タンパク質製造のための改良されたベクターおよび酵母株：Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ過剰発現
内因性または異種Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼが過剰発現される下等真核宿主細胞を記載する。カルレチクリンおよび／またはＥＲｐ５７タンパク質が過剰発現される下等真核宿主細胞も記載する。これらの宿主細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質を製造するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、小胞体レクチンシャペロン、例えばカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）（ＣＲＴ）もしくはカルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）（ＣＲＸ）および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む宿主細胞、ならびに軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質の製造のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の記載
糖タンパク質は、触媒、シグナリング、細胞−細胞コミュニケーションならびに分子認識および会合を含む、ヒトおよび他の哺乳動物における多数の必須機能を媒介する。糖タンパク質は真核生物における非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する（ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３））。多数の糖タンパク質が治療目的に利用されており、過去２０年間に、天然に存在する糖タンパク質の組換え体がバイオテクノロジー産業の主要部分となっている。治療剤として使用される組換えグリコシル化タンパク質の具体例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）５およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）（Ｇｕｍｍｉｎｇら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１））が含まれる。潜在的予防剤および治療剤として製造された組換えタンパク質は臨床使用に近づいているため、組換え的に製造された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変化は、最近、科学界において非常に注目されている話題である。
【０００３】
一般に、糖タンパク質オリゴ糖のグリコシル化構造は、それを産生させるために使用される宿主によって様々である。非ヒト宿主細胞において産生された治療用タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性応答を惹起しうる非ヒトグリコシル化、例えば、酵母における高マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（Ｂａｌｌｏｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０（１９９０））、植物におけるα（１，３）−フコースおよびβ（１，２）−キシロース（Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：３６５−３７２（１９９９））、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２（１９９５））、およびマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９（１９９３））を含有する可能性がある。
【０００４】
非ヒト哺乳類細胞により産生された糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のものに、より密接に関連している傾向にあるため、ほとんどの市販糖タンパク質は哺乳類細胞において産生される。しかし、哺乳類細胞はタンパク質産生用宿主細胞としての幾つかの重要な欠点を有する。哺乳類細胞におけるタンパク質の製造方法は、高い費用を要することに加えて、異種集団の糖形態を産生し、低い容量測定力価を示し、継続的なウイルス抑制を要すると同時に安定な細胞系を作製するための相当な時間を要する。２０００年頃までは、ヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有する組換え糖タンパク質を産生させるのに適した下等真核宿主細胞は実現不可能であった。その後、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓは米国特許第７，０２９，８７２号において、ヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を製造しうる組換え下等真核宿主細胞の製造方法を開示した。したがって、現在、組換え糖タンパク質を製造するために下等真核宿主細胞を使用することに相当な関心が持たれている。
【０００５】
Ｎ−結合グリコシル化の経路は多くの分析の対象となっているが、Ｏ−結合グリコシル化の過程および機能も十分には理解されていない。Ｎ−結合グリコシル化とは対照的に、Ｏ−グリコシル化は翻訳後事象であり、これはシスゴルジにおいて生じることが公知である（Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０（１９９３））。Ｎ−結合グリコシル化の場合と同様のＯ−結合グリコシル化のためのＯ−結合グリコシル化コンセンサスアクセプター配列は存在しないようであるが、幾つかの糖タンパク質の多数のＯ−結合グリコシル化部位のアミノ酸配列の比較は、グリコシル化残基と比較した場合の−１および＋３におけるプロリン残基の頻度の増加ならびにセリン、トレオニンおよびアラニン残基の著しい増加を示している（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４（１９９１））。糖タンパク質におけるセリンおよびトレオニン残基の伸長はＯ−グリコシル化のための潜在的部位でもありうる。酵母由来組換えタンパク質は、しばしば、それらの天然対応物と比較して追加的な非天然Ｏ−グリカンを含有することが示されている（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．３３：１５１−２０８，（１９９８））。これらの非天然Ｏ−グリカンは、望ましくない免疫原性または異常活性を有するタンパク質を与えうる。したがって、Ｏ−グリコシル化が軽減している又はそれを伴わない酵母および他の下等真核生物におけるタンパク質の製造方法を開発することが必要とされている。
【０００６】
Ｔａｎｎｅｒらは米国特許第５，７１４，３７７号において、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子、ならびに組換えタンパク質が産生されるようＰＭＴ遺伝子の１以上が遺伝的に修飾されている真菌細胞を使用する軽減したＯ−結合グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法を記載している。
【０００７】
Ｎｇらは米国公開特許出願第２００２００６８３２５号において、アンチセンスもしくは共抑制の使用またはＯ−結合グリコシル化に関連した遺伝子（特にＰＭＴ遺伝子の１以上）における機能喪失突然変異を有する酵母宿主株の操作によるＯ−グリコシル化の抑制を開示している。
【０００８】
Ｃｌａｕｓｅｎは米国公開特許出願第２００３０１８６８５０号において、ポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼのレクチンを選択的に抑制するための及びＯ−グリカン生合成に関与する他のグリコシルトランスフェラーゼの基質として働かないようにするためのＧａｌＮＡｃ−ベータ−ベンジルの使用を開示している。
【０００９】
Ｏｒｃｈａｒｄらは米国特許第７，１０５，５５４号において、ベンジリデンチアゾリジンジオンおよび抗真菌剤としてのそれらの使用を記載している。例えば、ＢｏｂｒｏｗｉｃｚらがＷＯ２００７０６１６３１において示している抗真菌剤は、軽減したＯ−結合グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造のための宿主細胞に致死的ではない様態で使用されうる。
【００１０】
Ｋｏｎｒａｄらは米国公開特許出願第２００２０１２８２３５号において、組織または細胞におけるＯ−結合タンパク質グリコシル化を薬理学的に抑制することにより糖尿病を治療または予防するための方法を開示している。
【００１１】
Ｋｏｊｉｍａらは米国特許第５，２６８，３６４号において、白血球または腫瘍細胞によるＳＬｅｘまたはＳＬｅａの発現を阻止して内皮細胞および血小板へのこれらの細胞の接着を抑制するための、Ｏ−α−ＧａｌＮＡｃの蓄積を招くＯ−グリコシル化の伸長を抑制するベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミンのような化合物を使用するＯ−グリコシル化の抑制のための治療用組成物を開示している。
【００１２】
Ｂｏｉｍｅらは米国特許第６，１０３，５０１号において、グリコシル化部位のアミノ酸配列を修飾することによりＯ−結合グリコシル化が改変されたホルモンの変異体を開示している。
【００１３】
しかし、Ｏ−グリコシル化が軽減された又はそれを伴わないタンパク質を産生する組換え宿主細胞を製造するための前記の試みを考慮したとしても、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞が尚も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，０２９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１４，３７７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００６８３２５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１８６８５０号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１０５，５５４号明細書
【特許文献６】国際公開第２００７／０６１６３１号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００２／０１２８２３５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２６８，３６４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，１０３，５０１号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３）
【非特許文献２】Ｇｕｍｍｉｎｇら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１）
【非特許文献３】Ｂａｌｌｏｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０（１９９０）
【非特許文献４】Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：３６５−３７２（１９９９）
【非特許文献５】Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２（１９９５）
【非特許文献６】Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９（１９９３）
【非特許文献７】Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０（１９９３）
【非特許文献８】Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４（１９９１）
【非特許文献９】Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．３３：１５１−２０８，（１９９８）
【発明の概要】
【００１６】
発明の簡潔な概要
本発明者らは、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え宿主細胞における組換えタンパク質の発現が、該組換え宿主細胞において内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現させることによりもたらされうることを見出した。内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する宿主細胞は、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない同じ細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生する。実施例に示されているとおり、異種または内因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする発現カセットを含む組換え宿主下等真核宿主細胞は、内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない細胞と比較してＯ−グリカン占有度が４倍まで減少した組換えタンパク質を産生することが可能であった。
【００１７】
したがって、本発明は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子が導入されている下等真核宿主細胞であって、該核酸分子が該宿主細胞内で発現され、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、下等真核宿主細胞を提供する。特定の態様においては、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼは、該宿主細胞において機能的であり該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの構成的または調節可能な発現をもたらしうる異種調節配列に機能的に連結されたオープンリーディングフレームによりコードされている。更なる態様においては、該下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。更に詳細な態様においては、該宿主細胞はメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。特定の態様においては、該Ｃａ２＋ ＡＴＰは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＲ１およびアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＣＡ１よりなる群から選ばれる。
【００１８】
更なる態様においては、本発明の下等真核宿主細胞は、下等真核宿主細胞由来の調節性ヌクレオチド配列と、前記宿主細胞により産生されるべき選択された哺乳類タンパク質をコードするコード配列とを含む組換えベクターで更に形質転換される。ある態様においては、選択された哺乳類タンパク質は治療用タンパク質であり、抗体（これに限定されるものではない）を含む糖タンパク質でありうる。
【００１９】
更なる実施形態においては、該宿主細胞は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするベクターが宿主細胞に導入され宿主細胞において発現される、酵母または糸状菌宿主細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞であることが可能であり、該宿主細胞は更に、該宿主細胞内に導入された例えば抗体のようなヒト治療用糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞に由来し該細胞において機能性である調節性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現する。
【００２０】
また、該下等真核宿主細胞におけるカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）およびＥＲｐ５７タンパク質の過剰発現はＯ−グリカン占有度の減少をももたらしうることが判明している。したがって、異所性発現されるカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む下等真核宿主細胞も提供する。更なる実施形態においては、該宿主細胞は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含み、ここで、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である。一般に、該下等真核宿主細胞は更に、組換えタンパク質をコードする核酸分子を含み、該タンパク質は、特定の態様においては糖タンパク質であり、これは、更なる態様においては抗体またはそのフラグメント、例えばＦｃもしくはＦａｂである。
【００２１】
更なる実施形態においては、前記宿主細胞のいずれかは、機能性ＰＭＴ遺伝子を有する宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞を得るために、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子の機能を軽減または排除するために操作される。更なる態様においては、該ＰＭＴタンパク質は、ＰＭＴ１およびＰＭＴ４よりなる群から選ばれる。更なる態様においては、該宿主細胞は更に、ＰＭＴ遺伝子発現またはＰＭＴタンパク質機能のインヒビターの１以上と接触される。
【００２２】
更なる実施形態においては、内因性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が軽減、欠失または破壊され、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該細胞内に導入される。特定の態様においては、該シャペロンタンパク質はＰＤＩ１タンパク質である。
【００２３】
前記宿主細胞の更なる態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選ばれる。
【００２４】
更なる実施形態は、本明細書に開示されている遺伝的修飾を含まない組換え糖タンパク質と比較して軽減したＯ−グリコシル化またはＯ−グリカン占有度を有する組換えタンパク質の製造方法を含む。組換えタンパク質は、抗体およびそのフラグメントを含む治療上重要なタンパク質および糖タンパク質を含む。
【００２５】
したがって、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２６】
更に、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）ＣＲＴまたはＥＲｐ５７の少なくとも１つをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の発現は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２７】
更に、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよびＣＲＴまたはＥＲｐ５７の少なくとも１つをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性であり、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ、ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２８】
更なる実施形態においては、機能性ＰＭＴ遺伝子を有する宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞を得るための、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の機能。更なる態様においては、該ＰＭＴタンパク質は、ＰＭＴ１およびＰＭＴ４よりなる群から選ばれる。更なる態様においては、該宿主細胞は更に、ＰＭＴ遺伝子発現またはＰＭＴタンパク質機能のインヒビターの１以上と接触される。
【００２９】
更なる実施形態においては、内因性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が軽減、欠失または破壊され、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該細胞内に導入される。特定の態様においては、該シャペロンタンパク質はＰＤＩ１タンパク質である。
【００３０】
更に詳細な態様においては、本明細書に開示されている宿主細胞のいずれかはＰＭＴ遺伝子のインヒビターの存在下で増殖されうる。
【００３１】
本発明における方法は、抗体（これに限定されるものではない）を含む治療上重要なタンパク質を製造するのに特に有用である。したがって、治療上重要なタンパク質を製造するための、本発明における宿主細胞のいずれかの使用を提供する。特定の態様においては、抗体を製造するための、本発明における宿主細胞のいずれかの使用。
【００３２】
前記方法の更なる態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選ばれる。
【００３３】
更に、本明細書に開示されている宿主細胞により製造される組換えタンパク質を提供する。
【００３４】
特定の実施形態においては、前記宿主細胞のいずれかは更に、主に特定のＮグリカン構造体またはＮグリカン構造体の特定の混合物を有する糖タンパク質を該宿主細胞が産生するのを可能にする遺伝的修飾を含みうる。例えば、該宿主細胞は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮグリカン（これは、特定の態様においては、１以上の追加的な糖、例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースまたはシアル酸を非還元末端に、そして場合によっては、還元末端のＧｌｃＮＡｃ上にフコースを含む）を産生するよう遺伝的に操作されている。したがって、Ｎグリカンは、二アンテナ（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）および多アンテナ（ｍｕｌｔｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）糖形態ならびに二分枝状（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）の糖形態の両方を含む。Ｎグリカンの具体例には、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
定義
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００３６】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００３７】
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意義を有すると理解されるものとする。
【００３８】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「糖形態」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、該タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、ゴルジ装置内で継続する。
【００３９】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有することが可能であり、該残基は、場合によっては、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数の分枝を有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」とも称される。
【００４０】
本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００４１】
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸分子を運搬しうる核酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミドベクター」であり、これは、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結されうるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。
【００４２】
本明細書中で用いる「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」なる語は、宿主細胞内で通常は産生されない、タンパク質を典型的にはコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主細胞ゲノム内に安定に組込まれた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心のある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上のポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼが含まれる。
【００４３】
「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の両方の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。
【００４４】
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するよう、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するよう、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【００４５】
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
【００４６】
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。後の世代においては突然変異または環境の影響により或る修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
【００４７】
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
【００４８】
「下等真核細胞」なる語は、酵母および糸状菌を含む。酵母および糸状菌は、限定的なものではないが、以下のものを含む：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。
【００４９】
タンパク質をコードする遺伝子の機能が「軽減」していると言えるのは、その遺伝子が例えば１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異または置換により修飾されていて、そのような修飾を伴わない対応遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して、標準的なアッセイで測定された場合に少なくとも２０％〜５０％低い活性、特定の態様においては、少なくとも４０％低い活性または少なくとも５０％低い活性を有するタンパク質を該修飾遺伝子がコードしている場合である。タンパク質をコードする遺伝子の機能が「排除」されていると言えるのは、その遺伝子が例えば１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異または置換により修飾されていて、そのような修飾を伴わない対応遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して、標準的なアッセイで測定された場合に少なくとも９０％〜９９％低い活性、特定の態様においては、少なくとも９５％低い活性または少なくとも９９％低い活性を有するタンパク質を該修飾遺伝子がコードしている場合である。
【００５０】
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明に関連する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。典型的な方法および物質（材料）を以下に説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および物質も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記載されている全ての刊行物および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。該材料、方法および実施例（具体例）は例示に過ぎず、何ら限定的ではないと意図される。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に開示されている遺伝的に操作されていない宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる組換え宿主細胞を提供する。一般に、１以上の内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの異所性発現のための１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞、および軽減したＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するための、該組換え宿主細胞の使用を提供する。
【００５２】
本発明者らは、組換え宿主細胞における内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの過剰発現が、内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造を可能にすることを見出した。実施例３および４に示すとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）またはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）の過剰発現は、いずれのＣａ２＋ ＡＴＰアーゼをも発現しない宿主細胞株と比較してＯ−グリカン占有度における４倍以上の減少をもたらした。したがって、内因性または外因性ゴルジまたはＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ここで、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼは異種プロモーターに機能的に連結されている）をコードする１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を与えるであろう。これらの宿主細胞は、タンパク質上のＯ−グリコシル化の量が軽減することが望まれる組換えタンパク質を製造するために使用されうる。好適な他のＣａ２＋ ＡＴＰアーゼには、ヒトＳＥＲＣＡ２ｂタンパク質（ＡＴＰ２Ａ２ ＡＴＰアーゼ、Ｃａ＋＋輸送、心筋、緩縮２）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＯＤ１タンパク質（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＰＦ１のホモログ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
カルレチクリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）（ＣＲＴ）は、小胞体の内腔における主要Ｃａ（２＋）結合性（貯蔵）タンパク質として作用する多機能性タンパク質である。それは核においても見出され、このことは、それが転写調節において何らかの役割を果たしうることを示唆している。カルレチクリンは合成ペプチドＫＬＧＦＦＫＲ（配列番号４７）に結合し、これは核内受容体のスーパーファミリーのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列とほぼ同一である。カルレチクリンは、抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体を含有する全身性ループスおよびシェーグレン患者の或る血清における抗体に結合し、それは種間で高度に保存されており、それは小胞体および筋小胞体に位置し、それらの部位においてそれはカルシウムに結合しうる。カルレチクリンは、ミスフォールドしたタンパク質に結合し、小胞体からゴルジ装置へそれらが輸出されるのを妨げる。好適な他のタンパク質には、ヒトＵＧＧＴ（ＵＤＰ−グルコース：糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ）タンパク質およびヒトＲＥｐ２７タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ＥＲｐ５７は、新たに合成された糖タンパク質のフォールディングをモジュレーションするためにレクチンシャペロンであるカルレチクリンおよびカルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）と相互作用する小胞体のシャペロンタンパク質である。該タンパク質はかつてはホスホリパーゼであると考えられていたが、該タンパク質は実際にはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有することが実証されている。したがって、ＥＲｐ５７は小胞体（ＥＲ）の内腔タンパク質であり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーのメンバーである。レクチンとこのタンパク質との複合体は、それらの糖タンパク質基質におけるジスルフィド結合の形成を促進することによりタンパク質フォールディングを媒介すると考えられている。原型ＰＤＩとは対照的に、ＥＲｐ５７は、新たに合成された糖タンパク質と特異的に相互作用する。
【００５５】
本発明者らは更に、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒトＣＲＴおよびヒトＥＲｐ５７の過剰発現が、ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７を発現しない株と比較してＯ−グリカン占有度における約３分の１の軽減を引き起こすことを見出した。
【００５６】
したがって、宿主細胞における異所性発現のためのカルレチクリンタンパク質および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞を更に提供する。これらの宿主細胞は、タンパク質上のＯ−グリコシル化の量が軽減されることが望ましい組換えタンパク質を製造するために使用されうる。該宿主細胞が、内因性または異種Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする１以上の核酸分子を更に含む場合、これらの宿主細胞はＯ−グリコシル化における更なる軽減を伴う。実施例４に示すとおり、内因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼまたは外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しヒトカルレチクリンタンパク質およびヒトＥＲｐ５７タンパク質を過剰発現する組換え宿主細胞の提供は、該宿主細胞により産生された組換えタンパク質のＯ−グリコシル化における更なる軽減をもたらした。したがって、内因性または異種Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする１以上の核酸分子とカルレチクリンタンパク質および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子とを含む組換え宿主細胞を更に提供する。これらの宿主細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するために使用されうる。
【００５７】
分子シャペロンは抗体のフォールディングおよび分泌において決定的に重要な役割を果たしている。１つのシャペロンタンパク質、特にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、抗体重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド間および内結合形成を触媒するよう機能する。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、非触媒化反応と比較してジスルフィド含有タンパク質の回収における相当な増加または相当な減少を引き起こしうる。すなわち、小胞体（ＥＲ）における高濃度のＰＤＩがジスルフィド含有タンパク質の発現に必須である（ＰｕｉｇおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７７６４−７７７１（１９９４））。実施例に示すとおり、内因性ＰＤＩ１シャペロン遺伝子がヒトＰＤＩシャペロン遺伝子で置換されている細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有していた。これらの細胞が内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよび／またはＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７タンパク質の異所性過剰発現を更に伴う場合、Ｏ−グリコシル化の更なる軽減が認められた（実施例３および４を参照されたい）。
【００５８】
したがって、Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよび／またはＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７タンパク質を異所性発現する宿主細胞が更に含まれ、ここで、内因性シャペロンタンパク質をコードする１以上の遺伝子が欠失している又は破壊されており、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該シャペロンタンパク質の異所性発現のために導入されている。更なる実施形態は、追加的な異種コシャペロンタンパク質、例えばＥＲＯ−１αおよび／またはＧＲＰ９４タンパク質も該細胞において発現される前記細胞を含む。
【００５９】
下等真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、分泌タンパク質のセリルおよびトレオニル残基へのマンノースの転移に関与するタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）として公知の遺伝子のファミリーを含有する。本発明者らは、１以上のヒト化またはキメラシャペロン遺伝子を発現するよう遺伝的に改変されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系が、細胞増殖またはタンパク質発現にほとんど又は全く影響を及ぼすことなく、より良好に１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失に耐えうることを見出した。欠失されうるＰＭＴ遺伝子には、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６が含まれる。一般に、ＯＣＨ１遺伝子およびＰＭＴ遺伝子の両方が欠失しているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は増殖不良を示すか又は全く増殖しない。ＯＣＨ１遺伝子の欠失または機能的ノックアウトは、ヒト様Ｎ−グリカンを有するヒト糖タンパク質を産生しうる組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の構築に必要である。Ｏ−グリコシル化を有さない又は軽減したＯ−グリコシル化を有するヒト糖タンパク質を製造することが望ましいため、ヒト様Ｎ−グリカンを有するヒト糖タンパク質をも産生しうる組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞におけるＯ−グリコシル化を軽減するための手段を見出すことが必要とされている。したがって、更なる実施形態において、１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を更に含む宿主細胞を提供する。
【００６０】
更なる態様においては、該過剰発現遺伝子産物は分泌遺伝子産物である。過剰発現遺伝子産物が分泌されるかどうかを観察するための方法は当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓおよびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．。
【００６１】
過剰発現遺伝子産物を分泌させるためには、該過剰発現遺伝子産物の分泌に十分な条件下、該宿主細胞を培養する。そのような条件は、該細胞による分泌を可能にする温度、栄養および細胞密度条件を含む。更に、そのような条件は、該細胞が転写、翻訳、および１つの細胞画分から別の細胞画分へのタンパク質の移行の基本的細胞機能を行いうる条件であり、当業者に公知である。
【００６２】
更に、当業者に公知のとおり、分泌遺伝子産物は、現在の宿主細胞を維持するため又は増殖させるために使用される培地内で検出されうる。該培地は、公知方法、例えば遠心分離または濾過により、該宿主細胞から分離されうる。ついで該過剰発現遺伝子産物は、該過剰発現遺伝子産物の公知特性を利用することにより無細胞培地内で検出されうる。そのような特性には、該過剰発現遺伝子産物の特徴的な免疫学的、酵素的または物理的特性が含まれうる。例えば、過剰発現遺伝子産物が特有の酵素活性を有する場合、該宿主細胞により利用される培地上でその活性に関するアッセイが行われうる。更に、与えられた過剰発現遺伝子産物に対して反応性である抗体が利用可能である場合には、いずれかの公知の免疫学的アッセイで該遺伝子産物を検出するために、そのような抗体が使用されうる（Ｈａｒｌｏｗｅら，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００６３】
また、分泌遺伝子産物は融合タンパク質であることが可能であり、この場合、該遺伝子産物は、該遺伝子産物の分泌を促進する異種シグナルまたはリーダーペプチドを含む。分泌シグナルペプチドは特有のアミノ酸配列であり、これは、該宿主細胞が遺伝子産物を内部および外部細胞膜を介して細胞外環境へ導くのを可能にする。分泌シグナルペプチドは、分泌のための新生ポリペプチド遺伝子産物のＮ末端に存在する。追加的な真核分泌シグナルも、特異的アミノ酸に結合した炭水化物の形態（すなわち、グリコシル化分泌シグナル）で、該遺伝子産物のポリペプチド鎖に沿って存在しうる。
【００６４】
Ｎ末端シグナルペプチドは、約２〜約１０アミノ酸の短い荷電ドメインに続いて存在しうる約１０〜約３０アミノ酸の疎水性ドメインを含む。更に、該シグナルペプチドは分泌のための遺伝子産物のＮ末端に存在する。一般に、シグナル配列の個々の配列は決定的に重要ではないが、シグナル配列は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）などのような疎水性アミノ酸に富む。
【００６５】
多数のシグナルペプチドが公知である（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：４２５（１９８２））。例えば、酵母酸ホスファターゼ、酵母インベルターゼおよび酵母α因子シグナルペプチドが異種ポリペプチドコード領域に結合されており、該異種ポリペプチドの分泌のために成功裏に使用されている（例えば、Ｓａｔｏら，Ｇｅｎｅ ８３：３５５−３６５（１９８９）；Ｃｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１８１２−１８１９（１９８６）；およびＢｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６（１９８４）を参照されたい）。したがって、５’末端にシグナルペプチドをも有する過剰発現遺伝子産物のコード領域をコードする核酸を当業者は容易に設計または入手することが可能である。
【００６６】
好ましくは本方法により分泌される過剰発現遺伝子産物の具体例には、哺乳類遺伝子産物、例えば酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ワクチン、抗体などが含まれる。より詳しくは、過剰発現遺伝子産物には、エリスロポエチン、インスリン、ソマトトロピン、成長ホルモン放出因子、血小板由来成長因子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、顆粒球コロニー刺激因子、多系統コロニー刺激活性、顆粒球−マクロファージ刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、Ｔ細胞増殖因子、リンホトキシン、免疫グロブリン、抗体などのような遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫グロブリンまたは抗体の定常領域に融合されたペプチドおよびポリペプチド（これらに限定されるものではない）を含む融合タンパク質が更に含まれる。特に有用な過剰発現遺伝子産物はヒト遺伝子産物である。
【００６７】
「抗体」および「免疫グロブリン」なる語は、組換えＤＮＡ技術により産生された任意の組換えモノクローナル抗体を含み、更にヒト化およびキメラ抗体を含むと意図される。
【００６８】
本方法は、ワクチンとして使用されうる任意の過剰発現遺伝子産物の分泌を増強するために容易に適合化されうる。ワクチンとして使用されうる過剰発現遺伝子産物には、哺乳類病原体の任意の構造的、膜会合、膜結合または分泌遺伝子産物が含まれる。哺乳類病原体には、哺乳類に感染し又は哺乳類を攻撃しうるウイルス、細菌、単細胞または多細胞寄生生物が含まれる。例えば、ウイルスワクチンには、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ワクシニア、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ポリオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、デングウイルス、日本脳炎Ｂ、水痘・帯状疱疹、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎、ロタウイルスのようなウイルスに対するワクチン、ならびにライム病、麻疹、黄熱病、流行性耳下腺炎、狂犬病、ヘルペス、インフルエンザ、パラインフルエンザなどのようなウイルス疾患に対するワクチンが含まれうる。細菌ワクチンには、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）などのような細菌に対するワクチンが含まれうる。
【００６９】
一般に、本発明の過剰発現タンパク質（例えば、Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ、ＥＲｐ５７、カルレチクリン）および組換えタンパク質は、組換え的に、すなわち、過剰発現タンパク質または組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現カセット内に配置することにより発現される。そのような発現カセットは少なくとも調節配列を含有し、これは、該タンパク質をコードする核酸分子に該配列が機能的に連結されている場合に該タンパク質の発現をもたらす。ついで該発現カセットを、複製起点、選択マーカー、転写または終結シグナル、動原体、自律的複製配列などのような追加的要素をも含有しうるプラスミドのようなベクター内に挿入して、発現ベクターを得る。
【００７０】
発現ベクターは複製可能または複製不能な発現ベクターでありうる。複製可能な発現ベクターは、宿主細胞染色体ＤＮＡから独立して複製可能であり、あるいは宿主細胞染色体ＤＮＡ内にそのようなベクターが組込まれているため複製可能である。組込み発現ベクターは、該ベクターが後に組込まれる宿主細胞ゲノム内の特定の位置へと該発現ベクターを標的化する標的化配列を含む。宿主細胞染色体ＤＮＡ内に組込まれると、そのような発現ベクターは幾つかの構造要素を喪失しうるが、過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子および該過剰発現または組換えタンパク質の発現をもたらしうるセグメントを保有する。したがって、本発明における発現ベクターは染色体組込み性または染色体非組込み性発現ベクターでありうる。
【００７１】
更なる態様においては、宿主細胞内への組込み性または非組込み性発現ベクターの導入により、該宿主細胞において１以上の過剰発現または組換えタンパク質を過剰発現させる。少なくとも１つの過剰発現または組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクターの導入の後、該遺伝子産物をコードする内因性遺伝子の発現を誘導することにより、あるいは該遺伝子産物をコードする発現ベクターを宿主細胞内に導入することにより、該遺伝子産物を過剰発現させる。もう１つの実施形態においては、少なくとも１つの異種シャペロンタンパク質を構成的に又は誘導可能な様態で発現する細胞系を樹立する。過剰発現すべき遺伝子産物をコードする発現ベクターをそのような細胞系内に導入して、該過剰発現遺伝子産物の分泌を亢進させる。
【００７２】
発現ベクターが該過剰発現または組換えタンパク質の発現を可能にして、選択された宿主細胞型におけるそのような遺伝子産物の分泌を促進する限り、本発現ベクターは１つの宿主細胞型（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））においては複製可能であるが別の宿主細胞型（例えば、真核宿主細胞）においてはほとんど又は全く複製を受けないことが可能である。
【００７３】
本明細書に記載されている発現ベクターは、所望の遺伝子、すなわち、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする遺伝子の制御発現のために操作されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。そのようなベクターは、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された核酸分子セグメントをもコードしうる。この文脈における機能的に連結されたは、そのようなセグメントが、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子の発現をもたらしうることを意味する。これらの核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、上流制御要素、転写因子またはリプレッサー結合部位、終結シグナル、および意図される宿主細胞における遺伝子発現を制御しうる他の要素を含む。好ましくは、該ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、コスミドまたはウイルスである。
【００７４】
本発明の発現ベクターは酵母または哺乳類細胞において機能する。酵母ベクターには、酵母２μサークルおよびその誘導体、酵母自律的複製配列をコードする酵母ベクター、酵母ミニ染色体、任意の酵母組込みベクターなどが含まれうる。多数のタイプの酵母ベクターの包括的一覧がＰａｒｅｎｔら（Ｙｅａｓｔ １：８３−１３８（１９８５））に記載されている。
【００７５】
遺伝子産物の発現をもたらしうる要素または核酸調節配列には、プロモーター、エンハンサー要素、上流活性化配列、転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位が含まれる。全てのそのようなプロモーターおよび転写調節要素が、単独で又は組合されて、本発現ベクターにおいて使用されると想定される。更に、遺伝的に操作された及び突然変異した調節配列も想定される。
【００７６】
プロモーターは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列要素である。特に、プロモーターは転写開始部位を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含みうる。選択されるプロモーターは、選択された個々の宿主系において機能しうると予想されるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母プロモーターが本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌プロモーターが使用されるであろう。酵母プロモーターの具体例には、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦおよびＧＵＴ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｒｏｍａｎｏｓら（Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８（１９９２））は酵母プロモーターおよび発現ベクターの総説を記載している。
【００７７】
本明細書に開示されている核酸分子に機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターまたは誘導プロモーターでありうる。誘導プロモーターは、転写因子の結合に際して、増加または減少した速度での転写を導くプロモーターである。本明細書中に記載の転写因子には、プロモーターの調節または制御領域に結合して転写に影響を及ぼしうる任意の因子が含まれる。宿主細胞における転写因子のプロモーター結合能または合成は、該宿主を誘導因子にさらす又は宿主細胞培地から誘導因子を除去することにより制御されうる。したがって、誘導プロモーターの発現を調節するためには、誘導因子を宿主細胞の増殖培地に加えるか又は該増殖培地から除去する。そのような誘導因子には、糖、ホスファート、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、寒冷などが含まれうる。例えば、酵母において一般的に用いられる誘導因子はグルコース、ガラクトースなどである。
【００７８】
選択される転写終結配列は、選択された個々の宿主細胞において機能しうるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母転写終結配列が本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌転写終結配列が使用されるであろう。転写終結配列には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３ ＴＴ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列（ＰｐＰＭＡ１ ＴＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の発現ベクターは選択マーカーをもコードしうる。選択マーカーは、選択マーカーを含有するベクターで形質転換された細胞が非形質転換細胞から識別されうるよう、同定可能な形質を宿主細胞に付与する遺伝的機能体である。また、該マーカーに連結された遺伝的機能体が宿主細胞集団において保有されることを保証するために、ベクター内への選択マーカーの導入が用いられうる。そのような選択マーカーは、いずれかの容易に同定される優性形質、例えば薬物耐性、細胞栄養素などを合成または代謝する能力などを付与しうる。
【００８０】
酵母選択マーカーは、薬物耐性マーカー、および必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能体を含む。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））などが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能体が、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異体を有する利用可能な酵母株と共に使用される。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国公開出願第２００７／００７２２６２号に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている。例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、ＷＯ２００７１３６８６５およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／１３７１９を参照されたい。挿入部位の具体例には、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＭＣＡ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＣＹＭ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＰＥＰ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＰＲＢ遺伝子およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＬＥＵ遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号に記載されており、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０に記載されている。
【００８１】
したがって、本発現ベクターは、培養内に存在する細胞集団内のベクター含有宿主細胞を特定し維持するのに有用な選択マーカーをコードしうる。幾つかの場合においては、選択マーカーは、発現ベクターのコピー数を増幅するためにも使用されうる。過剰発現または組換えタンパク質をコードするＲＮＡを産生させるために本発現ベクターから転写を誘導した後、該ＲＮＡは細胞因子により翻訳されて該過剰発現または組換えタンパク質を与える。
【００８２】
酵母および他の真核生物においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳は、該ｍＲＮＡの５’キャップへのリボソーム結合、およびポリペプチド合成が開始されうる最初のＡＵＧ開始コドンへの該ｍＲＮＡに沿った該リボソームの移動により開始される。酵母および哺乳類細胞における発現は、原核生物発現系において時には必要とされるような、リボソーム結合部位と開始コドンとの間の特定の数のヌクレオチドを一般には要しない。しかし、酵母または哺乳類宿主細胞における発現の場合、ｍＲＮＡにおける最初のＡＵＧコドンは、好ましくは、所望の翻訳開始コドンである。
【００８３】
更に、酵母宿主細胞において発現が行われる場合、長い（例えば、５０〜１００ヌクレオチドより長い）非翻訳リーダー配列の存在は、ｍＲＮＡの翻訳を軽減しうる。酵母ｍＲＮＡリーダー配列は約５０ヌクレオチドの平均長を有し、アデニンに富み、二次構造をほとんど有さず、ほぼ常に最初のＡＵＧを開始に利用する。これらの特徴を有さないリーダー配列はタンパク質翻訳の効率を軽減しうるため、好ましくは、酵母リーダー配列が酵母宿主細胞における過剰発現遺伝子産物またはシャペロンタンパク質の発現に使用される。多数の酵母リーダー配列の配列が公知であり、Ｃｉｇａｎら（Ｇｅｎｅ ５９：１−１８（１９８７））を参照して当業者に利用可能である。
【００８４】
得られる発現のレベルに影響を及ぼしうる要因には、プロモーター、リボソーム結合部位および開始コドンの位置に加えて、複製可能な発現ベクターのコピー数が含まれる。ベクターのコピー数は、一般に、該ベクターの複製起点およびそれに関連したいずれかのシス作用性制御要素により決定される。例えば、調節性動原体をコードする酵母エピソームベクターのコピー数の増加は、該動原体に近接して配置されたプロモーターからの転写を誘導することにより達成されうる。更に、酵母ベクターにおける酵母ＦＬＰ機能のコード化も該ベクターのコピー数を増加させうる。
【００８５】
そのような調節要素をコードする核酸分子を合成し又は新たな調節要素を本ベクター内にクローニングし配置することにより、入手可能なベクターからのＤＮＡ断片を組合せることにより、前記配列を含む発現ベクターを、当業者は容易に設計し製造することが可能である。発現ベクターの製造方法はよく知られている。過剰発現ＤＮＡ法は遺伝的操作に関する多数の標準的な実験マニュアルのいずれかに見出される。
【００８６】
本発明の発現ベクターは、プロモーターおよび遺伝子発現を制御するために使用される他の配列要素に対して適切な配向で過剰発現または組換えタンパク質コード領域を連結することにより製造されうる。本発現ベクターの構築の後、そのようなベクターを、該過剰発現遺伝子産物および該過剰発現または組換えタンパク質が発現されうる宿主細胞内に形質転換する。酵母および他の下等真核細胞を発現ベクターで形質転換するための方法はよく知られており、当業者に容易に利用可能である。例えば、発現ベクターは、酢酸リチウム、スフェロプラスト、エレクトロポレーションおよび類似方法を含む幾つかの方法のいずれかにより、酵母細胞内に形質転換されうる。
【００８７】
酵母複製可能発現ベクターと共に使用されうる酵母宿主細胞には、分泌能を有する酵母の任意の野生型または突然変異株が含まれる。そのような株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）および酵母の関連種に由来しうる。一般に、酵母の有用な突然変異株には、選択マーカーをコードする酵母ベクターと共に用いられうる遺伝的欠損を有する株が含まれる。多数のタイプの酵母株がＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｏｎｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．９４７２０）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，以下、ＡＴＣＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｎｅｙ Ｌａｎｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ ＮＲ４ ７ＵＡ，ＵＫ）およびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｙｅａｓｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｊｕｌｉａｎａｌａａｎ ６７ａ，２６２８ ＢＣ Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
【００８８】
一般に、酵母のような下等真核生物は糖タンパク質の発現に有用である。なぜなら、それらは経済的に培養され、高収率を与え、適切に修飾されると適切にグリコシル化されうるからである。酵母は特に、確立された遺伝学的特徴を示し、迅速な形質転換、試験されるタンパク質局在化法、および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする。適当なベクターは、所望により、発現制御配列、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、複製起点、終結配列などを有する。
【００８９】
種々の酵母、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が細胞培養に有用である。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。
【００９０】
下等真核生物、特に酵母は、該グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するよう、遺伝的に修飾されうる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４００１８５９０に記載されているとおり、選択された内因性グリコシル化酵素を排除し、および／または外因性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が喪失するよう選択され又は操作されうる。
【００９１】
１つの実施形態においては、該宿主細胞は更にα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、これは、該１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した組換え糖タンパク質の移動は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
【００９２】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９３】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、これは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９４】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９５】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を得ることが可能である。
【００９６】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質を与える。酵母および糸状菌のような下等真核宿主細胞の場合、該宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供給する手段を含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するよう下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するよう下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をニューロミニダーゼでインビトロで処理して、主にＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９７】
前宿主細胞はいずれも、例えば米国公開特許出願第２００４／０７４４５８および第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分枝（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ ＩＩＩ）および／または多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）（ＧｎＴ ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるために、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩおよびＧｎＴ ＩＸよりなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
【００９８】
更なる実施形態においては、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を与える。
【００９９】
更なる実施形態においては、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する直前の宿主細胞は更にシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を与える。
【０１００】
種々の前宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠いているため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌を、前記輸送体を含むよう遺伝的に操作することが好ましい。
【０１０１】
前記宿主細胞の更なる実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＢＭＴ２）を欠失させ又は破壊することにより（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を排除するよう、およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失させ又は破壊することにより（米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するよう、遺伝的に操作されている。前記宿主細胞の更なる実施形態においては、該宿主細胞は更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）の１以上を欠失させ又は破壊することにより（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）糖タンパク質のＯ−グリコシル化を排除するよう遺伝的に修飾されているか、あるいは公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号に開示されているＰｍｔ−１、Ｐｍｔｉ−２およびＰｍｔｉ−３のようなインヒビターの存在下で増殖され、あるいはそれらの両方に付される。
【０１０２】
したがって、糖タンパク質を産生するよう遺伝的に修飾された宿主細胞を提供し、ここで、該糖タンパク質上の主要Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含むが、これらに限定されるものではない。更に、糖タンパク質上に前記Ｎ−グリカンの特定の混合物を有する該糖タンパク質を産生する宿主細胞が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明を例示するために実施例に記載されている酵母株の系譜を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明を例示するために実施例に記載されている酵母株の系譜を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＰＤＩ１（ｈＰＤＩ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＰＤＩ１（ｈＰＤＩ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。
【図３】図３は、ヒトＥＲＯ１α（ｈＥＲＯ１α）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰｒＢ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を例示する。
【図４】図４は、ヒトＧＲＰ９４をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を例示する。
【図５】図５は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスα−１，２マンノシダーゼＩＡ（ＦＢ５３）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６およびｐＧＦＩ２０７ｔの構築を例示する。
【図６】図６は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の構築を例示する。
【図７】図７は、抗ＤＫＫ１抗体重鎖（ＧＦＩ７１０Ｈ）および軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座を標的化しピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１の地図である。
【図８】図８は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＲ１をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２２の地図である。
【図９】図９は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＣＡ１（ＡｔＥＣＡ１）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２７の地図である。
【図１０】図１０は、ヒトＣＲＴ（ｈＣＲＴ）およびヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ３遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１２３４の地図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
以下の実施例においては、種ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の宿主細胞において異種ヒトタンパク質を発現させる。これらの実施例は本発明の特定の実施形態に関して本発明を実証するものであり、何ら限定的なものと解釈されるべきではない。本明細書における開示および実施例を読んだ当業者は、記載されている方法および材料に対する多数の変更、修飾および改良が、本発明の実施から逸脱することなく可能である、と認識するであろう。
【実施例１】
【０１０５】
本実施例は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する組換えタンパク質を産生する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の構築を示す。
【０１０６】
発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築は以下のとおりであり、図２に示されている。該プラスミドベクターは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換するために、ヒトＰＤＩタンパク質をコードする発現カセットと、該プラスミドベクターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座へと標的化する核酸分子とを含む。プライマーｈＰＤＩ／ＵＰｌ：５’ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣ ３’（配列番号１）およびｈＰＤＩ／ＬＰ−ＰａｃＩ：５’ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴ ３’（配列番号２）、ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびにヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用するＰＣＲにより、ヒトＰＤＩ１をコードするｃＤＮＡを増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングしてプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８を得た。ヒトＰＤＩ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９および２０）を表９に示す。
【０１０７】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１および２２）を表９に示す。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡからの領域のＰＣＲ増幅により、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１ ５’および３’領域を含む核酸分子の単離を行った。プライマーＰＢ２４８：５’ＡＴＧＡＡ ＴＴＣＡＧ ＧＣＣＡＴ ＡＴＣＧＧ ＣＣＡＴＴ ＧＴＴＴＡ ＣＴＧＴＧ ＣＧＣＣＣ ＡＣＡＧＴ ＡＧ ３’（配列番号３）；ＰＢ２４９：５’ＡＴＧＴＴ ＴＡＡＡＣ ＧＴＧＡＧ ＧＡＴＴＡ ＣＴＧＧＴ ＧＡＴＧＡ ＡＡＧＡＣ ３’（配列番号４）を使用して、該５’領域を増幅した。プライマーＰＢ２５０：５’ＡＧＡＣＴ ＡＧＴＣＴ ＡＴＴＴＧ ＧＡＧＡＣ ＡＴＴＧＡ ＣＧＧＡＴ ＣＣＡＣ ３’（配列番号５）；ＰＢ２５１：５’ＡＴＣＴＣ ＧＡＧＡＧ ＧＣＣＡＴ ＧＣＡＧＧ ＣＣＡＡＣ ＣＡＣＡＡ ＧＡＴＧＡ ＡＴＣＡＡ ＡＴＴＴＴ Ｇ−３’（配列番号６）を使用して、該３’領域を増幅した。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に使用した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ断片ＰｐＰＤＩ１（５’）およびＰｐＰＤＩ１（３’）を別々にプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングして、それぞれプラスミドベクターｐＧＬＹ６２０およびｐＧＬＹ６１７を得た。ｐＧＬＹ６７８を構築するために、組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２４のＤＮＡ断片ＰｐＡＲＧ３−５’およびＰｐＡＲＧ−３’［これは、該プラスミドベクターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ３遺伝子座に標的化する］を、プラスミドベクターｐＧＬＹ６７８をＰＤＩ１遺伝子座に標的化しＰＤＩ１遺伝子座の発現を破壊するそれぞれＤＮＡ断片ＰｐＰＤＩ（５’）およびＰｐＰＤＩ（３’）で置換した。
【０１０８】
ついで、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８内にクローニングして、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ）の制御下に配置されているプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を得た。５’末端のＮｏｔＩ制限酵素部位および平滑３’末端を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ−シグナルペプチド（ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチド（配列番号１８））をコードする核酸分子（配列番号７）と、ＡｆｅＩおよびＰａｃＩでプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８から遊離されたヒトＰＤＩをコードする核酸分子を含む発現カセットとを、平滑５’末端および３’末端のＰａｃＩ部位を有する核酸分子を得るためにＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８内に連結することにより、発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を構築した。得られた組込み／発現プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロモーターと、ＰＤＩ１遺伝子座の破壊およびＰＤＩ１遺伝子座内への該発現カセットの組込みのために該プラスミドをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座に標的化するための核酸分子配列とに機能的に連結された、ヒトＰＤＩ１／ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチド融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。図２はプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および１８に示す。
【０１０９】
ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３２の構築は以下のとおりであり、図３に示されている。ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする核酸分子がＧｅｎｅ Ａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成され、それを使用してプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２４を構築した。ヒトＥＲＯ１αタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２３および２４）を表９に示す。ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする核酸分子を、制限酵素ＡｆｅＩおよびＦｓｅＩを使用して該プラスミドベクターから遊離させ、ついで、前記のとおり５’ＮｏｔＩおよび３’平滑末端を有するＳｃαＭＰプレ−シグナルペプチドをコードする核酸分子と共に、ＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８内に連結した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８はまた、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＢ１遺伝子の５’および３’領域（それぞれＰｐＰＲＢ１−５’およびＰｐＰＲＢ１−３’領域）を含む核酸分子を含んでいた。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３０をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ついで、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７から得たピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１プロモーター（ＰｐＰＤＩプロモーター）を含有する核酸分子に連結した。ＰｐＰＤＩプロモーターのヌクレオチド配列は５’−ＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＧＡ−３’（配列番号３１）である。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１プロモーター制御下にヒトＥＲＯ１α融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する発現／組込みベクターであり、ＰＲＢ１遺伝子座の破壊およびＰＲＢ１遺伝子座内への該発現カセットの組込みのためにゲノムのＰＲＢ１遺伝子座に該プラスミドベクターを標的化するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＢ１遺伝子の５’および３’領域を含む。図３はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を例示する。
【０１１０】
ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３３の構築は以下のとおりであり、図４に示されている。プライマーｈＧＲＰ９４／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣ ＴＧＡＣＧ ＡＴＧＡＡ ＧＴＴＧＡ ＴＧＴＧＧ ＡＴＧＧＴ ＡＣＡＧＴ ＡＧ−３’（配列番号１５）およびｈＧＲＰ９４／ＬＰ１：５’−ＧＧＣＣＧ ＧＣＣＴＴ ＡＣＡＡＴ ＴＣＡＴＣ ＡＴＧＴＴ ＣＡＧＣＴ ＧＴＡＧＡ ＴＴＣ ３’（配列番号１６）でヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からヒトＧＲＰ９４をＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。該ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングしてプラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６を得た。ヒトＧＲＰ９４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２５および２６）を表９に示す。
【０１１１】
ヒトＧＲＰ９４をコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６からＡｆｅＩおよびＦｓｅＩで遊離させた。ついで該核酸分子を、前記のとおりＮｏｔＩおよび平滑末端を有するＳｃαＭＰプレ−シグナルペプチドをコードする核酸分子、ならびにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４ ５’および３’領域（それぞれＰｐＰＥＰ４−５’およびＰｐＰＥＰ４−３’領域）を含む核酸分子を含有するＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３１に連結して、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９を得た。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰｐＰＤＩ１プロモーターを含有するＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩでプラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７から取り出し、該ＤＮＡ断片をｐＧＬＹ２２２９内に連結して、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３を得た。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩプロモーターの制御下にヒトＧＲＰ９４融合タンパク質をコードしており、ＰＥＰ４遺伝子座の破壊および発現カセットの組込みのために該プラスミドベクターをゲノムのＰＥＰ４遺伝子座に標的化するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の５’および３’領域を含む。図４はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を例示する。
【０１１２】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２、ｐＧＬＹ１８９６およびｐＧＦＩ２０７ｔの構築は以下のとおりであった。全てのトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドベクターをｐＧＦＩ１６５から誘導した。これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴプレシグナルペプチドに融合されたトリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号を参照されたい）をコードしており、この場合、発現はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーターの制御下にあり、該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に標的化され、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５の地図を図５に示す。
【０１１３】
ｐＧＦＩ１６５におけるＧＡＰプロモーターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１（ＰｐＡＯＸ１）プロモーターで置換することにより、プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２を作製した。これは、ｐＧＬＹ２０２８からのＥｃｏＲＩ（平滑化される）−ＢｇｌＩＩ断片としてＰｐＡＯＸ１プロモーターを単離し、ＮｏｔＩ（平滑化される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＦＩ１６５内に挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の地図を図６に示す。
【０１１４】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６は、プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５内に挿入されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２膜挿入リーダーペプチド融合タンパク質（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）を参照されたい）に融合したマウスα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットを含有する（図５）。これは、ＸｈｏＩで消化され（そして平滑末端化され）ＰｍｅＩで消化されたｐＧＬＹ１４３３からＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２−マウスＭＮＳＩ発現カセットを単離し、ＰｍｅＩで消化されたｐＧＦＩ１６５内に該断片を挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６の地図を図５に示す。
【０１１５】
亜ヒ酸塩に対する耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３（ＳｃＡＲＲ３）遺伝子でＵＲＡ５選択マーカーが置換されたこと以外は、プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔはｐＧＬＹ１８９６に類似している。これは、ＡｓｃＩ（平滑末端化される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＦＩ１６６からＳｃＡＲＲ３遺伝子を単離し、ＳｐｅＩ（平滑末端される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬＹ１８９６内に該断片を挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの地図を図５に示す。
【０１１６】
抗ＤＫＫ１抗体発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１（図７）の構築は以下のとおりであった。抗ＤＫＫ１抗体は、Ｗｎｔシグナリング経路に関与するリガンドであるディッコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質１を認識する抗体である。抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１を作製するために、α−アミラーゼ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来）シグナルペプチドをコードする核酸分子に対してそれぞれがインフレームである重鎖（ＨＣ；ＶＨ＋ＩｇＧ２ｍ４を含有する融合タンパク質）および軽鎖（ＬＣ；ＶＬ＋Ｌλ定常領域を含有する融合タンパク質）融合タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子がＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧにより合成された。α−アミラーゼシグナルペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号４８および４９に示す。ＨＣのヌクレオチド配列を配列番号２７に示し、アミノ酸配列を配列番号２８に示す。ＬＣのヌクレオチド配列を配列番号２９に示し、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。ＩｇＧ２ｍ４イソタイプは米国公開出願第２００７／０１４８１６７号および米国公開出願第２００６／０２２８３４９号に開示されている。ユニーク５’−ＥｃｏＲＩおよび３’−ＦｓｅＩ部位を用いて、ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードする核酸分子を別々に発現プラスミドベクターｐＧＬＹ１５０８内にクローニングして、それぞれプラスミドベクターｐＧＬＹ１２７８およびｐＧＬＹ１２７４を得た。これらのプラスミドベクターは、ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結されたゼオシン耐性マーカーおよびＴＲＰ２組込み部位およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含有していた。該ＬＣ融合タンパク質発現カセットをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩでｐＧＬＹ１２７４から取り出し、ＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬＹ１２７８内にクローニングして、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０を得た。これは該ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードしており、ＴＲＰ２遺伝子座内への該発現カセットの組込みのために該発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２６１はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０内に追加的なＬＣを含有する（図７）。
【０１１７】
前記発現／組込みベクターでの酵母形質転換は以下のとおりであった。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、約０．２〜６のＯＤまで、５０ｍＬ ＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））内で一晩増殖させた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌１Ｍ ソルビトールで３回洗浄した後、０．５ｍｌの氷冷無菌１Ｍ ソルビトールに再懸濁させた。１０μＬの線状化ＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で５分間インキュベートした。予め設定されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘセル内でエレクトロポレーションを行い、その直後に、１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍ ソルビトール）を加えた。該形質転換細胞を室温（２４℃）で４時間〜一晩にわたって回収した後、該細胞を選択培地上にプレーティングした。
【０１１８】
細胞系の作製は以下のとおりであり、図１Ａおよび１Ｂに示されている。既に記載されている方法（例えば、ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）を用いて、株ｙＧＬＹ２４−１（ｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１ ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ ｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ）を構築した。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国公開出願第２００６０２１１０８５号に開示されている。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ｍｎｎ４Ｌ１遺伝子（ｍｎｎ４ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。ｍｎｎ４はｍｎｎ４Ｌ２またはｍｎｎ４ａを意味する。遺伝子型においては、ＫｌＭＮＮ２−２はクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＧｌｃＮＡｃ輸送体であり、ＭｍＳＬＣ３５Ａ３はムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧｌｃＮＡｃ輸送体である。ＵＲＡ５の欠失はｙＧＬＹ２４−１株をウラシルに関して栄養要求性にし（米国公開出願第２００４／０２２９０３６号を参照されたい）、これを使用して、以下のヒト化シャペロン株を構築した。種々の発現カセットが本明細書の実施例におけるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムの特定の遺伝子座内に組込まれたが、本発明の実施は、組込みに用いられる遺伝子座には無関係であると理解される。本明細書に開示されているもの以外の遺伝子座が該発現カセットの組込みに用いられうる。適当な組込み部位には、米国公開出願第２００７００７２２６２号に列挙されているものが含まれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログが含まれる。
【０１１９】
対照株ｙＧＬＹ６４５（ＰｐＰＤＩ１）を構築した。株ｙＧＬＹ６４５はトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）を発現し、それぞれはＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現され、天然ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座は無傷である。該プラスミドベクターをピチア（Ｐｉｃｈｉａ）プロリン１（ＰＲＯ１）遺伝子座に標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ２４−１から株ｙＧＬＹ６４５を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＦＢ５３、ＭｕＭＮＳ１Ａ）（それぞれ、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現される）をコードする発現カセットを含有する。
【０１２０】
内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子の非存在下でピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞から発現されたヒトＰＤＩの有効性を試験するために、株ｙＧＬＹ７０２およびｙＧＬＹ７０４を作製した。株ｙＧＬＹ７０２およびｙＧＬＹ７０４（ｈＰＤＩ）は以下のとおりに構築した。構成的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトＰＤＩをコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ７０２を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、株ｙＧＬＹ７０２をウラシルに関して原栄養性にするピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５をコードする発現カセットをも含有していた。５−ＦＯＡプレート上でｐＧＬＹ７０２を対抗選択することにより、ＵＲＡ５発現カセットを取り出して、株ｙＧＬＹ７０４を得た。該株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で安定に置換されており、該株はウラシルに関して栄養要求性である。
【０１２１】
プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を使用するヒトＰＤＩでのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の置換は、ＰｐＰＤＩ１ ＯＲＦのみに特異的な以下のプライマーを使用するコロニーＰＣＲにより確認された：ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−１，５’−ＧＧＴＧＡ ＧＧＴＴＧ ＡＧＧＴＣ ＣＣＡＡＧ ＴＧＡＣＴ ＡＴＣＡＡ ＧＧＴＣ−３’；（配列番号７）；ＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１，５’−ＧＡＣＣＴ ＴＧＡＴＡ ＧＴＣＡＣ ＴＴＧＧＧ ＡＣＣＴＣ ＡＡＣＣＴ ＣＡＣＣ−３’；（配列番号８）；ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−２，５’ＣＧＣＣＡ ＡＴＧＡＴ ＧＡＧＧＡ ＴＧＣＣＴ ＣＴＴＣＡ ＡＡＧＧＴ ＴＧＴＧ−３’；（配列番号９）；およびＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−２，５’−ＣＡＣＡＡ ＣＣＴＴＴ ＧＡＡＧＡ ＧＧＣＡＴ ＣＣＴＣＡ ＴＣＡＴＴ ＧＧＣＧ−３’；（配列番号１０）。したがって、ＰＣＲ産物の非存在はＰｐＰＤＩ１のノックアウトを示す。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２２】
ＰＣＲプライマー：ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰ，５’−ＧＧＣＧＡ ＴＴＧＣＡ ＴＴＣＧＣ ＧＡＣＴＧ ＴＡＴＣ−３’；（配列番号１１）；およびｈＰＤＩ−３７ＬＰ ５’−ＣＣＴＡＧ ＡＧＡＧＣ ＧＧＴＧＧ ＣＣＡＡＧ ＡＴＧ−３’；（配列番号１２）を使用して、ＰｐＰＤＩ１遺伝子座におけるｐＧＬＹ６４２の二重交差を確認するために、追加的なＰＣＲを用いた。ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰは、ｐＧＹ６４２のＰｐＰＤＩ１（５’）には存在しないＰｐＰＤＩ１の上流領域をプライマー化し、ｈＰＤＩ−３’／ＬＰはｐＧＬＹ６４２におけるヒトＰＤＩ ＯＲＦをプライマー化する。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２３】
ノックアウト（すなわち、二重交差事象）としての又は「ロール・イン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）」（すなわち、ゲノム内への該プラスミドベクターの単一組込み）としてのプラスミドベクターの組込み効率は、ベクターと宿主染色体ＤＮＡ上の対応遺伝子との間の相同領域の数および長さ、選択マーカー、関心のある遺伝子の役割ならびに内因性機能を相補するノック・イン遺伝子の能力を含む幾つかの要因に左右されうる。幾つかの場合には、ｐＧＬＹ６４２は二重交差として組込まれてヒトＰｐＰＤＩでの内因性ＰｐＰＤＩ遺伝子の置換をもたらし、他の場合には、ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターは単一組込みとして組込まれて内因性ＰｐＰＤＩ１遺伝子とヒトＰｐＰＤＩ遺伝子との両方の存在をもたらすことを、本発明者らは見出した。これらの事象を識別するために、本発明者らは、本明細書に記載されている配列番号１１〜１４のＰＣＲプライマーを利用した。ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターの組込みの後にＰｐＰＤＩ遺伝子が保有されている場合には、内部ＰｐＰＤＩコード配列に向けられたＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰおよびｈＰＤＩ−３’／ＬＰは増幅産物および対応バンドを与えるであろう。ノックアウトまたは二重交差の場合には、これらのプライマーはいずれの増幅産物も与えず、対応バンドは視認されないであろう。
【０１２４】
以下のプライマーでｐＧＬＹ６４２のロール・インが確認された：ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−１（配列番号７）およびＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１（配列番号８）（ＰｐＰＤＩ１をコードする）、ならびにｈＰＤＩ／ＵＰ，５’−ＧＴＧＧＣ ＣＡＣＡＣ ＣＡＧＧＧ ＧＧＣＡＴ ＧＧＡＡＣ−３’；（配列番号１３）；およびｈＰＤＩ−３’／ＬＰ，５’−ＣＣＴＡＧ ＡＧＡＧＣ ＧＧＴＧＧ ＣＣＡＡＧ ＡＴＧ−３’；（配列番号１４）（ヒトＰＤＩをコードする）。該ＰＣＲ条件は、ＰｐＰＤＩ１に関しては９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクル、そしてヒトＰＤＩに関しては９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２５】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１）に機能的に連結されたトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセットを含むプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２をｙＧＬＹ７０４のＰＲＯ１遺伝子座内に形質転換することにより、株ｙＧＬＹ７３３を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。該細胞をメタノールの存在下で増殖させると、ＰｐＡＯＸ１プロモーターは過剰発現を可能にする。
【０１２６】
プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔにおけるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターにそれぞれが機能的に連結されているＴｒＭＮＳ１およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノム内の５’ＰＲＯ１遺伝子座ＵＴＲにおいて株ｙＧＬＹ７３３内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ７６２を構築した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１２７】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ６４５を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ２２６３を作製した。
【０１２８】
５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７３３を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ２６７４を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５栄養要求性である。
【０１２９】
５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７６２を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ２６７７を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ＰｐＧＡＰＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５栄養要求性である。
【０１３０】
ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２をＰＲＢ１遺伝子座内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ２６９０を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ヒトＥＲＯ１α発現カセットがＰＲＢ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１３１】
ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３をＰＥＰ４遺伝子座内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ２６９６を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ヒトＧＲＰ９４がＰＥＰ４遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１３２】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６２８を作製した。
【０１３３】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６４７を作製した。
【０１３４】
表１は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するよう遺伝的に操作された酵母において、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換することが、Ｏ−グリコシル化占有度の減少およびＮ−グリコシル化の増加をもたらすことを示している。
【０１３５】
【表１】
【実施例２】
【０１３６】
抗体産生のための該形質転換株の細胞増殖条件は一般には以下のとおりであった。
【０１３７】
該形質転換酵母株に関するタンパク質発現を、１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素塩基、４×１０−５％ ビオチンおよび１％ グリセロールよりなる緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）を使用して振とうフラスコにおいて２４℃で行った。タンパク質発現のための誘導培地は、ＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１％ メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）であった。該誘導培地を加えた時点で、メタノール中のＰｍｔインヒビターＰｍｔｉ−３を１８．３μＭの最終濃度まで該増殖培地に加えた。細胞を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０１３８】
ＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽スクリーニング法は、表２に示すパラメータに従った。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
接種後約１８時間の時点で、３５０ｍＬの培地Ａ（後記表６を参照されたい）＋４％ グリセロールを含有するＳｉｘＦｏｒｓ容器に、関心のある株を接種した。少量（１００％ メタノール中の０．２ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）（公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号を参照されたい）を接種物と共に加えた。約２０時間の時点で、１７ｍＬの５０％ グリセロール溶液（グリセロール・フェッドバッチ供給；後記表７を参照されたい）＋より大量（４ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３のボーラスを容器ごとに加えた。溶存酸素（ＤＯ）濃度における正のスパイクにより示される、該グリセロールが消費された約２６時間の時点で、メタノール供給（後記表６を参照されたい）を０．７ｍＬ／時間で連続的に開始した。同時に、別用量のＰｍｔｉ−３（４ｍｇ／ｍＬ ストックの０．３ｍＬ）を容器ごとに加えた。約４８時間の時点で、別用量（４ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を容器ごとに加えた。接種後約６０時間の時点で培養を回収し、加工した。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
以下のとおりにＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用してＯ−グリカンの測定を行った。Ｏ−グリコシル化の軽減を測定するために、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を用いて、該増殖培地からタンパク質を精製し、アルカリ除去（ベータ脱離）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：３４９−４５１（１９９９））により該Ｏ−グリカンをタンパク質から遊離させ分離した。この方法はまた、遊離したＯ−グリカン（オリゴマンノースまたはマンノース）の新たに生じた還元末端をマンニトールへと還元する。したがって、該マンニトール基は各Ｏ−グリカンの特有の指標として働く。１００μＬの容量のＰＢＳバッファー中に含有されている０．５ｎｍｏｌまたはそれ以上のタンパク質がベータ脱離に必要であった。該サンプルを２５μＬのアルカリ性ボロヒドリド試薬で処理し、５０℃で１６時間インキュベートした。約２０μＬのアラビトール内部標準を加え、ついで１０μＬの氷酢酸を加えた。ついで該サンプルを、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳおよびＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを介して遠心分離し、水で洗浄した。洗液を含む該サンプルをプラスチックオートサンプラーバイアルに移し、遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。１５０μＬの１％ ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨを該サンプルに加え、該サンプルを遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。この最終工程を更に５回繰返した。２００μＬの水を加え、１００μＬの該サンプルを、脈動電気化学的検出−Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣと組合された高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分析した。回収されたマンニトールの量に基づき、平均Ｏ−グリカン占有度を決定した。
【実施例３】
【０１４６】
本実施例は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の代わりにヒトＰＤＩを発現する前記株において産生されたタンパク質におけるＯ−グリカンの占有度が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）またはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）が該株において過剰発現された場合、有意に減少されうることを実証する。本実施例においては、該効果は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する抗体を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を使用して例示されている。
【０１４７】
ＰｐＰＭＲ１遺伝子をコードする発現カセットを以下のとおりに構築した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）のオープンリーディングフレームを、プライマー（ＰｐＰＭＲ１／ＵＰ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３６）およびＰｐＰＭＲ１／ＬＰ：５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧ−３’（配列番号３７））を使用してピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ１１４３０ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル；９５℃で１０秒間、５２℃で２０秒間および７２℃で３分間の５サイクル；９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で３分間の２０サイクル；ならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローニングし、ｐＧＬＹ３８１１と命名した。ＰｓｔＩおよびＦｓｅＩでプラスミドを消化することにより（ＦｓｅＩでの消化の前に該ＰｓｔＩ末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）、ｐＧＬＹ３８１１からＰｐＰＭＲ１を取り出した。ＰｐＰＭＲ１をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ（該末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）およびＦｓｅＩで消化されたｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングして、ＰｐＰＭＲ１がＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結されているｐＧＬＹ３８２２を得た。プラスミドｐＧＬＹ３８２２はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化する。プラスミドｐＧＬＹ３８２２を図８に示す。ＰｐＰＭＲ１のＤＮＡ配列を配列番号３２に記載し、ＰｐＰＭＲ１のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。
【０１４８】
アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）をコードする発現カセットを以下のとおりに構築した。ＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から合成し、クローニングしてｐＧＬＹ３３０６を得た。ＭｌｙＩおよびＦｓｅＩで消化し、ＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ（該末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）およびＦｓｅＩで消化されたｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングすることにより、合成されたＡｔＥＣＡ１をｐＧＬＹ３３０６から回収して、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７を得た。プラスミドｐＧＬＹ３８２７はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化する。プラスミドｐＧＬＹ３８２７を図９に示す。ＡｔＥＣＡ１のＤＮＡ配列をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化し、配列番号３４に示す。コードされるＡｔＥＣＡ１は、配列番号３５に記載されているアミノ酸配列を有する。
【０１４９】
組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２（ＰｐＰＭＲ１をコードする発現カセットを含有する）またはｐＧＬＹ３８２７（ＡｔＥＣＡ１をコードする発現カセットを含有する）をＳｐｅＩで線状化し、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ｙＧＬＹ３６４７またはｙＧＬＹ３６９３内にＵＲＡ６遺伝子座において形質転換した。ＵＲＡ６遺伝子座におけるｐＧＬＹ３８２２またはｐＧＬＹ３８２７のゲノム組込みは、以下のプライマーを使用するコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）により確認された：ＵＲＡ６遺伝子座内へのＰｐＰＭＲ１組込みを確認するためには、５’ＡＯＸｌ（５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号３８）およびＰｐＰＭＲ１／ｃＬＰ（５’−ＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３９）；ＵＲＡ６遺伝子座内へのＡｔＥＣＡ１の組込みを確認するためには、５’ＡＯＸ１およびＡｔＥＣＡ１／ｃＬＰ（５’−ＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４０）。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１５０】
ＰｐＰＭＲ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２３８を作製した。株ｙＧＬＹ３６４７においては、実施例１に記載され図１Ａおよび１Ｂに示されているとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１シャペロン遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で置換されている。
【０１５１】
ＡｔＥＣＡ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２４０を作製した。該株の系譜を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１５２】
ヒト化シャペロン株へのＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１の添加が、該株により産生された抗体のＯ−グリコシル化の軽減に及ぼす効果に関して、該株を評価した。表７に示すとおり、株ｙＧＬＹ３６４７内へのＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１の添加は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の代わりにヒトＰＤＩを発現する株ｙＧＬＹ３６４７、または内因性ＰＤＩ１しか発現しないが株ｙＧＬＹ３６４７と同様のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を有する抗体を産生しうる株ｙＧＬＹ２２６３と比較して、Ｏ−グリコシル化占有度における有意な減少を引き起こした。該結果はまた、その内因性ＰＤＩ１を発現するがヒトＰＤＩ１を発現せずＣａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株が、減少したＯ−グリカン占有度を有する糖タンパク質を産生することを示唆している。
【０１５３】
【表７】
【実施例４】
【０１５４】
自身の天然シグナル配列を伴わないヒトカルレチクリン（ｈＣＲＴ）をコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマーを使用してヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅した：ｈＣＲＴ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＨＡ／ＵＰ：５’−ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号４５）およびｈＣＲＴ−ＰａｃＩ／ＬＰ；５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４６）。該ＰＣＲ条件は、９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ Ｔｏｐｏベクター内にクローニングしてｐＧＬＹ１２２４を得た。ｈＣＲＴをコードするＤＮＡは更に、コードされるトランケート化ｈＣＲＴがそのＮ末端におけるＨＡタグおよびそのＣ末端におけるＨＤＥＬを有するように修飾を含んでいた。ｈＣＲＴをコードするＤＮＡをＢｓｔＺ１７１およびＰａｃＩでの消化によりｐＧＬＹ１２２４から遊離させ、該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ適合末端を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列をコードするＤＮＡ断片と共に、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化された発現ベクターｐＧＬＹ５７９内にクローニングして、ｐＧＬＹ１２３０を得た。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターに機能的に連結されておりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＨＩＳ３遺伝子座を標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列およびＮ末端におけるＨＡタグおよびそのＣ末端におけるＨＤＥＬ配列と共にｈＣＲＴをコードする組込み／発現プラスミドである。
【０１５５】
ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ適合末端を有する、ヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードするＤＮＡ断片がＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧにより合成された。ついで該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化されたｐＧＬＹ１２９内にクローニングして、ｐＧＬＹ１２３１を得た。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターに機能的に連結されたｈＥＲｐ５７をコードしている。
【０１５６】
プラスミドｐＧＬＹ１２３１をＳｗａＩで消化し、ｈＥＲｐ５７をコードするＤＮＡ断片を、ＰｍｅＩで消化されたプラスミドｐＧＬＹ１２３０内にクローニングした。したがって、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４はｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７の両方をコードしている。プラスミドｐＧＬＹ１２３４を図１０に示す。
【０１５７】
５’ＦＯＡの存在下で株ｙＧＬＹ２６９０を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ３６４２を作製した（ＵＲＡ５栄養要求体）。
【０１５８】
ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７をコードしＨＩＳ３遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４でｙＧＬＹ３６４２を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６６８を作製した。
【０１５９】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ３６６８を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６９３を作製した。
【０１６０】
ＰｐＰＭＲ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２３９を作製した。
【０１６１】
ＡｔＥＣＡ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２４１を作製した。
【０１６２】
本実施例に記載されている株の系譜を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１６３】
前実施例のＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１を発現するヒト化シャペロン株へのｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７の添加が産生抗体のＯ−グリカン占有度の更なる減少をもたらしうるかどうかを調べるために、前記株を評価した。表８に示すとおり、ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７のみを発現する株ｙＧＬＹ３６９３においては、Ｏ−グリカン占有度における約２倍の減少が認められ、これは、ＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１を更に発現する株においては更に４倍まで減少した。該結果はまた、その内因性ＰＤＩ１を発現しＣａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株が、減少したＯ−グリカン占有度を有する糖タンパク質を産生することを示唆している。
【０１６４】
【表８】
【０１６５】
【表９】
【０１６６】
本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれに限定されないと理解されるべきである。通常の技量を有し本明細書中の教示を利用できる当業者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、小胞体レクチンシャペロン、例えばカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）（ＣＲＴ）もしくはカルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）（ＣＲＸ）および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む宿主細胞、ならびに軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質の製造のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の記載
糖タンパク質は、触媒、シグナリング、細胞−細胞コミュニケーションならびに分子認識および会合を含む、ヒトおよび他の哺乳動物における多数の必須機能を媒介する。糖タンパク質は真核生物における非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する（ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３））。多数の糖タンパク質が治療目的に利用されており、過去２０年間に、天然に存在する糖タンパク質の組換え体がバイオテクノロジー産業の主要部分となっている。治療剤として使用される組換えグリコシル化タンパク質の具体例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）５およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）（Ｇｕｍｍｉｎｇら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１））が含まれる。潜在的予防剤および治療剤として製造された組換えタンパク質は臨床使用に近づいているため、組換え的に製造された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変化は、最近、科学界において非常に注目されている話題である。
【０００３】
一般に、糖タンパク質オリゴ糖のグリコシル化構造は、それを産生させるために使用される宿主によって様々である。非ヒト宿主細胞において産生された治療用タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性応答を惹起しうる非ヒトグリコシル化、例えば、酵母における高マンノシル化（ｈｙｐｅｒｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）（Ｂａｌｌｏｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０（１９９０））、植物におけるα（１，３）−フコースおよびβ（１，２）−キシロース（Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：３６５−３７２（１９９９））、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２（１９９５））、およびマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９（１９９３））を含有する可能性がある。
【０００４】
非ヒト哺乳類細胞により産生された糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のものに、より密接に関連している傾向にあるため、ほとんどの市販糖タンパク質は哺乳類細胞において産生される。しかし、哺乳類細胞はタンパク質産生用宿主細胞としての幾つかの重要な欠点を有する。哺乳類細胞におけるタンパク質の製造方法は、高い費用を要することに加えて、異種集団の糖形態を産生し、低い容量測定力価を示し、継続的なウイルス抑制を要すると同時に安定な細胞系を作製するための相当な時間を要する。２０００年頃までは、ヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有する組換え糖タンパク質を産生させるのに適した下等真核宿主細胞は実現不可能であった。その後、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓは米国特許第７，０２９，８７２号において、ヒト様Ｎ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を製造しうる組換え下等真核宿主細胞の製造方法を開示した。したがって、現在、組換え糖タンパク質を製造するために下等真核宿主細胞を使用することに相当な関心が持たれている。
【０００５】
Ｎ−結合グリコシル化の経路は多くの分析の対象となっているが、Ｏ−結合グリコシル化の過程および機能も十分には理解されていない。Ｎ−結合グリコシル化とは対照的に、Ｏ−グリコシル化は翻訳後事象であり、これはシスゴルジにおいて生じることが公知である（Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０（１９９３））。Ｎ−結合グリコシル化の場合と同様のＯ−結合グリコシル化のためのＯ−結合グリコシル化コンセンサスアクセプター配列は存在しないようであるが、幾つかの糖タンパク質の多数のＯ−結合グリコシル化部位のアミノ酸配列の比較は、グリコシル化残基と比較した場合の−１および＋３におけるプロリン残基の頻度の増加ならびにセリン、トレオニンおよびアラニン残基の著しい増加を示している（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４（１９９１））。糖タンパク質におけるセリンおよびトレオニン残基の伸長はＯ−グリコシル化のための潜在的部位でもありうる。酵母由来組換えタンパク質は、しばしば、それらの天然対応物と比較して追加的な非天然Ｏ−グリカンを含有することが示されている（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．３３：１５１−２０８，（１９９８））。これらの非天然Ｏ−グリカンは、望ましくない免疫原性または異常活性を有するタンパク質を与えうる。したがって、Ｏ−グリコシル化が軽減している又はそれを伴わない酵母および他の下等真核生物におけるタンパク質の製造方法を開発することが必要とされている。
【０００６】
Ｔａｎｎｅｒらは米国特許第５，７１４，３７７号において、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＭＴ１およびＰＭＴ２遺伝子、ならびに組換えタンパク質が産生されるようＰＭＴ遺伝子の１以上が遺伝的に修飾されている真菌細胞を使用する軽減したＯ−結合グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法を記載している。
【０００７】
Ｎｇらは米国公開特許出願第２００２００６８３２５号において、アンチセンスもしくは共抑制の使用またはＯ−結合グリコシル化に関連した遺伝子（特にＰＭＴ遺伝子の１以上）における機能喪失突然変異を有する酵母宿主株の操作によるＯ−グリコシル化の抑制を開示している。
【０００８】
Ｃｌａｕｓｅｎは米国公開特許出願第２００３０１８６８５０号において、ポリペプチドＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼのレクチンを選択的に抑制するための及びＯ−グリカン生合成に関与する他のグリコシルトランスフェラーゼの基質として働かないようにするためのＧａｌＮＡｃ−ベータ−ベンジルの使用を開示している。
【０００９】
Ｏｒｃｈａｒｄらは米国特許第７，１０５，５５４号において、ベンジリデンチアゾリジンジオンおよび抗真菌剤としてのそれらの使用を記載している。例えば、ＢｏｂｒｏｗｉｃｚらがＷＯ２００７０６１６３１において示している抗真菌剤は、軽減したＯ−結合グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造のための宿主細胞に致死的ではない様態で使用されうる。
【００１０】
Ｋｏｎｒａｄらは米国公開特許出願第２００２０１２８２３５号において、組織または細胞におけるＯ−結合タンパク質グリコシル化を薬理学的に抑制することにより糖尿病を治療または予防するための方法を開示している。
【００１１】
Ｋｏｊｉｍａらは米国特許第５，２６８，３６４号において、白血球または腫瘍細胞によるＳＬｅｘまたはＳＬｅａの発現を阻止して内皮細胞および血小板へのこれらの細胞の接着を抑制するための、Ｏ−α−ＧａｌＮＡｃの蓄積を招くＯ−グリコシル化の伸長を抑制するベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミンのような化合物を使用するＯ−グリコシル化の抑制のための治療用組成物を開示している。
【００１２】
Ｂｏｉｍｅらは米国特許第６，１０３，５０１号において、グリコシル化部位のアミノ酸配列を修飾することによりＯ−結合グリコシル化が改変されたホルモンの変異体を開示している。
【００１３】
しかし、Ｏ−グリコシル化が軽減された又はそれを伴わないタンパク質を産生する組換え宿主細胞を製造するための前記の試みを考慮したとしても、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞が尚も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，０２９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１４，３７７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００６８３２５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１８６８５０号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１０５，５５４号明細書
【特許文献６】国際公開第２００７／０６１６３１号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００２／０１２８２３５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２６８，３６４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，１０３，５０１号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＬｉｓおよびＳｈａｒｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３）
【非特許文献２】Ｇｕｍｍｉｎｇら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：１１５−１３０（１９９１）
【非特許文献３】Ｂａｌｌｏｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０（１９９０）
【非特許文献４】Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：３６５−３７２（１９９９）
【非特許文献５】Ｎｏｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２（１９９５）
【非特許文献６】Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９（１９９３）
【非特許文献７】Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０（１９９３）
【非特許文献８】Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４（１９９１）
【非特許文献９】Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．３３：１５１−２０８，（１９９８）
【発明の概要】
【００１６】
発明の簡潔な概要
本発明者らは、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え宿主細胞における組換えタンパク質の発現が、該組換え宿主細胞において内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現させることによりもたらされうることを見出した。内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する宿主細胞は、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない同じ細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生する。実施例に示されているとおり、異種または内因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする発現カセットを含む組換え宿主下等真核宿主細胞は、内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない細胞と比較してＯ−グリカン占有度が４倍まで減少した組換えタンパク質を産生することが可能であった。
【００１７】
したがって、本発明は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子が導入されている下等真核宿主細胞であって、該核酸分子が該宿主細胞内で発現され、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、下等真核宿主細胞を提供する。特定の態様においては、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼは、該宿主細胞において機能的であり該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの構成的または調節可能な発現をもたらしうる異種調節配列に機能的に連結されたオープンリーディングフレームによりコードされている。更なる態様においては、該下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。更に詳細な態様においては、該宿主細胞はメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。特定の態様においては、該Ｃａ２＋ ＡＴＰは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＲ１およびアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＣＡ１よりなる群から選ばれる。
【００１８】
更なる態様においては、本発明の下等真核宿主細胞は、下等真核宿主細胞由来の調節性ヌクレオチド配列と、前記宿主細胞により産生されるべき選択された哺乳類タンパク質をコードするコード配列とを含む組換えベクターで更に形質転換される。ある態様においては、選択された哺乳類タンパク質は治療用タンパク質であり、抗体（これに限定されるものではない）を含む糖タンパク質でありうる。
【００１９】
更なる実施形態においては、該宿主細胞は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするベクターが宿主細胞に導入され宿主細胞において発現される、酵母または糸状菌宿主細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞であることが可能であり、該宿主細胞は更に、該宿主細胞内に導入された例えば抗体のようなヒト治療用糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞に由来し該細胞において機能性である調節性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現する。
【００２０】
また、該下等真核宿主細胞におけるカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）およびＥＲｐ５７タンパク質の過剰発現はＯ−グリカン占有度の減少をももたらしうることが判明している。したがって、異所性発現されるカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む下等真核宿主細胞も提供する。更なる実施形態においては、該宿主細胞は、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含み、ここで、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である。一般に、該下等真核宿主細胞は更に、組換えタンパク質をコードする核酸分子を含み、該タンパク質は、特定の態様においては糖タンパク質であり、これは、更なる態様においては抗体またはそのフラグメント、例えばＦｃもしくはＦａｂである。
【００２１】
更なる実施形態においては、前記宿主細胞のいずれかは、機能性ＰＭＴ遺伝子を有する宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞を得るために、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子の機能を軽減または排除するために操作される。更なる態様においては、該ＰＭＴタンパク質は、ＰＭＴ１およびＰＭＴ４よりなる群から選ばれる。更なる態様においては、該宿主細胞は更に、ＰＭＴ遺伝子発現またはＰＭＴタンパク質機能のインヒビターの１以上と接触される。
【００２２】
更なる実施形態においては、内因性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が軽減、欠失または破壊され、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該細胞内に導入される。特定の態様においては、該シャペロンタンパク質はＰＤＩ１タンパク質である。
【００２３】
前記宿主細胞の更なる態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選ばれる。
【００２４】
更なる実施形態は、本明細書に開示されている遺伝的修飾を含まない組換え糖タンパク質と比較して軽減したＯ−グリコシル化またはＯ−グリカン占有度を有する組換えタンパク質の製造方法を含む。組換えタンパク質は、抗体およびそのフラグメントを含む治療上重要なタンパク質および糖タンパク質を含む。
【００２５】
したがって、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２６】
更に、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）ＣＲＴまたはＥＲｐ５７の少なくとも１つをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の発現は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２７】
更に、組換えタンパク質の製造方法であって、（ａ）内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよびＣＲＴまたはＥＲｐ５７の少なくとも１つをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性であり、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ、ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７は異所性である）を準備し、（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法を提供する。
【００２８】
更なる実施形態においては、機能性ＰＭＴ遺伝子を有する宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる宿主細胞を得るための、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の機能。更なる態様においては、該ＰＭＴタンパク質は、ＰＭＴ１およびＰＭＴ４よりなる群から選ばれる。更なる態様においては、該宿主細胞は更に、ＰＭＴ遺伝子発現またはＰＭＴタンパク質機能のインヒビターの１以上と接触される。
【００２９】
更なる実施形態においては、内因性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が軽減、欠失または破壊され、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該細胞内に導入される。特定の態様においては、該シャペロンタンパク質はＰＤＩ１タンパク質である。
【００３０】
更に詳細な態様においては、本明細書に開示されている宿主細胞のいずれかはＰＭＴ遺伝子のインヒビターの存在下で増殖されうる。
【００３１】
本発明における方法は、抗体（これに限定されるものではない）を含む治療上重要なタンパク質を製造するのに特に有用である。したがって、治療上重要なタンパク質を製造するための、本発明における宿主細胞のいずれかの使用を提供する。特定の態様においては、抗体を製造するための、本発明における宿主細胞のいずれかの使用。
【００３２】
前記方法の更なる態様においては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選ばれる。
【００３３】
更に、本明細書に開示されている宿主細胞により製造される組換えタンパク質を提供する。
【００３４】
特定の実施形態においては、前記宿主細胞のいずれかは更に、主に特定のＮグリカン構造体またはＮグリカン構造体の特定の混合物を有する糖タンパク質を該宿主細胞が産生するのを可能にする遺伝的修飾を含みうる。例えば、該宿主細胞は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮグリカン（これは、特定の態様においては、１以上の追加的な糖、例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースまたはシアル酸を非還元末端に、そして場合によっては、還元末端のＧｌｃＮＡｃ上にフコースを含む）を産生するよう遺伝的に操作されている。したがって、Ｎグリカンは、二アンテナ（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）および多アンテナ（ｍｕｌｔｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）糖形態ならびに二分枝状（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）の糖形態の両方を含む。Ｎグリカンの具体例には、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
定義
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００３６】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００３７】
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意義を有すると理解されるものとする。
【００３８】
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「糖形態」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、該タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、ゴルジ装置内で継続する。
【００３９】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有することが可能であり、該残基は、場合によっては、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数の分枝を有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」とも称される。
【００４０】
本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００４１】
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸分子を運搬しうる核酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミドベクター」であり、これは、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結されうるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、それが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。
【００４２】
本明細書中で用いる「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」なる語は、宿主細胞内で通常は産生されない、タンパク質を典型的にはコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主細胞ゲノム内に安定に組込まれた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心のある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上のポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼが含まれる。
【００４３】
「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の両方の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。
【００４４】
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するよう、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するよう、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【００４５】
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
【００４６】
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。後の世代においては突然変異または環境の影響により或る修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
【００４７】
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
【００４８】
「下等真核細胞」なる語は、酵母および糸状菌を含む。酵母および糸状菌は、限定的なものではないが、以下のものを含む：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、いずれかのサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、いずれかのクライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、いずれかのアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、いずれかのフザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。
【００４９】
タンパク質をコードする遺伝子の機能が「軽減」していると言えるのは、その遺伝子が例えば１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異または置換により修飾されていて、そのような修飾を伴わない対応遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して、標準的なアッセイで測定された場合に少なくとも２０％〜５０％低い活性、特定の態様においては、少なくとも４０％低い活性または少なくとも５０％低い活性を有するタンパク質を該修飾遺伝子がコードしている場合である。タンパク質をコードする遺伝子の機能が「排除」されていると言えるのは、その遺伝子が例えば１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異または置換により修飾されていて、そのような修飾を伴わない対応遺伝子によりコードされるタンパク質と比較して、標準的なアッセイで測定された場合に少なくとも９０％〜９９％低い活性、特定の態様においては、少なくとも９５％低い活性または少なくとも９９％低い活性を有するタンパク質を該修飾遺伝子がコードしている場合である。
【００５０】
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明に関連する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。典型的な方法および物質（材料）を以下に説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および物質も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記載されている全ての刊行物および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。該材料、方法および実施例（具体例）は例示に過ぎず、何ら限定的ではないと意図される。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に開示されている遺伝的に操作されていない宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質を産生しうる組換え宿主細胞を提供する。一般に、１以上の内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの異所性発現のための１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞、および軽減したＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するための、該組換え宿主細胞の使用を提供する。
【００５２】
本発明者らは、組換え宿主細胞における内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの過剰発現が、内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しない宿主細胞と比較して軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造を可能にすることを見出した。実施例３および４に示すとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）またはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）の過剰発現は、いずれのＣａ２＋ ＡＴＰアーゼをも発現しない宿主細胞株と比較してＯ−グリカン占有度における４倍以上の減少をもたらした。したがって、内因性または外因性ゴルジまたはＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ここで、該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼは異種プロモーターに機能的に連結されている）をコードする１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有する組換え糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を与えるであろう。これらの宿主細胞は、タンパク質上のＯ−グリコシル化の量が軽減することが望まれる組換えタンパク質を製造するために使用されうる。好適な他のＣａ２＋ ＡＴＰアーゼには、ヒトＳＥＲＣＡ２ｂタンパク質（ＡＴＰ２Ａ２ ＡＴＰアーゼ、Ｃａ＋＋輸送、心筋、緩縮２）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＯＤ１タンパク質（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＰＦ１のホモログ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
カルレチクリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）（ＣＲＴ）は、小胞体の内腔における主要Ｃａ（２＋）結合性（貯蔵）タンパク質として作用する多機能性タンパク質である。それは核においても見出され、このことは、それが転写調節において何らかの役割を果たしうることを示唆している。カルレチクリンは合成ペプチドＫＬＧＦＦＫＲ（配列番号４７）に結合し、これは核内受容体のスーパーファミリーのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列とほぼ同一である。カルレチクリンは、抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体を含有する全身性ループスおよびシェーグレン患者の或る血清における抗体に結合し、それは種間で高度に保存されており、それは小胞体および筋小胞体に位置し、それらの部位においてそれはカルシウムに結合しうる。カルレチクリンは、ミスフォールドしたタンパク質に結合し、小胞体からゴルジ装置へそれらが輸出されるのを妨げる。好適な他のタンパク質には、ヒトＵＧＧＴ（ＵＤＰ−グルコース：糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ）タンパク質およびヒトＲＥｐ２７タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ＥＲｐ５７は、新たに合成された糖タンパク質のフォールディングをモジュレーションするためにレクチンシャペロンであるカルレチクリンおよびカルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）と相互作用する小胞体のシャペロンタンパク質である。該タンパク質はかつてはホスホリパーゼであると考えられていたが、該タンパク質は実際にはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有することが実証されている。したがって、ＥＲｐ５７は小胞体（ＥＲ）の内腔タンパク質であり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーのメンバーである。レクチンとこのタンパク質との複合体は、それらの糖タンパク質基質におけるジスルフィド結合の形成を促進することによりタンパク質フォールディングを媒介すると考えられている。原型ＰＤＩとは対照的に、ＥＲｐ５７は、新たに合成された糖タンパク質と特異的に相互作用する。
【００５５】
本発明者らは更に、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒトＣＲＴおよびヒトＥＲｐ５７の過剰発現が、ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７を発現しない株と比較してＯ−グリカン占有度における約３分の１の軽減を引き起こすことを見出した。
【００５６】
したがって、宿主細胞における異所性発現のためのカルレチクリンタンパク質および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む組換え宿主細胞を更に提供する。これらの宿主細胞は、タンパク質上のＯ−グリコシル化の量が軽減されることが望ましい組換えタンパク質を製造するために使用されうる。該宿主細胞が、内因性または異種Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする１以上の核酸分子を更に含む場合、これらの宿主細胞はＯ−グリコシル化における更なる軽減を伴う。実施例４に示すとおり、内因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼまたは外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現しヒトカルレチクリンタンパク質およびヒトＥＲｐ５７タンパク質を過剰発現する組換え宿主細胞の提供は、該宿主細胞により産生された組換えタンパク質のＯ−グリコシル化における更なる軽減をもたらした。したがって、内因性または異種Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする１以上の核酸分子とカルレチクリンタンパク質および／またはＥＲｐ５７タンパク質をコードする１以上の核酸分子とを含む組換え宿主細胞を更に提供する。これらの宿主細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を製造するために使用されうる。
【００５７】
分子シャペロンは抗体のフォールディングおよび分泌において決定的に重要な役割を果たしている。１つのシャペロンタンパク質、特にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、抗体重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド間および内結合形成を触媒するよう機能する。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、非触媒化反応と比較してジスルフィド含有タンパク質の回収における相当な増加または相当な減少を引き起こしうる。すなわち、小胞体（ＥＲ）における高濃度のＰＤＩがジスルフィド含有タンパク質の発現に必須である（ＰｕｉｇおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７７６４−７７７１（１９９４））。実施例に示すとおり、内因性ＰＤＩ１シャペロン遺伝子がヒトＰＤＩシャペロン遺伝子で置換されている細胞は、軽減したＯ−グリコシル化を有していた。これらの細胞が内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよび／またはＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７タンパク質の異所性過剰発現を更に伴う場合、Ｏ−グリコシル化の更なる軽減が認められた（実施例３および４を参照されたい）。
【００５８】
したがって、Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼおよび／またはＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７タンパク質を異所性発現する宿主細胞が更に含まれ、ここで、内因性シャペロンタンパク質をコードする１以上の遺伝子が欠失している又は破壊されており、異種シャペロンタンパク質をコードする核酸分子が該シャペロンタンパク質の異所性発現のために導入されている。更なる実施形態は、追加的な異種コシャペロンタンパク質、例えばＥＲＯ−１αおよび／またはＧＲＰ９４タンパク質も該細胞において発現される前記細胞を含む。
【００５９】
下等真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、分泌タンパク質のセリルおよびトレオニル残基へのマンノースの転移に関与するタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）として公知の遺伝子のファミリーを含有する。本発明者らは、１以上のヒト化またはキメラシャペロン遺伝子を発現するよう遺伝的に改変されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系が、細胞増殖またはタンパク質発現にほとんど又は全く影響を及ぼすことなく、より良好に１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失に耐えうることを見出した。欠失されうるＰＭＴ遺伝子には、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５およびＰＭＴ６が含まれる。一般に、ＯＣＨ１遺伝子およびＰＭＴ遺伝子の両方が欠失しているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は増殖不良を示すか又は全く増殖しない。ＯＣＨ１遺伝子の欠失または機能的ノックアウトは、ヒト様Ｎ−グリカンを有するヒト糖タンパク質を産生しうる組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の構築に必要である。Ｏ−グリコシル化を有さない又は軽減したＯ−グリコシル化を有するヒト糖タンパク質を製造することが望ましいため、ヒト様Ｎ−グリカンを有するヒト糖タンパク質をも産生しうる組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞におけるＯ−グリコシル化を軽減するための手段を見出すことが必要とされている。したがって、更なる実施形態において、１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を更に含む宿主細胞を提供する。
【００６０】
更なる態様においては、該過剰発現遺伝子産物は分泌遺伝子産物である。過剰発現遺伝子産物が分泌されるかどうかを観察するための方法は当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓおよびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．。
【００６１】
過剰発現遺伝子産物を分泌させるためには、該過剰発現遺伝子産物の分泌に十分な条件下、該宿主細胞を培養する。そのような条件は、該細胞による分泌を可能にする温度、栄養および細胞密度条件を含む。更に、そのような条件は、該細胞が転写、翻訳、および１つの細胞画分から別の細胞画分へのタンパク質の移行の基本的細胞機能を行いうる条件であり、当業者に公知である。
【００６２】
更に、当業者に公知のとおり、分泌遺伝子産物は、現在の宿主細胞を維持するため又は増殖させるために使用される培地内で検出されうる。該培地は、公知方法、例えば遠心分離または濾過により、該宿主細胞から分離されうる。ついで該過剰発現遺伝子産物は、該過剰発現遺伝子産物の公知特性を利用することにより無細胞培地内で検出されうる。そのような特性には、該過剰発現遺伝子産物の特徴的な免疫学的、酵素的または物理的特性が含まれうる。例えば、過剰発現遺伝子産物が特有の酵素活性を有する場合、該宿主細胞により利用される培地上でその活性に関するアッセイが行われうる。更に、与えられた過剰発現遺伝子産物に対して反応性である抗体が利用可能である場合には、いずれかの公知の免疫学的アッセイで該遺伝子産物を検出するために、そのような抗体が使用されうる（Ｈａｒｌｏｗｅら，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００６３】
また、分泌遺伝子産物は融合タンパク質であることが可能であり、この場合、該遺伝子産物は、該遺伝子産物の分泌を促進する異種シグナルまたはリーダーペプチドを含む。分泌シグナルペプチドは特有のアミノ酸配列であり、これは、該宿主細胞が遺伝子産物を内部および外部細胞膜を介して細胞外環境へ導くのを可能にする。分泌シグナルペプチドは、分泌のための新生ポリペプチド遺伝子産物のＮ末端に存在する。追加的な真核分泌シグナルも、特異的アミノ酸に結合した炭水化物の形態（すなわち、グリコシル化分泌シグナル）で、該遺伝子産物のポリペプチド鎖に沿って存在しうる。
【００６４】
Ｎ末端シグナルペプチドは、約２〜約１０アミノ酸の短い荷電ドメインに続いて存在しうる約１０〜約３０アミノ酸の疎水性ドメインを含む。更に、該シグナルペプチドは分泌のための遺伝子産物のＮ末端に存在する。一般に、シグナル配列の個々の配列は決定的に重要ではないが、シグナル配列は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）などのような疎水性アミノ酸に富む。
【００６５】
多数のシグナルペプチドが公知である（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：４２５（１９８２））。例えば、酵母酸ホスファターゼ、酵母インベルターゼおよび酵母α因子シグナルペプチドが異種ポリペプチドコード領域に結合されており、該異種ポリペプチドの分泌のために成功裏に使用されている（例えば、Ｓａｔｏら，Ｇｅｎｅ ８３：３５５−３６５（１９８９）；Ｃｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１８１２−１８１９（１９８６）；およびＢｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６（１９８４）を参照されたい）。したがって、５’末端にシグナルペプチドをも有する過剰発現遺伝子産物のコード領域をコードする核酸を当業者は容易に設計または入手することが可能である。
【００６６】
好ましくは本方法により分泌される過剰発現遺伝子産物の具体例には、哺乳類遺伝子産物、例えば酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ワクチン、抗体などが含まれる。より詳しくは、過剰発現遺伝子産物には、エリスロポエチン、インスリン、ソマトトロピン、成長ホルモン放出因子、血小板由来成長因子、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、顆粒球コロニー刺激因子、多系統コロニー刺激活性、顆粒球−マクロファージ刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、Ｔ細胞増殖因子、リンホトキシン、免疫グロブリン、抗体などのような遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫グロブリンまたは抗体の定常領域に融合されたペプチドおよびポリペプチド（これらに限定されるものではない）を含む融合タンパク質が更に含まれる。特に有用な過剰発現遺伝子産物はヒト遺伝子産物である。
【００６７】
「抗体」および「免疫グロブリン」なる語は、組換えＤＮＡ技術により産生された任意の組換えモノクローナル抗体を含み、更にヒト化およびキメラ抗体を含むと意図される。
【００６８】
本方法は、ワクチンとして使用されうる任意の過剰発現遺伝子産物の分泌を増強するために容易に適合化されうる。ワクチンとして使用されうる過剰発現遺伝子産物には、哺乳類病原体の任意の構造的、膜会合、膜結合または分泌遺伝子産物が含まれる。哺乳類病原体には、哺乳類に感染し又は哺乳類を攻撃しうるウイルス、細菌、単細胞または多細胞寄生生物が含まれる。例えば、ウイルスワクチンには、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ワクシニア、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ポリオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、デングウイルス、日本脳炎Ｂ、水痘・帯状疱疹、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎、ロタウイルスのようなウイルスに対するワクチン、ならびにライム病、麻疹、黄熱病、流行性耳下腺炎、狂犬病、ヘルペス、インフルエンザ、パラインフルエンザなどのようなウイルス疾患に対するワクチンが含まれうる。細菌ワクチンには、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）などのような細菌に対するワクチンが含まれうる。
【００６９】
一般に、本発明の過剰発現タンパク質（例えば、Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ、ＥＲｐ５７、カルレチクリン）および組換えタンパク質は、組換え的に、すなわち、過剰発現タンパク質または組換えタンパク質をコードする核酸分子を発現カセット内に配置することにより発現される。そのような発現カセットは少なくとも調節配列を含有し、これは、該タンパク質をコードする核酸分子に該配列が機能的に連結されている場合に該タンパク質の発現をもたらす。ついで該発現カセットを、複製起点、選択マーカー、転写または終結シグナル、動原体、自律的複製配列などのような追加的要素をも含有しうるプラスミドのようなベクター内に挿入して、発現ベクターを得る。
【００７０】
発現ベクターは複製可能または複製不能な発現ベクターでありうる。複製可能な発現ベクターは、宿主細胞染色体ＤＮＡから独立して複製可能であり、あるいは宿主細胞染色体ＤＮＡ内にそのようなベクターが組込まれているため複製可能である。組込み発現ベクターは、該ベクターが後に組込まれる宿主細胞ゲノム内の特定の位置へと該発現ベクターを標的化する標的化配列を含む。宿主細胞染色体ＤＮＡ内に組込まれると、そのような発現ベクターは幾つかの構造要素を喪失しうるが、過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子および該過剰発現または組換えタンパク質の発現をもたらしうるセグメントを保有する。したがって、本発明における発現ベクターは染色体組込み性または染色体非組込み性発現ベクターでありうる。
【００７１】
更なる態様においては、宿主細胞内への組込み性または非組込み性発現ベクターの導入により、該宿主細胞において１以上の過剰発現または組換えタンパク質を過剰発現させる。少なくとも１つの過剰発現または組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクターの導入の後、該遺伝子産物をコードする内因性遺伝子の発現を誘導することにより、あるいは該遺伝子産物をコードする発現ベクターを宿主細胞内に導入することにより、該遺伝子産物を過剰発現させる。もう１つの実施形態においては、少なくとも１つの異種シャペロンタンパク質を構成的に又は誘導可能な様態で発現する細胞系を樹立する。過剰発現すべき遺伝子産物をコードする発現ベクターをそのような細胞系内に導入して、該過剰発現遺伝子産物の分泌を亢進させる。
【００７２】
発現ベクターが該過剰発現または組換えタンパク質の発現を可能にして、選択された宿主細胞型におけるそのような遺伝子産物の分泌を促進する限り、本発現ベクターは１つの宿主細胞型（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））においては複製可能であるが別の宿主細胞型（例えば、真核宿主細胞）においてはほとんど又は全く複製を受けないことが可能である。
【００７３】
本明細書に記載されている発現ベクターは、所望の遺伝子、すなわち、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする遺伝子の制御発現のために操作されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。そのようなベクターは、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された核酸分子セグメントをもコードしうる。この文脈における機能的に連結されたは、そのようなセグメントが、該過剰発現または組換えタンパク質をコードする核酸分子の発現をもたらしうることを意味する。これらの核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、上流制御要素、転写因子またはリプレッサー結合部位、終結シグナル、および意図される宿主細胞における遺伝子発現を制御しうる他の要素を含む。好ましくは、該ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、コスミドまたはウイルスである。
【００７４】
本発明の発現ベクターは酵母または哺乳類細胞において機能する。酵母ベクターには、酵母２μサークルおよびその誘導体、酵母自律的複製配列をコードする酵母ベクター、酵母ミニ染色体、任意の酵母組込みベクターなどが含まれうる。多数のタイプの酵母ベクターの包括的一覧がＰａｒｅｎｔら（Ｙｅａｓｔ １：８３−１３８（１９８５））に記載されている。
【００７５】
遺伝子産物の発現をもたらしうる要素または核酸調節配列には、プロモーター、エンハンサー要素、上流活性化配列、転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位が含まれる。全てのそのようなプロモーターおよび転写調節要素が、単独で又は組合されて、本発現ベクターにおいて使用されると想定される。更に、遺伝的に操作された及び突然変異した調節配列も想定される。
【００７６】
プロモーターは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列要素である。特に、プロモーターは転写開始部位を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含みうる。選択されるプロモーターは、選択された個々の宿主系において機能しうると予想されるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母プロモーターが本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌プロモーターが使用されるであろう。酵母プロモーターの具体例には、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦおよびＧＵＴ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｒｏｍａｎｏｓら（Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８（１９９２））は酵母プロモーターおよび発現ベクターの総説を記載している。
【００７７】
本明細書に開示されている核酸分子に機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターまたは誘導プロモーターでありうる。誘導プロモーターは、転写因子の結合に際して、増加または減少した速度での転写を導くプロモーターである。本明細書中に記載の転写因子には、プロモーターの調節または制御領域に結合して転写に影響を及ぼしうる任意の因子が含まれる。宿主細胞における転写因子のプロモーター結合能または合成は、該宿主を誘導因子にさらす又は宿主細胞培地から誘導因子を除去することにより制御されうる。したがって、誘導プロモーターの発現を調節するためには、誘導因子を宿主細胞の増殖培地に加えるか又は該増殖培地から除去する。そのような誘導因子には、糖、ホスファート、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、寒冷などが含まれうる。例えば、酵母において一般的に用いられる誘導因子はグルコース、ガラクトースなどである。
【００７８】
選択される転写終結配列は、選択された個々の宿主細胞において機能しうるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が使用される場合には、酵母転写終結配列が本発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌転写終結配列が使用されるであろう。転写終結配列には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３ ＴＴ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列（ＰｐＰＭＡ１ ＴＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の発現ベクターは選択マーカーをもコードしうる。選択マーカーは、選択マーカーを含有するベクターで形質転換された細胞が非形質転換細胞から識別されうるよう、同定可能な形質を宿主細胞に付与する遺伝的機能体である。また、該マーカーに連結された遺伝的機能体が宿主細胞集団において保有されることを保証するために、ベクター内への選択マーカーの導入が用いられうる。そのような選択マーカーは、いずれかの容易に同定される優性形質、例えば薬物耐性、細胞栄養素などを合成または代謝する能力などを付与しうる。
【００８０】
酵母選択マーカーは、薬物耐性マーカー、および必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能体を含む。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））などが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能体が、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異体を有する利用可能な酵母株と共に使用される。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国公開出願第２００７／００７２２６２号に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている。例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、ＷＯ２００７１３６８６５およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／１３７１９を参照されたい。挿入部位の具体例には、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＭＣＡ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＣＹＭ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＰＥＰ遺伝子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＰＲＢ遺伝子およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＬＥＵ遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号に記載されており、ＨＩＳ３およびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０に記載されている。
【００８１】
したがって、本発現ベクターは、培養内に存在する細胞集団内のベクター含有宿主細胞を特定し維持するのに有用な選択マーカーをコードしうる。幾つかの場合においては、選択マーカーは、発現ベクターのコピー数を増幅するためにも使用されうる。過剰発現または組換えタンパク質をコードするＲＮＡを産生させるために本発現ベクターから転写を誘導した後、該ＲＮＡは細胞因子により翻訳されて該過剰発現または組換えタンパク質を与える。
【００８２】
酵母および他の真核生物においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳は、該ｍＲＮＡの５’キャップへのリボソーム結合、およびポリペプチド合成が開始されうる最初のＡＵＧ開始コドンへの該ｍＲＮＡに沿った該リボソームの移動により開始される。酵母および哺乳類細胞における発現は、原核生物発現系において時には必要とされるような、リボソーム結合部位と開始コドンとの間の特定の数のヌクレオチドを一般には要しない。しかし、酵母または哺乳類宿主細胞における発現の場合、ｍＲＮＡにおける最初のＡＵＧコドンは、好ましくは、所望の翻訳開始コドンである。
【００８３】
更に、酵母宿主細胞において発現が行われる場合、長い（例えば、５０〜１００ヌクレオチドより長い）非翻訳リーダー配列の存在は、ｍＲＮＡの翻訳を軽減しうる。酵母ｍＲＮＡリーダー配列は約５０ヌクレオチドの平均長を有し、アデニンに富み、二次構造をほとんど有さず、ほぼ常に最初のＡＵＧを開始に利用する。これらの特徴を有さないリーダー配列はタンパク質翻訳の効率を軽減しうるため、好ましくは、酵母リーダー配列が酵母宿主細胞における過剰発現遺伝子産物またはシャペロンタンパク質の発現に使用される。多数の酵母リーダー配列の配列が公知であり、Ｃｉｇａｎら（Ｇｅｎｅ ５９：１−１８（１９８７））を参照して当業者に利用可能である。
【００８４】
得られる発現のレベルに影響を及ぼしうる要因には、プロモーター、リボソーム結合部位および開始コドンの位置に加えて、複製可能な発現ベクターのコピー数が含まれる。ベクターのコピー数は、一般に、該ベクターの複製起点およびそれに関連したいずれかのシス作用性制御要素により決定される。例えば、調節性動原体をコードする酵母エピソームベクターのコピー数の増加は、該動原体に近接して配置されたプロモーターからの転写を誘導することにより達成されうる。更に、酵母ベクターにおける酵母ＦＬＰ機能のコード化も該ベクターのコピー数を増加させうる。
【００８５】
そのような調節要素をコードする核酸分子を合成し又は新たな調節要素を本ベクター内にクローニングし配置することにより、入手可能なベクターからのＤＮＡ断片を組合せることにより、前記配列を含む発現ベクターを、当業者は容易に設計し製造することが可能である。発現ベクターの製造方法はよく知られている。過剰発現ＤＮＡ法は遺伝的操作に関する多数の標準的な実験マニュアルのいずれかに見出される。
【００８６】
本発明の発現ベクターは、プロモーターおよび遺伝子発現を制御するために使用される他の配列要素に対して適切な配向で過剰発現または組換えタンパク質コード領域を連結することにより製造されうる。本発現ベクターの構築の後、そのようなベクターを、該過剰発現遺伝子産物および該過剰発現または組換えタンパク質が発現されうる宿主細胞内に形質転換する。酵母および他の下等真核細胞を発現ベクターで形質転換するための方法はよく知られており、当業者に容易に利用可能である。例えば、発現ベクターは、酢酸リチウム、スフェロプラスト、エレクトロポレーションおよび類似方法を含む幾つかの方法のいずれかにより、酵母細胞内に形質転換されうる。
【００８７】
酵母複製可能発現ベクターと共に使用されうる酵母宿主細胞には、分泌能を有する酵母の任意の野生型または突然変異株が含まれる。そのような株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセ・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）および酵母の関連種に由来しうる。一般に、酵母の有用な突然変異株には、選択マーカーをコードする酵母ベクターと共に用いられうる遺伝的欠損を有する株が含まれる。多数のタイプの酵母株がＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｏｎｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．９４７２０）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，以下、ＡＴＣＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｎｅｙ Ｌａｎｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ ＮＲ４ ７ＵＡ，ＵＫ）およびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｙｅａｓｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｊｕｌｉａｎａｌａａｎ ６７ａ，２６２８ ＢＣ Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
【００８８】
一般に、酵母のような下等真核生物は糖タンパク質の発現に有用である。なぜなら、それらは経済的に培養され、高収率を与え、適切に修飾されると適切にグリコシル化されうるからである。酵母は特に、確立された遺伝学的特徴を示し、迅速な形質転換、試験されるタンパク質局在化法、および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする。適当なベクターは、所望により、発現制御配列、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含むプロモーター、複製起点、終結配列などを有する。
【００８９】
種々の酵母、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が細胞培養に有用である。なぜなら、それらは高い細胞密度まで増殖可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが本発明の糖タンパク質を工業的規模で製造するために使用されうる。
【００９０】
下等真核生物、特に酵母は、該グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するよう、遺伝的に修飾されうる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４００１８５９０に記載されているとおり、選択された内因性グリコシル化酵素を排除し、および／または外因性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が喪失するよう選択され又は操作されうる。
【００９１】
１つの実施形態においては、該宿主細胞は更にα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、これは、該１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した組換え糖タンパク質の移動は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
【００９２】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９３】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、これは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を有する糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９４】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインを含み、これは、該ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９５】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質組成物を与える。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質、例えば、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質組成物を得ることが可能である。
【００９６】
更なる実施形態においては、直前の宿主細胞は更にシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質を与える。酵母および糸状菌のような下等真核宿主細胞の場合、該宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供給する手段を含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するよう下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するよう下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をニューロミニダーゼでインビトロで処理して、主にＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖形態またはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質を得ることが可能である。
【００９７】
前宿主細胞はいずれも、例えば米国公開特許出願第２００４／０７４４５８および第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分枝（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ ＩＩＩ）および／または多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）（ＧｎＴ ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるために、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩおよびＧｎＴ ＩＸよりなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
【００９８】
更なる実施形態においては、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更にガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を与える。
【００９９】
更なる実施形態においては、主にＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生する直前の宿主細胞は更にシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、これは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するよう選択された、該触媒ドメインに通常は付随しない細胞標的化シグナルペプチドに融合されている。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を介した該組換え糖タンパク質の移動は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を含む組換え糖タンパク質を与える。
【０１００】
種々の前宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体）、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（例えば、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠いているため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌を、前記輸送体を含むよう遺伝的に操作することが好ましい。
【０１０１】
前記宿主細胞の更なる実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＢＭＴ２）を欠失させ又は破壊することにより（米国公開特許出願第２００６／０２１１０８５号を参照されたい）α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を排除するよう、およびホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失させ又は破壊することにより（米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するよう、遺伝的に操作されている。前記宿主細胞の更なる実施形態においては、該宿主細胞は更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）の１以上を欠失させ又は破壊することにより（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）糖タンパク質のＯ−グリコシル化を排除するよう遺伝的に修飾されているか、あるいは公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号に開示されているＰｍｔ−１、Ｐｍｔｉ−２およびＰｍｔｉ−３のようなインヒビターの存在下で増殖され、あるいはそれらの両方に付される。
【０１０２】
したがって、糖タンパク質を産生するよう遺伝的に修飾された宿主細胞を提供し、ここで、該糖タンパク質上の主要Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含むが、これらに限定されるものではない。更に、糖タンパク質上に前記Ｎ−グリカンの特定の混合物を有する該糖タンパク質を産生する宿主細胞が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明を例示するために実施例に記載されている酵母株の系譜を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明を例示するために実施例に記載されている酵母株の系譜を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＰＤＩ１（ｈＰＤＩ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＰＤＩ１（ｈＰＤＩ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。
【図３】図３は、ヒトＥＲＯ１α（ｈＥＲＯ１α）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰｒＢ１遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を例示する。
【図４】図４は、ヒトＧＲＰ９４をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を例示する。
【図５】図５は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスα−１，２マンノシダーゼＩＡ（ＦＢ５３）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６およびｐＧＦＩ２０７ｔの構築を例示する。
【図６】図６は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の構築を例示する。
【図７】図７は、抗ＤＫＫ１抗体重鎖（ＧＦＩ７１０Ｈ）および軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座を標的化しピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１の地図である。
【図８】図８は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＲ１をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２２の地図である。
【図９】図９は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＣＡ１（ＡｔＥＣＡ１）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２７の地図である。
【図１０】図１０は、ヒトＣＲＴ（ｈＣＲＴ）およびヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードしピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ３遺伝子座を標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１２３４の地図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
以下の実施例においては、種ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の宿主細胞において異種ヒトタンパク質を発現させる。これらの実施例は本発明の特定の実施形態に関して本発明を実証するものであり、何ら限定的なものと解釈されるべきではない。本明細書における開示および実施例を読んだ当業者は、記載されている方法および材料に対する多数の変更、修飾および改良が、本発明の実施から逸脱することなく可能である、と認識するであろう。
【実施例１】
【０１０５】
本実施例は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する組換えタンパク質を産生する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の構築を示す。
【０１０６】
発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築は以下のとおりであり、図２に示されている。該プラスミドベクターは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換するために、ヒトＰＤＩタンパク質をコードする発現カセットと、該プラスミドベクターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座へと標的化する核酸分子とを含む。プライマーｈＰＤＩ／ＵＰｌ：５’ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣ ３’（配列番号１）およびｈＰＤＩ／ＬＰ−ＰａｃＩ：５’ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴ ３’（配列番号２）、ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびにヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用するＰＣＲにより、ヒトＰＤＩ１をコードするｃＤＮＡを増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングしてプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８を得た。ヒトＰＤＩ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９および２０）を表９に示す。
【０１０７】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１および２２）を表９に示す。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡからの領域のＰＣＲ増幅により、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１ ５’および３’領域を含む核酸分子の単離を行った。プライマーＰＢ２４８：５’ＡＴＧＡＡ ＴＴＣＡＧ ＧＣＣＡＴ ＡＴＣＧＧ ＣＣＡＴＴ ＧＴＴＴＡ ＣＴＧＴＧ ＣＧＣＣＣ ＡＣＡＧＴ ＡＧ ３’（配列番号３）；ＰＢ２４９：５’ＡＴＧＴＴ ＴＡＡＡＣ ＧＴＧＡＧ ＧＡＴＴＡ ＣＴＧＧＴ ＧＡＴＧＡ ＡＡＧＡＣ ３’（配列番号４）を使用して、該５’領域を増幅した。プライマーＰＢ２５０：５’ＡＧＡＣＴ ＡＧＴＣＴ ＡＴＴＴＧ ＧＡＧＡＣ ＡＴＴＧＡ ＣＧＧＡＴ ＣＣＡＣ ３’（配列番号５）；ＰＢ２５１：５’ＡＴＣＴＣ ＧＡＧＡＧ ＧＣＣＡＴ ＧＣＡＧＧ ＣＣＡＡＣ ＣＡＣＡＡ ＧＡＴＧＡ ＡＴＣＡＡ ＡＴＴＴＴ Ｇ−３’（配列番号６）を使用して、該３’領域を増幅した。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に使用した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ断片ＰｐＰＤＩ１（５’）およびＰｐＰＤＩ１（３’）を別々にプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングして、それぞれプラスミドベクターｐＧＬＹ６２０およびｐＧＬＹ６１７を得た。ｐＧＬＹ６７８を構築するために、組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２４のＤＮＡ断片ＰｐＡＲＧ３−５’およびＰｐＡＲＧ−３’［これは、該プラスミドベクターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ３遺伝子座に標的化する］を、プラスミドベクターｐＧＬＹ６７８をＰＤＩ１遺伝子座に標的化しＰＤＩ１遺伝子座の発現を破壊するそれぞれＤＮＡ断片ＰｐＰＤＩ（５’）およびＰｐＰＤＩ（３’）で置換した。
【０１０８】
ついで、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８内にクローニングして、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ）の制御下に配置されているプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を得た。５’末端のＮｏｔＩ制限酵素部位および平滑３’末端を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ−シグナルペプチド（ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチド（配列番号１８））をコードする核酸分子（配列番号７）と、ＡｆｅＩおよびＰａｃＩでプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８から遊離されたヒトＰＤＩをコードする核酸分子を含む発現カセットとを、平滑５’末端および３’末端のＰａｃＩ部位を有する核酸分子を得るためにＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８内に連結することにより、発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を構築した。得られた組込み／発現プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロモーターと、ＰＤＩ１遺伝子座の破壊およびＰＤＩ１遺伝子座内への該発現カセットの組込みのために該プラスミドをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座に標的化するための核酸分子配列とに機能的に連結された、ヒトＰＤＩ１／ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチド融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。図２はプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を例示する。ＳｃαＭＦプレ−シグナルペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および１８に示す。
【０１０９】
ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３２の構築は以下のとおりであり、図３に示されている。ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする核酸分子がＧｅｎｅ Ａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成され、それを使用してプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２４を構築した。ヒトＥＲＯ１αタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２３および２４）を表９に示す。ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードする核酸分子を、制限酵素ＡｆｅＩおよびＦｓｅＩを使用して該プラスミドベクターから遊離させ、ついで、前記のとおり５’ＮｏｔＩおよび３’平滑末端を有するＳｃαＭＰプレ−シグナルペプチドをコードする核酸分子と共に、ＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８内に連結した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８はまた、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＢ１遺伝子の５’および３’領域（それぞれＰｐＰＲＢ１−５’およびＰｐＰＲＢ１−３’領域）を含む核酸分子を含んでいた。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３０をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ついで、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７から得たピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１プロモーター（ＰｐＰＤＩプロモーター）を含有する核酸分子に連結した。ＰｐＰＤＩプロモーターのヌクレオチド配列は５’−ＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＧＡ−３’（配列番号３１）である。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１プロモーター制御下にヒトＥＲＯ１α融合タンパク質をコードする発現カセットを含有する発現／組込みベクターであり、ＰＲＢ１遺伝子座の破壊およびＰＲＢ１遺伝子座内への該発現カセットの組込みのためにゲノムのＰＲＢ１遺伝子座に該プラスミドベクターを標的化するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＢ１遺伝子の５’および３’領域を含む。図３はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を例示する。
【０１１０】
ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３３の構築は以下のとおりであり、図４に示されている。プライマーｈＧＲＰ９４／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣ ＴＧＡＣＧ ＡＴＧＡＡ ＧＴＴＧＡ ＴＧＴＧＧ ＡＴＧＧＴ ＡＣＡＧＴ ＡＧ−３’（配列番号１５）およびｈＧＲＰ９４／ＬＰ１：５’−ＧＧＣＣＧ ＧＣＣＴＴ ＡＣＡＡＴ ＴＣＡＴＣ ＡＴＧＴＴ ＣＡＧＣＴ ＧＴＡＧＡ ＴＴＣ ３’（配列番号１６）でヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からヒトＧＲＰ９４をＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。該ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１内にクローニングしてプラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６を得た。ヒトＧＲＰ９４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号２５および２６）を表９に示す。
【０１１１】
ヒトＧＲＰ９４をコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６からＡｆｅＩおよびＦｓｅＩで遊離させた。ついで該核酸分子を、前記のとおりＮｏｔＩおよび平滑末端を有するＳｃαＭＰプレ−シグナルペプチドをコードする核酸分子、ならびにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４ ５’および３’領域（それぞれＰｐＰＥＰ４−５’およびＰｐＰＥＰ４−３’領域）を含む核酸分子を含有するＮｏｔＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３１に連結して、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９を得た。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰｐＰＤＩ１プロモーターを含有するＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩでプラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７から取り出し、該ＤＮＡ断片をｐＧＬＹ２２２９内に連結して、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３を得た。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩプロモーターの制御下にヒトＧＲＰ９４融合タンパク質をコードしており、ＰＥＰ４遺伝子座の破壊および発現カセットの組込みのために該プラスミドベクターをゲノムのＰＥＰ４遺伝子座に標的化するためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の５’および３’領域を含む。図４はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を例示する。
【０１１２】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２、ｐＧＬＹ１８９６およびｐＧＦＩ２０７ｔの構築は以下のとおりであった。全てのトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドベクターをｐＧＦＩ１６５から誘導した。これは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴプレシグナルペプチドに融合されたトリコデルマ・レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号を参照されたい）をコードしており、この場合、発現はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰプロモーターの制御下にあり、該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に標的化され、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５の地図を図５に示す。
【０１１３】
ｐＧＦＩ１６５におけるＧＡＰプロモーターをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１（ＰｐＡＯＸ１）プロモーターで置換することにより、プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２を作製した。これは、ｐＧＬＹ２０２８からのＥｃｏＲＩ（平滑化される）−ＢｇｌＩＩ断片としてＰｐＡＯＸ１プロモーターを単離し、ＮｏｔＩ（平滑化される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＦＩ１６５内に挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の地図を図６に示す。
【０１１４】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６は、プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５内に挿入されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２膜挿入リーダーペプチド融合タンパク質（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）を参照されたい）に融合したマウスα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットを含有する（図５）。これは、ＸｈｏＩで消化され（そして平滑末端化され）ＰｍｅＩで消化されたｐＧＬＹ１４３３からＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２−マウスＭＮＳＩ発現カセットを単離し、ＰｍｅＩで消化されたｐＧＦＩ１６５内に該断片を挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６の地図を図５に示す。
【０１１５】
亜ヒ酸塩に対する耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３（ＳｃＡＲＲ３）遺伝子でＵＲＡ５選択マーカーが置換されたこと以外は、プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔはｐＧＬＹ１８９６に類似している。これは、ＡｓｃＩ（平滑末端化される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＦＩ１６６からＳｃＡＲＲ３遺伝子を単離し、ＳｐｅＩ（平滑末端される）およびＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬＹ１８９６内に該断片を挿入することにより達成された。該プラスミドベクターの組込みはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＯ１遺伝子座に対するものであり、選択は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３遺伝子を用いるものである。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの地図を図５に示す。
【０１１６】
抗ＤＫＫ１抗体発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１（図７）の構築は以下のとおりであった。抗ＤＫＫ１抗体は、Ｗｎｔシグナリング経路に関与するリガンドであるディッコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）タンパク質１を認識する抗体である。抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０およびｐＧＬＹ２２６１を作製するために、α−アミラーゼ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来）シグナルペプチドをコードする核酸分子に対してそれぞれがインフレームである重鎖（ＨＣ；ＶＨ＋ＩｇＧ２ｍ４を含有する融合タンパク質）および軽鎖（ＬＣ；ＶＬ＋Ｌλ定常領域を含有する融合タンパク質）融合タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子がＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧにより合成された。α−アミラーゼシグナルペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号４８および４９に示す。ＨＣのヌクレオチド配列を配列番号２７に示し、アミノ酸配列を配列番号２８に示す。ＬＣのヌクレオチド配列を配列番号２９に示し、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。ＩｇＧ２ｍ４イソタイプは米国公開出願第２００７／０１４８１６７号および米国公開出願第２００６／０２２８３４９号に開示されている。ユニーク５’−ＥｃｏＲＩおよび３’−ＦｓｅＩ部位を用いて、ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードする核酸分子を別々に発現プラスミドベクターｐＧＬＹ１５０８内にクローニングして、それぞれプラスミドベクターｐＧＬＹ１２７８およびｐＧＬＹ１２７４を得た。これらのプラスミドベクターは、ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結されたゼオシン耐性マーカーおよびＴＲＰ２組込み部位およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含有していた。該ＬＣ融合タンパク質発現カセットをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩでｐＧＬＹ１２７４から取り出し、ＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬＹ１２７８内にクローニングして、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０を得た。これは該ＨＣおよびＬＣ融合タンパク質をコードしており、ＴＲＰ２遺伝子座内への該発現カセットの組込みのために該発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２６１はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０内に追加的なＬＣを含有する（図７）。
【０１１７】
前記発現／組込みベクターでの酵母形質転換は以下のとおりであった。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、約０．２〜６のＯＤまで、５０ｍＬ ＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））内で一晩増殖させた。氷上で３０分間のインキュベーションの後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌１Ｍ ソルビトールで３回洗浄した後、０．５ｍｌの氷冷無菌１Ｍ ソルビトールに再懸濁させた。１０μＬの線状化ＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で５分間インキュベートした。予め設定されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘセル内でエレクトロポレーションを行い、その直後に、１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍ ソルビトール）を加えた。該形質転換細胞を室温（２４℃）で４時間〜一晩にわたって回収した後、該細胞を選択培地上にプレーティングした。
【０１１８】
細胞系の作製は以下のとおりであり、図１Ａおよび１Ｂに示されている。既に記載されている方法（例えば、ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）を用いて、株ｙＧＬＹ２４−１（ｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１ ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ ｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ）を構築した。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国公開出願第２００６０２１１０８５号に開示されている。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ｍｎｎ４Ｌ１遺伝子（ｍｎｎ４ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。ｍｎｎ４はｍｎｎ４Ｌ２またはｍｎｎ４ａを意味する。遺伝子型においては、ＫｌＭＮＮ２−２はクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＧｌｃＮＡｃ輸送体であり、ＭｍＳＬＣ３５Ａ３はムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧｌｃＮＡｃ輸送体である。ＵＲＡ５の欠失はｙＧＬＹ２４−１株をウラシルに関して栄養要求性にし（米国公開出願第２００４／０２２９０３６号を参照されたい）、これを使用して、以下のヒト化シャペロン株を構築した。種々の発現カセットが本明細書の実施例におけるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムの特定の遺伝子座内に組込まれたが、本発明の実施は、組込みに用いられる遺伝子座には無関係であると理解される。本明細書に開示されているもの以外の遺伝子座が該発現カセットの組込みに用いられうる。適当な組込み部位には、米国公開出願第２００７００７２２６２号に列挙されているものが含まれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログが含まれる。
【０１１９】
対照株ｙＧＬＹ６４５（ＰｐＰＤＩ１）を構築した。株ｙＧＬＹ６４５はトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）を発現し、それぞれはＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現され、天然ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子座は無傷である。該プラスミドベクターをピチア（Ｐｉｃｈｉａ）プロリン１（ＰＲＯ１）遺伝子座に標的化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ２４−１から株ｙＧＬＹ６４５を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６は、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＦＢ５３、ＭｕＭＮＳ１Ａ）（それぞれ、ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現される）をコードする発現カセットを含有する。
【０１２０】
内因性ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子の非存在下でピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞から発現されたヒトＰＤＩの有効性を試験するために、株ｙＧＬＹ７０２およびｙＧＬＹ７０４を作製した。株ｙＧＬＹ７０２およびｙＧＬＹ７０４（ｈＰＤＩ）は以下のとおりに構築した。構成的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトＰＤＩをコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ７０２を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、株ｙＧＬＹ７０２をウラシルに関して原栄養性にするピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５をコードする発現カセットをも含有していた。５−ＦＯＡプレート上でｐＧＬＹ７０２を対抗選択することにより、ＵＲＡ５発現カセットを取り出して、株ｙＧＬＹ７０４を得た。該株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で安定に置換されており、該株はウラシルに関して栄養要求性である。
【０１２１】
プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を使用するヒトＰＤＩでのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の置換は、ＰｐＰＤＩ１ ＯＲＦのみに特異的な以下のプライマーを使用するコロニーＰＣＲにより確認された：ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−１，５’−ＧＧＴＧＡ ＧＧＴＴＧ ＡＧＧＴＣ ＣＣＡＡＧ ＴＧＡＣＴ ＡＴＣＡＡ ＧＧＴＣ−３’；（配列番号７）；ＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１，５’−ＧＡＣＣＴ ＴＧＡＴＡ ＧＴＣＡＣ ＴＴＧＧＧ ＡＣＣＴＣ ＡＡＣＣＴ ＣＡＣＣ−３’；（配列番号８）；ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−２，５’ＣＧＣＣＡ ＡＴＧＡＴ ＧＡＧＧＡ ＴＧＣＣＴ ＣＴＴＣＡ ＡＡＧＧＴ ＴＧＴＧ−３’；（配列番号９）；およびＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−２，５’−ＣＡＣＡＡ ＣＣＴＴＴ ＧＡＡＧＡ ＧＧＣＡＴ ＣＣＴＣＡ ＴＣＡＴＴ ＧＧＣＧ−３’；（配列番号１０）。したがって、ＰＣＲ産物の非存在はＰｐＰＤＩ１のノックアウトを示す。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２２】
ＰＣＲプライマー：ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰ，５’−ＧＧＣＧＡ ＴＴＧＣＡ ＴＴＣＧＣ ＧＡＣＴＧ ＴＡＴＣ−３’；（配列番号１１）；およびｈＰＤＩ−３７ＬＰ ５’−ＣＣＴＡＧ ＡＧＡＧＣ ＧＧＴＧＧ ＣＣＡＡＧ ＡＴＧ−３’；（配列番号１２）を使用して、ＰｐＰＤＩ１遺伝子座におけるｐＧＬＹ６４２の二重交差を確認するために、追加的なＰＣＲを用いた。ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰは、ｐＧＹ６４２のＰｐＰＤＩ１（５’）には存在しないＰｐＰＤＩ１の上流領域をプライマー化し、ｈＰＤＩ−３’／ＬＰはｐＧＬＹ６４２におけるヒトＰＤＩ ＯＲＦをプライマー化する。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２３】
ノックアウト（すなわち、二重交差事象）としての又は「ロール・イン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）」（すなわち、ゲノム内への該プラスミドベクターの単一組込み）としてのプラスミドベクターの組込み効率は、ベクターと宿主染色体ＤＮＡ上の対応遺伝子との間の相同領域の数および長さ、選択マーカー、関心のある遺伝子の役割ならびに内因性機能を相補するノック・イン遺伝子の能力を含む幾つかの要因に左右されうる。幾つかの場合には、ｐＧＬＹ６４２は二重交差として組込まれてヒトＰｐＰＤＩでの内因性ＰｐＰＤＩ遺伝子の置換をもたらし、他の場合には、ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターは単一組込みとして組込まれて内因性ＰｐＰＤＩ１遺伝子とヒトＰｐＰＤＩ遺伝子との両方の存在をもたらすことを、本発明者らは見出した。これらの事象を識別するために、本発明者らは、本明細書に記載されている配列番号１１〜１４のＰＣＲプライマーを利用した。ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターの組込みの後にＰｐＰＤＩ遺伝子が保有されている場合には、内部ＰｐＰＤＩコード配列に向けられたＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰおよびｈＰＤＩ−３’／ＬＰは増幅産物および対応バンドを与えるであろう。ノックアウトまたは二重交差の場合には、これらのプライマーはいずれの増幅産物も与えず、対応バンドは視認されないであろう。
【０１２４】
以下のプライマーでｐＧＬＹ６４２のロール・インが確認された：ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−１（配列番号７）およびＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１（配列番号８）（ＰｐＰＤＩ１をコードする）、ならびにｈＰＤＩ／ＵＰ，５’−ＧＴＧＧＣ ＣＡＣＡＣ ＣＡＧＧＧ ＧＧＣＡＴ ＧＧＡＡＣ−３’；（配列番号１３）；およびｈＰＤＩ−３’／ＬＰ，５’−ＣＣＴＡＧ ＡＧＡＧＣ ＧＧＴＧＧ ＣＣＡＡＧ ＡＴＧ−３’；（配列番号１４）（ヒトＰＤＩをコードする）。該ＰＣＲ条件は、ＰｐＰＤＩ１に関しては９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクル、そしてヒトＰＤＩに関しては９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間および７２℃で２．５分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１２５】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１）に機能的に連結されたトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセットを含むプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２をｙＧＬＹ７０４のＰＲＯ１遺伝子座内に形質転換することにより、株ｙＧＬＹ７３３を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。該細胞をメタノールの存在下で増殖させると、ＰｐＡＯＸ１プロモーターは過剰発現を可能にする。
【０１２６】
プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔにおけるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターにそれぞれが機能的に連結されているＴｒＭＮＳ１およびマウスマンノシダーゼ１Ａ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノム内の５’ＰＲＯ１遺伝子座ＵＴＲにおいて株ｙＧＬＹ７３３内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ７６２を構築した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１２７】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ６４５を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ２２６３を作製した。
【０１２８】
５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７３３を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ２６７４を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５栄養要求性である。
【０１２９】
５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７６２を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ２６７７を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ＰｐＧＡＰＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５栄養要求性である。
【０１３０】
ヒトＥＲＯ１αタンパク質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２をＰＲＢ１遺伝子座内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ２６９０を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ヒトＥＲＯ１α発現カセットがＰＲＢ１遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１３１】
ヒトＧＲＰ９４タンパク質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３をＰＥＰ４遺伝子座内に組込むことにより、株ｙＧＬＹ２６９６を作製した。この株においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子が、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換されており、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１およびＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座内に組込まれており、ヒトＧＲＰ９４がＰＥＰ４遺伝子座内に組込まれており、この株はＵＲＡ５原栄養性である。
【０１３２】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６２８を作製した。
【０１３３】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６４７を作製した。
【０１３４】
表１は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するよう遺伝的に操作された酵母において、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換することが、Ｏ−グリコシル化占有度の減少およびＮ−グリコシル化の増加をもたらすことを示している。
【０１３５】
【表１】
【実施例２】
【０１３６】
抗体産生のための該形質転換株の細胞増殖条件は一般には以下のとおりであった。
【０１３７】
該形質転換酵母株に関するタンパク質発現を、１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素塩基、４×１０−５％ ビオチンおよび１％ グリセロールよりなる緩衝化グリセロール−複合培地（ＢＭＧＹ）を使用して振とうフラスコにおいて２４℃で行った。タンパク質発現のための誘導培地は、ＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１％ メタノールよりなる緩衝化メタノール−複合培地（ＢＭＭＹ）であった。該誘導培地を加えた時点で、メタノール中のＰｍｔインヒビターＰｍｔｉ−３を１８．３μＭの最終濃度まで該増殖培地に加えた。細胞を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０１３８】
ＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽スクリーニング法は、表２に示すパラメータに従った。
【０１３９】
【表２】
【０１４０】
接種後約１８時間の時点で、３５０ｍＬの培地Ａ（後記表６を参照されたい）＋４％ グリセロールを含有するＳｉｘＦｏｒｓ容器に、関心のある株を接種した。少量（１００％ メタノール中の０．２ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）（公開国際出願第ＷＯ２００７０６１６３１号を参照されたい）を接種物と共に加えた。約２０時間の時点で、１７ｍＬの５０％ グリセロール溶液（グリセロール・フェッドバッチ供給；後記表７を参照されたい）＋より大量（４ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３のボーラスを容器ごとに加えた。溶存酸素（ＤＯ）濃度における正のスパイクにより示される、該グリセロールが消費された約２６時間の時点で、メタノール供給（後記表６を参照されたい）を０．７ｍＬ／時間で連続的に開始した。同時に、別用量のＰｍｔｉ−３（４ｍｇ／ｍＬ ストックの０．３ｍＬ）を容器ごとに加えた。約４８時間の時点で、別用量（４ｍｇ／ｍＬの０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を容器ごとに加えた。接種後約６０時間の時点で培養を回収し、加工した。
【０１４１】
【表３】
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
【表５】
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
以下のとおりにＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用してＯ−グリカンの測定を行った。Ｏ−グリコシル化の軽減を測定するために、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を用いて、該増殖培地からタンパク質を精製し、アルカリ除去（ベータ脱離）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：３４９−４５１（１９９９））により該Ｏ−グリカンをタンパク質から遊離させ分離した。この方法はまた、遊離したＯ−グリカン（オリゴマンノースまたはマンノース）の新たに生じた還元末端をマンニトールへと還元する。したがって、該マンニトール基は各Ｏ−グリカンの特有の指標として働く。１００μＬの容量のＰＢＳバッファー中に含有されている０．５ｎｍｏｌまたはそれ以上のタンパク質がベータ脱離に必要であった。該サンプルを２５μＬのアルカリ性ボロヒドリド試薬で処理し、５０℃で１６時間インキュベートした。約２０μＬのアラビトール内部標準を加え、ついで１０μＬの氷酢酸を加えた。ついで該サンプルを、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳおよびＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを介して遠心分離し、水で洗浄した。洗液を含む該サンプルをプラスチックオートサンプラーバイアルに移し、遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。１５０μＬの１％ ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨを該サンプルに加え、該サンプルを遠心エバポレーター内で蒸発乾固させた。この最終工程を更に５回繰返した。２００μＬの水を加え、１００μＬの該サンプルを、脈動電気化学的検出−Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣと組合された高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分析した。回収されたマンニトールの量に基づき、平均Ｏ−グリカン占有度を決定した。
【実施例３】
【０１４６】
本実施例は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の代わりにヒトＰＤＩを発現する前記株において産生されたタンパク質におけるＯ−グリカンの占有度が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）またはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）が該株において過剰発現された場合、有意に減少されうることを実証する。本実施例においては、該効果は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する抗体を産生する糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を使用して例示されている。
【０１４７】
ＰｐＰＭＲ１遺伝子をコードする発現カセットを以下のとおりに構築した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゴルジＣａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）のオープンリーディングフレームを、プライマー（ＰｐＰＭＲ１／ＵＰ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３６）およびＰｐＰＭＲ１／ＬＰ：５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧ−３’（配列番号３７））を使用してピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ１１４３０ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル；９５℃で１０秒間、５２℃で２０秒間および７２℃で３分間の５サイクル；９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で３分間の２０サイクル；ならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローニングし、ｐＧＬＹ３８１１と命名した。ＰｓｔＩおよびＦｓｅＩでプラスミドを消化することにより（ＦｓｅＩでの消化の前に該ＰｓｔＩ末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）、ｐＧＬＹ３８１１からＰｐＰＭＲ１を取り出した。ＰｐＰＭＲ１をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ（該末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）およびＦｓｅＩで消化されたｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングして、ＰｐＰＭＲ１がＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結されているｐＧＬＹ３８２２を得た。プラスミドｐＧＬＹ３８２２はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化する。プラスミドｐＧＬＹ３８２２を図８に示す。ＰｐＰＭＲ１のＤＮＡ配列を配列番号３２に記載し、ＰｐＰＭＲ１のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。
【０１４８】
アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲ Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）をコードする発現カセットを以下のとおりに構築した。ＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から合成し、クローニングしてｐＧＬＹ３３０６を得た。ＭｌｙＩおよびＦｓｅＩで消化し、ＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ（該末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）およびＦｓｅＩで消化されたｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングすることにより、合成されたＡｔＥＣＡ１をｐＧＬＹ３３０６から回収して、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７を得た。プラスミドｐＧＬＹ３８２７はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ６遺伝子座を標的化する。プラスミドｐＧＬＹ３８２７を図９に示す。ＡｔＥＣＡ１のＤＮＡ配列をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化し、配列番号３４に示す。コードされるＡｔＥＣＡ１は、配列番号３５に記載されているアミノ酸配列を有する。
【０１４９】
組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２（ＰｐＰＭＲ１をコードする発現カセットを含有する）またはｐＧＬＹ３８２７（ＡｔＥＣＡ１をコードする発現カセットを含有する）をＳｐｅＩで線状化し、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ｙＧＬＹ３６４７またはｙＧＬＹ３６９３内にＵＲＡ６遺伝子座において形質転換した。ＵＲＡ６遺伝子座におけるｐＧＬＹ３８２２またはｐＧＬＹ３８２７のゲノム組込みは、以下のプライマーを使用するコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）により確認された：ＵＲＡ６遺伝子座内へのＰｐＰＭＲ１組込みを確認するためには、５’ＡＯＸｌ（５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号３８）およびＰｐＰＭＲ１／ｃＬＰ（５’−ＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３９）；ＵＲＡ６遺伝子座内へのＡｔＥＣＡ１の組込みを確認するためには、５’ＡＯＸ１およびＡｔＥＣＡ１／ｃＬＰ（５’−ＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４０）。該ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の１サイクル、９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。
【０１５０】
ＰｐＰＭＲ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２３８を作製した。株ｙＧＬＹ３６４７においては、実施例１に記載され図１Ａおよび１Ｂに示されているとおり、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１シャペロン遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で置換されている。
【０１５１】
ＡｔＥＣＡ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化するプラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２４０を作製した。該株の系譜を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１５２】
ヒト化シャペロン株へのＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１の添加が、該株により産生された抗体のＯ−グリコシル化の軽減に及ぼす効果に関して、該株を評価した。表７に示すとおり、株ｙＧＬＹ３６４７内へのＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１の添加は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＤＩ１の代わりにヒトＰＤＩを発現する株ｙＧＬＹ３６４７、または内因性ＰＤＩ１しか発現しないが株ｙＧＬＹ３６４７と同様のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖形態を有する抗体を産生しうる株ｙＧＬＹ２２６３と比較して、Ｏ−グリコシル化占有度における有意な減少を引き起こした。該結果はまた、その内因性ＰＤＩ１を発現するがヒトＰＤＩ１を発現せずＣａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株が、減少したＯ−グリカン占有度を有する糖タンパク質を産生することを示唆している。
【０１５３】
【表７】
【実施例４】
【０１５４】
自身の天然シグナル配列を伴わないヒトカルレチクリン（ｈＣＲＴ）をコードするＤＮＡ断片を、以下のプライマーを使用してヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅した：ｈＣＲＴ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＨＡ／ＵＰ：５’−ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号４５）およびｈＣＲＴ−ＰａｃＩ／ＬＰ；５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４６）。該ＰＣＲ条件は、９８℃で２分間の１サイクル、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクルならびにそれに続く７２℃で１０分間の１サイクルであった。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ Ｔｏｐｏベクター内にクローニングしてｐＧＬＹ１２２４を得た。ｈＣＲＴをコードするＤＮＡは更に、コードされるトランケート化ｈＣＲＴがそのＮ末端におけるＨＡタグおよびそのＣ末端におけるＨＤＥＬを有するように修飾を含んでいた。ｈＣＲＴをコードするＤＮＡをＢｓｔＺ１７１およびＰａｃＩでの消化によりｐＧＬＹ１２２４から遊離させ、該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ適合末端を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列をコードするＤＮＡ断片と共に、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化された発現ベクターｐＧＬＹ５７９内にクローニングして、ｐＧＬＹ１２３０を得た。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターに機能的に連結されておりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＨＩＳ３遺伝子座を標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレシグナル配列およびＮ末端におけるＨＡタグおよびそのＣ末端におけるＨＤＥＬ配列と共にｈＣＲＴをコードする組込み／発現プラスミドである。
【０１５５】
ＮｏｔＩおよびＰａｃＩ適合末端を有する、ヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードするＤＮＡ断片がＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧにより合成された。ついで該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化されたｐＧＬＹ１２９内にクローニングして、ｐＧＬＹ１２３１を得た。このプラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターに機能的に連結されたｈＥＲｐ５７をコードしている。
【０１５６】
プラスミドｐＧＬＹ１２３１をＳｗａＩで消化し、ｈＥＲｐ５７をコードするＤＮＡ断片を、ＰｍｅＩで消化されたプラスミドｐＧＬＹ１２３０内にクローニングした。したがって、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４はｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７の両方をコードしている。プラスミドｐＧＬＹ１２３４を図１０に示す。
【０１５７】
５’ＦＯＡの存在下で株ｙＧＬＹ２６９０を対抗選択することにより、株ｙＧＬＹ３６４２を作製した（ＵＲＡ５栄養要求体）。
【０１５８】
ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７をコードしＨＩＳ３遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４でｙＧＬＹ３６４２を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６６８を作製した。
【０１５９】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ３６６８を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ３６９３を作製した。
【０１６０】
ＰｐＰＭＲ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２３９を作製した。
【０１６１】
ＡｔＥＣＡ１をコードしＵＲＡ６遺伝子座を標的化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより、株ｙＧＬＹ８２４１を作製した。
【０１６２】
本実施例に記載されている株の系譜を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１６３】
前実施例のＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１を発現するヒト化シャペロン株へのｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７の添加が産生抗体のＯ−グリカン占有度の更なる減少をもたらしうるかどうかを調べるために、前記株を評価した。表８に示すとおり、ｈＣＲＴおよびｈＥＲｐ５７のみを発現する株ｙＧＬＹ３６９３においては、Ｏ−グリカン占有度における約２倍の減少が認められ、これは、ＰｐＰＭＲ１またはＡｔＥＣＡ１を更に発現する株においては更に４倍まで減少した。該結果はまた、その内因性ＰＤＩ１を発現しＣａ２＋ ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株が、減少したＯ−グリカン占有度を有する糖タンパク質を産生することを示唆している。
【０１６４】
【表８】
【０１６５】
【表９】
【０１６６】
本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれに限定されないと理解されるべきである。通常の技量を有し本明細書中の教示を利用できる当業者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞であって、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、下等真核宿主細胞。
【請求項２】
該核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結された該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項３】
該宿主細胞が、組換えタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項４】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項３記載の下等真核宿主細胞。
【請求項５】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項６】
該宿主細胞が、ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項７】
軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法であって、
（ａ）少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である）を準備し、
（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法。
【請求項８】
該核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結された該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
該宿主細胞が、ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項７記載の製造方法。
【請求項１２】
ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞であって、該宿主細胞における該タンパク質の発現が異所性である、下等真核宿主細胞。
【請求項１３】
該宿主細胞が、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を更に含み、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１４】
該宿主細胞が、組換えタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１５】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項１４記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１６】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１７】
軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法であって、
（ａ）ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該タンパク質の発現は異所性である）を準備し、
（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法。
【請求項１８】
該宿主細胞が、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を更に含み、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１７記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞であって、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、下等真核宿主細胞。
【請求項２】
該核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結された該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項３】
該宿主細胞が、組換えタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項４】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項３記載の下等真核宿主細胞。
【請求項５】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項６】
該宿主細胞が、ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１記載の下等真核宿主細胞。
【請求項７】
軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法であって、
（ａ）少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現は異所性である）を準備し、
（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法。
【請求項８】
該核酸分子が、異種プロモーターに機能的に連結された該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
該宿主細胞が、ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項７記載の製造方法。
【請求項１２】
ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞であって、該宿主細胞における該タンパク質の発現が異所性である、下等真核宿主細胞。
【請求項１３】
該宿主細胞が、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を更に含み、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１４】
該宿主細胞が、組換えタンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１５】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項１４記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１６】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１２記載の下等真核宿主細胞。
【請求項１７】
軽減したＯ−グリコシル化を有する組換えタンパク質の製造方法であって、
（ａ）ＥＲｐ５７タンパク質をコードする核酸分子および／またはカルレチクリンタンパク質をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞（該宿主細胞における該タンパク質の発現は異所性である）を準備し、
（ｂ）該組換えタンパク質をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
（ｃ）該組換えタンパク質の製造に適した条件下、該宿主細胞を増殖させることを含む製造方法。
【請求項１８】
該宿主細胞が、少なくとも１つの内因性または外因性Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を更に含み、該宿主細胞における該Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼの発現が異所性である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該組換えタンパク質が抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が軽減、破壊または欠失されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類ホモログの少なくとも１つをコードする核酸分子が該宿主細胞において発現される、請求項１７記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５３０３１１（Ｐ２０１１−５３０３１１Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３０６１（Ｐ２０１１−５２３０６１）
【出願日】平成２１年８月１０日（２００９．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３２４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９４８７
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１０日（２００９．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３２４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９４８７
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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