テアニンの製造法
【課題】 従来より、テアニンの製造方法としてはテアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、この場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１．５％前後程度しか蓄積されず、また一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、ほとんど蓄積されないのが実情である。本発明は、Ｌ−テアニンの効率的な新規製造法を提供し、簡易かつ工業的に有利なＬ−テアニンの高収率生産を可能とする事を目的とする。
【解決手段】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）を用いる事により上記課題を解決する。
【解決手段】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）を用いる事により上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアニン（γ−グルタミルエチルアミド）の新規製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアニンは緑茶に含まれる旨味の主成分として知られ、茶をはじめとする食品の香味物質として重要な物質である。また一方、テアニンを含めγ−グルタミル誘導体は、動・植物体における生理活性物質として作用する事が指摘されている。例えば、テアニンやグルタミンがカフェインによって誘発される痙攣に拮抗する事が報告されており、この事からこれらの化合物が中枢神経系に作用する事が考えられ、生理活性物質としての有用性が期待されている。
【０００３】
従来より、テアニンの製造方法としてはテアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、この場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１．５％前後程度しか蓄積されず、また一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、ほとんど蓄積されないのが実情である。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では工業的に実用的ではない事が指摘されている。
【０００４】
このような事から、工業的生産方法の開発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学的に有機合成する方法が報告されている（非特許文献１参照）。しかし、このような有機合成反応では収率が低く、未反応原料や副生成物との混合溶液から目的生成物の分離精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘されている。また、特許文献１では酵母が糖の醗酵の際に生成するＡＴＰを利用して、グルタミン合成酵素の存在下でグルタミン酸からテアニンを合成する方法が開示されている。しかしながら、該公報に開示されている方法は酵母の至適ｐＨが中性（６．０〜８．０）であるのに対して、グルタミン合成酵素によるテアニン合成反応の至適ｐＨが１０．０〜１１．０であるために両反応を組み合わせる事は容易ではなく、実施が困難である事が指摘されている。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌から得られるグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンにｐＨ９．０−１２．０の条件下で作用させる事を特徴とするテアニンの製造方法（特許文献２参照）、細菌の固定化菌体を用いる事を特徴とするテアニンの製造方法（特許文献３参照）が開示されている。しかし、エチルアミンは沸点が１６．６℃と非常に低いため、製造する上で揮発したエチルアミン蒸気が作業員や環境に悪影響を及ぼしたり、反応効率の向上を目的に沸点以上の温度で反応しようとすると特別な設備が必要となる等問題がある。また、これら製造法においては基質濃度が低く、かつ製品の収率が低いため、実用上問題がある。また特許文献２に開示されている酵素はその精製が煩雑である事、ｐＨ及び温度に対する酵素の安定性に問題がある事、さらに反応後の酵素と生成物の分離操作が煩雑である事、及び連続的な反応によるテアニンの生産が困難である等の多くの問題点を有する。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１）
【特許文献１】特開昭５８−０４００９４号
【特許文献２】特開平０５−０５５１５４号
【特許文献３】特開平０５−３２８９８６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、テアニンの効率的な製造法を提供し、簡易かつ工業的に有利なテアニン生産を可能とする事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記の課題を解決するために、メチロトローフ細菌及びメチロトローフ細菌の一部が持つγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）について検討する事にした。ＧＭＡＳはグルタミン酸、メチルアミン及びＡＴＰからγ−グルタミルメチルアミドを合成する酵素であるが、メチルアミンのホモログであるエチルアミンにおいても高い反応性があるといわれている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって新規なテアニンの効率的な製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とする事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるＧＭＡＳはメタノール資化性の微生物由来のものが使用でき、例としてメチロトローフ（Ｃ１化合物資化性菌）細菌や酵母を挙げる事ができ、好ましくはＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ属やＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌が挙げられ、最も好ましくはＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９等が挙げられる。この反応の酵素源としては、生菌体や生菌体各種処理標品、例えば菌体磨砕物、超音波処理菌体、溶剤処理菌体、低温乾燥菌体、硫安塩析物が使用できる。ＧＭＡＳは粗酵素や精製酵素が利用でき、特に精製方法として限定するものではないが、ゲルろ過、イオン交換、膜分離、アセトン処理、硫安分画等が考えられる。また、精製酵素標品や菌体等をそのまま、あるいは担体に固定化したものが使用できる。担体とは、ＧＭＡＳを固定化するものであり、例えばセライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明におけるテアニンの生産には金属塩の存在が重要であり、金属塩としては２価の金属塩が望ましい。２価の金属塩としてはマンガンイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等が挙げられるが、中でも塩化マンガン等のマンガンイオンや塩化マグネシウム等のマグネシウムイオンが存在する事が望ましく、水可溶性のマンガン塩やマグネシウム塩であれば使用可能である。これら２価の金属イオンを２種類以上組み合わせて存在する事によりテアニンの生成のための至適ｐＨはアルカリ側から中性側に移行し本発明の目的とする条件を得る事が出来る。反応液中の濃度は特に限定するものではないが好ましくは０．０１〜５００ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１００ｍＭであり、最も好ましくは１〜５０ｍＭである。
【００１１】
本発明におけるＧＭＡＳを活性化するには発酵化学エネルギーであるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が必須であり、ＡＴＰ源として考えられるものとして発酵化学エネルギー生成微生物が挙げられる。この発酵化学エネルギー生成微生物としては、糖の発酵によってＡＴＰを生成する能力を有する微生物である酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物が一般的に利用できる。これらの微生物の菌体を得るためには通常の培養法が用いられる。これらの微生物は溶剤処理菌体、乾燥菌体、破砕菌体、無細胞標品等各種形態で使用できる。また、その他のＡＴＰ源として高リン酸結合を有するポリリン酸等の化合物も考えられる。
【００１２】
本発明におけるグルタミン酸は化学合成法や発酵法等により作られるもので、Ｌ体、Ｄ体のどちらでも良いがＬ体が好ましい。また形態としては遊離の酸のほか金属塩等があり、水への溶解度が高い金属塩が好ましく、最も好ましいのはナトリウム塩である。テアニン生成反応の至適グルタミン酸濃度は、グルタミン酸による酵素の阻害は起こらないので特に限定されるものではないが、後の精製を考慮すると未反応の基質が残らないように調整する事が望ましい。
【００１３】
本発明によるエチルアミンの形態は無水物の他に塩酸塩等があり、どの形態でも良いが安全性から塩酸塩が好ましい。テアニン生成反応の至適エチルアミン濃度は、高濃度のエチルアミンは酵母の解糖系でのＡＴＰ生成速度を低下させるため、３．０Ｍ以下にする事が望ましく、好ましくは２．０Ｍ以下、更に好ましくは１．０Ｍ以下である。しかしエチルアミンを数回に分割して添加する方法によれば、各添加時にこの濃度を超えない限りエチルアミンを多量に加える事ができ、テアニンの生成量を向上させる事ができる。基質となるグルタミン酸とエチルアミンの割合においても１：０．１〜５での反応が望まれるが、１：０．５〜３が好ましい。本発明において効率的な反応を行うためには、ｐＨ６．０〜９．０が好ましく、６．５〜７．５がより好ましい。また、反応温度は０〜５５℃が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０℃、最も好ましくは２０〜３５℃である。このようにして得られるテアニンの反応液からの単離精製は、通常の公知の方法が用いられ、例えば溶媒分配及び各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせる事により容易に行う事ができる。
【００１４】
以下実施例によって本発明を更に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１
Ｃ１化合物資化性能を指標にした細菌の分離
メタノールを炭素源、メチルアミンを窒素源とする培地（メチルアミン０．２５％、メタノール０．２５％、ＮａＣｌ０．２％、ＫＣｌ０．１％、ＭｇＳＯ４０．０３％、ＫＨ２ＰＯ４０．００５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．００５％、ｐＨ７．０）による継代培養を３回行い、約１００株のメチロトローフ細菌を分離した。
【００１６】
実施例２
テアニン生成活性による細菌の分離
テアニン合成の基質と２価の金属イオン及び界面活性剤、分離菌の生菌体を含む反応液（グルタミン酸５０ｍＭ、エチルアミン１５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２３０ｍＭ ｏｒ ＭｎＣｌ２３ｍＭ、ＡＴＰ７．５ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ１００ｍＭ、ＣＴＡＢ０．１Ｍｇ／ｍｌ、菌体Ｏ．Ｄ．６１０ｎｍ＝１．０、ｐＨ７．７）よりテアニンの定量より活性を測定し、約１００株のメチロトローフ細菌より６種類の候補菌を得て、その中でも偏性メタノール資化性菌として近年報告されたＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓと９９％の相同性を持つＴＧＭＳ Ｎｏ．９株に注目した。結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】
実施例３
グルタミルメチルアミド合成酸素（ＧＭＡＳ）の調製
（ａ） Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９の培養
Ｍｅｔｈａｎｏｌ ０．２５％
Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ塩酸塩 ０．２５％
Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ０．０３％
ＮａＣｌ １．０％
ＫＣｌ ０．０２％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０３％
ＫＨ２ＰＯ４ ０．００５％
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．００５％
Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ １×１０−７％
を含む培養液５リットル容のジャーファメンター（３０℃、回転数１００ｒｐｍ）中Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９を５日間培養した。
（ｂ） 無細胞抽出液
１リットル分の菌体を洗浄後、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０ミリリットルに懸濁し、５〜２０℃で超音波破砕を行い、無細胞抽出液を得た。
（ｃ） 硫酸アンモニウム分画
７％アンモニア水でｐＨ７．０に調整しながら硫酸アンモニウム分画を行い、４５〜９０％飽和分画を得た。これを０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った。
（ｄ） ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー
透析酵素液を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した。次にＤＥＡＥ−セルロースカラム（１５×６０ｃｍ）に吸着させ、吸着した酵素を０．１Ｍの食塩を含む緩衝液で溶出した。
【００１９】
以上の操作で事実上十分な純度のグルタミルメチルアミド合成酸素（ＧＭＡＳ）を得る事ができた。その後ディスク電気泳動的に単一な標品を得た。精製率は３１倍、総活性からみた回収率は２１％であった。
【００２０】
実施例４
エネルギー共役によるテアニンの生産
ＧＭＡＳの活性をグルタミン酸、ヒドロキシルアミン、及びＡＴＰからγ−グルタミルヒドロキサル酸を合成する反応によって簡易的に測定した。酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのγ−グルタミルヒドロキサル酸を合成する酵素量とした。共役反応液に１単位のＧＭＡＳを加えて反応を行った結果、完全反応系では酵母菌体によるグルコースの消費と共に解糖系中間体のフルクトース１，６ビスリン酸（ＦＢＰ）が一時的に蓄積し、次いでＦＢＰの減少に伴ってテアニンが生成した。完全反応系からＧＭＡＳ或いは酵母菌体を取り除くとテアニンが生成しなかった事は、完全反応系で認められたテアニンの生成がＧＭＡＳと酵母菌体の共役によって進行している事を示している。結果を図１に示す。
【００２１】
実施例５
テアニン生産に対する２価金属イオンの影響
共益エネルギー源として酵母菌体を含む反応液中に金属イオンを添加しない場合（図２左）は、酵母菌体の糖発酵が正常に進行しているにもかかわらずテアニンはほとんど生成しなかった。金属イオンとして２価の金属イオンであるＭｇ２＋及びＭｎ２＋等を使用した。Ｍｇ２＋を反応液に添加した時のテアニンの生成量と比較すると、Ｍｎ２＋のほうがテアニン合成に効果的である事がわかった。また、Ｍｎ２＋及びＭｇ２＋をそれぞれ単独で添加するよりもＭｇ２＋とＭｎ２＋を同時に添加するとさらに多くのテアニンが生成する事か可能であった。結果を図２に示す。
【００２２】
実施例６
テアニン生産に有用である金属イオンのＭｇ２＋あるいはＭｎ２＋存在下でのＧＭＡＳによるテアニン合成反応に対するｐＨの影響を精査した。その結果、Ｍｇ２＋依存性反応至適ｐＨ（７．７５，１００％）でのＭｎ２＋依存性反応の活性は約２８％であった。またＭｎ２＋依存性反応至適ｐＨ（７．０）ではＭｇ２＋依存性反応の活性はＭｎ２＋のそれと同程度であった。結果を図３に示す。
【００２３】
実施例７
基質の濃度によるテアニン生産能の変化
次いで、高濃度のテアニンを生産するにあたって基質であるグルタミン酸とエチルアミンの濃度をグルコースの濃度と共に増加させたところ、逆にテアニンの生成量が減少した。酵母菌体によるグルコースの消費速度が低下している事から、高濃度の基質が酵母の解糖反応を阻害する事によりテアニンの生産量の低下をもたらしていると考える事ができる。結果を図４に示す。
【００２４】
実施例８
反応液中の成分濃度と酵母解糖系への影響
そこで反応液中の各成分について酵母解糖系への影響を調査したところリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）とエチルアミンの濃度が酵母解糖系に顕著な影響を与える事が確認された。図にあるようにＫＰＢの濃度が増加するに伴って、グルコースの消費速度が大きくなり酵母解糖系が円滑に進行するようになった。またエチルアミン濃度を低下させても酵母解糖系の反応の阻害が緩和された。結果を図５に示す。
【００２５】
実施例９
各反応液成分の濃度とテアニンの生成量
これまでの実施例をもとにテアニン生産に影響を与えうる成分の濃度を調整し、最も効率の良い反応条件を検討した。エチルアミンの濃度を９００ｍＭから６００ｍＭに、ＫＰＢの濃度を５０ｍＭから２００ｍＭに変える事によって酵母解糖系の反応阻害は解消し、それに伴ってテアニン生産量も増加した。結果を図６に示す。
【００２６】
実施例１０
キトパール４０１０を用いた固定化ＧＭＡＳの調製
キトサンビーズである市販品のキトパール４０１０（富士紡績（株））を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)に２４時間浸漬した。この平衡化後キトパール４０１０の１０ｍＬを実施例３にて調製したＧＭＡＳ２５ｍＬに浸漬し、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したキトパール４０１０を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度(２８０ｎｍ)が０.０１以下になるまで洗浄することでキトパール４０１０を用いた固定化ＧＭＡＳを作成することができる。
【００２７】
実施例１１
陰イオン交換樹脂を用いた固定化ＧＭＡＳの調製
実施例３にて得られた精製ＧＭＡＳ２５ｍＬに対し、陰イオン交換樹脂であるダイヤイオンＨＰＡ２５（三菱化学（株））を１０ｍＬ添加後、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したＨＰＡ２５を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度（２８０ｎｍ）が０.０１以下になるまで洗浄することでダイヤイオンＨＰＡ２５を用いた固定化ＧＭＡＳを作成することができる。
【００２８】
テアニンの製造
最終の条件として、グルタミン酸６００ｍＭ、エチルアミン６００ｍＭ、グルコース３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２３０ｍＭ、ＭｎＣｌ２３ｍＭ、ＡＭＰ ５ｍＭを含む２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、酵母乾燥菌体４０ｍｇ／ｍｌを添加して、３０．０ｕｎｉｔ／ｍｌのＧＭＡＳにて３０℃、２７時間反応させた。この結果、反応液１Ｌより約６００ｍＭのテアニンを単離した。テアニン反応液からの単離精製は、反応液をＤｏｗｅｘ５０×８、Ｄｏｗｅｘ１×２カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理する事で行った。この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけると標準物質と同じピークを示し、塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行うと、１：１の割合で、グルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように単離物質がグルタミナーゼによって加水分解された事から、エチルアミンがグルタミン酸のγ位に結合していた事が示される。また加水分解で生じたグルタミン酸がＬ型である事も、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によるＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）由来のγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を用いる事により、従来技術と比較して効率的なテアニンの製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とする事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＧＭＡＳの反応系が共役エネルギーを必要とする事を示した図である。
【図２】２価の金属イオン存在下でのテアニン生産への影響をみた図である。
【図３】２価の金属イオンとｐＨによるテアニン生産性の影響に関する図である。
【図４】基質の濃度によるテアニンの生産能の変化に関する図である。
【図５】反応液中の成分濃度が解糖系に与える影響を示した図である。
【図６】基質成分の濃度変化によるテアニン生成率の変化に関する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テアニン（γ−グルタミルエチルアミド）の新規製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テアニンは緑茶に含まれる旨味の主成分として知られ、茶をはじめとする食品の香味物質として重要な物質である。また一方、テアニンを含めγ−グルタミル誘導体は、動・植物体における生理活性物質として作用する事が指摘されている。例えば、テアニンやグルタミンがカフェインによって誘発される痙攣に拮抗する事が報告されており、この事からこれらの化合物が中枢神経系に作用する事が考えられ、生理活性物質としての有用性が期待されている。
【０００３】
従来より、テアニンの製造方法としてはテアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、この場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１．５％前後程度しか蓄積されず、また一般の煎茶用茶園では光合成が活発であるため、ほとんど蓄積されないのが実情である。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では工業的に実用的ではない事が指摘されている。
【０００４】
このような事から、工業的生産方法の開発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学的に有機合成する方法が報告されている（非特許文献１参照）。しかし、このような有機合成反応では収率が低く、未反応原料や副生成物との混合溶液から目的生成物の分離精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘されている。また、特許文献１では酵母が糖の醗酵の際に生成するＡＴＰを利用して、グルタミン合成酵素の存在下でグルタミン酸からテアニンを合成する方法が開示されている。しかしながら、該公報に開示されている方法は酵母の至適ｐＨが中性（６．０〜８．０）であるのに対して、グルタミン合成酵素によるテアニン合成反応の至適ｐＨが１０．０〜１１．０であるために両反応を組み合わせる事は容易ではなく、実施が困難である事が指摘されている。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌から得られるグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンにｐＨ９．０−１２．０の条件下で作用させる事を特徴とするテアニンの製造方法（特許文献２参照）、細菌の固定化菌体を用いる事を特徴とするテアニンの製造方法（特許文献３参照）が開示されている。しかし、エチルアミンは沸点が１６．６℃と非常に低いため、製造する上で揮発したエチルアミン蒸気が作業員や環境に悪影響を及ぼしたり、反応効率の向上を目的に沸点以上の温度で反応しようとすると特別な設備が必要となる等問題がある。また、これら製造法においては基質濃度が低く、かつ製品の収率が低いため、実用上問題がある。また特許文献２に開示されている酵素はその精製が煩雑である事、ｐＨ及び温度に対する酵素の安定性に問題がある事、さらに反応後の酵素と生成物の分離操作が煩雑である事、及び連続的な反応によるテアニンの生産が困難である等の多くの問題点を有する。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９（７）１３０１−１３０７（１９７１）
【特許文献１】特開昭５８−０４００９４号
【特許文献２】特開平０５−０５５１５４号
【特許文献３】特開平０５−３２８９８６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、テアニンの効率的な製造法を提供し、簡易かつ工業的に有利なテアニン生産を可能とする事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記の課題を解決するために、メチロトローフ細菌及びメチロトローフ細菌の一部が持つγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）について検討する事にした。ＧＭＡＳはグルタミン酸、メチルアミン及びＡＴＰからγ−グルタミルメチルアミドを合成する酵素であるが、メチルアミンのホモログであるエチルアミンにおいても高い反応性があるといわれている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって新規なテアニンの効率的な製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とする事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるＧＭＡＳはメタノール資化性の微生物由来のものが使用でき、例としてメチロトローフ（Ｃ１化合物資化性菌）細菌や酵母を挙げる事ができ、好ましくはＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ属やＰａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌が挙げられ、最も好ましくはＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９等が挙げられる。この反応の酵素源としては、生菌体や生菌体各種処理標品、例えば菌体磨砕物、超音波処理菌体、溶剤処理菌体、低温乾燥菌体、硫安塩析物が使用できる。ＧＭＡＳは粗酵素や精製酵素が利用でき、特に精製方法として限定するものではないが、ゲルろ過、イオン交換、膜分離、アセトン処理、硫安分画等が考えられる。また、精製酵素標品や菌体等をそのまま、あるいは担体に固定化したものが使用できる。担体とは、ＧＭＡＳを固定化するものであり、例えばセライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明におけるテアニンの生産には金属塩の存在が重要であり、金属塩としては２価の金属塩が望ましい。２価の金属塩としてはマンガンイオン、マグネシウムイオン、銅イオン等が挙げられるが、中でも塩化マンガン等のマンガンイオンや塩化マグネシウム等のマグネシウムイオンが存在する事が望ましく、水可溶性のマンガン塩やマグネシウム塩であれば使用可能である。これら２価の金属イオンを２種類以上組み合わせて存在する事によりテアニンの生成のための至適ｐＨはアルカリ側から中性側に移行し本発明の目的とする条件を得る事が出来る。反応液中の濃度は特に限定するものではないが好ましくは０．０１〜５００ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１００ｍＭであり、最も好ましくは１〜５０ｍＭである。
【００１１】
本発明におけるＧＭＡＳを活性化するには発酵化学エネルギーであるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が必須であり、ＡＴＰ源として考えられるものとして発酵化学エネルギー生成微生物が挙げられる。この発酵化学エネルギー生成微生物としては、糖の発酵によってＡＴＰを生成する能力を有する微生物である酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物が一般的に利用できる。これらの微生物の菌体を得るためには通常の培養法が用いられる。これらの微生物は溶剤処理菌体、乾燥菌体、破砕菌体、無細胞標品等各種形態で使用できる。また、その他のＡＴＰ源として高リン酸結合を有するポリリン酸等の化合物も考えられる。
【００１２】
本発明におけるグルタミン酸は化学合成法や発酵法等により作られるもので、Ｌ体、Ｄ体のどちらでも良いがＬ体が好ましい。また形態としては遊離の酸のほか金属塩等があり、水への溶解度が高い金属塩が好ましく、最も好ましいのはナトリウム塩である。テアニン生成反応の至適グルタミン酸濃度は、グルタミン酸による酵素の阻害は起こらないので特に限定されるものではないが、後の精製を考慮すると未反応の基質が残らないように調整する事が望ましい。
【００１３】
本発明によるエチルアミンの形態は無水物の他に塩酸塩等があり、どの形態でも良いが安全性から塩酸塩が好ましい。テアニン生成反応の至適エチルアミン濃度は、高濃度のエチルアミンは酵母の解糖系でのＡＴＰ生成速度を低下させるため、３．０Ｍ以下にする事が望ましく、好ましくは２．０Ｍ以下、更に好ましくは１．０Ｍ以下である。しかしエチルアミンを数回に分割して添加する方法によれば、各添加時にこの濃度を超えない限りエチルアミンを多量に加える事ができ、テアニンの生成量を向上させる事ができる。基質となるグルタミン酸とエチルアミンの割合においても１：０．１〜５での反応が望まれるが、１：０．５〜３が好ましい。本発明において効率的な反応を行うためには、ｐＨ６．０〜９．０が好ましく、６．５〜７．５がより好ましい。また、反応温度は０〜５５℃が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０℃、最も好ましくは２０〜３５℃である。このようにして得られるテアニンの反応液からの単離精製は、通常の公知の方法が用いられ、例えば溶媒分配及び各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせる事により容易に行う事ができる。
【００１４】
以下実施例によって本発明を更に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１
Ｃ１化合物資化性能を指標にした細菌の分離
メタノールを炭素源、メチルアミンを窒素源とする培地（メチルアミン０．２５％、メタノール０．２５％、ＮａＣｌ０．２％、ＫＣｌ０．１％、ＭｇＳＯ４０．０３％、ＫＨ２ＰＯ４０．００５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．００５％、ｐＨ７．０）による継代培養を３回行い、約１００株のメチロトローフ細菌を分離した。
【００１６】
実施例２
テアニン生成活性による細菌の分離
テアニン合成の基質と２価の金属イオン及び界面活性剤、分離菌の生菌体を含む反応液（グルタミン酸５０ｍＭ、エチルアミン１５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２３０ｍＭ ｏｒ ＭｎＣｌ２３ｍＭ、ＡＴＰ７．５ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ１００ｍＭ、ＣＴＡＢ０．１Ｍｇ／ｍｌ、菌体Ｏ．Ｄ．６１０ｎｍ＝１．０、ｐＨ７．７）よりテアニンの定量より活性を測定し、約１００株のメチロトローフ細菌より６種類の候補菌を得て、その中でも偏性メタノール資化性菌として近年報告されたＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓと９９％の相同性を持つＴＧＭＳ Ｎｏ．９株に注目した。結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】
実施例３
グルタミルメチルアミド合成酸素（ＧＭＡＳ）の調製
（ａ） Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９の培養
Ｍｅｔｈａｎｏｌ ０．２５％
Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ塩酸塩 ０．２５％
Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ０．０３％
ＮａＣｌ １．０％
ＫＣｌ ０．０２％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０３％
ＫＨ２ＰＯ４ ０．００５％
Ｋ２ＨＰＯ４ ０．００５％
Ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ １×１０−７％
を含む培養液５リットル容のジャーファメンター（３０℃、回転数１００ｒｐｍ）中Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９を５日間培養した。
（ｂ） 無細胞抽出液
１リットル分の菌体を洗浄後、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０ミリリットルに懸濁し、５〜２０℃で超音波破砕を行い、無細胞抽出液を得た。
（ｃ） 硫酸アンモニウム分画
７％アンモニア水でｐＨ７．０に調整しながら硫酸アンモニウム分画を行い、４５〜９０％飽和分画を得た。これを０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った。
（ｄ） ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー
透析酵素液を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した。次にＤＥＡＥ−セルロースカラム（１５×６０ｃｍ）に吸着させ、吸着した酵素を０．１Ｍの食塩を含む緩衝液で溶出した。
【００１９】
以上の操作で事実上十分な純度のグルタミルメチルアミド合成酸素（ＧＭＡＳ）を得る事ができた。その後ディスク電気泳動的に単一な標品を得た。精製率は３１倍、総活性からみた回収率は２１％であった。
【００２０】
実施例４
エネルギー共役によるテアニンの生産
ＧＭＡＳの活性をグルタミン酸、ヒドロキシルアミン、及びＡＴＰからγ−グルタミルヒドロキサル酸を合成する反応によって簡易的に測定した。酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのγ−グルタミルヒドロキサル酸を合成する酵素量とした。共役反応液に１単位のＧＭＡＳを加えて反応を行った結果、完全反応系では酵母菌体によるグルコースの消費と共に解糖系中間体のフルクトース１，６ビスリン酸（ＦＢＰ）が一時的に蓄積し、次いでＦＢＰの減少に伴ってテアニンが生成した。完全反応系からＧＭＡＳ或いは酵母菌体を取り除くとテアニンが生成しなかった事は、完全反応系で認められたテアニンの生成がＧＭＡＳと酵母菌体の共役によって進行している事を示している。結果を図１に示す。
【００２１】
実施例５
テアニン生産に対する２価金属イオンの影響
共益エネルギー源として酵母菌体を含む反応液中に金属イオンを添加しない場合（図２左）は、酵母菌体の糖発酵が正常に進行しているにもかかわらずテアニンはほとんど生成しなかった。金属イオンとして２価の金属イオンであるＭｇ２＋及びＭｎ２＋等を使用した。Ｍｇ２＋を反応液に添加した時のテアニンの生成量と比較すると、Ｍｎ２＋のほうがテアニン合成に効果的である事がわかった。また、Ｍｎ２＋及びＭｇ２＋をそれぞれ単独で添加するよりもＭｇ２＋とＭｎ２＋を同時に添加するとさらに多くのテアニンが生成する事か可能であった。結果を図２に示す。
【００２２】
実施例６
テアニン生産に有用である金属イオンのＭｇ２＋あるいはＭｎ２＋存在下でのＧＭＡＳによるテアニン合成反応に対するｐＨの影響を精査した。その結果、Ｍｇ２＋依存性反応至適ｐＨ（７．７５，１００％）でのＭｎ２＋依存性反応の活性は約２８％であった。またＭｎ２＋依存性反応至適ｐＨ（７．０）ではＭｇ２＋依存性反応の活性はＭｎ２＋のそれと同程度であった。結果を図３に示す。
【００２３】
実施例７
基質の濃度によるテアニン生産能の変化
次いで、高濃度のテアニンを生産するにあたって基質であるグルタミン酸とエチルアミンの濃度をグルコースの濃度と共に増加させたところ、逆にテアニンの生成量が減少した。酵母菌体によるグルコースの消費速度が低下している事から、高濃度の基質が酵母の解糖反応を阻害する事によりテアニンの生産量の低下をもたらしていると考える事ができる。結果を図４に示す。
【００２４】
実施例８
反応液中の成分濃度と酵母解糖系への影響
そこで反応液中の各成分について酵母解糖系への影響を調査したところリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）とエチルアミンの濃度が酵母解糖系に顕著な影響を与える事が確認された。図にあるようにＫＰＢの濃度が増加するに伴って、グルコースの消費速度が大きくなり酵母解糖系が円滑に進行するようになった。またエチルアミン濃度を低下させても酵母解糖系の反応の阻害が緩和された。結果を図５に示す。
【００２５】
実施例９
各反応液成分の濃度とテアニンの生成量
これまでの実施例をもとにテアニン生産に影響を与えうる成分の濃度を調整し、最も効率の良い反応条件を検討した。エチルアミンの濃度を９００ｍＭから６００ｍＭに、ＫＰＢの濃度を５０ｍＭから２００ｍＭに変える事によって酵母解糖系の反応阻害は解消し、それに伴ってテアニン生産量も増加した。結果を図６に示す。
【００２６】
実施例１０
キトパール４０１０を用いた固定化ＧＭＡＳの調製
キトサンビーズである市販品のキトパール４０１０（富士紡績（株））を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)に２４時間浸漬した。この平衡化後キトパール４０１０の１０ｍＬを実施例３にて調製したＧＭＡＳ２５ｍＬに浸漬し、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したキトパール４０１０を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度(２８０ｎｍ)が０.０１以下になるまで洗浄することでキトパール４０１０を用いた固定化ＧＭＡＳを作成することができる。
【００２７】
実施例１１
陰イオン交換樹脂を用いた固定化ＧＭＡＳの調製
実施例３にて得られた精製ＧＭＡＳ２５ｍＬに対し、陰イオン交換樹脂であるダイヤイオンＨＰＡ２５（三菱化学（株））を１０ｍＬ添加後、約２時間振盪した。その後、付着液を除去したＨＰＡ２５を２.５％グルタルアルデヒド溶液に加え、さらに２時間振盪した。グルタルアルデヒド処理後、３０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて吸光度（２８０ｎｍ）が０.０１以下になるまで洗浄することでダイヤイオンＨＰＡ２５を用いた固定化ＧＭＡＳを作成することができる。
【００２８】
テアニンの製造
最終の条件として、グルタミン酸６００ｍＭ、エチルアミン６００ｍＭ、グルコース３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２３０ｍＭ、ＭｎＣｌ２３ｍＭ、ＡＭＰ ５ｍＭを含む２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、酵母乾燥菌体４０ｍｇ／ｍｌを添加して、３０．０ｕｎｉｔ／ｍｌのＧＭＡＳにて３０℃、２７時間反応させた。この結果、反応液１Ｌより約６００ｍＭのテアニンを単離した。テアニン反応液からの単離精製は、反応液をＤｏｗｅｘ５０×８、Ｄｏｗｅｘ１×２カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理する事で行った。この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけると標準物質と同じピークを示し、塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行うと、１：１の割合で、グルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように単離物質がグルタミナーゼによって加水分解された事から、エチルアミンがグルタミン酸のγ位に結合していた事が示される。また加水分解で生じたグルタミン酸がＬ型である事も、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によるＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）由来のγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を用いる事により、従来技術と比較して効率的なテアニンの製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とする事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＧＭＡＳの反応系が共役エネルギーを必要とする事を示した図である。
【図２】２価の金属イオン存在下でのテアニン生産への影響をみた図である。
【図３】２価の金属イオンとｐＨによるテアニン生産性の影響に関する図である。
【図４】基質の濃度によるテアニンの生産能の変化に関する図である。
【図５】反応液中の成分濃度が解糖系に与える影響を示した図である。
【図６】基質成分の濃度変化によるテアニン生成率の変化に関する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）を用いる事を特徴とするテアニンの製造法。
【請求項２】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）由来のγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を用いる事を特徴とするテアニンの製造法。
【請求項３】
グルタミン酸とエチルアミンの混合物にｐＨ６．０〜７．５の条件下でγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を作用させる事を特徴とする請求項１又は２記載のテアニンの製造法。
【請求項４】
２価の金属イオン存在下でγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を作用させる事を特徴とする請求項１〜３いずれか記載のテアニンの製造法。
【請求項１】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）を用いる事を特徴とするテアニンの製造法。
【請求項２】
Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−２９８ 識別の表示：ＭＭＴＧＭＳ−９）由来のγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を用いる事を特徴とするテアニンの製造法。
【請求項３】
グルタミン酸とエチルアミンの混合物にｐＨ６．０〜７．５の条件下でγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を作用させる事を特徴とする請求項１又は２記載のテアニンの製造法。
【請求項４】
２価の金属イオン存在下でγ−グルタミルメチルアミド合成酵素（ＧＭＡＳ）を作用させる事を特徴とする請求項１〜３いずれか記載のテアニンの製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２２５７０５（Ｐ２００９−２２５７０５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７３５３１（Ｐ２００８−７３５３１）
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
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