テルペン並びにその血中濃度定量方法及び薬物動態解析方法
【課題】 血液中に低濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できるテルペンの血中濃度定量方法及びこれを用いたテルペンの薬剤動態解析方法、並びにこの薬剤動態解析方法により薬物動態が解析されたテルペンを提供すること。
【解決手段】 血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法。
【解決手段】 血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルペン並びにその血中濃度定量方法及び薬物動態解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物中に含まれるトリテルペン等のテルペンは、その多くが種々の生理活性を有することが知られている。例えば、乾燥したバナバ葉を熱水抽出又はアルコール抽出して得られるバナバエキス中に含まれる、コロソリン酸及びこれと構造活性連関を有するトリテルペンについて、これまでに、ラット、マウス、イヌ及びヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの血糖値降下作用や、骨格筋細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＵＴ４の取り込み促進作用などが研究され、血糖値降下剤や、抗肥満剤として利用できる可能性が示唆されている（特許文献１）。
【０００３】
このような生理活性を有する薬物については、生体に投与されたときの薬物動態を詳細に解析することが重要である。薬物動態の解析においては、生体内に取り込まれた薬物について、吸収、分布、代謝及び排泄の過程について調べられる。そのために、投与された薬物の血中濃度推移、血中濃度半減期、排泄速度等が測定される。この薬物動態の解析によって、例えば、薬物が吸収されてから排泄されるまでの過程における、酸化、還元、加水分解や、グルクロン酸結合に代表される共役といった、薬物の構造の変化が明らかにされる。
【０００４】
そして、薬物動態を解析することで、生理活性に関係する部位や官能基、立体構造等を特定することができれば、多数の天然のテルペンの中から有用なものを見出すことが容易になるばかりでなく、アルコキシ化、配糖化、ハロゲン化、ケトン化及びジケトン化等による天然のテルペンの誘導体化や、植物培養、液培養、遺伝子操作等の手法により、天然のテルペンよりもさらに薬効を強化した薬物の開発が容易になることが期待される。
【特許文献１】特開２０００−１６９３８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のようなテルペンの薬物動態については、これまで十分に解析されていなかった。これは、テルペンの薬物動態の正確な解析のためには、ｐｇ／ｍＬ〜ｎｇ／ｍＬオーダーの極めて低い濃度領域にある血中濃度を定量する必要があるが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような従来の手法のみでは、このような低濃度で存在するテルペンの検出自体が困難であり、テルペンの血中濃度を高精度で定量できる方法が確立されていなかったためであると考えられる。
【０００６】
そこで、本発明は、血液中に低濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できるテルペンの血中濃度定量方法及びこれを用いたテルペンの薬剤動態解析方法、並びにこの薬剤動態解析方法により薬物動態が解析されたテルペンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、質量分析計を用いてテルペンを検出することにより、ＨＰＬＣ等のみでは検出できないような低濃度の血中のテルペンを検出できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法である。
【０００９】
本発明の血中濃度定量方法においては、質量分析計を採用したことにより、血液中に極めて低い濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できる。
【００１０】
上記質量分析計としては、四重極質量分析計が、血中濃度定量の精度が特に高くできるため好ましい。
【００１１】
上記の血中濃度定量方法においては、血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分に含まれるテルペンを、質量分析計で検出することが好ましい。これにより、血液中の混在成分の影響を受けにくくなり、検出感度をより高めることができる。さらに、液体クロマトグラフィーによる分画は、血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物について行うことがより好ましい。
【００１２】
上記テルペンとしては、特に、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体であることが好ましく、さらに、コロソリン酸類縁体としては、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンであることが好ましい。
【００１３】
また、上記テルペンは、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンであることが好ましい。これら植物には薬学的に有用なトリテルペンが豊富に含まれている。
【００１４】
本発明はまた、生体に投与されたテルペンの血中濃度を、上記本発明のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することを特徴とするテルペンの薬物動態解析方法である。
【００１５】
この薬物動態解析方法においては、上記本発明のテルペンの血中濃度定量方法を採用することにより、テルペンが血液中に極めて低い濃度で存在する場合でも、高精度でテルペンの薬物動態を解析することが可能である。
【００１６】
本発明はさらに、上記本発明のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするテルペンである。この本発明のテルペンは、上記本発明の薬物動態解析方法によって高精度にその薬物動態が解析されていることによって、投与量の最適化等を行うことが容易であり、経口投与等したときの安全性が高い。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、血液中に極めて低い濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できるテルペンの血中濃度定量方法及びこれを用いたテルペンの薬剤動態解析方法、並びにこの薬剤動態解析方法により薬物動態が解析されたテルペンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明においては、テルペンを含有する血液におけるテルペンの血中濃度を、質量分析計で分析して定量する。
【００１９】
質量分析計としては、四重極質量分析計が好ましい。四重極質量分析計においては、棒状の4本の電極が互いに等しい距離をとって配置されており、これら電極で囲まれた空間に、試料のイオンがイオン化室から投入される。４本の電極には直流電圧に高周波を重畳した信号が印加されており、投入されたイオンは、これら電極の間を、マシューの式に沿った振動モード振動しながら飛行するが、直流電圧の大きさと高周波の振幅の大きさに応じて、特定の質量を有するイオンのみが電極間の空間を通過することができる。そして、通過したイオンの強度をイオン検出器で検出することで、試料中に含まれる特定の質量を有する成分の量を定量することができる。
【００２０】
質量分析計においては、血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分を分析試料として分析することが好ましい。すなわち、血液を液体クロマトグラフィーで分画するとともに、分画された成分について連続的に質量分析計で分析を行うことが好ましい。このような分析は、ＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳのような、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた公知の分析装置を用いて好適に行うことができる。
【００２１】
テルペンの血中濃度の定量は、分析対象とするテルペンの分子量に相当するピークの強度と、試料中のテルペンの濃度との関係について予め検量線を作成しておき、この検量線に基づいて行う。検量線は、例えば、所定の濃度でテルペンを含有するように調製した濃度既知の試料について質量分析計による分析を行い、テルペンの分子量に相当するピークの強度と、各試料におけるテルペンの濃度との関係をプロットし、得られたプロットについて直線回帰することで、作成できる。
【００２２】
上記プロットで直線関係が得られ、検量線が作成できるような濃度領域において、テルペンの血中濃度を高精度で定量できる。具体的には、例えば、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体の場合、１ｎｇ／ｍＬ以上程度の濃度領域において、その血中濃度を定量できる。特に、１〜６０ｎｇ／ｍＬ程度の極めて低い濃度の領域については、従来の液体クロマトグラフィーのみによる分析では検出が困難であったが、質量分析計を用いることで、このような低濃度でも血中濃度を高精度で定量することが可能になった。
【００２３】
上記の液体クロマトグラフィーにおいては、ＯＤＳや、ポリマー系等の逆相系のカラムを用いることが好ましい。そして、逆相系のカラムを用いる場合、移動相としては、メタノール／水混合液系等、液体クロマトグラフィーにおいて通常用いられている溶媒の中から、分析対象とするテルペンや、カラムの種類等に応じて適宜選択して用いることができる。
【００２４】
液体クロマトグラフィーで血液を分画する際には、血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物を、液体クロマトグラフィーに注入することが好ましい。これにより、血液が除タンパクされて、液体クロマトグラフィーによる分画を、安定して高い分解能で行うことができる。上記有機溶媒としては、アセトニトリル等を好適に用いることができる。
【００２５】
本発明は、テルペンとして、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体の血中濃度の定量に有用なものである。上記コロソリン酸類縁体としては、特に、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンが好ましい。
【００２６】
あるいは、インスリン初期分泌促進剤や糖依存性インスリン初期分泌促進剤等としての活性おいて、上記のようなトリテルペンと構造活性連関部位を共有するトリテルペンの定量にも好適に用いることができる。構造活性連関部位を共有するトリテルペンは、２位及び３位のうち少なくとも一方に水酸基を有するものであり、好ましくは、更に、２９位及び３０位のうち少なくとも一方に水酸基を、２８位にカルボキシル基を有するものである。このようなトリテルペンとしては、ウルサン型ペンタサイクリックトリテルペン、オレアナン型ペンタサイクリックトリテルペン等が挙げられる。
【００２７】
ウルサン型ペンタサイクリックトリテルペンの具体例としては、デスフォンテニック酸（Ｄｅｓｆｏｎｔａｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２α,１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−１，１２−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α,１９α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１，１２−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２ξ，２０β−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２ξ,２０β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルスジエン−２８−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１α，２α，３β，１９α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１α，２α，３β，１９α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，７α，１９α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，７α，１９α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２α，３α，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２α，３α，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２α，３β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２α，３β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２β，３β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２β，３β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，７α，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，７α，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，７β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，７β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１３β，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１３β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３−トリヒドロキシ−１１−オキソ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２４−トリヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α，３β，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２７−トリヒドロキシ−２８−ウルサノイック酸（２α，３β，２７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−２８−ｕｒｓａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２４−２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２β，３β−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（１β，２β，３β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２３−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２４−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２７−ウルサントリオール（２α，３β，２７−Ｕｒｓａｎｅｔｒｉｏｌ）、１２−ウルスエン−１β，２α，３β，１１α，２０β−ペントール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α，２０β−ｐｅｎｔｏｌ）、１２−ウルスエン−１β，２α，３β，１１α−テトロール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−ウルスエン−２α，３β，１１α，２０β−テトロール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−２α，３β，１１α，２０β−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−ウルスエン−２α，３β，１１α−トリオール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）等が挙げられる。
【００２８】
オレアナン型ペンタサイクリックトリテルペンの具体例としては、２α，３β−ジヒドロキシ−１２，１８−オレアナジエン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，１８−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８，３０−ジオイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８，３０−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１３（１８）−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１３（１８）−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２β，１３β−エポキシ−２α，３β，２１β，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１２β，１３β−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，２１β，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１３，２８−エポキシ−２α，３β，１６α，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１３，２８−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，１６α，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１３β，２８−エポキシ−２α，３β，１６α，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１３β，２８−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，１６α，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２−オレアネン−２α，３α−ジオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β−ジオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β−ｄｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２α，３α−ジオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２β，３β−ジオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β−ｄｉｏｌ）、１８−オレアネン−２α，３β−ジオール（１８−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β−ｄｉｏｌ）、１８−オレアネン−２α，３α−ジオール（１８−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１３−オレアネン−２α，３β，１６β，２１β，２２α，２８−ヘキソール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１６β，２１β，２２α，２８−ｈｅｘｏｌ）、１２−オレアネン−１β，２α，３β，１１α−テトロール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−オレアネン−２β，３β，２３，２８−テトロール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β，２３，２８−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β，１１α−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）、１２−オレアネン−２β，３β，２８−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β，２８−ｔｒｉｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β，２３−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，２３−ｔｒｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２α，３β，１１α−トリオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）、２β，３β，６β，１６α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６β，１６α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β，２３−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６β，２１β，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３，２４−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６α，２３，２４−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１３β，１６α−テトラヒドロキシ−２３，２８−オレアナンジオイック酸（２β，３β，１３β，１６α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−２３，２８−ｏｌｅａｎａｎｅｄｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６β，２１β−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２２β，２７−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β，２２β，２７−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６β，２１β−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２１β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２１β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３，２４−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２３，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２３−トリヒドロキシ−５，１２−オレアナジエン−２８−オイック酸（２β，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−５，１２−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１１，１３（１８）−オレアナジエン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１，１３（１８）−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１３β−トリヒドロキシ−２８−オレアノール酸（２α，３β，１３β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−２８−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１８β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１８β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２３−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８，３０−ジオイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８，３０−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２７−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，２７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１８β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１８β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２９−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２９−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２１β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２１β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２３−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，３０−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，３０−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００２９】
さらには、上記の各種トリテルペンの水酸基をハロゲン化炭化水素（ＣＨ３Ｂｒ，ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＢｒ等）と反応させる等して得られるエーテル体、２位及び／又は３位の水酸基を選択的に酸化して得られるケトン体若しくはジケトン体等の誘導体についても、本発明の血中濃度定量方法を適用可能である。
【００３０】
本発明また、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンの血中濃度の定量に有用なものである。さらに、これらの植物を用いた植物培養、遺伝子操作、半合成などから得られたトリテルペンについても本発明の適用が可能である。
【００３１】
血中濃度の定量や薬物動態の解析のために用いるテルペンは、上記の植物等から抽出して得ることができる。以下に、バナバ葉からトリテルペンを得る場合についての好適な前処理及び抽出の方法について説明する。
【００３２】
バナバからトリテルペンを抽出する前に、原料となるバナバについて、熱水抽出等の前処理を行う。原料となるバナバ葉は、バナバから採取されたままの状態でも抽出は可能であるが、効率的に抽出するために、前処理の際に細かく刻んでおくことが好ましい。この場合、刻む程度はその後の抽出工程の設備に応じて適宜決定すればよいが、例えば、１ｍｍ角以上程度のサイズにバナバ葉を刻むことが望ましい。１ｍｍ角よりも小さく刻むと、抽出工程において目詰まりを起こしやすくなる傾向にある。
【００３３】
刻んだバナバ葉を、まず、バナバ葉１ｋｇに対し２リッター以上の水に浸漬する。この際、水の温度を１０〜６０℃として、２４時間以上浸漬させる操作を、水を入れ替えながら３回以上繰り返す。続いて、熱湯への浸漬や、煮沸、蒸気との接触等により、３〜５回水を入れ替えながら繰り返し熱水抽出する。熱水抽出は、圧力釜等を用いて１〜３ａｔｍに加圧しながら、１００℃以上の温度で行うことが好ましく、抽出時間は３〜１０分程度がよい。抽出時間が長いと、前処理の段階でコロソリン酸が失われてしまう場合がある。
【００３４】
熱水抽出の後、更に、水５０％アルコール５０％の溶媒を用いて、溶媒の温度を好ましくは０〜１００℃として抽出する。
【００３５】
以上の前処理工程を経たバナバ葉を、乾燥工程において、天日若しくは乾燥機にて乾燥する。このとき、遠心分離機でバナバに付着した水分を取り除いた後、乾燥することが望ましい。乾燥は３０〜６０℃の温風、若しくは冷気風であるが出来るだけ湿度の低い空気風を吹き付けて行う。
【００３６】
次に、乾燥したバナバ葉から、ｎ−ヘキサンで一時間、精製水で一時間、熱環流抽出を行った後、エタノールで一時間熱還流抽出を行う。抽出物をろ過し、減圧濃縮を行いさらに濃縮乾固させる。
【００３７】
主としてエタノール抽出物から、白色のエキスが得られる。このエキスには、コロソリン酸、マスリン酸、トリメンティック酸、ウルソール酸、オレアノール酸、α―アミリン酸、β―アミリン酸、アシアティック酸、１８β―グリチルレチン酸、タンニン類、葉緑素類、ヘミセルロースなどが含まれる。そして、エキス中、コロソリン酸は、３〜５０重量％程度含まれる。エキスはペースト状の液体か、又は粉末状の固体である。エキスは、室温若しくは冷蔵庫で、遮光しながら乾燥状態で保管することが望ましい。
【００３８】
上記エキスを、更に精製することで、コロソリン酸等を単離することができる。例えば、エキスを水で懸濁した懸濁液に、へキサンまたはエーテルを加えて吸引ろ過を行い、可溶水画分、可溶有機溶媒画分および不溶画分に分ける。そして、不溶画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：ジクロロメタン／メタノール混合溶媒）で、コロソリン酸を含有するフラクションを得、これをイオン交換樹脂に通した後、更に、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣ（移動相：８５％メタノール／０．０５％トリフルオロ酢酸、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ）で分取して、コロソリン酸を得ることができる。
【００３９】
本発明の薬物動態解析方法においては、生体に投与されたテルペンの血中濃度を、上記のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することで、テルペンの薬物動態を解析する。例えば、テルペンを投与された生体の血液におけるテルペンの血中濃度を、テルペンの生体への投与後、３０〜６０分程度の間隔をおいて定量することで、テルペンの血液中への吸収等について詳細に解析することが可能である。本発明の薬物動態解析方法は、特に、生体にテルペンを経口投与した場合の薬物動態に対して好適である。
【００４０】
この薬物動態解析方法は、特に、ヒト、イヌ、ネズミ等の哺乳類に投与したテルペンの薬物動態解析について好適に適用することができる。
【００４１】
例えば、トリテルペンの１種であるコロソリン酸（分子式：Ｃ３０Ｈ４８O４、分子量：４７２）について、上記の方法でイヌに投与したときの薬物動態を解析したところ、生体に投与されたコロソリン酸が、修飾反応を受けることなく血液中に取り込まれていることが初めて明らかとなった。
【００４２】
本発明のテルペンは、上記のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするものである。この本発明のテルペンは、例えば、上記本発明の薬物動態解析方法によって高精度にその薬物動態が解析されていることによって、投与量の最適化等を行うことが容易であり、経口投与等したときの安全性が高い。そして、本発明のテルペンは、例えば、インスリン初期分泌促進剤、糖依存性インスリン初期分泌促進剤として、抗糖尿病、抗肥満剤、中性脂肪抑制、コレステロール値低下などに好適に用いることができる。
【００４３】
テルペンの使用方法は特に限定されるものではなく、栄養補助食品や、飲料、麺類、乾燥食品、菓子類、パン、酒類、油脂、調味料等の一般食品飲料へ添加してもよいし、薬品として粉末、錠剤、液体、ペースト状の形態や、噴霧器、タバコなどで気化された状態で用いてもよい。
【００４４】
テルペンが水溶性であることが求められる場合は、配糖体等の水溶性の誘導体に誘導体化してもよいし、植物から抽出されたときに混在するタンニン類、繊維素、葉緑素等との混合物の状態で用いてもよい。あるいは、水、アルコール等を溶媒とするテルペンの溶液を、デンプン、難消化性デキストリン等と混合した混合物から、溶媒を除去して得られる固形物の状態で用いてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００４６】
＜コロソリン酸標品のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析＞
液体クロマトグラフィー／タンデム四重極質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）である、アプライバイオシステムズ社（米国）製の「ＡＰＩ３０００（製品名）」を用いて、トリテルペンの１種でるコロソリン酸標品の分析を行った。
【００４７】
まず、コロソリン酸のアセトニトリル／ギ酸溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）を試料として、これを上記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入し、コロソリン酸のＭＳスペクトル（図１）を得た。このとき、イオン化はエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）で行った。図１に示すように、コロソリン酸の分子量に相当するｍ／ｚ＝４７２の位置にピークが認められたことから、このＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置によって、コロソリン酸の検出が可能であることが確認された。
【００４８】
また、同様の分析を、コロソリン酸濃度が１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの試料についても行い、得られたＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ＝４７２のピーク（以下、「親ピーク」という。）のピーク強度をコロソリン酸濃度に対してプロットし、このプロットから直線回帰することによって、コロソリン酸の検量線が得られた。図２に得られたプロット及び検量線を示す。このことから、親ピークの強度を測定することによって、コロソリン酸の濃度の定量が可能であることが確認された。
【００４９】
＜血液中のコロソリン酸の検量線作成＞
イヌ（ビーグル犬）から採取した血液に、１０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにコロソリン酸を加え、この血液５００μＬを遠心分離機で遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）して、血清を得た。続いて、この血清１００μＬにアセトニトリルを４００μＬ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）して、除タンパクを行った。次に、アセトニトリル層に窒素ガス流を吹き付けて濃縮した後、酢酸エチル３００μＬで液液抽出し、酢酸エチル層を乾固させた。乾固後に残った固形物を溶出溶媒（９５％メタノール水）１００μＬに溶かした溶液を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用の試料とした。
【００５０】
上記で得た試料、及び、コロソリン酸の濃度のみ異なるように同様に調製した他の試料について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析を行い、図３に示す検量線を得た。この結果から、図３の検量線に基づいて、血液中のコロソリン酸について、１〜１００ｎｇ／ｍＬ程度の濃度の範囲において、その血中濃度が定量可能であることが確認された。
【００５１】
＜コロソリン酸血中濃度の経時変化＞
（実施例１）
前日より絶食させたイヌ（ビーグル犬）に、２０ｍｇ／ｋｇのコロソリン酸及び２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、投与前、投与後３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分及び２４０分後のそれぞれの時点においてイヌから採取した血液について、上述の血液中のコロソリン酸の検量線作成の場合と同様にしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析して、血中濃度の経時的を測定した。
【００５２】
図４に、上記測定結果を示す。図４において、（ａ）は投与前、（ｂ）は３０分後、（ｄ）は６０分後、（ｅ）は９０分後、（ｆ）は１２０分後、（ｇ）は１８０分後、（ｈ）は２４０分後に得たグラフである。なお、図４中、横軸はＬＣ部分における保持時間を示し、縦軸はＭＳにおけるｍ／ｚ＝４７２のピークのピーク強度を示す。図４に示すように、コロソリン酸のピーク（リテンションタイム１２分付近）は、（ｃ）の投与後９０分後から血中に検出され、（ｆ）の１８０分後に最大となった後減少に転じた。コロソリン酸の血中濃度の最大値は、２０μｇ／ｍＬであった。
【００５３】
以上の結果より、コロソリン酸のようなトリテルペンは、生体に投与された後、分解したり、修飾されたりすることなく、そのまま体内に取り込まれることがわかった。このことは、ペプチドをはじめとするタンパク質系の糖依存性インスリン初期分泌促進剤のほとんどが消化分解されてしまうのとは対照的である。コロソリン酸の分子量は４７２であるが、この程度の分子量の化合物の場合、分解等されずにそのまま吸収されるか否かの予想は一般に困難であるが、上記のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析することで、上記の様なコロソリン酸の薬物動態が初めて確認できた。
【００５４】
（比較例１）
実施例１と同様にしてイヌから採取した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）して得た血清２ｍＬを、マイクロチューブに２００μＬずつ取り分け、それぞれに４倍量（８００μＬ）のアセトニトリルを加えて除タンパクし、遠心分離（１５０００ＲＰＭ、５分、４℃）後、上澄みを一本のサンプル瓶内に集め、アセトニトリルを全て蒸発させて、濃縮物を得た。続いて、この濃縮物を５００μＬの９５体積％メタノール水（ＨＰＬＣの展開溶媒と同様のもの）に溶かて調製した試料について、ＨＰＬＣによる分析を行った。なお、ＨＰＬＣによる分析は以下の条件で行った。
・カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０（ポリマー系） ６Ｄ（２５０×１０．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
・流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ．
・検出：ＵＶ吸収（２１０ｎｍ）
【００５５】
しかし、コロソリン酸投与後の血液から得た何れの試料についても、コロソリン酸に相当するピーク（リテンションタイム１２分付近）は認められなかった。
【００５６】
以上の結果から、比較例１のようにＨＰＬＣのみではコロソリン酸の血中濃度を定量することが不可能で、その薬物動態を全く解析できないのに対して、実施例１のように質量分析計を用いて分析することで、生体に投与されたコロソリン酸の血中濃度を高精度で定量し、その薬物動態を解析することが可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】コロソリン酸のＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２】コロソリン酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析におけるピーク面積と濃度との関係を表すグラフである。
【図３】コロソリン酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析におけるピーク面積と濃度との関係を表すグラフである。
【図４】実施例１における、コロソリン酸に由来するピーク強度の経時変化を表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルペン並びにその血中濃度定量方法及び薬物動態解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物中に含まれるトリテルペン等のテルペンは、その多くが種々の生理活性を有することが知られている。例えば、乾燥したバナバ葉を熱水抽出又はアルコール抽出して得られるバナバエキス中に含まれる、コロソリン酸及びこれと構造活性連関を有するトリテルペンについて、これまでに、ラット、マウス、イヌ及びヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの血糖値降下作用や、骨格筋細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＵＴ４の取り込み促進作用などが研究され、血糖値降下剤や、抗肥満剤として利用できる可能性が示唆されている（特許文献１）。
【０００３】
このような生理活性を有する薬物については、生体に投与されたときの薬物動態を詳細に解析することが重要である。薬物動態の解析においては、生体内に取り込まれた薬物について、吸収、分布、代謝及び排泄の過程について調べられる。そのために、投与された薬物の血中濃度推移、血中濃度半減期、排泄速度等が測定される。この薬物動態の解析によって、例えば、薬物が吸収されてから排泄されるまでの過程における、酸化、還元、加水分解や、グルクロン酸結合に代表される共役といった、薬物の構造の変化が明らかにされる。
【０００４】
そして、薬物動態を解析することで、生理活性に関係する部位や官能基、立体構造等を特定することができれば、多数の天然のテルペンの中から有用なものを見出すことが容易になるばかりでなく、アルコキシ化、配糖化、ハロゲン化、ケトン化及びジケトン化等による天然のテルペンの誘導体化や、植物培養、液培養、遺伝子操作等の手法により、天然のテルペンよりもさらに薬効を強化した薬物の開発が容易になることが期待される。
【特許文献１】特開２０００−１６９３８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のようなテルペンの薬物動態については、これまで十分に解析されていなかった。これは、テルペンの薬物動態の正確な解析のためには、ｐｇ／ｍＬ〜ｎｇ／ｍＬオーダーの極めて低い濃度領域にある血中濃度を定量する必要があるが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような従来の手法のみでは、このような低濃度で存在するテルペンの検出自体が困難であり、テルペンの血中濃度を高精度で定量できる方法が確立されていなかったためであると考えられる。
【０００６】
そこで、本発明は、血液中に低濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できるテルペンの血中濃度定量方法及びこれを用いたテルペンの薬剤動態解析方法、並びにこの薬剤動態解析方法により薬物動態が解析されたテルペンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、質量分析計を用いてテルペンを検出することにより、ＨＰＬＣ等のみでは検出できないような低濃度の血中のテルペンを検出できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法である。
【０００９】
本発明の血中濃度定量方法においては、質量分析計を採用したことにより、血液中に極めて低い濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できる。
【００１０】
上記質量分析計としては、四重極質量分析計が、血中濃度定量の精度が特に高くできるため好ましい。
【００１１】
上記の血中濃度定量方法においては、血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分に含まれるテルペンを、質量分析計で検出することが好ましい。これにより、血液中の混在成分の影響を受けにくくなり、検出感度をより高めることができる。さらに、液体クロマトグラフィーによる分画は、血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物について行うことがより好ましい。
【００１２】
上記テルペンとしては、特に、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体であることが好ましく、さらに、コロソリン酸類縁体としては、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンであることが好ましい。
【００１３】
また、上記テルペンは、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンであることが好ましい。これら植物には薬学的に有用なトリテルペンが豊富に含まれている。
【００１４】
本発明はまた、生体に投与されたテルペンの血中濃度を、上記本発明のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することを特徴とするテルペンの薬物動態解析方法である。
【００１５】
この薬物動態解析方法においては、上記本発明のテルペンの血中濃度定量方法を採用することにより、テルペンが血液中に極めて低い濃度で存在する場合でも、高精度でテルペンの薬物動態を解析することが可能である。
【００１６】
本発明はさらに、上記本発明のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするテルペンである。この本発明のテルペンは、上記本発明の薬物動態解析方法によって高精度にその薬物動態が解析されていることによって、投与量の最適化等を行うことが容易であり、経口投与等したときの安全性が高い。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、血液中に極めて低い濃度で存在するテルペンの血中濃度を高精度で定量できるテルペンの血中濃度定量方法及びこれを用いたテルペンの薬剤動態解析方法、並びにこの薬剤動態解析方法により薬物動態が解析されたテルペンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明においては、テルペンを含有する血液におけるテルペンの血中濃度を、質量分析計で分析して定量する。
【００１９】
質量分析計としては、四重極質量分析計が好ましい。四重極質量分析計においては、棒状の4本の電極が互いに等しい距離をとって配置されており、これら電極で囲まれた空間に、試料のイオンがイオン化室から投入される。４本の電極には直流電圧に高周波を重畳した信号が印加されており、投入されたイオンは、これら電極の間を、マシューの式に沿った振動モード振動しながら飛行するが、直流電圧の大きさと高周波の振幅の大きさに応じて、特定の質量を有するイオンのみが電極間の空間を通過することができる。そして、通過したイオンの強度をイオン検出器で検出することで、試料中に含まれる特定の質量を有する成分の量を定量することができる。
【００２０】
質量分析計においては、血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分を分析試料として分析することが好ましい。すなわち、血液を液体クロマトグラフィーで分画するとともに、分画された成分について連続的に質量分析計で分析を行うことが好ましい。このような分析は、ＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳのような、液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合わせた公知の分析装置を用いて好適に行うことができる。
【００２１】
テルペンの血中濃度の定量は、分析対象とするテルペンの分子量に相当するピークの強度と、試料中のテルペンの濃度との関係について予め検量線を作成しておき、この検量線に基づいて行う。検量線は、例えば、所定の濃度でテルペンを含有するように調製した濃度既知の試料について質量分析計による分析を行い、テルペンの分子量に相当するピークの強度と、各試料におけるテルペンの濃度との関係をプロットし、得られたプロットについて直線回帰することで、作成できる。
【００２２】
上記プロットで直線関係が得られ、検量線が作成できるような濃度領域において、テルペンの血中濃度を高精度で定量できる。具体的には、例えば、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体の場合、１ｎｇ／ｍＬ以上程度の濃度領域において、その血中濃度を定量できる。特に、１〜６０ｎｇ／ｍＬ程度の極めて低い濃度の領域については、従来の液体クロマトグラフィーのみによる分析では検出が困難であったが、質量分析計を用いることで、このような低濃度でも血中濃度を高精度で定量することが可能になった。
【００２３】
上記の液体クロマトグラフィーにおいては、ＯＤＳや、ポリマー系等の逆相系のカラムを用いることが好ましい。そして、逆相系のカラムを用いる場合、移動相としては、メタノール／水混合液系等、液体クロマトグラフィーにおいて通常用いられている溶媒の中から、分析対象とするテルペンや、カラムの種類等に応じて適宜選択して用いることができる。
【００２４】
液体クロマトグラフィーで血液を分画する際には、血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物を、液体クロマトグラフィーに注入することが好ましい。これにより、血液が除タンパクされて、液体クロマトグラフィーによる分画を、安定して高い分解能で行うことができる。上記有機溶媒としては、アセトニトリル等を好適に用いることができる。
【００２５】
本発明は、テルペンとして、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体の血中濃度の定量に有用なものである。上記コロソリン酸類縁体としては、特に、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンが好ましい。
【００２６】
あるいは、インスリン初期分泌促進剤や糖依存性インスリン初期分泌促進剤等としての活性おいて、上記のようなトリテルペンと構造活性連関部位を共有するトリテルペンの定量にも好適に用いることができる。構造活性連関部位を共有するトリテルペンは、２位及び３位のうち少なくとも一方に水酸基を有するものであり、好ましくは、更に、２９位及び３０位のうち少なくとも一方に水酸基を、２８位にカルボキシル基を有するものである。このようなトリテルペンとしては、ウルサン型ペンタサイクリックトリテルペン、オレアナン型ペンタサイクリックトリテルペン等が挙げられる。
【００２７】
ウルサン型ペンタサイクリックトリテルペンの具体例としては、デスフォンテニック酸（Ｄｅｓｆｏｎｔａｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２α,１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−１，１２−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α,１９α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１，１２−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２ξ，２０β−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２ξ,２０β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルスジエン−２８−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１α，２α，３β，１９α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１α，２α，３β，１９α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，７α，１９α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，７α，１９α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２α，３α，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２α，３α，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２α，３β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２α，３β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２β，３β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（１β，２β，３β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，７α，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，７α，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，７β，１９α−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，７β，１９α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１３β，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１３β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３−トリヒドロキシ−１１−オキソ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２４−トリヒドロキシ−１２，２０（３０）−ウルサジエン−２８−オイック酸（２α，３β，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，２０（３０）−ｕｒｓａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２７−トリヒドロキシ−２８−ウルサノイック酸（２α，３β，２７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−２８−ｕｒｓａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２４−２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、１β，２β，３β−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２３−オイック酸（１β，２β，３β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，６β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２３−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２４−トリヒドロキシ−１２−ウルスエン−２８−オイック酸（２α，３β，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｕｒｓｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２７−ウルサントリオール（２α，３β，２７−Ｕｒｓａｎｅｔｒｉｏｌ）、１２−ウルスエン−１β，２α，３β，１１α，２０β−ペントール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α，２０β−ｐｅｎｔｏｌ）、１２−ウルスエン−１β，２α，３β，１１α−テトロール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−ウルスエン−２α，３β，１１α，２０β−テトロール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−２α，３β，１１α，２０β−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−ウルスエン−２α，３β，１１α−トリオール（１２−Ｕｒｓｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）等が挙げられる。
【００２８】
オレアナン型ペンタサイクリックトリテルペンの具体例としては、２α，３β−ジヒドロキシ−１２，１８−オレアナジエン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２，１８−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８，３０−ジオイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８，３０−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２３−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β−ジヒドロキシ−１３（１８）−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１３（１８）−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２β，１３β−エポキシ−２α，３β，２１β，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１２β，１３β−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，２１β，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１３，２８−エポキシ−２α，３β，１６α，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１３，２８−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，１６α，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１３β，２８−エポキシ−２α，３β，１６α，２２β−テトラヒドロキシ−３０−オレアノール酸（１３β，２８−Ｅｐｏｘｙ−２α，３β，１６α，２２β−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−３０−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１２−オレアネン−２α，３α−ジオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β−ジオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β−ｄｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２α，３α−ジオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２β，３β−ジオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β−ｄｉｏｌ）、１８−オレアネン−２α，３β−ジオール（１８−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β−ｄｉｏｌ）、１８−オレアネン−２α，３α−ジオール（１８−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３α−ｄｉｏｌ）、１３−オレアネン−２α，３β，１６β，２１β，２２α，２８−ヘキソール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１６β，２１β，２２α，２８−ｈｅｘｏｌ）、１２−オレアネン−１β，２α，３β，１１α−テトロール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−１β，２α，３β，１１α−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−オレアネン−２β，３β，２３，２８−テトロール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β，２３，２８−ｔｅｔｒｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β，１１α−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）、１２−オレアネン−２β，３β，２８−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２β，３β，２８−ｔｒｉｏｌ）、１２−オレアネン−２α，３β，２３−トリオール（１２−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，２３−ｔｒｉｏｌ）、１３（１８）−オレアネン−２α，３β，１１α−トリオール（１３（１８）−Ｏｌｅａｎｅｎｅ−２α，３β，１１α−ｔｒｉｏｌ）、２β，３β，６β，１６α，２３−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６β，１６α，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β，２３−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６β，２１β，２３−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３，２４−ペンタヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６α，２３，２４−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１３β，１６α−テトラヒドロキシ−２３，２８−オレアナンジオイック酸（２β，３β，１３β，１６α−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−２３，２８−ｏｌｅａｎａｎｅｄｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６β，２１β−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２２β，２７−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β，２２β，２７−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，６β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，６β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６β，２１β−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６β，２１β−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２β，３β，１６α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α，２４−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２１β，２３−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２１β，２３−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２３，２４−テトラヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２３，２４−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２３−トリヒドロキシ−５，１２−オレアナジエン−２８−オイック酸（２β，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−５，１２−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１１，１３（１８）−オレアナジエン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１１，１３（１８）−ｏｌｅａｎａｄｉｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１３β−トリヒドロキシ−２８−オレアノール酸（２α，３β，１３β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−２８−ｏｌｅａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，１６α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２β，３β，１６α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１８β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１８β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２４，２８−ジオイック酸（２α，３β，１９β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２４，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２３−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８，３０−ジオイック酸（２α，３β，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８，３０−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２β，３β，２７−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２３，２８−ジオイック酸（２α，３β，２７−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２３，２８−ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１８β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１８β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２９−オイック酸（２α，３β，１９α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２９−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３β，２１β−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３β，２１β−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２３−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，２３−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，２４−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，２４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）、２α，３α，３０−トリヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸（２α，３α，３０−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｏｌｅａｎｅｎｅ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００２９】
さらには、上記の各種トリテルペンの水酸基をハロゲン化炭化水素（ＣＨ３Ｂｒ，ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＢｒ等）と反応させる等して得られるエーテル体、２位及び／又は３位の水酸基を選択的に酸化して得られるケトン体若しくはジケトン体等の誘導体についても、本発明の血中濃度定量方法を適用可能である。
【００３０】
本発明また、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンの血中濃度の定量に有用なものである。さらに、これらの植物を用いた植物培養、遺伝子操作、半合成などから得られたトリテルペンについても本発明の適用が可能である。
【００３１】
血中濃度の定量や薬物動態の解析のために用いるテルペンは、上記の植物等から抽出して得ることができる。以下に、バナバ葉からトリテルペンを得る場合についての好適な前処理及び抽出の方法について説明する。
【００３２】
バナバからトリテルペンを抽出する前に、原料となるバナバについて、熱水抽出等の前処理を行う。原料となるバナバ葉は、バナバから採取されたままの状態でも抽出は可能であるが、効率的に抽出するために、前処理の際に細かく刻んでおくことが好ましい。この場合、刻む程度はその後の抽出工程の設備に応じて適宜決定すればよいが、例えば、１ｍｍ角以上程度のサイズにバナバ葉を刻むことが望ましい。１ｍｍ角よりも小さく刻むと、抽出工程において目詰まりを起こしやすくなる傾向にある。
【００３３】
刻んだバナバ葉を、まず、バナバ葉１ｋｇに対し２リッター以上の水に浸漬する。この際、水の温度を１０〜６０℃として、２４時間以上浸漬させる操作を、水を入れ替えながら３回以上繰り返す。続いて、熱湯への浸漬や、煮沸、蒸気との接触等により、３〜５回水を入れ替えながら繰り返し熱水抽出する。熱水抽出は、圧力釜等を用いて１〜３ａｔｍに加圧しながら、１００℃以上の温度で行うことが好ましく、抽出時間は３〜１０分程度がよい。抽出時間が長いと、前処理の段階でコロソリン酸が失われてしまう場合がある。
【００３４】
熱水抽出の後、更に、水５０％アルコール５０％の溶媒を用いて、溶媒の温度を好ましくは０〜１００℃として抽出する。
【００３５】
以上の前処理工程を経たバナバ葉を、乾燥工程において、天日若しくは乾燥機にて乾燥する。このとき、遠心分離機でバナバに付着した水分を取り除いた後、乾燥することが望ましい。乾燥は３０〜６０℃の温風、若しくは冷気風であるが出来るだけ湿度の低い空気風を吹き付けて行う。
【００３６】
次に、乾燥したバナバ葉から、ｎ−ヘキサンで一時間、精製水で一時間、熱環流抽出を行った後、エタノールで一時間熱還流抽出を行う。抽出物をろ過し、減圧濃縮を行いさらに濃縮乾固させる。
【００３７】
主としてエタノール抽出物から、白色のエキスが得られる。このエキスには、コロソリン酸、マスリン酸、トリメンティック酸、ウルソール酸、オレアノール酸、α―アミリン酸、β―アミリン酸、アシアティック酸、１８β―グリチルレチン酸、タンニン類、葉緑素類、ヘミセルロースなどが含まれる。そして、エキス中、コロソリン酸は、３〜５０重量％程度含まれる。エキスはペースト状の液体か、又は粉末状の固体である。エキスは、室温若しくは冷蔵庫で、遮光しながら乾燥状態で保管することが望ましい。
【００３８】
上記エキスを、更に精製することで、コロソリン酸等を単離することができる。例えば、エキスを水で懸濁した懸濁液に、へキサンまたはエーテルを加えて吸引ろ過を行い、可溶水画分、可溶有機溶媒画分および不溶画分に分ける。そして、不溶画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：ジクロロメタン／メタノール混合溶媒）で、コロソリン酸を含有するフラクションを得、これをイオン交換樹脂に通した後、更に、ＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣ（移動相：８５％メタノール／０．０５％トリフルオロ酢酸、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍ）で分取して、コロソリン酸を得ることができる。
【００３９】
本発明の薬物動態解析方法においては、生体に投与されたテルペンの血中濃度を、上記のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することで、テルペンの薬物動態を解析する。例えば、テルペンを投与された生体の血液におけるテルペンの血中濃度を、テルペンの生体への投与後、３０〜６０分程度の間隔をおいて定量することで、テルペンの血液中への吸収等について詳細に解析することが可能である。本発明の薬物動態解析方法は、特に、生体にテルペンを経口投与した場合の薬物動態に対して好適である。
【００４０】
この薬物動態解析方法は、特に、ヒト、イヌ、ネズミ等の哺乳類に投与したテルペンの薬物動態解析について好適に適用することができる。
【００４１】
例えば、トリテルペンの１種であるコロソリン酸（分子式：Ｃ３０Ｈ４８O４、分子量：４７２）について、上記の方法でイヌに投与したときの薬物動態を解析したところ、生体に投与されたコロソリン酸が、修飾反応を受けることなく血液中に取り込まれていることが初めて明らかとなった。
【００４２】
本発明のテルペンは、上記のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするものである。この本発明のテルペンは、例えば、上記本発明の薬物動態解析方法によって高精度にその薬物動態が解析されていることによって、投与量の最適化等を行うことが容易であり、経口投与等したときの安全性が高い。そして、本発明のテルペンは、例えば、インスリン初期分泌促進剤、糖依存性インスリン初期分泌促進剤として、抗糖尿病、抗肥満剤、中性脂肪抑制、コレステロール値低下などに好適に用いることができる。
【００４３】
テルペンの使用方法は特に限定されるものではなく、栄養補助食品や、飲料、麺類、乾燥食品、菓子類、パン、酒類、油脂、調味料等の一般食品飲料へ添加してもよいし、薬品として粉末、錠剤、液体、ペースト状の形態や、噴霧器、タバコなどで気化された状態で用いてもよい。
【００４４】
テルペンが水溶性であることが求められる場合は、配糖体等の水溶性の誘導体に誘導体化してもよいし、植物から抽出されたときに混在するタンニン類、繊維素、葉緑素等との混合物の状態で用いてもよい。あるいは、水、アルコール等を溶媒とするテルペンの溶液を、デンプン、難消化性デキストリン等と混合した混合物から、溶媒を除去して得られる固形物の状態で用いてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００４６】
＜コロソリン酸標品のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析＞
液体クロマトグラフィー／タンデム四重極質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）である、アプライバイオシステムズ社（米国）製の「ＡＰＩ３０００（製品名）」を用いて、トリテルペンの１種でるコロソリン酸標品の分析を行った。
【００４７】
まず、コロソリン酸のアセトニトリル／ギ酸溶液（１００ｎｇ／ｍＬ）を試料として、これを上記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置に注入し、コロソリン酸のＭＳスペクトル（図１）を得た。このとき、イオン化はエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）で行った。図１に示すように、コロソリン酸の分子量に相当するｍ／ｚ＝４７２の位置にピークが認められたことから、このＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置によって、コロソリン酸の検出が可能であることが確認された。
【００４８】
また、同様の分析を、コロソリン酸濃度が１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの試料についても行い、得られたＭＳスペクトルにおけるｍ／ｚ＝４７２のピーク（以下、「親ピーク」という。）のピーク強度をコロソリン酸濃度に対してプロットし、このプロットから直線回帰することによって、コロソリン酸の検量線が得られた。図２に得られたプロット及び検量線を示す。このことから、親ピークの強度を測定することによって、コロソリン酸の濃度の定量が可能であることが確認された。
【００４９】
＜血液中のコロソリン酸の検量線作成＞
イヌ（ビーグル犬）から採取した血液に、１０ｎｇ／ｍＬの濃度になるようにコロソリン酸を加え、この血液５００μＬを遠心分離機で遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）して、血清を得た。続いて、この血清１００μＬにアセトニトリルを４００μＬ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）して、除タンパクを行った。次に、アセトニトリル層に窒素ガス流を吹き付けて濃縮した後、酢酸エチル３００μＬで液液抽出し、酢酸エチル層を乾固させた。乾固後に残った固形物を溶出溶媒（９５％メタノール水）１００μＬに溶かした溶液を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用の試料とした。
【００５０】
上記で得た試料、及び、コロソリン酸の濃度のみ異なるように同様に調製した他の試料について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析を行い、図３に示す検量線を得た。この結果から、図３の検量線に基づいて、血液中のコロソリン酸について、１〜１００ｎｇ／ｍＬ程度の濃度の範囲において、その血中濃度が定量可能であることが確認された。
【００５１】
＜コロソリン酸血中濃度の経時変化＞
（実施例１）
前日より絶食させたイヌ（ビーグル犬）に、２０ｍｇ／ｋｇのコロソリン酸及び２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口投与し、投与前、投与後３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分及び２４０分後のそれぞれの時点においてイヌから採取した血液について、上述の血液中のコロソリン酸の検量線作成の場合と同様にしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析して、血中濃度の経時的を測定した。
【００５２】
図４に、上記測定結果を示す。図４において、（ａ）は投与前、（ｂ）は３０分後、（ｄ）は６０分後、（ｅ）は９０分後、（ｆ）は１２０分後、（ｇ）は１８０分後、（ｈ）は２４０分後に得たグラフである。なお、図４中、横軸はＬＣ部分における保持時間を示し、縦軸はＭＳにおけるｍ／ｚ＝４７２のピークのピーク強度を示す。図４に示すように、コロソリン酸のピーク（リテンションタイム１２分付近）は、（ｃ）の投与後９０分後から血中に検出され、（ｆ）の１８０分後に最大となった後減少に転じた。コロソリン酸の血中濃度の最大値は、２０μｇ／ｍＬであった。
【００５３】
以上の結果より、コロソリン酸のようなトリテルペンは、生体に投与された後、分解したり、修飾されたりすることなく、そのまま体内に取り込まれることがわかった。このことは、ペプチドをはじめとするタンパク質系の糖依存性インスリン初期分泌促進剤のほとんどが消化分解されてしまうのとは対照的である。コロソリン酸の分子量は４７２であるが、この程度の分子量の化合物の場合、分解等されずにそのまま吸収されるか否かの予想は一般に困難であるが、上記のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析することで、上記の様なコロソリン酸の薬物動態が初めて確認できた。
【００５４】
（比較例１）
実施例１と同様にしてイヌから採取した血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分）して得た血清２ｍＬを、マイクロチューブに２００μＬずつ取り分け、それぞれに４倍量（８００μＬ）のアセトニトリルを加えて除タンパクし、遠心分離（１５０００ＲＰＭ、５分、４℃）後、上澄みを一本のサンプル瓶内に集め、アセトニトリルを全て蒸発させて、濃縮物を得た。続いて、この濃縮物を５００μＬの９５体積％メタノール水（ＨＰＬＣの展開溶媒と同様のもの）に溶かて調製した試料について、ＨＰＬＣによる分析を行った。なお、ＨＰＬＣによる分析は以下の条件で行った。
・カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０（ポリマー系） ６Ｄ（２５０×１０．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）
・流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ．
・検出：ＵＶ吸収（２１０ｎｍ）
【００５５】
しかし、コロソリン酸投与後の血液から得た何れの試料についても、コロソリン酸に相当するピーク（リテンションタイム１２分付近）は認められなかった。
【００５６】
以上の結果から、比較例１のようにＨＰＬＣのみではコロソリン酸の血中濃度を定量することが不可能で、その薬物動態を全く解析できないのに対して、実施例１のように質量分析計を用いて分析することで、生体に投与されたコロソリン酸の血中濃度を高精度で定量し、その薬物動態を解析することが可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】コロソリン酸のＭＳスペクトルを示すグラフである。
【図２】コロソリン酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析におけるピーク面積と濃度との関係を表すグラフである。
【図３】コロソリン酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析におけるピーク面積と濃度との関係を表すグラフである。
【図４】実施例１における、コロソリン酸に由来するピーク強度の経時変化を表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、前記血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項２】
前記質量分析計が四重極質量分析計であることを特徴とする請求項１記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項３】
前記血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分に含まれるテルペンを、前記質量分析計で検出することを特徴とする請求項１又は２記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項４】
前記血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物を、前記液体クロマトグラフィーで分画することを特徴とする請求項３記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項５】
前記テルペンが、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項６】
前記コロソリン酸類縁体が、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンであることを特徴とする請求項５記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項７】
前記テルペンが、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンであることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項８】
テルペンを投与した生体の血液における前記テルペンの血中濃度を、請求項１〜７の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することを特徴とするテルペンの薬物動態解析方法。
【請求項９】
請求項８記載のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするテルペン。
【請求項１】
血液に含まれるテルペンを質量分析計で検出して、前記血液におけるテルペンの血中濃度を定量することを特徴とするテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項２】
前記質量分析計が四重極質量分析計であることを特徴とする請求項１記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項３】
前記血液を液体クロマトグラフィーで分画して得た分画成分に含まれるテルペンを、前記質量分析計で検出することを特徴とする請求項１又は２記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項４】
前記血液を遠心分離して得た血清からの有機溶媒による抽出物を、前記液体クロマトグラフィーで分画することを特徴とする請求項３記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項５】
前記テルペンが、コロソリン酸又はコロソリン酸類縁体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項６】
前記コロソリン酸類縁体が、マスリン酸、ウルソール酸、アンシアチコ酸、オレアノール酸、トルメンティック酸及び２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイック酸からなる群より選ばれる少なくとも１種のトリテルペンであることを特徴とする請求項５記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項７】
前記テルペンが、バナバ、シソ、ビワ又はグアバから得られるトリテルペンであることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法。
【請求項８】
テルペンを投与した生体の血液における前記テルペンの血中濃度を、請求項１〜７の何れか一項記載のテルペンの血中濃度定量方法で経時的に定量することを特徴とするテルペンの薬物動態解析方法。
【請求項９】
請求項８記載のテルペンの薬物動態解析方法によって、生体に投与されたときの薬物動態が解析されたものであることを特徴とするテルペン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１７０９０５（Ｐ２００６−１７０９０５Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６６４７１（Ｐ２００４−３６６４７１）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（５９８１６９４９１）株式会社ユース・テクノコーポレーション (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（５９８１６９４９１）株式会社ユース・テクノコーポレーション (9)
【Ｆターム（参考）】
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