タンパク質の糖化度の評価方法及びタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法
【課題】タンパク質の糖化度、及びタンパク質の糖化を抑制・改善する薬剤の評価を簡便且つ迅速に行う方法を提供する。
【解決手段】本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
また、本発明にかかるタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
【解決手段】本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
また、本発明にかかるタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の糖化度の評価方法及びタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法に関し、特にその簡便化及び迅速化に関する。
【背景技術】
【０００２】
食事によって過剰に摂取し、血液中の糖度が上昇すると、ブドウ糖のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基が重合反応を起こし、各組織においてタンパク質が糖化される。このようなタンパク質の糖化は、糖尿病患者において特に顕著に認められ、例えば、動脈硬化（血管タンパク質の糖化）、白内障（水晶体タンパク質の糖化）、皮膚弾力の低下（皮膚コラーゲンの糖化）等の合併症の原因であることが知られてきた。
そのため、糖化タンパク質の測定は糖尿病の治療や診断の一つとして従来利用されてきた。糖尿病の治療ないし診断の手段として汎用されている糖化タンパク質の測定方法は、尿ないし血液を検体として用いた方法が主である。これらの測定方法は病気の診断を主眼としたものであるため、患者からの尿や血液の採取をはじめ、煩雑な処理や精密な測定を要する。
【０００３】
ところで、糖尿病患者において、前記診断にかかる血液中のタンパク質と同様に、毛髪のタンパク質もまた糖化されていることが知られている（特許文献１）。さらに驚くべきことに、本発明者らは、非糖尿病患者においても加齢に伴って毛髪のケラチンタンパク質が糖化される傾向にあることを見出した。従来、加齢により血糖度が上昇することは知られていたが、毛髪ケラチンにおいても同様の傾向が認められることは知られていなかった。また、本発明者らは、このようなタンパク質の糖化が毛髪を切れ易くしたり、毛髪表面をくすませるといった変化を引き起こすことをも見出した。
これらの知見から、毛髪ケラチンの糖化度を評価することは、従来のように糖尿病の治療及び診断に寄与するだけでなく、基礎的な加齢研究、ないしは広く行なわれているアンチエイジングに関する評価に極めて貢献し得ると考えられる。
【０００４】
なお、毛髪における糖化タンパク質の測定法については、例えば、先に挙げた特許文献１に記載がある。この測定方法は、毛髪をヒドラジンで処理し、その後発色試薬（フェニルヒドラジン）と反応させて比色定量するというものであり、これまでの糖化タンパク質の比色法に比べ、測定の簡便さ及び迅速さに優れていることが報告されている。
しかしながら、前記測定法においても、毛髪に数段階の前処理を施すことが必要とされ、毛髪におけるタンパク質の糖化度をより容易に評価する方法は、未だ開発されていない。
【０００５】
また、タンパク質糖化度の評価や、タンパク質の糖化を抑制ないし改善し得る薬剤の評価において、タンパク質を人工的に糖化した検体を比較対象として用いることが考えられる。すなわち、タンパク質の糖化過程に前記薬剤を作用させ、これを糖化ないし薬剤未処理検体等と糖化度を比較することにより、検体の糖化度及び薬剤作用が評価される。
毛髪のタンパク質を人工的に糖化する手段として、例えば、非特許文献１に、毛髪をグルコース溶液で処理することが報告されている。また、一般的に五炭糖が高いタンパク質糖化作用を有することが知られている。
しかしながら、グルコース等を用いて毛髪を糖化するには１０日以上に及ぶ長期間の処理を要するため、検体の準備を含めて簡易的に糖化度及び薬剤作用の評価を実施することは困難であった。
また、毛髪の糖化程度には個体差があるため、特に薬剤の効果を精密に評価するには多数の検体について試験を行うことが必須とされていた。
【非特許文献１】Nissimov et al., Journal of Immunological Methods, 320 (2007) p. 1-17
【特許文献１】特開平０６−３０７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記知見及び従来技術に鑑みて行なわれたものであり、タンパク質の糖化度、及びタンパク質の糖化を抑制・改善する薬剤の評価を簡便且つ迅速に行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らによる鋭意研究の結果、ケラチンフィルム化した毛髪を用いることにより、容易なタンパク質糖化度の評価が可能であり、しかも個体差によるデータのぶれを排除できることを見出した。また、本発明者らは、前記ケラチンフィルムをリボースで糖化することで、極めて短時間にタンパク質の糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価を行なうことができことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前記方法において、下記工程を備えることが好適である。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
また、本発明にかかる毛髪損傷度の評価方法は、前記方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明にかかるタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前期方法において、下記（１）〜（３）のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することが好適である。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、毛髪由来タンパク質の糖化度を簡便且つ迅速に測定・評価することが可能となる。また、複数個体の混合毛髪より得たケラチンフィルムを用いることにより、個体による測定値のばらつきを低減し、高精度のデータを得ることができる。
本発明は従来操作が煩雑で長時間を要していたタンパク質糖化度の評価を容易にすることから、糖尿病の治療・診断をはじめ、加齢に伴うタンパク質の糖化の研究や、タンパク質の糖化予防・抑制剤の開発において高い貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明にかかる方法は、毛髪からケラチンフィルムを製造してこれを検体とし、該検体の吸光度を比較測定することにより、その毛髪タンパク質の糖化度を相対的に評価することに基づいている。前記測定は通常の単離毛髪においても可能であるが、測定時間の短縮及び個体差による測定値のばらつきを抑制する観点から、本発明では特に毛髪由来のケラチンフィルムを用いることが好ましい。
以下、本発明をその手順に沿って説明する。
【００１１】
ケラチンフィルムの調製
まず、毛髪からケラチンフィルムを調製する方法について説明する。
毛髪から、それを構成するケラチンタンパク質群を抽出するために、タンパク質変性剤を用いる。タンパク質変性剤としては、尿素系の化合物が好ましく、例えば、尿素、チオ尿素、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらの尿素系タンパク質変性剤の１種または２種以上を混合して用いることが好ましい。より好ましくは、尿素とチオ尿素を混合して用いることである。尿素とチオ尿素を混合して用いる場合には、混合質量比が５：１〜１：２であることが好ましい。チオ尿素の混合比が前記範囲より少ないとタンパク質の変成作用が劣る場合があり、また前記範囲を超えると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向がある。
【００１２】
前記タンパク質変性剤は、毛髪サンプル処理液中の濃度が３０〜７０質量％であることが好ましい。３０質量％未満であると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向があり、また、７０質量％を超えて用いても増量による抽出率の向上の効果は認められず、さらに毛髪サンプル処理液の粘性が高くなり作業性が悪くなる場合がある。ここで、「毛髪サンプル処理液」とは、毛髪サンプルとタンパク質変性剤からなる毛髪ケラチンタンパク質溶解液、および後述する還元剤等を含み、ケラチンタンパク質群を抽出する製造過程の混合液を意味する。
前述のようにタンパク質変性剤を用いることにより、温和な条件で効率よくケラチンタンパク質群を毛髪から溶解させて抽出することが可能となる。
【００１３】
また、本発明に用いるケラチンフィルムを調製するにあたり、前記タンパク質変性剤と共に還元剤を併用する。還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリコール酸等のチオアルコール類が挙げられる。これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
還元剤を前記タンパク質変性剤と併用することにより、ケラチンタンパク質群の抽出率をさらに向上させることができる。これは、強固なケラチン繊維構造をタンパク質変性剤が変性させ、続いて還元剤がケラチンタンパク質間の強固なＳ−Ｓ結合を効率よく解離させ、さらに毛髪サンプル処理液中での再結合が起こりにくくするためと考えられる。
【００１４】
前記還元剤をタンパク質変性剤と併用する場合、毛髪サンプル処理液中０．５〜４０質量％の濃度で含有させることが好ましく、より好ましくは１〜２０質量％である。ただし、用いる還元剤の毛髪サンプル処理液中における溶解性により適宜決定されることが好ましい。
還元剤の濃度が０．５質量％未満であると、ケラチンタンパク質感の強固なＳ−Ｓ結合の還元切断が十分に行なわれない傾向があり、また、４０質量％の濃度を超えて使用すると毛髪処理液中でのケラチンタンパク質群の溶解性が悪くなる場合がある。
【００１５】
毛髪ケラチンタンパク質溶液を得るための処理時間は、処理温度にも左右されるが、１〜４日間であることが好ましい。また、処理温度は、２０〜６０℃であることが好ましい。２０℃未満であると反応の進行が遅くなり効率が悪く、６０℃を超えると、毛髪サンプル処理液がアルカリ性を呈しているため、ペプチド結合の切断や置換基変換、架橋等の副反応を伴う場合がある。
また、毛髪サンプルと毛髪サンプル処理液の比は、１〜１００ｍｇ毛髪サンプル／ｍｌ毛髪サンプル処理液であることが好ましい。
毛髪サンプル処理液は、ケラチンタンパク質が十分に抽出された後、ろ過により未抽出毛髪を除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液を得ることができる。
【００１６】
タンパク質変性剤と還元剤とを併用して毛髪サンプルを処理し、ろ過した後に得られる毛髪ケラチンタンパク質溶液の固体化またはゲル化のため、展開用溶液を接触させる。この固体化またはゲル化により、毛髪ケラチンタンパク質を本発明にかかるタンパク質の糖化度評価、ないしはタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価に適したフィルムとして成形することができる。
展開用溶液としては、例えば、トリクロロ酢酸、グアニジン塩酸、過塩素酸、およびそれらの誘導体等の変性剤と、水、生理食塩水、低級アルコール等の溶媒を混合して得られる変性剤溶液、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸およびそれらの塩等の酸性物質からなる賛成溶液が挙げられる。これらの１種または２種以上を用いることができる。本発明で用い得るケラチンフィルムの調製においては、展開溶液として過塩素酸溶液、グアニジン塩酸溶液、酢酸溶液、酢酸緩衝液から選択される１種または２種以上であることが好ましい。特に好ましくは、酢酸溶液または酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）である。
【００１７】
前記展開用溶液として用いる前記変性剤溶液の濃度は、１０〜６０質量％であることが好ましい。また、前記展開用溶液として用いる酸性溶液の濃度は、１０〜５００ｍＭであることが好ましい。
前記展開用溶液は、前記毛髪ケラチンタンパク質溶液のイオン強度を下げる作用を有し、これにより、毛髪サンプル処理液中のタンパク質変性剤、還元剤の溶解性の低下を招く。その結果、ケラチンタンパク質群の溶解性が低下、それに伴いケラチンタンパク質間のＳ−Ｓ結合が解離して−ＳＨ状態であったものが、再びＳ−Ｓ結合が再形成されて、短時間にケラチンタンパク質の固体化が進行することになる。
【００１８】
本発明で用いるケラチンフィルムを調製する場合、Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法またはＰｒｅ−ｃａｓｔ法を適用することができる。
Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法としては、シャーレ等の容器に予め前記展開用溶媒を満たしておき、これに毛髪ケラチンタンパク質溶液をキャストする方法（フォワード法）、または毛髪ケラチンタンパク質溶液を予め添加したシャーレ等の容器に、展開用溶液をキャストする方法（リバース法）が挙げられる。
Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法とは、予め毛髪ケラチンタンパク質に展開用溶媒を混合し、水を張ったシャーレ等の容器へ前記混合用液をキャストする方法である。
本発明においては、前記Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法及びＰｒｅ−ｃａｓｔ法のいずれの適用によっても、本発明にかかるタンパク質糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価方法に適した均一性に優れたケラチンフィルムを調製することができる。
特に、Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法に用いる展開用溶媒としては、酢酸溶液が好適に使用され得る。Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法においては、酢酸緩衝液が展開用溶媒として好適である。
また、還元剤としては、２−メルカプトエタノールがＰｏｓｔ−ｃａｓｔ法での使用に適し、ジチオスレイトールがＰｒｅ−ｃａｓｔ法での使用に適している。
展開用溶液は、毛髪ケラチンタンパク質溶液に対し１０〜１００００倍の質量比で用いることが好ましい。前記範囲内で展開用溶液を毛髪ケラチンタンパク質溶液に接触させることにより、適度な薄さを呈する薄膜を調製することができる。
【００１９】
シャーレ内に形成された薄膜状の毛髪ケラチンタンパク質成形品を前記展開用溶媒で洗浄する。洗浄の回数は特に限定されないが、１〜５回程度であることが好ましい。洗浄後、溶液を取り除き、シャーレ上の毛髪ケラチンタンパク質成形品を乾燥させ、ケラチンフィルムを得ることができる。乾燥の方法は特に限定されないが、埃がつかない室温下で静置することにより乾燥を行なうことなどが挙げられる。
【００２０】
ケラチンフィルムの調製に用いる毛髪サンプルは、油分が多く含まれているものもあり、処理前に予め脱脂しておいてもよい。脱脂の方法としては、例えばクロロホルムとメタノールの混合溶媒での処理等が挙げられるが、その他の慣用の方法を用いてもよく、特に制限されない。
【００２１】
上記ケラチンフィルムは、同一個体の毛髪から調製することもできるが、複数個体の混合毛髪から調製することもできる。
したがって、同一個体におけるタンパク質糖化度を評価することは勿論のこと、混合毛髪のフィルムを用いることで個体差によるデータのぶれを初めから排除し、薬剤の糖化抑制・改善作用を容易に評価することができる。
【００２２】
前記方法により得たケラチンフィルムは、乾燥させたフィルムをシャーレ等に入れ、吸光光度計を用いて可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定することで糖化度を測定することができる。前記ケラチンフィルムは、含有タンパク質の糖化度合が高くなる程白濁し、透明性が低下する。したがって、各ケラチンフィルムの吸光度を比較することにより、糖化度合を評価することができる。また、ケラチンフィルムの表面のくすみを目視で観察したり、反射強度を測定することによっても糖化度を評価することが可能である。
【００２３】
また、前記糖化度の評価において、ケラチンフィルムに糖化処理を施した糖化ケラチンフィルムを比較測定に用いることができる。
ケラチンフィルムの糖化処理は、特定条件下においてケラチンフィルムを糖類溶液に浸漬することによって為し得る。糖類溶液には五炭糖を用いることが好ましく、特にリボース、さらにはＤ−リボースの使用が好ましい。糖類溶液にリボースを適用することにより、タンパク質の糖化に汎用されるグルコース等に比べ、糖化に要する処理時間を著しく短縮することができる。
【００２４】
リボース溶液は、生理食塩水、リン酸緩衝液等の溶媒中に、リボースを０．５ｍM〜５Ｍ、より好ましくは５〜５００ｍＭの濃度で溶解して得たものが好ましい。リボース濃度が０．５ｍＭ未満であると糖化に要する時間が長くなる、もしくは毛髪の糖化が不十分となることがあり、リボース濃度が５Ｍを超えても糖化に要する時間や糖化の程度に一定以上の向上は認められない。
前記リボース溶液に浸漬された毛髪サンプルは、ｐH ７．０〜８．０、温度３０〜５０℃の条件下において１２時間〜１０日間インキュベートする。
前記濃度範囲のリボース溶液を用い、且つ前記ｐH及び温度条件を適用することにより、従来数日から数週間を要していた毛髪タンパク質の十分な糖化をほぼ１日で達成することが可能となる。
インキュベート終了後は、ケラチンフィルムを滅菌水等で十分に洗浄して付着したリボース溶液を完全に除去し、必要に応じて乾燥させて前記吸光度の測定に供する。
【００２５】
すなわち、上記糖化処理を施したケラチンフィルムを測定に用いる場合、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価は、下記工程を備えることが好ましい。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視領域における吸光度を測定する。
また、本発明者らの検討により、正常な毛髪は糖化度合が高くなる程損傷を受け、強度が低下する傾向にあることが明らかとなった。したがって、ケラチンフィルムの糖化度を指標として毛髪損傷度を評価することができると考えられる。
【００２６】
さらに、本発明においては、上記したタンパク質糖化度の評価を利用して、各種薬剤等のタンパク質の糖化抑制及び／または改善効果を評価することができる。薬剤の具体的な評価方法には、検体としてケラチンフィルムを用いること以外特に制限はなく、例えば、以下のようにして行なうことができる。
まず、同じ毛髪構混合物から得たケラチンフィルムについて、次の（１）〜（３）のサンプルを用意する。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
上記各サンプルの可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定し、（３）に対する（１）の糖化度合を指標に（２）の糖化度を評価することにより、評価薬剤のタンパク質糖化抑制・改善効果を計ることができる。
また、単に（１）及び（２）の糖化度を比較することで、薬剤の効果を評価してもよい。
評価薬剤は１つのサンプルに２種以上を添加してもよく、薬剤の種類や濃度を変えて（２）のサンプルを複数作成し、各々評価することも可能である。なお、（１）及び（２）におけるリボース溶液への浸漬は、前述の糖化処理条件に準じて行うことができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明にかかる評価方法を具体的に示すが、これらは一例であって本発明を何ら限定するものではない。
＜ケラチンフィルムによる糖化度の評価＞
下記方法により、毛髪由来のケラチンフィルムについて、吸光度とタンパク質の糖化における関係を試験した。
まず、本実施例において使用したケラチンフィルムの調製例を示す。
ケラチンフィルムの調製例１：Pre-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇへ、展開用溶媒６ｍｌを添加、混合し、この混合用液を蒸留水を満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
【００２８】
ケラチンフィルムの調製例２：Post-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して、毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇを、展開用溶媒６ｍｌを満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
【００２９】
ケラチンフィルムの糖化
上記で得たケラチンフィルムの一部を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
その後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸けて洗浄し、インキュベーター内で乾燥させて糖化したケラチンフィルムを得た。なお、前記洗浄中、滅菌水の交換を３回行なった。
【００３０】
吸光度の測定
上記で得た糖化したケラチンフィルムと、未糖化処理のケラチンフィルムとを、それぞれシャーレに入れ、吸光光度計（POWERSCAN HT、大日本製薬社製）にて２００〜８００ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、コントロールとして、シャーレのみの吸光度についても測定を行なった。結果を図１に示す。また、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における糖化及び未糖化ケラチンフィルムの吸光度をそれぞれ積算した結果を図２に示す。
【００３１】
図１に示すとおり、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）において、糖化フィルムと未糖化フィルム共に、波長の上昇に伴い吸光度（ＯＤ）が低下する傾向を示したが、両者の値には明らかな差が認められた。この糖化フィルム及び未糖化フィルムにおける吸光度の差は、図２に示した両者の積算値を比較することにより、さらに明瞭となった。すなわち、毛髪由来のケラチンフィルムは、糖化により可視光領域における吸光度が上昇する。
以上のことから、毛髪由来のケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定することにより、毛髪タンパク質の糖化度を評価することができる。また、前記ケラチンフィルムをリボースで処理することによって、容易にタンパク質の糖化サンプルが得られることが明らかである。
【００３２】
＜糖化度と毛髪損傷の関係＞
次の方法により加齢と毛髪の糖化における関係を試験した。
１０〜６０代の男性被験者８４名から毛髪を１０本ずつ採取し、各毛髪の根元から３ｍｍを混合したものをサンプルとした。各サンプルを特開平０６−３０７９１号公報に記載の方法に準じてヒドラジン処理後、発色試薬と反応させ、糖化タンパク質の比色定量を行った。年代ごとに糖化度の平均値（相対値）と標準偏差を算出した結果を図３に示す。
【００３３】
図３に示すとおり、５０代及び６０代の毛髪の糖化度は、２０代〜４０代の毛髪よりも高いことが明らかになった。この結果から、男性の毛髪は、加齢に伴って糖化が進む傾向にあることが認められる。
【００３４】
続いて、次の方法により毛髪の強度と糖化における関係を試験した。
被験者３名から毛髪（先端２ｃｍ）をそれぞれ採取し、を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら７２時間インキュベートした。その後、毛髪を滅菌水に２４時間浸けて洗浄を行ない、乾燥させて糖化毛髪を得た（洗浄中、滅菌水は３回交換した）。
前記糖化毛髪と、同一被験者から得た未糖化毛髪とを、それぞれ水中における引っ張り試験（KES-G1-SH, カトーテック社製）に供し、両者の破断までに要する積算荷重（ｇｆ／Ｐ・mm２）を比較した。結果を図４に示す（Ｐ＜０．００５）。
【００３５】
図４に示すとおり、糖化毛髪は未糖化毛髪に比べ、引っ張り強度に有意な低下が認められた。すなわち、毛髪は糖化により損傷を受け、破断し易くなったと考えられる。
以上の試験結果に鑑みると、加齢と毛髪損傷の関係、あるいは加齢または毛髪損傷それぞれの検討において、糖化度はその指標として広く用い得るものと認められる。
【００３６】
＜タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価＞
下記各評価方法により、Ｌ−アルギニンのタンパク質糖化抑制効果を検討した。評価方法は次のとおりである。
実施例１
上記調製方法により得たケラチンフィルム１２枚を、下記表１に示す構成の溶液へそれぞれ浸漬した。各サンプルは３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
インキュベート後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸け、洗浄を行なった（洗浄中、滅菌水を３回交換した）。
洗浄後、各ケラチンフィルムをデシケーター内で乾燥し、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）の吸光度を測定した。吸光度に基づく糖化度の評価結果を図５に示す。なお、図５における糖化量は、糖液及び薬剤処理を行ったサンプル４〜６（Ｌ−アルギニン未添加）、サンプル７〜９（Ｌ−アルギニン０．１％添加）、サンプル１０〜１２（Ｌ−アルギニン１％添加）それぞれの可視光領域の吸光度積算値から、未処理サンプル（サンプル１〜３）の可視光領域の吸光度積算値を引いた差を示す。
【００３７】
（表１）
【００３８】
また、同様に、Ｌ−リシンについてもタンパク質糖化抑制効果を評価した。
実施例２
上記実施例１と同様の方法を用い、表１のＬ−アルギニンをＬ−リシン塩酸塩に替えて評価を行なった。結果を図５に示す。
【００３９】
図５に示すとおり、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシンを添加した糖類溶液で処理したケラチンフィルムは、前記薬剤を添加しない糖類溶液で処理したケラチンフィルムに比べ、糖化量が抑制されていた。したがって、ケラチンフィルムを検体として用いることによって、薬剤のタンパク質の糖化抑制効果を簡便な操作で迅速に評価することができると認められる。
また、この結果から、アルギニン及びリジンが毛髪タンパク質の糖化抑制効果を有することが分かった。さらに詳細な検討を行った結果、アルギニン及び／またはリジンを毛髪化粧料に配合する場合、その配合量は、化粧料に対しそれぞれ０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であることが明らかになった。
【００４０】
以下、タンパク質の糖化抑制剤としてアルギニンまたはリジンを配合した毛髪化粧料の処方例を示すが、これらは本発明を何ら制限するものではない。
処方例１〜４の毛髪化粧料は全て、毛髪ケラチンフィルムによる本発明にかかる評価方法により、優れたタンパク質の糖化抑制作用を有することが示された。
【００４１】
＜処方例１ 育毛料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．１
エタノール ６０
ジプロピレングリコール ２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
乳酸 適 量
乳酸ナトリウム液 適 量
グリチルリチン酸モノアンモニウム ０．１
ニコチン酸アミド ０．１
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール ０．１
Ｌ−メントール ０．２
色素 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
【００４２】
＜処方例２ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．１
揮発性イソパラフィン １４
ジメチルポリシロキサン ８
エタノール 適 量
精製水 ２
高重合ジメチルシロキサン・メチル（アミノプロピル）シロキサン共重合体
４
ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）・メチルポリシロキサン共重合体
４
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝４０／６０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．１１５ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
【００４３】
＜処方例３ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．０１
流動パラフィン ６
ジメチルポリシロキサン ５
グリセリン ８
プロピレングリコール ８
ブチルエチルプロパンジオール ０．５
ホホバ油 １
カルナウバロウ ５
イソステアリン酸 ０．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル ５
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
８
フェノキシエタノール ０．５
高重合ジメチルポリシロキサン ０．５
精製水 残 余
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝９０／１０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．４３ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
【００４４】
＜処方例４ シャンプー＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．０１
ジステアリン酸エチレングリコール １．５
ヤシ油脂肪酸エタノールアミド ５．５
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム ８
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン ５
ポリマーＪＲ−４００（ユニオンカーバイド社製） ０．５
クエン酸 ０．５
塩化ナトリウム １．２
ビワ葉エキス ０．１
フェノキシエタノール ０．１
安息香酸ナトリウム 適 量
エデト酸２ナトリウム 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】糖化したケラチンフィルム、未糖化ケラチンフィルム、及びコントロールにおける波長に対する吸光度変化を示したグラフである。
【図２】糖化したケラチンフィルム及び未糖化ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度の積算値を示すグラフである。
【図３】各年代の男性の毛髪における糖化度の平均値（相対値）と標準偏差を示すグラフである。
【図４】未糖化毛髪及び糖化毛髪の引っ張り強度を示すグラフである。
【図５】アルギニン及びリジンの糖化抑制効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の糖化度の評価方法及びタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法に関し、特にその簡便化及び迅速化に関する。
【背景技術】
【０００２】
食事によって過剰に摂取し、血液中の糖度が上昇すると、ブドウ糖のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基が重合反応を起こし、各組織においてタンパク質が糖化される。このようなタンパク質の糖化は、糖尿病患者において特に顕著に認められ、例えば、動脈硬化（血管タンパク質の糖化）、白内障（水晶体タンパク質の糖化）、皮膚弾力の低下（皮膚コラーゲンの糖化）等の合併症の原因であることが知られてきた。
そのため、糖化タンパク質の測定は糖尿病の治療や診断の一つとして従来利用されてきた。糖尿病の治療ないし診断の手段として汎用されている糖化タンパク質の測定方法は、尿ないし血液を検体として用いた方法が主である。これらの測定方法は病気の診断を主眼としたものであるため、患者からの尿や血液の採取をはじめ、煩雑な処理や精密な測定を要する。
【０００３】
ところで、糖尿病患者において、前記診断にかかる血液中のタンパク質と同様に、毛髪のタンパク質もまた糖化されていることが知られている（特許文献１）。さらに驚くべきことに、本発明者らは、非糖尿病患者においても加齢に伴って毛髪のケラチンタンパク質が糖化される傾向にあることを見出した。従来、加齢により血糖度が上昇することは知られていたが、毛髪ケラチンにおいても同様の傾向が認められることは知られていなかった。また、本発明者らは、このようなタンパク質の糖化が毛髪を切れ易くしたり、毛髪表面をくすませるといった変化を引き起こすことをも見出した。
これらの知見から、毛髪ケラチンの糖化度を評価することは、従来のように糖尿病の治療及び診断に寄与するだけでなく、基礎的な加齢研究、ないしは広く行なわれているアンチエイジングに関する評価に極めて貢献し得ると考えられる。
【０００４】
なお、毛髪における糖化タンパク質の測定法については、例えば、先に挙げた特許文献１に記載がある。この測定方法は、毛髪をヒドラジンで処理し、その後発色試薬（フェニルヒドラジン）と反応させて比色定量するというものであり、これまでの糖化タンパク質の比色法に比べ、測定の簡便さ及び迅速さに優れていることが報告されている。
しかしながら、前記測定法においても、毛髪に数段階の前処理を施すことが必要とされ、毛髪におけるタンパク質の糖化度をより容易に評価する方法は、未だ開発されていない。
【０００５】
また、タンパク質糖化度の評価や、タンパク質の糖化を抑制ないし改善し得る薬剤の評価において、タンパク質を人工的に糖化した検体を比較対象として用いることが考えられる。すなわち、タンパク質の糖化過程に前記薬剤を作用させ、これを糖化ないし薬剤未処理検体等と糖化度を比較することにより、検体の糖化度及び薬剤作用が評価される。
毛髪のタンパク質を人工的に糖化する手段として、例えば、非特許文献１に、毛髪をグルコース溶液で処理することが報告されている。また、一般的に五炭糖が高いタンパク質糖化作用を有することが知られている。
しかしながら、グルコース等を用いて毛髪を糖化するには１０日以上に及ぶ長期間の処理を要するため、検体の準備を含めて簡易的に糖化度及び薬剤作用の評価を実施することは困難であった。
また、毛髪の糖化程度には個体差があるため、特に薬剤の効果を精密に評価するには多数の検体について試験を行うことが必須とされていた。
【非特許文献１】Nissimov et al., Journal of Immunological Methods, 320 (2007) p. 1-17
【特許文献１】特開平０６−３０７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記知見及び従来技術に鑑みて行なわれたものであり、タンパク質の糖化度、及びタンパク質の糖化を抑制・改善する薬剤の評価を簡便且つ迅速に行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らによる鋭意研究の結果、ケラチンフィルム化した毛髪を用いることにより、容易なタンパク質糖化度の評価が可能であり、しかも個体差によるデータのぶれを排除できることを見出した。また、本発明者らは、前記ケラチンフィルムをリボースで糖化することで、極めて短時間にタンパク質の糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価を行なうことができことを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前記方法において、下記工程を備えることが好適である。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
また、本発明にかかる毛髪損傷度の評価方法は、前記方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明にかかるタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前期方法において、下記（１）〜（３）のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することが好適である。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、毛髪由来タンパク質の糖化度を簡便且つ迅速に測定・評価することが可能となる。また、複数個体の混合毛髪より得たケラチンフィルムを用いることにより、個体による測定値のばらつきを低減し、高精度のデータを得ることができる。
本発明は従来操作が煩雑で長時間を要していたタンパク質糖化度の評価を容易にすることから、糖尿病の治療・診断をはじめ、加齢に伴うタンパク質の糖化の研究や、タンパク質の糖化予防・抑制剤の開発において高い貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明にかかる方法は、毛髪からケラチンフィルムを製造してこれを検体とし、該検体の吸光度を比較測定することにより、その毛髪タンパク質の糖化度を相対的に評価することに基づいている。前記測定は通常の単離毛髪においても可能であるが、測定時間の短縮及び個体差による測定値のばらつきを抑制する観点から、本発明では特に毛髪由来のケラチンフィルムを用いることが好ましい。
以下、本発明をその手順に沿って説明する。
【００１１】
ケラチンフィルムの調製
まず、毛髪からケラチンフィルムを調製する方法について説明する。
毛髪から、それを構成するケラチンタンパク質群を抽出するために、タンパク質変性剤を用いる。タンパク質変性剤としては、尿素系の化合物が好ましく、例えば、尿素、チオ尿素、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらの尿素系タンパク質変性剤の１種または２種以上を混合して用いることが好ましい。より好ましくは、尿素とチオ尿素を混合して用いることである。尿素とチオ尿素を混合して用いる場合には、混合質量比が５：１〜１：２であることが好ましい。チオ尿素の混合比が前記範囲より少ないとタンパク質の変成作用が劣る場合があり、また前記範囲を超えると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向がある。
【００１２】
前記タンパク質変性剤は、毛髪サンプル処理液中の濃度が３０〜７０質量％であることが好ましい。３０質量％未満であると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向があり、また、７０質量％を超えて用いても増量による抽出率の向上の効果は認められず、さらに毛髪サンプル処理液の粘性が高くなり作業性が悪くなる場合がある。ここで、「毛髪サンプル処理液」とは、毛髪サンプルとタンパク質変性剤からなる毛髪ケラチンタンパク質溶解液、および後述する還元剤等を含み、ケラチンタンパク質群を抽出する製造過程の混合液を意味する。
前述のようにタンパク質変性剤を用いることにより、温和な条件で効率よくケラチンタンパク質群を毛髪から溶解させて抽出することが可能となる。
【００１３】
また、本発明に用いるケラチンフィルムを調製するにあたり、前記タンパク質変性剤と共に還元剤を併用する。還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリコール酸等のチオアルコール類が挙げられる。これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
還元剤を前記タンパク質変性剤と併用することにより、ケラチンタンパク質群の抽出率をさらに向上させることができる。これは、強固なケラチン繊維構造をタンパク質変性剤が変性させ、続いて還元剤がケラチンタンパク質間の強固なＳ−Ｓ結合を効率よく解離させ、さらに毛髪サンプル処理液中での再結合が起こりにくくするためと考えられる。
【００１４】
前記還元剤をタンパク質変性剤と併用する場合、毛髪サンプル処理液中０．５〜４０質量％の濃度で含有させることが好ましく、より好ましくは１〜２０質量％である。ただし、用いる還元剤の毛髪サンプル処理液中における溶解性により適宜決定されることが好ましい。
還元剤の濃度が０．５質量％未満であると、ケラチンタンパク質感の強固なＳ−Ｓ結合の還元切断が十分に行なわれない傾向があり、また、４０質量％の濃度を超えて使用すると毛髪処理液中でのケラチンタンパク質群の溶解性が悪くなる場合がある。
【００１５】
毛髪ケラチンタンパク質溶液を得るための処理時間は、処理温度にも左右されるが、１〜４日間であることが好ましい。また、処理温度は、２０〜６０℃であることが好ましい。２０℃未満であると反応の進行が遅くなり効率が悪く、６０℃を超えると、毛髪サンプル処理液がアルカリ性を呈しているため、ペプチド結合の切断や置換基変換、架橋等の副反応を伴う場合がある。
また、毛髪サンプルと毛髪サンプル処理液の比は、１〜１００ｍｇ毛髪サンプル／ｍｌ毛髪サンプル処理液であることが好ましい。
毛髪サンプル処理液は、ケラチンタンパク質が十分に抽出された後、ろ過により未抽出毛髪を除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液を得ることができる。
【００１６】
タンパク質変性剤と還元剤とを併用して毛髪サンプルを処理し、ろ過した後に得られる毛髪ケラチンタンパク質溶液の固体化またはゲル化のため、展開用溶液を接触させる。この固体化またはゲル化により、毛髪ケラチンタンパク質を本発明にかかるタンパク質の糖化度評価、ないしはタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価に適したフィルムとして成形することができる。
展開用溶液としては、例えば、トリクロロ酢酸、グアニジン塩酸、過塩素酸、およびそれらの誘導体等の変性剤と、水、生理食塩水、低級アルコール等の溶媒を混合して得られる変性剤溶液、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸およびそれらの塩等の酸性物質からなる賛成溶液が挙げられる。これらの１種または２種以上を用いることができる。本発明で用い得るケラチンフィルムの調製においては、展開溶液として過塩素酸溶液、グアニジン塩酸溶液、酢酸溶液、酢酸緩衝液から選択される１種または２種以上であることが好ましい。特に好ましくは、酢酸溶液または酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）である。
【００１７】
前記展開用溶液として用いる前記変性剤溶液の濃度は、１０〜６０質量％であることが好ましい。また、前記展開用溶液として用いる酸性溶液の濃度は、１０〜５００ｍＭであることが好ましい。
前記展開用溶液は、前記毛髪ケラチンタンパク質溶液のイオン強度を下げる作用を有し、これにより、毛髪サンプル処理液中のタンパク質変性剤、還元剤の溶解性の低下を招く。その結果、ケラチンタンパク質群の溶解性が低下、それに伴いケラチンタンパク質間のＳ−Ｓ結合が解離して−ＳＨ状態であったものが、再びＳ−Ｓ結合が再形成されて、短時間にケラチンタンパク質の固体化が進行することになる。
【００１８】
本発明で用いるケラチンフィルムを調製する場合、Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法またはＰｒｅ−ｃａｓｔ法を適用することができる。
Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法としては、シャーレ等の容器に予め前記展開用溶媒を満たしておき、これに毛髪ケラチンタンパク質溶液をキャストする方法（フォワード法）、または毛髪ケラチンタンパク質溶液を予め添加したシャーレ等の容器に、展開用溶液をキャストする方法（リバース法）が挙げられる。
Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法とは、予め毛髪ケラチンタンパク質に展開用溶媒を混合し、水を張ったシャーレ等の容器へ前記混合用液をキャストする方法である。
本発明においては、前記Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法及びＰｒｅ−ｃａｓｔ法のいずれの適用によっても、本発明にかかるタンパク質糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価方法に適した均一性に優れたケラチンフィルムを調製することができる。
特に、Ｐｒｅ−ｃａｓｔ法に用いる展開用溶媒としては、酢酸溶液が好適に使用され得る。Ｐｏｓｔ−ｃａｓｔ法においては、酢酸緩衝液が展開用溶媒として好適である。
また、還元剤としては、２−メルカプトエタノールがＰｏｓｔ−ｃａｓｔ法での使用に適し、ジチオスレイトールがＰｒｅ−ｃａｓｔ法での使用に適している。
展開用溶液は、毛髪ケラチンタンパク質溶液に対し１０〜１００００倍の質量比で用いることが好ましい。前記範囲内で展開用溶液を毛髪ケラチンタンパク質溶液に接触させることにより、適度な薄さを呈する薄膜を調製することができる。
【００１９】
シャーレ内に形成された薄膜状の毛髪ケラチンタンパク質成形品を前記展開用溶媒で洗浄する。洗浄の回数は特に限定されないが、１〜５回程度であることが好ましい。洗浄後、溶液を取り除き、シャーレ上の毛髪ケラチンタンパク質成形品を乾燥させ、ケラチンフィルムを得ることができる。乾燥の方法は特に限定されないが、埃がつかない室温下で静置することにより乾燥を行なうことなどが挙げられる。
【００２０】
ケラチンフィルムの調製に用いる毛髪サンプルは、油分が多く含まれているものもあり、処理前に予め脱脂しておいてもよい。脱脂の方法としては、例えばクロロホルムとメタノールの混合溶媒での処理等が挙げられるが、その他の慣用の方法を用いてもよく、特に制限されない。
【００２１】
上記ケラチンフィルムは、同一個体の毛髪から調製することもできるが、複数個体の混合毛髪から調製することもできる。
したがって、同一個体におけるタンパク質糖化度を評価することは勿論のこと、混合毛髪のフィルムを用いることで個体差によるデータのぶれを初めから排除し、薬剤の糖化抑制・改善作用を容易に評価することができる。
【００２２】
前記方法により得たケラチンフィルムは、乾燥させたフィルムをシャーレ等に入れ、吸光光度計を用いて可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定することで糖化度を測定することができる。前記ケラチンフィルムは、含有タンパク質の糖化度合が高くなる程白濁し、透明性が低下する。したがって、各ケラチンフィルムの吸光度を比較することにより、糖化度合を評価することができる。また、ケラチンフィルムの表面のくすみを目視で観察したり、反射強度を測定することによっても糖化度を評価することが可能である。
【００２３】
また、前記糖化度の評価において、ケラチンフィルムに糖化処理を施した糖化ケラチンフィルムを比較測定に用いることができる。
ケラチンフィルムの糖化処理は、特定条件下においてケラチンフィルムを糖類溶液に浸漬することによって為し得る。糖類溶液には五炭糖を用いることが好ましく、特にリボース、さらにはＤ−リボースの使用が好ましい。糖類溶液にリボースを適用することにより、タンパク質の糖化に汎用されるグルコース等に比べ、糖化に要する処理時間を著しく短縮することができる。
【００２４】
リボース溶液は、生理食塩水、リン酸緩衝液等の溶媒中に、リボースを０．５ｍM〜５Ｍ、より好ましくは５〜５００ｍＭの濃度で溶解して得たものが好ましい。リボース濃度が０．５ｍＭ未満であると糖化に要する時間が長くなる、もしくは毛髪の糖化が不十分となることがあり、リボース濃度が５Ｍを超えても糖化に要する時間や糖化の程度に一定以上の向上は認められない。
前記リボース溶液に浸漬された毛髪サンプルは、ｐH ７．０〜８．０、温度３０〜５０℃の条件下において１２時間〜１０日間インキュベートする。
前記濃度範囲のリボース溶液を用い、且つ前記ｐH及び温度条件を適用することにより、従来数日から数週間を要していた毛髪タンパク質の十分な糖化をほぼ１日で達成することが可能となる。
インキュベート終了後は、ケラチンフィルムを滅菌水等で十分に洗浄して付着したリボース溶液を完全に除去し、必要に応じて乾燥させて前記吸光度の測定に供する。
【００２５】
すなわち、上記糖化処理を施したケラチンフィルムを測定に用いる場合、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価は、下記工程を備えることが好ましい。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視領域における吸光度を測定する。
また、本発明者らの検討により、正常な毛髪は糖化度合が高くなる程損傷を受け、強度が低下する傾向にあることが明らかとなった。したがって、ケラチンフィルムの糖化度を指標として毛髪損傷度を評価することができると考えられる。
【００２６】
さらに、本発明においては、上記したタンパク質糖化度の評価を利用して、各種薬剤等のタンパク質の糖化抑制及び／または改善効果を評価することができる。薬剤の具体的な評価方法には、検体としてケラチンフィルムを用いること以外特に制限はなく、例えば、以下のようにして行なうことができる。
まず、同じ毛髪構混合物から得たケラチンフィルムについて、次の（１）〜（３）のサンプルを用意する。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
上記各サンプルの可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における吸光度を測定し、（３）に対する（１）の糖化度合を指標に（２）の糖化度を評価することにより、評価薬剤のタンパク質糖化抑制・改善効果を計ることができる。
また、単に（１）及び（２）の糖化度を比較することで、薬剤の効果を評価してもよい。
評価薬剤は１つのサンプルに２種以上を添加してもよく、薬剤の種類や濃度を変えて（２）のサンプルを複数作成し、各々評価することも可能である。なお、（１）及び（２）におけるリボース溶液への浸漬は、前述の糖化処理条件に準じて行うことができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明にかかる評価方法を具体的に示すが、これらは一例であって本発明を何ら限定するものではない。
＜ケラチンフィルムによる糖化度の評価＞
下記方法により、毛髪由来のケラチンフィルムについて、吸光度とタンパク質の糖化における関係を試験した。
まず、本実施例において使用したケラチンフィルムの調製例を示す。
ケラチンフィルムの調製例１：Pre-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇへ、展開用溶媒６ｍｌを添加、混合し、この混合用液を蒸留水を満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
【００２８】
ケラチンフィルムの調製例２：Post-cast
毛髪サンプル６００ｍｇを、尿素及びチオ尿素、還元剤、２５ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH８．５）８ｍｌを含む混合液に浸漬し、これを５０℃にて４日間保持して、毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液３．５ｍｇを、展開用溶媒６ｍｌを満たしたシャーレ（直径３５ｍｍ）へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
【００２９】
ケラチンフィルムの糖化
上記で得たケラチンフィルムの一部を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
その後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸けて洗浄し、インキュベーター内で乾燥させて糖化したケラチンフィルムを得た。なお、前記洗浄中、滅菌水の交換を３回行なった。
【００３０】
吸光度の測定
上記で得た糖化したケラチンフィルムと、未糖化処理のケラチンフィルムとを、それぞれシャーレに入れ、吸光光度計（POWERSCAN HT、大日本製薬社製）にて２００〜８００ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、コントロールとして、シャーレのみの吸光度についても測定を行なった。結果を図１に示す。また、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）における糖化及び未糖化ケラチンフィルムの吸光度をそれぞれ積算した結果を図２に示す。
【００３１】
図１に示すとおり、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）において、糖化フィルムと未糖化フィルム共に、波長の上昇に伴い吸光度（ＯＤ）が低下する傾向を示したが、両者の値には明らかな差が認められた。この糖化フィルム及び未糖化フィルムにおける吸光度の差は、図２に示した両者の積算値を比較することにより、さらに明瞭となった。すなわち、毛髪由来のケラチンフィルムは、糖化により可視光領域における吸光度が上昇する。
以上のことから、毛髪由来のケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定することにより、毛髪タンパク質の糖化度を評価することができる。また、前記ケラチンフィルムをリボースで処理することによって、容易にタンパク質の糖化サンプルが得られることが明らかである。
【００３２】
＜糖化度と毛髪損傷の関係＞
次の方法により加齢と毛髪の糖化における関係を試験した。
１０〜６０代の男性被験者８４名から毛髪を１０本ずつ採取し、各毛髪の根元から３ｍｍを混合したものをサンプルとした。各サンプルを特開平０６−３０７９１号公報に記載の方法に準じてヒドラジン処理後、発色試薬と反応させ、糖化タンパク質の比色定量を行った。年代ごとに糖化度の平均値（相対値）と標準偏差を算出した結果を図３に示す。
【００３３】
図３に示すとおり、５０代及び６０代の毛髪の糖化度は、２０代〜４０代の毛髪よりも高いことが明らかになった。この結果から、男性の毛髪は、加齢に伴って糖化が進む傾向にあることが認められる。
【００３４】
続いて、次の方法により毛髪の強度と糖化における関係を試験した。
被験者３名から毛髪（先端２ｃｍ）をそれぞれ採取し、を３０ｍＭのＤ−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）へ浸漬し、これを３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら７２時間インキュベートした。その後、毛髪を滅菌水に２４時間浸けて洗浄を行ない、乾燥させて糖化毛髪を得た（洗浄中、滅菌水は３回交換した）。
前記糖化毛髪と、同一被験者から得た未糖化毛髪とを、それぞれ水中における引っ張り試験（KES-G1-SH, カトーテック社製）に供し、両者の破断までに要する積算荷重（ｇｆ／Ｐ・mm２）を比較した。結果を図４に示す（Ｐ＜０．００５）。
【００３５】
図４に示すとおり、糖化毛髪は未糖化毛髪に比べ、引っ張り強度に有意な低下が認められた。すなわち、毛髪は糖化により損傷を受け、破断し易くなったと考えられる。
以上の試験結果に鑑みると、加齢と毛髪損傷の関係、あるいは加齢または毛髪損傷それぞれの検討において、糖化度はその指標として広く用い得るものと認められる。
【００３６】
＜タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価＞
下記各評価方法により、Ｌ−アルギニンのタンパク質糖化抑制効果を検討した。評価方法は次のとおりである。
実施例１
上記調製方法により得たケラチンフィルム１２枚を、下記表１に示す構成の溶液へそれぞれ浸漬した。各サンプルは３７℃で振とう（３０〜４０ｒｐｍ）しながら２４時間インキュベートした。
インキュベート後、ケラチンフィルムを滅菌水に２４時間浸け、洗浄を行なった（洗浄中、滅菌水を３回交換した）。
洗浄後、各ケラチンフィルムをデシケーター内で乾燥し、可視光領域（４００〜８００ｎｍ）の吸光度を測定した。吸光度に基づく糖化度の評価結果を図５に示す。なお、図５における糖化量は、糖液及び薬剤処理を行ったサンプル４〜６（Ｌ−アルギニン未添加）、サンプル７〜９（Ｌ−アルギニン０．１％添加）、サンプル１０〜１２（Ｌ−アルギニン１％添加）それぞれの可視光領域の吸光度積算値から、未処理サンプル（サンプル１〜３）の可視光領域の吸光度積算値を引いた差を示す。
【００３７】
（表１）
【００３８】
また、同様に、Ｌ−リシンについてもタンパク質糖化抑制効果を評価した。
実施例２
上記実施例１と同様の方法を用い、表１のＬ−アルギニンをＬ−リシン塩酸塩に替えて評価を行なった。結果を図５に示す。
【００３９】
図５に示すとおり、Ｌ−アルギニンまたはＬ−リシンを添加した糖類溶液で処理したケラチンフィルムは、前記薬剤を添加しない糖類溶液で処理したケラチンフィルムに比べ、糖化量が抑制されていた。したがって、ケラチンフィルムを検体として用いることによって、薬剤のタンパク質の糖化抑制効果を簡便な操作で迅速に評価することができると認められる。
また、この結果から、アルギニン及びリジンが毛髪タンパク質の糖化抑制効果を有することが分かった。さらに詳細な検討を行った結果、アルギニン及び／またはリジンを毛髪化粧料に配合する場合、その配合量は、化粧料に対しそれぞれ０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％であることが明らかになった。
【００４０】
以下、タンパク質の糖化抑制剤としてアルギニンまたはリジンを配合した毛髪化粧料の処方例を示すが、これらは本発明を何ら制限するものではない。
処方例１〜４の毛髪化粧料は全て、毛髪ケラチンフィルムによる本発明にかかる評価方法により、優れたタンパク質の糖化抑制作用を有することが示された。
【００４１】
＜処方例１ 育毛料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．１
エタノール ６０
ジプロピレングリコール ２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
乳酸 適 量
乳酸ナトリウム液 適 量
グリチルリチン酸モノアンモニウム ０．１
ニコチン酸アミド ０．１
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール ０．１
Ｌ−メントール ０．２
色素 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
【００４２】
＜処方例２ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．１
揮発性イソパラフィン １４
ジメチルポリシロキサン ８
エタノール 適 量
精製水 ２
高重合ジメチルシロキサン・メチル（アミノプロピル）シロキサン共重合体
４
ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）・メチルポリシロキサン共重合体
４
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝４０／６０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．１１５ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
【００４３】
＜処方例３ 頭髪用化粧料＞
（配合成分） （質量％）
Ｌ−アルギニン ０．０１
流動パラフィン ６
ジメチルポリシロキサン ５
グリセリン ８
プロピレングリコール ８
ブチルエチルプロパンジオール ０．５
ホホバ油 １
カルナウバロウ ５
イソステアリン酸 ０．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル ５
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
８
フェノキシエタノール ０．５
高重合ジメチルポリシロキサン ０．５
精製水 残 余
香料 適 量
（製造方法）
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し（原液／噴射剤＝９０／１０（Ｌ．Ｐ．Ｇ． ０．４３ＭＰａ））、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
【００４４】
＜処方例４ シャンプー＞
（配合成分） （質量％）
塩酸Ｌ−リジン ０．０１
ジステアリン酸エチレングリコール １．５
ヤシ油脂肪酸エタノールアミド ５．５
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム ８
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン ５
ポリマーＪＲ−４００（ユニオンカーバイド社製） ０．５
クエン酸 ０．５
塩化ナトリウム １．２
ビワ葉エキス ０．１
フェノキシエタノール ０．１
安息香酸ナトリウム 適 量
エデト酸２ナトリウム 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】糖化したケラチンフィルム、未糖化ケラチンフィルム、及びコントロールにおける波長に対する吸光度変化を示したグラフである。
【図２】糖化したケラチンフィルム及び未糖化ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度の積算値を示すグラフである。
【図３】各年代の男性の毛髪における糖化度の平均値（相対値）と標準偏差を示すグラフである。
【図４】未糖化毛髪及び糖化毛髪の引っ張り強度を示すグラフである。
【図５】アルギニン及びリジンの糖化抑制効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質糖化度の評価方法。
【請求項２】
下記工程を備えることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質糖化度の評価方法。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする毛髪損傷度の評価方法。
【請求項４】
毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
【請求項５】
下記（１）〜（３）のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
【請求項１】
毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質糖化度の評価方法。
【請求項２】
下記工程を備えることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質糖化度の評価方法。
（Ｉ）ケラチンフィルムをリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬する。
（ＩＩ）ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする毛髪損傷度の評価方法。
【請求項４】
毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
【請求項５】
下記（１）〜（３）のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
（１）リボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（２）評価薬剤を添加したリボース溶液中に１２時間〜１０日間浸漬したケラチンフィルム。
（３）未処理のケラチンフィルム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２３８０（Ｐ２０１０−２３８０Ａ）
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６３２３１（Ｐ２００８−１６３２３１）
【出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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