解反応が生じることを見出した。さらに、セルロースの分解産物は、水相に含まれるということも見出した。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の処理方法であって、前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程、を備える、処理方法が提供される。前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上のカチオン種を有することができる。
【化１】
【００１２】
（式（I）及び(II)中、Ｒ１〜Ｒ４から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（III）及び（IV）中、Ｒ１及びＲ2から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（V）中、Ｒ１が、下記式（１）で表される。また、式（I）〜（IV）中、下記式（１）で表されない置換基は、それぞれ独立に、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【化２】
【００１３】
（式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【００１４】
好ましくは、前記カチオン種は、下記（２）で表される。
【化３】
【００１５】
（式（２）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。）
【００１６】
さらに、前記イオン液体のアニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上としてもよい。さらに、前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程を備えていてもよい。また、前記疎水性イオン液体は、塩化リチウムを含有していてもよいし、前記接触工程に先だって、前記疎水性イオン液体に、塩化リチウム又は塩化リチウム水溶液を添加する工程を備えていてもよい。
【００１７】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程と、前記疎水性イオン液体に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、を備える、生産方法が提供される。
【００１８】
前記生産方法にあっては、前記セルロースの分解工程後に、前記親水性溶媒相の少なくとも一部を回収する工程を備えることもできる。また、前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収する工程を備えていてもよい。
【００１９】
さらに、本明細書の開示によれば、セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物が提供される。前記組成物は、さらに、塩化リチウムを含有していてもよい。また、前記疎水性イオン液体に塩化リチウム水溶液が添加されて得られるものであってもよい。さらに、前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上であってもよい。さらにまた、前記組成物は、セルロース含有材料を含んでいてもよい。
【００２０】
前記組成物の前記イオン液体のアニオン成分は、前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上としてもよい。
【００２１】
本明細書の開示によれば、有用物質の生産方法であって、セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相に分散させる工程と、前記疎水性イオン液体相に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、前記セルロース分解工程で得られたセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程と、を備える、生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のセルロースの処理方法及びセルロースの分解産物の生産方法等の一例を示す図である。
【図２】疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面におけるセルロース含有材料又はセルロースの存在状態及びセルラーゼによる分解挙動の一態様を模式的に示す図である。
【図３】疎水性イオン液体に対する塩化リチウムの添加効果の評価結果を示す図である。
【図４】疎水性イオン液体に対する塩化リチウム飽和水溶液の添加効果の評価結果を示す図である。
【図５】塩化リチウム以外の塩の添加効果の評価結果を示す図である。
【図６】塩化リチウムの添加量の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書の開示は、セルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法等に関する。本明細書の開示によれば、セルロース含有材料は、カチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体と接触されると、疎水性イオン液体とセルロース含有材料とがよく親和し、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透する。疎水性イオン液体がセルロース含有材料に対して過剰に存在する場合には、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体に分散される。この後、この疎水性イオン液体に水性媒体などの親水性溶媒を供給することにより、セルロース含有材料を含む疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系が形成される。
【００２４】
図２に示すように、上記処理方法で形成された二相系においては、その界面にセルロースを含む画分が局在され濃縮される。このとき、疎水性イオン液体と親和したセルロース含有材料は、界面に局在し濃縮されたセルロースはセルラーゼがアクセスしやすい状態に形成されている。一方、セルラーゼは、親水性溶媒相に存在する。この結果、界面に局在するセルロース含有材料のセルロースは、セルラーゼにより分解されやすくなっている。同時に、セルラーゼと疎水性イオン液体との接触は抑制されており、その酵素活性は確保されやすくなっている。これらの結果、セルラーゼによりセルロースが効率的に分解される。
【００２５】
以上の効果は、ある種の疎水性イオン液体相と親水性溶媒相の二相系を形成した状態でセルロースを分解するためである。すなわち、疎水性イオン液体によるセルロース含有材料に対する作用によって親水性溶媒に対して親和性が高い部分が生成又は露出されるため、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面に局在されるようになる。そして、セルラーゼはこうしたセルロースにアクセスしてセルロースを分解し、その分解によりさらにセルロースの崩壊が進行し、セルラーゼによる分解も進行するものと考えられる。セルロースの分解産物は、分解に伴い親水性溶媒相に移行してさらに確実に分解され回収される。
【００２６】
また、二相系ゆえに、疎水性イオン液体はそれ自体分離回収が容易である。また、セルロースの分解産物であるグルコース等は親水性溶媒相に移行する。このため、セルロース分解産物は親水性溶媒相としてあるいは当該溶媒相から容易に分離回収される。
【００２７】
以上のように、本明細書の開示によれば、疎水性イオン液体とセルロース含有材料とを接触させてセルロース含有材料に疎水性イオン液体を浸透させることで、その後親水性溶媒を供給したときに二相系を形成できる。その結果、セルラーゼによるセルロースの効率的な分解とその回収並びに疎水性イオン液体の分離回収及び再利用が可能となる。また、これにより、セルロース含有材料を効率的に有用物質に変換できるようになる。
【００２８】
以下、本明細書に開示される各種の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法及び有用物質の生産方法の概要の一例を示す図であり、図２は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系の界面におけるセルロースの分解挙動の一態様を模式的に示す図である。
【００２９】
（セルロース含有材料）
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが、好ましくは２００以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００３０】
また、セルロースは、天然では植物細胞壁の主たる構成成分として存在し、多糖としては地球上で最も多く生産されている。植物細胞壁において、セルロースは、結晶性セルロース領域と非晶質セルロース領域とを形成している。また、セルロースは、植物細胞壁において、リグニンやヘミセルロースと複合化されたセルロース含有マトリックスを形成している。
【００３１】
本明細書において、セルロース含有材料とは、上記したセルロースを含むものであればよい。したがって、セルロースは結晶性セルロースであっても非結晶性セルロースであってもよく、セルロースのほか、ヘミセルロースやリグニンを含んでいてもよい。セルロース含有材料としては、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラなどの各種ワラ、籾殻、バガス、木材チップなどの農産廃棄物、古紙、建築廃材などの各種廃棄物などを含むバイオマス（木質系及び草本系）が挙げられる。
【００３２】
本明細書に開示される各種実施形態に適用されるセルロース含有材料は特に限定されない。後述する実施例においても開示するように、本明細書に開示される疎水性イオン液体は、結晶性セルロースであってもその一部を可溶化又は崩壊又は溶解できることがわかっている。すなわち、結晶性セルロースのように、水素結合により強固に相互作用して結晶性の高い領域であっても、疎水性イオン液体が親和し浸透し、その構造を緩和してセルラーゼによる分解を促進できる。このため、疎水性イオン液体がセルロースを含むマトリックスの崩壊・可溶化又は溶解に作用することができれば、そのセルロース含有材料を本処理方法に適用できると考えられる。また、疎水性イオン液体のセルロースを含むマトリックスへの作用を考慮すると、セルロース含有材料は水に不溶性あるいは難溶解性のものであることが好ましい。かかるセルロース含有材料としては、結晶性セルロースを含有するセルロース含有材料が挙げられ、また、例えば、セルロースのほかリグニン及び／又はヘミセルロースを含有する植物細胞壁由来のセルロース含有マトリックスを含む材料が挙げられる。典型的には、草本系や木質系のバイオマスが挙げられる。
【００３３】
（セルロース含有材料の処理方法）
本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法は、セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程（以下、接触工程という。）を備えることができる。さらに、本明細書に開示される処理方法は、疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程（以下、二相系形成工程という。）を備えることもできる。
【００３４】
（接触工程）
本明細書に開示される接触工程は、液相である疎水性イオン液体と固相であるセルロース含有材料とを接触させる工程である。カルボニル基を有する疎水性イオン液体は、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに親和性ないし浸透性を有しており、セルロース含有材料の少なくとも一部を崩壊させその構造を緩和することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、セルロースは疎水性領域と親水性領域とを併せ持つ高分子材料であるため、その疎水性領域と疎水性イオン液体との相互作用により疎水性イオン液体がセルロース含有マトリックスに浸透し、その少なくとも一部を破壊するものと考えられる。また、セルロース含有材料が、セルロース以外にヘミセルロースやリグニンを含むセルロース含有マトリックスを備えている場合には、同様に、これらの成分の疎水性領域と相互作用して、セルロース含有マトリックスに浸透し、その一部を崩壊するものと考えられる。
【００３５】
（疎水性イオン液体）
本明細書において、疎水イオン液体は、水と二相分離するイオン液体をいうものとする。なお、温度変化によって水と二相分離するイオン液体であってもよい。接触工程に適用される疎水性イオン液体は、カチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体であれば特に限定されない。こうした疎水性イオン液体は、例えば、セルロース含有材料に対して浸透性を有する疎水性イオン液体は、セルロース含有材料と混合したとき、セルロース含有材料を疎水性イオン液体の下方への集積を抑制して懸濁ないし分散することができる。また、その疎水性イオン液体と接触後に親水性溶媒相中のセルラーゼのアクセスを容易化できる。
【００３６】
イオン液体は、その融点が１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは８０℃以下である。さらに好ましくは４０℃以下であり、最も好ましくは２０℃以下である。
【００３７】
疎水性イオン液体としては、例えば、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、炭化水素基等で置換された置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩、置換ピロリジニウム塩（脂環式第４級アンモニウム塩）、第三級スルホニウム塩等が挙げられ、本発明の疎水性イオン液体としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩及び置換ピロリジニウム塩が好ましく、なかでも第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩が好ましい。第４級アンモニウム塩、第４級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピロリジニウム塩及び置換ピリジニウム塩をそれぞれ一般式(I)〜（V）として表す。
【００３８】
【化４】
【００３９】
疎水性イオン液体の構成カチオン種の基本骨格としては、一般式（Ｉ）に示すように、同一または相異なる４つ置換基が窒素原子に結合したアンモニウムカチオン、一般式(II)に示すように、同一または相異なる４つの置換基がリン原子に結合したホスホニウムカチオン、一般式（III）に示すように、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、一般式(IV)に示すように、ピロリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピロリジニウムカチオン、一般式（V）に示すように、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン、同一または相異なる３つの置換基がイオウ原子に結合したスルホニウムカチオンなどが挙げられる。
【００４０】
好ましい構成カチオン種の基本骨格としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン及びピロリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピロリジニウムカチオンが挙げられる。なお、これらの環状体は、２個が連結されるなどの多環構造を形成していてもよい。
【００４１】
これらのカチオン種における置換基（一般式（I）〜(V)中においてはＲ１〜Ｒ４で表される。）は、少なくとも１つの置換基がカルボニル基を有していることが好ましい。カルボニル基は、置換基の末端にあってもよいし、各環の近傍にあってもよい。また、カルボニル基は、その炭素原子にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキル置換アミノ基を有していてもよい。こうしたカルボニル基を有する置換基としては、たとえば、以下の式（１）で表される置換基が挙げられる。
【００４２】
【化５】
【００４３】
式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。
【００４４】
好ましくは、前記カチオン種は、下記（２）で表される。
【化６】
【００４５】
式（１）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。炭化水素のジイル基は、炭素数１〜１８程度のアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜６程度、より好ましくは炭素数１〜４程度のアルキレン基である。また、炭化水素のジイル基は、アルキル基等で置換されていてもよいベンゼン環を有していてもよく、２つのイル基は、ベンゼン環上にあってもよいし、一方がベンゼン環上にあり他方が置換基上にあってもよし、双方が置換基上にあってもよい。例えば、炭化水素のジイル基としては、メチレン基のほか以下の式（３）で表されるジイル基が挙げられる。
【００４６】
【化７】
【００４７】
カルボニル基を有する置換基以外の置換基Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に炭素数１〜１８であって、直鎖状又は分岐状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基であることが好ましい。好ましいアルキル基としては、炭素数１〜１８の直鎖状のアルキル基が挙げられる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基などが挙げられる。また、ベンジル基、ベンザル基、ベンジリデン基などの芳香族系炭化水素基であってもよい。好ましいアルケニル基としては、低級アルキル基等で置換されていてもよいアリル基（２−プロペニル基）などがあげられる。また、置換基には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基の炭素数１〜４程度のアルキル基を備えるアルコキシ基を有していてもよい。好ましくは、２−メトキシエチル基のように、アルキル鎖の末端にアルコキシ基を備える。
【００４８】
好ましいアニオン種は、例えば以下の式（４）〜（６）に挙げられる。
【化８】
【００４９】
疎水性イオン液体の構成アニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのビス（パーフルオロアルカン）スルホンイミドアニオン、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロアンチモネートアニオン（ＳｂＦ6-）、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートアニオンなどのパーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロホスフェートアニオン（ＰＦ6-）、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいテトラフルオロボレートアニオン（ＢＦ4-）など、塩素アニオン（Ｃｌ-）、臭素アニオン（Ｂｒ-）、ヨウ素アニオン（Ｉ-）などのハロゲンアニオン、アルカンスルホネートアニオン、パーフルオロアルカンスルホネートアニオン（ＣＦ3ＳＯ3-など）、酢酸アニオン（ＣＨ3ＣＯ2-）、パーフルオロ酢酸アニオン（ＣＦ3ＣＯ2-）、硝酸アニオン（ＮＯ3-）などが挙げられる。
【００５０】
好ましいアニオン種としては、フッ化アルキル基含有アニオン種が挙げられる。フッ化アルキル基は、好ましくはパーフルオロアルキル基である。かかるアニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンやトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロフェートアニオンなどのパーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオンが挙げられる。
【００５１】
イオン液体は、カチオン種とアニオン種との組み合わせからなり、上述したカチオン種及びアニオン種を含む従来公知のカチオン種及びアニオン種を適宜組み合わせて用いることができる。疎水性イオン液体は、商業的に入手できるものであるほかは、公知の方法で合成することができる。合成方法は特に限定されないで、カチオンを塩化物との塩として合成、精製し、その後、得ようとするイオン液体のアニオンの塩と反応させるなどするか、一旦水酸化物とした上でアニオンを含む酸で中和してもよい。
【００５２】
疎水性イオン液体には塩化リチウムを含むことができる。塩化リチウムは、イオン性化合物であって、疎水性イオン液体中において、その一部あるいは全部がそれぞれＬｉ+イオン及びＣｌ-イオンとして存在していると考えられる。カチオン種がカルボニル基を有する疎水性イオン液体中において、塩化リチウムが存在すると、セルロースの糖化率が向上する。したがって、カルボニル基を有するカチオン種と塩化リチウムとが併存することで、セルロースの構造緩和が促進されたものと考えられる。これは、水素結合能の高い塩素イオンによるものと考えられる。なお、ＫＣｌ及びＮａＣｌでは、ＬｉＣｌのような添加効果が得られないことがわかっている。したがって、Ｌｉ塩であることも関与しているものと考えられる。以上の塩化リチウムの添加による作用は推論であって本明細書の開示を拘束するものではない。
【００５３】
塩化リチウムは固形物の状態で疎水性イオン液体に供給されてもよいし、飽和水溶液の形態で疎水性イオン液体に供給されてもよい。飽和水溶液の形態で供給されるとき、セルロースの構造緩和がより促進されると考えられる。すなわち、低温で接触工程を行っても、６０℃以上１００℃以下で１時間〜６時間程度の接触工程でも、良好な糖化率を得ることができる。
【００５４】
塩化リチウムの添加量は、特に限定しないが、疎水性イオン液体との総量に対して、０．０５質量％以上２０％質量以下程度であることが好ましい。多すぎると、セルラーゼ活性に影響が及ぶおそれがあり、少なすぎると添加効果が十分に得られないからである。より好ましくは、０．１質量％以上であり、さらに１質量％以上であることが好ましい。また、好ましくは５質量％以下であり、より好ましくは３％質量％以下であり、さらに好ましくは２質量％以下である。
【００５５】
イオン液体の純度は高いことが好ましい。イオン液体の合成工程の不純物は、イオン液体と親水性溶媒とを混合して得られる媒体のｐＨに大きく影響し、結果として酵素の触媒活性に大きく影響する場合があるからである。本発明者らによれば、例えば、イミダゾリウム系カチオンを用いるイオン液体の場合、純度が低いほど水や緩衝液などの親水性溶媒と混合したときのｐＨがアルカリにシフトしやすく、セルラーゼによるセルロース分解活性が低下する傾向があることがわかっている。
【００５６】
以上の疎水性イオン液体は、単独で用いることができるほか、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。こうした疎水性イオン液体又はその組み合わせは、それ自体、セルロース含有材料の構造緩和、分解・糖化用の媒体として有用である。かかる媒体によれば、セルロースをセルラーゼで効率的に分解し、しかも、当該媒体の回収再利用及び分解産物の回収を容易化することができる。
【００５７】
セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを接触させる方法は特に限定されない。セルロース含有材料は疎水性イオン液体が親和していれば足り、必ずしも疎水性イオン液体中にセルロース含有材料が浸漬され、分散され、あるいは懸濁された状態であることを要しない。セルロース含有材料に疎水性イオン液体を接触させるには、例えば、図１に示すように、十分量の疎水性イオン液体中にセルロース含有材料を供給するようにしてもよいし、セルロース含有材料に対して疎水性イオン液体を噴霧等によりセルロース含有材料が湿る程度の量を供給し、セルロース含有材料に疎水性イオン液体を含浸させるようにしてもよい。
【００５８】
セルロース含有材料中に疎水性イオン液体を浸透させるための処理は適宜設定することができる。適度に、例えば、４０℃以上１５０℃以下程度、好ましくは５０℃以上１５０℃以下程度に加熱してもよい。加熱を行うことで、疎水性イオン液体のセルロース含有材料への浸透を促進し、セルラーゼにより分解を促進することができる。１５０℃を超えると、セルロース含有材料の種類によっては好ましくない反応が生じる可能性があり、４０℃未満では、加熱の効果が得られにくいからである。また、必要に応じて、攪拌を行ってもよい。さらに、超音波処理を行ってもよい。これらの各種処理は、単独で採用してもよいが、適宜組み合わせて採用してもよい。処理の種類は、用いる疎水性イオン液体の種類やセルロース含有材料によっても適宜変更される。
【００５９】
なお、後段の二相系形成工程において、疎水性イオン液体量を低減するには、浸透に必要量程度の疎水性イオン液体をセルロース含有材料に供給してもよいし、十分量の疎水性イオン液体に浸漬したセルロース含有材料を、その後、ろ過や遠心分離等の固液分離手段により疎水性イオン液体から分離してもよい。
【００６０】
このような接触工程の実施により、セルロース含有材料には疎水性イオン液体が親和し、そのセルロース含有マトリックスが緩んだようになっているものと考えられる。疎水性イオン液体によってセルロース含有材料の構造が緩和されることにより、水性媒体などの親水性溶媒と接触して二相系が形成されたとき、セルロースの親水性領域が親水性溶媒相との界面に露出されやすくなり、界面のセルロースが親水性溶媒相中のセルラーゼによって分解されると考えられる。したがって、こうした接触工程を経て疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料は、その後、セルラーゼ等によるセルロースの分解に供することができる。
【００６１】
（二相系形成工程）
さらに、本明細書に開示される処理方法は、二相系形成工程を備えることもできる。疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料に親水性溶媒を供給することで二相系を構成できる。これにより、セルロース含有材料を親水性溶媒相との界面に局在・濃縮でき、セルラーゼ等によりセルロースを分解するのに適した環境を形成することができる。
【００６２】
疎水性イオン液体に対して供給する液体は、疎水性イオン液体と二相系を構成できるものであって（疎水性イオン液体と二相系を形成可能な程度に親水性の溶媒であって）、セルロースの分解産物のうち少なくともグルコースの良溶媒となる親水性溶媒であればよい。また、ここで使用する疎水性イオン液体は、異なる２種類以上のものを混合して用いてもよい。かかる液体としては、例えば、水性の液体であって、水又は水と相溶性のある有機溶媒との混液が挙げられる。
【００６３】
有機溶媒としては、炭素数が１〜４程度の低級アルコールが挙げられる。また、当該液体には、セルロースの分解産物であるグルコース等の溶解のため、あるいはセルラーゼによる酵素反応に適したｐＨや塩濃度を形成するための酸、アルカリあるいは塩類が含まれていてもよい。典型的には、二相系形成時において親水性溶媒相に酵素反応に適したｐＨを付与できる緩衝液や塩溶液が挙げられる。親水性溶媒には、酵素反応に必要な金属イオンを含めることもできる。さらに、セルラーゼ等に酵素を予め含有していてもよい。酵素反応を考慮した塩類及び酵素は、必ずしも二相系形成工程において親水性溶媒に含まれることを要するものではない。少なくともセルロースの分解時においてこれらを添加するようにしてもよい。
【００６４】
二相系を形成する方法や二相系の形態は特に限定されない。疎水性イオン液体に分散又は懸濁されたセルロース含有材料に対して親水性溶媒を供給してもよいし、疎水性イオン液体が含浸されただけのセルロース含有材料に親水性溶媒を供給してもよい。親水性溶媒との接触に先だって、必要に応じて過剰量の疎水性イオン液体を固液分離により除去しておいてもよい。なお、二相系の形成にあたっては、セルロース含有材料と親水性溶媒とを十分に接触させるために、適宜攪拌してもよい。また、適当な温度での加熱を伴っていてもよい。
【００６５】
図１の左側に示すように、セルロース含有材料が疎水性イオン液体相中に分散又は懸濁した状態で保持されるときには、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相とで明らかな二相系となる。一方、図１の右側に示すように、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透しているが、セルロース含有材料に対して過剰量では存在しない場合には、親水性溶媒中に疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料が存在するような二相系となる。後者の二相系では、セルロース含有材料自体が実質的な疎水性イオン液体相となっている。なお、このような場合であっても、セルロース含有材料は、親水性溶媒相との界面近傍に局在しているといえる。
【００６６】
こうした二相系の形成工程の実施により、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面に局在、濃縮される。これは、セルロース含有材料に含まれるセルロース等の親水性領域との親水性溶媒相との相互作用によるものと推測される。二相系の界面においては、親水性領域が親水性溶媒相側に露出された状態となっていると推測される。このようなセルロース含有材料の局在・濃縮及び親水性溶媒相への露出は、親水性溶媒相に存在するセルラーゼによるセルロースの分解に適した状態になっている。同時に、二相系は、疎水性イオン液体の回収と分解産物の回収にも好ましい系になっている。
【００６７】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法によれば、セルロース含有材料のセルロースを含有するマトリックスの構造を緩和して、セルラーゼがアクセスしやすい環境を形成することができる。さらに、二相系を形成することでセルラーゼによるセルロースの分解に適し、疎水性イオン液体と分解産物の双方の分離回収に適した環境を形成することができる。
【００６８】
（セルロース糖化用のイオン液体組成物）
本明細書の開示によれば、セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物が提供される。本組成物によれば、セルロース含有材料に浸透して、その後のセルラーゼによる分解糖化反応に適した前処理を行うことができる。本組成物は、塩化リチウムを含有していてもよいし、塩化リチウム水溶液が添加されて得られるものであってもよい。疎水性イオン液体としては、既に説明した各種の疎水性イオン液体を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。本組成物は、セルロース含有材料を含んでいてもよい。また、疎水性イオン液体と二相系を形成する親水性溶媒を含んでいてもよい。
【００６９】
なお、かかる組成物は、基質をセルロース含有材料のセルロースとし、酵素をセルラーゼとするものであるが、疎水性イオン液体による構造緩和作用が発揮される基質含有材料であればほかの物質とその分解酵素にも適用が可能である。すなわち、酵素が作動可能な環境下では難溶性の基質形態を採るものであっても、疎水性イオン液体が浸透されていることで酵素を作用させて利用しやすくすることができる。
【００７０】
基質としては特に限定しないが、天然多糖や天然樹脂、合成多糖や合成樹脂などを含む高分子が挙げられる。天然多糖としては、例えば、セルロース、キシラン、キチン及びキトサンが挙げられる。また、酵素は基質の種類によるが、セルロースを基質とする場合には、既に説明したセルラーゼであり、キシランにはキシラナーゼ、キチンやキトサンには、キチナーゼ等が挙げられる。
【００７１】
疎水性イオン液体は、セルロースに好ましく用いることのできるイオン液体は、類似した構造を有するキチンやキトサンにも好ましく用いることができる。
【００７２】
なお、疎水性イオン液体の特性の変動によるｐＨシフトやｐＨ変動の酵素活性及び分解効率への悪影響を抑制又は回避可能な反応媒体を調製するには、用いるイオン液体と親水性溶媒が接触したとき生じる可能性のあるｐＨシフトを補正し又はｐＨ変動を緩衝するのに十分な調整能力を有する親水性溶媒を用いることが好ましい。本組成物には、さらに、基質に作用させるための酵素を含んでいてもよい。酵素は、予め親水性溶媒に添加してあってもよいし、二相系を形成後に添加されるものであってもよい。
【００７３】
（セルロース含有材料の分解産物の生産方法）
本明細書の開示によれば、図１に示すように、上記接触工程と、上記二相系形成工程と、セルロース分解工程と、を備えるセルロース含有材料の分解産物の生産方法が提供される。本明細書に開示される生産方法によれば、セルロースのセルラーゼによる分解に適しており、しかも、疎水性イオン液体の分離回収及び再利用と、グルコース等の分解産物の回収に適し二相系を備えているため、実用的なレベルでのセルロース含有材料の分解利用が可能となっている。なお、接触工程と二相系形成工程に関しては、上記処理方法において説明した各種の態様をそのまま適用することができる。なお、セルロースの分解産物としては、セルロースが低分子化されたものであればよい。より具体的には、最終分解産物であるグルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。
【００７４】
（セルロース分解工程）
セルロース分解工程は、親水性溶媒相中のセルラーゼによりセルロースを分解する工程である。セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。セルラーゼとしては、狭義には、β１，４−エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、グルカン１，４−βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セルロース１，４−βセロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。また、セルラーゼは、天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定しないが、Trichoderma属又はAspergillus属由来のセルラーゼなどを好ましく用いることができる。また、７０℃以上で高い活性を示し、９０℃から１００℃でも活性を維持する耐熱性セルラーゼを用いることもできる。例えば、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。本発明においては、上記した狭義のセルラーゼを１種類又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。異種のセルラーゼでなく、同種であっても２種類以上組み合わせてもよい。また、由来の異なるセルラーゼを組み合わせて用いることもできる。また、セルラーゼは、適当な担体に保持された形態であってもよい。
【００７５】
また、セルロース分解工程では、植物細胞壁においてセルロースと複合体を形成しているヘミセルロースを分解する酵素を用いることもできる。ヘミセルロースとしては、キシラン、マンナン、グルコマンナン等が挙げられる。ヘミセルロースの分解酵素としては、キシラナーゼ等が挙げられ、こうした酵素は、上記のTrichoderma属やAspergillus属等のセルロース分解性微生物に由来するものであってもよい。また、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼなどの耐熱性セルラーゼであってもよい。
【００７６】
セルラーゼは、二相系形成工程において予め親水性溶媒に含めておいてもよいし、セルラーゼ分解工程において、親水性溶媒相に添加してもよい。セルラーゼの添加時においては、親水性溶媒相は、酵素活性の発現に適した環境であることが好ましい。酵素反応の安定性や操作の簡便性を考慮すると、親水性溶媒相は、用いるセルラーゼの至適ｐＨを含む酵素活性に適したｐＨ範囲に一致する範囲に緩衝能を有する緩衝液を用いることが好ましい。一般的なセルラーゼの典型的な好適ｐＨは４〜６程度であるため、例えば、クエン酸緩衝液（クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム）、クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸−リン酸二水素ナトリウム）等が挙げられる。こうした緩衝液の濃度やｐＨを適宜調製して、親水性溶媒相のｐＨを４以上６以下、より確実には、４．０以上６．０以下となるように設定することが好ましい。
【００７７】
セルラーゼによるセルロース分解のための温度や時間は特に限定されない。セルラーゼの種類にもよるが、通常、３０℃〜７０℃程度、好ましくは３５℃〜４５℃程度で、ｐＨ２以上６以下程度とし、数時間から数十時間程度実施する。耐熱性セルラーゼを用いる場合は、７０℃以上１００℃以下であってもよい。
【００７８】
セルロース分解工程によれば、疎水性イオン液体によりセルロースマトリックスの構造が緩和されかつ一部が親水性溶媒相との界面に露出された二相系が形成されているため、親水性溶媒相中のセルラーゼがセルロースを効率的に分解することができる。しかも、グルコースなどセルロースの低分子化物（二糖やオリゴ糖を含む分解産物）は、親水性溶媒相に移行するため、一層セルラーゼにより分解されやすくなる。後述するように、親水性溶媒相からは、分解産物を容易に回収できる。
【００７９】
このようなセルロース分解工程を実施することで、たとえば、図２に示すようにして、セルロースはセルラーゼにより分解され、かかる低分子化によって構造緩和が一層促進され、セルラーゼによる分解も促進される。また、分解産物は、親水性溶媒相に移行し、さらにセルラーゼにより分解されることもある。一方、後述するように、未分解のセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどのセルロース含有由来の炭素原は、固液分離手段により固相として分離されるため、再度の分解等の処理が可能であり、炭素原の損失を十分に抑制又は回避できる。また、後述するように、疎水性イオン液体も容易に分離回収され再利用できる。
【００８０】
（分解産物の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、少なくとも一部の親水性溶媒相を回収することができる。二相系は分解工程後も維持され、親水性溶媒相は容易に回収される。通常、疎水性イオン液体相は親水性溶媒相よりも比重が大きく、親水性溶媒相が上相、疎水性イオン液体相が下相となっている。したがって、通常は、上相を回収すればよい。回収した親水性溶媒相は疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのまま、たとえば後段で説明する有用物質の生産方法における発酵工程等に利用できる。また、必要に応じて濃縮されてもよい。なお、親水性溶媒相にはセルラーゼが含まれているが、公知の方法で分離回収も可能である。セルラーゼを固相担体に固定化しておくことで分離回収は容易になる。
【００８１】
（疎水性イオン液体の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、少なくとも一部の疎水性イオン液体を回収することができる。二相系のため、疎水性イオン液体は容易に回収される。また、図１に示すように、回収された疎水性イオン液体相は、再度、接触工程に供給してセルロース含有材料に浸透させるための疎水性イオン液体として再利用や循環利用が可能である。疎水性イオン液体は、高価であるためかかる循環利用が可能となることでセルロースの糖化がより現実的となる。なお、疎水性イオン液体は、セルロース含有マトリックスの構造緩和作用を有しているが、セルロースを溶解するものではない。また、水可溶性画分は、親水性溶媒相に移行され、未分解の固相（セルロース含有材料の分解残渣）は後述するように固液分離手段で分離される。したがって、疎水性イオン液体相へのセルロース含有材料由来成分の溶解は、回避又は抑制されている。
【００８２】
なお、界面に局在するなどして残存したセルロース含有材料の分解残渣は、固液分離手段によって回収できる。かかる残留物については再度、接触工程〜分解工程を実施することもできる。残留物は、用いたセルロース含有材料の種類やセルラーゼの種類等によるが、ヘミセルロースやリグニン、未分解のセルロース等が含まれていると考えられる。
【００８３】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法によれば、用いた疎水性イオン液体及びセルロース分解産物の回収等が容易なより実用的なセルロース含有材料の利用が可能となる。
【００８４】
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースを利用する有用物質の生産方法は、上記したセルロースの分解産物の生産方法によって得られるセルロース分解産物を炭素源として用いて酵母などの微生物の発酵によって有用物質を生産する工程（以下、単に発酵工程ともいう。）を備えることができる。この生産方法によれば、セルロース含有材料から効率的に分解回収されたセルロース分解産物を用いることで、全体としての製造コストを低減することができる。
【００８５】
炭素源は、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料とセルラーゼを含有する親水性溶媒とを含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系において前記セルロース含有材料中のセルロースを分解して得られた親水性溶媒相中のセルロース分解産物を用いる。本生産方法において用いるセルロース分解産物は、セルロース分解工程後の親水性溶媒相、その濃縮物、又は親水性溶媒相から分離回収されたものであってもよい。上述したように親水性溶媒相は、疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのままであって発酵工程に供することができる。したがって、例えば、セルロース分解工程後の親水性溶媒相等を発酵用の培地の一部として用いることができる。
【００８６】
発酵工程で用いる微生物は、特に限定しないで、セルロースの分解産物を資化可能であって生産しようとする有用物質の種類に応じて適宜選択される。セルロース分解産物は、グルコースが主であるが、ヘミセルロース由来のキシラン等であってもよい。例えば、酵母やカビなどの真菌類や大腸菌等の微生物が挙げられる。微生物は、野生型であってもよいし、遺伝子工学的技術等によって人為的にセルロース分解産物を効率的に資化可能に改変されたり、有用物質を生産可能に改変されたりしたものであってもよい。典型的には、エタノールを生産する酵母などの微生物が挙げられる。また、有機酸を生産する酵母や乳酸菌であってもよい。
【００８７】
発酵工程は、用いる微生物の種類や生産しようとする有用物質に応じて実施すればよい。発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。
【００８８】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノールなどの低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００８９】
以上説明したように、本明細書に開示される有用物質の生産方法によれば、従来に比してより効率的に得られたセルロース分解産物を利用するため、有用物質の生産コストを効果的に低減することができる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９１】
（疎水性イオン液体への塩化リチウムの添加効果の評価）
疎水性イオン液体を利用した二相系でのセルロースの糖化ならびに回収において、塩化リチウムを添加した場合のグルコース糖化効率について、以下の検討を実施した。なお本検討において、モデルとして以下に示す、4種類の疎水性イオン液体を使用した。
3-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[DMAcmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
3-[2-(diethylamino)-2-oxoethyl]-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[DEAcmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
3-(4-acetylphenethyl)-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[AcPEmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
l-Ethyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide
（Solvent innovation社製、以下、[Emim][Tf2N]と称す）
【００９２】
本実施例で利用した４種類の疎水性イオン液体の構造式は下記の通りである。
【００９３】
【化９】
【００９４】
（１）上記に示した各疎水性イオン液体 495 mgに無水LiClを1 wt% (5 mg) 添加し、500 mgの疎水性イオン液体を調製した。また、LiCl無添加の疎水性IL500 mgからなるサンプルも準備した。それぞれに、結晶性セルロースであるAvicel（Sigma）を1 wt％ (5 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに1 mg/mlのセルラーゼ (Tricoderma ressei由来、Sigma) 水溶液 (100 mMクエン酸緩衝溶液) を500 μl 加え、2相系を形成させた。40℃で攪拌して糖化反応を行い24時間後にそれぞれサンプリングした。
【００９５】
次に、溶液中のグルコース、セロビオース量を測定した。測定には、4−アミノ安息香酸エチルエステル (ABEE) 化試薬で誘導体化によって実施した。そのスキームを以下に示す。1.5 mlエッペンドルフチューブに、試料10 μlとABEE化標識試薬40μlを加え、ボルテックスで攪拌し遠心した (8000 rpm、1分、20℃) 後、ブロックインキュベータを用いて80 ℃で60分間保温した。Milli-Q水200 μlとクロロホルム200 μlを加え、ボルテックスで攪拌し遠心した (8000 rpm、3分、20℃) 後、水相を回収した。回収した水相をHPLC分析して生成した糖の定量を行った。ABEE溶液の組成ならびに、HPLCの分析条件は、下記表に示す。
【００９６】
【化１０】
【００９７】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] ´ 100
【００９８】
24時間後の糖化反応の結果を図３に示す。図３に示すように、本実施例で合成したイオン液体の分子構造中にカルボニル基を含むいずれのイオン液体についても、塩化リチウムを添加することで糖化率の上昇が確認された。一方、分子構造にカルボニル基を含まない[Emim][Tf2N]においては、塩化リチウムの添加による糖化率の上昇は見られなかった。このことから、イオン液体中に一部溶解した塩化リチウムと、イオン液体のカルボニル基との相互作用との結果生じる水素結合の高いCl- によってセルロース鎖の構造緩和効果が高められる可能性が示唆された。
【実施例２】
【００９９】
（疎水性イオン液体への塩化リチウム飽和水溶液の添加効果）
実施例１では無水LiClの添加効果を検討した。より効率的にイオン液体中にLiClを取り込ませることを目的とし、LiCl飽和水溶液の添加効果を検討した。
【０１００】
使用した疎水性イオン液体としては、実施例１でも利用したカルボニル基を含む3種類のイオン液体（[DMAcmim][Tf2N]、[DEAcmim][Tf2N]、[AcPEmim][Tf2N]）を利用した。とりこ
【０１０１】
各疎水性イオン液体 490 mgにLiCl飽和水溶液（１９．５３mol／Ｌ、約８２．８質量％）を10 mg添加した。また、疎水性イオン液体 500 mgのみのサンプルも準備した。それぞれのサンプルに結晶性セルロースであるAvicel（Sigma）を1 wt％ (5 mg) 添加し、80 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに1 mg/mlのセルラーゼ (Tricoderma reessei由来) 水溶液 (100 mMクエン酸緩衝溶液) を500 μl加え、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い24時間後にそれぞれサンプリングして、実施例１と同様に、4−アミノ安息香酸エチルエステル (ABEE) 化試薬で誘導体化し、HPLC分析により生成した糖の定量を行った。得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
【０１０２】
24時間後の糖化反応の結果を図４に示す。図４に示すように、実施例１と同様に、カルボニル基を含む疎水性イオン液体すべてにおいて、塩化リチウムを添加することで糖化率の上昇が確認された。疎水性イオン液体の種類別に比較すると、塩化リチウム飽和水溶液を[DMAcmim][Tf2N]及び[DEAcmim][Tf2N]添加することで80℃という比較的低温での処理条件下でも約60 %の糖化率が得られ、固体の塩化リチウム添加効果を上回る糖化率が得られることが判明した。したがって、実施例１と同様にイオン液体の分子構造にカルボニル基を含む場合、これと塩化リチウムとが相互作用することで生じる水素結合能の高いCl-によってセルロース鎖の構造緩和効果が高められる可能性が示唆された。また、この効果は塩化リチウムが水溶液中に分散した状態にある場合、より効果的に進行することも明らかとなった。
【実施例３】
【０１０３】
（疎水性イオン液体へのLiCl以外の塩の添加効果）
実施例１でのLiCl添加効果を受け、その他の塩に添加効果があるかを検証する目的で、NaCl、KClの添加効果を検討した。
【０１０４】
検討には、カルボニル基を含む疎水性イオン液体[DEAcmim][Tf2N]を利用した。 [DEAcmim][Tf2N] 980 mgを採取し、これに無水のLiCl, NaCl, KClを各1 wt％ (10 mg) になるよう添加し1,000 mgの疎水性ILを調製した。またネガティブコントロールとして、[DEAcmim][Tf2N] 1,000 mgから成るサンプルも準備した。
これに結晶性セルロース（Avicel, Sigma）を1 wt％ (10 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに、セルラーゼ混合溶液を含有させたクエン酸緩衝液（最終濃度10 mM）を1,000 μl添加し、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い、一定時間後にそれぞれサンプリングした。サンプリング試料を、バイオセンサーBF5にて、グルコースを測定し糖化効率を算出した。
【０１０５】
なおセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reesei ATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma) を 5 :1 の割合で混合させたものを、最終濃度 6 FPU / g バイオマスになるよう添加した。
【０１０６】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、既出の計算式に従って算出した。
【０１０７】
糖化反応の結果を図５に示す。結果より、NaClならびにKCl添加には、効果が認められなかった。従って、リチウム塩であることが重要であることが確認された。
【実施例４】
【０１０８】
（疎水性イオン液体へのLiCl添加量の検討）
実施例１でのLiCl添加効果を受け、LiClの添加量を検討した。検討には、カルボニル基を含む疎水性イオン液体 [DEAcmim][Tf2N]を利用した。 [DEAcmim][Tf2N] 1,000 〜 980 mgを採取し、これに無水LiClを各0 〜 20 mg になるよう添加し、1,000 mgの疎水性ILを調製した。これに結晶性セルロース（Avicel）を1 wt％ (10 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに、セルラーゼ混合溶液を含有させたクエン酸緩衝液（最終濃度10 mM）を1,000μl添加し、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い一定時間後にそれぞれサンプリングした。サンプリング試料を、バイオセンサーBF5にて、グルコースを測定し糖化効率を算出した。
【０１０９】
なおセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reesei ATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma) を 5 :1 の割合で混合させたものを、最終濃度 6 FPU / g バイオマスになるよう添加した。
【０１１０】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、既出の計算式に従って算出した。
【０１１１】
糖化反応の結果を図６示す。結果より、LiCl添加量 1mgであっても糖化向上効果が認められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有材料の処理方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを糖化して各種用途に用いるための効率的な方法が探索されている。こうした方法の一つとして、イオン液体の利用が着目されている。イオン液体は、常温で液体であり、そのイオン性により、セルロースを可溶化することが報告されている。例えば、クロライド系のイオン液体に１００℃程度の条件下でセルロースを可溶化させる性質が見出されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
さらに、イオン液体で可溶化したセルロースをセルラーゼで糖化する試みもなされているが、イオン液体中ではセルラーゼが不活性化されるという報告がなされている（非特許文献２，３）。イオン液体で可溶化したセルロースを水などの親水性溶媒で洗浄し、その後、イオン液体可溶化セルロースを水に投入することで、初めてセルラーゼで分解できることも報告されている（非特許文献４）。さらに、イオン液体でセルロースを膨潤化し、その後イオン液体を除去した後に、酵素処理を行うという手法も試みられている（特許文献２、非特許文献５）。
【０００４】
こうした中、親水性イオン液体でセルロースを膨潤させた後、膨潤させたセルロースを含む親水性イオン液体にセルラーゼ水溶液を投入することで、イオン液体存在下であってもセルロースを糖化できることが開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０６４０１号公報
【特許文献２】米国特許公開2008/0227162号明細書
【特許文献３】特開２００９−２０３４５４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】R D. Rogerら、J. Am. Chem. Soc. 124(18),4974-4975, 2002
【非特許文献２】大野ら、Polym. Prep. Jpn., 55(1), 2090, 2006
【非特許文献３】R D. Rogerら、Green Chem., 5, 443-447, 2003
【非特許文献４】C A. Schallら、Biotechnol. Bioeng., 95(5), 904-910,2006
【非特許文献５】Ｑ. Liら，Bioresour Technol., Vol.100, p3570-3575, 2009
【発明の概要】
【０００７】
以上の先行技術のうち、特許文献３以外は、いずれも、セルロースの糖化に先立つセルロースの前処理に対するイオン液体の利用に留まっている。すなわち、イオン液体で前処理したセルロースを、効率的にセルラーゼによって分解する技術については開示されていない。一方、特許文献３に開示の技術によれば、構造が緩和されたセルロースを含む親水性イオン液体の存在下で、セルラーゼを作用させることができるため、イオン液体による前処理工程と、セルラーゼによるセルロースの分解糖化工程とを、効率的にあるいは連続的に行い得る。
【０００８】
しかしながら、特許文献３の記載の方法では、糖化の際、親水性イオン液体と水とが相互に混ざり合ってしまう。このため、この混合液からセルロースの低分子化物を回収する工程や、この混合液からイオン液体を回収して再利用する工程等において多くのプロセスやエネルギーが必要になってしまうという問題があった。
【０００９】
そこで、本発明は、イオン液体を用いたセルロースの糖化にあたり、イオン液体やセルロースの分解産物の回収に効率的に行いうる、セルロース含有材料の処理方法等を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、イオン液体で前処理したセルロースを効率的に酵素分解することについて種々検討した結果、ある種の疎水性イオン液体とセルロースとの親和性が高いこと、及びこの疎水性イオン液体に水を添加すると、セルロースが疎水性イオン液体相と水相との界面に局在することを見出した。また、この水相にセルラーゼを含有させることで、界面に局在するセルラーゼの糖化分解反応が生じることを見出した。さらに、セルロースの分解産物は、水相に含まれるということも見出した。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の処理方法であって、前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程、を備える、処理方法が提供される。前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上のカチオン種を有することができる。
【化１】
【００１２】
（式（I）及び(II)中、Ｒ１〜Ｒ４から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（III）及び（IV）中、Ｒ１及びＲ2から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（V）中、Ｒ１が、下記式（１）で表される。また、式（I）〜（IV）中、下記式（１）で表されない置換基は、それぞれ独立に、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【化２】
【００１３】
（式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【００１４】
好ましくは、前記カチオン種は、下記（２）で表される。
【化３】
【００１５】
（式（２）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。）
【００１６】
さらに、前記イオン液体のアニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上としてもよい。さらに、前記疎水性イオン液体と接触後の前記セルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程を備えていてもよい。また、前記疎水性イオン液体は、塩化リチウムを含有していてもよいし、前記接触工程に先だって、前記疎水性イオン液体に、塩化リチウム又は塩化リチウム水溶液を添加する工程を備えていてもよい。
【００１７】
本明細書の開示によれば、セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程と、前記疎水性イオン液体に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、を備える、生産方法が提供される。
【００１８】
前記生産方法にあっては、前記セルロースの分解工程後に、前記親水性溶媒相の少なくとも一部を回収する工程を備えることもできる。また、前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収する工程を備えていてもよい。
【００１９】
さらに、本明細書の開示によれば、セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物が提供される。前記組成物は、さらに、塩化リチウムを含有していてもよい。また、前記疎水性イオン液体に塩化リチウム水溶液が添加されて得られるものであってもよい。さらに、前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上であってもよい。さらにまた、前記組成物は、セルロース含有材料を含んでいてもよい。
【００２０】
前記組成物の前記イオン液体のアニオン成分は、前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上としてもよい。
【００２１】
本明細書の開示によれば、有用物質の生産方法であって、セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相に分散させる工程と、前記疎水性イオン液体相に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、前記セルロース分解工程で得られたセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程と、を備える、生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のセルロースの処理方法及びセルロースの分解産物の生産方法等の一例を示す図である。
【図２】疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面におけるセルロース含有材料又はセルロースの存在状態及びセルラーゼによる分解挙動の一態様を模式的に示す図である。
【図３】疎水性イオン液体に対する塩化リチウムの添加効果の評価結果を示す図である。
【図４】疎水性イオン液体に対する塩化リチウム飽和水溶液の添加効果の評価結果を示す図である。
【図５】塩化リチウム以外の塩の添加効果の評価結果を示す図である。
【図６】塩化リチウムの添加量の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書の開示は、セルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法等に関する。本明細書の開示によれば、セルロース含有材料は、カチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体と接触されると、疎水性イオン液体とセルロース含有材料とがよく親和し、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透する。疎水性イオン液体がセルロース含有材料に対して過剰に存在する場合には、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体に分散される。この後、この疎水性イオン液体に水性媒体などの親水性溶媒を供給することにより、セルロース含有材料を含む疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系が形成される。
【００２４】
図２に示すように、上記処理方法で形成された二相系においては、その界面にセルロースを含む画分が局在され濃縮される。このとき、疎水性イオン液体と親和したセルロース含有材料は、界面に局在し濃縮されたセルロースはセルラーゼがアクセスしやすい状態に形成されている。一方、セルラーゼは、親水性溶媒相に存在する。この結果、界面に局在するセルロース含有材料のセルロースは、セルラーゼにより分解されやすくなっている。同時に、セルラーゼと疎水性イオン液体との接触は抑制されており、その酵素活性は確保されやすくなっている。これらの結果、セルラーゼによりセルロースが効率的に分解される。
【００２５】
以上の効果は、ある種の疎水性イオン液体相と親水性溶媒相の二相系を形成した状態でセルロースを分解するためである。すなわち、疎水性イオン液体によるセルロース含有材料に対する作用によって親水性溶媒に対して親和性が高い部分が生成又は露出されるため、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面に局在されるようになる。そして、セルラーゼはこうしたセルロースにアクセスしてセルロースを分解し、その分解によりさらにセルロースの崩壊が進行し、セルラーゼによる分解も進行するものと考えられる。セルロースの分解産物は、分解に伴い親水性溶媒相に移行してさらに確実に分解され回収される。
【００２６】
また、二相系ゆえに、疎水性イオン液体はそれ自体分離回収が容易である。また、セルロースの分解産物であるグルコース等は親水性溶媒相に移行する。このため、セルロース分解産物は親水性溶媒相としてあるいは当該溶媒相から容易に分離回収される。
【００２７】
以上のように、本明細書の開示によれば、疎水性イオン液体とセルロース含有材料とを接触させてセルロース含有材料に疎水性イオン液体を浸透させることで、その後親水性溶媒を供給したときに二相系を形成できる。その結果、セルラーゼによるセルロースの効率的な分解とその回収並びに疎水性イオン液体の分離回収及び再利用が可能となる。また、これにより、セルロース含有材料を効率的に有用物質に変換できるようになる。
【００２８】
以下、本明細書に開示される各種の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法、セルロース分解産物の生産方法及び有用物質の生産方法の概要の一例を示す図であり、図２は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との二相系の界面におけるセルロースの分解挙動の一態様を模式的に示す図である。
【００２９】
（セルロース含有材料）
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが、好ましくは２００以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００３０】
また、セルロースは、天然では植物細胞壁の主たる構成成分として存在し、多糖としては地球上で最も多く生産されている。植物細胞壁において、セルロースは、結晶性セルロース領域と非晶質セルロース領域とを形成している。また、セルロースは、植物細胞壁において、リグニンやヘミセルロースと複合化されたセルロース含有マトリックスを形成している。
【００３１】
本明細書において、セルロース含有材料とは、上記したセルロースを含むものであればよい。したがって、セルロースは結晶性セルロースであっても非結晶性セルロースであってもよく、セルロースのほか、ヘミセルロースやリグニンを含んでいてもよい。セルロース含有材料としては、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラなどの各種ワラ、籾殻、バガス、木材チップなどの農産廃棄物、古紙、建築廃材などの各種廃棄物などを含むバイオマス（木質系及び草本系）が挙げられる。
【００３２】
本明細書に開示される各種実施形態に適用されるセルロース含有材料は特に限定されない。後述する実施例においても開示するように、本明細書に開示される疎水性イオン液体は、結晶性セルロースであってもその一部を可溶化又は崩壊又は溶解できることがわかっている。すなわち、結晶性セルロースのように、水素結合により強固に相互作用して結晶性の高い領域であっても、疎水性イオン液体が親和し浸透し、その構造を緩和してセルラーゼによる分解を促進できる。このため、疎水性イオン液体がセルロースを含むマトリックスの崩壊・可溶化又は溶解に作用することができれば、そのセルロース含有材料を本処理方法に適用できると考えられる。また、疎水性イオン液体のセルロースを含むマトリックスへの作用を考慮すると、セルロース含有材料は水に不溶性あるいは難溶解性のものであることが好ましい。かかるセルロース含有材料としては、結晶性セルロースを含有するセルロース含有材料が挙げられ、また、例えば、セルロースのほかリグニン及び／又はヘミセルロースを含有する植物細胞壁由来のセルロース含有マトリックスを含む材料が挙げられる。典型的には、草本系や木質系のバイオマスが挙げられる。
【００３３】
（セルロース含有材料の処理方法）
本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法は、セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程（以下、接触工程という。）を備えることができる。さらに、本明細書に開示される処理方法は、疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程（以下、二相系形成工程という。）を備えることもできる。
【００３４】
（接触工程）
本明細書に開示される接触工程は、液相である疎水性イオン液体と固相であるセルロース含有材料とを接触させる工程である。カルボニル基を有する疎水性イオン液体は、セルロース含有材料のセルロースを含むマトリックスに親和性ないし浸透性を有しており、セルロース含有材料の少なくとも一部を崩壊させその構造を緩和することができる。本明細書の開示を拘束するものではないが、セルロースは疎水性領域と親水性領域とを併せ持つ高分子材料であるため、その疎水性領域と疎水性イオン液体との相互作用により疎水性イオン液体がセルロース含有マトリックスに浸透し、その少なくとも一部を破壊するものと考えられる。また、セルロース含有材料が、セルロース以外にヘミセルロースやリグニンを含むセルロース含有マトリックスを備えている場合には、同様に、これらの成分の疎水性領域と相互作用して、セルロース含有マトリックスに浸透し、その一部を崩壊するものと考えられる。
【００３５】
（疎水性イオン液体）
本明細書において、疎水イオン液体は、水と二相分離するイオン液体をいうものとする。なお、温度変化によって水と二相分離するイオン液体であってもよい。接触工程に適用される疎水性イオン液体は、カチオン種にカルボニル基を有する疎水性イオン液体であれば特に限定されない。こうした疎水性イオン液体は、例えば、セルロース含有材料に対して浸透性を有する疎水性イオン液体は、セルロース含有材料と混合したとき、セルロース含有材料を疎水性イオン液体の下方への集積を抑制して懸濁ないし分散することができる。また、その疎水性イオン液体と接触後に親水性溶媒相中のセルラーゼのアクセスを容易化できる。
【００３６】
イオン液体は、その融点が１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは８０℃以下である。さらに好ましくは４０℃以下であり、最も好ましくは２０℃以下である。
【００３７】
疎水性イオン液体としては、例えば、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、炭化水素基等で置換された置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩、置換ピロリジニウム塩（脂環式第４級アンモニウム塩）、第三級スルホニウム塩等が挙げられ、本発明の疎水性イオン液体としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピリジニウム塩及び置換ピロリジニウム塩が好ましく、なかでも第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩が好ましい。第４級アンモニウム塩、第４級ホスホニウム塩、置換イミダゾリウム塩、置換ピロリジニウム塩及び置換ピリジニウム塩をそれぞれ一般式(I)〜（V）として表す。
【００３８】
【化４】
【００３９】
疎水性イオン液体の構成カチオン種の基本骨格としては、一般式（Ｉ）に示すように、同一または相異なる４つ置換基が窒素原子に結合したアンモニウムカチオン、一般式(II)に示すように、同一または相異なる４つの置換基がリン原子に結合したホスホニウムカチオン、一般式（III）に示すように、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、一般式(IV)に示すように、ピロリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピロリジニウムカチオン、一般式（V）に示すように、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン、同一または相異なる３つの置換基がイオウ原子に結合したスルホニウムカチオンなどが挙げられる。
【００４０】
好ましい構成カチオン種の基本骨格としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なる置換基と結合したイミダゾリウムカチオン、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピリジニウムカチオン及びピロリジン環上の窒素原子が置換基と結合したピロリジニウムカチオンが挙げられる。なお、これらの環状体は、２個が連結されるなどの多環構造を形成していてもよい。
【００４１】
これらのカチオン種における置換基（一般式（I）〜(V)中においてはＲ１〜Ｒ４で表される。）は、少なくとも１つの置換基がカルボニル基を有していることが好ましい。カルボニル基は、置換基の末端にあってもよいし、各環の近傍にあってもよい。また、カルボニル基は、その炭素原子にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルキル置換アミノ基を有していてもよい。こうしたカルボニル基を有する置換基としては、たとえば、以下の式（１）で表される置換基が挙げられる。
【００４２】
【化５】
【００４３】
式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。
【００４４】
好ましくは、前記カチオン種は、下記（２）で表される。
【化６】
【００４５】
式（１）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。炭化水素のジイル基は、炭素数１〜１８程度のアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基等が挙げられる。好ましくは炭素数１〜６程度、より好ましくは炭素数１〜４程度のアルキレン基である。また、炭化水素のジイル基は、アルキル基等で置換されていてもよいベンゼン環を有していてもよく、２つのイル基は、ベンゼン環上にあってもよいし、一方がベンゼン環上にあり他方が置換基上にあってもよし、双方が置換基上にあってもよい。例えば、炭化水素のジイル基としては、メチレン基のほか以下の式（３）で表されるジイル基が挙げられる。
【００４６】
【化７】
【００４７】
カルボニル基を有する置換基以外の置換基Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に炭素数１〜１８であって、直鎖状又は分岐状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基であることが好ましい。好ましいアルキル基としては、炭素数１〜１８の直鎖状のアルキル基が挙げられる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基などが挙げられる。また、ベンジル基、ベンザル基、ベンジリデン基などの芳香族系炭化水素基であってもよい。好ましいアルケニル基としては、低級アルキル基等で置換されていてもよいアリル基（２−プロペニル基）などがあげられる。また、置換基には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基の炭素数１〜４程度のアルキル基を備えるアルコキシ基を有していてもよい。好ましくは、２−メトキシエチル基のように、アルキル鎖の末端にアルコキシ基を備える。
【００４８】
好ましいアニオン種は、例えば以下の式（４）〜（６）に挙げられる。
【化８】
【００４９】
疎水性イオン液体の構成アニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのビス（パーフルオロアルカン）スルホンイミドアニオン、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロアンチモネートアニオン（ＳｂＦ6-）、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスフェートアニオンなどのパーフルオロアルカン基で置換されていてもよいヘキサフルオロホスフェートアニオン（ＰＦ6-）、パーフルオロアルカン基で置換されていてもよいテトラフルオロボレートアニオン（ＢＦ4-）など、塩素アニオン（Ｃｌ-）、臭素アニオン（Ｂｒ-）、ヨウ素アニオン（Ｉ-）などのハロゲンアニオン、アルカンスルホネートアニオン、パーフルオロアルカンスルホネートアニオン（ＣＦ3ＳＯ3-など）、酢酸アニオン（ＣＨ3ＣＯ2-）、パーフルオロ酢酸アニオン（ＣＦ3ＣＯ2-）、硝酸アニオン（ＮＯ3-）などが挙げられる。
【００５０】
好ましいアニオン種としては、フッ化アルキル基含有アニオン種が挙げられる。フッ化アルキル基は、好ましくはパーフルオロアルキル基である。かかるアニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオン（(ＣＦ3ＳＯ2)2Ｎ-）などのパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンやトリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロフェートアニオンなどのパーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオンが挙げられる。
【００５１】
イオン液体は、カチオン種とアニオン種との組み合わせからなり、上述したカチオン種及びアニオン種を含む従来公知のカチオン種及びアニオン種を適宜組み合わせて用いることができる。疎水性イオン液体は、商業的に入手できるものであるほかは、公知の方法で合成することができる。合成方法は特に限定されないで、カチオンを塩化物との塩として合成、精製し、その後、得ようとするイオン液体のアニオンの塩と反応させるなどするか、一旦水酸化物とした上でアニオンを含む酸で中和してもよい。
【００５２】
疎水性イオン液体には塩化リチウムを含むことができる。塩化リチウムは、イオン性化合物であって、疎水性イオン液体中において、その一部あるいは全部がそれぞれＬｉ+イオン及びＣｌ-イオンとして存在していると考えられる。カチオン種がカルボニル基を有する疎水性イオン液体中において、塩化リチウムが存在すると、セルロースの糖化率が向上する。したがって、カルボニル基を有するカチオン種と塩化リチウムとが併存することで、セルロースの構造緩和が促進されたものと考えられる。これは、水素結合能の高い塩素イオンによるものと考えられる。なお、ＫＣｌ及びＮａＣｌでは、ＬｉＣｌのような添加効果が得られないことがわかっている。したがって、Ｌｉ塩であることも関与しているものと考えられる。以上の塩化リチウムの添加による作用は推論であって本明細書の開示を拘束するものではない。
【００５３】
塩化リチウムは固形物の状態で疎水性イオン液体に供給されてもよいし、飽和水溶液の形態で疎水性イオン液体に供給されてもよい。飽和水溶液の形態で供給されるとき、セルロースの構造緩和がより促進されると考えられる。すなわち、低温で接触工程を行っても、６０℃以上１００℃以下で１時間〜６時間程度の接触工程でも、良好な糖化率を得ることができる。
【００５４】
塩化リチウムの添加量は、特に限定しないが、疎水性イオン液体との総量に対して、０．０５質量％以上２０％質量以下程度であることが好ましい。多すぎると、セルラーゼ活性に影響が及ぶおそれがあり、少なすぎると添加効果が十分に得られないからである。より好ましくは、０．１質量％以上であり、さらに１質量％以上であることが好ましい。また、好ましくは５質量％以下であり、より好ましくは３％質量％以下であり、さらに好ましくは２質量％以下である。
【００５５】
イオン液体の純度は高いことが好ましい。イオン液体の合成工程の不純物は、イオン液体と親水性溶媒とを混合して得られる媒体のｐＨに大きく影響し、結果として酵素の触媒活性に大きく影響する場合があるからである。本発明者らによれば、例えば、イミダゾリウム系カチオンを用いるイオン液体の場合、純度が低いほど水や緩衝液などの親水性溶媒と混合したときのｐＨがアルカリにシフトしやすく、セルラーゼによるセルロース分解活性が低下する傾向があることがわかっている。
【００５６】
以上の疎水性イオン液体は、単独で用いることができるほか、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。こうした疎水性イオン液体又はその組み合わせは、それ自体、セルロース含有材料の構造緩和、分解・糖化用の媒体として有用である。かかる媒体によれば、セルロースをセルラーゼで効率的に分解し、しかも、当該媒体の回収再利用及び分解産物の回収を容易化することができる。
【００５７】
セルロース含有材料と疎水性イオン液体とを接触させる方法は特に限定されない。セルロース含有材料は疎水性イオン液体が親和していれば足り、必ずしも疎水性イオン液体中にセルロース含有材料が浸漬され、分散され、あるいは懸濁された状態であることを要しない。セルロース含有材料に疎水性イオン液体を接触させるには、例えば、図１に示すように、十分量の疎水性イオン液体中にセルロース含有材料を供給するようにしてもよいし、セルロース含有材料に対して疎水性イオン液体を噴霧等によりセルロース含有材料が湿る程度の量を供給し、セルロース含有材料に疎水性イオン液体を含浸させるようにしてもよい。
【００５８】
セルロース含有材料中に疎水性イオン液体を浸透させるための処理は適宜設定することができる。適度に、例えば、４０℃以上１５０℃以下程度、好ましくは５０℃以上１５０℃以下程度に加熱してもよい。加熱を行うことで、疎水性イオン液体のセルロース含有材料への浸透を促進し、セルラーゼにより分解を促進することができる。１５０℃を超えると、セルロース含有材料の種類によっては好ましくない反応が生じる可能性があり、４０℃未満では、加熱の効果が得られにくいからである。また、必要に応じて、攪拌を行ってもよい。さらに、超音波処理を行ってもよい。これらの各種処理は、単独で採用してもよいが、適宜組み合わせて採用してもよい。処理の種類は、用いる疎水性イオン液体の種類やセルロース含有材料によっても適宜変更される。
【００５９】
なお、後段の二相系形成工程において、疎水性イオン液体量を低減するには、浸透に必要量程度の疎水性イオン液体をセルロース含有材料に供給してもよいし、十分量の疎水性イオン液体に浸漬したセルロース含有材料を、その後、ろ過や遠心分離等の固液分離手段により疎水性イオン液体から分離してもよい。
【００６０】
このような接触工程の実施により、セルロース含有材料には疎水性イオン液体が親和し、そのセルロース含有マトリックスが緩んだようになっているものと考えられる。疎水性イオン液体によってセルロース含有材料の構造が緩和されることにより、水性媒体などの親水性溶媒と接触して二相系が形成されたとき、セルロースの親水性領域が親水性溶媒相との界面に露出されやすくなり、界面のセルロースが親水性溶媒相中のセルラーゼによって分解されると考えられる。したがって、こうした接触工程を経て疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料は、その後、セルラーゼ等によるセルロースの分解に供することができる。
【００６１】
（二相系形成工程）
さらに、本明細書に開示される処理方法は、二相系形成工程を備えることもできる。疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料に親水性溶媒を供給することで二相系を構成できる。これにより、セルロース含有材料を親水性溶媒相との界面に局在・濃縮でき、セルラーゼ等によりセルロースを分解するのに適した環境を形成することができる。
【００６２】
疎水性イオン液体に対して供給する液体は、疎水性イオン液体と二相系を構成できるものであって（疎水性イオン液体と二相系を形成可能な程度に親水性の溶媒であって）、セルロースの分解産物のうち少なくともグルコースの良溶媒となる親水性溶媒であればよい。また、ここで使用する疎水性イオン液体は、異なる２種類以上のものを混合して用いてもよい。かかる液体としては、例えば、水性の液体であって、水又は水と相溶性のある有機溶媒との混液が挙げられる。
【００６３】
有機溶媒としては、炭素数が１〜４程度の低級アルコールが挙げられる。また、当該液体には、セルロースの分解産物であるグルコース等の溶解のため、あるいはセルラーゼによる酵素反応に適したｐＨや塩濃度を形成するための酸、アルカリあるいは塩類が含まれていてもよい。典型的には、二相系形成時において親水性溶媒相に酵素反応に適したｐＨを付与できる緩衝液や塩溶液が挙げられる。親水性溶媒には、酵素反応に必要な金属イオンを含めることもできる。さらに、セルラーゼ等に酵素を予め含有していてもよい。酵素反応を考慮した塩類及び酵素は、必ずしも二相系形成工程において親水性溶媒に含まれることを要するものではない。少なくともセルロースの分解時においてこれらを添加するようにしてもよい。
【００６４】
二相系を形成する方法や二相系の形態は特に限定されない。疎水性イオン液体に分散又は懸濁されたセルロース含有材料に対して親水性溶媒を供給してもよいし、疎水性イオン液体が含浸されただけのセルロース含有材料に親水性溶媒を供給してもよい。親水性溶媒との接触に先だって、必要に応じて過剰量の疎水性イオン液体を固液分離により除去しておいてもよい。なお、二相系の形成にあたっては、セルロース含有材料と親水性溶媒とを十分に接触させるために、適宜攪拌してもよい。また、適当な温度での加熱を伴っていてもよい。
【００６５】
図１の左側に示すように、セルロース含有材料が疎水性イオン液体相中に分散又は懸濁した状態で保持されるときには、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相とで明らかな二相系となる。一方、図１の右側に示すように、疎水性イオン液体がセルロース含有材料に浸透しているが、セルロース含有材料に対して過剰量では存在しない場合には、親水性溶媒中に疎水性イオン液体が浸透したセルロース含有材料が存在するような二相系となる。後者の二相系では、セルロース含有材料自体が実質的な疎水性イオン液体相となっている。なお、このような場合であっても、セルロース含有材料は、親水性溶媒相との界面近傍に局在しているといえる。
【００６６】
こうした二相系の形成工程の実施により、セルロース含有材料は、疎水性イオン液体相と親水性溶媒相との界面に局在、濃縮される。これは、セルロース含有材料に含まれるセルロース等の親水性領域との親水性溶媒相との相互作用によるものと推測される。二相系の界面においては、親水性領域が親水性溶媒相側に露出された状態となっていると推測される。このようなセルロース含有材料の局在・濃縮及び親水性溶媒相への露出は、親水性溶媒相に存在するセルラーゼによるセルロースの分解に適した状態になっている。同時に、二相系は、疎水性イオン液体の回収と分解産物の回収にも好ましい系になっている。
【００６７】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース含有材料の処理方法によれば、セルロース含有材料のセルロースを含有するマトリックスの構造を緩和して、セルラーゼがアクセスしやすい環境を形成することができる。さらに、二相系を形成することでセルラーゼによるセルロースの分解に適し、疎水性イオン液体と分解産物の双方の分離回収に適した環境を形成することができる。
【００６８】
（セルロース糖化用のイオン液体組成物）
本明細書の開示によれば、セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物が提供される。本組成物によれば、セルロース含有材料に浸透して、その後のセルラーゼによる分解糖化反応に適した前処理を行うことができる。本組成物は、塩化リチウムを含有していてもよいし、塩化リチウム水溶液が添加されて得られるものであってもよい。疎水性イオン液体としては、既に説明した各種の疎水性イオン液体を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。本組成物は、セルロース含有材料を含んでいてもよい。また、疎水性イオン液体と二相系を形成する親水性溶媒を含んでいてもよい。
【００６９】
なお、かかる組成物は、基質をセルロース含有材料のセルロースとし、酵素をセルラーゼとするものであるが、疎水性イオン液体による構造緩和作用が発揮される基質含有材料であればほかの物質とその分解酵素にも適用が可能である。すなわち、酵素が作動可能な環境下では難溶性の基質形態を採るものであっても、疎水性イオン液体が浸透されていることで酵素を作用させて利用しやすくすることができる。
【００７０】
基質としては特に限定しないが、天然多糖や天然樹脂、合成多糖や合成樹脂などを含む高分子が挙げられる。天然多糖としては、例えば、セルロース、キシラン、キチン及びキトサンが挙げられる。また、酵素は基質の種類によるが、セルロースを基質とする場合には、既に説明したセルラーゼであり、キシランにはキシラナーゼ、キチンやキトサンには、キチナーゼ等が挙げられる。
【００７１】
疎水性イオン液体は、セルロースに好ましく用いることのできるイオン液体は、類似した構造を有するキチンやキトサンにも好ましく用いることができる。
【００７２】
なお、疎水性イオン液体の特性の変動によるｐＨシフトやｐＨ変動の酵素活性及び分解効率への悪影響を抑制又は回避可能な反応媒体を調製するには、用いるイオン液体と親水性溶媒が接触したとき生じる可能性のあるｐＨシフトを補正し又はｐＨ変動を緩衝するのに十分な調整能力を有する親水性溶媒を用いることが好ましい。本組成物には、さらに、基質に作用させるための酵素を含んでいてもよい。酵素は、予め親水性溶媒に添加してあってもよいし、二相系を形成後に添加されるものであってもよい。
【００７３】
（セルロース含有材料の分解産物の生産方法）
本明細書の開示によれば、図１に示すように、上記接触工程と、上記二相系形成工程と、セルロース分解工程と、を備えるセルロース含有材料の分解産物の生産方法が提供される。本明細書に開示される生産方法によれば、セルロースのセルラーゼによる分解に適しており、しかも、疎水性イオン液体の分離回収及び再利用と、グルコース等の分解産物の回収に適し二相系を備えているため、実用的なレベルでのセルロース含有材料の分解利用が可能となっている。なお、接触工程と二相系形成工程に関しては、上記処理方法において説明した各種の態様をそのまま適用することができる。なお、セルロースの分解産物としては、セルロースが低分子化されたものであればよい。より具体的には、最終分解産物であるグルコースのほか、セロビオース及びセロオリゴ糖が挙げられる。
【００７４】
（セルロース分解工程）
セルロース分解工程は、親水性溶媒相中のセルラーゼによりセルロースを分解する工程である。セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。セルラーゼとしては、狭義には、β１，４−エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、グルカン１，４−βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セルロース１，４−βセロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。また、セルラーゼは、天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定しないが、Trichoderma属又はAspergillus属由来のセルラーゼなどを好ましく用いることができる。また、７０℃以上で高い活性を示し、９０℃から１００℃でも活性を維持する耐熱性セルラーゼを用いることもできる。例えば、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。本発明においては、上記した狭義のセルラーゼを１種類又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。異種のセルラーゼでなく、同種であっても２種類以上組み合わせてもよい。また、由来の異なるセルラーゼを組み合わせて用いることもできる。また、セルラーゼは、適当な担体に保持された形態であってもよい。
【００７５】
また、セルロース分解工程では、植物細胞壁においてセルロースと複合体を形成しているヘミセルロースを分解する酵素を用いることもできる。ヘミセルロースとしては、キシラン、マンナン、グルコマンナン等が挙げられる。ヘミセルロースの分解酵素としては、キシラナーゼ等が挙げられ、こうした酵素は、上記のTrichoderma属やAspergillus属等のセルロース分解性微生物に由来するものであってもよい。また、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼなどの耐熱性セルラーゼであってもよい。
【００７６】
セルラーゼは、二相系形成工程において予め親水性溶媒に含めておいてもよいし、セルラーゼ分解工程において、親水性溶媒相に添加してもよい。セルラーゼの添加時においては、親水性溶媒相は、酵素活性の発現に適した環境であることが好ましい。酵素反応の安定性や操作の簡便性を考慮すると、親水性溶媒相は、用いるセルラーゼの至適ｐＨを含む酵素活性に適したｐＨ範囲に一致する範囲に緩衝能を有する緩衝液を用いることが好ましい。一般的なセルラーゼの典型的な好適ｐＨは４〜６程度であるため、例えば、クエン酸緩衝液（クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム）、クエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸−リン酸二水素ナトリウム）等が挙げられる。こうした緩衝液の濃度やｐＨを適宜調製して、親水性溶媒相のｐＨを４以上６以下、より確実には、４．０以上６．０以下となるように設定することが好ましい。
【００７７】
セルラーゼによるセルロース分解のための温度や時間は特に限定されない。セルラーゼの種類にもよるが、通常、３０℃〜７０℃程度、好ましくは３５℃〜４５℃程度で、ｐＨ２以上６以下程度とし、数時間から数十時間程度実施する。耐熱性セルラーゼを用いる場合は、７０℃以上１００℃以下であってもよい。
【００７８】
セルロース分解工程によれば、疎水性イオン液体によりセルロースマトリックスの構造が緩和されかつ一部が親水性溶媒相との界面に露出された二相系が形成されているため、親水性溶媒相中のセルラーゼがセルロースを効率的に分解することができる。しかも、グルコースなどセルロースの低分子化物（二糖やオリゴ糖を含む分解産物）は、親水性溶媒相に移行するため、一層セルラーゼにより分解されやすくなる。後述するように、親水性溶媒相からは、分解産物を容易に回収できる。
【００７９】
このようなセルロース分解工程を実施することで、たとえば、図２に示すようにして、セルロースはセルラーゼにより分解され、かかる低分子化によって構造緩和が一層促進され、セルラーゼによる分解も促進される。また、分解産物は、親水性溶媒相に移行し、さらにセルラーゼにより分解されることもある。一方、後述するように、未分解のセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどのセルロース含有由来の炭素原は、固液分離手段により固相として分離されるため、再度の分解等の処理が可能であり、炭素原の損失を十分に抑制又は回避できる。また、後述するように、疎水性イオン液体も容易に分離回収され再利用できる。
【００８０】
（分解産物の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、少なくとも一部の親水性溶媒相を回収することができる。二相系は分解工程後も維持され、親水性溶媒相は容易に回収される。通常、疎水性イオン液体相は親水性溶媒相よりも比重が大きく、親水性溶媒相が上相、疎水性イオン液体相が下相となっている。したがって、通常は、上相を回収すればよい。回収した親水性溶媒相は疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのまま、たとえば後段で説明する有用物質の生産方法における発酵工程等に利用できる。また、必要に応じて濃縮されてもよい。なお、親水性溶媒相にはセルラーゼが含まれているが、公知の方法で分離回収も可能である。セルラーゼを固相担体に固定化しておくことで分離回収は容易になる。
【００８１】
（疎水性イオン液体の回収工程）
図１に示すように、セルロース分解工程後、少なくとも一部の疎水性イオン液体を回収することができる。二相系のため、疎水性イオン液体は容易に回収される。また、図１に示すように、回収された疎水性イオン液体相は、再度、接触工程に供給してセルロース含有材料に浸透させるための疎水性イオン液体として再利用や循環利用が可能である。疎水性イオン液体は、高価であるためかかる循環利用が可能となることでセルロースの糖化がより現実的となる。なお、疎水性イオン液体は、セルロース含有マトリックスの構造緩和作用を有しているが、セルロースを溶解するものではない。また、水可溶性画分は、親水性溶媒相に移行され、未分解の固相（セルロース含有材料の分解残渣）は後述するように固液分離手段で分離される。したがって、疎水性イオン液体相へのセルロース含有材料由来成分の溶解は、回避又は抑制されている。
【００８２】
なお、界面に局在するなどして残存したセルロース含有材料の分解残渣は、固液分離手段によって回収できる。かかる残留物については再度、接触工程〜分解工程を実施することもできる。残留物は、用いたセルロース含有材料の種類やセルラーゼの種類等によるが、ヘミセルロースやリグニン、未分解のセルロース等が含まれていると考えられる。
【００８３】
以上説明したように、本明細書に開示されるセルロース分解産物の生産方法によれば、用いた疎水性イオン液体及びセルロース分解産物の回収等が容易なより実用的なセルロース含有材料の利用が可能となる。
【００８４】
（有用物質の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースを利用する有用物質の生産方法は、上記したセルロースの分解産物の生産方法によって得られるセルロース分解産物を炭素源として用いて酵母などの微生物の発酵によって有用物質を生産する工程（以下、単に発酵工程ともいう。）を備えることができる。この生産方法によれば、セルロース含有材料から効率的に分解回収されたセルロース分解産物を用いることで、全体としての製造コストを低減することができる。
【００８５】
炭素源は、疎水性イオン液体が浸透されたセルロース含有材料とセルラーゼを含有する親水性溶媒とを含み、前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系において前記セルロース含有材料中のセルロースを分解して得られた親水性溶媒相中のセルロース分解産物を用いる。本生産方法において用いるセルロース分解産物は、セルロース分解工程後の親水性溶媒相、その濃縮物、又は親水性溶媒相から分離回収されたものであってもよい。上述したように親水性溶媒相は、疎水性イオン液体を実質的に含んでいないため、そのままであって発酵工程に供することができる。したがって、例えば、セルロース分解工程後の親水性溶媒相等を発酵用の培地の一部として用いることができる。
【００８６】
発酵工程で用いる微生物は、特に限定しないで、セルロースの分解産物を資化可能であって生産しようとする有用物質の種類に応じて適宜選択される。セルロース分解産物は、グルコースが主であるが、ヘミセルロース由来のキシラン等であってもよい。例えば、酵母やカビなどの真菌類や大腸菌等の微生物が挙げられる。微生物は、野生型であってもよいし、遺伝子工学的技術等によって人為的にセルロース分解産物を効率的に資化可能に改変されたり、有用物質を生産可能に改変されたりしたものであってもよい。典型的には、エタノールを生産する酵母などの微生物が挙げられる。また、有機酸を生産する酵母や乳酸菌であってもよい。
【００８７】
発酵工程は、用いる微生物の種類や生産しようとする有用物質に応じて実施すればよい。発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。なお、変換工程終了後、培養液から微生物を除去してエタノール等の有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを濃縮する工程を実施してもよい。
【００８８】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。例えば、エタノールなどの低級アルコール、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００８９】
以上説明したように、本明細書に開示される有用物質の生産方法によれば、従来に比してより効率的に得られたセルロース分解産物を利用するため、有用物質の生産コストを効果的に低減することができる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９１】
（疎水性イオン液体への塩化リチウムの添加効果の評価）
疎水性イオン液体を利用した二相系でのセルロースの糖化ならびに回収において、塩化リチウムを添加した場合のグルコース糖化効率について、以下の検討を実施した。なお本検討において、モデルとして以下に示す、4種類の疎水性イオン液体を使用した。
3-[2-(dimethylamino)-2-oxoethyl]-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[DMAcmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
3-[2-(diethylamino)-2-oxoethyl]-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[DEAcmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
3-(4-acetylphenethyl)-1-methylimidazolium bis(trifluomethylsulfonyl)imide
（以下、[AcPEmim][Tf2N]と称す。合成により作成）
l-Ethyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide
（Solvent innovation社製、以下、[Emim][Tf2N]と称す）
【００９２】
本実施例で利用した４種類の疎水性イオン液体の構造式は下記の通りである。
【００９３】
【化９】
【００９４】
（１）上記に示した各疎水性イオン液体 495 mgに無水LiClを1 wt% (5 mg) 添加し、500 mgの疎水性イオン液体を調製した。また、LiCl無添加の疎水性IL500 mgからなるサンプルも準備した。それぞれに、結晶性セルロースであるAvicel（Sigma）を1 wt％ (5 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに1 mg/mlのセルラーゼ (Tricoderma ressei由来、Sigma) 水溶液 (100 mMクエン酸緩衝溶液) を500 μl 加え、2相系を形成させた。40℃で攪拌して糖化反応を行い24時間後にそれぞれサンプリングした。
【００９５】
次に、溶液中のグルコース、セロビオース量を測定した。測定には、4−アミノ安息香酸エチルエステル (ABEE) 化試薬で誘導体化によって実施した。そのスキームを以下に示す。1.5 mlエッペンドルフチューブに、試料10 μlとABEE化標識試薬40μlを加え、ボルテックスで攪拌し遠心した (8000 rpm、1分、20℃) 後、ブロックインキュベータを用いて80 ℃で60分間保温した。Milli-Q水200 μlとクロロホルム200 μlを加え、ボルテックスで攪拌し遠心した (8000 rpm、3分、20℃) 後、水相を回収した。回収した水相をHPLC分析して生成した糖の定量を行った。ABEE溶液の組成ならびに、HPLCの分析条件は、下記表に示す。
【００９６】
【化１０】
【００９７】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
グルコース変換効率 (%) = [produced glucose] / [glucose units in cellulose] ´ 100
【００９８】
24時間後の糖化反応の結果を図３に示す。図３に示すように、本実施例で合成したイオン液体の分子構造中にカルボニル基を含むいずれのイオン液体についても、塩化リチウムを添加することで糖化率の上昇が確認された。一方、分子構造にカルボニル基を含まない[Emim][Tf2N]においては、塩化リチウムの添加による糖化率の上昇は見られなかった。このことから、イオン液体中に一部溶解した塩化リチウムと、イオン液体のカルボニル基との相互作用との結果生じる水素結合の高いCl- によってセルロース鎖の構造緩和効果が高められる可能性が示唆された。
【実施例２】
【００９９】
（疎水性イオン液体への塩化リチウム飽和水溶液の添加効果）
実施例１では無水LiClの添加効果を検討した。より効率的にイオン液体中にLiClを取り込ませることを目的とし、LiCl飽和水溶液の添加効果を検討した。
【０１００】
使用した疎水性イオン液体としては、実施例１でも利用したカルボニル基を含む3種類のイオン液体（[DMAcmim][Tf2N]、[DEAcmim][Tf2N]、[AcPEmim][Tf2N]）を利用した。とりこ
【０１０１】
各疎水性イオン液体 490 mgにLiCl飽和水溶液（１９．５３mol／Ｌ、約８２．８質量％）を10 mg添加した。また、疎水性イオン液体 500 mgのみのサンプルも準備した。それぞれのサンプルに結晶性セルロースであるAvicel（Sigma）を1 wt％ (5 mg) 添加し、80 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに1 mg/mlのセルラーゼ (Tricoderma reessei由来) 水溶液 (100 mMクエン酸緩衝溶液) を500 μl加え、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い24時間後にそれぞれサンプリングして、実施例１と同様に、4−アミノ安息香酸エチルエステル (ABEE) 化試薬で誘導体化し、HPLC分析により生成した糖の定量を行った。得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、以下の計算式に従って算出した。
【０１０２】
24時間後の糖化反応の結果を図４に示す。図４に示すように、実施例１と同様に、カルボニル基を含む疎水性イオン液体すべてにおいて、塩化リチウムを添加することで糖化率の上昇が確認された。疎水性イオン液体の種類別に比較すると、塩化リチウム飽和水溶液を[DMAcmim][Tf2N]及び[DEAcmim][Tf2N]添加することで80℃という比較的低温での処理条件下でも約60 %の糖化率が得られ、固体の塩化リチウム添加効果を上回る糖化率が得られることが判明した。したがって、実施例１と同様にイオン液体の分子構造にカルボニル基を含む場合、これと塩化リチウムとが相互作用することで生じる水素結合能の高いCl-によってセルロース鎖の構造緩和効果が高められる可能性が示唆された。また、この効果は塩化リチウムが水溶液中に分散した状態にある場合、より効果的に進行することも明らかとなった。
【実施例３】
【０１０３】
（疎水性イオン液体へのLiCl以外の塩の添加効果）
実施例１でのLiCl添加効果を受け、その他の塩に添加効果があるかを検証する目的で、NaCl、KClの添加効果を検討した。
【０１０４】
検討には、カルボニル基を含む疎水性イオン液体[DEAcmim][Tf2N]を利用した。 [DEAcmim][Tf2N] 980 mgを採取し、これに無水のLiCl, NaCl, KClを各1 wt％ (10 mg) になるよう添加し1,000 mgの疎水性ILを調製した。またネガティブコントロールとして、[DEAcmim][Tf2N] 1,000 mgから成るサンプルも準備した。
これに結晶性セルロース（Avicel, Sigma）を1 wt％ (10 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに、セルラーゼ混合溶液を含有させたクエン酸緩衝液（最終濃度10 mM）を1,000 μl添加し、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い、一定時間後にそれぞれサンプリングした。サンプリング試料を、バイオセンサーBF5にて、グルコースを測定し糖化効率を算出した。
【０１０５】
なおセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reesei ATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma) を 5 :1 の割合で混合させたものを、最終濃度 6 FPU / g バイオマスになるよう添加した。
【０１０６】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、既出の計算式に従って算出した。
【０１０７】
糖化反応の結果を図５に示す。結果より、NaClならびにKCl添加には、効果が認められなかった。従って、リチウム塩であることが重要であることが確認された。
【実施例４】
【０１０８】
（疎水性イオン液体へのLiCl添加量の検討）
実施例１でのLiCl添加効果を受け、LiClの添加量を検討した。検討には、カルボニル基を含む疎水性イオン液体 [DEAcmim][Tf2N]を利用した。 [DEAcmim][Tf2N] 1,000 〜 980 mgを採取し、これに無水LiClを各0 〜 20 mg になるよう添加し、1,000 mgの疎水性ILを調製した。これに結晶性セルロース（Avicel）を1 wt％ (10 mg) 添加し、150 ℃で3時間加熱攪拌した。室温に冷却後、それぞれのサンプルに、セルラーゼ混合溶液を含有させたクエン酸緩衝液（最終濃度10 mM）を1,000μl添加し、2相系にした。40 ℃で攪拌して糖化反応を行い一定時間後にそれぞれサンプリングした。サンプリング試料を、バイオセンサーBF5にて、グルコースを測定し糖化効率を算出した。
【０１０９】
なおセルラーゼ混合溶液は、Treichoderma reesei ATCC26921からなるNovozyme-Celluclast (Sigma) と Aspergillus nigerからなるNovozyme 188 (Sigma) を 5 :1 の割合で混合させたものを、最終濃度 6 FPU / g バイオマスになるよう添加した。
【０１１０】
得られたグルコース濃度をもとに、反応前に添加した結晶性セルロースを100とした場合の糖への変換効率を、既出の計算式に従って算出した。
【０１１１】
糖化反応の結果を図６示す。結果より、LiCl添加量 1mgであっても糖化向上効果が認められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース含有材料の処理方法であって、
前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程、
を備える、処理方法。
【請求項２】
前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上のカチオン種を有する、請求項１又は２に記載の処理方法。
【化１１】
（式（I）及び(II)中、Ｒ１〜Ｒ４から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（III）及び（IV）中、Ｒ１及びＲ2から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（V）中、Ｒ１が、下記式（１）で表される。また、式（I）〜（IV）中、下記式（１）で表されない置換基は、それぞれ独立に、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【化１２】
（式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【請求項３】
前記カチオン種は、式（２）で表される、請求項１又は２に記載の方法。
【化１３】
（式（２）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。）
【請求項４】
前記イオン液体のアニオン種は、前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の処理方法。
【請求項５】
前記疎水性イオン液体に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、を備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記疎水性イオン液体は、塩化リチウムを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の処理方法。
【請求項７】
前記分散工程に先だって、前記疎水性イオン液体に、塩化リチウム又は塩化リチウム水溶液を添加する工程を備える、請求項６に記載の処理方法。
【請求項８】
セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、
前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相とを接触させる工程と、
前記疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、
セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項９】
前記セルロースの分解工程後に、前記親水性溶媒相の少なくとも一部を回収する工程を備える、請求項６に記載の生産方法。
【請求項１０】
前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収する工程をそなえる、請求項に記載の生産方法。
【請求項１１】
セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、
カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物。
【請求項１２】
さらに、塩化リチウムを含有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記疎水性イオン液体に塩化リチウム水溶液が添加されて得られる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
有用物質の生産方法であって、
セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相とを接触させる工程と、
前記疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、
セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、
前記セルロース分解工程で得られたセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１】
セルロース含有材料の処理方法であって、
前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体とを接触させる工程、
を備える、処理方法。
【請求項２】
前記疎水性イオン液体は、以下の式で表されるイオン液体から選択される１種又は２種以上のカチオン種を有する、請求項１又は２に記載の処理方法。
【化１１】
（式（I）及び(II)中、Ｒ１〜Ｒ４から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（III）及び（IV）中、Ｒ１及びＲ2から選択される少なくとも一つの置換基が、下記式（１）で表される。式（V）中、Ｒ１が、下記式（１）で表される。また、式（I）〜（IV）中、下記式（１）で表されない置換基は、それぞれ独立に、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【化１２】
（式（１）中、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表し、Ｒ6は、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表す。）
【請求項３】
前記カチオン種は、式（２）で表される、請求項１又は２に記載の方法。
【化１３】
（式（２）中、Ｒ1及びＲ6は、それぞれ独立に置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基を表し、Ｒ５は、置換されていてもよい炭化水素のジイル基を表す。）
【請求項４】
前記イオン液体のアニオン種は、前記フッ化アルキル基含有アニオン種は、パーフルオロアルキル基含有フルオロホスフェートアニオン及びパーフルオロアルキル基含有スルホニルイミドアニオンから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の処理方法。
【請求項５】
前記疎水性イオン液体に親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、を備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記疎水性イオン液体は、塩化リチウムを含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の処理方法。
【請求項７】
前記分散工程に先だって、前記疎水性イオン液体に、塩化リチウム又は塩化リチウム水溶液を添加する工程を備える、請求項６に記載の処理方法。
【請求項８】
セルロース含有材料の分解産物の生産方法であって、
前記セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相とを接触させる工程と、
前記疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、
セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項９】
前記セルロースの分解工程後に、前記親水性溶媒相の少なくとも一部を回収する工程を備える、請求項６に記載の生産方法。
【請求項１０】
前記セルロースの分解工程後の疎水性イオン液体相の少なくとも一部を回収する工程をそなえる、請求項に記載の生産方法。
【請求項１１】
セルロース糖化用のイオン液体組成物であって、
カルボニル基を有する疎水性イオン液体を含有する、組成物。
【請求項１２】
さらに、塩化リチウムを含有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記疎水性イオン液体に塩化リチウム水溶液が添加されて得られる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
有用物質の生産方法であって、
セルロース含有材料とカルボニル基を有する疎水性イオン液体相とを接触させる工程と、
前記疎水性イオン液体と接触後のセルロース含有材料に疎水性イオン液体に対する親水性溶媒を供給して前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との二相系を形成する工程と、
セルラーゼにより前記疎水性イオン液体相と前記親水性溶媒相との界面近傍の前記セルロース含有材料のセルロースを分解する工程と、
前記セルロース分解工程で得られたセルロース分解産物を炭素源として用いて微生物の発酵によって有用物質を生産する工程と、
を備える、生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−５５１６７（Ｐ２０１２−５５１６７Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９８３８０（Ｐ２０１０−１９８３８０）
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第４２回秋期大会研究発表講演要旨集、社団法人化学工学会、平成２２年８月６日発行
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の依託研究の成果に係る特許出願（平成２１年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／イオン液体を利用したバイオマスからのバイオ燃料生産技術の開発」依託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第４２回秋期大会研究発表講演要旨集、社団法人化学工学会、平成２２年８月６日発行
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の依託研究の成果に係る特許出願（平成２１年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／イオン液体を利用したバイオマスからのバイオ燃料生産技術の開発」依託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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