タンパク質のリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法
【課題】凝集しやすいタンパク質をリフォールディングするリフォールディング剤およびタンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】
一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）；
又は、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、（Ｂ）と、１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）を使用する。
【化１】
【解決手段】
一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）；
又は、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、（Ｂ）と、１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）を使用する。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すために使用されるリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。特に、ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは透析法や希釈法を中心に盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
発明者は、特定のリン酸塩もしくはカルボン酸塩をリフォールディング剤として使用することで、高い生産性を得ることができるリフォールディング方法を既に見いだした（特許文献１、２）。
【０００６】
しかしながら、これらの方法では、リパーゼなどの構造が比較的単純なタンパク質は巻き戻るものの、リゾチームなどの分子内にジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と略す場合がある）を含むタンパク質に対して使用すると、リフォールディング中にＳ−Ｓ結合が正しく再結合されずに誤った３次元構造となり、タンパク質が凝集することが頻繁に起こる。その結果、活性を持つタンパク質の収量が極端に減少する場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１２６３９１号公報
【特許文献２】特開２００７−１４５８０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用しても、タンパク質の凝集が起こりにくいリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法を提供し、活性を持つタンパク質の収量を向上させることが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）であることを要旨とする。
また、本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）であることを要旨とする。
また、本発明のタンパク質の製造方法は、タンパク質を前記リフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法であることを要旨とする。
【００１０】
【化１】
【発明の効果】
【００１１】
本発明のリフォールディング剤は、タンパク質のリフォールディングに使用する際に、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
本発明のタンパク質の製造方法は、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、大別して、第１発明であるリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、第２発明であるオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）の２種である。すなわち、下記一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）である。
【００１３】
本願の第１の発明のリフォールディング剤（Ｉ）は、リン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とする。このリン含有化合物（Ａ）は、下記一般式（１）で示される基を有する化合物である。
【００１４】
【化２】
【００１５】
一般式（１）におけるＰはリン原子を表し、Ｏは酸素原子を表す。リン含有化合物（Ａ）としては、無機リン酸及びその塩（Ａ１）；リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル及びそれらの塩（Ａ２）；並びに糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）などが挙げられる。
リン含有化合物（Ａ）は、１種であってもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
無機リン酸及びその塩（Ａ１）としては、リン酸、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、及びこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、及び４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００１７】
塩としては、（Ａ１）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００１８】
（Ａ１）のうちの塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩及びリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩及び亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩及びピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩などが挙げられる。
【００１９】
リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル及びそれらの塩（Ａ２）としては、リン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル及びアルキル（炭素数１〜１２）ホスホン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２１）、ピロリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２２）並びにトリポリリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２３）などが挙げられる。
リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル（Ａ２１）としては、リン酸モノアルキルエステル、リン酸ジアルキルエステル、リン酸トリアルキルエステル、アルキルホスホン酸モノアルキルエステル及びアルキルホスホン酸ジアルキルエステルが含まれる。リン酸モノアルキルエステルとしては、リン酸メチルエステル、リン酸エチルエステル、リン酸プロピルエステル、リン酸２−プロピルエステル、リン酸ブチルエステル、リン酸２−ブチルエステル、リン酸ｔ−ブチルエステル、リン酸ペンチルエステル、リン酸ヘキシルエステル、リン酸シクロヘキシルエステル、リン酸オクチルエステル、リン酸ノニルエステル、リン酸デシルエステルなどが挙げられる。リン酸ジアルキルエステルとしては上記リン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、リン酸トリアルキルエステルとしては上記リン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。アルキルホスホン酸モノアルキルエステルとしては、メチルホスホン酸メチルエステル、メチルホスホン酸エチルエステル、エチルホスホン酸メチルエステル及びエチルホスホン酸エチルエステルなどが挙げられる。アルキルホスホン酸ジアルキルエステルとしては上記アルキルホスホン酸のジエステルが挙げられる。
【００２０】
ピロリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２２）としては、ピロリン酸モノアルキルエステル、ピロリン酸ジアルキルエステル、ピロリン酸トリアルキルエステルが含まれる。ピロリン酸モノアルキルエステルとしては、ピロリン酸メチルエステル、ピロリン酸エチルエステル、ピロリン酸プロピルエステル、ピロリン酸２−プロピルエステル、ピロリン酸ブチルエステル、ピロリン酸２−ブチルエステル、ピロリン酸ｔ−ブチルエステル、ピロリン酸ペンチルエステル、ピロリン酸ヘキシルエステル、ピロリン酸シクロヘキシルエステル、ピロリン酸オクチルエステル、ピロリン酸ノニルエステル、ピロリン酸デシルエステルなどが挙げられる。ピロリン酸ジアルキルエステルとしては上記ピロリン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、ピロリン酸トリアルキルエステルとしては上記ピロリン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。
【００２１】
トリポリリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２３）としては、トリポリリン酸モノアルキルエステル、トリポリリン酸ジアルキルエステル、トリポリリン酸トリアルキルエステルが含まれる。トリポリリン酸モノアルキルエステルとしては、トリポリリン酸メチルエステル、トリポリリン酸エチルエステル、トリポリリン酸プロピルエステル、トリポリリン酸２−プロピルエステル、トリポリリン酸ブチルエステル、トリポリリン酸２−ブチルエステル、トリポリリン酸ｔ−ブチルエステル、トリポリリン酸ペンチルエステル、トリポリリン酸ヘキシルエステル、トリポリリン酸シクロヘキシルエステル、トリポリリン酸オクチルエステル、トリポリリン酸ノニルエステル、トリポリリン酸デシルエステルなどが挙げられる。トリポリリン酸ジアルキルエステルとしては上記トリポリリン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、トリポリリン酸トリアルキルエステルとしては上記トリポリリン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。
【００２２】
上記（Ａ２１）〜（Ａ２３）の塩としては、前述の（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
塩としては、（Ａ２１）〜（Ａ２３）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００２３】
糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）及び環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）並びにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２４】
リン含有化合物（Ａ）のうち、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、（Ａ１）、（Ａ２１）及び（Ａ３）が好ましく、さらに好ましいのは、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩、メチルホスホン酸アルキルエステル及びエチルホスホン酸アルキルエステルである。
【００２５】
リフォールディング工程において、系中の（Ａ）の濃度は、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、０．１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．２〜６モル／Ｌである。
【００２６】
ここで系とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤が混合された状態を指す。系中の濃度とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤の混合溶液の容量又は重量に対するリフォールディング剤の濃度を指し、以下の記載において同様である。
なお、変性剤とは、ミスフォールディング状態のタンパク質の３次元構造を解きほぐすための薬剤のことを指し、タンパク質の水素結合及びジスルフィド結合を切断する物質が用いられる。具体的には６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液や８モル／Ｌ尿素水溶液が挙げられる。ジスルフィド結合を完全に切断するためにメルカプトエタノールやジチオスレイトール等を添加して使用しても良い。
【００２７】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）における必須成分である非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、高級アルコールのアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物（Ｂ１）、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）付加物（Ｂ３）、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する。）付加物（Ｂ４）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）、及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）などが含まれる。
【００２８】
ここでＡＯとは、アルキレンオキサイドを指し、具体的にエチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００２９】
高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物などや、同じく炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはオレイルアルコールのＥＯ１８モルである。
【００３０】
アルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノールなど）のＥＯ１〜４０モル付加物などや、同じく炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＥＯ１〜４０モル付加物が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００などが容易に入手できる。
【００３１】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物（Ｂ３）としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ１０モル付加物、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ２５モル付加物が好ましい。
【００３２】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物（Ｂ４）としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物が挙げられ、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜５０個のポリエチレングリコールＰＯ１０モル付加物が好ましい。
【００３３】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸、オレイン酸など）のＥＯ１〜２５モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ラウリル酸ＥＯ１０モル付加物、ステアリン酸ＥＯ２０モル付加物及びオレイン酸ＥＯ２０モル付加物が好ましい。
なお（Ｂ５）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と併用する際には（Ｃ）として取り扱い、それ以外の場合には（Ｂ５）として取り扱うものとする。
【００３４】
多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）としては、分子内に水酸基を２個以上含むアルコールのＥＯ付加物等が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物やグリセリンアルキルエステルＥＯ２〜４０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物であり、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０などが容易に入手できる。
【００３５】
これらの中で、タンパク質の凝集防止の観点で、高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）、及び多価アルコールのＡＯ付加物（Ｂ６）が好ましく、さらに好ましくは（Ｂ１）である。
好ましい具体例としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（オレイルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物；ソルビタンアルキルエステルＥＯ付加物などが挙げられる。
【００３６】
リフォールディング剤（Ｉ）を使用するリフォールディング工程において、タンパク質の凝集防止の観点から、系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度は、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００３７】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ａ）の濃度（重量％）の比率｛（Ａ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０５〜５０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜５，０００（重量％／重量％）である。
【００３８】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）において、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）を必須成分とする。
【００３９】
チオール基含有アミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸であれば特に限定はなく、具体的には、システインが含まれる。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、システインが好ましい。
【００４０】
本発明において、チオール基含有ペプチドとは、チオール基を少なくとも１個有するペプチドを意味する。チオール基の個数は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、１〜３個が好ましく、さらに好ましくは１〜２個であり、最も好ましくは１個である。
本発明において、ペプチドとはアミノ酸数が２〜５０個のポリペプチドを意味する。ペプチドのアミノ酸数は、タンパク質のリフォールディング効率の観点から、２〜５０個が好ましく、さらに好ましくは２〜１０個であり、最も好ましくは３個である。
【００４１】
チオール基含有ペプチドとしては、チオール基含有アミノ酸及びその他のアミノ酸を構成アミノ酸とするペプチドである。
チオール基含有アミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸であれば特に限定はなく、具体的にはシステインが含まれる。
【００４２】
その他のアミノ酸としては、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メチオニン、アスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン等が含まれる。これらのアミノ酸のうち、タンパク質のリフォールディング効率の観点から、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びアラニンが好ましく、さらに好ましくはグルタミン酸及びグリシンである。
【００４３】
チオール基含有ペプチドの構成アミノ酸として、チオール基含有アミノ酸は少なくとも１個含有することが必要であり、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、１〜３個有することが好ましく、さらに好ましくは１〜２個であり、最も好ましくは１個である。複数個のチオール基含有アミノ酸を含有する場合、これらは同一のチオール基含有アミノ酸であっても異なっていてもよい。
【００４４】
チオール基含有ペプチドの構成アミノ酸として、その他のアミノ酸を複数個含有する場合、これらは同一のアミノ酸であっても異なっていてもよい。
【００４５】
チオール基含有ペプチドのアミノ酸配列として、チオール基含有アミノ酸は、どの位置に含有されていてもよい。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、チオール基含有アミノ酸は、ペプチドのアミノ酸配列の両末端より内側に含有されていることが好ましい。
【００４６】
チオール基含有ペプチドの具体例としては、還元型グルタチオンが含まれる。
【００４７】
これらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物とは、上記のチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有ペプチド同士が、その含有するチオール基同士でジスルフィド結合した化合物を意味する。結合するチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドとしては、異なったチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドであってもよいが、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、同一のチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドを結合させることが好ましい。
チオール基同士のジスルフィド結合は、チオール基含有ペプチド又はチオール基含有ペプチドが、一分子に複数のチオール基を有する場合、分子内でジスルフィド結合が形成した分子でもよいし、２分子間でジスルフィド結合が形成した化合物でもよい。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、２分子間でジスルフィド結合が形成した化合物が好ましい。
【００４８】
チオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物としては、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、酸化型グルタチオン及びシスチンが好ましく、さらに好ましくは酸化型グルタチオンである。
【００４９】
化合物（Ｔ）としては、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、システイン及びシスチンが好ましく、さらに好ましくは酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンである。
【００５０】
化合物（Ｔ）は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から２種以上の併用が好ましく、チオール基含有アミノ酸又はチオール基含有ペプチドと、これらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物との併用が好ましい。具体的には、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの併用、及びシステインとシスチンとの併用などが挙げられ、最も好ましくは酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの併用である。
【００５１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）中における化合物（Ｔ）の合計濃度は０．００００１〜０．１（重量％）であり、酸化型グルタチオン又は還元型グルタチオンの場合、タンパク質の凝集防止及び活性収率向上の観点から、好ましくは０．０００１〜０．１であり、さらに好ましくは０．００１〜０．１である。
【００５２】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）中における酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの重量比（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）は、タンパク質の活性収率向上の観点から、０．０１〜１０が好ましく、０．０５〜５がさらに好ましく、最も好ましくは ０．１〜２である。
【００５３】
リフォールディング工程において系中の（Ａ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ａ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０００００１〜０．０１（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜０．００５（重量％／重量％）である。
【００５４】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００００１〜１０（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜５（重量％／重量％）である。
【００５５】
本願の第２の発明のリフォールディング剤（ＩＩ）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）を必須成分とし、このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）はカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である。
このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）は、いずれも分子内にオキシカルボニル基（−ＣＯＯ−）を有する。
【００５６】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）としては、分子内に少なくとも１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくは少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ−）を有する化合物（Ｃ１）、並びに、分子内に少なくとも１個のエステル基（−ＣＯＯＲ）を有する化合物（Ｃ２）が挙げられる。なお、これらのオキシカルボニル基と水酸基を同時に有する乳酸等のオキシカルボン酸も、本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）に含まれる。
【００５７】
分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、ポリオキシアルキレン基を分子内に有しない通常のカルボン酸（Ｃ１１）、ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）；及びそれらの塩が挙げられる。
【００５８】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）及び炭素数７〜３６の芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）等が挙げられる。
【００５９】
脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）としては、炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）及びそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００６０】
芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）としては、炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸及びテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸等）等が挙げられる。
【００６１】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、さらに、上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル（シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなど）が挙げられる。
【００６２】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）としては、一般式（２）で示されるエーテルカルボン酸化合物が挙げられる。
【００６３】
Ｒ１−Ｏ−（Ｒ２Ｏ）ｐ−Ｒ３ＣＯＯＨ （２）
（式中、Ｒ１は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ２は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。）
【００６４】
Ｒ１は炭素数１〜３６の炭化水素基であって、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられる。
なお、Ｒ１の水素の一部が水酸基で置換されていてもよい。
Ｒ２は、炭素数２〜４のアルキレン基であって、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。
Ｒ３は、炭素数１〜３のアルキレン基であって、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−プロピレン基が挙げられる。ｐは１〜５０の整数であって、タンパク質の収率向上の観点から、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００６５】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸などが挙げられる。
なお、エーテルカルボン酸は、高級アルコールにアルキレンオキサイドを付加した後、モノクロルカルボン酸を反応させて製造することができる。
【００６６】
分子内に少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、カルボン酸（Ｃ１１）又はポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩も含まれる。
塩としては、（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
【００６７】
カルボン酸（Ｃ１１）の塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸グアニジウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸グアニジウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸グアニジウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸グアニジウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）が挙げられる。
【００６８】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６９】
本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のうちのもう１つの、分子内に少なくとも１個のエステル基を有する化合物（Ｃ２）としては、カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）、カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）などが含まれる。
【００７０】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）を構成するカルボン酸としては、前述の分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）として例示したのと同様のカルボン酸が挙げられる。
また、アルキルエステル基を構成するアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などの炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐の脂肪族アルキル基が挙げられる。
【００７１】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）の具体例としては、モノカルボン酸アルキルエステル（蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチル及びステアリン酸ｎ−ブチルなど）；ジカルボン酸ジアルキルエステル（シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチル及びアジピン酸ジメチルなど）；３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（クエン酸トリメチル及びエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）などが挙げられる。
【００７２】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）としては、前述の（Ｃ１）で挙げたカルボン酸の炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドが挙げられる。
【００７３】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては、モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族多価カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００７４】
これら化合物（Ｃ）のうち、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、（Ｃ１）及びこの塩が好ましく、さらに好ましくは脂肪族カルボン酸（Ｃ１１）及びこの塩、特に好ましくは炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸（例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸）及びこの塩である。
【００７５】
リフォールディング工程において、系中の（Ｃ）の濃度は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、０．００１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜６モル／Ｌである。
【００７６】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の非イオン性界面活性剤（Ｂ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した非イオン性界面活性剤（Ｂ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００７７】
リフォールディング剤（ＩＩ）を使用するリフォールディング工程において、系中の（Ｂ）の濃度は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００７８】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度に対する（Ｃ）の濃度の比率｛（Ｃ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０１〜６０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜６，０００（重量％／重量％）である。
【００７９】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の化合物（Ｔ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した化合物（Ｔ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００８０】
リフォールディング工程において系中の（Ｃ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ｃ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００００１〜１０（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜５（重量％／重量％）である。
【００８１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）には、必要に応じて水、塩、及び緩衝剤等を含有させることもできる。
【００８２】
水を含有する場合、その含有量は特に限定されないが、化合物リン含有化合物（Ａ）、非イオン性界面活性剤（Ｂ）並びに化合物（Ｔ）の合計重量、又はオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、操作性の観点から、１００〜１０，０００重量％が好ましく、さらに好ましくは２００〜５，０００重量％である。
【００８３】
塩としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量、または（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点から、１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜３重量％である。
【００８４】
緩衝剤としては、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量、または（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点から、１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜１０重量％である。
【００８５】
対象とするタンパク質は、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（例えばリゾチームなど）である場合が本発明の効果が顕著であるので好ましい。その場合リフォールディングされるものは塩酸グアニジンまたは尿素と共に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、チオフェノール等の還元剤を加えてアンフォールディングされたタンパク質である。
【００８６】
本発明におけるタンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）に分類できる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）として、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の対象となるタンパク質としては、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましい。分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的に個数が大きいほど凝集しやすい。本発明の対象となるタンパク質分子内のＳ−Ｓ結合の数は１個〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２個〜４個である。具体的にはリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が挙げられる。
【００８７】
本発明におけるタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のリフォールディング方法はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても非常に有効な方法となる。
【００８８】
本発明における「アンフォールディング」とは、タンパク質の水素結合、ジスルフィド結合を切断し、タンパク質本来の３次元構造を崩すことを指し、タンパク質変性剤をインクルージョンボディに作用させタンパク質を変成させ可溶化することでおこなわれる。
【００８９】
本発明における「リフォールディング工程」とは、アンフォールディングされたタンパク質とリフォールディング剤とを撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。アンフォールディングされたタンパク質とリフォールディング剤を撹拌・混合する際には、ほとんど不均一部分が無くなるまで撹拌混合することが好ましい。静置時間は特に限定されないが、例えば１〜５０時間である。また処理工程時の温度は、特に限定されないが、例えば４〜３０℃である。
【００９０】
本発明のリフォールディング剤を使用してリフォールディングする工程は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらにｐＨ調整剤（Ｄ）、タンパク質安定化剤（Ｅ）を使用してもよい。
ｐＨ調整剤（Ｄ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）などが挙げられる。
【００９１】
なお、従来のリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複する。しかし、従来のｐＨ調整が目的で使用するリン酸緩衝剤の添加濃度の上限は高くても０．０５モル／Ｌであり、本発明のリフォールディング剤としてのリン系化合物（Ａ）と従来のｐＨ調整が目的のリン酸緩衝剤とは使用する際の濃度が明確に異なる。従来のリン酸緩衝剤は、本発明においては、リン含有化合物（Ａ）として取り扱う。
【００９２】
一般的にリフォールディング操作はｐＨ７〜８で行われ、ｐＨ調整剤（Ｄ）の使用量は、この範囲に調整するためであれば、特に限定されないが、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止の観点から、２０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜２０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００９３】
タンパク質安定化剤（Ｅ）としては、ポリオール、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
ポリオールとしてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン及びカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００９４】
タンパク質安定化剤（Ｅ）の使用量は、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、１０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００９５】
本発明のリフォールディング方法において、アンフォールディングされたタンパク質の系中の濃度は、０．２〜３０ｍｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）又は（Ｃ）の、タンパク質の重量に対する使用量（重量）は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、タンパク質１重量部に対して５〜２，０００重量部が好ましく、さらに好ましくは１０〜１，０００重量部である。
【００９６】
本発明のタンパク質の製造方法は、上記のリフォールディング剤でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
本発明のタンパク質の製造方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング剤を使用して得られるため、リフォールディング工程中の凝集が少なく、収率が著しく向上する。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素又は組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質溶液に、（Ｉ）又は（ＩＩ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とするリフォールディングされたタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００９７】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌及びバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、並びに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００９８】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００９９】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特開２００６−３２０３１３号公報記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【０１００】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０２】
製造例１ （アンフォールディング溶液の調製）
６モル／Ｌの塩酸グアニジン、１０ミリモル／Ｌのジチオスレイトール、１５０ミリモル／Ｌの塩化ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、１ミリモル／Ｌのエチレンジアミン４酢酸ナトリウムとなるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解し、アンフォールディング溶液を調製した。
【０１０３】
実施例１ （リフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌリン酸水素ナトリウム、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ８０」：和光純薬製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、０．００５重量％の酸化型グルタチオン、０．００５重量％の還元型グルタチオン（ともに和光純薬製）となるようにそれぞれ加え、イオン交換水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ−１）を調製した。
｛（Ｒ−１）中の化合物（Ｔ）の濃度＝０．０１重量％；酸化型グルタチオン重量／還元型グルタチオン重量＝１｝
【０１０４】
実施例２〜実施例２５及び比較例１〜８
実施例１において、表１〜４に示す濃度とする以外は実施例１と同様にして、リフォールディング剤（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び比較のリフォールディング剤（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を調整した。
【０１０５】
上記実施例１〜２５及び比較例１〜８で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を表１〜４に示す。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
実施例２６
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリゾチーム（「塩化リゾチーム」ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１１１】
実施例２７〜５０及び比較例９〜１６
実施例２６において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例２６と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１１２】
＜リゾチームの凝集性の測定＞
実施例２６〜５０及び比較例９〜１６で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でリゾチームをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１１３】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１１４】
上記実施例２６〜５０及び比較例９〜１６の凝集防止率を表５に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１１５】
＜リゾチーム酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度の枯草菌溶液を３ｍｌ入れ、実施例２６〜５０又は比較例９〜１６で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに（Ａ０）を測定して５分後に５分後の吸光度（Ａ５）を測定し、これらの数値から４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ０−Ａ５を算出した。
また、実施例２６〜５０及び比較例９〜１６のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１１６】
リフォールディング後の酵素の活性収率は以下の式を用いて算出した。
活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１１７】
上記実施例２６〜５０及び比較例９〜１６の活性収率を表５に示す。なお、活性収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
実施例５１
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのβラクトグロブリン（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しβラクトグロブリンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１２０】
実施例５２〜７５及び比較例１７〜２４
実施例５１において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例５１と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１２１】
＜βラクトグロブリンの凝集性の測定＞
実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でβラクトグロブリンをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１２２】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１２３】
上記実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４の凝集防止率を表６に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１２４】
＜βラクトグロブリン巻き戻し率の測定＞
リフォールディングをおこなったβラクトグロブリン溶液の２１５ｎｍにおけるモル楕円率（Ｑｒ）をＣＤスペクトル（日本分光社製「ＪＡＳＣＯ Ｊ−８２０」）で測定した。また、リフォールディング前のアンフォールディングされたβラクトグロブリン溶液のモル楕円率（Ｑｕ）を同様に測定した。さらに試薬のβラクトグロブリン２ｍｇをイオン交換水１ｍＬに溶解させた溶液のモル楕円率（Ｑ０）を測定した。
【０１２５】
リフォールディング後のβラクトグロブリンの巻き戻し収率は以下の式を用いて算出した。
巻き戻し収率（％）＝（Ｑｒ−Ｑｕ）／（Ｑ０−Ｑｕ） ×１００
【０１２６】
上記実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４の巻き戻し収率を表６に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
実施例７６
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのトリプシン（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しトリプシンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１２９】
実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２
実施例７５において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例７５と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１３０】
＜トリプシンの凝集性の測定＞
実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でトリプシンをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１３１】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１３２】
上記実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２の凝集防止率を表７に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１３３】
＜トリプシンの酵素活性測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度のカゼイン溶液を３ｍｌ入れ、実施例７６〜１００又は比較例２５〜３２で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。２５℃で１０分経過した後に、１０％トリクロロ酢酸ナトリウム水溶液３ｍＬを加え、２０分静置した。遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、上澄み液１ｍＬに、フォーリン試薬（和光純薬工業製）１ｍＬを加え、２５℃で２０分静置した。この液の上澄みの５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ１０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、カゼイン溶液を加える前にトリクロロ酢酸ナトリウム水溶液を加え、以降同様に実験を行い、上澄みの５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定し、これらの数値から５６２ｎｍにおける吸光度変化ＤＡ＝Ａ１０−Ａ０を算出した。
また、実施例７６〜１００及び比較例９〜１６のトリプシン濃度と同濃度の市販品「トリプシン」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、５６２ｎｍにおける吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１３４】
リフォールディング後のトリプシンの酵素活性収率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１３５】
上記実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２の巻き戻し収率を表７に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
実施例１０１
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリパーゼ（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１３８】
実施例１０２〜１２５及び比較例３３〜４０
実施例１０１において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例１０１と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１３９】
＜リパーゼの凝集性の測定＞
実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でリパーゼをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１４０】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１４１】
上記実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０の凝集防止率を表８に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１４２】
＜リパーゼの酵素活性測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．０１重量％濃度のｐ−ニトロフェニルアセテート溶液を３ｍｌ入れ、実施例１０１〜１２５又は比較例３３〜４０で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４００ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに（Ａ０）を測定して５分後に５分後の吸光度（Ａ５）を測定し、これらの数値から４００ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ０−Ａ５を算出した。
また、実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０のリパーゼ濃度と同濃度の市販品「リパーゼ」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４００ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１４３】
リフォールディング後のリパーゼの酵素活性収率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１４４】
上記実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０の巻き戻し収率を表８に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１４５】
【表８】
【０１４６】
表５によると、凝集防止率の値から、比較例９のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１１のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例１０で非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみの使用や、比較例１２〜１３のように非イオン性界面活性剤（Ｂ）と組み合わせることで、リゾチームの凝集量は若干改善されるが依然として多い。また、比較例９〜１６では、リゾチームがリフォールディングせず活性収率が低いことが表５からわかる。さらに、比較例１４〜１６のように（Ａ）〜（Ｃ）をそれぞれ単独で酸化型グルタチオンや還元型グルタチオンと併用した場合でも、リゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性収率が低いことが分かる。
一方、化合物（Ｔ）と、（Ａ）又は（Ｃ）と、（Ｂ）とを同時に含む実施例２６〜５０の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起こりにくく、高収率でリフォールディングできることがわかる。さらに酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを併用するとさらに凝集が起こりにくく、収率もさらに向上することがわかる。
【０１４７】
同様のことが表６〜８でも見られ、本発明のリフォールディング剤は幅広くタンパク質に対して有効であることが分かる。特に、Ｓ−Ｓ結合を含むタンパク質（表５〜７）に対しては、Ｓ−Ｓ結合を含まないタンパク質（表８）に比べて、本発明の効果が顕著に表れている。すなわち、Ｓ−Ｓ結合を含むタンパク質（表５〜７）においては、比較例は凝集防止率及び活性収率又は巻き戻し収率が極めて低い値であるが、本発明の実施例では、それらが全て高い値となっている。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明のリフォールディング剤、及びタンパク質の製造方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、凝集させること無く、高収率で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質などが挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すために使用されるリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。特に、ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは透析法や希釈法を中心に盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
発明者は、特定のリン酸塩もしくはカルボン酸塩をリフォールディング剤として使用することで、高い生産性を得ることができるリフォールディング方法を既に見いだした（特許文献１、２）。
【０００６】
しかしながら、これらの方法では、リパーゼなどの構造が比較的単純なタンパク質は巻き戻るものの、リゾチームなどの分子内にジスルフィド結合（以下、Ｓ−Ｓ結合と略す場合がある）を含むタンパク質に対して使用すると、リフォールディング中にＳ−Ｓ結合が正しく再結合されずに誤った３次元構造となり、タンパク質が凝集することが頻繁に起こる。その結果、活性を持つタンパク質の収量が極端に減少する場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１２６３９１号公報
【特許文献２】特開２００７−１４５８０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質に対して使用しても、タンパク質の凝集が起こりにくいリフォールディング剤及びタンパク質の製造方法を提供し、活性を持つタンパク質の収量を向上させることが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）であることを要旨とする。
また、本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）であることを要旨とする。
また、本発明のタンパク質の製造方法は、タンパク質を前記リフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法であることを要旨とする。
【００１０】
【化１】
【発明の効果】
【００１１】
本発明のリフォールディング剤は、タンパク質のリフォールディングに使用する際に、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
本発明のタンパク質の製造方法は、従来よりもリフォールディング時のタンパク質の凝集を抑制することができ、活性のあるタンパク質を多く得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のリフォールディング剤は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、大別して、第１発明であるリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、第２発明であるオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）を必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）の２種である。すなわち、下記一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）と、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）である。
【００１３】
本願の第１の発明のリフォールディング剤（Ｉ）は、リン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とする。このリン含有化合物（Ａ）は、下記一般式（１）で示される基を有する化合物である。
【００１４】
【化２】
【００１５】
一般式（１）におけるＰはリン原子を表し、Ｏは酸素原子を表す。リン含有化合物（Ａ）としては、無機リン酸及びその塩（Ａ１）；リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル及びそれらの塩（Ａ２）；並びに糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）などが挙げられる。
リン含有化合物（Ａ）は、１種であってもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
無機リン酸及びその塩（Ａ１）としては、リン酸、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、及びこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、及び４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００１７】
塩としては、（Ａ１）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００１８】
（Ａ１）のうちの塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩及びリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩及び亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩及びピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩などが挙げられる。
【００１９】
リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル及びそれらの塩（Ａ２）としては、リン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル及びアルキル（炭素数１〜１２）ホスホン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２１）、ピロリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２２）並びにトリポリリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２３）などが挙げられる。
リン酸アルキルエステル及びアルキルホスホン酸アルキルエステル（Ａ２１）としては、リン酸モノアルキルエステル、リン酸ジアルキルエステル、リン酸トリアルキルエステル、アルキルホスホン酸モノアルキルエステル及びアルキルホスホン酸ジアルキルエステルが含まれる。リン酸モノアルキルエステルとしては、リン酸メチルエステル、リン酸エチルエステル、リン酸プロピルエステル、リン酸２−プロピルエステル、リン酸ブチルエステル、リン酸２−ブチルエステル、リン酸ｔ−ブチルエステル、リン酸ペンチルエステル、リン酸ヘキシルエステル、リン酸シクロヘキシルエステル、リン酸オクチルエステル、リン酸ノニルエステル、リン酸デシルエステルなどが挙げられる。リン酸ジアルキルエステルとしては上記リン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、リン酸トリアルキルエステルとしては上記リン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。アルキルホスホン酸モノアルキルエステルとしては、メチルホスホン酸メチルエステル、メチルホスホン酸エチルエステル、エチルホスホン酸メチルエステル及びエチルホスホン酸エチルエステルなどが挙げられる。アルキルホスホン酸ジアルキルエステルとしては上記アルキルホスホン酸のジエステルが挙げられる。
【００２０】
ピロリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２２）としては、ピロリン酸モノアルキルエステル、ピロリン酸ジアルキルエステル、ピロリン酸トリアルキルエステルが含まれる。ピロリン酸モノアルキルエステルとしては、ピロリン酸メチルエステル、ピロリン酸エチルエステル、ピロリン酸プロピルエステル、ピロリン酸２−プロピルエステル、ピロリン酸ブチルエステル、ピロリン酸２−ブチルエステル、ピロリン酸ｔ−ブチルエステル、ピロリン酸ペンチルエステル、ピロリン酸ヘキシルエステル、ピロリン酸シクロヘキシルエステル、ピロリン酸オクチルエステル、ピロリン酸ノニルエステル、ピロリン酸デシルエステルなどが挙げられる。ピロリン酸ジアルキルエステルとしては上記ピロリン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、ピロリン酸トリアルキルエステルとしては上記ピロリン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。
【００２１】
トリポリリン酸アルキル（炭素数１〜１２）エステル（Ａ２３）としては、トリポリリン酸モノアルキルエステル、トリポリリン酸ジアルキルエステル、トリポリリン酸トリアルキルエステルが含まれる。トリポリリン酸モノアルキルエステルとしては、トリポリリン酸メチルエステル、トリポリリン酸エチルエステル、トリポリリン酸プロピルエステル、トリポリリン酸２−プロピルエステル、トリポリリン酸ブチルエステル、トリポリリン酸２−ブチルエステル、トリポリリン酸ｔ−ブチルエステル、トリポリリン酸ペンチルエステル、トリポリリン酸ヘキシルエステル、トリポリリン酸シクロヘキシルエステル、トリポリリン酸オクチルエステル、トリポリリン酸ノニルエステル、トリポリリン酸デシルエステルなどが挙げられる。トリポリリン酸ジアルキルエステルとしては上記トリポリリン酸アルキルエステルのジエステルが挙げられ、トリポリリン酸トリアルキルエステルとしては上記トリポリリン酸アルキルエステルのトリエステルが挙げられる。
【００２２】
上記（Ａ２１）〜（Ａ２３）の塩としては、前述の（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
塩としては、（Ａ２１）〜（Ａ２３）が含有する酸基が複数の場合は、酸基の全てが塩になっていてもよく、酸基の一部が塩になっていてもよい。
【００２３】
糖リン酸エステル及びその塩（Ａ３）としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）及び環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）並びにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２４】
リン含有化合物（Ａ）のうち、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、（Ａ１）、（Ａ２１）及び（Ａ３）が好ましく、さらに好ましいのは、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸及びそれらの塩、メチルホスホン酸アルキルエステル及びエチルホスホン酸アルキルエステルである。
【００２５】
リフォールディング工程において、系中の（Ａ）の濃度は、タンパク質の凝集低減及び／又は活性タンパク質の収量向上の観点から、０．１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．２〜６モル／Ｌである。
【００２６】
ここで系とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤が混合された状態を指す。系中の濃度とは、水、タンパク質、変性剤及びリフォールディング剤の混合溶液の容量又は重量に対するリフォールディング剤の濃度を指し、以下の記載において同様である。
なお、変性剤とは、ミスフォールディング状態のタンパク質の３次元構造を解きほぐすための薬剤のことを指し、タンパク質の水素結合及びジスルフィド結合を切断する物質が用いられる。具体的には６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液や８モル／Ｌ尿素水溶液が挙げられる。ジスルフィド結合を完全に切断するためにメルカプトエタノールやジチオスレイトール等を添加して使用しても良い。
【００２７】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）における必須成分である非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、高級アルコールのアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記する。）付加物（Ｂ１）、炭素数６〜２４のアルキル基を有するアルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記する。）付加物（Ｂ３）、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記する。）付加物（Ｂ４）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）、及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）などが含まれる。
【００２８】
ここでＡＯとは、アルキレンオキサイドを指し、具体的にエチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００２９】
高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物などや、同じく炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはオレイルアルコールのＥＯ１８モルである。
【００３０】
アルキルフェノールのＡＯ付加物（Ｂ２）としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノールなど）のＥＯ１〜４０モル付加物などや、同じく炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集及び／又はタンパク質の収量向上の観点で、炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＥＯ１〜４０モル付加物が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ３００などが容易に入手できる。
【００３１】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物（Ｂ３）としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ１０モル付加物、プロピレンオキシドの繰り返し単位が２０〜５０個のポリプロピレングリコールＥＯ２５モル付加物が好ましい。
【００３２】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物（Ｂ４）としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物が挙げられ、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜５０個のポリエチレングリコールＰＯ１０モル付加物が好ましい。
【００３３】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ｂ５）としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸、オレイン酸など）のＥＯ１〜２５モル付加物などが挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ラウリル酸ＥＯ１０モル付加物、ステアリン酸ＥＯ２０モル付加物及びオレイン酸ＥＯ２０モル付加物が好ましい。
なお（Ｂ５）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と併用する際には（Ｃ）として取り扱い、それ以外の場合には（Ｂ５）として取り扱うものとする。
【００３４】
多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｂ６）としては、分子内に水酸基を２個以上含むアルコールのＥＯ付加物等が挙げられる。タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点で、ソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物やグリセリンアルキルエステルＥＯ２〜４０モル付加物が好ましく、さらに好ましくはソルビタンアルキルエステルＥＯ６〜４０モル付加物であり、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ４０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８０などが容易に入手できる。
【００３５】
これらの中で、タンパク質の凝集防止の観点で、高級アルコールのＡＯ付加物（Ｂ１）、及び多価アルコールのＡＯ付加物（Ｂ６）が好ましく、さらに好ましくは（Ｂ１）である。
好ましい具体例としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（オレイルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールなど）のＥＯ１〜２０モル付加物；ソルビタンアルキルエステルＥＯ付加物などが挙げられる。
【００３６】
リフォールディング剤（Ｉ）を使用するリフォールディング工程において、タンパク質の凝集防止の観点から、系中の非イオン性界面活性剤（Ｂ）の濃度は、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００３７】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ａ）の濃度（重量％）の比率｛（Ａ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０５〜５０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜５，０００（重量％／重量％）である。
【００３８】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）において、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）を必須成分とする。
【００３９】
チオール基含有アミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸であれば特に限定はなく、具体的には、システインが含まれる。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、システインが好ましい。
【００４０】
本発明において、チオール基含有ペプチドとは、チオール基を少なくとも１個有するペプチドを意味する。チオール基の個数は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、１〜３個が好ましく、さらに好ましくは１〜２個であり、最も好ましくは１個である。
本発明において、ペプチドとはアミノ酸数が２〜５０個のポリペプチドを意味する。ペプチドのアミノ酸数は、タンパク質のリフォールディング効率の観点から、２〜５０個が好ましく、さらに好ましくは２〜１０個であり、最も好ましくは３個である。
【００４１】
チオール基含有ペプチドとしては、チオール基含有アミノ酸及びその他のアミノ酸を構成アミノ酸とするペプチドである。
チオール基含有アミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸であれば特に限定はなく、具体的にはシステインが含まれる。
【００４２】
その他のアミノ酸としては、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メチオニン、アスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン等が含まれる。これらのアミノ酸のうち、タンパク質のリフォールディング効率の観点から、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸及びアラニンが好ましく、さらに好ましくはグルタミン酸及びグリシンである。
【００４３】
チオール基含有ペプチドの構成アミノ酸として、チオール基含有アミノ酸は少なくとも１個含有することが必要であり、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、１〜３個有することが好ましく、さらに好ましくは１〜２個であり、最も好ましくは１個である。複数個のチオール基含有アミノ酸を含有する場合、これらは同一のチオール基含有アミノ酸であっても異なっていてもよい。
【００４４】
チオール基含有ペプチドの構成アミノ酸として、その他のアミノ酸を複数個含有する場合、これらは同一のアミノ酸であっても異なっていてもよい。
【００４５】
チオール基含有ペプチドのアミノ酸配列として、チオール基含有アミノ酸は、どの位置に含有されていてもよい。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、チオール基含有アミノ酸は、ペプチドのアミノ酸配列の両末端より内側に含有されていることが好ましい。
【００４６】
チオール基含有ペプチドの具体例としては、還元型グルタチオンが含まれる。
【００４７】
これらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物とは、上記のチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有ペプチド同士が、その含有するチオール基同士でジスルフィド結合した化合物を意味する。結合するチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドとしては、異なったチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドであってもよいが、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、同一のチオール基含有アミノ酸及びチオール基含有ペプチドを結合させることが好ましい。
チオール基同士のジスルフィド結合は、チオール基含有ペプチド又はチオール基含有ペプチドが、一分子に複数のチオール基を有する場合、分子内でジスルフィド結合が形成した分子でもよいし、２分子間でジスルフィド結合が形成した化合物でもよい。タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、２分子間でジスルフィド結合が形成した化合物が好ましい。
【００４８】
チオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物としては、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、酸化型グルタチオン及びシスチンが好ましく、さらに好ましくは酸化型グルタチオンである。
【００４９】
化合物（Ｔ）としては、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から、酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン、システイン及びシスチンが好ましく、さらに好ましくは酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンである。
【００５０】
化合物（Ｔ）は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収量向上の観点から２種以上の併用が好ましく、チオール基含有アミノ酸又はチオール基含有ペプチドと、これらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物との併用が好ましい。具体的には、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの併用、及びシステインとシスチンとの併用などが挙げられ、最も好ましくは酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの併用である。
【００５１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）中における化合物（Ｔ）の合計濃度は０．００００１〜０．１（重量％）であり、酸化型グルタチオン又は還元型グルタチオンの場合、タンパク質の凝集防止及び活性収率向上の観点から、好ましくは０．０００１〜０．１であり、さらに好ましくは０．００１〜０．１である。
【００５２】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）中における酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの重量比（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）は、タンパク質の活性収率向上の観点から、０．０１〜１０が好ましく、０．０５〜５がさらに好ましく、最も好ましくは ０．１〜２である。
【００５３】
リフォールディング工程において系中の（Ａ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ａ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０００００１〜０．０１（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜０．００５（重量％／重量％）である。
【００５４】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００００１〜１０（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜５（重量％／重量％）である。
【００５５】
本願の第２の発明のリフォールディング剤（ＩＩ）は、オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、化合物（Ｔ）を必須成分とし、このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）はカルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である。
このオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）は、いずれも分子内にオキシカルボニル基（−ＣＯＯ−）を有する。
【００５６】
オキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）としては、分子内に少なくとも１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくは少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ−）を有する化合物（Ｃ１）、並びに、分子内に少なくとも１個のエステル基（−ＣＯＯＲ）を有する化合物（Ｃ２）が挙げられる。なお、これらのオキシカルボニル基と水酸基を同時に有する乳酸等のオキシカルボン酸も、本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）に含まれる。
【００５７】
分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、ポリオキシアルキレン基を分子内に有しない通常のカルボン酸（Ｃ１１）、ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）；及びそれらの塩が挙げられる。
【００５８】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）及び炭素数７〜３６の芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）等が挙げられる。
【００５９】
脂肪族カルボン酸（Ｃ１１１）としては、炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）及びそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００６０】
芳香族カルボン酸（Ｃ１１２）としては、炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸及びテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；芳香族ヒドロキシカルボン酸（サリチル酸等）等が挙げられる。
【００６１】
カルボン酸（Ｃ１１）としては、さらに、上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル（シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなど）が挙げられる。
【００６２】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）としては、一般式（２）で示されるエーテルカルボン酸化合物が挙げられる。
【００６３】
Ｒ１−Ｏ−（Ｒ２Ｏ）ｐ−Ｒ３ＣＯＯＨ （２）
（式中、Ｒ１は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ２は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。）
【００６４】
Ｒ１は炭素数１〜３６の炭化水素基であって、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられる。
なお、Ｒ１の水素の一部が水酸基で置換されていてもよい。
Ｒ２は、炭素数２〜４のアルキレン基であって、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。
Ｒ３は、炭素数１〜３のアルキレン基であって、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−プロピレン基が挙げられる。ｐは１〜５０の整数であって、タンパク質の収率向上の観点から、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００６５】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸などが挙げられる。
なお、エーテルカルボン酸は、高級アルコールにアルキレンオキサイドを付加した後、モノクロルカルボン酸を反応させて製造することができる。
【００６６】
分子内に少なくとも１個のカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）としては、カルボン酸（Ｃ１１）又はポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩も含まれる。
塩としては、（Ａ１）で挙げた塩と同様のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、及び４級アンモニウム塩が挙げられる。
【００６７】
カルボン酸（Ｃ１１）の塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（ギ酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸グアニジウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸アンモニウム、プロピオン酸グアニジウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族ヒドロキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸グアニジウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸グアニジウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸又は３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）が挙げられる。
【００６８】
ポリオキシアルキレン基含有カルボン酸（Ｃ１２）の塩の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテル酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６９】
本発明のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のうちのもう１つの、分子内に少なくとも１個のエステル基を有する化合物（Ｃ２）としては、カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）、カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）などが含まれる。
【００７０】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）を構成するカルボン酸としては、前述の分子内に少なくとも１個のカルボキシル基もしくはカルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ｃ１）として例示したのと同様のカルボン酸が挙げられる。
また、アルキルエステル基を構成するアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などの炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐の脂肪族アルキル基が挙げられる。
【００７１】
カルボン酸アルキルエステル（Ｃ２１）の具体例としては、モノカルボン酸アルキルエステル（蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチル及びステアリン酸ｎ−ブチルなど）；ジカルボン酸ジアルキルエステル（シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチル及びアジピン酸ジメチルなど）；３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（クエン酸トリメチル及びエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）などが挙げられる。
【００７２】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物（Ｃ２２）としては、前述の（Ｃ１）で挙げたカルボン酸の炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイドが挙げられる。
【００７３】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては、モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族多価カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００７４】
これら化合物（Ｃ）のうち、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、（Ｃ１）及びこの塩が好ましく、さらに好ましくは脂肪族カルボン酸（Ｃ１１）及びこの塩、特に好ましくは炭素数１〜８の脂肪族カルボン酸（例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸）及びこの塩である。
【００７５】
リフォールディング工程において、系中の（Ｃ）の濃度は、タンパク質の凝集防止及び／又はタンパク質の収率向上の観点から、０．００１〜６モル／Ｌが好ましく、さらに好ましくは０．０１〜６モル／Ｌである。
【００７６】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の非イオン性界面活性剤（Ｂ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した非イオン性界面活性剤（Ｂ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００７７】
リフォールディング剤（ＩＩ）を使用するリフォールディング工程において、系中の（Ｂ）の濃度は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１重量％である。
【００７８】
リフォールディング工程において系中の（Ｂ）の濃度に対する（Ｃ）の濃度の比率｛（Ｃ）の濃度／（Ｂ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．０１〜６０，０００（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは１〜６，０００（重量％／重量％）である。
【００７９】
本発明のリフォールディング剤（ＩＩ）における必須成分の化合物（Ｔ）は、前述のリフォールディング剤（Ｉ）で示した化合物（Ｔ）と同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００８０】
リフォールディング工程において系中の（Ｃ）の濃度（重量％）に対する（Ｔ）の濃度（重量％）の比率｛（Ｔ）の濃度／（Ｃ）の濃度｝は、タンパク質の凝集防止の観点から、０．００００１〜１０（重量％／重量％）が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜５（重量％／重量％）である。
【００８１】
本発明のリフォールディング剤（Ｉ）又は（ＩＩ）には、必要に応じて水、塩、及び緩衝剤等を含有させることもできる。
【００８２】
水を含有する場合、その含有量は特に限定されないが、化合物リン含有化合物（Ａ）、非イオン性界面活性剤（Ｂ）並びに化合物（Ｔ）の合計重量、又はオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、操作性の観点から、１００〜１０，０００重量％が好ましく、さらに好ましくは２００〜５，０００重量％である。
【００８３】
塩としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量、または（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点から、１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜３重量％である。
【００８４】
緩衝剤としては、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等が挙げられ、その含有量は、化合物（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量、または（Ｃ）、（Ｂ）及び（Ｔ）の合計重量に対し、タンパク質の収率向上の観点から、１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜１０重量％である。
【００８５】
対象とするタンパク質は、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（例えばリゾチームなど）である場合が本発明の効果が顕著であるので好ましい。その場合リフォールディングされるものは塩酸グアニジンまたは尿素と共に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチン、チオフェノール等の還元剤を加えてアンフォールディングされたタンパク質である。
【００８６】
本発明におけるタンパク質は分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）と分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）に分類できる。
分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質（Ｐ１）として、リゾチーム、βラクトグロブリン、アルカリ性フォスファターゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、インターフェロン、インスリン、ナトリウム利尿ペプチド及び抗体等が挙げられる。
分子内にジスルフィド結合を含まないタンパク質（Ｐ２）として、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び２〜１０個のアミノ酸で構成されたペプチド等が挙げられる。
これらのうち、本発明の対象となるタンパク質としては、本発明の効果が顕著である点から、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質（Ｐ１）が好ましい。分子内のＳ−Ｓ結合の個数はタンパク質の凝集に大きく関与し、一般的に個数が大きいほど凝集しやすい。本発明の対象となるタンパク質分子内のＳ−Ｓ結合の数は１個〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２個〜４個である。具体的にはリゾチーム（４個）、βラクトグロブリン（２〜３個）、トリプシン（２個）等が挙げられる。
【００８７】
本発明におけるタンパク質の分子量は１，０００〜３００，０００であり、リフォールディングのしやすさの観点から好ましくは１０，０００〜２５０，０００である。ここで分子量とはＳＤＳゲル電気泳動法によって推定された分子量を指す。
一般に分子量の大きさとリフォールディングのしにくさには相関があり、分子量の大きなタンパク（分子量１０，０００以上程度）になるとリフォールディングが著しく困難になるとされている。本発明のリフォールディング方法はリフォールディング効果が優れるので、分子量１０，０００以上の高分子量タンパク質に対しても非常に有効な方法となる。
【００８８】
本発明における「アンフォールディング」とは、タンパク質の水素結合、ジスルフィド結合を切断し、タンパク質本来の３次元構造を崩すことを指し、タンパク質変性剤をインクルージョンボディに作用させタンパク質を変成させ可溶化することでおこなわれる。
【００８９】
本発明における「リフォールディング工程」とは、アンフォールディングされたタンパク質とリフォールディング剤とを撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。アンフォールディングされたタンパク質とリフォールディング剤を撹拌・混合する際には、ほとんど不均一部分が無くなるまで撹拌混合することが好ましい。静置時間は特に限定されないが、例えば１〜５０時間である。また処理工程時の温度は、特に限定されないが、例えば４〜３０℃である。
【００９０】
本発明のリフォールディング剤を使用してリフォールディングする工程は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらにｐＨ調整剤（Ｄ）、タンパク質安定化剤（Ｅ）を使用してもよい。
ｐＨ調整剤（Ｄ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）などが挙げられる。
【００９１】
なお、従来のリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複する。しかし、従来のｐＨ調整が目的で使用するリン酸緩衝剤の添加濃度の上限は高くても０．０５モル／Ｌであり、本発明のリフォールディング剤としてのリン系化合物（Ａ）と従来のｐＨ調整が目的のリン酸緩衝剤とは使用する際の濃度が明確に異なる。従来のリン酸緩衝剤は、本発明においては、リン含有化合物（Ａ）として取り扱う。
【００９２】
一般的にリフォールディング操作はｐＨ７〜８で行われ、ｐＨ調整剤（Ｄ）の使用量は、この範囲に調整するためであれば、特に限定されないが、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止の観点から、２０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜２０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
【００９３】
タンパク質安定化剤（Ｅ）としては、ポリオール、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
ポリオールとしてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン及びカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及びグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００９４】
タンパク質安定化剤（Ｅ）の使用量は、（Ａ）又は（Ｃ）の重量に対し、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、１０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１０重量％、次にさらに好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００９５】
本発明のリフォールディング方法において、アンフォールディングされたタンパク質の系中の濃度は、０．２〜３０ｍｇ／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜５ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）又は（Ｃ）の、タンパク質の重量に対する使用量（重量）は、タンパク質の凝集防止及びタンパク質の収率向上の観点から、タンパク質１重量部に対して５〜２，０００重量部が好ましく、さらに好ましくは１０〜１，０００重量部である。
【００９６】
本発明のタンパク質の製造方法は、上記のリフォールディング剤でリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法である。
本発明のタンパク質の製造方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング剤を使用して得られるため、リフォールディング工程中の凝集が少なく、収率が著しく向上する。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素又は組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程：インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤及び２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質溶液に、（Ｉ）又は（ＩＩ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とするリフォールディングされたタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００９７】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌及びバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳｆ９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３及びボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、並びに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００９８】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージ又はプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００９９】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特開２００６−３２０３１３号公報記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【０１００】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０２】
製造例１ （アンフォールディング溶液の調製）
６モル／Ｌの塩酸グアニジン、１０ミリモル／Ｌのジチオスレイトール、１５０ミリモル／Ｌの塩化ナトリウム、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、１ミリモル／Ｌのエチレンジアミン４酢酸ナトリウムとなるようにそれぞれ加え、滅菌水で溶解し、アンフォールディング溶液を調製した。
【０１０３】
実施例１ （リフォールディング剤の調製１）
２０ｍＬ容の滅菌済みバイアル瓶に、１．０モル／Ｌリン酸水素ナトリウム、０．１０重量％ソルビタンモノオレエートＥＯ付加物（「ＴＷＥＥＮ８０」：和光純薬製）、５０ミリモル／Ｌのトリス緩衝液（ｐＨ＝８）、０．００５重量％の酸化型グルタチオン、０．００５重量％の還元型グルタチオン（ともに和光純薬製）となるようにそれぞれ加え、イオン交換水で溶解しリフォールディング剤（Ｒ−１）を調製した。
｛（Ｒ−１）中の化合物（Ｔ）の濃度＝０．０１重量％；酸化型グルタチオン重量／還元型グルタチオン重量＝１｝
【０１０４】
実施例２〜実施例２５及び比較例１〜８
実施例１において、表１〜４に示す濃度とする以外は実施例１と同様にして、リフォールディング剤（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び比較のリフォールディング剤（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を調整した。
【０１０５】
上記実施例１〜２５及び比較例１〜８で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を表１〜４に示す。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
実施例２６
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリゾチーム（「塩化リゾチーム」ナカライテスク社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しリゾチームをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１１１】
実施例２７〜５０及び比較例９〜１６
実施例２６において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例２６と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１１２】
＜リゾチームの凝集性の測定＞
実施例２６〜５０及び比較例９〜１６で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でリゾチームをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１１３】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１１４】
上記実施例２６〜５０及び比較例９〜１６の凝集防止率を表５に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１１５】
＜リゾチーム酵素活性の測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度の枯草菌溶液を３ｍｌ入れ、実施例２６〜５０又は比較例９〜１６で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに（Ａ０）を測定して５分後に５分後の吸光度（Ａ５）を測定し、これらの数値から４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ０−Ａ５を算出した。
また、実施例２６〜５０及び比較例９〜１６のリゾチーム濃度と同濃度の市販品「リゾチーム」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４５０ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１１６】
リフォールディング後の酵素の活性収率は以下の式を用いて算出した。
活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１１７】
上記実施例２６〜５０及び比較例９〜１６の活性収率を表５に示す。なお、活性収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
実施例５１
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのβラクトグロブリン（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しβラクトグロブリンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１２０】
実施例５２〜７５及び比較例１７〜２４
実施例５１において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例５１と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１２１】
＜βラクトグロブリンの凝集性の測定＞
実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でβラクトグロブリンをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１２２】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１２３】
上記実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４の凝集防止率を表６に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１２４】
＜βラクトグロブリン巻き戻し率の測定＞
リフォールディングをおこなったβラクトグロブリン溶液の２１５ｎｍにおけるモル楕円率（Ｑｒ）をＣＤスペクトル（日本分光社製「ＪＡＳＣＯ Ｊ−８２０」）で測定した。また、リフォールディング前のアンフォールディングされたβラクトグロブリン溶液のモル楕円率（Ｑｕ）を同様に測定した。さらに試薬のβラクトグロブリン２ｍｇをイオン交換水１ｍＬに溶解させた溶液のモル楕円率（Ｑ０）を測定した。
【０１２５】
リフォールディング後のβラクトグロブリンの巻き戻し収率は以下の式を用いて算出した。
巻き戻し収率（％）＝（Ｑｒ−Ｑｕ）／（Ｑ０−Ｑｕ） ×１００
【０１２６】
上記実施例５１〜７５及び比較例１７〜２４の巻き戻し収率を表６に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
実施例７６
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのトリプシン（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しトリプシンをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１２９】
実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２
実施例７５において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例７５と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１３０】
＜トリプシンの凝集性の測定＞
実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でトリプシンをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１３１】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１３２】
上記実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２の凝集防止率を表７に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１３３】
＜トリプシンの酵素活性測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．５重量％濃度のカゼイン溶液を３ｍｌ入れ、実施例７６〜１００又は比較例２５〜３２で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。２５℃で１０分経過した後に、１０％トリクロロ酢酸ナトリウム水溶液３ｍＬを加え、２０分静置した。遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、上澄み液１ｍＬに、フォーリン試薬（和光純薬工業製）１ｍＬを加え、２５℃で２０分静置した。この液の上澄みの５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ１０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、カゼイン溶液を加える前にトリクロロ酢酸ナトリウム水溶液を加え、以降同様に実験を行い、上澄みの５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定し、これらの数値から５６２ｎｍにおける吸光度変化ＤＡ＝Ａ１０−Ａ０を算出した。
また、実施例７６〜１００及び比較例９〜１６のトリプシン濃度と同濃度の市販品「トリプシン」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、５６２ｎｍにおける吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１３４】
リフォールディング後のトリプシンの酵素活性収率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１３５】
上記実施例７６〜１００及び比較例２５〜３２の巻き戻し収率を表７に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
実施例１０１
１．５ｍＬ容の滅菌済みエッペンドルフチューブに、２ｍｇのリパーゼ（和光純薬工業社製：以下、同様のものを使用）及び製造例１で調整したアンフォールディング溶液を１ｍＬ加えて、４℃で１２時間放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液０．２５ｍＬに、実施例１で調整したリフォールディング剤（Ｒ−１）を０．７５ｍＬ加えて、１０℃で１２時間放置してリフォールディングを行った。
【０１３８】
実施例１０２〜１２５及び比較例３３〜４０
実施例１０１において、（Ｒ−１）の代わりにそれぞれ（Ｒ−２）〜（Ｒ−２５）及び（Ｒ’−１）〜（Ｒ’−８）を使用する以外は実施例１０１と同様におこないリフォールディングを行った。
【０１３９】
＜リパーゼの凝集性の測定＞
実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０で得られたタンパク質溶液が入ったエッペンドルフチューブをそれぞれ遠心分離器（ＴＯＭＹ社製「ＰＭＣ−０６０」）で３０００ｒｐｍで１０分遠心し、得られた上澄みの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定した。また、製造例１に示したアンフォールディング液でリパーゼをアンフォールディングしたアンフォールディング液の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ’）を測定した。
【０１４０】
リフォールディング後の凝集防止率は以下の式を用いて算出した。
凝集防止率（％）＝（Ａ’×１）／（Ａ×０．２５）×１００
【０１４１】
上記実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０の凝集防止率を表８に示す。なお、凝集防止率は値が大きい程、凝集が防止できており優れていることを示す。
【０１４２】
＜リパーゼの酵素活性測定＞
１０ｍｌの滅菌済み試験管に０．０１重量％濃度のｐ−ニトロフェニルアセテート溶液を３ｍｌ入れ、実施例１０１〜１２５又は比較例３３〜４０で得られたタンパク質溶液を１０μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。タンパク質を加えた直後の４００ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で測定し、さらに（Ａ０）を測定して５分後に５分後の吸光度（Ａ５）を測定し、これらの数値から４００ｎｍにおける５分間の吸光度変化ＤＡ＝Ａ０−Ａ５を算出した。
また、実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０のリパーゼ濃度と同濃度の市販品「リパーゼ」で他に添加剤を加えないブランクの水溶液を調製し、これを用いて上記と同様に、４００ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ＤＡｂ）を算出した。
【０１４３】
リフォールディング後のリパーゼの酵素活性収率は以下の式を用いて算出した。
酵素活性収率（％）＝（ＤＡ／ＤＡｂ） ×１００
【０１４４】
上記実施例１０１〜１２５及び比較例３３〜４０の巻き戻し収率を表８に示す。なお、巻き戻し収率は値が大きい程、活性があるタンパク質が多く得られており、優れていることを示す。
【０１４５】
【表８】
【０１４６】
表５によると、凝集防止率の値から、比較例９のリン含有化合物（Ａ）のみや、比較例１１のオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）のみではリゾチームの凝集を抑えることができない。また、比較例１０で非イオン性界面活性剤（Ｂ）のみの使用や、比較例１２〜１３のように非イオン性界面活性剤（Ｂ）と組み合わせることで、リゾチームの凝集量は若干改善されるが依然として多い。また、比較例９〜１６では、リゾチームがリフォールディングせず活性収率が低いことが表５からわかる。さらに、比較例１４〜１６のように（Ａ）〜（Ｃ）をそれぞれ単独で酸化型グルタチオンや還元型グルタチオンと併用した場合でも、リゾチームの凝集は抑制できない、もしくは活性収率が低いことが分かる。
一方、化合物（Ｔ）と、（Ａ）又は（Ｃ）と、（Ｂ）とを同時に含む実施例２６〜５０の本発明のリフォールディング剤は、タンパク質としてのリゾチームの凝集が起こりにくく、高収率でリフォールディングできることがわかる。さらに酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを併用するとさらに凝集が起こりにくく、収率もさらに向上することがわかる。
【０１４７】
同様のことが表６〜８でも見られ、本発明のリフォールディング剤は幅広くタンパク質に対して有効であることが分かる。特に、Ｓ−Ｓ結合を含むタンパク質（表５〜７）に対しては、Ｓ−Ｓ結合を含まないタンパク質（表８）に比べて、本発明の効果が顕著に表れている。すなわち、Ｓ−Ｓ結合を含むタンパク質（表５〜７）においては、比較例は凝集防止率及び活性収率又は巻き戻し収率が極めて低い値であるが、本発明の実施例では、それらが全て高い値となっている。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明のリフォールディング剤、及びタンパク質の製造方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、凝集させること無く、高収率で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質などが挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）。
【化１】
【請求項２】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）。
【請求項３】
化合物（Ｔ）が、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンである請求項１又は２に記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
化合物（Ｔ）が、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンである請求項１〜３のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンのリフォールディング剤（Ｉ）中の合計濃度が０．００００１〜０．１（重量％）である請求項３又は４に記載のリフォールディング剤。
【請求項６】
酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの重量比（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）が０．０１〜１０である請求項４又は５に記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
タンパク質が、分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のリフォールディング剤でタンパク質をリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、一般式（１）で示される基を有するリン含有化合物（Ａ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（Ｉ）。
【化１】
【請求項２】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であって、カルボキシル基、カルボキシレートアニオン基及びエステル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を有するオキシカルボニル基含有化合物（Ｃ）と、非イオン性界面活性剤（Ｂ）と、チオール基含有アミノ酸、チオール基含有ペプチド及びこれらのチオール基同士がジスルフィド結合で結合した化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ｔ）とを必須成分とするリフォールディング剤（ＩＩ）。
【請求項３】
化合物（Ｔ）が、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンである請求項１又は２に記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
化合物（Ｔ）が、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンである請求項１〜３のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンのリフォールディング剤（Ｉ）中の合計濃度が０．００００１〜０．１（重量％）である請求項３又は４に記載のリフォールディング剤。
【請求項６】
酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの重量比（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）が０．０１〜１０である請求項４又は５に記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
タンパク質が、分子内にジスルフィド結合を含むタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載のリフォールディング剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のリフォールディング剤でタンパク質をリフォールディングする工程を含むタンパク質の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１３２６４９（Ｐ２０１０−１３２６４９Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４６４５１（Ｐ２００９−２４６４５１）
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２７日（２００９．１０．２７）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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