タンパク質抽出方法
【課題】 生体の状態を反映するタンパク質をヒト皮膚の角層から迅速かつ簡便に抽出し、高感度に分析する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】 テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
【解決手段】 テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚からテープストリッピング法を利用してタンパク質を抽出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現が、生体の状態を反映することが知られており、タンパク質の発現を調べて、生体の状態を評価するために、簡便、かつ、迅速にタンパク質を抽出する方法が必要とされている。手術で切り取ったヒトの皮膚を免疫染色することにより、maspinが老化に伴い増加することが見出されている（非特許文献１：NICKOLOFF,B.J. et al., Cancer Research, (2004), Vol.64, pp.2956-2961）。ヒト前腕の皮膚を切り取り、［３５Ｓ］メチオニンで同位体ラベルし、２次元電気泳動で測定することにより、加齢に伴ってMx-A、Mn-SOD、tryptophanyl-tRNA synthetase、the p85β subunit of phosphatidylinositol 3-kinase、the proteasome regulator PA28-α、the eukaryotic initiation factor 5A, NM23H2, cyclophilin A and its variant, proteasomal protein SSP 0107, HSP60の発現が増加し、annexin I, plasminogen activator inhibitor 2の発現が減少することが見出されている（非特許文献２：GROMOV, P. et al., Mol. Cell. Proteomics, (2003), Vol.2, No.2, pp.70-84）。ヒトさい帯静脈内皮細胞のタンパク質を２次元電気泳動法で分析することにより、老化に伴ってcytokeratin 7が減少することが見出されている（非特許文献３：Martina Wei-Fen CHANG et al., Experimental Cell Res., (Jun.2005), Vol.309, pp.121-136）。免疫染色法により表皮細胞中のcytokeratin 15が老化に伴って減少することが見出されている（非特許文献４：LYLE, S. et al., J. Invest. Dermatol., (1999), Vol.112, No.4, pp.623）。しかしながら、これらの研究は手術で切り取った皮膚やヒトさい帯静脈内皮細胞、あるいは培養細胞を用いており、一般人の老化の状態を簡便に評価することは困難である。これらの老化に伴って変化するタンパク質を抗体を用いて分析するにあたり、迅速、かつ、簡便に抽出する方法は開発されていない。
アトピー患者及び非アトピー患者の皮膚を切り取り、２次元電気泳動法を用いてアトピー患者に多く発現するタンパク質、少なく発現するタンパク質が見出されている。（非特許文献５：PARK YD, et al., Proteomics, 2004, vol.4, no.11, pp.3446-3455）。タンパク質の発現を評価することにより、アトピー症状を評価することができるが、タンパク質を迅速、かつ、簡便に抽出する方法は示されていない。
【０００３】
一方、皮膚からタンパク質を簡便に採取する方法としてテープストリッピングが提案されている。テープストリッピングを用いて角層を採取し、角層が付着している粘着テープを直径９０ｍｍの培養皿に並べて、バッファーに浸し、緩やかに２０分間攪拌することによりタンパク質を抽出する手法が知られているが（非特許文献６：J. J. Thiele et al., J. Invest. Dermatol. 1999, vol.113, no.3, pp.335-339）、タンパク質を迅速に、かつ、簡便に抽出する方法は検討されていない。
【０００４】
【非特許文献１】NICKOLOFF,B.J. et al., Cancer Research, (2004), Vol.64, pp.2956-2961
【非特許文献２】GROMOV, P. et al., Mol. Cell. Proteomics, (2003), Vol.2, No.2, pp.70-84
【非特許文献３】Martina Wei-Fen CHANG et al., Experimental Cell Res., (Jun.2005), Vol.309, pp.121-136
【非特許文献４】LYLE, S. et al., J. Invest. Dermatol., (1999), Vol.112, No.4, pp.623
【非特許文献５】PARK YD, et al., Proteomics, 2004, vol.4, no.11, pp.3446-3455
【非特許文献６】J. J. Thiele et al., J. Invest. Dermatol. 1999, vol.113, no.3, pp.335-339
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体の状態を反映するタンパク質をヒト皮膚の角層から迅速かつ簡便に抽出し、高感度に分析する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ヒト皮膚タンパク質を抗体反応により分析するために、ヒト皮膚タンパク質を抽出する方法であって、テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
（２）抽出バッファーに含有させるラウリル硫酸ナトリウムの濃度が０．１〜１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする（１）に記載のタンパク質の抽出方法。
（３）ヒト皮膚タンパク質がケラチン７および／又はケラチン１５および／又はマスピン（maspin）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のタンパク質の抽出方法。
【発明の効果】
【０００７】
１．テープストリッピング法により被験者の角層を採取するので、被験者を傷つけることが無く、簡便である。
２．角層からタンパク質を５分以内に抽出することができる。
３．生体の状態を反映するタンパク質として、皮膚老化を反映するケラチン７、ケラチン１５、マスピン（maspin）を高感度に検出することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
（１）テープストリッピング法による角層の採取
テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に粘着した角層を採取する方法である。
市販の粘着テープを用いて、例えばヒト頬部に粘着テープを押し付けることにより、角層を粘着テープに粘着させて採取することができる。市販の粘着テープとしてはアサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、PROMOTOOL社製角質チェッカー（ディスクタイプW、ディスクタイプG、PROタイプ）、Integral社製Corneofix、3M社製透明テープ、3M社製透明両面テープ等が挙げられる。
【０００９】
（２）抽出バッファー
粘着テープに粘着した角層からタンパク質を抽出するために抽出バッファーを用いる。抽出バッファーとして例えば以下の組成を挙げることができる。組成：50mM Tris-HCl
(pH7.5)、120mM NaCl（塩化ナトリウム）, 1mM Na3VO4（オルトバナジン酸ナトリウム）。
粘着テープで採取されてくる皮膚の角質層は角化細胞が分化したもので、細胞骨格系のタンパク質を多く含む。そのためタンパク質の抽出効率を上げるには、この抽出バッファーに適当な界面活性剤を含有させることが必要である。さらに、界面活性剤としてはSDS（ラウリル硫酸ナトリウム、CH3(CH2)11OSO3Na）を使用することが必要である。SDSを用いると、タンパク質を分析する際の抗体の反応性が際立って高くなる。また、抽出バッファー中のSDSの濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上１％（ｗ／ｖ）以下が好ましい。０．１％未満であるとタンパク質の抽出量が不十分の場合があり、１％（ｗ／ｖ）を超えるとタンパク質を分析する際に抗体の反応を阻害する場合がある。
【００１０】
本発明の抽出法を用いることにより、皮膚老化を反映するケラチン７、ケラチン１５、マスピンを迅速かつ高感度に検出することができる。
ケラチン７は分子質量５１，２８７Ｄａの細胞骨格タンパク質で中間系フィラメントの成分である。腺細胞を含む多様な上皮細胞で発現が見られる。尿管の移行上皮、胆管、肺、乳腺上皮でも発現している。一部、腫瘍マーカーとしても使用されている。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ ７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７：１３３７−１３５０，１９８８，ＡＦ５０９８８７）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ７，Ｐ０８７２９）。ケラチン７は老化に伴って発現が減少することが知られている。
ケラチン１５は分子質量４９，１６７Ｄａの細胞骨格タンパク質である。中間系フィラメントの成分である。主に上皮基底層に局在している。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １５， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：１２４９−１２６１，１９８８，Ｘ０７６９６）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １５，Ｐ１９０１２）。ケラチン１５は老化に伴って発現が上昇することが知られている。
マスピンは分子質量42,138Daの分泌タンパク質である。腫瘍抑制因子(tumor suppressor)として機能し、哺乳動物の癌細胞のgrowth,invasion, metastaticを抑制する。セルピン(serpin)様の構造を持つが、セリンプロテアーゼ阻害効果は見られない細胞外へ分泌されており、主に正常上皮細胞に存在する。遺伝子塩基配列情報（Maspin, Science 263:526-529(1994), U04313）。アミノ酸配列情報（Maspin, J.Biol.Chem. 270:15832-15837(1995), P36952）。マスピンは老化に伴って発現が上昇することが知られている。
【００１１】
（３）タンパク質の抽出
角層を採取した粘着テープを円筒容器に入れて、高速回転するホモジナイゼーション用のペッスル（以下、「ペッスル」と呼ぶ）を用いて粘着面を擦ることにより迅速なタンパク質の抽出が可能である。従来は、角層を採取した粘着テープを抽出バッファーに浸して手作業によりスクレーパーで擦ってタンパク質を抽出していたが、以下に示すペッスルを用いる攪拌方法により５分以内にスクレーパー法の１．５倍以上のタンパク質を抽出することができる。このことは、振盪法や超音波照射法では困難である。
【００１２】
角層を採取した粘着テープ並びに抽出バッファーを入れる容器の内径は５ｍｍ以上１５ｍｍ以下が好ましい。内径が５ｍｍ未満であると、ペッスルの掻きとり部の直径を小さくしなければならず、粘着面を擦る効率が悪くなり、タンパク質の抽出効率が悪い。また、粘着テープを容器に入れることが困難である。内径が１５ｍｍを超えると、粘着テープを内壁に沿わせて保持することが困難となる。
粘着テープは粘着面を円筒容器内側に向けて、粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせるようにして、円筒容器に入れる。粘着テープを粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせて入れることにより、ペッスルにより容易に粘着面を擦ることができる。粘着テープは湾曲性のある素材を使用する。粘着テープを円筒容器に挿入する際に、挿入する方向と垂直の方向の粘着テープの幅は、円筒容器内周の６０％以上１００％以下が好ましい。粘着テープの幅が円筒容器内周の６０％未満であると、粘着テープの湾曲性によって粘着テープを円筒容器内面に沿って接触させることが困難となり、１００％を超えると粘着テープが重なって好ましくない。
【００１３】
ペッスルは、棒の先端に掻き取り可能な突起状、あるいはヘラ状の構造を有するものであればよい。ペッスルの構造としては、例えば、棒の先端に、棒の直径より大きい同心円筒を接続し、その円筒に軸と平行に複数の欠失部を設けることにより、円筒の円周上に並んだ複数のヘラ状構造（掻きとり部）を設けることができ、そのヘラで粘着テープを擦ることができる。市販品としてはHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)等を用いることができる。Handy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)の掻きとり部の直径は約７ｍｍである。
ペッスルの回転数は６０００ｒｐｍ〜９０００ｒｐｍが好ましい。６０００ｒｐｍ未満であるとタンパク質の抽出効率が必ずしも十分ではなく、９０００ｒｐｍを超えると、泡立ちが激しくなり好ましくない。
ペッスルで粘着面を擦る時間は２分以上５分以下が好ましい。２分未満であるとタンパク質の抽出効率が必ずしも十分ではなく、５分を超えて攪拌してもタンパク質の抽出量は殆ど変わらない。
例えば、内径１.１ｃｍの円筒容器に角層を採取した粘着テープと２００μＬの抽出バッファーを入れ、直径７ｍｍの掻きとり部を有するペッスルを用いて、９０００ｒｐｍの回転数で４分間粘着面を擦ることによりタンパク質を効率的に抽出することが可能である。
【００１４】
（４）タンパク質抽出液の採集
タンパク質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器からタンパク質抽出液を吸引して採集することが好ましい。
【００１５】
（５）タンパク質の分析
得られたタンパク質抽出液中のタンパク質は、ELISA法、抗体チップ法、FRET法により定量分析することができる。
【００１６】
タンパク質の抽出方法の検討
テープストリッピングにより採取した角層から、タンパク質を迅速に抽出するための方法を検討した。
１．テープストリッピング
粘着テープとしてアサヒバイオメッド社製角質チェッカー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いて前腕内側部および顔面頬部の角層を採取した。具体的には、被験者の前腕内側部および顔面頬部に角質チェッカーを貼り、指先で軽く擦り付けて角層を角質チェッカーの粘着面に粘着させた。
２．抽出操作の比較
従来、スクレーパーを用いて手作業で粘着テープを擦りながら攪拌し、タンパク質を抽出しており、再現性が良いことを確認している。そこで、スクレーパーを用いたタンパク質の抽出を標準操作として、振盪器、超音波、ペッスルそれぞれの方法で抽出した際の抽出効率を比較した。
３．タンパク質量の測定
タンパク質抽出液に含まれるタンパク質の量はDC protein Assay Kit(BIO-RAD社)を用いて測定した。
【００１７】
（１）振盪器によるタンパク質の抽出検討
比較例１、標準操作１について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は３００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例１、標準操作１について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例１、標準操作１について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００１８】
比較例１ 振盪器によるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れてTuple mixer (IWAKI社 code TWIN3-28N)を用いて１分、３分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分振盪し、タンパク質を抽出した。
標準操作１ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００１９】
図１に実験結果を示す。振盪器を用いた場合は、３０分振盪で33.6μg／粘着テープ、のタンパク質が抽出され、標準操作１（33.6μg／粘着テープ）と同程度の抽出量となった。しかし、５分でのタンパク質の抽出量（8.7μg／粘着テープ）は標準操作の１／３以下である。従って、振盪器による攪拌は迅速な抽出操作に適さない。
【００２０】
（２）超音波装置によるタンパク質の抽出検討
比較例２、標準操作２について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は３００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例２、標準操作２について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例２、標準操作２について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２１】
比較例２ 超音波装置によるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて超音波装置（SHARP UT-205）を用いて１分、３分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分超音波をかけて、タンパク質を抽出した。
標準操作２ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２２】
図２に実験結果を示す。洗浄用超音波装置を用いた場合には１０分で34.65μg／粘着テープ、のタンパク質が抽出され、標準操作２（36μg／粘着テープ）とほぼ同等のタンパク質の抽出量となったが、５分でのタンパク質の抽出量（8.1μg／粘着テープ）は標準操作２の１／３以下であり、迅速な抽出操作に適さない。
【００２３】
（３）ペッスルを用いたタンパク質の抽出 粘着テープの入れ方の検討
比較例４、５、実施例１、標準操作４について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.1%(w/v)SDS
比較例４、５、実施例１、標準操作４について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例４，５、実施例１、標準操作４について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２４】
比較例４ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを丸めて入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内の抽出バッファーを攪拌した。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
比較例５ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープをペッスルで押し込んでシワを寄らせて入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内の抽出バッファーを攪拌した。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
実施例１ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 code13753E）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
標準操作４ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２５】
図３に実験結果を示す。円筒容器への粘着テープへの入れ方により、タンパク質の抽出効率が変わることがわかった。比較例４、５で用いた粘着テープを丸めて入れる方法やペッスルで押し込んで入れる方法では６０秒の攪拌で、標準操作４と比べて約1/10、3/4のタンパク質しか抽出されず、タンパク質の抽出効率が悪いが、実施例１で用いた粘着テープの粘着面の反対面を容器の内壁に沿うようにいれ、ペッスルで粘着面を擦る方法では標準操作４の条件（45μg／粘着テープ）よりも30秒処理（61.8μg／粘着テープ）では約1.4倍、また６０秒処理（100.05μg／粘着テープ）では約2.2倍のタンパク質が抽出され、実施例１の操作によるタンパク質の抽出効果が高いことが示された。
【００２６】
（４）ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間の検討１
実施例２、標準操作５について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
実施例３、標準操作６について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.1%(w/v)SDS
実施例２、３、標準操作５、６について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
実施例２，３、標準操作５、６について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２７】
実施例２ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒、１２０秒とした。
標準操作５ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
実施例３ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒、１２０秒とした。
標準操作６ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２８】
図４に実験結果を示す。１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた実施例２、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた実施例３では、ほぼ同量のタンパク質が抽出されることがわかった。抽出バッファー中のSDSの濃度が０．１〜１%(w/v)で、再現性の良い抽出ができる。また、実施例２，３ともにペッスルで擦る時間６０秒で標準操作６のタンパク質量を超え、１２０秒で標準操作６よりも明らかにタンパク質の抽出量が多くなった。１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた標準操作５と０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた標準操作６を比較すると、標準操作６のタンパク質抽出量は標準操作５の６割であり、標準操作による抽出タンパク質量は抽出バッファー中のSDSの濃度に影響される。
【００２９】
（５）ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間の検討２
実施例４、標準操作７について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
実施例４、標準操作７について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
実施例４、標準操作７について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００３０】
実施例４ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は０．５分、１分、２分、３分、４分とした。
標準操作７ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００３１】
図５に実験結果を示す。粘着面を擦る時間が３分と４分のタンパク質抽出量はほぼ等しく、粘着面を擦る時間は４分で十分であることがわかった。
【００３２】
（６）ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤の検討１
実施例５、比較例６〜１０について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は４分とした。
実施例５、比較例６〜１０について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００３３】
実施例５および比較例６〜１０の抽出バッファーの組成を以下に示す。
実施例５ 1%SDS含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例６ 0.4%NP-40含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.4%(w/v)NP-40
NP-40：（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
比較例７ 2%NP-40含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)NP-40
NP-40：（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
比較例８ 2%CHAPS含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)CHAPS
CHAPS：（３−[ (３−コラシドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、C32H58N2O7S）
比較例９ 2%ASB-14含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)ASB-14
ASB-14：（アミドスルホベタイン、C22H46N2O4S）
比較例１０ 5%TritonX-100含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 5%(w/v)TritonX-100
Triton X-100（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
【００３４】
図６に実験結果を示す。実施例５、比較例６〜１０に用いた界面活性剤はいずれもタンパク質の抽出が可能である。
【００３５】
（７）ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤の検討２ ケラチン１５、ケラチン７、マスピン（maspin）の分析
実施例５、比較例６〜１０の手順を用いて抽出したタンパク質中のケラチン１５、ケラチン７、マスピンを以下の方法により分析した。
抽出したタンパク質の量をDC protein Assay Kit(BIO-RAD社)を用いて測定した。そのうち２μｇ分のサンプルを用いて、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンの抗体を用いて、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンをＥＬＩＳＡ法により検出した。
【００３６】
ケラチン１５の検出結果を図７に、ケラチン７の検出結果を図８に、マスピンの検出結果を図９に示す。
1%(w/v)SDS含有抽出バッファーを用いた実施例５のケラチン１５、ケラチン７、マスピンの発現量（検出量）は、他の界面活性剤を含有する抽出バッファーを用いた比較例６〜１０と比べて７倍以上であり、抽出バッファーにSDSを含有させることにより、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンの検出感度が格段に高くなることがわかった。具体的には、ケラチン１５について実施例５による発現量は228.4（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例８（2%CHAPS含有抽出バッファー）で25.2であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて９倍以上検出感度が高い。ケラチン７について実施例５による発現量は451.6（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例１０（5%TritonX-100含有抽出バッファー）で61.2であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて7倍以上検出感度が高い。マスピンについて実施例５による発現量は302.5（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例８（2%CHAPS含有抽出バッファー）で30.5であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて約１０倍以上検出感度が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】振盪器によるタンパク質の抽出
【図２】超音波装置によるタンパク質の抽出
【図３】ペッスルを用いたタンパク質の抽出 粘着テープの入れ方によるタンパク質抽出量
【図４】ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間と抽出量
【図５】ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間とタンパク質の抽出量
【図６】ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤とタンパク質抽出量
【図７】抽出バッファー中の界面活性剤とケラチン１５の発現量
【図８】抽出バッファー中の界面活性剤とケラチン７の発現量
【図９】抽出バッファー中の界面活性剤とマスピンの発現量
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚からテープストリッピング法を利用してタンパク質を抽出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現が、生体の状態を反映することが知られており、タンパク質の発現を調べて、生体の状態を評価するために、簡便、かつ、迅速にタンパク質を抽出する方法が必要とされている。手術で切り取ったヒトの皮膚を免疫染色することにより、maspinが老化に伴い増加することが見出されている（非特許文献１：NICKOLOFF,B.J. et al., Cancer Research, (2004), Vol.64, pp.2956-2961）。ヒト前腕の皮膚を切り取り、［３５Ｓ］メチオニンで同位体ラベルし、２次元電気泳動で測定することにより、加齢に伴ってMx-A、Mn-SOD、tryptophanyl-tRNA synthetase、the p85β subunit of phosphatidylinositol 3-kinase、the proteasome regulator PA28-α、the eukaryotic initiation factor 5A, NM23H2, cyclophilin A and its variant, proteasomal protein SSP 0107, HSP60の発現が増加し、annexin I, plasminogen activator inhibitor 2の発現が減少することが見出されている（非特許文献２：GROMOV, P. et al., Mol. Cell. Proteomics, (2003), Vol.2, No.2, pp.70-84）。ヒトさい帯静脈内皮細胞のタンパク質を２次元電気泳動法で分析することにより、老化に伴ってcytokeratin 7が減少することが見出されている（非特許文献３：Martina Wei-Fen CHANG et al., Experimental Cell Res., (Jun.2005), Vol.309, pp.121-136）。免疫染色法により表皮細胞中のcytokeratin 15が老化に伴って減少することが見出されている（非特許文献４：LYLE, S. et al., J. Invest. Dermatol., (1999), Vol.112, No.4, pp.623）。しかしながら、これらの研究は手術で切り取った皮膚やヒトさい帯静脈内皮細胞、あるいは培養細胞を用いており、一般人の老化の状態を簡便に評価することは困難である。これらの老化に伴って変化するタンパク質を抗体を用いて分析するにあたり、迅速、かつ、簡便に抽出する方法は開発されていない。
アトピー患者及び非アトピー患者の皮膚を切り取り、２次元電気泳動法を用いてアトピー患者に多く発現するタンパク質、少なく発現するタンパク質が見出されている。（非特許文献５：PARK YD, et al., Proteomics, 2004, vol.4, no.11, pp.3446-3455）。タンパク質の発現を評価することにより、アトピー症状を評価することができるが、タンパク質を迅速、かつ、簡便に抽出する方法は示されていない。
【０００３】
一方、皮膚からタンパク質を簡便に採取する方法としてテープストリッピングが提案されている。テープストリッピングを用いて角層を採取し、角層が付着している粘着テープを直径９０ｍｍの培養皿に並べて、バッファーに浸し、緩やかに２０分間攪拌することによりタンパク質を抽出する手法が知られているが（非特許文献６：J. J. Thiele et al., J. Invest. Dermatol. 1999, vol.113, no.3, pp.335-339）、タンパク質を迅速に、かつ、簡便に抽出する方法は検討されていない。
【０００４】
【非特許文献１】NICKOLOFF,B.J. et al., Cancer Research, (2004), Vol.64, pp.2956-2961
【非特許文献２】GROMOV, P. et al., Mol. Cell. Proteomics, (2003), Vol.2, No.2, pp.70-84
【非特許文献３】Martina Wei-Fen CHANG et al., Experimental Cell Res., (Jun.2005), Vol.309, pp.121-136
【非特許文献４】LYLE, S. et al., J. Invest. Dermatol., (1999), Vol.112, No.4, pp.623
【非特許文献５】PARK YD, et al., Proteomics, 2004, vol.4, no.11, pp.3446-3455
【非特許文献６】J. J. Thiele et al., J. Invest. Dermatol. 1999, vol.113, no.3, pp.335-339
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体の状態を反映するタンパク質をヒト皮膚の角層から迅速かつ簡便に抽出し、高感度に分析する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ヒト皮膚タンパク質を抗体反応により分析するために、ヒト皮膚タンパク質を抽出する方法であって、テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
（２）抽出バッファーに含有させるラウリル硫酸ナトリウムの濃度が０．１〜１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする（１）に記載のタンパク質の抽出方法。
（３）ヒト皮膚タンパク質がケラチン７および／又はケラチン１５および／又はマスピン（maspin）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のタンパク質の抽出方法。
【発明の効果】
【０００７】
１．テープストリッピング法により被験者の角層を採取するので、被験者を傷つけることが無く、簡便である。
２．角層からタンパク質を５分以内に抽出することができる。
３．生体の状態を反映するタンパク質として、皮膚老化を反映するケラチン７、ケラチン１５、マスピン（maspin）を高感度に検出することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
（１）テープストリッピング法による角層の採取
テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に粘着した角層を採取する方法である。
市販の粘着テープを用いて、例えばヒト頬部に粘着テープを押し付けることにより、角層を粘着テープに粘着させて採取することができる。市販の粘着テープとしてはアサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、PROMOTOOL社製角質チェッカー（ディスクタイプW、ディスクタイプG、PROタイプ）、Integral社製Corneofix、3M社製透明テープ、3M社製透明両面テープ等が挙げられる。
【０００９】
（２）抽出バッファー
粘着テープに粘着した角層からタンパク質を抽出するために抽出バッファーを用いる。抽出バッファーとして例えば以下の組成を挙げることができる。組成：50mM Tris-HCl
(pH7.5)、120mM NaCl（塩化ナトリウム）, 1mM Na3VO4（オルトバナジン酸ナトリウム）。
粘着テープで採取されてくる皮膚の角質層は角化細胞が分化したもので、細胞骨格系のタンパク質を多く含む。そのためタンパク質の抽出効率を上げるには、この抽出バッファーに適当な界面活性剤を含有させることが必要である。さらに、界面活性剤としてはSDS（ラウリル硫酸ナトリウム、CH3(CH2)11OSO3Na）を使用することが必要である。SDSを用いると、タンパク質を分析する際の抗体の反応性が際立って高くなる。また、抽出バッファー中のSDSの濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上１％（ｗ／ｖ）以下が好ましい。０．１％未満であるとタンパク質の抽出量が不十分の場合があり、１％（ｗ／ｖ）を超えるとタンパク質を分析する際に抗体の反応を阻害する場合がある。
【００１０】
本発明の抽出法を用いることにより、皮膚老化を反映するケラチン７、ケラチン１５、マスピンを迅速かつ高感度に検出することができる。
ケラチン７は分子質量５１，２８７Ｄａの細胞骨格タンパク質で中間系フィラメントの成分である。腺細胞を含む多様な上皮細胞で発現が見られる。尿管の移行上皮、胆管、肺、乳腺上皮でも発現している。一部、腫瘍マーカーとしても使用されている。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ ７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７：１３３７−１３５０，１９８８，ＡＦ５０９８８７）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ７，Ｐ０８７２９）。ケラチン７は老化に伴って発現が減少することが知られている。
ケラチン１５は分子質量４９，１６７Ｄａの細胞骨格タンパク質である。中間系フィラメントの成分である。主に上皮基底層に局在している。遺伝子配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ １５， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：１２４９−１２６１，１９８８，Ｘ０７６９６）。アミノ酸配列情報（Ｋｅｒａｔｉｎ，ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ １５，Ｐ１９０１２）。ケラチン１５は老化に伴って発現が上昇することが知られている。
マスピンは分子質量42,138Daの分泌タンパク質である。腫瘍抑制因子(tumor suppressor)として機能し、哺乳動物の癌細胞のgrowth,invasion, metastaticを抑制する。セルピン(serpin)様の構造を持つが、セリンプロテアーゼ阻害効果は見られない細胞外へ分泌されており、主に正常上皮細胞に存在する。遺伝子塩基配列情報（Maspin, Science 263:526-529(1994), U04313）。アミノ酸配列情報（Maspin, J.Biol.Chem. 270:15832-15837(1995), P36952）。マスピンは老化に伴って発現が上昇することが知られている。
【００１１】
（３）タンパク質の抽出
角層を採取した粘着テープを円筒容器に入れて、高速回転するホモジナイゼーション用のペッスル（以下、「ペッスル」と呼ぶ）を用いて粘着面を擦ることにより迅速なタンパク質の抽出が可能である。従来は、角層を採取した粘着テープを抽出バッファーに浸して手作業によりスクレーパーで擦ってタンパク質を抽出していたが、以下に示すペッスルを用いる攪拌方法により５分以内にスクレーパー法の１．５倍以上のタンパク質を抽出することができる。このことは、振盪法や超音波照射法では困難である。
【００１２】
角層を採取した粘着テープ並びに抽出バッファーを入れる容器の内径は５ｍｍ以上１５ｍｍ以下が好ましい。内径が５ｍｍ未満であると、ペッスルの掻きとり部の直径を小さくしなければならず、粘着面を擦る効率が悪くなり、タンパク質の抽出効率が悪い。また、粘着テープを容器に入れることが困難である。内径が１５ｍｍを超えると、粘着テープを内壁に沿わせて保持することが困難となる。
粘着テープは粘着面を円筒容器内側に向けて、粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせるようにして、円筒容器に入れる。粘着テープを粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせて入れることにより、ペッスルにより容易に粘着面を擦ることができる。粘着テープは湾曲性のある素材を使用する。粘着テープを円筒容器に挿入する際に、挿入する方向と垂直の方向の粘着テープの幅は、円筒容器内周の６０％以上１００％以下が好ましい。粘着テープの幅が円筒容器内周の６０％未満であると、粘着テープの湾曲性によって粘着テープを円筒容器内面に沿って接触させることが困難となり、１００％を超えると粘着テープが重なって好ましくない。
【００１３】
ペッスルは、棒の先端に掻き取り可能な突起状、あるいはヘラ状の構造を有するものであればよい。ペッスルの構造としては、例えば、棒の先端に、棒の直径より大きい同心円筒を接続し、その円筒に軸と平行に複数の欠失部を設けることにより、円筒の円周上に並んだ複数のヘラ状構造（掻きとり部）を設けることができ、そのヘラで粘着テープを擦ることができる。市販品としてはHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)等を用いることができる。Handy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)の掻きとり部の直径は約７ｍｍである。
ペッスルの回転数は６０００ｒｐｍ〜９０００ｒｐｍが好ましい。６０００ｒｐｍ未満であるとタンパク質の抽出効率が必ずしも十分ではなく、９０００ｒｐｍを超えると、泡立ちが激しくなり好ましくない。
ペッスルで粘着面を擦る時間は２分以上５分以下が好ましい。２分未満であるとタンパク質の抽出効率が必ずしも十分ではなく、５分を超えて攪拌してもタンパク質の抽出量は殆ど変わらない。
例えば、内径１.１ｃｍの円筒容器に角層を採取した粘着テープと２００μＬの抽出バッファーを入れ、直径７ｍｍの掻きとり部を有するペッスルを用いて、９０００ｒｐｍの回転数で４分間粘着面を擦ることによりタンパク質を効率的に抽出することが可能である。
【００１４】
（４）タンパク質抽出液の採集
タンパク質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器からタンパク質抽出液を吸引して採集することが好ましい。
【００１５】
（５）タンパク質の分析
得られたタンパク質抽出液中のタンパク質は、ELISA法、抗体チップ法、FRET法により定量分析することができる。
【００１６】
タンパク質の抽出方法の検討
テープストリッピングにより採取した角層から、タンパク質を迅速に抽出するための方法を検討した。
１．テープストリッピング
粘着テープとしてアサヒバイオメッド社製角質チェッカー（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いて前腕内側部および顔面頬部の角層を採取した。具体的には、被験者の前腕内側部および顔面頬部に角質チェッカーを貼り、指先で軽く擦り付けて角層を角質チェッカーの粘着面に粘着させた。
２．抽出操作の比較
従来、スクレーパーを用いて手作業で粘着テープを擦りながら攪拌し、タンパク質を抽出しており、再現性が良いことを確認している。そこで、スクレーパーを用いたタンパク質の抽出を標準操作として、振盪器、超音波、ペッスルそれぞれの方法で抽出した際の抽出効率を比較した。
３．タンパク質量の測定
タンパク質抽出液に含まれるタンパク質の量はDC protein Assay Kit(BIO-RAD社)を用いて測定した。
【００１７】
（１）振盪器によるタンパク質の抽出検討
比較例１、標準操作１について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は３００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例１、標準操作１について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例１、標準操作１について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００１８】
比較例１ 振盪器によるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れてTuple mixer (IWAKI社 code TWIN3-28N)を用いて１分、３分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分振盪し、タンパク質を抽出した。
標準操作１ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００１９】
図１に実験結果を示す。振盪器を用いた場合は、３０分振盪で33.6μg／粘着テープ、のタンパク質が抽出され、標準操作１（33.6μg／粘着テープ）と同程度の抽出量となった。しかし、５分でのタンパク質の抽出量（8.7μg／粘着テープ）は標準操作の１／３以下である。従って、振盪器による攪拌は迅速な抽出操作に適さない。
【００２０】
（２）超音波装置によるタンパク質の抽出検討
比較例２、標準操作２について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は３００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例２、標準操作２について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例２、標準操作２について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２１】
比較例２ 超音波装置によるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて超音波装置（SHARP UT-205）を用いて１分、３分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分超音波をかけて、タンパク質を抽出した。
標準操作２ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２２】
図２に実験結果を示す。洗浄用超音波装置を用いた場合には１０分で34.65μg／粘着テープ、のタンパク質が抽出され、標準操作２（36μg／粘着テープ）とほぼ同等のタンパク質の抽出量となったが、５分でのタンパク質の抽出量（8.1μg／粘着テープ）は標準操作２の１／３以下であり、迅速な抽出操作に適さない。
【００２３】
（３）ペッスルを用いたタンパク質の抽出 粘着テープの入れ方の検討
比較例４、５、実施例１、標準操作４について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.1%(w/v)SDS
比較例４、５、実施例１、標準操作４について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
比較例４，５、実施例１、標準操作４について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２４】
比較例４ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを丸めて入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内の抽出バッファーを攪拌した。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
比較例５ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープをペッスルで押し込んでシワを寄らせて入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内の抽出バッファーを攪拌した。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
実施例１ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 code13753E）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒とした。
標準操作４ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２５】
図３に実験結果を示す。円筒容器への粘着テープへの入れ方により、タンパク質の抽出効率が変わることがわかった。比較例４、５で用いた粘着テープを丸めて入れる方法やペッスルで押し込んで入れる方法では６０秒の攪拌で、標準操作４と比べて約1/10、3/4のタンパク質しか抽出されず、タンパク質の抽出効率が悪いが、実施例１で用いた粘着テープの粘着面の反対面を容器の内壁に沿うようにいれ、ペッスルで粘着面を擦る方法では標準操作４の条件（45μg／粘着テープ）よりも30秒処理（61.8μg／粘着テープ）では約1.4倍、また６０秒処理（100.05μg／粘着テープ）では約2.2倍のタンパク質が抽出され、実施例１の操作によるタンパク質の抽出効果が高いことが示された。
【００２６】
（４）ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間の検討１
実施例２、標準操作５について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
実施例３、標準操作６について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.1%(w/v)SDS
実施例２、３、標準操作５、６について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
実施例２，３、標準操作５、６について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００２７】
実施例２ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒、１２０秒とした。
標準操作５ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
実施例３ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は３０秒、６０秒、１２０秒とした。
標準操作６ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００２８】
図４に実験結果を示す。１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた実施例２、０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた実施例３では、ほぼ同量のタンパク質が抽出されることがわかった。抽出バッファー中のSDSの濃度が０．１〜１%(w/v)で、再現性の良い抽出ができる。また、実施例２，３ともにペッスルで擦る時間６０秒で標準操作６のタンパク質量を超え、１２０秒で標準操作６よりも明らかにタンパク質の抽出量が多くなった。１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた標準操作５と０．１%(w/v)SDSを含有する抽出バッファーを用いた標準操作６を比較すると、標準操作６のタンパク質抽出量は標準操作５の６割であり、標準操作による抽出タンパク質量は抽出バッファー中のSDSの濃度に影響される。
【００２９】
（５）ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間の検討２
実施例４、標準操作７について抽出バッファーは以下の組成のものを用いた。抽出バッファーの量は２００μＬとした。
抽出バッファー：50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
実施例４、標準操作７について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。
実施例４、標準操作７について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００３０】
実施例４ ペッスルによるタンパク質の抽出
円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は０．５分、１分、２分、３分、４分とした。
標準操作７ 標準操作によるタンパク質の抽出
粘着面を上にして粘着テープをパラフィルムの上に置き、抽出バッファーをのせて、プラスチックスクレーパーで５分間粘着面を擦り、タンパク質を抽出した。
【００３１】
図５に実験結果を示す。粘着面を擦る時間が３分と４分のタンパク質抽出量はほぼ等しく、粘着面を擦る時間は４分で十分であることがわかった。
【００３２】
（６）ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤の検討１
実施例５、比較例６〜１０について抽出容器は直径１１ｍｍの円筒容器を用いた。円筒容器に粘着テープを粘着面の反対の面が容器の内壁に沿うようにして入れ、抽出バッファーを入れて、ミニ・コードレスグラインダー（フナコシ社 ＣＧ−４Ａ）にペッスルとしてHandy pestle (TOYOBO社、code HMX-301)を接続し、ペッスルを９０００ｒｍｐで回転させて、円筒容器内壁に沿わせた粘着テープの粘着面を擦った。攪拌時間は４分とした。
実施例５、比較例６〜１０について、同一被験者からテープストリッピングにより角層を採取し、各操作方法について３枚の粘着テープからタンパク質を抽出し、平均値を求めた。
【００３３】
実施例５および比較例６〜１０の抽出バッファーの組成を以下に示す。
実施例５ 1%SDS含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 1%(w/v)SDS
比較例６ 0.4%NP-40含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 0.4%(w/v)NP-40
NP-40：（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
比較例７ 2%NP-40含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)NP-40
NP-40：（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
比較例８ 2%CHAPS含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)CHAPS
CHAPS：（３−[ (３−コラシドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、C32H58N2O7S）
比較例９ 2%ASB-14含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 2%(w/v)ASB-14
ASB-14：（アミドスルホベタイン、C22H46N2O4S）
比較例１０ 5%TritonX-100含有抽出バッファー
50mM Tris-HCl (pH7.5)、120mM NaCl, 1mM Na3VO4, 5%(w/v)TritonX-100
Triton X-100（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）
【００３４】
図６に実験結果を示す。実施例５、比較例６〜１０に用いた界面活性剤はいずれもタンパク質の抽出が可能である。
【００３５】
（７）ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤の検討２ ケラチン１５、ケラチン７、マスピン（maspin）の分析
実施例５、比較例６〜１０の手順を用いて抽出したタンパク質中のケラチン１５、ケラチン７、マスピンを以下の方法により分析した。
抽出したタンパク質の量をDC protein Assay Kit(BIO-RAD社)を用いて測定した。そのうち２μｇ分のサンプルを用いて、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンの抗体を用いて、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンをＥＬＩＳＡ法により検出した。
【００３６】
ケラチン１５の検出結果を図７に、ケラチン７の検出結果を図８に、マスピンの検出結果を図９に示す。
1%(w/v)SDS含有抽出バッファーを用いた実施例５のケラチン１５、ケラチン７、マスピンの発現量（検出量）は、他の界面活性剤を含有する抽出バッファーを用いた比較例６〜１０と比べて７倍以上であり、抽出バッファーにSDSを含有させることにより、ケラチン１５、ケラチン７、マスピンの検出感度が格段に高くなることがわかった。具体的には、ケラチン１５について実施例５による発現量は228.4（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例８（2%CHAPS含有抽出バッファー）で25.2であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて９倍以上検出感度が高い。ケラチン７について実施例５による発現量は451.6（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例１０（5%TritonX-100含有抽出バッファー）で61.2であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて7倍以上検出感度が高い。マスピンについて実施例５による発現量は302.5（相対値）であるのに対して、他の界面活性剤の中で最も発現量の多い比較例８（2%CHAPS含有抽出バッファー）で30.5であり、実施例５は他の界面活性剤と比べて約１０倍以上検出感度が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】振盪器によるタンパク質の抽出
【図２】超音波装置によるタンパク質の抽出
【図３】ペッスルを用いたタンパク質の抽出 粘着テープの入れ方によるタンパク質抽出量
【図４】ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間と抽出量
【図５】ペッスルによるタンパク質の抽出 粘着面を擦る時間とタンパク質の抽出量
【図６】ペッスルによるタンパク質の抽出 抽出バッファーに配合する界面活性剤とタンパク質抽出量
【図７】抽出バッファー中の界面活性剤とケラチン１５の発現量
【図８】抽出バッファー中の界面活性剤とケラチン７の発現量
【図９】抽出バッファー中の界面活性剤とマスピンの発現量
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚タンパク質を抗体反応により分析するために、ヒト皮膚タンパク質を抽出する方法であって、テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
【請求項２】
抽出バッファーに含有させるラウリル硫酸ナトリウムの濃度が０．１〜１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の抽出方法。
【請求項３】
ヒト皮膚タンパク質がケラチン７および／又はケラチン１５および／又はマスピン（maspin）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質の抽出方法。
【請求項１】
ヒト皮膚タンパク質を抗体反応により分析するために、ヒト皮膚タンパク質を抽出する方法であって、テープストリッピング法により採取した角層が粘着している粘着テープを、粘着面の反対の面が容器の内壁に接するように円筒容器に入れ、ラウリル硫酸ナトリウムを含有する抽出バッファーを入れて、ホモジナイゼーション用のペッスルを回転させて粘着面を擦ることを特徴とするタンパク質の抽出方法。
【請求項２】
抽出バッファーに含有させるラウリル硫酸ナトリウムの濃度が０．１〜１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の抽出方法。
【請求項３】
ヒト皮膚タンパク質がケラチン７および／又はケラチン１５および／又はマスピン（maspin）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質の抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２４９４２９（Ｐ２００８−２４９４２９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８９７３７（Ｐ２００７−８９７３７）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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