タンパク質のリフォールディング組成物
【課題】アルギニンの溶液中の実効濃度を増加させ、かつタンパク質の凝集を抑制させる相乗効果により、リフォールディング収率を向上させるリフォールディング組成物や、かかるリフォールディング組成物を用いた変性タンパク質のリフォールディング方法を提供すること。
【解決手段】タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、アルギニン類と、ヨウ化物塩やチオシアン酸塩などのカオトロープとを含むリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、６０℃以下で静置することにより変性タンパク質をリフォールディングする。上記リフォールディング組成物として、０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとの混合物や０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとの混合物がある。
【解決手段】タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、アルギニン類と、ヨウ化物塩やチオシアン酸塩などのカオトロープとを含むリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、６０℃以下で静置することにより変性タンパク質をリフォールディングする。上記リフォールディング組成物として、０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとの混合物や０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとの混合物がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング組成物に関し、より詳しくは、アルギニン等とカオトロープとを含む、変性又は還元されたタンパク質のリフォールディング組成物やそれを用いたタンパク質のリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展により、有用なタンパク質を大腸菌などから組換え体として大量に調製し利用できるようになっている。例えば医薬品製造の分野では、炎症反応、抗腫瘍作用等の免疫系の調製を行うサイトカインや、抗体医薬品としての一本鎖抗体等が組換え体として調製され用いられている。また食品加工の分野では、リパーゼは脂質を分解、脱脂をして香味を付け、アミラーゼは水飴やウイスキー、製パン加工に不可欠である糖分解をし、ペプチターゼは食品を柔らかくするなどの、組換え体タンパク質の応用が進められている。臨床診断の分野では、感染症の診断のための抗体や、病原菌、ウイルス等の外来物質の検査のためのタンパク質の利用が挙げられる。
【０００３】
組換えタンパク質の大量調製にはさまざまな技術が研究開発され産業に利用されてきた。中でも大腸菌を宿主とした発現系は、操作が簡便で得られるタンパク質量も多いことから広く用いられてきた。しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは不活性な封入体と呼ばれる不溶性顆粒を形成することが多い。例えば医薬品に用いる抗体、一本鎖抗体、サイトカインは、大腸菌で発現させると必ず封入体を形成する。これらの封入体から機能を持ったタンパク質を得るためには、封入体を可溶化させた後、固有の立体構造をもつ天然状態タンパク質へと巻き戻す作業が必要である。
【０００４】
タンパク質のリフォールディングには、まずタンパク質を封入体から可溶化させる。可溶化剤には、ジチオトレイトールやβ−メルカプトエタノール等の還元試薬、及び高濃度の塩酸グアニジンや尿素などのタンパク質変性剤か、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）やＴｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）などの界面活性剤が含まれることが多い。タンパク質を可溶化剤によって還元変性させ活性のない構造として可溶化した後、これらを取り除くことで変性タンパク質は機能を持つ立体構造へと巻き戻ることができる。この可溶化させ、巻き戻す反応をリフォールディングと呼ぶ。しかしタンパク質を機能のある立体構造へと巻き戻す再生反応には、不活性な凝集を形成する副反応が競合する。不活性な凝集の生成を抑制することが、機能のある立体構造へと巻き戻す反応を促進させ、収率を上げる。
【０００５】
タンパク質可溶化剤を取り除くために、透析法か希釈法が用いられる。透析法とは、透析することでタンパク質可溶化剤を徐々に除去し、タンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる方法である。しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、１日ほど掛けて可溶化剤を除去するために、その間にリフォールディング中間体が凝集して収率が低下することが多い。希釈法とは、緩衝液等で希釈することで、タンパク質可溶化剤によるタンパク質変性状態からタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる方法である。希釈法は、透析法と比べて短時間で終了し、かつ使用する緩衝液の容積も比較的少なくて済むという利点がある。希釈法はタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる最も簡便で低コストの方法であるが、リフォールディング収率が低いのが現状である（例えば、非特許文献１参照）。これらを解決する手段として、タンパク質可溶化剤濃度を徐々に減少させることで、機能のある立体構造へのリフォールディング収率を上げる段階的希釈法（例えば、非特許文献２参照）が知られているが、時間が透析法よりも掛ることから、コストとリフォールディング収率を両立させる決定的な方法はまだ確立されていない。
【０００６】
リフォールディング収率が低下する主な原因は、副反応として起こる不溶性凝集体の形成である（例えば、非特許文献３参照）。リフォールディング中間体が蓄積して凝集体を形成することから、収率を改善するにはこの中間体の凝集を抑制すればよい。アルギニンやその誘導体は最もよく用いられるタンパク質凝集抑制剤であり、５００ｍＭ程度のアルギニン存在下において複数のタンパク質（例えばサイトカインや一本鎖抗体、リゾチーム及び他の酵素）のリフォールディングに効果的であることがわかっている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００７】
このような事情から、現在、タンパク質可溶化剤で変性させたタンパク質を比較的高濃度のアルギニンもしくはアルギニン塩酸塩を含む溶液で希釈してタンパク質をリフォールディングさせる希釈法が使用されることがある。アルギニンは安価で効果の高い小分子添加剤であり、アルギニンを用いた希釈法によるリフォールディングは短時間で行うことができかつコストも高くならない簡易な方法であるが、それでも収率の向上には限界がある。タンパク質によっては工業的な大量生産を行うには不十分なレベルのものもあり、まだ課題が残されているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，５９３，８６５号明細書（１９９７）
【特許文献２】特開２００７−３３２０９３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Immunol Methods. Vol.219 (1997) 119-129
【非特許文献２】J. Biol. Chem. Vol.278 (2003) 8979-8987
【非特許文献３】Fold Des. Vol. 3 (1998) 9-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
希釈法を用いてタンパク質をリフォールディングさせる、安価で簡便な低分子添加剤としてはアルギニンが用いられてきた。しかしながら、アルギニン単体を添加剤として用いた場合のリフォールディング収率の向上には限界があった。本発明の課題は、アルギニンの溶液中の実効濃度を増加させ、かつタンパク質の凝集を抑制させる相乗効果により、リフォールディング収率を向上させるリフォールディング組成物や、かかるリフォールディング組成物を用いた変性タンパク質のリフォールディング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アルギニン塩酸塩もしくはアルギニン（以下アルギニンと呼ぶ）にヨウ化物塩もしくはチオシアン酸塩（カオトロープ）を加えることで、アルギニンの水溶液中での実効的な濃度を増加させ、かつタンパク質の凝集を抑制することができ、リフォールディング収率が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、［１］アルギニン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質のリフォールディング組成物や、［２］カオトロープが、ヨウ化物塩又はチオシアン酸塩であることを特徴とする上記［１］記載のリフォールディング組成物や、［３］０．８８〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとを含有することを特徴とする上記［２］記載のリフォールディング組成物や、［４］０．９５〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとを含有することを特徴とする上記［２］記載のリフォールディング組成物に関する。
【００１３】
また本発明は、［５］タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、上記［１］〜［４］のいずれか記載のリフォールディング組成物、及び、酸化型グルタチオン又は還元型グルタチオンを含む緩衝液に希釈し、静置することを特徴とする変性タンパク質のリフォールディング方法や、［６］０〜６０℃で所定時間静置することを特徴とする上記［５］記載の変性タンパク質のリフォールディング方法や、［７］タンパク質が、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ、又はリボヌクレアーゼＡであることを特徴とする上記［５］又は［６］記載の変性タンパク質のリフォールディング方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、上記リフォールディング組成物を用いて還元変性させたタンパク質をリフォールディングさせることにより、アルギニンを添加しない場合及びアルギニンのみを添加した場合に比べて高い収率が得られた。本発明により、これまでアルギニンで十分な収率が望めなかったタンパク質についても高いリフォールディング収率を得られる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、ニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図２】実施例２におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、カルボニックアンヒドラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態カルボニックアンヒドラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図３】実施例３におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、α−アミラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態α−アミラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図４】実施例４におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、セルラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態セルラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図５】実施例５におけるリフォールディング試薬１と試薬２、試薬４と試薬６を混合した溶液を使用した場合のニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸をリフォールディング試薬の混合比、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。図中、「Ｎｏ．１／Ｎｏ．２」は試薬２に対する試薬１の混合比を、「Ｎｏ．４／Ｎｏ．６」は試薬６に対する試薬４の混合比を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のリフォールディング組成物としては、アルギニン若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質をリフォールディングすることができる組成物であれば特に制限されず、対象となるタンパク質としては、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グリコシダーゼ、リボヌクレアーゼ、リパーゼなどの酵素、抗体、一本鎖抗体、サイトカイン、アルブミン、ヘモグロビン等の非酵素タンパク質を生体から調製したものや大腸菌等の異種発現系を用いて遺伝子工学的に生産された組換え体等が対象となるが、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質、特に、大腸菌等の異種発現系を用いて遺伝子工学的に生産された組換え体の場合にはしばしば不溶性で不活性の凝集体、いわゆる封入体として得られるため、リフォールディングが必要となる。
【００１７】
上記アルギニンの誘導体としては、アルギニンアミド、Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ホモアルギニン、アルギニンメチルエステル等を挙げることができる。アルギニンやこれら誘導体の構造式を以下に示す。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
【００２１】
【化４】
【００２２】
【化５】
【００２３】
また、アルギニンやその誘導体の塩としては、無機酸や有機酸との塩であれば特に制限されず、無機酸の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩等を挙げることができ、有機酸の塩としては、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩等を挙げることができる。また、アルギニン若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、通常、リフォールディング緩衝液中で、０．２Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．８Ｍ〜２．３Ｍの範囲で使用され、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。さらに、他の凝集抑制剤との併用も可能である。
【００２４】
本発明において、カオトロープとは、水の構造を不安定化させ、非極性溶質の溶解度を増加させる塩を意味し、カオトロピック性の強さは陰イオンでは、タンパク質の沈殿効果を示すホフマイスター系列（硝酸イオン＞塩素酸イオン＞ヨウ化物イオン＞過塩素酸イオン＞チオシアン酸イオン）とほぼ逆の関係にあり、これらの無機塩であるチオシアン酸塩、過塩素酸塩、ヨウ化物塩、塩素酸塩、硝酸塩等が、入手が容易で安価なカオトロープとして用いることができ、より具体的には、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム等のナトリウム塩や、チオシアン酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、ヨウ化アンモニウム等のアンモニウム塩を挙げることができ、中でも、チオシアン酸アンモニウムやヨウ化アンモニウムを好適に例示することができる。これらカオトロープ類は、通常、リフォールディング緩衝液中で、０．５Ｍ〜３Ｍの範囲で使用され、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２５】
本発明のリフォールディング組成物は、タンパク質のリフォールディング補助剤及び凝集抑制剤として作用する。かかる本発明のリフォールディング組成物として、例えば、０．５Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．８８Ｍ〜２．２０Ｍのアルギニン塩酸塩と、０．５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．７７Ｍ〜２．６５Ｍのヨウ化アンモニウムとを含有する組成物や、０．５Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．９５Ｍ〜１．８９Ｍのアルギニン塩酸塩と、０．５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．６９Ｍ〜２．６５Ｍのチオシアン酸アンモニウムとを含有する組成物を具体的に挙げることができる。
【００２６】
本発明の変性タンパク質のリフォールディング方法としては、タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、上記本発明のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置する方法、好ましくは０〜６０℃、更に好ましくは２０〜６０℃で所定時間静置する方法であれば特に制限されず、上記リフォールディング用の緩衝液としては、タンパク質の機能を失わせるような濃度及び組成でなければ特に限定されないが、アミン系緩衝液が好ましく、例えばトリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液等を挙げることができる。アミン系緩衝液は、ｐＨ２〜１２の溶液であることが好ましく、特にｐＨ５〜９の範囲が好ましい。また、同緩衝液には、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加することができるほか、種々の添加物を添加することも可能である。添加物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩類、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩等の緩衝液、水酸化ナトリウム、塩酸、酢酸等の酸塩基類、メタノール、エタノール、プロパノール等の有機溶媒等を挙げることができる。
【００２７】
上記タンパク質可溶化剤としては、通常用いられる変性剤や界面活性剤であれば特に制限されず、タンパク質の可溶化は、通常、グアニジン塩酸、尿素等の変性剤、及び／又はＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸)等の界面活性剤にタンパク質を溶解させ、同時に、封入体中に存在する分子内及び分子間ジスルフィド結合をジチオトレイトールやβ−メルカプトエタノール等の還元剤により化学的に還元することにより行われる。変性剤や界面活性剤は、１種単独でも又は２種以上を混合して用いてもよく、また、変性剤と界面活性剤は、いずれか一方でもよいし、両方を用いてもよい。本発明において、リフォールディング対象となる可溶化したタンパク質とは、変性剤や界面活性剤によって本来の立体構造を有さない状態へとタンパク質を解きほぐした状態のタンパク質を意味すると共に、分子内又は分子間ジスルフィド結合をジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元剤により開裂させ、チオールへと化学的に変換させたタンパク質も含まれる。この可溶化したタンパク質を、本発明のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置することでタンパク質をリフォールディングさせる。
【００２８】
本発明の方法でリフォールディングされるタンパク質の濃度は、特に制限はないが、例えば１〜１０ｍｇ／ｍＬの高濃度でもリフォールディングが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００３０】
（試料等の調製）
緩衝液を加えたリフォールディング試薬の組成は次のとおり。
試薬１：２．６５Ｍヨウ化アンモニウム、０．８８Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬２：１．４９Ｍヨウ化アンモニウム、１．５１Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬３：０．７７Ｍヨウ化アンモニウム、２．２０Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬４：２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウム、０．９５Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬５：１．６４Ｍチオシアン酸アンモニウム、１．７０Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬６：０．６９Ｍチオシアン酸アンモニウム、１．８９Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬７：１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）（ネガティブコントロール）
試薬８：１．５Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）（ポジティブコントロール）
【００３１】
実施例１：ニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング
（実験方法）
５０．９ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチームに６．２Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してリゾチームを変性させた。その後、３８８．４μＬの試薬１〜８に１０μＬの２００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０．６μＬの変性リゾチーム溶液を加えて希釈し、３７℃で１８時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリゾチーム濃度は１．５７ｍｇ／ｍＬだった。リゾチームの活性測定は、１５９０μＬの基質液(６００ｎｍの吸光度が１．０になるよう６４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）にミクロコッカス・リゾディクティクスを溶かした溶液)に１０μＬのリフォールディング液を加えて、６００ｎｍの吸光度の減少を測定した。変性させていないリゾチーム溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３２】
（実験結果）
図１に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％以下、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４５〜６０％程度の収率だったのに対し、試薬２、試薬３、試薬５、及び試薬６では収率の増加が見られ、特に試薬２では８０％程度まで収率が増加した。
【００３３】
実施例２：カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）のリフォールディング
（実験方法）
２２．９ｍｇ／ｍＬのＣＡに６．０Ｍ尿素、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してＣＡを変性させた。その後、１８９．２μＬの試薬１〜８（ｐＨ８．２）に１０．８μＬの変性ＣＡを加えて希釈し、３７℃で１４時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なＣＡの濃度は１．２３ｍｇ／ｍＬだった。ＣＡの活性測定は、１５２０μＬの１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌し、速やかに７０μＬの１００ｍＭパラニトロフェニルアセテートを加えてよく攪拌して、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。変性させていないＣＡ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３４】
（実験結果）
図２に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ＣＡの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４０〜５０％程度の収率だったのに対し、試薬１〜６の全てにおいて収率の増加が見られ、特に試薬１では９０％前後にまで収率が増加した。
【００３５】
実施例３：α−アミラーゼのリフォールディング
（実験方法）
１８．５４ｍｇ／ｍＬのα−アミラーゼに５．０Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を２５℃で１６時間保温してα−アミラーゼを変性させた。その後、１８０μlの試薬１〜８に１０μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性α−アミラーゼ溶液を加えて希釈し、５０℃で２時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なα−アミラーゼ濃度は０．９３ｍｇ／ｍＬだった。α−アミラーゼの活性測定は、０．９％デンプン溶液に５０ｍＭ酢酸緩衝液を共存させた基質（ｐＨ５．５）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌して３７℃で６時間保温したのち、煮沸によって酵素反応を停止させた。この溶液４００μＬに１２００μＬの３, ５−ジニトロサリチル酸（3,5-Dinitro Salicylic Acid, ＤＮＳ）試薬を加えて再度５分間煮沸した。常温に冷却後、５００ｎｍの吸光度の値からリフォールディング収率を決定した。変性させていないα−アミラーゼ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３６】
（実験結果）
図３に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態α−アミラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では７０％程度の収率だったのに対し、試薬１〜６の全てにおいて９０％前後にまで収率の増加が見られた。
【００３７】
実施例４：セルラーゼのリフォールディング
（実験方法）
３３．１６ｍｇ／ｍＬのセルラーゼに６．０Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を２５℃で１６時間保温してセルラーゼを変性させた。その後、１８０μＬの溶液１〜８に１０μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性セルラーゼ溶液を加えて希釈し、５０℃で６時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なセルラーゼ濃度は１．６６ｍｇ／ｍＬだった。セルラーゼの活性測定は、１．０％カルボキシメチルセルロース溶液に５０ｍＭ酢酸緩衝液を共存させた基質（ｐＨ５．５）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌して３７℃で６時間保温し、煮沸によって酵素反応を停止した。この溶液４００μＬに１２００μＬの３,５−ジニトロサリチル酸（3,5-Dinitro Salicylic Acid, ＤＮＳ）試薬を加えて再度５分間煮沸した。常温に冷却後、５００ｎｍの吸光度の値からリフォールディング収率を決定した。変性させていないセルラーゼ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３８】
（実験結果）
図４に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態セルラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフで示す。添加剤を加えない試薬７では３０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４０％弱程度の収率であったが、試薬１〜６では試薬８をさらに上回る収率の増加が見られ、特に試薬４では８０％弱程度にまで収率が増加した。
【００３９】
実施例５：牛膵臓リボヌクレアーゼＡのリフォールディング
（実験方法）
２９．２ｍｇ／ｍＬの牛膵臓リボヌクレアーゼＡに５Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を５０℃で１時間保温してリボヌクレアーゼＡを変性させた。その後、１７４μＬの試薬１、７及び８に１６μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性リボヌクレアーゼＡ溶液を加えて希釈し、５０℃で２４時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリボヌクレアーゼＡ濃度は１．４６ｍｇ／ｍＬだった。リボヌクレアーゼＡの活性測定は０．１ｍｇ／ｍｌシチジン２’：３’リン酸に１００ｍＭＭＯＰＳ緩衝液を共存させた基質溶液（ｐＨ７．０）１４９０μＬに１０μＬのリフォールディング液を加えて、２８４ｎｍの吸光度の増加を測定した。変性させていないリボヌクレアーゼＡ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００４０】
（実験結果）
その結果、添加剤を加えない試薬７では１８％程度、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では５〜１２％程度の収率だったのに対し、試薬１では２５％程度まで収率が増加した。
【００４１】
実施例６：リフォールディング試薬中の添加剤濃度の最適化
（実験方法）
４４．２ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチームに６．２Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してリゾチームを変性させた。その後、試薬１及び試薬２、試薬４及び試薬６の混合比をそれぞれ２０％ずつ変えた溶液３９０μＬに１０μＬの２００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性リゾチーム溶液を加えて希釈し、３７℃で１８時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリゾチーム濃度は１．２０ｍｇ／ｍＬだった。リゾチームの活性測定は、１５９０μＬの基質液(６００ｎｍの吸光度が１．０になるよう６４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）にミクロコッカス・リゾディクティクスを溶かした溶液)に１０μＬのリフォールディング液を加えて、６００ｎｍの吸光度の減少からリゾチームのリフォールディング収率を決定した。変性させていないリゾチーム溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００４２】
（実験結果）
図５に、リフォールディング希釈液として試薬１及び試薬２、試薬４及び試薬６を混合した溶液を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬２に対する試薬１と試薬６に対する試薬４のそれぞれの混合比、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。図５から明らかなように、試薬１と試薬２の濃度比を６０％まで変えても高い収率を示した。このことからカオトロープ試薬に含まれる添加剤濃度の最適な組成は、０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムや、０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムという広範囲の濃度に渡る。
【００４３】
本発明により、リフォールディング時におけるタンパク質の凝集を抑制し、リフォールディング収率を向上させることで、効率よく目的のタンパク質を生産できるという点において産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング組成物に関し、より詳しくは、アルギニン等とカオトロープとを含む、変性又は還元されたタンパク質のリフォールディング組成物やそれを用いたタンパク質のリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展により、有用なタンパク質を大腸菌などから組換え体として大量に調製し利用できるようになっている。例えば医薬品製造の分野では、炎症反応、抗腫瘍作用等の免疫系の調製を行うサイトカインや、抗体医薬品としての一本鎖抗体等が組換え体として調製され用いられている。また食品加工の分野では、リパーゼは脂質を分解、脱脂をして香味を付け、アミラーゼは水飴やウイスキー、製パン加工に不可欠である糖分解をし、ペプチターゼは食品を柔らかくするなどの、組換え体タンパク質の応用が進められている。臨床診断の分野では、感染症の診断のための抗体や、病原菌、ウイルス等の外来物質の検査のためのタンパク質の利用が挙げられる。
【０００３】
組換えタンパク質の大量調製にはさまざまな技術が研究開発され産業に利用されてきた。中でも大腸菌を宿主とした発現系は、操作が簡便で得られるタンパク質量も多いことから広く用いられてきた。しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは不活性な封入体と呼ばれる不溶性顆粒を形成することが多い。例えば医薬品に用いる抗体、一本鎖抗体、サイトカインは、大腸菌で発現させると必ず封入体を形成する。これらの封入体から機能を持ったタンパク質を得るためには、封入体を可溶化させた後、固有の立体構造をもつ天然状態タンパク質へと巻き戻す作業が必要である。
【０００４】
タンパク質のリフォールディングには、まずタンパク質を封入体から可溶化させる。可溶化剤には、ジチオトレイトールやβ−メルカプトエタノール等の還元試薬、及び高濃度の塩酸グアニジンや尿素などのタンパク質変性剤か、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）やＴｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）などの界面活性剤が含まれることが多い。タンパク質を可溶化剤によって還元変性させ活性のない構造として可溶化した後、これらを取り除くことで変性タンパク質は機能を持つ立体構造へと巻き戻ることができる。この可溶化させ、巻き戻す反応をリフォールディングと呼ぶ。しかしタンパク質を機能のある立体構造へと巻き戻す再生反応には、不活性な凝集を形成する副反応が競合する。不活性な凝集の生成を抑制することが、機能のある立体構造へと巻き戻す反応を促進させ、収率を上げる。
【０００５】
タンパク質可溶化剤を取り除くために、透析法か希釈法が用いられる。透析法とは、透析することでタンパク質可溶化剤を徐々に除去し、タンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる方法である。しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、１日ほど掛けて可溶化剤を除去するために、その間にリフォールディング中間体が凝集して収率が低下することが多い。希釈法とは、緩衝液等で希釈することで、タンパク質可溶化剤によるタンパク質変性状態からタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる方法である。希釈法は、透析法と比べて短時間で終了し、かつ使用する緩衝液の容積も比較的少なくて済むという利点がある。希釈法はタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングさせる最も簡便で低コストの方法であるが、リフォールディング収率が低いのが現状である（例えば、非特許文献１参照）。これらを解決する手段として、タンパク質可溶化剤濃度を徐々に減少させることで、機能のある立体構造へのリフォールディング収率を上げる段階的希釈法（例えば、非特許文献２参照）が知られているが、時間が透析法よりも掛ることから、コストとリフォールディング収率を両立させる決定的な方法はまだ確立されていない。
【０００６】
リフォールディング収率が低下する主な原因は、副反応として起こる不溶性凝集体の形成である（例えば、非特許文献３参照）。リフォールディング中間体が蓄積して凝集体を形成することから、収率を改善するにはこの中間体の凝集を抑制すればよい。アルギニンやその誘導体は最もよく用いられるタンパク質凝集抑制剤であり、５００ｍＭ程度のアルギニン存在下において複数のタンパク質（例えばサイトカインや一本鎖抗体、リゾチーム及び他の酵素）のリフォールディングに効果的であることがわかっている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００７】
このような事情から、現在、タンパク質可溶化剤で変性させたタンパク質を比較的高濃度のアルギニンもしくはアルギニン塩酸塩を含む溶液で希釈してタンパク質をリフォールディングさせる希釈法が使用されることがある。アルギニンは安価で効果の高い小分子添加剤であり、アルギニンを用いた希釈法によるリフォールディングは短時間で行うことができかつコストも高くならない簡易な方法であるが、それでも収率の向上には限界がある。タンパク質によっては工業的な大量生産を行うには不十分なレベルのものもあり、まだ課題が残されているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，５９３，８６５号明細書（１９９７）
【特許文献２】特開２００７−３３２０９３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Immunol Methods. Vol.219 (1997) 119-129
【非特許文献２】J. Biol. Chem. Vol.278 (2003) 8979-8987
【非特許文献３】Fold Des. Vol. 3 (1998) 9-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
希釈法を用いてタンパク質をリフォールディングさせる、安価で簡便な低分子添加剤としてはアルギニンが用いられてきた。しかしながら、アルギニン単体を添加剤として用いた場合のリフォールディング収率の向上には限界があった。本発明の課題は、アルギニンの溶液中の実効濃度を増加させ、かつタンパク質の凝集を抑制させる相乗効果により、リフォールディング収率を向上させるリフォールディング組成物や、かかるリフォールディング組成物を用いた変性タンパク質のリフォールディング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アルギニン塩酸塩もしくはアルギニン（以下アルギニンと呼ぶ）にヨウ化物塩もしくはチオシアン酸塩（カオトロープ）を加えることで、アルギニンの水溶液中での実効的な濃度を増加させ、かつタンパク質の凝集を抑制することができ、リフォールディング収率が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、［１］アルギニン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質のリフォールディング組成物や、［２］カオトロープが、ヨウ化物塩又はチオシアン酸塩であることを特徴とする上記［１］記載のリフォールディング組成物や、［３］０．８８〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとを含有することを特徴とする上記［２］記載のリフォールディング組成物や、［４］０．９５〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとを含有することを特徴とする上記［２］記載のリフォールディング組成物に関する。
【００１３】
また本発明は、［５］タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、上記［１］〜［４］のいずれか記載のリフォールディング組成物、及び、酸化型グルタチオン又は還元型グルタチオンを含む緩衝液に希釈し、静置することを特徴とする変性タンパク質のリフォールディング方法や、［６］０〜６０℃で所定時間静置することを特徴とする上記［５］記載の変性タンパク質のリフォールディング方法や、［７］タンパク質が、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ、又はリボヌクレアーゼＡであることを特徴とする上記［５］又は［６］記載の変性タンパク質のリフォールディング方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、上記リフォールディング組成物を用いて還元変性させたタンパク質をリフォールディングさせることにより、アルギニンを添加しない場合及びアルギニンのみを添加した場合に比べて高い収率が得られた。本発明により、これまでアルギニンで十分な収率が望めなかったタンパク質についても高いリフォールディング収率を得られる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、ニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図２】実施例２におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、カルボニックアンヒドラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態カルボニックアンヒドラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図３】実施例３におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、α−アミラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態α−アミラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図４】実施例４におけるリフォールディング試薬１〜８を使用した場合の、セルラーゼのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸を試薬番号、縦軸を天然状態セルラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。
【図５】実施例５におけるリフォールディング試薬１と試薬２、試薬４と試薬６を混合した溶液を使用した場合のニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング収率を示したグラフである。横軸をリフォールディング試薬の混合比、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率とした。図中、「Ｎｏ．１／Ｎｏ．２」は試薬２に対する試薬１の混合比を、「Ｎｏ．４／Ｎｏ．６」は試薬６に対する試薬４の混合比を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のリフォールディング組成物としては、アルギニン若しくはその誘導体、又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質をリフォールディングすることができる組成物であれば特に制限されず、対象となるタンパク質としては、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グリコシダーゼ、リボヌクレアーゼ、リパーゼなどの酵素、抗体、一本鎖抗体、サイトカイン、アルブミン、ヘモグロビン等の非酵素タンパク質を生体から調製したものや大腸菌等の異種発現系を用いて遺伝子工学的に生産された組換え体等が対象となるが、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質、特に、大腸菌等の異種発現系を用いて遺伝子工学的に生産された組換え体の場合にはしばしば不溶性で不活性の凝集体、いわゆる封入体として得られるため、リフォールディングが必要となる。
【００１７】
上記アルギニンの誘導体としては、アルギニンアミド、Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、ホモアルギニン、アルギニンメチルエステル等を挙げることができる。アルギニンやこれら誘導体の構造式を以下に示す。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】
【化３】
【００２１】
【化４】
【００２２】
【化５】
【００２３】
また、アルギニンやその誘導体の塩としては、無機酸や有機酸との塩であれば特に制限されず、無機酸の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩等を挙げることができ、有機酸の塩としては、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩等を挙げることができる。また、アルギニン若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、通常、リフォールディング緩衝液中で、０．２Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．８Ｍ〜２．３Ｍの範囲で使用され、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。さらに、他の凝集抑制剤との併用も可能である。
【００２４】
本発明において、カオトロープとは、水の構造を不安定化させ、非極性溶質の溶解度を増加させる塩を意味し、カオトロピック性の強さは陰イオンでは、タンパク質の沈殿効果を示すホフマイスター系列（硝酸イオン＞塩素酸イオン＞ヨウ化物イオン＞過塩素酸イオン＞チオシアン酸イオン）とほぼ逆の関係にあり、これらの無機塩であるチオシアン酸塩、過塩素酸塩、ヨウ化物塩、塩素酸塩、硝酸塩等が、入手が容易で安価なカオトロープとして用いることができ、より具体的には、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム等のナトリウム塩や、チオシアン酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、ヨウ化アンモニウム等のアンモニウム塩を挙げることができ、中でも、チオシアン酸アンモニウムやヨウ化アンモニウムを好適に例示することができる。これらカオトロープ類は、通常、リフォールディング緩衝液中で、０．５Ｍ〜３Ｍの範囲で使用され、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２５】
本発明のリフォールディング組成物は、タンパク質のリフォールディング補助剤及び凝集抑制剤として作用する。かかる本発明のリフォールディング組成物として、例えば、０．５Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．８８Ｍ〜２．２０Ｍのアルギニン塩酸塩と、０．５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．７７Ｍ〜２．６５Ｍのヨウ化アンモニウムとを含有する組成物や、０．５Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．９５Ｍ〜１．８９Ｍのアルギニン塩酸塩と、０．５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．６９Ｍ〜２．６５Ｍのチオシアン酸アンモニウムとを含有する組成物を具体的に挙げることができる。
【００２６】
本発明の変性タンパク質のリフォールディング方法としては、タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、上記本発明のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置する方法、好ましくは０〜６０℃、更に好ましくは２０〜６０℃で所定時間静置する方法であれば特に制限されず、上記リフォールディング用の緩衝液としては、タンパク質の機能を失わせるような濃度及び組成でなければ特に限定されないが、アミン系緩衝液が好ましく、例えばトリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液等を挙げることができる。アミン系緩衝液は、ｐＨ２〜１２の溶液であることが好ましく、特にｐＨ５〜９の範囲が好ましい。また、同緩衝液には、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加することができるほか、種々の添加物を添加することも可能である。添加物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等の塩類、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩等の緩衝液、水酸化ナトリウム、塩酸、酢酸等の酸塩基類、メタノール、エタノール、プロパノール等の有機溶媒等を挙げることができる。
【００２７】
上記タンパク質可溶化剤としては、通常用いられる変性剤や界面活性剤であれば特に制限されず、タンパク質の可溶化は、通常、グアニジン塩酸、尿素等の変性剤、及び／又はＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸)等の界面活性剤にタンパク質を溶解させ、同時に、封入体中に存在する分子内及び分子間ジスルフィド結合をジチオトレイトールやβ−メルカプトエタノール等の還元剤により化学的に還元することにより行われる。変性剤や界面活性剤は、１種単独でも又は２種以上を混合して用いてもよく、また、変性剤と界面活性剤は、いずれか一方でもよいし、両方を用いてもよい。本発明において、リフォールディング対象となる可溶化したタンパク質とは、変性剤や界面活性剤によって本来の立体構造を有さない状態へとタンパク質を解きほぐした状態のタンパク質を意味すると共に、分子内又は分子間ジスルフィド結合をジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元剤により開裂させ、チオールへと化学的に変換させたタンパク質も含まれる。この可溶化したタンパク質を、本発明のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置することでタンパク質をリフォールディングさせる。
【００２８】
本発明の方法でリフォールディングされるタンパク質の濃度は、特に制限はないが、例えば１〜１０ｍｇ／ｍＬの高濃度でもリフォールディングが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００３０】
（試料等の調製）
緩衝液を加えたリフォールディング試薬の組成は次のとおり。
試薬１：２．６５Ｍヨウ化アンモニウム、０．８８Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬２：１．４９Ｍヨウ化アンモニウム、１．５１Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬３：０．７７Ｍヨウ化アンモニウム、２．２０Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬４：２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウム、０．９５Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬５：１．６４Ｍチオシアン酸アンモニウム、１．７０Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬６：０．６９Ｍチオシアン酸アンモニウム、１．８９Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）
試薬７：１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）（ネガティブコントロール）
試薬８：１．５Ｍアルギニン塩酸塩、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２）（ポジティブコントロール）
【００３１】
実施例１：ニワトリ卵白リゾチームのリフォールディング
（実験方法）
５０．９ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチームに６．２Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してリゾチームを変性させた。その後、３８８．４μＬの試薬１〜８に１０μＬの２００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０．６μＬの変性リゾチーム溶液を加えて希釈し、３７℃で１８時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリゾチーム濃度は１．５７ｍｇ／ｍＬだった。リゾチームの活性測定は、１５９０μＬの基質液(６００ｎｍの吸光度が１．０になるよう６４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）にミクロコッカス・リゾディクティクスを溶かした溶液)に１０μＬのリフォールディング液を加えて、６００ｎｍの吸光度の減少を測定した。変性させていないリゾチーム溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３２】
（実験結果）
図１に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％以下、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４５〜６０％程度の収率だったのに対し、試薬２、試薬３、試薬５、及び試薬６では収率の増加が見られ、特に試薬２では８０％程度まで収率が増加した。
【００３３】
実施例２：カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）のリフォールディング
（実験方法）
２２．９ｍｇ／ｍＬのＣＡに６．０Ｍ尿素、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してＣＡを変性させた。その後、１８９．２μＬの試薬１〜８（ｐＨ８．２）に１０．８μＬの変性ＣＡを加えて希釈し、３７℃で１４時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なＣＡの濃度は１．２３ｍｇ／ｍＬだった。ＣＡの活性測定は、１５２０μＬの１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌し、速やかに７０μＬの１００ｍＭパラニトロフェニルアセテートを加えてよく攪拌して、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。変性させていないＣＡ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３４】
（実験結果）
図２に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態ＣＡの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４０〜５０％程度の収率だったのに対し、試薬１〜６の全てにおいて収率の増加が見られ、特に試薬１では９０％前後にまで収率が増加した。
【００３５】
実施例３：α−アミラーゼのリフォールディング
（実験方法）
１８．５４ｍｇ／ｍＬのα−アミラーゼに５．０Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を２５℃で１６時間保温してα−アミラーゼを変性させた。その後、１８０μlの試薬１〜８に１０μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性α−アミラーゼ溶液を加えて希釈し、５０℃で２時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なα−アミラーゼ濃度は０．９３ｍｇ／ｍＬだった。α−アミラーゼの活性測定は、０．９％デンプン溶液に５０ｍＭ酢酸緩衝液を共存させた基質（ｐＨ５．５）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌して３７℃で６時間保温したのち、煮沸によって酵素反応を停止させた。この溶液４００μＬに１２００μＬの３, ５−ジニトロサリチル酸（3,5-Dinitro Salicylic Acid, ＤＮＳ）試薬を加えて再度５分間煮沸した。常温に冷却後、５００ｎｍの吸光度の値からリフォールディング収率を決定した。変性させていないα−アミラーゼ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３６】
（実験結果）
図３に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態α−アミラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。添加剤を加えない試薬７では１０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では７０％程度の収率だったのに対し、試薬１〜６の全てにおいて９０％前後にまで収率の増加が見られた。
【００３７】
実施例４：セルラーゼのリフォールディング
（実験方法）
３３．１６ｍｇ／ｍＬのセルラーゼに６．０Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を２５℃で１６時間保温してセルラーゼを変性させた。その後、１８０μＬの溶液１〜８に１０μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性セルラーゼ溶液を加えて希釈し、５０℃で６時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なセルラーゼ濃度は１．６６ｍｇ／ｍＬだった。セルラーゼの活性測定は、１．０％カルボキシメチルセルロース溶液に５０ｍＭ酢酸緩衝液を共存させた基質（ｐＨ５．５）に１０μＬのリフォールディング液を加えた後よく攪拌して３７℃で６時間保温し、煮沸によって酵素反応を停止した。この溶液４００μＬに１２００μＬの３,５−ジニトロサリチル酸（3,5-Dinitro Salicylic Acid, ＤＮＳ）試薬を加えて再度５分間煮沸した。常温に冷却後、５００ｎｍの吸光度の値からリフォールディング収率を決定した。変性させていないセルラーゼ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００３８】
（実験結果）
図４に、リフォールディング緩衝液として試薬１〜８を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬番号、縦軸を天然状態セルラーゼの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフで示す。添加剤を加えない試薬７では３０％前後、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では４０％弱程度の収率であったが、試薬１〜６では試薬８をさらに上回る収率の増加が見られ、特に試薬４では８０％弱程度にまで収率が増加した。
【００３９】
実施例５：牛膵臓リボヌクレアーゼＡのリフォールディング
（実験方法）
２９．２ｍｇ／ｍＬの牛膵臓リボヌクレアーゼＡに５Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ ジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を５０℃で１時間保温してリボヌクレアーゼＡを変性させた。その後、１７４μＬの試薬１、７及び８に１６μＬの１００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性リボヌクレアーゼＡ溶液を加えて希釈し、５０℃で２４時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリボヌクレアーゼＡ濃度は１．４６ｍｇ／ｍＬだった。リボヌクレアーゼＡの活性測定は０．１ｍｇ／ｍｌシチジン２’：３’リン酸に１００ｍＭＭＯＰＳ緩衝液を共存させた基質溶液（ｐＨ７．０）１４９０μＬに１０μＬのリフォールディング液を加えて、２８４ｎｍの吸光度の増加を測定した。変性させていないリボヌクレアーゼＡ溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００４０】
（実験結果）
その結果、添加剤を加えない試薬７では１８％程度、１．５Ｍアルギニンのみを添加した試薬８では５〜１２％程度の収率だったのに対し、試薬１では２５％程度まで収率が増加した。
【００４１】
実施例６：リフォールディング試薬中の添加剤濃度の最適化
（実験方法）
４４．２ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチームに６．２Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭトリス緩衝液を共存させた溶液（ｐＨ８．２）を３７℃で６時間保温してリゾチームを変性させた。その後、試薬１及び試薬２、試薬４及び試薬６の混合比をそれぞれ２０％ずつ変えた溶液３９０μＬに１０μＬの２００ｍＭ酸化型グルタチオンを加えた溶液（ｐＨ８．２）に１０μＬの変性リゾチーム溶液を加えて希釈し、３７℃で１８時間保温してリフォールディングさせた。これを１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（株式会社日立ハイテクノロジーズ製 ｈｉｍａｃ ＣＦ１５ＲＸを使用）し、上清画分を取り分けた。リフォールディング後の最終的なリゾチーム濃度は１．２０ｍｇ／ｍＬだった。リゾチームの活性測定は、１５９０μＬの基質液(６００ｎｍの吸光度が１．０になるよう６４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）にミクロコッカス・リゾディクティクスを溶かした溶液)に１０μＬのリフォールディング液を加えて、６００ｎｍの吸光度の減少からリゾチームのリフォールディング収率を決定した。変性させていないリゾチーム溶液を調製してその活性を１００％とした。
【００４２】
（実験結果）
図５に、リフォールディング希釈液として試薬１及び試薬２、試薬４及び試薬６を混合した溶液を用いた場合におけるリフォールディング収率を、横軸を試薬２に対する試薬１と試薬６に対する試薬４のそれぞれの混合比、縦軸を天然状態ニワトリ卵白リゾチームの活性を１００％としたときのリフォールディング収率としたグラフを示す。図５から明らかなように、試薬１と試薬２の濃度比を６０％まで変えても高い収率を示した。このことからカオトロープ試薬に含まれる添加剤濃度の最適な組成は、０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムや、０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムという広範囲の濃度に渡る。
【００４３】
本発明により、リフォールディング時におけるタンパク質の凝集を抑制し、リフォールディング収率を向上させることで、効率よく目的のタンパク質を生産できるという点において産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質のリフォールディング組成物。
【請求項２】
カオトロープが、ヨウ化物塩又はチオシアン酸塩であることを特徴とする請求項１記載のリフォールディング組成物。
【請求項３】
０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとを含有することを特徴とする請求項２記載のリフォールディング組成物。
【請求項４】
０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとを含有することを特徴とする請求項２記載のリフォールディング組成物。
【請求項５】
タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、請求項１〜４のいずれか記載のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置することを特徴とする変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項６】
０〜６０℃で所定時間静置することを特徴とする請求項５記載の変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項７】
タンパク質が、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ、又はリボヌクレアーゼＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項１】
アルギニン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、カオトロープとを含有する、変性されたタンパク質のリフォールディング組成物。
【請求項２】
カオトロープが、ヨウ化物塩又はチオシアン酸塩であることを特徴とする請求項１記載のリフォールディング組成物。
【請求項３】
０．８８Ｍ〜２．２０Ｍアルギニン塩酸塩と０．７７Ｍ〜２．６５Ｍヨウ化アンモニウムとを含有することを特徴とする請求項２記載のリフォールディング組成物。
【請求項４】
０．９５Ｍ〜１．８９Ｍアルギニン塩酸塩と０．６９Ｍ〜２．６５Ｍチオシアン酸アンモニウムとを含有することを特徴とする請求項２記載のリフォールディング組成物。
【請求項５】
タンパク質可溶化剤で変性させた変性タンパク質を、請求項１〜４のいずれか記載のリフォールディング組成物、及び、リフォールディング緩衝液に希釈し、静置することを特徴とする変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項６】
０〜６０℃で所定時間静置することを特徴とする請求項５記載の変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項７】
タンパク質が、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ、又はリボヌクレアーゼＡであることを特徴とする請求項５又は６記載の変性タンパク質のリフォールディング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１７３９７５（Ｐ２０１０−１７３９７５Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８９３０（Ｐ２００９−１８９３０）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]