タンパク質認識構造体、タンパク質認識基板、及びこれらの製造方法
【課題】特定のタンパク質に対して極めて高い認識能を持つタンパク質認識構造体、タンパク質認識基板、およびこれらの製造方法を提供する。
【解決手段】タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法。
【解決手段】タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質と特異的に認識・反応するタンパク質認識構造体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオセンサーなどのバイオテクノロジー、および病気の診断・治療等の分野において、タンパク質を利用してセンシングや診断・治療を行うことが多くなってきている。一般的に、タンパク質は、生体の細胞内において多くの種類が混じった混合物として存在する。バイオセンサーや病気の診断においては、生体内に含まれる複数種のタンパク質から、所望するタンパク質のみを特異的に認識し、検出する必要がある。
【０００３】
従来、特定のタンパク質を識別する方法としては、抗原となるタンパク質と、抗原と特異的に反応（認識）する物質（抗体）と、を用いた抗原抗体反応（免疫分析法）採用していた。しかし、免疫分析法では、ラットやマウス等の生体に特定のタンパク質（抗原）を注入し、生体内で抗原に対する抗体を形成させた後、その抗体を分離・抽出・精製する必要がある。よって、抗体の作成に長時間を要するという問題があった。
【０００４】
また、生体を用いて抗体を生成させなければならないため、生体（ラット、マウス等）の飼育・管理が煩雑でコストがかかる。さらに、このようにして得られた抗体は、熱や酸あるいはアルカリによって変性しやすく、また長時間の保存により失活して、認識能力を失ってしまうおそれがある。
【０００５】
このような背景から、特定のタンパク質を抗体と同程度以上に特異的に認識し、且つ製造が簡単で保存性の良いタンパク質認識構造体の開発が望まれている。
【０００６】
このような中、いわゆる分子インプリント法を用いてタンパク質認識構造体を作製する方法が提案されている。分子インプリント法は、機能性モノマーを用いてポリマー内にタンパク質等の分子を型取り、分子の形状や化学的特性をポリマー内に転写させる方法である。この方法によると、過酷な条件下でも安定して使用できるタンパク質認識構造体を効率よく生産できる。このような分子インプリント法を利用したタンパク質認識構造体に関する技術としては、特許文献１が挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特許3527239号公報
【０００８】
特許文献１に係る技術は、標的物質と結合する少なくとも２つのリガンドを、標的物質であるプリント分子（タンパク質）の少なくとも２つの結合部位に結合させ、次いでリガンドを吸着剤に固定化した後、プリント分子を除去することによって、選択的吸着材料を作製する技術である。この技術によると、特異的に配置された結合基を有し、選択的にタンパク質等の生体高分子を吸着できる吸着剤が得られるとされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らが分子インプリント法について鋭意研究したところ、従来の分子インプリント法では、溶液状態のタンパク質を用い、これに機能性モノマーを加えて重合させてインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）を作製しているが、溶液中ではタンパク質が分子運動しているので、作製されたタンパク質認識構造体に型取られたタンパク質の型と、本来のタンパク質の形状とが一致していない事を知った。このため、従来の分子インプリント法では、タンパク質の特異的官能基部位が正確に型取られていないため、従来の方法で作製されたタンパク質認識構造体は、鋳型として用いたタンパク質と形状の異なる標的物質以外のタンパク質とも結合してしまう。
【００１０】
本発明者らは、タンパク質結晶を鋳型として用いた分子インプリント法について、特願2005-337989に開示している。この技術によると、認識特異性の高いタンパク質認識構造体が得られる。しかしながら、タンパク質の結晶化は難しいため、結晶化が困難なタンパク質についての認識特異性の高いタンパク質認識構造体を得ることは難しい。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであって、認識特異性を飛躍的に向上させ得たタンパク質認識構造体を安価に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するためのタンパク質認識構造体に係る本発明は、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位のみを分子インプリントされたタンパク質認識構造体である。
【００１３】
上記タンパク質認識構造体は、タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面の特異的官能基部位が正確に型取られているため、当該タンパク質との認識特異性が高く、且つその他のタンパク質との認識特異性は極めて低いものとなる。よって、認識特異性に優れたタンパク質認識構造体となる。
【００１４】
上記課題を解決するためのタンパク質認識基板に係る本発明は、タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位を分子インプリントされたタンパク質認識構造体が、基板上にアレイ配置されているタンパク質認識基板である。
【００１５】
上記タンパク質認識構造体を、アレイ配置した基板を用いることにより、複数回のタンパク質の検出を一つの基板で行うことができる。
【００１６】
上記課題を解決するためのタンパク質認識構造体の製造方法に係る本発明は、タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法である。
である。
【００１７】
タンパク質アモルファスは、結晶のように規則的ではないが一定の立体構造をとっており、タンパク質が分子運動したり変性したりして構造が変化していない状態である。このように構造が一定で安定なタンパク質アモルファスを鋳型として用いることにより、正確にタンパク質アモルファスの表面の特異的感応部位のみの形をインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）に型取ることができ、タンパク質認識構造体の認識特異性が飛躍的に向上する。
【００１８】
本発明の効果を、より詳細に説明する。
従来技術のように、タンパク質を溶液に溶かして分子インプリントを行う方法では、分子インプリントがタンパク質のいろいろな部位で行われることになり、インプリントポリマー（タンパク質認識構造体）の結合部位は不均一となる。このため、認識力の弱い部位から強い部位までさまざまな官能基部位が存在することになり、認識特異性が低くなる。
【００１９】
他方、本発明では、タンパク質アモルファスを用いており、タンパク質アモルファスは多数のタンパク質分子が集合したものであり、アモルファスは結晶のように規則正しい配列にはなっていないが、タンパク質が分子運動したり変性したりして構造が変化しない安定した状態になっている。このため、アモルファス表面においては一定の表面（特定の官能基部位）が露出する。よって、本発明に係る分子インプリント法では、アモルファス表面形状を正確に型取れるとともに、重合性分子に含まれる機能性モノマーがアモルファス表面に露出している特定の官能基部位の型を取ることになるので、タンパク質認識構造体中に形成された結合部位は、タンパク質の特異的官能基部位の形を型取ったものとなる。よって、この製造方法で作製されたタンパク質認識構造体の結合特異性が飛躍的に向上する。
【００２０】
また、タンパク質の結晶化は困難であるという問題があるが、タンパク質のアモルファスを得ることは容易である。よって、結晶化が困難なタンパク質を特異的に認識する認識構造体を容易に作製できる。
【００２１】
ここで、本明細書において、タンパク質アモルファスとは、結晶状態以外の全ての固体状態のタンパク質を意味し、タンパク質固体の一部に微結晶が含まれていたり、タンパク質分子の一部が規則正しく配列されていたりするものも含む。
【００２２】
また、タンパク質アモルファス表面とは、タンパク質アモルファスの外表面を意味し、タンパク質の立体構造における内部表面を意味しない。つまり、アモルファス表面に配位したタンパク質の特異的官能基部位とは、タンパク質の立体構造において内部表面に配位した特異的官能基部位ではなく、外表面側に配位した特異的官能基部位を意味する。また、タンパク質アモルファスの表面形状とは、アモルファス表面に現れた１分子のみの形状であってもよい。
【００２３】
また、相補的に結合とは、水素結合、イオン結合、疎水結合などによる相互結合を意味する。
【００２４】
上記構成において、前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒である構成とすることができる。
【００２５】
タンパク質は、通常、有機溶媒と接触すると変性しやすいが、タンパク質をアモルファス状態とすることにより有機溶媒とタンパク質との接触を、アモルファス表面のみに限定することができる。アモルファス表面においては、タンパク質分子の一部分のみが表面に露出している状態であり、この表面部分のみが有機溶媒と接触するため、タンパク質をアモルファスとすることによりタンパク質の変性を極めておきにくくすることができる。また、有機溶媒を用いることにより、タンパク質アモルファスと水等の極性分子との水素結合によってタンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位（たとえば、カルボキシル基やアミノ基等）と機能性モノマーとの相互認識反応をより効果的に行うことができる。よって、タンパク質認識構造体の結合特異性を更に高めることができる。
【００２６】
ここで、有機溶媒の非比誘電膣が高いと、有機溶媒自体が機能性モノマーと特異的官能基部位との相補的結合を阻害するため、比誘電率が２５℃において水よりも小さいものを用いることが好ましい。
【００２７】
また、インプリント溶液に多量に水が含まれていると、水が機能性モノマーと特異的官能基部位との相補的結合を阻害するため、好ましくは、インプリント溶液の含水分量を１質量％以下とする。
【００２８】
ここで、インプリントの含水分量は、有機溶媒や重合性分子に含まれる水分量の総和を意味し、有機溶媒と水とが分離しているものは有機溶媒に含めない。
【００２９】
また、アモルファス作製を容易にする観点から、タンパク質アモルファスとして水溶性タンパク質のアモルファスを用いることが好ましい。
【００３０】
上記課題を解決するためのタンパク質認識基板の製造方法に係る本発明は、タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、前記除去ステップの後、作製されたタンパク質認識構造体を基板上にアレイ配置する配置ステップとを備えることを特徴とするタンパク質認識基板の製造方法である。
【００３１】
上記製造方法により、タンパク質認識基板を容易に作製できる。
【００３２】
上記構成において、前記重合ステップが、直径１０００ｎｍ以下のポリマーにインプリントするステップであるとすることができる。
【００３３】
試験管やバイアル瓶内で重合されたタンパク質認識構造体は、通常、容器の形状そのままとなる。よって、これを基板に配置するには、タンパク質認識構造体を粉砕し、この後所定の粒径のものを選別し、これを基板上に配置する必要がある。しかし、上記構成のように、作製されるタンパク質認識構造体のサイズを１０００ｎｍ以下とすることにより、粉砕・選別が不要となり、タンパク質認識基板の作製がより容易となる。
【００３４】
上記構成において、前記配置ステップは、異なる種類のタンパク質を鋳型としたタンパク質認識構造体を、それぞれ異なるアレイに配置するステップであるとすることができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によると、高い認識特異性を持つタンパク質認識構造体（インプリントポリマー）を低コストで提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面に基づいて説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
実施の形態１を図面に基づいて説明する。図１は実施の形態１のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
【００３８】
最初に、鋳型であるタンパク質のアモルファス作製を行う（図１（ａ））。水もしくは水系の緩衝液にタンパク質を溶かし、この後沈殿剤を加え、過飽和状態のタンパク質溶液を調製し、密閉された容器に入れて静置しておく。
【００３９】
タンパク質のアモルファス作製に際しては、タンパク質を変性させないために、タンパク質溶液のｐＨを一定に保つことが望ましい。このため、タンパク質は緩衝液に溶かすことが好ましい。そのような緩衝液として、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）などのグッズの緩衝液等を用いることができる。
【００４０】
沈殿剤は、タンパク質を過飽和状態にするものであって、塩、ポリエチレングリコール、アルコール等を用いることができる。塩としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。ポリエチレングリコールとしては、分子量１００〜１０００００のものを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メチルペンタンジオール等を用いることができる。
【００４１】
アモルファス作製時のタンパク質の濃度は、沈殿剤によりタンパク質が過飽和状態になる程度に高いことが望ましい。具体的には、１０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲内であることが好ましい。
このようにして、図１（ｂ）に示すようにタンパク質のアモルファス２が得られる。
【００４２】
この後、図１（ｃ）に示すようにアモルファス２を液から分離させる。これは、アモルファスのみをピペットなどで取ってもよく、アモルファスを残して液だけ除去してもよい。
【００４３】
次に、図１（ｄ）に示すように、重合は、有機溶媒に機能性モノマー、架橋剤を溶かしたプレポリマー溶液（インプリント溶液）３と、タンパク質アモルファスとを混合し、タンパク質アモルファスとプレポリマーとが接触した状態で、分子インプリント法により重合を行う。
【００４４】
有機溶媒としては、溶媒とタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位との水素結合等により、機能性モノマーと特異的官能基部位との相互作用が阻害されることを防止するため、比誘電率が水よりも低く、且つ極性が低いものを用いることが好ましい。例えば、ヘキサン等の脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類などの公知の有機溶媒を用いることができる。
【００４５】
また、インプリント溶液中には、２５℃、湿度２０〜８０％の雰囲気中に放置した場合に通常吸湿される程度の水分が含まれていてもよいが、水は機能性モノマーと特異的官能基部位との相互作用を阻害するため、有機溶媒を蒸留するや、シリカゲル等の吸湿材を用いること等により、水分を除去することが好ましい。また、有機溶媒と水とが完全に分離しているものは用いない。
【００４６】
この重合の具体的方法をさらに詳細に説明する。本実施の形態にかかる分子インプリント法では、タンパク質アモルファスの表面に配位した特異的官能基部位と相補的に結合する特異的結合部位を有する機能性モノマーと架橋性モノマーとを含むプレポリマー（重合性分子）を溶解した有機溶媒（インプリント溶液）と、鋳型であるタンパク質アモルファスと接触させた状態で重合（分子インプリント）を行う。
【００４７】
この重合において、タンパク質アモルファスは、その表面のみ有機溶媒と接触するため、有機溶媒による変性が生じにくい。また、溶媒として極性の小さい（比誘電率の小さい）有機溶媒を用いると、従来の水系溶媒とは異なり、溶媒がタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位と水素結合することがなくなるので、鋳型であるタンパク質アモルファスと機能性モノマーとの結合が阻害されなくなり、タンパク質アモルファスの表面に配位した特異的官能基部位を正確に型取ることができる。よって、認識特異性の高いタンパク質認識構造体が得られる。
【００４８】
この後、重合後のポリマーに、鋳型であるタンパク質を溶解できる溶液を接触させて、鋳型であるタンパク質アモルファスを取り除く。このようなタンパク質を溶解性できる溶液として、アモルファス作製時にタンパク質を溶解させた緩衝液や水を用いることができる。
【００４９】
この後、得られたインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）を取り扱いやすい大きさ粉砕し、直径が１ｍｍ以下、より好ましくは直径１０〜１００μｍの大きさに選別する。大きさの選別には、ふるいを用いることができる。
【００５０】
このようにして作製されたタンパク質認識構造体は、タンパク質アモルファスの表面形状のみを型取ったものではなく、タンパク質アモルファス表面に存在するカルボキシル基、アミノ基などの特異的官能基部位の位置情報をも型取られている。これは、機能性モノマーに含まれる特異的結合部位が、タンパク質アモルファスの表面の特異的官能基部位に相補的に結合した状態で重合されるためである。これにより、タンパク質認識の際、タンパク質の表面形状だけではなく、タンパク質表面の官能基と、タンパク質認識構造体中の官能基間の水素結合、イオン結合、疎水結合などによる相互結合を含む認識作用により、タンパク質の認識が行われることとなる。よって、認識特異性の高いタンパク質認識構造体となる。
【００５１】
機能性モノマーとしては、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相互作用可能な結合基と、重合可能なビニル基とを有するものを用いることが好ましい。このような化合物として、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレートなどが挙げられる。
【００５２】
架橋剤としては、分子中に重合可能なビニル基を少なくとも２個有する分子を用いることが好ましい。このような化合物として、エチレングリコールジメチルアクリレート、Ｎ,Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ジビニルベンゼン等が挙げられる。
【００５３】
インプリント溶液には、タンパク質アモルファスが溶けないように沈殿剤が加えられてもよい。このとき、沈殿剤としては、タンパク質のアモルファス作製の際に例示したものを用いることができるが、塩はタンパク質と機能性モノマーの静電的相互作用を阻害するので、用いないことが好ましい。また、アルコールは、アルコールの有するＯＨ基がタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位と水素結合して、特異的官能基部位を正確に型取ることを阻害するため、用いないことが好ましい。
【００５４】
重合には、重合開始剤を加えても良い。重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウム等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ系重合開始剤を用いることができる。
また、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどの重合促進剤を加えても良い。
【００５５】
重合は、熱重合、または紫外線照射による光重合を用いることができる。これらは単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。このときの重合温度は、タンパク質が熱変性しない温度が好ましく、４℃〜４０℃である。
重合時間に制限はないが、目視により溶液がゲル化していれば重合完了と判断できる。一般的には０．５〜４８時間で重合が完了する。
【００５６】
（実施の形態２）
実施の形態２を図面に基づいて説明する。実施の形態２では鋳型としてタンパク質アモルファスを用いて薄膜状のタンパク質認識構造体を作製する。図２は実施の形態２のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
【００５７】
この実施の形態において、タンパク質のアモルファス作製、重合溶媒、機能性モノマー、架橋剤、沈殿剤、重合促進剤、熱重合または紫外線照射による光重合、重合時間は上記実施の形態１と同様なので省略する。
【００５８】
タンパク質のアモルファスを作製し、アモルファスと溶液を分離後、図２（ａ）のようにアモルファス１２を基板上１１に置き、図２（ｂ）に示すように機能性モノマー、架橋剤、重合溶媒からなるプレポリマー溶液（インプリント溶液）１３を滴下する。このときプレポリマー溶液には必要に応じて沈殿剤、重合開始剤、重合促進剤を加えてもよい。図２（ｃ）のように、さらにその上に基板１４を乗せる。この基板１４にポリマー薄膜を形成させるため、基板１４とポリマーとを結合させる。そのような結合方法として物理的結合と化学的結合がある。中でも、化学的結合がより強固に結合するので望ましい。化学結合させる方法として、基板表面をビニル基のような重合可能な二重結合を持つ分子で修飾しておく方法が挙げられる。
【００５９】
次に、熱重合または光重合でポリマー重合を行った後、基板を剥がす。
最後に、ポリマー薄膜１５が形成された基板１４に、実施の形態１と同様に鋳型であるタンパク質に溶解性を示す溶液を接触させて、鋳型であるタンパク質を取り除く。これにより、図２（ｄ）のようにポリマー薄膜の表面に標的分子であるタンパク質がインプリントされたタンパク質認識構造体を作製することができる。
【００６０】
（実施の形態３）
実施の形態３を図面に基づいて説明する。実施の形態３はタンパク質のアモルファスを鋳型として用いてタンパク質認識構造体の微粒子を作製し、この微粒子を基板上に配置してタンパク質認識基板を作製する。
【００６１】
この実施の形態において、タンパク質のアモルファス作製、重合溶媒、機能性モノマー、架橋剤、沈殿剤、重合促進剤、熱重合または紫外線照射による光重合、重合時間は上記実施の形態１と同様なので省略する。
【００６２】
フラスコにタンパク質アモルファス、機能性モノマー、架橋剤、重合溶媒を入れ、必要に応じて沈殿剤、重合開始剤、重合促進剤を加える。このとき作製されるインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）をナノサイズの微粒子にするため、フラスコ内の溶液を攪拌しながら、熱重合または光重合でポリマー重合を行う。このときの攪拌速度は１分間に１０〜５００回転が望ましい。
【００６３】
合成されたタンパク質認識構造体微粒子から鋳型を除去する方法は、上記実施の形態１と同様であるので省略する。
【００６４】
次に、合成したタンパク質認識構造体微粒子を基板上に配置する。配置方法としては、微粒子の懸濁液、基板上に滴下することで配置する。このとき、微粒子と基板とを結合させることが望ましい。結合方法としては物理的結合と、化学的結合を行うことができるが、ナノサイズの大きさのものであれば、物理的結合で十分強く結合し、且つ低コストであるため、物理的結合が望ましい。
【００６５】
このとき、基板上の複数の位置に微粒子の懸濁溶液を滴下し、微粒子のスポットをアレイ状に配置することもできる。
【００６６】
また、図３に示すように、異なるタンパク質アモルファスを鋳型として作製した複数種のタンパク質認識構造体微粒子の懸濁溶液を、基板上の異なる位置に滴下して基板に固定させると、複数種のタンパク質を特異的に認識するタンパク質認識基板が得られる。この基板において、基板上の微粒子の各スポットは、それぞれ異なるタンパク質を認識する。
【００６７】
図３（ａ）に示すように、タンパク質Ａのアモルファスを鋳型として作製した微粒子２１の懸濁溶液を基板２０上に滴下しスポット２３を形成する。それとは異なる位置にタンパク質Ｂのアモルファスを鋳型として作製した微粒子２２の懸濁溶液を基板上に滴下しスポット２４を形成する。微粒子を基板に結合させされば、図３（ｂ）に示すように１枚の基板上に、タンパク質Ａを認識する部位２５とタンパク質Ｂを認識する部位２６が形成されたタンパク質認識基板が得られる。
【００６８】
（実施例１）
実施例１ではタンパク質のアモルファスを鋳型として薄膜状のタンパク質認識構造体を作製した。
鋳型のタンパク質としてリゾチームを用いた。
【００６９】
（タンパク質アモルファスの作製）
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌにリゾチームを１２０ｍｇ溶かした。この溶液に沈殿剤として硫酸アンモニウムを１．４ｇ加えて溶かした。この溶液を１０ｍｌバイアル瓶に入れ、密封し、２５℃で静置した。１日静置後にタンパク質アモルファスの形成が確認された。
【００７０】
（プレポリマー溶液の調整）
機能性モノマーとしてのアクリル酸７μｌと、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート１８８μｌと、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリル３．２ｍｇと、をクロロホルム６ｍｌに溶かし、プレポリマー溶液（インプリント溶液）とした。
【００７１】
（基板の修飾）
タンパク質認識構造体を載置する基板として、ガラス基板に金膜がコートされているＳＰＲ用のセンサーチップ（ビアコア社製）を用いた。センサーチップとポリマーとが化学的に結合できるように、次のようにしてセンサーチップ表面をビニル基で修飾した。具体的には、センサーチップをＮ,Ｎ’-ビス（アクリロイル）シスタミン１０ｍｇを溶かしたメタノール溶液８ｍｌに３０分間浸漬し、センサーチップ表面の金膜と、Ｎ,Ｎ’-ビス（アクリロイル）シスタミンのチオール基との間で共有結合させた。
【００７２】
（インプリント工程）
アモルファス溶液から上澄みを除き、上記プレポリマー溶液でタンパク質アモルファスを３回洗浄した。その後、タンパク質アモルファスをスライドガラスの上に置き、プレポリマー溶液１００μｌを滴下した。その上に、ビニル基修飾センサーチップを乗せ、４℃で紫外線照射を２時間行い、重合させた。
【００７３】
（洗浄）
重合反応後、センサーチップを剥がし、クロロホルム、メタノール、１Ｍ塩化ナトリウム溶液、純水の順に洗浄を行い、未反応モノマーおよび鋳型であるタンパク質アモルファスを除去した。
【００７４】
（再結合実験）
このようにして作製したタンパク質認識構造体の薄膜を用いて、リゾチーム、チトクロムｃ、リボヌクレアーゼＡ、ミオグロビン、ラクトアルブミン、トリプシンに対する結合実験を行った。結合実験は、ＳＰＲ（ビアコア社製）を用いて行った。
【００７５】
タンパク質濃度２μＭのサンプル溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間、タンパク質認識構造体の薄膜に添加した。添加終了後１０秒後の結合量を求めた。タンパク質添加後、１Ｍ塩化ナトリウム溶液を２分間添加し、結合したタンパク質を除いた。タンパク質認識構造体の薄膜に対するタンパク質の結合量を図４に示す。
【００７６】
図４に示すように、リゾチームのアモルファスを鋳型としたタンパク質認識構造体の薄膜には、鋳型であるリゾチームが他のタンパク質と比べて最も多く結合している。よって、鋳型として用いたタンパク質に対する極めて高い認識特異性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上に説明したように、本発明によると、特定のタンパク質に対する認識能力に優れたタンパク質認識構造体を、安価に提供することができる。よって、産業上の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明のタンパク質認識構造体の製造方法の一例を示す図である。
【図２】本発明のタンパク質認識構造体の製造方法の一例を示す図である。
【図３】本発明のタンパク質認識基板の製造方法の一例を示す図である。
【図４】実施例１のタンパク質認識構造体を用いたタンパク質の結合量を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
１ アモルファス作製溶液
２ タンパク質アモルファス
３ プレポリマー溶液
１１ 基板
１２ アモルファス
１３ プレポリマー溶液
１４ 基板
１５ ポリマー
２０ 基板
２１ 微粒子Ａ
２２ 微粒子Ｂ
２３ スポットＡ
２４ スポットＢ
２５ タンパク質Ａを認識する部位
２６ タンパク質Ｂを認識する部位
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質と特異的に認識・反応するタンパク質認識構造体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオセンサーなどのバイオテクノロジー、および病気の診断・治療等の分野において、タンパク質を利用してセンシングや診断・治療を行うことが多くなってきている。一般的に、タンパク質は、生体の細胞内において多くの種類が混じった混合物として存在する。バイオセンサーや病気の診断においては、生体内に含まれる複数種のタンパク質から、所望するタンパク質のみを特異的に認識し、検出する必要がある。
【０００３】
従来、特定のタンパク質を識別する方法としては、抗原となるタンパク質と、抗原と特異的に反応（認識）する物質（抗体）と、を用いた抗原抗体反応（免疫分析法）採用していた。しかし、免疫分析法では、ラットやマウス等の生体に特定のタンパク質（抗原）を注入し、生体内で抗原に対する抗体を形成させた後、その抗体を分離・抽出・精製する必要がある。よって、抗体の作成に長時間を要するという問題があった。
【０００４】
また、生体を用いて抗体を生成させなければならないため、生体（ラット、マウス等）の飼育・管理が煩雑でコストがかかる。さらに、このようにして得られた抗体は、熱や酸あるいはアルカリによって変性しやすく、また長時間の保存により失活して、認識能力を失ってしまうおそれがある。
【０００５】
このような背景から、特定のタンパク質を抗体と同程度以上に特異的に認識し、且つ製造が簡単で保存性の良いタンパク質認識構造体の開発が望まれている。
【０００６】
このような中、いわゆる分子インプリント法を用いてタンパク質認識構造体を作製する方法が提案されている。分子インプリント法は、機能性モノマーを用いてポリマー内にタンパク質等の分子を型取り、分子の形状や化学的特性をポリマー内に転写させる方法である。この方法によると、過酷な条件下でも安定して使用できるタンパク質認識構造体を効率よく生産できる。このような分子インプリント法を利用したタンパク質認識構造体に関する技術としては、特許文献１が挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特許3527239号公報
【０００８】
特許文献１に係る技術は、標的物質と結合する少なくとも２つのリガンドを、標的物質であるプリント分子（タンパク質）の少なくとも２つの結合部位に結合させ、次いでリガンドを吸着剤に固定化した後、プリント分子を除去することによって、選択的吸着材料を作製する技術である。この技術によると、特異的に配置された結合基を有し、選択的にタンパク質等の生体高分子を吸着できる吸着剤が得られるとされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らが分子インプリント法について鋭意研究したところ、従来の分子インプリント法では、溶液状態のタンパク質を用い、これに機能性モノマーを加えて重合させてインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）を作製しているが、溶液中ではタンパク質が分子運動しているので、作製されたタンパク質認識構造体に型取られたタンパク質の型と、本来のタンパク質の形状とが一致していない事を知った。このため、従来の分子インプリント法では、タンパク質の特異的官能基部位が正確に型取られていないため、従来の方法で作製されたタンパク質認識構造体は、鋳型として用いたタンパク質と形状の異なる標的物質以外のタンパク質とも結合してしまう。
【００１０】
本発明者らは、タンパク質結晶を鋳型として用いた分子インプリント法について、特願2005-337989に開示している。この技術によると、認識特異性の高いタンパク質認識構造体が得られる。しかしながら、タンパク質の結晶化は難しいため、結晶化が困難なタンパク質についての認識特異性の高いタンパク質認識構造体を得ることは難しい。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであって、認識特異性を飛躍的に向上させ得たタンパク質認識構造体を安価に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するためのタンパク質認識構造体に係る本発明は、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位のみを分子インプリントされたタンパク質認識構造体である。
【００１３】
上記タンパク質認識構造体は、タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面の特異的官能基部位が正確に型取られているため、当該タンパク質との認識特異性が高く、且つその他のタンパク質との認識特異性は極めて低いものとなる。よって、認識特異性に優れたタンパク質認識構造体となる。
【００１４】
上記課題を解決するためのタンパク質認識基板に係る本発明は、タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位を分子インプリントされたタンパク質認識構造体が、基板上にアレイ配置されているタンパク質認識基板である。
【００１５】
上記タンパク質認識構造体を、アレイ配置した基板を用いることにより、複数回のタンパク質の検出を一つの基板で行うことができる。
【００１６】
上記課題を解決するためのタンパク質認識構造体の製造方法に係る本発明は、タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法である。
である。
【００１７】
タンパク質アモルファスは、結晶のように規則的ではないが一定の立体構造をとっており、タンパク質が分子運動したり変性したりして構造が変化していない状態である。このように構造が一定で安定なタンパク質アモルファスを鋳型として用いることにより、正確にタンパク質アモルファスの表面の特異的感応部位のみの形をインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）に型取ることができ、タンパク質認識構造体の認識特異性が飛躍的に向上する。
【００１８】
本発明の効果を、より詳細に説明する。
従来技術のように、タンパク質を溶液に溶かして分子インプリントを行う方法では、分子インプリントがタンパク質のいろいろな部位で行われることになり、インプリントポリマー（タンパク質認識構造体）の結合部位は不均一となる。このため、認識力の弱い部位から強い部位までさまざまな官能基部位が存在することになり、認識特異性が低くなる。
【００１９】
他方、本発明では、タンパク質アモルファスを用いており、タンパク質アモルファスは多数のタンパク質分子が集合したものであり、アモルファスは結晶のように規則正しい配列にはなっていないが、タンパク質が分子運動したり変性したりして構造が変化しない安定した状態になっている。このため、アモルファス表面においては一定の表面（特定の官能基部位）が露出する。よって、本発明に係る分子インプリント法では、アモルファス表面形状を正確に型取れるとともに、重合性分子に含まれる機能性モノマーがアモルファス表面に露出している特定の官能基部位の型を取ることになるので、タンパク質認識構造体中に形成された結合部位は、タンパク質の特異的官能基部位の形を型取ったものとなる。よって、この製造方法で作製されたタンパク質認識構造体の結合特異性が飛躍的に向上する。
【００２０】
また、タンパク質の結晶化は困難であるという問題があるが、タンパク質のアモルファスを得ることは容易である。よって、結晶化が困難なタンパク質を特異的に認識する認識構造体を容易に作製できる。
【００２１】
ここで、本明細書において、タンパク質アモルファスとは、結晶状態以外の全ての固体状態のタンパク質を意味し、タンパク質固体の一部に微結晶が含まれていたり、タンパク質分子の一部が規則正しく配列されていたりするものも含む。
【００２２】
また、タンパク質アモルファス表面とは、タンパク質アモルファスの外表面を意味し、タンパク質の立体構造における内部表面を意味しない。つまり、アモルファス表面に配位したタンパク質の特異的官能基部位とは、タンパク質の立体構造において内部表面に配位した特異的官能基部位ではなく、外表面側に配位した特異的官能基部位を意味する。また、タンパク質アモルファスの表面形状とは、アモルファス表面に現れた１分子のみの形状であってもよい。
【００２３】
また、相補的に結合とは、水素結合、イオン結合、疎水結合などによる相互結合を意味する。
【００２４】
上記構成において、前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒である構成とすることができる。
【００２５】
タンパク質は、通常、有機溶媒と接触すると変性しやすいが、タンパク質をアモルファス状態とすることにより有機溶媒とタンパク質との接触を、アモルファス表面のみに限定することができる。アモルファス表面においては、タンパク質分子の一部分のみが表面に露出している状態であり、この表面部分のみが有機溶媒と接触するため、タンパク質をアモルファスとすることによりタンパク質の変性を極めておきにくくすることができる。また、有機溶媒を用いることにより、タンパク質アモルファスと水等の極性分子との水素結合によってタンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位（たとえば、カルボキシル基やアミノ基等）と機能性モノマーとの相互認識反応をより効果的に行うことができる。よって、タンパク質認識構造体の結合特異性を更に高めることができる。
【００２６】
ここで、有機溶媒の非比誘電膣が高いと、有機溶媒自体が機能性モノマーと特異的官能基部位との相補的結合を阻害するため、比誘電率が２５℃において水よりも小さいものを用いることが好ましい。
【００２７】
また、インプリント溶液に多量に水が含まれていると、水が機能性モノマーと特異的官能基部位との相補的結合を阻害するため、好ましくは、インプリント溶液の含水分量を１質量％以下とする。
【００２８】
ここで、インプリントの含水分量は、有機溶媒や重合性分子に含まれる水分量の総和を意味し、有機溶媒と水とが分離しているものは有機溶媒に含めない。
【００２９】
また、アモルファス作製を容易にする観点から、タンパク質アモルファスとして水溶性タンパク質のアモルファスを用いることが好ましい。
【００３０】
上記課題を解決するためのタンパク質認識基板の製造方法に係る本発明は、タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、前記除去ステップの後、作製されたタンパク質認識構造体を基板上にアレイ配置する配置ステップとを備えることを特徴とするタンパク質認識基板の製造方法である。
【００３１】
上記製造方法により、タンパク質認識基板を容易に作製できる。
【００３２】
上記構成において、前記重合ステップが、直径１０００ｎｍ以下のポリマーにインプリントするステップであるとすることができる。
【００３３】
試験管やバイアル瓶内で重合されたタンパク質認識構造体は、通常、容器の形状そのままとなる。よって、これを基板に配置するには、タンパク質認識構造体を粉砕し、この後所定の粒径のものを選別し、これを基板上に配置する必要がある。しかし、上記構成のように、作製されるタンパク質認識構造体のサイズを１０００ｎｍ以下とすることにより、粉砕・選別が不要となり、タンパク質認識基板の作製がより容易となる。
【００３４】
上記構成において、前記配置ステップは、異なる種類のタンパク質を鋳型としたタンパク質認識構造体を、それぞれ異なるアレイに配置するステップであるとすることができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によると、高い認識特異性を持つタンパク質認識構造体（インプリントポリマー）を低コストで提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面に基づいて説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
実施の形態１を図面に基づいて説明する。図１は実施の形態１のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
【００３８】
最初に、鋳型であるタンパク質のアモルファス作製を行う（図１（ａ））。水もしくは水系の緩衝液にタンパク質を溶かし、この後沈殿剤を加え、過飽和状態のタンパク質溶液を調製し、密閉された容器に入れて静置しておく。
【００３９】
タンパク質のアモルファス作製に際しては、タンパク質を変性させないために、タンパク質溶液のｐＨを一定に保つことが望ましい。このため、タンパク質は緩衝液に溶かすことが好ましい。そのような緩衝液として、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）などのグッズの緩衝液等を用いることができる。
【００４０】
沈殿剤は、タンパク質を過飽和状態にするものであって、塩、ポリエチレングリコール、アルコール等を用いることができる。塩としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。ポリエチレングリコールとしては、分子量１００〜１０００００のものを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メチルペンタンジオール等を用いることができる。
【００４１】
アモルファス作製時のタンパク質の濃度は、沈殿剤によりタンパク質が過飽和状態になる程度に高いことが望ましい。具体的には、１０ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲内であることが好ましい。
このようにして、図１（ｂ）に示すようにタンパク質のアモルファス２が得られる。
【００４２】
この後、図１（ｃ）に示すようにアモルファス２を液から分離させる。これは、アモルファスのみをピペットなどで取ってもよく、アモルファスを残して液だけ除去してもよい。
【００４３】
次に、図１（ｄ）に示すように、重合は、有機溶媒に機能性モノマー、架橋剤を溶かしたプレポリマー溶液（インプリント溶液）３と、タンパク質アモルファスとを混合し、タンパク質アモルファスとプレポリマーとが接触した状態で、分子インプリント法により重合を行う。
【００４４】
有機溶媒としては、溶媒とタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位との水素結合等により、機能性モノマーと特異的官能基部位との相互作用が阻害されることを防止するため、比誘電率が水よりも低く、且つ極性が低いものを用いることが好ましい。例えば、ヘキサン等の脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、酢酸エチル等のエステル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類などの公知の有機溶媒を用いることができる。
【００４５】
また、インプリント溶液中には、２５℃、湿度２０〜８０％の雰囲気中に放置した場合に通常吸湿される程度の水分が含まれていてもよいが、水は機能性モノマーと特異的官能基部位との相互作用を阻害するため、有機溶媒を蒸留するや、シリカゲル等の吸湿材を用いること等により、水分を除去することが好ましい。また、有機溶媒と水とが完全に分離しているものは用いない。
【００４６】
この重合の具体的方法をさらに詳細に説明する。本実施の形態にかかる分子インプリント法では、タンパク質アモルファスの表面に配位した特異的官能基部位と相補的に結合する特異的結合部位を有する機能性モノマーと架橋性モノマーとを含むプレポリマー（重合性分子）を溶解した有機溶媒（インプリント溶液）と、鋳型であるタンパク質アモルファスと接触させた状態で重合（分子インプリント）を行う。
【００４７】
この重合において、タンパク質アモルファスは、その表面のみ有機溶媒と接触するため、有機溶媒による変性が生じにくい。また、溶媒として極性の小さい（比誘電率の小さい）有機溶媒を用いると、従来の水系溶媒とは異なり、溶媒がタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位と水素結合することがなくなるので、鋳型であるタンパク質アモルファスと機能性モノマーとの結合が阻害されなくなり、タンパク質アモルファスの表面に配位した特異的官能基部位を正確に型取ることができる。よって、認識特異性の高いタンパク質認識構造体が得られる。
【００４８】
この後、重合後のポリマーに、鋳型であるタンパク質を溶解できる溶液を接触させて、鋳型であるタンパク質アモルファスを取り除く。このようなタンパク質を溶解性できる溶液として、アモルファス作製時にタンパク質を溶解させた緩衝液や水を用いることができる。
【００４９】
この後、得られたインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）を取り扱いやすい大きさ粉砕し、直径が１ｍｍ以下、より好ましくは直径１０〜１００μｍの大きさに選別する。大きさの選別には、ふるいを用いることができる。
【００５０】
このようにして作製されたタンパク質認識構造体は、タンパク質アモルファスの表面形状のみを型取ったものではなく、タンパク質アモルファス表面に存在するカルボキシル基、アミノ基などの特異的官能基部位の位置情報をも型取られている。これは、機能性モノマーに含まれる特異的結合部位が、タンパク質アモルファスの表面の特異的官能基部位に相補的に結合した状態で重合されるためである。これにより、タンパク質認識の際、タンパク質の表面形状だけではなく、タンパク質表面の官能基と、タンパク質認識構造体中の官能基間の水素結合、イオン結合、疎水結合などによる相互結合を含む認識作用により、タンパク質の認識が行われることとなる。よって、認識特異性の高いタンパク質認識構造体となる。
【００５１】
機能性モノマーとしては、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相互作用可能な結合基と、重合可能なビニル基とを有するものを用いることが好ましい。このような化合物として、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレートなどが挙げられる。
【００５２】
架橋剤としては、分子中に重合可能なビニル基を少なくとも２個有する分子を用いることが好ましい。このような化合物として、エチレングリコールジメチルアクリレート、Ｎ,Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ジビニルベンゼン等が挙げられる。
【００５３】
インプリント溶液には、タンパク質アモルファスが溶けないように沈殿剤が加えられてもよい。このとき、沈殿剤としては、タンパク質のアモルファス作製の際に例示したものを用いることができるが、塩はタンパク質と機能性モノマーの静電的相互作用を阻害するので、用いないことが好ましい。また、アルコールは、アルコールの有するＯＨ基がタンパク質アモルファス表面の特異的官能基部位と水素結合して、特異的官能基部位を正確に型取ることを阻害するため、用いないことが好ましい。
【００５４】
重合には、重合開始剤を加えても良い。重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウム等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ系重合開始剤を用いることができる。
また、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどの重合促進剤を加えても良い。
【００５５】
重合は、熱重合、または紫外線照射による光重合を用いることができる。これらは単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。このときの重合温度は、タンパク質が熱変性しない温度が好ましく、４℃〜４０℃である。
重合時間に制限はないが、目視により溶液がゲル化していれば重合完了と判断できる。一般的には０．５〜４８時間で重合が完了する。
【００５６】
（実施の形態２）
実施の形態２を図面に基づいて説明する。実施の形態２では鋳型としてタンパク質アモルファスを用いて薄膜状のタンパク質認識構造体を作製する。図２は実施の形態２のタンパク質認識構造体の作製手順を示す図である。
【００５７】
この実施の形態において、タンパク質のアモルファス作製、重合溶媒、機能性モノマー、架橋剤、沈殿剤、重合促進剤、熱重合または紫外線照射による光重合、重合時間は上記実施の形態１と同様なので省略する。
【００５８】
タンパク質のアモルファスを作製し、アモルファスと溶液を分離後、図２（ａ）のようにアモルファス１２を基板上１１に置き、図２（ｂ）に示すように機能性モノマー、架橋剤、重合溶媒からなるプレポリマー溶液（インプリント溶液）１３を滴下する。このときプレポリマー溶液には必要に応じて沈殿剤、重合開始剤、重合促進剤を加えてもよい。図２（ｃ）のように、さらにその上に基板１４を乗せる。この基板１４にポリマー薄膜を形成させるため、基板１４とポリマーとを結合させる。そのような結合方法として物理的結合と化学的結合がある。中でも、化学的結合がより強固に結合するので望ましい。化学結合させる方法として、基板表面をビニル基のような重合可能な二重結合を持つ分子で修飾しておく方法が挙げられる。
【００５９】
次に、熱重合または光重合でポリマー重合を行った後、基板を剥がす。
最後に、ポリマー薄膜１５が形成された基板１４に、実施の形態１と同様に鋳型であるタンパク質に溶解性を示す溶液を接触させて、鋳型であるタンパク質を取り除く。これにより、図２（ｄ）のようにポリマー薄膜の表面に標的分子であるタンパク質がインプリントされたタンパク質認識構造体を作製することができる。
【００６０】
（実施の形態３）
実施の形態３を図面に基づいて説明する。実施の形態３はタンパク質のアモルファスを鋳型として用いてタンパク質認識構造体の微粒子を作製し、この微粒子を基板上に配置してタンパク質認識基板を作製する。
【００６１】
この実施の形態において、タンパク質のアモルファス作製、重合溶媒、機能性モノマー、架橋剤、沈殿剤、重合促進剤、熱重合または紫外線照射による光重合、重合時間は上記実施の形態１と同様なので省略する。
【００６２】
フラスコにタンパク質アモルファス、機能性モノマー、架橋剤、重合溶媒を入れ、必要に応じて沈殿剤、重合開始剤、重合促進剤を加える。このとき作製されるインプリントポリマー（タンパク質認識構造体）をナノサイズの微粒子にするため、フラスコ内の溶液を攪拌しながら、熱重合または光重合でポリマー重合を行う。このときの攪拌速度は１分間に１０〜５００回転が望ましい。
【００６３】
合成されたタンパク質認識構造体微粒子から鋳型を除去する方法は、上記実施の形態１と同様であるので省略する。
【００６４】
次に、合成したタンパク質認識構造体微粒子を基板上に配置する。配置方法としては、微粒子の懸濁液、基板上に滴下することで配置する。このとき、微粒子と基板とを結合させることが望ましい。結合方法としては物理的結合と、化学的結合を行うことができるが、ナノサイズの大きさのものであれば、物理的結合で十分強く結合し、且つ低コストであるため、物理的結合が望ましい。
【００６５】
このとき、基板上の複数の位置に微粒子の懸濁溶液を滴下し、微粒子のスポットをアレイ状に配置することもできる。
【００６６】
また、図３に示すように、異なるタンパク質アモルファスを鋳型として作製した複数種のタンパク質認識構造体微粒子の懸濁溶液を、基板上の異なる位置に滴下して基板に固定させると、複数種のタンパク質を特異的に認識するタンパク質認識基板が得られる。この基板において、基板上の微粒子の各スポットは、それぞれ異なるタンパク質を認識する。
【００６７】
図３（ａ）に示すように、タンパク質Ａのアモルファスを鋳型として作製した微粒子２１の懸濁溶液を基板２０上に滴下しスポット２３を形成する。それとは異なる位置にタンパク質Ｂのアモルファスを鋳型として作製した微粒子２２の懸濁溶液を基板上に滴下しスポット２４を形成する。微粒子を基板に結合させされば、図３（ｂ）に示すように１枚の基板上に、タンパク質Ａを認識する部位２５とタンパク質Ｂを認識する部位２６が形成されたタンパク質認識基板が得られる。
【００６８】
（実施例１）
実施例１ではタンパク質のアモルファスを鋳型として薄膜状のタンパク質認識構造体を作製した。
鋳型のタンパク質としてリゾチームを用いた。
【００６９】
（タンパク質アモルファスの作製）
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌにリゾチームを１２０ｍｇ溶かした。この溶液に沈殿剤として硫酸アンモニウムを１．４ｇ加えて溶かした。この溶液を１０ｍｌバイアル瓶に入れ、密封し、２５℃で静置した。１日静置後にタンパク質アモルファスの形成が確認された。
【００７０】
（プレポリマー溶液の調整）
機能性モノマーとしてのアクリル酸７μｌと、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート１８８μｌと、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリル３．２ｍｇと、をクロロホルム６ｍｌに溶かし、プレポリマー溶液（インプリント溶液）とした。
【００７１】
（基板の修飾）
タンパク質認識構造体を載置する基板として、ガラス基板に金膜がコートされているＳＰＲ用のセンサーチップ（ビアコア社製）を用いた。センサーチップとポリマーとが化学的に結合できるように、次のようにしてセンサーチップ表面をビニル基で修飾した。具体的には、センサーチップをＮ,Ｎ’-ビス（アクリロイル）シスタミン１０ｍｇを溶かしたメタノール溶液８ｍｌに３０分間浸漬し、センサーチップ表面の金膜と、Ｎ,Ｎ’-ビス（アクリロイル）シスタミンのチオール基との間で共有結合させた。
【００７２】
（インプリント工程）
アモルファス溶液から上澄みを除き、上記プレポリマー溶液でタンパク質アモルファスを３回洗浄した。その後、タンパク質アモルファスをスライドガラスの上に置き、プレポリマー溶液１００μｌを滴下した。その上に、ビニル基修飾センサーチップを乗せ、４℃で紫外線照射を２時間行い、重合させた。
【００７３】
（洗浄）
重合反応後、センサーチップを剥がし、クロロホルム、メタノール、１Ｍ塩化ナトリウム溶液、純水の順に洗浄を行い、未反応モノマーおよび鋳型であるタンパク質アモルファスを除去した。
【００７４】
（再結合実験）
このようにして作製したタンパク質認識構造体の薄膜を用いて、リゾチーム、チトクロムｃ、リボヌクレアーゼＡ、ミオグロビン、ラクトアルブミン、トリプシンに対する結合実験を行った。結合実験は、ＳＰＲ（ビアコア社製）を用いて行った。
【００７５】
タンパク質濃度２μＭのサンプル溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間、タンパク質認識構造体の薄膜に添加した。添加終了後１０秒後の結合量を求めた。タンパク質添加後、１Ｍ塩化ナトリウム溶液を２分間添加し、結合したタンパク質を除いた。タンパク質認識構造体の薄膜に対するタンパク質の結合量を図４に示す。
【００７６】
図４に示すように、リゾチームのアモルファスを鋳型としたタンパク質認識構造体の薄膜には、鋳型であるリゾチームが他のタンパク質と比べて最も多く結合している。よって、鋳型として用いたタンパク質に対する極めて高い認識特異性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上に説明したように、本発明によると、特定のタンパク質に対する認識能力に優れたタンパク質認識構造体を、安価に提供することができる。よって、産業上の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明のタンパク質認識構造体の製造方法の一例を示す図である。
【図２】本発明のタンパク質認識構造体の製造方法の一例を示す図である。
【図３】本発明のタンパク質認識基板の製造方法の一例を示す図である。
【図４】実施例１のタンパク質認識構造体を用いたタンパク質の結合量を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
１ アモルファス作製溶液
２ タンパク質アモルファス
３ プレポリマー溶液
１１ 基板
１２ アモルファス
１３ プレポリマー溶液
１４ 基板
１５ ポリマー
２０ 基板
２１ 微粒子Ａ
２２ 微粒子Ｂ
２３ スポットＡ
２４ スポットＢ
２５ タンパク質Ａを認識する部位
２６ タンパク質Ｂを認識する部位
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体。
【請求項２】
タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体が、基板上にアレイ配置されているタンパク質認識基板。
【請求項３】
タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、
を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項４】
前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒である、
ことを特徴とする請求項３記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項５】
前記有機溶媒の比誘電率が、２５℃条件において水よりも小さいことを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項６】
前記インプリント溶液に含まれる水分量が、１質量％以下であることを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質アモルファスが水溶性タンパク質のアモルファスであることを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項８】
タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、
前記除去ステップの後、作製されたタンパク質認識構造体を基板上にアレイ配置する配置ステップと、
を備えることを特徴とするタンパク質認識基板の製造方法。
【請求項９】
前記重合ステップが、直径１０００ｎｍ以下のポリマーにインプリントするステップであることを特徴とする請求項８記載のタンパク質認識基板の製造方法。
【請求項１０】
前記配置ステップは、異なる種類のタンパク質を鋳型としたタンパク質認識構造体を、それぞれ異なるアレイに配置するステップであることを特徴とする請求項８記載のタンパク質認識基板の製造方法。
【請求項１】
タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体。
【請求項２】
タンパク質アモルファスの表面形状及びタンパク質アモルファスの表面に配位された特異的官能基部位が分子インプリントされたタンパク質認識構造体が、基板上にアレイ配置されているタンパク質認識基板。
【請求項３】
タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、
を備えることを特徴とするタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項４】
前記重合性分子を溶解させる溶媒が、有機溶媒である、
ことを特徴とする請求項３記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項５】
前記有機溶媒の比誘電率が、２５℃条件において水よりも小さいことを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項６】
前記インプリント溶液に含まれる水分量が、１質量％以下であることを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質アモルファスが水溶性タンパク質のアモルファスであることを特徴とする請求項４記載のタンパク質認識構造体の製造方法。
【請求項８】
タンパク質アモルファス固体表面に、タンパク質アモルファス表面に配位された特異的官能基部位と相補的に結合する機能性モノマーを有する前記重合性分子を溶解させたインプリント溶液を接触させ、この状態で前記重合性分子を重合させる重合ステップと、
前記重合ステップの後、重合されたインプリントポリマーからタンパク質を除去する除去ステップと、
前記除去ステップの後、作製されたタンパク質認識構造体を基板上にアレイ配置する配置ステップと、
を備えることを特徴とするタンパク質認識基板の製造方法。
【請求項９】
前記重合ステップが、直径１０００ｎｍ以下のポリマーにインプリントするステップであることを特徴とする請求項８記載のタンパク質認識基板の製造方法。
【請求項１０】
前記配置ステップは、異なる種類のタンパク質を鋳型としたタンパク質認識構造体を、それぞれ異なるアレイに配置するステップであることを特徴とする請求項８記載のタンパク質認識基板の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２４７８１（Ｐ２００８−２４７８１Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９６９６３（Ｐ２００６−１９６９６３）
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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