タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法
【課題】発電所の冷却水に混入する付着生物の一種、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出方法、検出試薬、検出キット、検出器を提供する。
【解決手段】ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生Ｂで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマから、Ｂ及びタマウミヒドラプラヌラ幼生Ａに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、Ｂに特異的に反応し、Ａには反応しないモノクローナル抗体を同定し、Ｂ及びＡに特異的に反応するモノクローナル抗体には反応性を示すが、Ｂに特異的に反応するがＡには反応しないモノクローナル抗体には反応性を示さない生物を特定することで、タマウミヒドラプラヌラ幼生Ａを検出する。
【解決手段】ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生Ｂで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマから、Ｂ及びタマウミヒドラプラヌラ幼生Ａに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、Ｂに特異的に反応し、Ａには反応しないモノクローナル抗体を同定し、Ｂ及びＡに特異的に反応するモノクローナル抗体には反応性を示すが、Ｂに特異的に反応するがＡには反応しないモノクローナル抗体には反応性を示さない生物を特定することで、タマウミヒドラプラヌラ幼生Ａを検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、火力発電所や原子力発電所には、タービンを駆動するのに使用した蒸気を冷やすため、蒸気と海水との間で熱交換を行わせる復水器が備えられている。この熱交換に使用する海水の取水の際に、海水に生息するヒドロ虫やミズクラゲ等の付着生物が流入し、取水路や配管に付着し、発電所プラントの正常稼働を妨げるという問題が知られる。
【０００３】
取水のための海域における付着生物の来襲、発生状況、プラントへの流入状況、発電所プラント内での付着状況を確認したり、これらの付着生物の種類を特定したりできれば、効率的な防除のタイミングや、付着生物種にあった防除方法を設定することができる。
【０００４】
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生は、ヒドロ虫綱生物の中でも特に頻繁に発電所に流入して被害をもたらしている。しかしながら、ヒドロ虫綱生物における抗原に特異的に結合する抗体として、ヒドロ虫綱生物の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体が知られているのみであり（特許文献１参照）、ヒドロ虫綱生物であるタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出できる方法は開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５０６１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することにより得られたハイブリドーマをスクリーニングしたところ、多くの場合、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫していることから予想されるように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応するモノクローナル抗体か、または、幼生の構造が似ているように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応するモノクローナル抗体しか得られなかった。しかしながら、本発明者らは、頻度は少ないながらも、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生には反応するが、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【０００９】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１０】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを試料（例えば、海水若しくは川水またはそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に加え、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原と反応させ、その抗原を同定することにより行うことができる。
【００１７】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法により、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになる。また、火力発電所や原子力発電所等の臨海プラント及び沿岸水産設備の周辺海域や取水口付近におけるタマウミヒドラプラヌラ幼生の襲来、発生、残存状況を容易に把握・推定することが可能となるため、タマウミヒドラ幼生及びタマウミヒドラ成体による被害の抑制化が可能となる。
【００１８】
具体的には、例えば、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で標識し、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に作用させる。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物を、タマウミヒドラプラヌラ幼生と特定することができる。
【００１９】
あるいは、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを磁性体などの担体に結合させる。まず、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に磁性体が結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させ、その後、磁石などを用いて担体を回収する。ここで回収された試料には、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれている。この回収試料に対し、続いて磁性体などの担体に結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させる。そして、磁石などを用いてそのモノクローナル抗体またはそのフラグメントを除去する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみが取り除かれ、タマウミヒドラプラヌラ幼生が残留する。従って、この方法によりタマウミヒドラプラヌラ幼生のみを回収することができる。なお、磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。また、磁性体の代わりにＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いても同様にタマウミヒドラプラヌラ幼生を回収できる。
【００２０】
なお、モノクローナル抗体またはそのフラグメントが幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、ｗｈｏｌｅ-ｍｏｕｎｔであっても、組織切片であっても、粗抽出液（超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理（固定、溶解、抽出等）も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。
【００２１】
＝＝モノクローナル抗体またはそのフラグメント＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に使用する２種類のモノクローナル抗体のそれぞれは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではない。このような２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによって、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応するが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物がタマウミヒドラプラヌラ幼生であると特定することができる。
【００２２】
ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それぞれベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生以外の生物種に対して反応性を有していても、有していなくても制限されない。ただし、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出するためには、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類の抗体またはそのフラグメントにおいて同じであることが好ましい。特に、タマウミヒドラプラヌラ幼生と生息域が重複するためにタマウミヒドラプラヌラ幼生と一緒に試料中に含まれる可能性の高い生物、例えば、ミズクラゲプラヌラ幼生、フジツボ類幼生、イガイ類幼生、及び、コペポーダ等に対する反応性が前述の２種類の抗体において同じであれば、より正確にタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することが可能である。
【００２３】
なお、モノクローナル抗体のフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
【００２４】
＝＝モノクローナル抗体製造方法＝＝
前述の２種類のモノクローナル抗体は、それぞれ、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。
【００２５】
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清または培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、または前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。
【００２６】
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されている細胞株ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）を用いることができる。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されている細胞株Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかを用いることができる。
【００２７】
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
本発明に係る方法に用いられる抗体を産生するハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
【００２８】
まず、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいはその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原をマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等の哺乳動物の静脈内、皮下、腹腔内等に１〜複数回投与して免疫する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生のいずれかのみを抗原として用いても、両方を抗原として用いてもよい。また、免疫にアジュバントを使用してもよい。
【００２９】
その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応性するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明に係る方法に用いられる２種類のモノクローナル抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００３０】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を培養培地に含ませてもよい。
【００３１】
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、または末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。
【００３２】
前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immuno Assay、ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明に係るハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液に対して特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対して反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。
【００３３】
なお、ハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対する反応性を調べればよいが、さらに、ミズクラゲプラヌラ幼生のような、ヒドロ虫綱以外の刺胞動物門に属する生物、アカフジツボをはじめとするフジツボ類のキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイをはじめとするイガイ類のペディベリジャー幼生等の他の幼生やプランクトンまたはその粗抽出液との反応性を調べ、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類のモノクローナル抗体またはフラグメントにおいて同じであることを確認することが好ましい。
【００３４】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬＝＝
上記「モノクローナル抗体またはそのフラグメント」に記載される２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、すなわち、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによってタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるので、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むことを特徴とするタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットとして利用可能である。
【００３５】
なお、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。
【００３６】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。
【００３７】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分または試料を浸す第一の部分と、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化された第二の部分と、第二の部分に固定化されたモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識されたクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。
【００３８】
例えば、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ａと称する）と、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ｂと称する）とが含まれる検出器を用いて同一の試料を解析し、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。逆に、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陰性の場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれていないと判断でき、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陽性の場合には、試料に少なくともベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生が含まれていると判断できるが、タマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれるか否かは不明である。
【００３９】
このような検出器の原理として、クロマトグラフ媒体Ａに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ａの第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ａの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出が可能となる。なお、このクロマトグラフ媒体Ａ第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生由来の抗原とタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原のいずれも含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、クロマトグラフ媒体Ａの第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。
【００４０】
また、クロマトグラフ媒体Ｂに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分に、滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、第二の部分に固定されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントとは反応性を有さないため、第一の部分から第二の部分を素通りして、第三の部分へ移動する。従って、第二の部分の位置において標識物質によってタマウミヒドラプラヌラ幼生は検出されない。同時に、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、液が媒体中を広がるのを利用して、フリーのまま第一の部分から第二の部分を経て、第三の部分へと移動する。第一の部分からくるこのフリーの抗体は、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。
【００４１】
この様に、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、その試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。
【００４２】
また、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、これらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、またはこれらのうち２以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。
【００４３】
なお、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットにおける標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、ＢＣＩＰ/Ｎｉｔｒｏ-ＴＢ（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、ｐＮＰＰ（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）等を用いることができる。
【００４４】
また、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットに関する前述の免疫学的手法としては、ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。
【００４５】
以上のように、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出方法を用いることにより、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになるが、検出器や検出キットを用いることにより、より容易にこれらを行うことができるようになる。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
[実施例１]
本実施例では、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
【００４８】
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の飼育方法＝＝
鹿児島県湾竜ヶ水沿岸に設置された養殖生簀、あるいは、播磨新島ヨットハーバーの浮き桟橋裏面からベニクダウミヒドラ群体を採取した。この群体を海水で洗浄した後、雌雄に選別し、オスとメスを約１：９の割合で水温６〜７℃の海水を有する循環式水槽に収容して孵化直後のアルテミアを与えながら飼育した。適宜、幼生遊出直前のメスポリプを選別し、遊出したアクチヌラ幼生を採取した。回収したアクチヌラ幼生をろ過海水で洗浄した後、１００個体ずつ冷凍保存した。この冷凍幼生を、以下に記載の免疫、ＥＬＩＳＡ用抗原試料として使用した。
【００４９】
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生によるマウスの免疫＝＝
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）の腹腔内に抗原（ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生１００〜２００個／３００〜４００μＬのＰＢＳ）を５回注射し、マウスを免疫した。具体的には、１回目の投与から１６８日目に２回目の投与を、２回目の投与から２４日目に３回目の投与を、３回目の投与から２１日目に４回目の投与を、４回目の投与から３９日目に５回目の投与を行った。
【００５０】
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
（脾臓組織の単離）
最終免疫から４日後に、マウスから脾臓を摘出し、１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：GIBCO社製）及び１％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic：GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製）培地中で滅菌ステンレスメッシュを用いて裏漉しし、細胞を分散・懸濁させて脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ＋培地）で洗浄・遠心した後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ−培地）で３回遠心・洗浄し、脾臓細胞を回収した。
【００５１】
（細胞融合とＨＡＴ選択：不活化ウィルス法）
まず、凍結ミエローマ細胞（マウス骨髄癌細胞、Ｐ３Ｕ１）を融解した後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、生存率、増殖性の高い株を選別し、１回移植して融合に備えた。GenomOne-CF（不活化センダイウィルス外膜：HVJ-E、石原産業(株)製）を用いて細胞融合を行った。前述のミエローマ細胞と脾臓細胞を１：２の割合で混合した後、遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに、氷冷した融合用緩衝液（１倍濃度液）を添加（脾臓細胞１０８細胞あたり１ｍＬ添加）し、細胞群を懸濁させた。氷冷したHVJ-E懸濁液を添加（細胞懸濁液１ｍＬあたり２５μＬを添加）し、氷上で５分間静置した。その後、遠心（４℃、１０００ｒｐｍ×５分間）を行い、３７℃で１５分間インキュベーションした。続いて、ＦＢＳ＋培地（３７℃）１０ｍＬを添加して細胞群を懸濁させた（脾臓細胞１０８細胞／５０ｍＬ）。これを、ＦＢＳ＋培地１０ｍＬが入った分室シャーレ３枚にそれぞれ２ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養を行った。培養開始から１日後、各シャーレから培地を４ｍＬずつ取り、２×ＨＡＴ培地６ｍＬとconditioned medium ０．３〜０．４ｍＬを各シャーレに添加し（終濃度０．８×ＨＡＴ培地）、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養することにより、ＨＡＴ選択培養を行った。
【００５２】
（ハイブリドーマ細胞のスクリーニング）
ＨＡＴ選択培養開始から４日（融合処理から５日）〜１０日後、各シャーレの各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、シングルコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地［１×ＨＴ培地と１０％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社）を含む］の入った９６穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、以下のＥＬＩＳＡ法により抗体の産生を確認した。
【００５３】
（ＥＬＩＳＡ法）
以下の各工程において、特に記載がない場合は室温にて処理、反応を行った。
（１）ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を加え、氷中でホモジナイズを行い、５０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより得たベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液をタンパク質濃度２０μｇ／ｍＬになるように調製した。
（２）（１）で得られたベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液５０μＬを、９６穴イワキＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをＴＢＳ（０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）２００μＬで洗浄した。
（４）各ウェルを１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ １００μlで１時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをＴＴＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（一次抗体）５０μＬを各ウェルに加え、２時間反応させた。
（７）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで４回洗浄した。
（８）各ウェルに２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ヤギ抗体、BETHYL社）溶液（ＴＢＳで５００倍に希釈した溶液）５０μｌを加えて１時間反応させた。
（９）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで５回洗浄した。
（１０）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社）溶液 １００μｌを加え、１時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。
【００５４】
上記ＥＬＩＳＡ法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、２４穴ウェルで２〜５日間培養し、ＥＬＩＳＡ法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液に対して結合性の高い抗体を産生するハイブリドーマ（Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）、ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）、ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３））を得た。
【００５５】
[実施例２]
本実施例では、実施例１で得られた１０種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に対する反応性を調べた。
【００５６】
＝＝アカフジツボキプリス幼生の飼育方法＝＝
循環式水槽を用い、アルテミアを給餌してアカフジツボ成体の維持・飼育を行い、定期的に幼生を孵出させた。幼生には培養した浮遊珪藻 Chaetoceros 等を給餌し、キプリス幼生を生産した。
【００５７】
＝＝ムラサキイガイペディベリジャー幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市周辺沿岸からムラサキイガイ成体を採取し、やや低温に制御した水槽を用いて維持・飼育し、定期的に放卵・放精させた。媒精後、発生が進行した初期幼生に、培養したハプト藻 Isochrysis 等を給餌することによって人工飼育し、ペディベリジャー幼生を生産した。
【００５８】
＝＝コペポーダの採取方法＝
兵庫県姫路市周辺沿岸から、プランクトンネットを用いてプランクトンを採取した。採取したプランクトンをシャーレ内の海水中に移し、ピペットでコペポーダ類のみ選別採取した。
【００５９】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県東播磨沿岸からタマウミヒドラポリプ群体を採取した後、低温水槽内で維持・飼育し、成熟させた。受精後、胚発生中の雌ポリプ群体を深型シャーレ内の海水中に移し、照明下で静置した。その後、生殖体外へ遊離してきたプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
【００６０】
＝＝ミズクラゲプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市近辺沿岸から成熟雌クラゲ体を採取した。海水を満たした小型プラスチック容器内でクラゲ体を裏返し、保育嚢の縁辺に存在しているプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
【００６１】
実施例１のＥＬＩＳＡ法の記載に従い、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度：２０μｇ/ｍＬ）を調製し、各ハイブリドーマが産生する抗体の、これらの粗抽出液に対する反応性を確認した。なお、小数第一位以上の数値が得られた場合に、反応性があるとした。
【００６２】
また、各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche Applied Science 社）を用いて調べた。
【００６３】
表１に示すように、Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、及びＴ−Ｐ２Ｆ１２（７）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。また、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、及びＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、及びコペポーダの粗抽出液には反応性を示さなかった。
【００６４】
つまり、実施例１で得られた、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体を産生する１０種のハイブリドーマのうち、ヒドロ虫綱に属するベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生の両方に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のみであった。
【表１】
【００６５】
以上のように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性のあるモノクローナル抗体は、通常ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応する（１０種中４種）か、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生以外にも、タマウミヒドラプラヌラ幼生だけでなく、ミズクラゲプラヌラ幼生やムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応する（１０種中５種）かのいずれかである。つまり、刺胞動物門に属する動物の幼生の間で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生というヒドロ虫綱の動物幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが得られたことは、当業者であっても容易に予測できるものではない。また、このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体によって、他種の動物を含む試料の中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるという有利な効果を奏する。
【００６６】
加えて、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対し反応性を示し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないＴ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対して反応性を示さない生物を特定することにより、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、火力発電所や原子力発電所には、タービンを駆動するのに使用した蒸気を冷やすため、蒸気と海水との間で熱交換を行わせる復水器が備えられている。この熱交換に使用する海水の取水の際に、海水に生息するヒドロ虫やミズクラゲ等の付着生物が流入し、取水路や配管に付着し、発電所プラントの正常稼働を妨げるという問題が知られる。
【０００３】
取水のための海域における付着生物の来襲、発生状況、プラントへの流入状況、発電所プラント内での付着状況を確認したり、これらの付着生物の種類を特定したりできれば、効率的な防除のタイミングや、付着生物種にあった防除方法を設定することができる。
【０００４】
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生は、ヒドロ虫綱生物の中でも特に頻繁に発電所に流入して被害をもたらしている。しかしながら、ヒドロ虫綱生物における抗原に特異的に結合する抗体として、ヒドロ虫綱生物の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体が知られているのみであり（特許文献１参照）、ヒドロ虫綱生物であるタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出できる方法は開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５０６１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することにより得られたハイブリドーマをスクリーニングしたところ、多くの場合、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫していることから予想されるように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応するモノクローナル抗体か、または、幼生の構造が似ているように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応するモノクローナル抗体しか得られなかった。しかしながら、本発明者らは、頻度は少ないながらも、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生には反応するが、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【０００９】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１０】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを試料（例えば、海水若しくは川水またはそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に加え、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原と反応させ、その抗原を同定することにより行うことができる。
【００１７】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法により、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになる。また、火力発電所や原子力発電所等の臨海プラント及び沿岸水産設備の周辺海域や取水口付近におけるタマウミヒドラプラヌラ幼生の襲来、発生、残存状況を容易に把握・推定することが可能となるため、タマウミヒドラ幼生及びタマウミヒドラ成体による被害の抑制化が可能となる。
【００１８】
具体的には、例えば、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で標識し、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に作用させる。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物を、タマウミヒドラプラヌラ幼生と特定することができる。
【００１９】
あるいは、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを磁性体などの担体に結合させる。まず、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に磁性体が結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させ、その後、磁石などを用いて担体を回収する。ここで回収された試料には、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれている。この回収試料に対し、続いて磁性体などの担体に結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させる。そして、磁石などを用いてそのモノクローナル抗体またはそのフラグメントを除去する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみが取り除かれ、タマウミヒドラプラヌラ幼生が残留する。従って、この方法によりタマウミヒドラプラヌラ幼生のみを回収することができる。なお、磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。また、磁性体の代わりにＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いても同様にタマウミヒドラプラヌラ幼生を回収できる。
【００２０】
なお、モノクローナル抗体またはそのフラグメントが幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、ｗｈｏｌｅ-ｍｏｕｎｔであっても、組織切片であっても、粗抽出液（超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理（固定、溶解、抽出等）も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。
【００２１】
＝＝モノクローナル抗体またはそのフラグメント＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に使用する２種類のモノクローナル抗体のそれぞれは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではない。このような２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによって、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応するが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物がタマウミヒドラプラヌラ幼生であると特定することができる。
【００２２】
ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それぞれベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生以外の生物種に対して反応性を有していても、有していなくても制限されない。ただし、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出するためには、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類の抗体またはそのフラグメントにおいて同じであることが好ましい。特に、タマウミヒドラプラヌラ幼生と生息域が重複するためにタマウミヒドラプラヌラ幼生と一緒に試料中に含まれる可能性の高い生物、例えば、ミズクラゲプラヌラ幼生、フジツボ類幼生、イガイ類幼生、及び、コペポーダ等に対する反応性が前述の２種類の抗体において同じであれば、より正確にタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することが可能である。
【００２３】
なお、モノクローナル抗体のフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
【００２４】
＝＝モノクローナル抗体製造方法＝＝
前述の２種類のモノクローナル抗体は、それぞれ、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。
【００２５】
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清または培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、または前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。
【００２６】
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されている細胞株ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）を用いることができる。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されている細胞株Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかを用いることができる。
【００２７】
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
本発明に係る方法に用いられる抗体を産生するハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
【００２８】
まず、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいはその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原をマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等の哺乳動物の静脈内、皮下、腹腔内等に１〜複数回投与して免疫する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生のいずれかのみを抗原として用いても、両方を抗原として用いてもよい。また、免疫にアジュバントを使用してもよい。
【００２９】
その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応性するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明に係る方法に用いられる２種類のモノクローナル抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００３０】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を培養培地に含ませてもよい。
【００３１】
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、または末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。
【００３２】
前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immuno Assay、ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明に係るハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液に対して特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対して反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。
【００３３】
なお、ハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対する反応性を調べればよいが、さらに、ミズクラゲプラヌラ幼生のような、ヒドロ虫綱以外の刺胞動物門に属する生物、アカフジツボをはじめとするフジツボ類のキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイをはじめとするイガイ類のペディベリジャー幼生等の他の幼生やプランクトンまたはその粗抽出液との反応性を調べ、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類のモノクローナル抗体またはフラグメントにおいて同じであることを確認することが好ましい。
【００３４】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬＝＝
上記「モノクローナル抗体またはそのフラグメント」に記載される２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、すなわち、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによってタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるので、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むことを特徴とするタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットとして利用可能である。
【００３５】
なお、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。
【００３６】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。
【００３７】
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分または試料を浸す第一の部分と、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化された第二の部分と、第二の部分に固定化されたモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識されたクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。
【００３８】
例えば、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ａと称する）と、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ｂと称する）とが含まれる検出器を用いて同一の試料を解析し、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。逆に、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陰性の場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれていないと判断でき、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陽性の場合には、試料に少なくともベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生が含まれていると判断できるが、タマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれるか否かは不明である。
【００３９】
このような検出器の原理として、クロマトグラフ媒体Ａに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ａの第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ａの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出が可能となる。なお、このクロマトグラフ媒体Ａ第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生由来の抗原とタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原のいずれも含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、クロマトグラフ媒体Ａの第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。
【００４０】
また、クロマトグラフ媒体Ｂに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分に、滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、第二の部分に固定されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントとは反応性を有さないため、第一の部分から第二の部分を素通りして、第三の部分へ移動する。従って、第二の部分の位置において標識物質によってタマウミヒドラプラヌラ幼生は検出されない。同時に、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、液が媒体中を広がるのを利用して、フリーのまま第一の部分から第二の部分を経て、第三の部分へと移動する。第一の部分からくるこのフリーの抗体は、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。
【００４１】
この様に、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、その試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。
【００４２】
また、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、これらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、またはこれらのうち２以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。
【００４３】
なお、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットにおける標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、ＢＣＩＰ/Ｎｉｔｒｏ-ＴＢ（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、ｐＮＰＰ（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）等を用いることができる。
【００４４】
また、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットに関する前述の免疫学的手法としては、ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。
【００４５】
以上のように、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出方法を用いることにより、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになるが、検出器や検出キットを用いることにより、より容易にこれらを行うことができるようになる。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
[実施例１]
本実施例では、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
【００４８】
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の飼育方法＝＝
鹿児島県湾竜ヶ水沿岸に設置された養殖生簀、あるいは、播磨新島ヨットハーバーの浮き桟橋裏面からベニクダウミヒドラ群体を採取した。この群体を海水で洗浄した後、雌雄に選別し、オスとメスを約１：９の割合で水温６〜７℃の海水を有する循環式水槽に収容して孵化直後のアルテミアを与えながら飼育した。適宜、幼生遊出直前のメスポリプを選別し、遊出したアクチヌラ幼生を採取した。回収したアクチヌラ幼生をろ過海水で洗浄した後、１００個体ずつ冷凍保存した。この冷凍幼生を、以下に記載の免疫、ＥＬＩＳＡ用抗原試料として使用した。
【００４９】
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生によるマウスの免疫＝＝
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）の腹腔内に抗原（ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生１００〜２００個／３００〜４００μＬのＰＢＳ）を５回注射し、マウスを免疫した。具体的には、１回目の投与から１６８日目に２回目の投与を、２回目の投与から２４日目に３回目の投与を、３回目の投与から２１日目に４回目の投与を、４回目の投与から３９日目に５回目の投与を行った。
【００５０】
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
（脾臓組織の単離）
最終免疫から４日後に、マウスから脾臓を摘出し、１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：GIBCO社製）及び１％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic：GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製）培地中で滅菌ステンレスメッシュを用いて裏漉しし、細胞を分散・懸濁させて脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ＋培地）で洗浄・遠心した後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ−培地）で３回遠心・洗浄し、脾臓細胞を回収した。
【００５１】
（細胞融合とＨＡＴ選択：不活化ウィルス法）
まず、凍結ミエローマ細胞（マウス骨髄癌細胞、Ｐ３Ｕ１）を融解した後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、生存率、増殖性の高い株を選別し、１回移植して融合に備えた。GenomOne-CF（不活化センダイウィルス外膜：HVJ-E、石原産業(株)製）を用いて細胞融合を行った。前述のミエローマ細胞と脾臓細胞を１：２の割合で混合した後、遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに、氷冷した融合用緩衝液（１倍濃度液）を添加（脾臓細胞１０８細胞あたり１ｍＬ添加）し、細胞群を懸濁させた。氷冷したHVJ-E懸濁液を添加（細胞懸濁液１ｍＬあたり２５μＬを添加）し、氷上で５分間静置した。その後、遠心（４℃、１０００ｒｐｍ×５分間）を行い、３７℃で１５分間インキュベーションした。続いて、ＦＢＳ＋培地（３７℃）１０ｍＬを添加して細胞群を懸濁させた（脾臓細胞１０８細胞／５０ｍＬ）。これを、ＦＢＳ＋培地１０ｍＬが入った分室シャーレ３枚にそれぞれ２ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養を行った。培養開始から１日後、各シャーレから培地を４ｍＬずつ取り、２×ＨＡＴ培地６ｍＬとconditioned medium ０．３〜０．４ｍＬを各シャーレに添加し（終濃度０．８×ＨＡＴ培地）、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養することにより、ＨＡＴ選択培養を行った。
【００５２】
（ハイブリドーマ細胞のスクリーニング）
ＨＡＴ選択培養開始から４日（融合処理から５日）〜１０日後、各シャーレの各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、シングルコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地［１×ＨＴ培地と１０％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社）を含む］の入った９６穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、以下のＥＬＩＳＡ法により抗体の産生を確認した。
【００５３】
（ＥＬＩＳＡ法）
以下の各工程において、特に記載がない場合は室温にて処理、反応を行った。
（１）ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を加え、氷中でホモジナイズを行い、５０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより得たベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液をタンパク質濃度２０μｇ／ｍＬになるように調製した。
（２）（１）で得られたベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液５０μＬを、９６穴イワキＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをＴＢＳ（０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）２００μＬで洗浄した。
（４）各ウェルを１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ １００μlで１時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをＴＴＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（一次抗体）５０μＬを各ウェルに加え、２時間反応させた。
（７）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで４回洗浄した。
（８）各ウェルに２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ヤギ抗体、BETHYL社）溶液（ＴＢＳで５００倍に希釈した溶液）５０μｌを加えて１時間反応させた。
（９）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで５回洗浄した。
（１０）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社）溶液 １００μｌを加え、１時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。
【００５４】
上記ＥＬＩＳＡ法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、２４穴ウェルで２〜５日間培養し、ＥＬＩＳＡ法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液に対して結合性の高い抗体を産生するハイブリドーマ（Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）、ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）、ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３））を得た。
【００５５】
[実施例２]
本実施例では、実施例１で得られた１０種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に対する反応性を調べた。
【００５６】
＝＝アカフジツボキプリス幼生の飼育方法＝＝
循環式水槽を用い、アルテミアを給餌してアカフジツボ成体の維持・飼育を行い、定期的に幼生を孵出させた。幼生には培養した浮遊珪藻 Chaetoceros 等を給餌し、キプリス幼生を生産した。
【００５７】
＝＝ムラサキイガイペディベリジャー幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市周辺沿岸からムラサキイガイ成体を採取し、やや低温に制御した水槽を用いて維持・飼育し、定期的に放卵・放精させた。媒精後、発生が進行した初期幼生に、培養したハプト藻 Isochrysis 等を給餌することによって人工飼育し、ペディベリジャー幼生を生産した。
【００５８】
＝＝コペポーダの採取方法＝
兵庫県姫路市周辺沿岸から、プランクトンネットを用いてプランクトンを採取した。採取したプランクトンをシャーレ内の海水中に移し、ピペットでコペポーダ類のみ選別採取した。
【００５９】
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県東播磨沿岸からタマウミヒドラポリプ群体を採取した後、低温水槽内で維持・飼育し、成熟させた。受精後、胚発生中の雌ポリプ群体を深型シャーレ内の海水中に移し、照明下で静置した。その後、生殖体外へ遊離してきたプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
【００６０】
＝＝ミズクラゲプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市近辺沿岸から成熟雌クラゲ体を採取した。海水を満たした小型プラスチック容器内でクラゲ体を裏返し、保育嚢の縁辺に存在しているプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
【００６１】
実施例１のＥＬＩＳＡ法の記載に従い、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度：２０μｇ/ｍＬ）を調製し、各ハイブリドーマが産生する抗体の、これらの粗抽出液に対する反応性を確認した。なお、小数第一位以上の数値が得られた場合に、反応性があるとした。
【００６２】
また、各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche Applied Science 社）を用いて調べた。
【００６３】
表１に示すように、Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、及びＴ−Ｐ２Ｆ１２（７）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。また、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、及びＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、及びコペポーダの粗抽出液には反応性を示さなかった。
【００６４】
つまり、実施例１で得られた、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体を産生する１０種のハイブリドーマのうち、ヒドロ虫綱に属するベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生の両方に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のみであった。
【表１】
【００６５】
以上のように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性のあるモノクローナル抗体は、通常ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応する（１０種中４種）か、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生以外にも、タマウミヒドラプラヌラ幼生だけでなく、ミズクラゲプラヌラ幼生やムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応する（１０種中５種）かのいずれかである。つまり、刺胞動物門に属する動物の幼生の間で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生というヒドロ虫綱の動物幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが得られたことは、当業者であっても容易に予測できるものではない。また、このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体によって、他種の動物を含む試料の中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるという有利な効果を奏する。
【００６６】
加えて、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対し反応性を示し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないＴ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対して反応性を示さない生物を特定することにより、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項４】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出用試薬。
【請求項５】
請求項４に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出用試薬。
【請求項６】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。
【請求項７】
請求項６に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出器。
【請求項８】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットであって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出キット。
【請求項９】
請求項８に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットであって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出キット。
【請求項１】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。
【請求項４】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出用試薬。
【請求項５】
請求項４に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出用試薬。
【請求項６】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器であって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。
【請求項７】
請求項６に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器であって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出器。
【請求項８】
タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットであって、
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出キット。
【請求項９】
請求項８に記載のタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットであって、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出キット。
【公開番号】特開２０１２−２１０１５９（Ｐ２０１２−２１０１５９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７６４６７（Ｐ２０１１−７６４６７）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００２１１３０７）中国電力株式会社 (6,505)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（０００２１１３０７）中国電力株式会社 (6,505)
【Ｆターム（参考）】
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