本発明は、特定の遺伝子又は遺伝子のファミリーの発現を調節するための少なくとも１つの干渉ＲＮＡ分子を発現する細胞及び動物、及び細胞及び動物を産生する方法に関する。本発明はさらに、新規なｉＲＮＡ分子、及びｉＲＮＡ分子を産生するためのＤＮＡテンプレートに関する。一実施形態では、本発明は、細胞又は動物のホメオスタシスに最小限の効果を有する標的化された挿入ベクターの使用を含む、タンパク質の発現を抑制するための新規方法及び材料を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含む、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
【請求項２】
ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物を細胞のゲノムの所定の位置に挿入する工程を含み、該挿入が該細胞の正常な遺伝子発現を破壊しない、トランスジェニック細胞を産生するための方法。
【請求項３】
（ｉ）標的ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのｉＲＮＡ配列を同定する工程；
（ｉｉ）細胞中の標的内因性遺伝子配列を同定する工程；
（ｉｉｉ）ｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物及び該内因性標的配列に対して相同な標的配列を製造する工程；
（ｉｖ）該ＤＮＡ構築物を該細胞に導入する工程；及び
（ｖ）該ｉＲＮＡ分子が発現され、それによって該標的ｍＲＮＡの発現を調節する条件下で、該細胞を増殖させる工程
を含む、標的ｍＲＮＡの発現を調節するための方法。
【請求項４】
前記挿入が標的遺伝子のエキソン内へのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記挿入が標的遺伝子のイントロン内へのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入が前記標的遺伝子の機能を破壊しない、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ構築物が、該標的遺伝子と前記ＤＮＡ構築物との間の相同的組換えを可能にするために、標的遺伝子に対して相同な配列を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ構築物が合成イントロン内に含有される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記合成イントロンが機能性イントロンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成イントロンが内因性イントロン内に挿入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成イントロンが内因性エキソン内に挿入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ構築物が、Ｄｒｏｓｈａ基質であるＲＮＡ分子をコードする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
ｉＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが相同的組換えを介して前記遺伝子内に挿入される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１又は２に従って産生されるトランスジェニック細胞。
【請求項１７】
請求項１又は２に記載の細胞を含むトランスジェニック動物。
【請求項１８】
第１の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第１のヌクレオチド配列と、第２の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第２のヌクレオチド配列とを含み、該第１及び第２のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖ｉＲＮＡ分子を形成する、二本鎖ｉＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記第１及び第２の標的ｍＲＮＡが同じである、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第１及び第２の標的ｍＲＮＡが異なる、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列が反復性である、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列を分離する第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記第１及び第２のヌクレオチド配列が１９〜３２ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記第３のヌクレオチド配列が４〜１０ヌクレオチド長である、請求項２２に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項２５】
第１の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第１のヌクレオチド配列と、第２の標的ｍＲＮＡに対して相補的な第２のヌクレオチドとを含み、該第１及び第２のヌクレオチド配列が実質的に共にハイブリダイズして二本鎖ｉＲＮＡ分子を形成する、二本鎖ｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
（ｉ）標的ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を同定する工程；
（ｉｉ）該相補的な配列を分析して、共にハイブリダイズ可能な配列の一部分を同定する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定された２つの相補的な配列を含有するｉＲＮＡ分子を製造する工程
を含み、該製造する工程を細胞中で行なうことができる、標的ｍＲＮＡの発現を調節するために二本鎖ｉＲＮＡ分子を産生するための方法。
【請求項２７】
前記ｉＲＮＡがＤＮＡ構築物によってコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｉＲＮＡ分子が、共にハイブリダイズする２個の相補的なヌクレオチド配列を分離する第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記相補的な配列が約１９〜３２ヌクレオチド長である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つの遺伝子の少なくとも２つの領域の発現を調節し、前記遺伝子の発現が機能的に排除される、１個のｉＲＮＡ分子。
【請求項３１】
標的ｍＲＮＡの同じ領域を標的化する２つのｉＲＮＡ分子を投与する工程を含む、標的ｍＲＮＡの発現を排除するための方法。
【請求項３２】
遺伝子ファミリーの全てのメンバーに共通の相同性領域を標的化することによって、前記遺伝子ファミリーの発現を調節する１個のｉＲＮＡ分子。
【請求項３３】
ブタ内因性レトロウイルスの発現を阻害するｉＲＮＡ分子。
【請求項３４】
複数の種類のブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）に結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３５】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３６】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｃに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３７】
前記ｉＲＮＡがＰＥＲＶ−Ｂ及びＰＥＲＶ−Ｃに結合する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ。
【請求項３８】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｅｎｖ領域を標的化する、請求項３３に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｇａｇ領域を標的化する、請求項３８に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記ブタ内因性レトロウイルスのｐｏｌ領域を標的化する、請求項３９に記載のｉＲＮＡ分子。
【請求項４１】
以下のｇａｇ配列を標的化する、請求項３９に記載のｉＲＮＡ分子：
ＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＴ、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。
【請求項４２】
以下のｐｏｌ配列を標的化する、請求項４０に記載のｉＲＮＡ分子：
ＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＴ、又はこれに実質的に相同性を有するか、又はこれにハイブリダイズする配列。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２００７−５１２０２７（Ｐ２００７−５１２０２７Ａ）
【公表日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１６１７（Ｐ２００６−５４１６１７）
【出願日】平成１６年１１月２２日（２００４．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９１９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８１７１４
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０４３６４３６７）レビビコア，　インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】