ダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体、及びその製造に用いられるプラスミドベクター及び遺伝子、並びにこの遺伝子でコードされるタンパク質
【課題】 アブラナ科植物の形質転換によりダイオキシン類分解能が高められた形質転換植物体、このような形質転換植物体を製造する上で必要なプラスミドベクター、及び特定の白色腐朽菌由来の新規タンパク質（ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼ）をそれぞれコードする遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質の提供。
【解決手段】 ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解形質転換植物体、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入させるために用いられるプラスミドベクター、特定ＤＮＡ配列遺伝子であり、また、これらの遺伝子でそれぞれコードされる６種のタンパク質。
【解決手段】 ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解形質転換植物体、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入させるために用いられるプラスミドベクター、特定ＤＮＡ配列遺伝子であり、また、これらの遺伝子でそれぞれコードされる６種のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換植物体、及びこの形質転換植物体を製造するために用いられるプラスミドベクター、並びに、このプラスミドベクターを製造するのに好適な白色腐朽菌から得られる新規な遺伝子、及びこの遺伝子でコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類には、数多くの化学構造を持つ物質があり、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類や多ハロゲン化ジベンゾフラン類を始めとして、その類縁化合物であるコプラナーＰＣＢ（coplanar polychlorobiphenyls；Co-PCBs）類等が知られている。そして、これらのダイオキシン類は、化学構造的に安定な物質であって環境中で分解され難く、また、人体に対して低濃度で強い毒性を有し、広範囲に汚染が広がるのが特徴であり、このために一旦このダイオキシン類で環境が汚染されるとその修復が極めて困難である。
【０００３】
このようなダイオキシン類を分解処理するための方法としては、例えば１，３００℃以上の高温で焼却する燃焼法を始めとして、光分解法、アルカリ処理法、オゾン分解法、超臨界処理法等の物理化学的な方法が実施され、また、検討されている。しかしながら、このような物理化学的な方法は、既に環境中に放出されたダイオキシン類を効果的に分解し処理するための方法としては十分ではなく、最近では、微生物又はそれらが産生する酵素を用いたダイオキシン類の分解処理、すなわちバイオレメディエーションが提案されており、また、植物を用いてダイオキシン類を浄化する、いわゆるファイトレメディエイションについても試みられている。
【０００４】
例えば、特開2001-37,465号公報には、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、カワラタケ（Coriolus versicolor）、ヒイロタケ（Pycnoporus coccineus）、ヒラタケ（Pleurotus octreatus）、ベッコウタケ（Fomitella fraxinea）等のラッカーゼ産生菌の培養物又はその処理物からなるラッカーゼ含有物と、ラッカーゼの酵素反応を促進するラッカーゼ・メディエイターを含有する組成物とを併用し、ダイオキシン類を分解する方法が提案されている。
【０００５】
また、特開2001-232,346号公報には、ダイオキシン類で汚染された土壌又は水に、マグヘマイト、マンガンフェライト等の磁性体微粒子に固定化されたラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の白色腐朽菌由来の塩素化ダイオキシン分解酵素を接触させ、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水中の塩素化ダイオキシン類を分解して無害化する方法が提案されている。
【０００６】
また、特開2001-245,652号公報には、ファネロカエテ（Phanerochaete）属に属する白色腐朽菌のマンガンペルオキシダーゼ産生菌の培養物又はその処理物と、マンガン(II)及びリノール酸等の不飽和脂肪酸とを含む系中で、ダイオキシンを分解することが記載されている。
【０００７】
また、特開2001-252,646号公報には、土壌、焼却灰又は水中浮遊物質に吸着されたダイオキシン類を、有機溶媒の存在下に、白色腐朽菌等の微生物及び／又はラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の酵素と接触させて分解することが記載されている。
【０００８】
また、特開2002-18,480号公報には、ダイオキシン類、ＰＣＢ類、フェノール類、ビスフェノールＡ、フタル酸エステル類及び色素からなる群から選ばれる難分解性物質で汚染された水に、活性炭、炭、軽石、多孔質セラミック等の担体に固定化されたラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の難分解性物質分解酵素及び／又は上記の如き担体を共存させた難分解性物質分解酵素を接触させ、これら難分解性物質で汚染された水を浄化する方法が提案されている。
【０００９】
また、特開2003-231,697号公報には、ダイオキシンを水相にトラッピングすることができる白色腐朽菌セリポリア・エスピー（Ceriporia sp.）由来のダイオキシントラッピング能を有するタンパク質及びその製造方法、並びにダイオキシンのトラッピング方法が提案されている。
【００１０】
更に、特開2001-232,345号公報には、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水を用いてウルシ（Rhus）属、ツバキ（Camellia）属、サクラ（Prunus）属、サンショウモドキ（Schinus）属、カエデ（Acer）属、マツ（Pinus）属、ハコヤナギ（Populus）属、ダイズ（Glycine）属、トマト（Lyopersicon）属等のラッカーゼを生産する植物を栽培することにより、又は、これらラッカーゼを生産する植物を栽培すると同時に塩素化ダイオキシン類分解能を有するトラメテス（Trametes）属、プレウロタス（Pleurotus）属等の白色腐朽菌を生育させることにより、これら汚染土壌や汚染水中の塩素化ダイオキシン類を分解して無害化する方法が開示されている。
【００１１】
更にまた、特開2001-276,803号公報には、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類含有土壌に、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類を吸収又は吸収分解する能力を有し、主な生育期間が異なる少なくとも２種類以上の植物（秋から夏に生育する植物：キャラウェイ等、春から夏に生育する植物：ベラドンナ等）を組み合わせて植栽することにより、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類含有土壌を短期間に効率良く浄化する方法が開示されている。
【特許文献１】特開2001-37,465号公報
【特許文献２】特開2001-232,346号公報
【特許文献３】特開2001-245,652号公報
【特許文献４】特開2001-252,646号公報
【特許文献５】特開2002-18,480号公報
【特許文献６】特開2003-231,697号公報
【特許文献７】特開2001-232,345号公報
【特許文献８】特開2001-276,803号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、白色腐朽菌の利用を主体とするバイオレメディエーションによっては、微生物の生育が周囲の環境（物理的条件や化学的条件）に大きく左右され、また、バイオマス量も比較的小さいため、土壌や水に含まれているダイオキシン類を効率良く生分解して確実に環境修復を行うには必ずしも十分ではない。また、これまでに提案されている植物を用いたファイトレメディエーションについても、植物それ自体が有するダイオキシン類分解能が必ずしも十分であるとはいえない。
【００１３】
そこで、本発明者らは、形質転換によりバイオマス量の大きい植物にダイオキシン類分解能を付与し、このダイオキシン類分解能が付与された植物を用いてダイオキシン類に汚染された土壌や水中のダイオキシン類を効率良く分解して無害化することについて鋭意検討した結果、優れたダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子をアブラナ科植物体に導入することによりバイオマス量の大きなアブラナ科植物体に優れたダイオキシン類分解能を付与し、このダイオキシン類分解能が付与されたアブラナ科植物体によってダイオキシン類汚染土壌・水中のダイオキシン類を効率良く分解し、ダイオキシン類汚染土壌・水の効率の良い環境修復が期待できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
従って、本発明の目的は、アブラナ科植物の形質転換によりダイオキシン類分解能が付与されたバイオマス量の大きい形質転換植物体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、このようにダイオキシン類分解能が付与されたアブラナ科植物の形質転換植物体を製造する上で必要なプラスミドベクターを提供することにある。
【００１５】
更に、本発明の他の目的は、これまでの白色腐朽菌を用いたバイオレメディエーションによっては容易には生分解できないコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）、特にテトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等についても効率良く生分解することができる特定の白色腐朽菌由来の新規なタンパク質、すなわちラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼをそれぞれコードする遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体である。
【００１７】
また、本発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入させるために用いられるプラスミドベクターである。
【００１８】
更に、本発明は、配列番号１〜６でそれぞれ表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子であり、また、これら配列番号１〜６の遺伝子でそれぞれコードされる６種のタンパク質である。
【００１９】
ここで、本発明において、ダイオキシン類とは、ジベンゾ-p-ジオキシン、ジベンゾフラン及びビフェニルが有する２つのベンゼン環において、複数の水素原子が塩素原子や臭素原子等のハロゲン原子で置換された多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類、多ハロゲン化ジベンゾフラン類及びコプラナーＰＣＢ類の総称であり、そのうち、１分子中に４個以上のハロゲン原子が核置換した多ハロゲン化体が特に人体に対して毒性が強いとされている。
【００２０】
具体的には、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾ-p-ジオキシン等の化合物を挙げることができ、また、多ハロゲン化ジベンゾフラン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、2,3,4,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8,9-ヘキサクロロジベンゾフラン、2,3,4,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾフラン等の化合物を挙げることができ、更に、コプラナーＰＣＢ類としては、例えば、3,3',4,4'-テトラクロロビフェノール、3,4,4',5-テトラクロロビフェニール、3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェノール、2,3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2,3,3',4,4'-ペンタクロロビフェニール、2,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2',3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、3,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェノール、2,3,3',4,4',5-ヘキサクロロビフェニール、2,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニール、2,3,3',4,4',5,5'-ヘプタクロロビフェノール、2,2',3,3',4,4',5-ヘプタクロロビフェノール等の化合物を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、宿主となる植物体は、例えばダイコン属（Raphanus）、ナズナ属（Capsella）、ワサビ属（Wasabia）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）等のアブラナ科植物体であり、好ましくはシロイヌナズナ属植物体であって、より好ましくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。アブラナ科植物体は一年草であって種子から開花まで１〜１．５ヶ月とその生育が早く、個体が小さくて生育し易いという特長を有し、特にそのうちのシロイヌナズナは染色体数（2n＝10）が少なくてゲノムサイズ（108塩基数）が小さく、更に全塩基配列が既に決定されていて遺伝子解析がやり易いという利点がある。
【００２２】
また、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質としては、これまでに知られている種々の白色腐朽菌が産生する酵素を挙げることができ、具体的には、例えば、ラッカーゼ（Laccase; Lac）、リグニンパーオキシダーゼ（Lignin peroxidase; LiP）、及びマンガンパーオキシダーゼ（Manganese peroxidase; MnP）を挙げることができる。
【００２３】
更に、このようなダイオキシン類分解能を有するタンパク質を産生する白色腐朽菌としては、例えば、トラメテス（Trametes）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、プレウロタス（Pleurotus）属、ファネロキーテ（Phanerochaete）属、ジェルカンデラ（Bjerkandera）属、イルペックス（Irpex）属、マイセリオソラ（Myceliophthora）属、ピクノポラス（Pycnoporus）属、ボツリティス（Botrytis）属、コリオラス（Coriolus）属、グリフォラ（Grifola）属、ステレウム（Stereum）属等に属する菌を例示することができる。
【００２４】
そして、本発明において特に好ましいのは、これまでの白色腐朽菌を用いたバイオレメディエーションによっては容易には生分解できないコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）、特にテトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等についても効率良く生分解することができる特定の白色腐朽菌由来の新規なラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼをそれぞれコードする遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００２５】
具体的には、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIIIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIVをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有してリグニンパーオキシダーゼをコードする白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子、及び、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有してマンガンパーオキシダーゼをコードする白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子であり、これらラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼは、それぞれそのライブラリ配列と９５%以上の相同性を有するが、数％の差異が見られ、新規な酵素活性を有するタンパク質である。
【００２６】
本発明においては、このようなダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を用い、宿主となる上記のアブラナ科植物体にこの遺伝子を導入するための植物形質転換用ベクターを作製し、次いで得られた植物形質転換用ベクターを用いて宿主のアブラナ科植物体に上記の遺伝子を導入し、形質転換されたアブラナ科植物体を得る。
【００２７】
ここで、プラスミドベクターの作製については、特に制限されるものではないが、例えば、特定の相同組換え認識配列（attＢ）を有する目的遺伝子を含んだＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attＰ）を含んだ導入ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（ＢＰ反応）により特定の相同組換え認識配列（attＬ）を有する目的遺伝子を含んだ導入クローンを作製し、この導入クローンと同じく認識配列（attＲ）を含み、かつ、植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（ＬＲ反応）により目的遺伝子を含んだ発現クローンを作製し、これを植物形質転換用のプラスミドベクターとして用いる方法や、制限酵素切断サイト遺伝子導入法等の方法を採用することができる。また、得られたプラスミドベクターを用いたアブラナ科植物体の形質転換法についても、特に制限されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたアグロインフェクション法、ショットガン法等により行うことができる。
【００２８】
本発明のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体については、この形質転換植物体を育成してその種子を採取し、この採取した種子をダイオキシン類汚染土壌に播種して栽培したり、この形質転換植物体を栽培する際にダイオキシン類汚染水を供給したり、水耕栽培システムを用いて栽培する際にダイオキシン類汚染水を循環水として供給する等の方法により、これらダイオキシン類汚染土壌やダイオキシン類汚染水中のダイオキシン類を効率良く分解して処理することができ、ダイオキシン類汚染環境の効率的な修復が期待される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、アブラナ科植物の形質転換によりダイオキシン類分解能を付与されたバイオマス量の大きい形質転換植物体を取得することができる。また、このような形質転換植物体を製造する上で必要なプラスミドベクターを得ることができる。更に、テトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等の特に難分解性のダイオキシン類を生分解することができる新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、実施例及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態を具体的に説明する。
【００３１】
１：白色腐朽菌の培養と酸化酵素活性の確認
1-1：白色腐朽菌の培養
白色腐朽菌は、カナダのAlberta大学のUAMH(University of Alberta Microfungus Collection & Herbarium)から購入したPhanerochaete chrysosporium UAMH 3641及びTrametes versicolor UAMH 8272を使用した。
【００３２】
白色腐朽菌の培養にはポリペプトン培地（1% グルコース、1%ポリペプトン、0.15%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム七水和物、2.0mg/Lチアミン塩酸、16mg/L硫酸銅五水和物、pH 5.6）を用いた。培地を滅菌済みの３００mlビーカーに１００mlずつ分注し、予めホモジナイザーで粉砕した白色腐朽菌P. chrysosporium及びT. versicolorを植菌した。P. chrysosporiumについては３７℃で、また、T. versicolorについては２６℃でそれぞれ１週間、１００rpmで振とう培養した。この間、毎日数分間の酸素によるエアレーションを行った。
【００３３】
1-2：ラッカーゼの調製
上記1-1の培養方法に従って培養後、菌体を取り除き、培養液を回収した。得られた培養液をロータリーエバポレーターで全量の３分の１程度まで濃縮し、培養液に対して65%硫酸アンモニウムを加え１８時間撹拌した。その後、冷却遠心機により遠心分離し、得られた沈殿を0.2M コハク酸溶液（pH5.6）に溶解させ、外液を0.02M コハク酸溶液（pH5.6）として１日間透析を行った。次に、酵素液を冷却遠心機にて遠心分離し、上澄みをDEAEセファロースカラム（Amersham Biosciences 社製Hiprep 16/10 QFF）に吸着させ、１mol/L ＮａＣｌ溶液を用いて、酵素を溶出させた。DEAEセファロースカラムで分画した画分のラッカーゼ活性測定を2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)（ABTS）を基質に用いて４２０nmの波長での吸光度を測定することにより行った。酵素活性単位は吸光度０．１を与えるのに必要な酵素量を１ユニットと定義した。その結果、DEAEセファロースカラムに未吸着画分(First fraction)と吸着画分(Second fraction)の２つのラッカーゼ画分が得られた。
【００３４】
1-3：ラッカーゼによるコプラナーＰＣＢの分解
ラッカーゼの未吸着画分(First fraction)と吸着画分(Second fraction)のそれぞれ１０，０００ユニットと５０，０００ユニットを用いてコプラナーＰＣＢの分解性試験を共栓付試験管内で行った。共栓付試験管に0.2Mコハク酸溶液（pH4.5）２５０μl、ジメチルスホキシド（DMSO）で溶解した５０ng/mlのCo-PCBs及び2,3,7,8-TCDDをそれぞれ５０μl（各2.5ng添加）、ラッカーゼのFirst fractionあるいはSecond fractionを加え全量が１．５mlになるように蒸留水を加え３７℃で４日間反応させた。また、コントロールとしてラッカーゼ画分を９８℃で２０分加熱し、酵素活性を失活させたものを用いた。
【００３５】
反応後、内部標準物質溶液５０μlと終濃度１mol/Lとなるように水酸化カリウムのエタノール溶液を加え約１００rpmで１晩振盪させ、アルカリ処理を行った。アルカリ処理液を１００mlの分液漏斗に移し、１．８mol/Lの硫酸を１ml加え酸性条件下で２５mlのヘキサンを用いて１５分間抽出を行った。３回分のヘキサン抽出液（25ml×3回）を分液漏斗に移し、ヘキサン洗浄水５０mlを加え軽く振盪させた。次に、この水層を捨てて18mol/L 硫酸を２０ml加え、穏やかに振盪させた。硫酸に着色が見られなくなるまでこれを繰り返し、着色が見られなくなったら硫酸層を捨て、ヘキサン洗浄水５０mlを加え、水洗を３回行った後、無水硫酸ナトリウムを用いて脱水した。脱水したヘキサン抽出液をクデルナ-ダニッシュ（KD）濃縮器で約８０μlまで濃縮した。この濃縮液をガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）用のサンプルとした。
【００３６】
ガスクロマトグラフィーについては、注入法としてスプリットレス注入法を採用し、注入口温度２５０℃、オーブン初期温度８０℃とし、８０℃２分保持、３０℃/minで２３０℃５分保持、２℃/minで２４０℃５分保持、５℃/minで２８０℃９分保持という昇温条件で行った。ガスクロマトグラフはHEWLETT PACKARD社のHP 6890 Series GC System、カラムはJ＆W製HP-5MS(60m×0.36mm×0.25μm)を用いた。質量分析については、質量分析計は日本電子株式会社のMStation JMS-700を用い、13ＣでマスラベルされたコプラナーＰＣＢを内部標準物質とし、イオン化法をＥＩ（電子イオン化法）、イオン化電圧を４５eV、イオン化電流を６００μA、イオン源温度を２８０℃、質量分解能を１０，０００とし、選択イオン検出法（SIM）によるロックマス法により定量を行った。ＳＩＭモニター質量は、それぞれ2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン(TCDD)は３２１．８９３６、テトラクロロビフェニール(TeCB)は２９１．９１９４、ペンタクロロビフェニール(PeCB)は３２５．８８０４、ヘキサクロロビフェニール(HxCB)は３５９．８４１５、ヘプタクロロビフェニール(HpCB)は３９３．８０２５とした。
【００３７】
その結果、下記の表１に示したように、ラッカーゼのFirst fractionとSecond fraction共にコプラナーＰＣＢ及びＴＣＤＤの分解性が確認された。これは試験管内でラッカーゼによるコプラナーＰＣＢ及びＴＣＤＤの分解性が示された最初のデータである。また分解活性はFirst fractionの方がSecond fractionに比べ全体的に高く、コプラナーＰＣＢ間の分解性の違いに差が見られた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
２：Gateway PCRクローニングシステムによるラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ 、及びマンガンパーオキシダーゼの完全長cＤＮＡのクローニング
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムはバクテリオファージラムダの部位特異的組換えシステムに基づいたクローニング法である。Gateway法はＢＰ反応とＬＲ反応のふたつの組換え反応から成り立っている。ＢＰ反応は、attＢ配列を有するＤＮＡ断片とattＰ配列を有する導入ベクターの間の組換え反応で、導入クローンを作製する反応である。一方、ＬＲ反応は、attＬ配列を有する導入クローンとattＲ配列を有する発現ベクターの間の組換え反応で、目的遺伝子を挿入した発現クローンを作製する反応である。また、ＢＰ反応とＬＲ反応で生じる副産物のプラスミドに、通常の大腸菌の生育を阻害するccdＢ遺伝子が組み込まれているため、目的の組換えクローンを９５%以上の効率で回収することができる。
【００４０】
2-1：Gateway法対応の完全長cＤＮＡのクローニング用プライマーの調製
Phanerochaete chrysosporiumの産生するリグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ及びTrametes versicolorの産生するラッカーゼのそれぞれの完全長cＤＮＡの検索を、NCBI-BLAST(National Center for Biotechnology Information)( HYPERLINK "http://www" http://www. ncbi.- nlm.nih.gov/blast/)のＤＮＡライブラリーを用いて行った。その結果、ラッカーゼについては塩基配列及びアミノ酸配列の相同性から４つのグループ（ラッカーゼI〜IV）に分けられることが判った。そこでそれぞれのグループの完全長cＤＮＡのクローニングをGateway法を用いて行う目的で下記の表２に示したようにそれぞれ開始コドンを含むForwardと停止コドンを含むReverseのプライマーにそれぞれattＢ1配列とattＢ2配列をリンカーとして結合したものを調製した。リグニンパーオキシダーゼとマンガンパーオキシダーゼについてはＤＮＡライブラリー中のそれぞれNCBI Accession numberのY00262とL29039の塩基配列からラッカーゼと同様にGateway法対応のプライマーを調製した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
2-2：白色腐朽菌から総ＲＮＡの抽出
白色腐朽菌からのＲＮＡ抽出は、ＲＮＡ分解酵素（RNase）の影響を抑えるため、強力なタンパク質変性剤であるグアニジンチオシアン酸塩を用いて行った。培養したP. chrysosporium及びT. versicolorを培地から取り出し、液体窒素で瞬間凍結させ、電子天秤にて秤量して、乳鉢で十分にホモジナイズした。菌体１gに対し、抽出バッファー６ml（4.2Mグアニジンチオシアン酸塩、0.5%Nラウロイルサルコシン、25mMクエン酸ナトリウム、0.1%アンチフォームA)、及び、β-メルカプトエタノールを１０μl加えて撹拌後、１，６００rpm、４℃で遠心分離を行った。ここで得られた上清をフェノール／クロロホルム処理し、イソプロパノール沈澱を行った。さらに、１０mol/L塩化リチウムでＲＮＡ沈澱を行い、沈殿物を滅菌蒸留水に溶解した。さらにDNase Iを用いてＤＮＡ除去を行い、ＲＮＡ溶液を１μg/μlに調製した。
【００４３】
2-3：cＤＮＡの調製
逆転写酵素反応キットであるTaKaRa 社製のRNA PCR Kit(AMV) Ver2.1を用いて逆転写反応によりcＤＮＡの調製を行った。氷上に２００μlチューブを置きmＲＮＡを０．１μg加えRNase不活化処理を施した滅菌水で９．５μlとした。ＰＣＲ装置（PERKIN ELMER 社製のGeneAmp PCR System 2400）に２００μlチューブをセットし、７０℃で１０分間インキュベートし、氷上で１０分間急冷した。更に、25mM塩化マグネシウム４μl、10×RNA PCR 緩衝液２μl、10mM dNTP混合液２μl、オリゴdTプライマー１μl、DNaseインヒビター０．５μl、逆転写酵素１μlを加え、再度２００μlチューブをGeneAmp PCR System 2400にセットし、３０℃で１０分間、５０℃で３０分間、９５℃で２分間、５℃で２分間の反応を行った。
【００４４】
2-4：ＰＣＲ
氷上で２００μlチューブに10×Ex Taq緩衝液 (TaKaRa)２．５μl、2.5mM dNTP混合液２μl、上記2-1で述べた50μM Gateway法対応attＢ1 Forwardプライマー１μl、50μM attＢ2 Reverseプライマー１μl、脱塩を行ったcＤＮＡ溶液２μlを加えて滅菌蒸留水で全量を２４．５μlに調製した。ＰＣＲ装置（GeneAmp PCR System 2400）に２００μlチューブをセットし、反応条件は、９８℃で３分間保持し、保持時間内にＤＮＡポリメラーゼであるEx Taq (TaKaRa)０．５μlを加え、９８℃で１０秒間の熱変性、６０℃で１０秒間のアニーリング反応、７２℃で９０秒間の伸長反応を１サイクルとして、このサイクルを５サイクル行った。引き続き、９８℃で１０秒間、７２℃で９０秒間の反応を１サイクルとしてこのサイクルを３０サイクル行った。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。この後QIAGEN 社製のQIAquick PCR Prification Kitを用いてＰＣＲ産物の精製を行い、分光光度計で濃度計測した。
【００４５】
2-5：ＢＰ反応
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムのマニュアルに従ってBP反応を行った。すなわち、上記2-4のＰＣＲにより得られた特定の相同組換え認識配列（attB）を有する各酵素の完全長cＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attP）を含んだ導入ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（BP反応）で図１に示したような各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンが得られる。
【００４６】
2-6：ＬＲ反応
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムのマニュアルに従ってＬＲ反応を行った。すなわち、上記2-5のＢＰ反応で得られた特定の相同組換え認識配列（attＬ配列）を有する各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンと、同じく認識配列（attＲ配列）を含みなおかつ植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（LR反応）で図２に示したような各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ発現クローンが得られ、これを以後のシロイヌナズナへの遺伝子導入用Tiプラスミドベクターに用いた。今回発現ベクターとしては除草剤耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質遺伝子をマーカー遺伝子として有するpB7WG2Dベクターを用いた。
【００４７】
2-7：発現クローンに導入された各酵素の完全長cＤＮＡの塩基配列決定
蛍光ラベルされた基質を用いるダイターミネーター法を用いた。また、ＤＮＡシークエンサーとしては島津製作所社製DSQ1000Lを用いた。反応に使用する４種類の基質液は、50μM dATP、50μM 7-デアザ-dGTP、50μM dCTP、50μM dTTP、及び1μMフルオレセイン-12-ddATPとなるようにdd/dATP液を調製した。ddATPの代わりに1μMフルオレセイン-12-ddGTP、又は1μMフルオレセイン-12-ddCTPを加えた溶液を、それぞれdd/dGTP及び、dd/dCTP液とした。また、25μM dATP、25μM 7-デアザ-dGTP、25μM dCTP、25μM dTTP、及び1μMフルオレセイン-12-ddUTPとなるようにdd/dUTP液を調製した。鋳型となるプラスミドは１０．０pmol使用し、エタノール沈澱後、8pmol pUC/M13ユニバーサルプライマー、8Uサーモシークナーゼ (Amersham)、サーモシークナーゼ反応緩衝液２μl及び滅菌蒸留水を加えて全量を３２μlとした。この溶液をdd/dATP液、dd/dGTP液、dd/dCTP液を４μlずつ分注してあるチューブに６μlずつ分注し、dd/dUTP液を４μl加えたチューブには１２μl分注した。反応条件は、前処理として９８℃で２分間熱処理を行った後、熱変性を９８℃で３０秒間、アニーリング反応を５０℃で３０秒間、伸長反応を７２℃で１分間を１サイクルとして３５サイクル繰り返した。各チューブのサンプルをエタノール沈澱し、ＴＥ緩衝液３μlに溶解した。反応停止溶液２μlを加えて９８℃で３分間の熱変性を行い、4%変性ポリアクリルアミド電気泳動を２，１００Vで２０時間行った。
【００４８】
2-8：ＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列の相同性検索
シークエンス結果から、各酵素の完全長cＤＮＡに当たる部分を抽出し、NCBI-BLASTのＤＮＡライブラリーに登録してあるラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼのそれぞれの完全長cＤＮＡとの相同性をGENETYX Mac Version 8.0(SOFTWARE DEVELOPMENT)により検討した。また、これらの完全長cＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に変換したものと、ライブラリ上の塩基配列を同じくアミノ酸に変換したものとの相同性も比較検討した。その結果、表３に示したように今回クローニングできたそれぞれの酵素の完全長cＤＮＡはそれぞれＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列において高い相同性を示すものがライブラリー中に見いだされるものの、完全に一致したものは存在せず、よって今回クローニングできた全ての酵素遺伝子は新規なものであることが判明した。
【００４９】
【表３】
【００５０】
３：酵素遺伝子の発現
3-1：大腸菌ＢＬ２１の形質転換
発現クローンによる各酵素遺伝子の発現を大腸菌レベルで確認するため、Invitrogen社製のコンピテントセルBL21 Starを使用した。コンピテントセル１０μlに、発現クローンプラスミド１μlを加えて３０分間氷上に放置し、４２℃で３０秒間熱処理を行った後、２分間氷上で放置した。９０μlのＳＯＣ培地（2%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.05%塩化ナトリウム、0.02M塩化マグネシウム、0.02Mグルコース）を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有のＬＢ寒天培地に、形質転換した菌液をコンラージ棒を用いてプレート全体に均一に塗沫し、３７℃で一晩インキュベートした。アンピシリン耐性の形質転換コロニーを爪楊枝で釣菌し、終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有ＬＢ液体培地、５mlに殖菌した後、３７℃で一晩振とう培養した。この培養菌体から、QIAprep spin Miniprep kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出して制限酵素で切断して目的とするcＤＮＡ断片が挿入されているか確認した。
【００５１】
3-2：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
形質転換したＢＬ２１を終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有のＬＢ液体培地中で３７℃、１６時間培養し、分光光度計（波長660nm）で吸光度を０．１に揃えた。その後、約２時間培養し、吸光度が大腸菌の対数増殖期を示す０．３〜０．４になったのを確認し、ＩＰＴＧ（イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトシド）を終濃度０．５mmol/Lになるよう加えた。その後、更に３時間培養し、吸光度が増加したのを確認した。この菌液を１．５mlチューブに１ml分取し、５，０００rpmで５分間遠心した後上澄みを除去した。沈殿物を−８０℃で１０分間凍結し、４２℃のウォーターバスで３分間溶解した。この操作を更に２度繰り返した。ここにNuPAGE LDS 試料緩衝液（Invitrogen）を２５μl、NuPAGE 試料還元剤を１０μl加え、滅菌水で１００μlとしたものを、９８℃で５分間処理しサンプルとした。このサンプルを10%アクリルアミドゲルで２００V、４０分間電気泳動した。ゲルを固定液（20%メタノール、7.5%酢酸）中に浸し３０分間振とうした。その後、ＣＢＢ（クマーシーブリリアントブルー R-250）溶液（50%メタノール、5%酢酸、0.25%CBB）による染色を３０分間行った。その後、脱色液（25%メタノール、7%酢酸）による脱色をバックグラウンドの色素が消えるまで繰り返した。脱色の完了したゲルを、ゲルドライヤーで乾燥し保存した。その結果、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼについて、導入クローンとタンパク質発現ベクターpDEST15をＬＲ反応させて得た発現クローンで大腸菌BL21 Starを形質転換し、この形質転換体が産生するタンパク質の電気泳動を10%アクリルアミドゲルを用いて行ったところ、それぞれの酵素の分子量と一致する部分にバンドが認められ、大腸菌BL21 Star中でそれぞれラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼの酵素タンパク質が生合成されていることが証明された。
【００５２】
４：シロイヌナズナの形質転換法
上記2-6で示したpB7WG2D発現ベクターと各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンとのＬＲ反応により得られた６種の遺伝子導入用Tiプラスミドベクター（pB7WG2D発現クローン）のうち、ラッカーゼIV遺伝子を導入したTiプラスミドベクターを用い、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）によるアグロインフェクション法によりシロイヌナズナの形質転換を行った。
【００５３】
4-1：Tiプラスミドベクターのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムへの遺伝子導入は、エレクトロポレーション法を用いて次のように行った。先ず、Invitrogen社製のアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株４０μlにTiプラスミドベクター溶液（0.1μg/μl）１μlを混ぜ合わせ、あらかじめ氷上に放置しておいたセルに移した。セルを遺伝子導入装置であるBioRed社製ジーンパルサーにセットし、電圧２．５kV、抵抗力２００Ω、及び、キャパシタンス１２５μFの条件でプラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株に導入した。その後セルにＹＭ培地１mlを加えてピペッティングを行い、３０℃で３時間インキュベーションし、カナマイシンを含むＹＥＰ培地のプレートに植菌した後、３０℃で２日間培養した。生じたカナマイシン耐性コロニーからプラスミドを精製し、アグロバクテリウムへのTiプラスミドベクター導入の確認を行った。
【００５４】
4-2：減圧浸潤法によるシロイヌナズナへの遺伝子導入
アグロバクテリウムを５mlのＹＥＰ培地により３０℃で対数増殖期まで前培養を行った。感染を行う前日にカナマイシンを含むＹＥＰ培地１２５mlに前培養した菌液１mlを加え、さらに増菌させた。そのアグロバクテリウム懸濁液を遠心用チューブに分け、６，０００rpm、１５min、室温の条件下で遠心をおこなった後、上澄みを捨て、駒込ピペットを使って浸透用ＭＳ培地に沈殿をＯＤ＝０．８になるように菌を再懸濁させた。感染に用いたシロイヌナズナは、植物栽培用ポッドに４〜６個体播種し、２６℃、長日条件（16時間明、8時間暗）で育て、摘心をしながら約６週間後に茎の高さが十数センチになった株を感染に用いた。感染前日に、シロイヌナズナで開花しているもの、結実しているものははさみ等で取り除いた。そのシロイヌナズナを逆さにしてアグロバクテリウム懸濁液に浸けた。シロイヌナズナを懸濁液に浸けたままデシケーターに入れ、減圧を行った。デシケーター内の圧力を約４００mmHgに調節し、１０分間その状態で減圧を行った。その後デシケーター内から植物を取り出し、水を切り、ペーパータオルで植物から懸濁液を吸い取った。次にその植物をバットに横倒しにして置き、バットの底に少量の水を滴下して、ラップなどの透明な覆いをかぶせた状態で一晩放置した。翌日ラップを外し、植物を立て、減圧浸潤から２日後にかん水を再開した。その後植物が完全に枯れたらＴ1種子を採取した。
【００５５】
4-3 形質転換シロイヌナズナの選抜
種子を採種し０．６７５μmol/Lの除草剤グルホシネート（商品名：バスタ(BASTA)）中で生育してくる個体を形質転換体として選抜した。その結果、ラッカーゼIV遺伝子を導入したTiプラスミドベクターを有するアグロバクテリウムの感染系でグルホシネート耐性形質転換体が約３，０００粒の種子から１個体取得できた。Tiプラスミドベクター中にはマーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質遺伝子が導入されていることから、この遺伝子の発現をシロイヌナズナ野生株と形質転換シロイヌナズナで実体顕微鏡下で比較観察したところ、形質転換シロイヌナズナのみに強い緑色蛍光の発色が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によって得られた形質転換植物体は、白色腐朽菌が有するダイオキシン類分解能に優れたタンパク質を産生するという特性と、植物体が有するバイオマス量が大きいという特性とを兼ね備えており、ダイオキシン類汚染土壌やダイオキシン類汚染水中のダイオキシン類を効率良く分解して無害化するダイオキシン類汚染環境の効率的な修復が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、プラスミドベクターの作製で用いたＢＰ反応を説明するための説明図である。
【図２】図２は、プラスミドベクターの作製で用いたＬＲ反応を説明するための説明図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換植物体、及びこの形質転換植物体を製造するために用いられるプラスミドベクター、並びに、このプラスミドベクターを製造するのに好適な白色腐朽菌から得られる新規な遺伝子、及びこの遺伝子でコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類には、数多くの化学構造を持つ物質があり、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類や多ハロゲン化ジベンゾフラン類を始めとして、その類縁化合物であるコプラナーＰＣＢ（coplanar polychlorobiphenyls；Co-PCBs）類等が知られている。そして、これらのダイオキシン類は、化学構造的に安定な物質であって環境中で分解され難く、また、人体に対して低濃度で強い毒性を有し、広範囲に汚染が広がるのが特徴であり、このために一旦このダイオキシン類で環境が汚染されるとその修復が極めて困難である。
【０００３】
このようなダイオキシン類を分解処理するための方法としては、例えば１，３００℃以上の高温で焼却する燃焼法を始めとして、光分解法、アルカリ処理法、オゾン分解法、超臨界処理法等の物理化学的な方法が実施され、また、検討されている。しかしながら、このような物理化学的な方法は、既に環境中に放出されたダイオキシン類を効果的に分解し処理するための方法としては十分ではなく、最近では、微生物又はそれらが産生する酵素を用いたダイオキシン類の分解処理、すなわちバイオレメディエーションが提案されており、また、植物を用いてダイオキシン類を浄化する、いわゆるファイトレメディエイションについても試みられている。
【０００４】
例えば、特開2001-37,465号公報には、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、カワラタケ（Coriolus versicolor）、ヒイロタケ（Pycnoporus coccineus）、ヒラタケ（Pleurotus octreatus）、ベッコウタケ（Fomitella fraxinea）等のラッカーゼ産生菌の培養物又はその処理物からなるラッカーゼ含有物と、ラッカーゼの酵素反応を促進するラッカーゼ・メディエイターを含有する組成物とを併用し、ダイオキシン類を分解する方法が提案されている。
【０００５】
また、特開2001-232,346号公報には、ダイオキシン類で汚染された土壌又は水に、マグヘマイト、マンガンフェライト等の磁性体微粒子に固定化されたラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の白色腐朽菌由来の塩素化ダイオキシン分解酵素を接触させ、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水中の塩素化ダイオキシン類を分解して無害化する方法が提案されている。
【０００６】
また、特開2001-245,652号公報には、ファネロカエテ（Phanerochaete）属に属する白色腐朽菌のマンガンペルオキシダーゼ産生菌の培養物又はその処理物と、マンガン(II)及びリノール酸等の不飽和脂肪酸とを含む系中で、ダイオキシンを分解することが記載されている。
【０００７】
また、特開2001-252,646号公報には、土壌、焼却灰又は水中浮遊物質に吸着されたダイオキシン類を、有機溶媒の存在下に、白色腐朽菌等の微生物及び／又はラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の酵素と接触させて分解することが記載されている。
【０００８】
また、特開2002-18,480号公報には、ダイオキシン類、ＰＣＢ類、フェノール類、ビスフェノールＡ、フタル酸エステル類及び色素からなる群から選ばれる難分解性物質で汚染された水に、活性炭、炭、軽石、多孔質セラミック等の担体に固定化されたラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ等の難分解性物質分解酵素及び／又は上記の如き担体を共存させた難分解性物質分解酵素を接触させ、これら難分解性物質で汚染された水を浄化する方法が提案されている。
【０００９】
また、特開2003-231,697号公報には、ダイオキシンを水相にトラッピングすることができる白色腐朽菌セリポリア・エスピー（Ceriporia sp.）由来のダイオキシントラッピング能を有するタンパク質及びその製造方法、並びにダイオキシンのトラッピング方法が提案されている。
【００１０】
更に、特開2001-232,345号公報には、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水を用いてウルシ（Rhus）属、ツバキ（Camellia）属、サクラ（Prunus）属、サンショウモドキ（Schinus）属、カエデ（Acer）属、マツ（Pinus）属、ハコヤナギ（Populus）属、ダイズ（Glycine）属、トマト（Lyopersicon）属等のラッカーゼを生産する植物を栽培することにより、又は、これらラッカーゼを生産する植物を栽培すると同時に塩素化ダイオキシン類分解能を有するトラメテス（Trametes）属、プレウロタス（Pleurotus）属等の白色腐朽菌を生育させることにより、これら汚染土壌や汚染水中の塩素化ダイオキシン類を分解して無害化する方法が開示されている。
【００１１】
更にまた、特開2001-276,803号公報には、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類含有土壌に、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類を吸収又は吸収分解する能力を有し、主な生育期間が異なる少なくとも２種類以上の植物（秋から夏に生育する植物：キャラウェイ等、春から夏に生育する植物：ベラドンナ等）を組み合わせて植栽することにより、ポリ塩化ビフェニル類及び／又はダイオキシン類含有土壌を短期間に効率良く浄化する方法が開示されている。
【特許文献１】特開2001-37,465号公報
【特許文献２】特開2001-232,346号公報
【特許文献３】特開2001-245,652号公報
【特許文献４】特開2001-252,646号公報
【特許文献５】特開2002-18,480号公報
【特許文献６】特開2003-231,697号公報
【特許文献７】特開2001-232,345号公報
【特許文献８】特開2001-276,803号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、白色腐朽菌の利用を主体とするバイオレメディエーションによっては、微生物の生育が周囲の環境（物理的条件や化学的条件）に大きく左右され、また、バイオマス量も比較的小さいため、土壌や水に含まれているダイオキシン類を効率良く生分解して確実に環境修復を行うには必ずしも十分ではない。また、これまでに提案されている植物を用いたファイトレメディエーションについても、植物それ自体が有するダイオキシン類分解能が必ずしも十分であるとはいえない。
【００１３】
そこで、本発明者らは、形質転換によりバイオマス量の大きい植物にダイオキシン類分解能を付与し、このダイオキシン類分解能が付与された植物を用いてダイオキシン類に汚染された土壌や水中のダイオキシン類を効率良く分解して無害化することについて鋭意検討した結果、優れたダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子をアブラナ科植物体に導入することによりバイオマス量の大きなアブラナ科植物体に優れたダイオキシン類分解能を付与し、このダイオキシン類分解能が付与されたアブラナ科植物体によってダイオキシン類汚染土壌・水中のダイオキシン類を効率良く分解し、ダイオキシン類汚染土壌・水の効率の良い環境修復が期待できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
従って、本発明の目的は、アブラナ科植物の形質転換によりダイオキシン類分解能が付与されたバイオマス量の大きい形質転換植物体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、このようにダイオキシン類分解能が付与されたアブラナ科植物の形質転換植物体を製造する上で必要なプラスミドベクターを提供することにある。
【００１５】
更に、本発明の他の目的は、これまでの白色腐朽菌を用いたバイオレメディエーションによっては容易には生分解できないコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）、特にテトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等についても効率良く生分解することができる特定の白色腐朽菌由来の新規なタンパク質、すなわちラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼをそれぞれコードする遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体である。
【００１７】
また、本発明は、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入させるために用いられるプラスミドベクターである。
【００１８】
更に、本発明は、配列番号１〜６でそれぞれ表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子であり、また、これら配列番号１〜６の遺伝子でそれぞれコードされる６種のタンパク質である。
【００１９】
ここで、本発明において、ダイオキシン類とは、ジベンゾ-p-ジオキシン、ジベンゾフラン及びビフェニルが有する２つのベンゼン環において、複数の水素原子が塩素原子や臭素原子等のハロゲン原子で置換された多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類、多ハロゲン化ジベンゾフラン類及びコプラナーＰＣＢ類の総称であり、そのうち、１分子中に４個以上のハロゲン原子が核置換した多ハロゲン化体が特に人体に対して毒性が強いとされている。
【００２０】
具体的には、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾ-p-ジオキシン等の化合物を挙げることができ、また、多ハロゲン化ジベンゾフラン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、2,3,4,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8,9-ヘキサクロロジベンゾフラン、2,3,4,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾフラン等の化合物を挙げることができ、更に、コプラナーＰＣＢ類としては、例えば、3,3',4,4'-テトラクロロビフェノール、3,4,4',5-テトラクロロビフェニール、3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェノール、2,3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2,3,3',4,4'-ペンタクロロビフェニール、2,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2',3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、3,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェノール、2,3,3',4,4',5-ヘキサクロロビフェニール、2,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニール、2,3,3',4,4',5,5'-ヘプタクロロビフェノール、2,2',3,3',4,4',5-ヘプタクロロビフェノール等の化合物を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、宿主となる植物体は、例えばダイコン属（Raphanus）、ナズナ属（Capsella）、ワサビ属（Wasabia）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）等のアブラナ科植物体であり、好ましくはシロイヌナズナ属植物体であって、より好ましくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。アブラナ科植物体は一年草であって種子から開花まで１〜１．５ヶ月とその生育が早く、個体が小さくて生育し易いという特長を有し、特にそのうちのシロイヌナズナは染色体数（2n＝10）が少なくてゲノムサイズ（108塩基数）が小さく、更に全塩基配列が既に決定されていて遺伝子解析がやり易いという利点がある。
【００２２】
また、ダイオキシン類分解能を有するタンパク質としては、これまでに知られている種々の白色腐朽菌が産生する酵素を挙げることができ、具体的には、例えば、ラッカーゼ（Laccase; Lac）、リグニンパーオキシダーゼ（Lignin peroxidase; LiP）、及びマンガンパーオキシダーゼ（Manganese peroxidase; MnP）を挙げることができる。
【００２３】
更に、このようなダイオキシン類分解能を有するタンパク質を産生する白色腐朽菌としては、例えば、トラメテス（Trametes）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、プレウロタス（Pleurotus）属、ファネロキーテ（Phanerochaete）属、ジェルカンデラ（Bjerkandera）属、イルペックス（Irpex）属、マイセリオソラ（Myceliophthora）属、ピクノポラス（Pycnoporus）属、ボツリティス（Botrytis）属、コリオラス（Coriolus）属、グリフォラ（Grifola）属、ステレウム（Stereum）属等に属する菌を例示することができる。
【００２４】
そして、本発明において特に好ましいのは、これまでの白色腐朽菌を用いたバイオレメディエーションによっては容易には生分解できないコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）、特にテトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等についても効率良く生分解することができる特定の白色腐朽菌由来の新規なラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼをそれぞれコードする遺伝子及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００２５】
具体的には、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIIIをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有してラッカーゼIVをコードする白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有してリグニンパーオキシダーゼをコードする白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子、及び、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有してマンガンパーオキシダーゼをコードする白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子であり、これらラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼは、それぞれそのライブラリ配列と９５%以上の相同性を有するが、数％の差異が見られ、新規な酵素活性を有するタンパク質である。
【００２６】
本発明においては、このようなダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を用い、宿主となる上記のアブラナ科植物体にこの遺伝子を導入するための植物形質転換用ベクターを作製し、次いで得られた植物形質転換用ベクターを用いて宿主のアブラナ科植物体に上記の遺伝子を導入し、形質転換されたアブラナ科植物体を得る。
【００２７】
ここで、プラスミドベクターの作製については、特に制限されるものではないが、例えば、特定の相同組換え認識配列（attＢ）を有する目的遺伝子を含んだＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attＰ）を含んだ導入ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（ＢＰ反応）により特定の相同組換え認識配列（attＬ）を有する目的遺伝子を含んだ導入クローンを作製し、この導入クローンと同じく認識配列（attＲ）を含み、かつ、植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（ＬＲ反応）により目的遺伝子を含んだ発現クローンを作製し、これを植物形質転換用のプラスミドベクターとして用いる方法や、制限酵素切断サイト遺伝子導入法等の方法を採用することができる。また、得られたプラスミドベクターを用いたアブラナ科植物体の形質転換法についても、特に制限されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたアグロインフェクション法、ショットガン法等により行うことができる。
【００２８】
本発明のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体については、この形質転換植物体を育成してその種子を採取し、この採取した種子をダイオキシン類汚染土壌に播種して栽培したり、この形質転換植物体を栽培する際にダイオキシン類汚染水を供給したり、水耕栽培システムを用いて栽培する際にダイオキシン類汚染水を循環水として供給する等の方法により、これらダイオキシン類汚染土壌やダイオキシン類汚染水中のダイオキシン類を効率良く分解して処理することができ、ダイオキシン類汚染環境の効率的な修復が期待される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、アブラナ科植物の形質転換によりダイオキシン類分解能を付与されたバイオマス量の大きい形質転換植物体を取得することができる。また、このような形質転換植物体を製造する上で必要なプラスミドベクターを得ることができる。更に、テトラクロロビフェニール（TeCB）、ペンタクロロビフェニール（PeCB）、ヘキサクロロビフェニール（HxCB）、ヘプタクロロビフェニール（HpCB）等の特に難分解性のダイオキシン類を生分解することができる新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、実施例及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態を具体的に説明する。
【００３１】
１：白色腐朽菌の培養と酸化酵素活性の確認
1-1：白色腐朽菌の培養
白色腐朽菌は、カナダのAlberta大学のUAMH(University of Alberta Microfungus Collection & Herbarium)から購入したPhanerochaete chrysosporium UAMH 3641及びTrametes versicolor UAMH 8272を使用した。
【００３２】
白色腐朽菌の培養にはポリペプトン培地（1% グルコース、1%ポリペプトン、0.15%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム七水和物、2.0mg/Lチアミン塩酸、16mg/L硫酸銅五水和物、pH 5.6）を用いた。培地を滅菌済みの３００mlビーカーに１００mlずつ分注し、予めホモジナイザーで粉砕した白色腐朽菌P. chrysosporium及びT. versicolorを植菌した。P. chrysosporiumについては３７℃で、また、T. versicolorについては２６℃でそれぞれ１週間、１００rpmで振とう培養した。この間、毎日数分間の酸素によるエアレーションを行った。
【００３３】
1-2：ラッカーゼの調製
上記1-1の培養方法に従って培養後、菌体を取り除き、培養液を回収した。得られた培養液をロータリーエバポレーターで全量の３分の１程度まで濃縮し、培養液に対して65%硫酸アンモニウムを加え１８時間撹拌した。その後、冷却遠心機により遠心分離し、得られた沈殿を0.2M コハク酸溶液（pH5.6）に溶解させ、外液を0.02M コハク酸溶液（pH5.6）として１日間透析を行った。次に、酵素液を冷却遠心機にて遠心分離し、上澄みをDEAEセファロースカラム（Amersham Biosciences 社製Hiprep 16/10 QFF）に吸着させ、１mol/L ＮａＣｌ溶液を用いて、酵素を溶出させた。DEAEセファロースカラムで分画した画分のラッカーゼ活性測定を2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)（ABTS）を基質に用いて４２０nmの波長での吸光度を測定することにより行った。酵素活性単位は吸光度０．１を与えるのに必要な酵素量を１ユニットと定義した。その結果、DEAEセファロースカラムに未吸着画分(First fraction)と吸着画分(Second fraction)の２つのラッカーゼ画分が得られた。
【００３４】
1-3：ラッカーゼによるコプラナーＰＣＢの分解
ラッカーゼの未吸着画分(First fraction)と吸着画分(Second fraction)のそれぞれ１０，０００ユニットと５０，０００ユニットを用いてコプラナーＰＣＢの分解性試験を共栓付試験管内で行った。共栓付試験管に0.2Mコハク酸溶液（pH4.5）２５０μl、ジメチルスホキシド（DMSO）で溶解した５０ng/mlのCo-PCBs及び2,3,7,8-TCDDをそれぞれ５０μl（各2.5ng添加）、ラッカーゼのFirst fractionあるいはSecond fractionを加え全量が１．５mlになるように蒸留水を加え３７℃で４日間反応させた。また、コントロールとしてラッカーゼ画分を９８℃で２０分加熱し、酵素活性を失活させたものを用いた。
【００３５】
反応後、内部標準物質溶液５０μlと終濃度１mol/Lとなるように水酸化カリウムのエタノール溶液を加え約１００rpmで１晩振盪させ、アルカリ処理を行った。アルカリ処理液を１００mlの分液漏斗に移し、１．８mol/Lの硫酸を１ml加え酸性条件下で２５mlのヘキサンを用いて１５分間抽出を行った。３回分のヘキサン抽出液（25ml×3回）を分液漏斗に移し、ヘキサン洗浄水５０mlを加え軽く振盪させた。次に、この水層を捨てて18mol/L 硫酸を２０ml加え、穏やかに振盪させた。硫酸に着色が見られなくなるまでこれを繰り返し、着色が見られなくなったら硫酸層を捨て、ヘキサン洗浄水５０mlを加え、水洗を３回行った後、無水硫酸ナトリウムを用いて脱水した。脱水したヘキサン抽出液をクデルナ-ダニッシュ（KD）濃縮器で約８０μlまで濃縮した。この濃縮液をガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）用のサンプルとした。
【００３６】
ガスクロマトグラフィーについては、注入法としてスプリットレス注入法を採用し、注入口温度２５０℃、オーブン初期温度８０℃とし、８０℃２分保持、３０℃/minで２３０℃５分保持、２℃/minで２４０℃５分保持、５℃/minで２８０℃９分保持という昇温条件で行った。ガスクロマトグラフはHEWLETT PACKARD社のHP 6890 Series GC System、カラムはJ＆W製HP-5MS(60m×0.36mm×0.25μm)を用いた。質量分析については、質量分析計は日本電子株式会社のMStation JMS-700を用い、13ＣでマスラベルされたコプラナーＰＣＢを内部標準物質とし、イオン化法をＥＩ（電子イオン化法）、イオン化電圧を４５eV、イオン化電流を６００μA、イオン源温度を２８０℃、質量分解能を１０，０００とし、選択イオン検出法（SIM）によるロックマス法により定量を行った。ＳＩＭモニター質量は、それぞれ2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン(TCDD)は３２１．８９３６、テトラクロロビフェニール(TeCB)は２９１．９１９４、ペンタクロロビフェニール(PeCB)は３２５．８８０４、ヘキサクロロビフェニール(HxCB)は３５９．８４１５、ヘプタクロロビフェニール(HpCB)は３９３．８０２５とした。
【００３７】
その結果、下記の表１に示したように、ラッカーゼのFirst fractionとSecond fraction共にコプラナーＰＣＢ及びＴＣＤＤの分解性が確認された。これは試験管内でラッカーゼによるコプラナーＰＣＢ及びＴＣＤＤの分解性が示された最初のデータである。また分解活性はFirst fractionの方がSecond fractionに比べ全体的に高く、コプラナーＰＣＢ間の分解性の違いに差が見られた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
２：Gateway PCRクローニングシステムによるラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ 、及びマンガンパーオキシダーゼの完全長cＤＮＡのクローニング
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムはバクテリオファージラムダの部位特異的組換えシステムに基づいたクローニング法である。Gateway法はＢＰ反応とＬＲ反応のふたつの組換え反応から成り立っている。ＢＰ反応は、attＢ配列を有するＤＮＡ断片とattＰ配列を有する導入ベクターの間の組換え反応で、導入クローンを作製する反応である。一方、ＬＲ反応は、attＬ配列を有する導入クローンとattＲ配列を有する発現ベクターの間の組換え反応で、目的遺伝子を挿入した発現クローンを作製する反応である。また、ＢＰ反応とＬＲ反応で生じる副産物のプラスミドに、通常の大腸菌の生育を阻害するccdＢ遺伝子が組み込まれているため、目的の組換えクローンを９５%以上の効率で回収することができる。
【００４０】
2-1：Gateway法対応の完全長cＤＮＡのクローニング用プライマーの調製
Phanerochaete chrysosporiumの産生するリグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ及びTrametes versicolorの産生するラッカーゼのそれぞれの完全長cＤＮＡの検索を、NCBI-BLAST(National Center for Biotechnology Information)( HYPERLINK "http://www" http://www. ncbi.- nlm.nih.gov/blast/)のＤＮＡライブラリーを用いて行った。その結果、ラッカーゼについては塩基配列及びアミノ酸配列の相同性から４つのグループ（ラッカーゼI〜IV）に分けられることが判った。そこでそれぞれのグループの完全長cＤＮＡのクローニングをGateway法を用いて行う目的で下記の表２に示したようにそれぞれ開始コドンを含むForwardと停止コドンを含むReverseのプライマーにそれぞれattＢ1配列とattＢ2配列をリンカーとして結合したものを調製した。リグニンパーオキシダーゼとマンガンパーオキシダーゼについてはＤＮＡライブラリー中のそれぞれNCBI Accession numberのY00262とL29039の塩基配列からラッカーゼと同様にGateway法対応のプライマーを調製した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
2-2：白色腐朽菌から総ＲＮＡの抽出
白色腐朽菌からのＲＮＡ抽出は、ＲＮＡ分解酵素（RNase）の影響を抑えるため、強力なタンパク質変性剤であるグアニジンチオシアン酸塩を用いて行った。培養したP. chrysosporium及びT. versicolorを培地から取り出し、液体窒素で瞬間凍結させ、電子天秤にて秤量して、乳鉢で十分にホモジナイズした。菌体１gに対し、抽出バッファー６ml（4.2Mグアニジンチオシアン酸塩、0.5%Nラウロイルサルコシン、25mMクエン酸ナトリウム、0.1%アンチフォームA)、及び、β-メルカプトエタノールを１０μl加えて撹拌後、１，６００rpm、４℃で遠心分離を行った。ここで得られた上清をフェノール／クロロホルム処理し、イソプロパノール沈澱を行った。さらに、１０mol/L塩化リチウムでＲＮＡ沈澱を行い、沈殿物を滅菌蒸留水に溶解した。さらにDNase Iを用いてＤＮＡ除去を行い、ＲＮＡ溶液を１μg/μlに調製した。
【００４３】
2-3：cＤＮＡの調製
逆転写酵素反応キットであるTaKaRa 社製のRNA PCR Kit(AMV) Ver2.1を用いて逆転写反応によりcＤＮＡの調製を行った。氷上に２００μlチューブを置きmＲＮＡを０．１μg加えRNase不活化処理を施した滅菌水で９．５μlとした。ＰＣＲ装置（PERKIN ELMER 社製のGeneAmp PCR System 2400）に２００μlチューブをセットし、７０℃で１０分間インキュベートし、氷上で１０分間急冷した。更に、25mM塩化マグネシウム４μl、10×RNA PCR 緩衝液２μl、10mM dNTP混合液２μl、オリゴdTプライマー１μl、DNaseインヒビター０．５μl、逆転写酵素１μlを加え、再度２００μlチューブをGeneAmp PCR System 2400にセットし、３０℃で１０分間、５０℃で３０分間、９５℃で２分間、５℃で２分間の反応を行った。
【００４４】
2-4：ＰＣＲ
氷上で２００μlチューブに10×Ex Taq緩衝液 (TaKaRa)２．５μl、2.5mM dNTP混合液２μl、上記2-1で述べた50μM Gateway法対応attＢ1 Forwardプライマー１μl、50μM attＢ2 Reverseプライマー１μl、脱塩を行ったcＤＮＡ溶液２μlを加えて滅菌蒸留水で全量を２４．５μlに調製した。ＰＣＲ装置（GeneAmp PCR System 2400）に２００μlチューブをセットし、反応条件は、９８℃で３分間保持し、保持時間内にＤＮＡポリメラーゼであるEx Taq (TaKaRa)０．５μlを加え、９８℃で１０秒間の熱変性、６０℃で１０秒間のアニーリング反応、７２℃で９０秒間の伸長反応を１サイクルとして、このサイクルを５サイクル行った。引き続き、９８℃で１０秒間、７２℃で９０秒間の反応を１サイクルとしてこのサイクルを３０サイクル行った。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。この後QIAGEN 社製のQIAquick PCR Prification Kitを用いてＰＣＲ産物の精製を行い、分光光度計で濃度計測した。
【００４５】
2-5：ＢＰ反応
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムのマニュアルに従ってBP反応を行った。すなわち、上記2-4のＰＣＲにより得られた特定の相同組換え認識配列（attB）を有する各酵素の完全長cＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attP）を含んだ導入ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（BP反応）で図１に示したような各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンが得られる。
【００４６】
2-6：ＬＲ反応
Invitrogen社のGateway PCRクローニングシステムのマニュアルに従ってＬＲ反応を行った。すなわち、上記2-5のＢＰ反応で得られた特定の相同組換え認識配列（attＬ配列）を有する各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンと、同じく認識配列（attＲ配列）を含みなおかつ植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクターを混合し、相同組換え酵素による反応（LR反応）で図２に示したような各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ発現クローンが得られ、これを以後のシロイヌナズナへの遺伝子導入用Tiプラスミドベクターに用いた。今回発現ベクターとしては除草剤耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質遺伝子をマーカー遺伝子として有するpB7WG2Dベクターを用いた。
【００４７】
2-7：発現クローンに導入された各酵素の完全長cＤＮＡの塩基配列決定
蛍光ラベルされた基質を用いるダイターミネーター法を用いた。また、ＤＮＡシークエンサーとしては島津製作所社製DSQ1000Lを用いた。反応に使用する４種類の基質液は、50μM dATP、50μM 7-デアザ-dGTP、50μM dCTP、50μM dTTP、及び1μMフルオレセイン-12-ddATPとなるようにdd/dATP液を調製した。ddATPの代わりに1μMフルオレセイン-12-ddGTP、又は1μMフルオレセイン-12-ddCTPを加えた溶液を、それぞれdd/dGTP及び、dd/dCTP液とした。また、25μM dATP、25μM 7-デアザ-dGTP、25μM dCTP、25μM dTTP、及び1μMフルオレセイン-12-ddUTPとなるようにdd/dUTP液を調製した。鋳型となるプラスミドは１０．０pmol使用し、エタノール沈澱後、8pmol pUC/M13ユニバーサルプライマー、8Uサーモシークナーゼ (Amersham)、サーモシークナーゼ反応緩衝液２μl及び滅菌蒸留水を加えて全量を３２μlとした。この溶液をdd/dATP液、dd/dGTP液、dd/dCTP液を４μlずつ分注してあるチューブに６μlずつ分注し、dd/dUTP液を４μl加えたチューブには１２μl分注した。反応条件は、前処理として９８℃で２分間熱処理を行った後、熱変性を９８℃で３０秒間、アニーリング反応を５０℃で３０秒間、伸長反応を７２℃で１分間を１サイクルとして３５サイクル繰り返した。各チューブのサンプルをエタノール沈澱し、ＴＥ緩衝液３μlに溶解した。反応停止溶液２μlを加えて９８℃で３分間の熱変性を行い、4%変性ポリアクリルアミド電気泳動を２，１００Vで２０時間行った。
【００４８】
2-8：ＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列の相同性検索
シークエンス結果から、各酵素の完全長cＤＮＡに当たる部分を抽出し、NCBI-BLASTのＤＮＡライブラリーに登録してあるラッカーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼのそれぞれの完全長cＤＮＡとの相同性をGENETYX Mac Version 8.0(SOFTWARE DEVELOPMENT)により検討した。また、これらの完全長cＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に変換したものと、ライブラリ上の塩基配列を同じくアミノ酸に変換したものとの相同性も比較検討した。その結果、表３に示したように今回クローニングできたそれぞれの酵素の完全長cＤＮＡはそれぞれＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列において高い相同性を示すものがライブラリー中に見いだされるものの、完全に一致したものは存在せず、よって今回クローニングできた全ての酵素遺伝子は新規なものであることが判明した。
【００４９】
【表３】
【００５０】
３：酵素遺伝子の発現
3-1：大腸菌ＢＬ２１の形質転換
発現クローンによる各酵素遺伝子の発現を大腸菌レベルで確認するため、Invitrogen社製のコンピテントセルBL21 Starを使用した。コンピテントセル１０μlに、発現クローンプラスミド１μlを加えて３０分間氷上に放置し、４２℃で３０秒間熱処理を行った後、２分間氷上で放置した。９０μlのＳＯＣ培地（2%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.05%塩化ナトリウム、0.02M塩化マグネシウム、0.02Mグルコース）を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有のＬＢ寒天培地に、形質転換した菌液をコンラージ棒を用いてプレート全体に均一に塗沫し、３７℃で一晩インキュベートした。アンピシリン耐性の形質転換コロニーを爪楊枝で釣菌し、終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有ＬＢ液体培地、５mlに殖菌した後、３７℃で一晩振とう培養した。この培養菌体から、QIAprep spin Miniprep kit (QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出して制限酵素で切断して目的とするcＤＮＡ断片が挿入されているか確認した。
【００５１】
3-2：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
形質転換したＢＬ２１を終濃度１００μg/mlのアンピシリン含有のＬＢ液体培地中で３７℃、１６時間培養し、分光光度計（波長660nm）で吸光度を０．１に揃えた。その後、約２時間培養し、吸光度が大腸菌の対数増殖期を示す０．３〜０．４になったのを確認し、ＩＰＴＧ（イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトシド）を終濃度０．５mmol/Lになるよう加えた。その後、更に３時間培養し、吸光度が増加したのを確認した。この菌液を１．５mlチューブに１ml分取し、５，０００rpmで５分間遠心した後上澄みを除去した。沈殿物を−８０℃で１０分間凍結し、４２℃のウォーターバスで３分間溶解した。この操作を更に２度繰り返した。ここにNuPAGE LDS 試料緩衝液（Invitrogen）を２５μl、NuPAGE 試料還元剤を１０μl加え、滅菌水で１００μlとしたものを、９８℃で５分間処理しサンプルとした。このサンプルを10%アクリルアミドゲルで２００V、４０分間電気泳動した。ゲルを固定液（20%メタノール、7.5%酢酸）中に浸し３０分間振とうした。その後、ＣＢＢ（クマーシーブリリアントブルー R-250）溶液（50%メタノール、5%酢酸、0.25%CBB）による染色を３０分間行った。その後、脱色液（25%メタノール、7%酢酸）による脱色をバックグラウンドの色素が消えるまで繰り返した。脱色の完了したゲルを、ゲルドライヤーで乾燥し保存した。その結果、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼについて、導入クローンとタンパク質発現ベクターpDEST15をＬＲ反応させて得た発現クローンで大腸菌BL21 Starを形質転換し、この形質転換体が産生するタンパク質の電気泳動を10%アクリルアミドゲルを用いて行ったところ、それぞれの酵素の分子量と一致する部分にバンドが認められ、大腸菌BL21 Star中でそれぞれラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼの酵素タンパク質が生合成されていることが証明された。
【００５２】
４：シロイヌナズナの形質転換法
上記2-6で示したpB7WG2D発現ベクターと各酵素の完全長cＤＮＡを含んだ導入クローンとのＬＲ反応により得られた６種の遺伝子導入用Tiプラスミドベクター（pB7WG2D発現クローン）のうち、ラッカーゼIV遺伝子を導入したTiプラスミドベクターを用い、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）によるアグロインフェクション法によりシロイヌナズナの形質転換を行った。
【００５３】
4-1：Tiプラスミドベクターのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムへの遺伝子導入は、エレクトロポレーション法を用いて次のように行った。先ず、Invitrogen社製のアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株４０μlにTiプラスミドベクター溶液（0.1μg/μl）１μlを混ぜ合わせ、あらかじめ氷上に放置しておいたセルに移した。セルを遺伝子導入装置であるBioRed社製ジーンパルサーにセットし、電圧２．５kV、抵抗力２００Ω、及び、キャパシタンス１２５μFの条件でプラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンスLBA4404株に導入した。その後セルにＹＭ培地１mlを加えてピペッティングを行い、３０℃で３時間インキュベーションし、カナマイシンを含むＹＥＰ培地のプレートに植菌した後、３０℃で２日間培養した。生じたカナマイシン耐性コロニーからプラスミドを精製し、アグロバクテリウムへのTiプラスミドベクター導入の確認を行った。
【００５４】
4-2：減圧浸潤法によるシロイヌナズナへの遺伝子導入
アグロバクテリウムを５mlのＹＥＰ培地により３０℃で対数増殖期まで前培養を行った。感染を行う前日にカナマイシンを含むＹＥＰ培地１２５mlに前培養した菌液１mlを加え、さらに増菌させた。そのアグロバクテリウム懸濁液を遠心用チューブに分け、６，０００rpm、１５min、室温の条件下で遠心をおこなった後、上澄みを捨て、駒込ピペットを使って浸透用ＭＳ培地に沈殿をＯＤ＝０．８になるように菌を再懸濁させた。感染に用いたシロイヌナズナは、植物栽培用ポッドに４〜６個体播種し、２６℃、長日条件（16時間明、8時間暗）で育て、摘心をしながら約６週間後に茎の高さが十数センチになった株を感染に用いた。感染前日に、シロイヌナズナで開花しているもの、結実しているものははさみ等で取り除いた。そのシロイヌナズナを逆さにしてアグロバクテリウム懸濁液に浸けた。シロイヌナズナを懸濁液に浸けたままデシケーターに入れ、減圧を行った。デシケーター内の圧力を約４００mmHgに調節し、１０分間その状態で減圧を行った。その後デシケーター内から植物を取り出し、水を切り、ペーパータオルで植物から懸濁液を吸い取った。次にその植物をバットに横倒しにして置き、バットの底に少量の水を滴下して、ラップなどの透明な覆いをかぶせた状態で一晩放置した。翌日ラップを外し、植物を立て、減圧浸潤から２日後にかん水を再開した。その後植物が完全に枯れたらＴ1種子を採取した。
【００５５】
4-3 形質転換シロイヌナズナの選抜
種子を採種し０．６７５μmol/Lの除草剤グルホシネート（商品名：バスタ(BASTA)）中で生育してくる個体を形質転換体として選抜した。その結果、ラッカーゼIV遺伝子を導入したTiプラスミドベクターを有するアグロバクテリウムの感染系でグルホシネート耐性形質転換体が約３，０００粒の種子から１個体取得できた。Tiプラスミドベクター中にはマーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質遺伝子が導入されていることから、この遺伝子の発現をシロイヌナズナ野生株と形質転換シロイヌナズナで実体顕微鏡下で比較観察したところ、形質転換シロイヌナズナのみに強い緑色蛍光の発色が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によって得られた形質転換植物体は、白色腐朽菌が有するダイオキシン類分解能に優れたタンパク質を産生するという特性と、植物体が有するバイオマス量が大きいという特性とを兼ね備えており、ダイオキシン類汚染土壌やダイオキシン類汚染水中のダイオキシン類を効率良く分解して無害化するダイオキシン類汚染環境の効率的な修復が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、プラスミドベクターの作製で用いたＢＰ反応を説明するための説明図である。
【図２】図２は、プラスミドベクターの作製で用いたＬＲ反応を説明するための説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項２】
宿主のアブラナ科植物体がシロイヌナズナ属植物体である請求項１に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項３】
宿主のシロイヌナズナ属植物体がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である請求項２に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項４】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼから選ばれたいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項５】
ラッカーゼIをコードする遺伝子が、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項６】
ラッカーゼIIをコードする遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項７】
ラッカーゼIIIをコードする遺伝子が、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項８】
ラッカーゼIVをコードする遺伝子が、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項９】
リグニンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項１０】
マンガンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項１１】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入するために用いられるプラスミドベクター。
【請求項１２】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼから選ばれたいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である請求項１１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
ラッカーゼIをコードする遺伝子が、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１４】
ラッカーゼIIをコードする遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１５】
ラッカーゼIIIをコードする遺伝子が、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１６】
ラッカーゼIVをコードする遺伝子が、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１７】
リグニンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１８】
マンガンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１９】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２０】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２１】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２２】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２３】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２４】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２５】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２６】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２８】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２９】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項３０】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項１】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子を含むプラスミドベクターを宿主のアブラナ科植物体に導入させることにより得られたダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項２】
宿主のアブラナ科植物体がシロイヌナズナ属植物体である請求項１に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項３】
宿主のシロイヌナズナ属植物体がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である請求項２に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項４】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼから選ばれたいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項５】
ラッカーゼIをコードする遺伝子が、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項６】
ラッカーゼIIをコードする遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項７】
ラッカーゼIIIをコードする遺伝子が、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項８】
ラッカーゼIVをコードする遺伝子が、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項９】
リグニンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項１０】
マンガンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項４に記載のダイオキシン類分解能を有する形質転換植物体。
【請求項１１】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする白色腐朽菌由来の遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主のアブラナ科植物体に導入するために用いられるプラスミドベクター。
【請求項１２】
ダイオキシン類分解能を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ラッカーゼI〜IV、リグニンパーオキシダーゼ、及びマンガンパーオキシダーゼから選ばれたいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である請求項１１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
ラッカーゼIをコードする遺伝子が、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１４】
ラッカーゼIIをコードする遺伝子が、配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１５】
ラッカーゼIIIをコードする遺伝子が、配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１６】
ラッカーゼIVをコードする遺伝子が、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Trametes versicolor UAMH 8272由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１７】
リグニンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１８】
マンガンパーオキシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporium UAMH 3641由来の遺伝子である請求項１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１９】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２０】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２１】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２２】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２３】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２４】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子。
【請求項２５】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２６】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２８】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項２９】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【請求項３０】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列を有する遺伝子でコードされるタンパク質。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−３３３７５８（Ｐ２００６−３３３７５８Ａ）
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６１２３３（Ｐ２００５−１６１２３３）
【出願日】平成１７年６月１日（２００５．６．１）
【出願人】（５０２３４１５４６）学校法人麻布獣医学園 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１日（２００５．６．１）
【出願人】（５０２３４１５４６）学校法人麻布獣医学園 (17)
【Ｆターム（参考）】
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