トリプシン様酵素
【課題】ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するプロテアーゼを提供すること。
【解決手段】本発明のトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対する加水分解活性を有し、好適には、以下の性質：（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；を有する。また、本発明のトリプシン様酵素は、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株により産生される。
【解決手段】本発明のトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対する加水分解活性を有し、好適には、以下の性質：（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；を有する。また、本発明のトリプシン様酵素は、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株により産生される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有する新規トリプシン様酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚、腱、および軟骨の主成分ならびに骨、歯、および角膜の有機成分であり、細胞外マトリクスの主要成分である。コラーゲンは、すべての高等生物において、最も豊富なタンパク質であり、哺乳動物のタンパク質の約２５〜３３％を構成する。コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を有しており、ポリペプチド鎖は、繰り返しトリペプチド配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙを含む。このＸおよびＹの位置のアミノ酸は、プロリンおよび翻訳後改変の４−ヒドロキシプロリンであることが多く、したがって、コラーゲンは、プロリンリッチなタンパク質である。コラーゲン分子は、ヒドロキシプロリンによってその三重らせんが非常に安定化されており（非特許文献１）、水不溶性繊維またはシートに組み立てられ、そしてほとんどのプロテアーゼに抵抗性である。
【０００３】
このようなコラーゲンタンパク質ファミリーとして、現在までに、少なくとも２５種が同定されている（非特許文献２）。これらは、三重らせんを形成しているドメインの長さおよび連続性、加水分解される残基と加水分解されない残基との割合、ヒドロキシリジングリコシル化の程度の差などによって区別されている。例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、およびＩＸ型コラーゲンは、非らせん端を有する連続する三重らせんを含む古典的繊維状コラーゲンである。一方、ＩＶ型コラーゲンは、より多くの非らせん領域を含みそして球形のドメインによって相互作用し得るテトラマーに組み立てられて、基底膜の構造足場になるシート様ネットワークを形成している。
【０００４】
コラーゲンは、多くの細胞事象に関連するため、種々の適用の可能性を有する生体材料である。さらに、コラーゲン分解物であるコラーゲンペプチドは、工業および医療目的の種々の生物学的活性を有することが報告されており、急速に広範な適用が確立されている。例えば、骨粗鬆症、胃潰瘍、および高血圧用の薬剤、皮膚保湿剤、保存剤などの用途が挙げられる。コラーゲンペプチドの調製のために現在使用される化学的切断方法は、非常に反応性の高いＣＮＢｒを必要とする（非特許文献３）。したがって、強力な活性を有しそして使用に安全であるコラーゲン分解酵素が、食品や医薬品産業への利用に所望される。
【０００５】
種々のコラーゲンの分子構造の差異は、各タイプを切断し得るコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）の性質に影響を及ぼす。コラーゲン分解酵素として、哺乳動物マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーが一般的に知られている。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−１３は、Ｉ〜ＩＩＩ型コラーゲンの三重らせんドメイン内で加水分解する（非特許文献４および５）。一方、ＭＭＰ−９は、Ｖ型およびＸＩ型コラーゲンの三重らせんを切断するが、Ｉ〜ＩＩＩ型コラーゲンを切断しない（非特許文献６および７）。ＭＭＰ−２は、ＩＶ型コラーゲンを切断し、そして変性コラーゲンであるゼラチンも分解することが知られている（非特許文献８）。近年、ＭＭＰのコラーゲン特異性が、基質配列と熱安定性との組み合わせに基づくことが報告されている（非特許文献９）。
【０００６】
コラーゲン分解については、３つのメカニズムが知られている：（１）上記のＭＭＰのような哺乳動物間質コラゲナーゼによるメカニズムであり、単一の部位でコラーゲンの安定な三重らせんを切断する；（２）システインプロテイナーゼのような広い特異性を有するプロテイナーゼよるメカニズムであり、天然のコラーゲンの非らせんテロペプチドを切断し、そして変性コラーゲン、すなわち、ゼラチンも分解する；および（３）細菌のコラゲナーゼによるメカニズムであり、天然の三重らせんを多数の部位で切断する。
【０００７】
非特許文献１０では、細菌のコラゲナーゼが、カテプシンＫ、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３よりも非常に高いコラーゲン分解活性を有することが示されている。細菌コラゲナーゼの中でも、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼは、広く研究され、そして組織分散酵素として広く使用される（非特許文献１１）。好熱性のジオバシラス・コラゲノボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ＭＯ−１株由来のプロテアーゼが、コラーゲンを分解し得ることも報告されている（非特許文献１２）。最近、クロストリジウム・ヒストリティカムのコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）およびジオバシラス・コラゲノボランスＭＯ−１プロテアーゼのコラーゲン結合ドメインが決定されている（非特許文献１３および１４）。しかし、これらは、基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンに対する分解活性があまり強くない。
【０００８】
また、近年、プロテアーゼの基質優先性について、ＦＲＥＴＳコンビナトリアルライブラリーを用いて検討されている（非特許文献１５〜１７および特許文献１）。この手法は、プロリンおよびヒドロキシプロリンを多く含むコラーゲンに対して加水分解活性を有するプロテアーゼについての検討に応用できる。しかし、網目構造を有するＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するプロテアーゼについての報告はない。
【特許文献１】特開２００６−１９７８０２号公報
【非特許文献１】Ramshaw, J. A.ら、J. Struct. Biol.，1998年，122巻，86-91頁
【非特許文献２】Kielty, C. M.およびGrant, M. E.、Connective Tissue and Its Heritable Disorders，Royce, P. M.およびSteinmann, B.編，Wiley-Liss, Inc.，New York，2002年，159-221頁
【非特許文献３】Watanabe, K.、Appl. Microbiol. Biotechnol.，2004年，63巻，520-526頁
【非特許文献４】McCawley, L. J.およびMatrisian, L. M.、Curr. Opin. Cell Biol.，2001年，13巻，534-540頁
【非特許文献５】Overall, C. M.、Mol. Biotechnol.，2002年，22巻，51-86頁
【非特許文献６】Niyibizi, C.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.，1994年，202巻，328-333頁
【非特許文献７】Sternlicht, M. D.およびWerb, Z.、Annu. Rev. Cell Dev. Biol.，2001年，17巻，463-516頁
【非特許文献８】Birkedal-Hansen H.ら、Crit Rev Oral Biol Med.，1993年，4巻，197-250頁
【非特許文献９】Minond, D.ら，J. Biol. Chem.，2006年，281巻，38302-38313頁
【非特許文献１０】Garnero, P.ら、J. Biol. Chem.，1998年，273巻，32347-32352頁
【非特許文献１１】Mookhtiar, K. A.および Van Wart, H. E.、Matrix Suppl.，1992年，1巻，116-126頁
【非特許文献１２】Okamoto, M.ら、Appl. Microbiol. Biotechnol.，2001年，57巻，103-108頁
【非特許文献１３】Matsushita, O.ら，J. Biol. Chem.，1998年，273巻，3643-3648頁
【非特許文献１４】Itoi, Y.ら，J. Bacteriol.，2006年，188巻，6572-6579頁
【非特許文献１５】T. Hatanakaら、Arch. Biochem. Biophys.，2005年，434巻，289-298頁
【非特許文献１６】K. Odaら、FEBS Lett.，2005年，579巻，5013-5018頁
【非特許文献１７】S. Tankulら、Biochem. Biophys. Res. Commun.，2003年，309巻，547-551頁
【非特許文献１８】Wlodawer, A.ら、J. Biol. Chem.，2004年，279巻，21500-21510頁
【非特許文献１９】Katoh, T.ら、J. Ferment. Bioeng.，1995年，80巻，440-445頁
【非特許文献２０】Kim, I. S.およびLee, K. J.，Microbiology，1995年，141巻，1017-1025頁
【非特許文献２１】Olafson, R. W.ら、Biochemistry，1975年，14巻，1168-1177頁
【非特許文献２２】Kim, J. C.、Biochem. Biophys. Res. Commun.，1991年，181巻，707-713頁
【非特許文献２３】Read, R. J.およびJames, M. N.、J. Mol. Biol.，1988年，200巻，523-551頁
【非特許文献２４】Hatanaka, T.ら、Arch. Biochem. Biophys.，2005年，434巻，289-298頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、コラーゲンおよびそのペプチドは、生化学的および医学的機能のため、産業上興味深い生体材料であり、基底膜を形成するＩＶ型コラーゲンに対して高い分解活性を有するプロテアーゼが、その処理に必要とされている。したがって、本発明は、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するプロテアーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する、トリプシン様酵素を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記トリプシン様酵素は、以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；
（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；
（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および
（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；
を有する。
【００１２】
ある実施態様では、トリプシン様酵素は、上記ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）により産生される。
【００１３】
さらなる実施態様では、上記トリプシン様酵素は、
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
別の実施態様では、上記トリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項１から４のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素であって、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１５】
本発明はまた、トリプシン様酵素をコードする遺伝子を提供し、該トリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００１６】
１つの実施態様では、上記遺伝子において、上記メトリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１７】
本発明はさらに、上記のいずれかの遺伝子を含む、発現用担体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、上記のいずれかの遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記の形質転換細胞により産生される、組換えトリプシン様酵素を提供する。
【００２０】
本発明はまた、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するトリプシン様酵素が提供される。本発明のトリプシン様酵素を用いれば、これまで酵素的にほとんど分解されなかったＩＶ型コラーゲンを分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字または１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、ＡｌａまたはＡ；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ；システインは、ＣｙｓまたはＣ；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥ；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ；グリシンは、ＧｌｙまたはＧ；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ；リジンは、ＬｙｓまたはＫ；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ；フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ；プロリンは、ＰｒｏまたはＰ；セリンは、ＳｅｒまたはＳ；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴ；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ；チロシンは、ＴｙｒまたはＹ；そしてバリンは、ＶａｌまたはＶを示す。また、任意のアミノ酸は、ＸａａまたはＸ、あるいはＹａａまたはＺａａと表記する場合がある。
【００２３】
本明細書において、「置換、欠失、挿入または付加」を有するアミノ酸配列とは、天然由来の変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的な変異を導入されたアミノ酸配列であってもよい。「アミノ酸配列の置換、欠失、挿入または付加」は、当該技術分野で通常用いられる部位特異的変異導入法などにより、アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸に対して生じさせ得る。得られたアミノ酸配列を有するペプチドが、元のペプチドと同等またはそれ以上の活性を示せばよい。
【００２４】
本発明のトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する。
【００２５】
本発明において、酵素のコラーゲン分解活性は、任意の方法で測定され得る。例えば、天然のコラーゲンを基質として用いて、酵素により遊離されたアミノ基の増加の初期速度を、ニンヒドリン法によって測定する（非特許文献１８）。また、酵素のタンパク質分解活性を、蛍光標識されたＤＱ−ゼラチン、ＤＱ−コラーゲン、またはフルオレセインカゼイン（いずれもMolecular Probesより入手可能）を用いて測定してもよい。これらの基質は、フルオレセインで大量に標識されており、その分子内ではほぼ完全に消光しているが、酵素加水分解により分子内自己消光が緩和され、明るい蛍光反応産物を生成する。あるいは、酵素の加水分解活性は、トリプシンのコンセンサス基質であるベンジル−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロフェノール・ＨＣｌ（Ａｒｇ−ｐＮＡ）を基質として用いて、ｐ−ニトロアニリンの放出による４０５ｎｍの吸光度を測定してもよい。
【００２６】
本発明のトリプシン様酵素は、至適反応ｐＨが、好ましくはｐＨ８．０〜９．０であり、至適反応温度が、カルシウムイオン不在下で約５０℃、およびカルシウムイオン存在下で約５５℃である。また、本発明のトリプシン様酵素は、９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃の熱安定性、およびカルシウムイオン存在下で５０℃の熱安定性を示す。本発明のトリプシン様酵素は、カルシウムイオンの存在下で、安定化される。
【００２７】
本発明のトリプシン様酵素の酵素活性は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって阻害され、そしてＥＤＴＡによってわずかに阻害される。例えば、５ｍＭのＰＭＳＦの存在下では７１％阻害され、そして５０ｍＭのＥＤＴＡの存在下では、Ａｒｇ−ｐＮＡに対する加水分解活性が１４％阻害される。
【００２８】
本発明のトリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、好ましくは、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対して、３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性についての基質優先性を有する。
【００２９】
本発明のトリプシン様酵素は、好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に基づいて算出された分子量が約２４ｋＤａであり、単量体である。
【００３０】
さらに、本発明のトリプシン様酵素は、基質としてＡｒｇ−ｐＮＡを用いる場合、好ましくは、Ｋｍ値は約０．０１４ｍＭ、そしてｋｃａｔ値は約１２．７（ｓ−１）である。
【００３１】
本発明のトリプシン様酵素としては、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）［Streptomyces omiyaensis 84A06と命名・表示され、受託番号：（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）（寄託日：２００７年１１月３０日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］により産生されるトリプシン様酵素が挙げられる。
【００３２】
本発明のストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株は、土壌より分離された放線菌であり、ＩＳＰ培地Ｎｏ．２（「ダイゴ」日本製薬株式会社）にて３０℃で４８時間培養した場合、以下の（ｉ）〜（iii）の性質を有する。
【００３３】
（ｉ）形態的性質（ＩＳＰ培地Ｎｏ．２で生育）
コロニーサイズ：φ４．０〜５．０ｍｍ
コロニー表面の形状：綿状（７２時間培養）および湿潤状（１週間以上培養）
コロニーの色調：表面（気菌糸）灰色および裏面（基生菌糸）黄土色
水溶性色素産生：−
なお、ＩＳＰ培地Ｎｏ．３で生育させた場合、表面：淡黄色（湿潤）および基底：淡黄色（綿状）；ＩＳＰ培地Ｎｏ．４で生育させた場合、表面：白色（綿状）および基底：白色；およびＩＳＰ培地Ｎｏ．５で生育させた場合、表面：白色（綿状）および基底：淡黄色であった。
【００３４】
（ii）微視的性質
気菌糸の形状：分岐あり、幅０．８〜０．９μｍ
【００３５】
（iii）生理・生化学的性質（＋は陽性、−は陰性を示す）
ゼラチンの液化： ＋
デンプンの加水分解： ＋
硝酸還元反応： ＋
脱脂粉乳のペプトン化・凝固： ペプトン化
生育温度の範囲（℃）：
２０ ＋
２５ ＋
３０ ＋
３７ ＋
４５ −
耐塩性（％）：
４．０ ＋
７．０ −
１０．０ −
１３．０ −
炭素源の利用性：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．９ −
グルコース ＋
Ｌ−ラムノース ＋
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−フラクトース ＋
Ｌ−アラビノース −
ラフィノース −
シュクロース ＋
Ｄ−キシロース ＋
イノシトール −
メラニン様色素産生：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．６ −
ＩＳＰ培地Ｎｏ．７ −
【００３６】
このストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株を培養し、培養上清から単離・精製することによって、トリプシン様酵素を容易に得ることができる。ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株の培養条件は、特に限定されず、約３０℃、例えば、２５〜３４℃で、６日間前後、例えば、３〜１０日間撹拌しながら培養する条件が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株を、２％(w/v)グルコース、０．５％(w/v)ポリペプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．８％(w/v)Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０５％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培養培地（ＰＧ培地）に接種し、そして１２５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃にて６日間培養する。
【００３８】
得られた培養物は、細胞と培地成分とを分離し得る手段、例えば、遠心分離、限外ろ過などに供し、培養上清を得る。得られた培養上清は、適切な緩衝液などに対して透析してもよい。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの当該技術分野で通常用いられるタンパク質精製法により、本発明のトリプシン様酵素を精製することができる。
【００３９】
より具体的には、４℃にて、７０％(w/v)飽和硫酸アンモニウム分画に供し、沈殿物を回収する。沈殿物を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析した後、上記イオン交換カラムにかけ、結合したタンパク質を、０．２５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出し、そして２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析する。上清を、さらにイオン交換カラムにかけて、ＮａＣｌグラジエントにより活性の高い画分を溶出させることにより、目的のトリプシン様酵素を得ることができる。
【００４０】
このようにして得られるストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来のトリプシン様酵素（ＳＯＴ）の一次構造は、ストレプトマイセス・ファラディアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）由来のトリプシノーゲン（ＳＦＴ：非特許文献１９）、ストレプトマイセス・エクスフォリアタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ）由来のトリプシン様プロテアーゼ前駆体（ＳＥＴ：非特許文献２０）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のトリプシン（ＳＧＴ：非特許文献２１〜２３）と、それぞれ８２％、８２％、および７７％の配列同一性を示す。また、ＳＯＴの推定アミノ酸配列では、ＳＧＴ中の活性なＳｅｒ１９５およびＨｉｓ５７残基、ならびに正荷電した基質の結合に重要な役割を果たすことが知られているＡｓｐ１８９が保存されている。
【００４１】
本発明のトリプシン様酵素としては、より具体的には、
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、トリプシン様酵素が挙げられる。
【００４２】
上記（Ａ）の配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株のトリプシン様酵素（ＳＯＴ）のアミノ酸配列である。なお、配列表の配列番号２の１位から３４位のアミノ酸配列は、ＳＯＴのシグナル配列である。
【００４３】
本発明においては、上記ＳＯＴの活性の測定法の条件下に、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有するものであれば、本発明のトリプシン様酵素には、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントの配列を有するポリペプチドも含まれる。配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントとしては、上記（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が挙げられる。また、後述の核酸によりコードされるポリペプチドであって、上記トリプシン様酵素活性の測定法の条件下に同様の活性（特に、ＩＶ型コラーゲン加水分解活性）を示すものであれば、本発明のトリプシン様酵素に含まれる。
【００４４】
上記（Ｂ）および（Ｃ）のアミノ酸配列のバリアントの天然の供給源となる生物は、特に限定されるものではなく、ストレプトマイセス・オミヤエンシスに分類される他の株などが挙げられる。
【００４５】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加（以下、「変異」ともいう）の数は、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に同様の活性を示す範囲であればよく、少なくとも１個、好ましくは、１個〜複数個、より好ましくは、１個〜数個である。上記変異を有するアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントに準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異の導入は、例えば、慣用のＰＣＲを用いた部位特異的変異導入方法などにより行われ得る。なお、ＳＯＴのシグナル配列は、他の適切なシグナル配列に置き換えられていてもよい。
【００４６】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、類似した物理学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換（保存的置換）されたアミノ酸配列が挙げられる。保存的置換は、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などに類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換、本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみ該ポリペプチドの立体構造や折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換などが挙げられる。より具体的には、上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、以下のアミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシンおよびアラニン、
（２）バリン、イソロイシンおよびロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、
（４）セリンおよびスレオニン、
（５）リジンおよびアルギニン、および
（６）フェニルアラニンおよびチロシン
からなる群より選択されるアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行われたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４７】
上記（Ｃ）において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、本明細書においては、配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００４８】
本発明においては、配列同一性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上である。
【００４９】
本発明のトリプシン様酵素はまた、以下に詳述する本発明の遺伝子を用いて、遺伝子工学的に製造することができる。例えば、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株とは異なる異種細胞において、本発明のトリプシン様酵素を発現させることができる。
【００５０】
本発明のトリプシン様酵素をコードする遺伝子は、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００５１】
このうち（ａ）〜（ｃ）の塩基配列は、それぞれ、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、そして（ｄ）の塩基配列は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列であり得る。この遺伝子によってコードされるトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する。
【００５２】
上記（ｄ）の「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(v/v)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、さらに０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃または６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃または６５℃以上の温度条件で洗浄することなどの、より厳しい条件も含む。また、本発明においては、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に関して、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも８５％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であり、該塩基配列に関して、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列との配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列との特異的なハイブリダイゼーションが達成され得る条件であることが望ましい。
【００５３】
なお、本明細書においては、塩基配列の配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００５４】
また、本発明の遺伝子に基づき、本発明のトリプシン様酵素と同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングするための、プローブおよびプライマー対も提供できる。
【００５５】
さらに、本発明の遺伝子を含むトリプシン様酵素の発現用担体を用いて、本発明の遺伝子によりコードされる組換えトリプシン様酵素を製造することもできる。本明細書において、「発現用担体」とは、慣用の生物ベクターなどを基本骨格として含有し、かつ適切な位置に本発明の遺伝子が作動可能に連結された核酸構築物；金粒子、リポソーム、デキストラン、リン酸カルシウムなどの担体に、細胞内での発現に適したエレメントなどを有する本発明の遺伝子を担持させた構築物などを意味する。
【００５６】
本発明のトリプシン様酵素の発現用担体を用いて、本発明のトリプシン様酵素をストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株以外の細胞に導入することができ、それにより、異種細胞において本発明のトリプシン様酵素を発現させることができる。したがって、本発明のトリプシン様酵素の工業的な生産のための手段が提供される。
【００５７】
上記生物ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＴｋｍＳ２（Mishima, N.ら、Biotechnol. Prog.、第13巻、864-868頁、1997年）、ｐＯＭａｌ（New England Biolabs）などの大腸菌用プラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などの大腸菌用ファージベクター；ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＩＣＺα（インビトロジェン株式会社）などの酵母用ベクター；ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet.、203巻、468-478頁、1986年）、ｐＫＣ１０６４（Gene、103巻、97-99頁、1991年）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene、165巻、149-150頁、1995年）、ｐＩＪ７０２（Katz, E.ら、J. Gen. Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）、およびｐＩＪ８６００（Sun, J.ら、Microbiology、145巻、2221-2227頁、1999年）などの放線菌用ベクター；ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどの昆虫細胞用ベクター；ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などの動物細胞用ベクターなどが挙げられる。このようなベクターには、適切なプロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなど）、選択マーカー遺伝子、ターミネーターなどのエレメントを適宜有していてもよい。
【００５８】
また、上記ベクターは、本発明のトリプシン様酵素を、慣用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグなど）や融合パートナー（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）と融合した状態で発現させ得るベクターであってもよい。
【００５９】
このようなベクターの調製に用いられる菌としては、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌が挙げられ、具体的には、例えば、放線菌、大腸菌などが挙げられる。より具体的には、放線菌としては、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２３など、そして大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９などが挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、安全性などの観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９が望ましい。
【００６０】
本発明のトリプシン様酵素の発現用担体は、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞を形質転換して、形質転換細胞を作製する。形質転換法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクル銃によるボンバードメント法など、当業者に周知の方法が採用される。
【００６１】
本発明においては、宿主細胞として、好適には微生物（宿主菌）が用いられる。宿主菌としては、放線菌、大腸菌、バシラス属菌、シュードモナス属菌、サーマス属菌、アグロバクテリウム属菌、酵母（例えば、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａなど）などが挙げられる。中でも、本発明においては、放線菌が好適に用いられる。
【００６２】
本発明において、放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌をいう。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌などに生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、およびノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。本発明において放線菌とは、好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本発明においては、宿主菌として、特にストレプトマイセス・リビダンスが好適に用いられる。このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、種々のカタログに記載されており、当業者であれば容易に入手可能である。
【００６３】
宿主細胞への本発明の発現用担体の導入により得られた細胞が、目的の形質転換細胞であることは、細胞または該細胞の培養上清について、上記トリプシン様酵素の活性の測定法により、トリプシン様酵素活性、特にＩＶ型コラーゲン加水分解活性が検出されることを指標として、確認され得る。
【００６４】
本発明の形質転換細胞を培養して増殖させることにより、本発明のトリプシン様酵素を遺伝子工学的に容易に精製できる状態で発現させることができ、それにより、該トリプシン様酵素を工業的に製造することができる。
【００６５】
本発明の組換えトリプシン様酵素の製造においては、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間などについて、トリプシン様酵素の発現の最適な条件を決定することによって、効率よく組換えトリプシン様酵素を生産させることができる。
【００６６】
本発明の形質転換細胞の培養に通常用いられる培地としては、天然培地および合成培地のいずれを用いてもよい。液体培地または固体培地を使用することができる。例えば、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であればよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸などを含んでいてもよい。その他に、無機塩として、微量のカリウム、ナトリウム、鉄などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩などを含んでいてもよい。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００６７】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、宿主細胞が増殖し、目的のタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振とう培養または攪拌培養などの好気的条件下で、１０℃〜４０℃、好ましくは２８℃で１２〜１２０時間行われる。ｐＨは、４から１０、好ましくは６から８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【００６８】
形質転換細胞が生産する組換えトリプシン様酵素は、それが細胞内に生産されるときは細胞内の他のタンパク質、他のポリペプチドなどが共存するが、これらは発現されるトリプシン様酵素の量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、トリプシン様酵素が菌体外に分泌される。
【００６９】
形質転換細胞の培養物からトリプシン様酵素活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換細胞が大腸菌のように細胞内にトリプシン様酵素活性を有するポリペプチドが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を集め、得られた細胞を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換細胞によっては、発現産物が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行えばよい。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、実施例により限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第２版（ザンブルーク（Sambrook, J）ら、1989年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。
【００７１】
以下の実施例における一般的なタンパク質は、蛍光性ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチンを用いて決定した。ＤＱ−ゼラチンは、フルオレセインで大量に標識されており、その分子内ではほぼ完全に消光しているが、酵素加水分解により分子内自己消光が緩和され、明るい蛍光反応産物を生成する。代表的には、アッセイを、以下のように行った：１０μＬの酵素溶液および１０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＤＱ−ゼラチンを、蛍光用のマイクロタイタープレートのウェル中の１００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に添加し、そして３７℃にてインキュベートした。反応を、酵素溶液の添加によって開始した。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いてλｅｘ５３５ｎｍおよびλｅｍ４８５ｎｍでの蛍光強度の増加によってモニターした。反応速度を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：和光純薬工業株式会社）溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。１ユニットの活性を、アッセイ条件下で１分当たり１ｎｍｏｌのＦＩＴＣを放出するに必要とされる酵素量として定義した。
【００７２】
（実施例１：ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株の培養物からのトリプシン様酵素の精製および生化学的特徴）
土壌より分離された放線菌ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６株を、２％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．８％Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培養培地（ＰＧ培地）に接種し、そして１２５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃にて６日間培養した。
【００７３】
次いで、培養上清を、４℃にて７０％飽和硫酸アンモニウム分画に付し、沈殿物を４℃にて２００００ｒｐｍで１００分間の遠心分離によって回収した。沈殿物を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析した。得られた試料を、上記緩衝液で平衡化したVivapure Sスピンカラム（VIVASCIENCE）に供した。結合したタンパク質を、０．２５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出し、そして溶出液を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。遠心分離後、上清を、透析緩衝液で予め平衡化したMono S HR5/5カラム（Pharmacia Biotech）に供した。緩衝液中０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線グラジエントにより酵素を溶出した。精製過程を表１に示す。精製工程において、酵素活性を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中３７℃にて８３μｇ／ｍＬのＤＱ−ゼラチン（Molecular Probes）を用いて決定した。１ユニットの活性を、上記の条件下で１分当たり１ｎｍｏｌのＦＩＴＣを放出するに必要とされる酵素の量として定義した。
【００７４】
【表１】
【００７５】
１０００ｍＬの培養上清から、トリプシン様酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ均一にまで精製し（図１）、０．７％の収率で９９．３倍に精製し、そしてゼラチン加水分解の高い比活性（１１４６Ｕ／ｍｇ）を得た。このストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来のトリプシン様酵素を、以下、ＳＯＴと記載する場合がある。ＳＯＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量が約２４ｋＤａであることを確認した。また、精製ＳＯＴは、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）により酵素活性が７１％阻害され、そしてＥＤＴＡによっても１４％阻害された。
【００７６】
（実施例２：トリプシン様酵素の遺伝子の取得）
精製ＳＯＴを、ＰＶＤＦメンブラン（Bio-Rad社）上にエレクトロブロットし、次いでプロテインシークエンサーにかけて、Ｎ末端アミノ酸配列（ＶＶＧＧＴＲＡＡＱＧＥＦＰ：配列番号４）を同定した。また、精製ＳＯＴを、通常試薬として用いられるトリプシン（Sigma）で処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、ＬＣ−ＭＳにより解析し、内部アミノ酸配列（ＬＡＥＴＴＡＹＮＳＧＴＦ：配列番号５、ＧＫＤＷＡＬＩＫ：配列番号６、およびＬＡＳＰＩＴＳＬＰＴＬ：配列番号７）を同定した。
【００７７】
次に、ゲノムＤＮＡを、Hopwoodらの方法（D.A. Hopwoodら、A Laboratory Manual, The John Ines Foundation，Norwich，1985年，70-84頁）を用いてストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株から調製した。ＳＯＴのＮ末端配列（ＶＶＧＧＴＲＡＡＱＧＥＦＰ：配列番号４）および内部配列（ＬＡＥＴＴＡＹＮＳＧＴＦ：配列番号５）から縮重ＰＣＲプライマー（フォワード：５’−ＣＧ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＣＡＧＧＧ（ＣＧ）ＧＡＧＴＴＣＣＣ−３’（配列番号８）およびリバース：５’−ＴＴＧＴＡ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＧＴ（ＣＧ）ＧＴＣＴＣ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）Ａ−３’（配列番号９））を設計し、これらを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、９４℃にて１分のインキュベーションの後、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を３５サイクル行い、次いで７２℃にて５分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Promega）中にクローニングし、そして配列決定した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したプローブを、ＳＯＴ遺伝子配列の一部およびＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて合成した。このプローブを、ＳｍａＩで切断したゲノムＤＮＡの約１．２ｋｂフラグメントにハイブリダイズさせた。次に、これらのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて回収し、そして自己ライゲートさせた。ライゲーション産物を、ＳＯＴ遺伝子の部分ＤＮＡフラグメントから設計したプライマーセットを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。結果を図２に示す。
【００７８】
図２に、ＳＯＴ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、ＤＤＢＪデータベースアクセッション番号：ＡＢ３６２８３７）およびその推定アミノ酸配列を示す。オープンリーディングフレームは７８６ヌクレオチド長であり、推定分子量２６７０４を有する２６１アミノ酸をコードすると予測した。成熟酵素について算出した分子量は、２２８９２であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した実測分子量（約２４ｋＤａ）と一致した。推定−３５および−１０配列ならびに推定リボソーム結合部位（ＳＤ）を、ヌクレオチド配列中に下線を引いた。精製ＳＯＴを用いて決定したＮ末端および内部配列を、それぞれ太字および二重下線で示す。停止コドンをアステリスクで示す。
【００７９】
また、成熟ＳＯＴの一次構造について、マルチプル配列アラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムを用いて行った。アラインメントを図３に示す。図３においては、ＳＧＴ（ストレプトマイセス・グリセウス由来のトリプシン）、ＳＦＴ（ストレプトマイセス・ファラディアエ由来のトリプシノーゲン）、およびＳＥＴ（ストレプトマイセス・エクスフォリアタスのトリプシン様プロテアーゼ前駆体）と並べた。すべての配列で保存された残基を、白抜き文字で示す。ＳＯＴは、ＳＧＴ、ＳＦＴ、およびＳＥＴとそれぞれ７７％、８２％、および８２％の配列同一性を示し、トリプシンファミリーに属することがわかった。また、ＳＯＴの推定アミノ酸配列では、ＳＧＴ中の活性中心にあるＳｅｒ１９５およびＨｉｓ５７残基、ならびに正荷電した基質の結合に重要な役割を果たすことが知られているＡｓｐ１８９が保存されていた。
【００８０】
（参考例１：発現ベクターｐＴＯＮＡ５の作製）
大腸菌と放線菌との間の遺伝子間結合によって、ストレプトマイセスのメタロエンドペプチダーゼのプロモーターを含む発現ベクターｐＴＯＮＡ５ａを構築した。
【００８１】
まず、pBluescript II KS (-)（TOYOBO）を鋳型に大腸菌ＪＭ１０９のｏｒｉ（０．６ｋｂ）の部分をプライマー１および２（配列番号１０および１１）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分の後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル繰り返し、その後４℃に冷却した。ＰＣＲには、KOD plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いた。次いで、ｐＴＹＭ１８（オナカ（Onaka,H.）ら、J. Antibiotics、56巻、950-956頁、2003年）を鋳型に、ａｐｈＩＩ（大腸菌−放線菌カナマイシン耐性遺伝子：１．３ｋｂ）を、プライマー３および４（配列番号１２および１３）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。
【００８２】
得られた２つの断片をそれぞれ制限酵素SspIおよびPstIで処理し、２つの断片を互いにライゲーションした後、大腸菌に導入した。大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％ＮａＣｌ、１％ポリペプトン、および０．５％酵母エキス）中３７℃にてカナマイシンを選択マーカーにして、ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＢＳａｐｈＩＩを得た。ｐＩＪ７０２（モルナー（Molnar）ら、J. Ferment. Bioeng.、72巻、368-372頁、1991年）および得られたｐＢＳａｐｈＩＩをそれぞれ制限酵素PstIで処理し、２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥ７０２を得た。
【００８３】
次に、ｐＴＹＭ１８を鋳型にｏｒｉＴ（０．８ｋｂ）をプライマー５および６（配列番号１４および１５）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。得られた断片を制限酵素HincIIおよびSmaIで処理し、そしてｐＩＪＥ７０２を制限酵素SspIで処理した。得られた２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥＣ７０２を得た。次いで、ｐＩＪＥＣ７０２のNdeI部位を、QuikChange II Kit（Stratagene）ならびにプライマー７および８（配列番号１６および１７）を用いてサイレント変異によって欠失させ、ｐＩＪＥＣ’７０２を得た。
【００８４】
次に、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを、S. septatus TH-2［Streptomyces septatus TH-2と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センター（現：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］から、サイトウ・ミウラ法（サイトウ（Saito,H.）ら、Biochem. Biophys. Acta.，72巻、619-629頁、1963年）により調製した。ＳＳＭＰプロモーター（０．４ｋｂ）を、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー９および１０（配列番号１８および１９）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。また、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡをS. aureofaciens TH-3（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４３）から上記と同様の方法により調製した。ＴＨ−３ ｃｏｌｌターミネーター（０．５ｋｂ）を、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１１および１２（それぞれ配列番号２０および２１）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。ＳＳＭＰプロモーター断片を、AseIおよびEcoRIで処理し、ターミネーター断片をEcoRIおよびBglIIで処理し、そしてｐＩＪＥＣ’７０２を制限酵素AseIおよびBglIIで処理した。得られた３つの断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＴＯＮＡ５を得た。プラスミドｐＴＯＮＡ５の構成（制限酵素地図）を図８に示す。このプラスミドｐＴＯＮＡ５には、ＳＳＭＰプロモーター配列（配列番号２２）およびＴＨ−３ ｃｏｌｌターミネーター（配列番号２３）が含まれている。
【００８５】
（実施例３：組換えＳＯＴ発現ベクターおよび組換えＳＧＴ発現ベクターの構築）
ＳＯＴの生化学的研究のために、株の入手可能性の点でＳＧＴ（ストレプトマイセス・グリセウス由来のトリプシン）を比較酵素として選択した。そこで、組換え酵素を、活性形態として細胞外培地中に分泌するように、S. lividans 1326株をＳＯＴまたはＳＧＴ発現用の宿主株として用いて、ＳＯＴおよびＳＧＴについて、それぞれ以下のようにして発現ベクターを構築した。
【００８６】
まず、ＳＯＴ遺伝子を、ＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマー（５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＣ−３’：配列番号２４（ＡＴＧが開始コドン））と停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧ−３’：配列番号２５（ＴＴＡが停止コドン））とのセットおよびＫＯＤ ｖｅｒ．２ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントを、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングして配列決定した。ＳＯＴをコードするＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＴＯＮＡ５ａのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結し、発現ベクターｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｏｔ）を得た。
【００８７】
次に、ＳＧＴをコードする遺伝子を、ＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマー（５’−ＣＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＣ−３’：配列番号２６（ＡＴＧが開始コドン））とＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧ−３’：配列番号２７（ＴＣＡが停止コドン））とのセットならびにストレプトマイセス・グリセウスＡＴＣＣ １０１３７株のゲノムを用いて、ＤＮＡＫＯＤ−ｐｌｕｓ Ｖｅｒ．２キット（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーは、非特許文献２２に開示されているトリプシン遺伝子（ｓｐｒＴ）のヌクレオチド配列から設計した。ＳＧＴをコードする遺伝子を有する発現ベクター（ｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｇｔ））の構築は、上記のｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｏｔ）と同様の操作で行った。
【００８８】
（実施例４：組換えＳＯＴおよびＳＧＴの発現ならびに精製）
上記実施例３で得られた組換えＳＯＴおよびＳＧＴの発現ベクターを、それぞれ大腸菌Ｓ１７−１に導入して形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地中で３７℃にて８時間培養した。細胞を回収し、ピペットを用いてＬＢ培地で３回洗浄して、カナマイシンを除去した。細胞を５００μＬのＬＢ培地に懸濁し、次いで放線菌S. lividans 1326株の胞子懸濁液と混合した。混合物をＩＳＰ Ｎｏ．４寒天プレート上に塗布し、３０℃にて１８〜２２時間培養した。カナマイシン２０μｇ／ｍＬおよびナリジキシン酸ナトリウム６７μｇ／ｍＬを含むソフトアガー栄養培地の４．５ｍＬを、寒天プレート上に分配し、３０℃にてさらに３日間インキュベートした。単一コロニーを、水道水中に２．０％大豆ミール、２．０％マンニトール、カナマイシン（２０ μｇ／ｍＬ）およびナリジキシン酸ナトリウム（５μｇ／ｍＬ）を含む培地を含む寒天プレート上に画線した。得られたS. lividans 1326形質転換体を、５００ｍｌ容バッフル付フラスコ中のＰＧ培地５０ｍＬに接種し、そして１８０ｒｐｍで回転振とうしながら３０℃にて６日間増殖させた。
【００８９】
組換えＳＯＴの培養上清を、４℃にて２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。組換えＳＯＴの精製は、上記の野生型と同様に行った。一方、組換えＳＧＴについては、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いることおよびVivapure Sスピンカラムから０．１５Ｍ ＮａＣｌで溶出することを除いて、組換えＳＯＴと同様に精製を行った。得られたそれぞれの酵素溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、精製組換えＳＯＴおよび組換えＳＧＴを得た。
【００９０】
（実施例５：組換えＳＯＴおよびＳＧＴについての生化学的特徴の比較検討）
トリプシンのコンセンサス基質であるＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（Ａｒｇ−ｐＮＡ）を、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの生化学的研究に用いた。標準的なアッセイを以下のように行った：１０μＬの酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中２ｍＭのＡｒｇ−ｐＮＡの９０μＬに添加し、そしてサーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃にて３０分間インキュベートした。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。インキュベーション後、反応混合物を９８℃にて１分間加熱して、酵素反応を停止した。次いで、２５μＬの反応混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中の７５μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加した。加水分解アッセイを、マイクロプレートリーダーを用いてｐ−ニトロアニリンの放出による４０５ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。
【００９１】
酵素活性に対するｐＨの影響については、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜６）、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜９）、およびグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９〜１０．６）中で検討した。酵素の至適温度については、１０ｍＭ ＣａＣｌ２の存在または不在下で適切な加熱処理（３０〜７０℃）で上記の条件下で決定した。
【００９２】
熱安定性試験を、以下のように行った：１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含むまたは含まない酵素溶液を、サーマルサイクラーを用いて種々の温度（３０〜７０℃）で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、残存活性を、上記の条件下で測定し、そして４℃での活性に対する比として算出した。酵素安定性に対するカルシウムの影響を、０〜１００ｍＭのＣａＣｌ２での熱安定性試験に基づいて検討した。相対活性を、カルシウムイオンを含まない場合の酵素活性に対する比として算出した。
【００９３】
加水分解活性の速度論的アッセイでは、反応を１．５ｍＬキュベット中で行った：０．８ｍＬの反応混合物は、３７℃にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．０６〜０．３ｍＭの範囲の最終濃度のＡｒｇ−ｐＮＡと精製酵素とを含む。１分当たりの４０５ｎｍでの吸光度の上昇を、U2800分光光度計（Hitachi）を用いてモニターした。初期速度を、光学密度プロファイルの直線部分から決定した（ε４０５ｎｍ=１０６００Ｍ−１ｃｍ−１）。酵素活性の１ユニットを、アッセイ条件下で１分当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを放出するに必要とされる酵素量として定義した。
【００９４】
至適ｐＨおよび温度、熱およびｐＨ安定性、インビビターなどの生化学的特性について検討した。結果を表２に示す。
【００９５】
【表２】
【００９６】
精製した組換えＳＯＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の野生型ＳＯＴと同じ分子量として約２４ｋＤａの分子量に対応する単一バンドを示した。ＳＯＴの特性は、至適ｐＨおよび至適温度ならびに熱安定性についてＳＧＴと同様であった。これらの組換え体は、熱安定性試験において、カルシウムイオンによって非常に安定化された（図４）。組換えＳＯＴは、カルシウムによって実質的に約８０倍安定化され、一方、組換えＳＧＴは、カルシウムによって約２０倍安定化された。なお、これらの活性は、カルシウムの存在によってわずかに増強された（ＳＯＴ：１．４倍、ＳＧＴ：１．２倍）。
【００９７】
基質としてＡｒｇ−ｐＮＡを用いる組換えＳＯＴおよびＳＧＴの見かけのＫｍおよびｋｃａｔ値を決定した（表２）。Ｋｍ値は、組換えＳＯＴおよびＳＧＴについて、それぞれ０．０１４ｍＭおよび０．０２６ｍＭであった。ｋｃａｔ値は、ＳＯＴおよびＳＧＴについてそれぞれ１２．７（ｓ−１）および５．８（ｓ−１）であった。したがって、ＳＯＴのｋｃａｔ／Ｋｍは、ＳＧＴよりも４．１倍高かった。
【００９８】
（実施例６：基質特異性の検討）
蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴＳ）コンビナトリアルライブラリーにより、基質特異性の解析を行った。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー（株式会社ペプチド研究所：配列番号３）は、図５に示される構造を有する基質のライブラリーである。これは、アミノ末端のＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ａ２ｐｒ）残基の側鎖に連結された高蛍光の２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）基を含む。このＮｍａは、Ｌｙｓのε−アミノ官能基に連結した２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基によって効率的に消光されている。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリーを基質として、上記実施例４で得た精製ＳＯＴおよびＳＧＴについて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて３７℃にて酵素反応を行った。
【００９９】
一次スクリーニングに、５０ｎｇの組換えＳＯＴおよびＳＧＴを用いた。ＦＲＥＴＳを用いる手順は、非特許文献２４に従って行った。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いてλｅｘ３５５ｎｍおよびλｅｍ４６０ｎｍでの蛍光強度の増加によってモニターした。組換えＳＯＴおよびＳＧＴのＰ１位での優先性を、図６に示す。図６から、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの両方とも、Ｐ１位で主にＡｒｇおよびＬｙｓ残基を優先することがわかった。
【０１００】
次いで、二次スクリーニングについては、ライブラリー中から最良の基質としてＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇ（配列番号３の４位のアミノ酸がＡｒｇである）を選択した。それぞれ１２ｎｇの組換えＳＯＴおよび３５ｎｇの組換えＳＧＴを用いて、３７℃にて５分間の酵素反応を行って、Ｐ２位およびＰ３位についての酵素の優先性を決定した。反応混合物へ酢酸を添加し、９５℃にて５分間加熱して、酵素反応を停止させ、そして基質の切断速度を決定した。得られた試料の約２５％の量が切断されていた。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−マススペクトロメトリー（ＭＳ）により、組換えＳＯＴおよびＳＧＴによって切断されたＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇに由来する配列を同定した。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１として比較したピーク面積から算出した。結果を図７に示す。
【０１０１】
図７に示すように、組換えＳＯＴおよびＳＧＴはいずれも、Ｐ２位でＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓを降順で優先し、そしてＰ３位でＡｒｇを優先した。両方の酵素とも、Ｐ２およびＰ３位で酸性残基を優先しなかった。
【０１０２】
（実施例７：組換えＳＯＴおよびＳＧＴによる種々のコラーゲンの加水分解の検討）
組換えＳＯＴおよびＳＧＴの天然コラーゲンに対する分解活性を、ウシアキレス腱由来の天然の不溶性Ｉ型コラーゲン（Sigma）およびヒト胎盤由来のＩＶ型コラーゲン（Sigma）を用いて、非特許文献１８に記載の手順に基づいて検討した。反応混合物は、２ｍｇコラーゲン、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．４ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および０．１ｍＬの酵素溶液を含んでいた。３７℃でのプレインキュベーション後、反応を、３７℃にて振とう（１０００ｒｐｍ）しながら３０〜６０分間行った。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。反応を、１μＬの０．２Ｍ ＨＣｌの添加によって停止した。遊離アミノ基の増加の初期速度を、ニンヒドリン法によって測定した。４℃にて１００００ｇでの１０分間の遠心分離後、０．１ｍｌの上清を、０．４ｍＬのニンヒドリン呈色試薬溶液（ナカライテスク株式会社）と混合し、そして９７℃にて１０分間加熱し、次いで、氷上で混合物を冷却した。次いで、２−プロパノール（１ｍＬ）を混合物に添加し、そして５７０ｎｍでの上清の吸光度の上昇を測定した。参照酵素として、クロストリジウム・ヒストリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のＩ型コラゲナーゼ（ＣｏｌＩ：Sigma）を用いた。１コラーゲン切断ユニットは、カルシウムイオンの存在下、３７℃にてｐＨ７．４で５時間インキュベートしたときのＩ型コラゲナーゼ（ＣｏｌＩ）によるコラーゲンからペプチドの遊離が、１．０μｍｏｌのロイシンに対するニンヒドリン呈色に相当する酵素量である。
【０１０３】
図８に示すように、組換えＳＯＴおよびＳＧＴは両方とも、繊維状のＩ型コラーゲンを顕著に分解した。これらのコラーゲン分解活性は、参照酵素としてのＣｏｌＩよりも非常に高かった（６．４〜８．３倍）（図８Ａ）。ＩＶ型コラーゲンについては、組換えＳＯＴのコラーゲン分解活性は組換えＳＧＴよりも５．６倍高かった（図８Ｂ）。このように、ＳＯＴは、Ｉ型およびＩＶ型の両方のコラーゲンを非常によく加水分解するが、ＳＧＴはＩＶ型コラーゲンを加水分解する能力に乏しいことを見出した。
【０１０４】
次に、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの基質特異性をさらに検討するために、フルオレセイン標識したウシ皮膚ＤＱ−Ｉ型コラーゲン、ヒト胎盤ＤＱ−ＩＶ型コラーゲン、ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチン、およびフルオレセインカゼイン（いずれもMolecular Probes）を基質として用いて決定した。３７℃にて５分間のプレインキュベーションの後、アッセイを、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝液を用いて、上記と同様に行った。参照酵素として、ＴＰＣＫ処理したウシ膵臓トリプシン（Sigma）およびＣｏｌＩを用いた。結果を図９に示す。
【０１０５】
上記の組換えＳＯＴの蛍光標識Ｉ型コラーゲンに対する加水分解活性は、組換えＳＧＴと同様であり、ＣｏｌＩよりも９．６倍高かった（図９Ａ）。これに対して、図９Ｂに示すように、ＩＶ型コラーゲンに対しては、組換えＳＯＴのみが非常に高い加水分解活性を有し、組換えＳＯＴの活性は、ＳＧＴよりも６．５倍高かった。蛍光標識したコラーゲンに対する加水分解の結果は、天然のコラーゲンに対する加水分解の結果とよく一致していた（図８および９）。ＳＯＴはまた、ゼラチンに対してもＳＧＴよりも高い加水分解活性を示した（図９Ｃ）。なお、カゼイン加水分解は、ウシ膵臓トリプシンがＳＯＴおよびＳＧＴよりもかなり高かった（図９Ｄ）。これらの結果は、構造タンパク質基質に対して、組換えＳＯＴは広い基質特異性を有することを示す。したがって、ＳＯＴは、ヘリックスコラーゲンおよび多くの切断を有する非ヘリックスコラーゲンの両方を分解し得、そして繊維状および基底膜コラーゲンを攻撃する能力を有する、独特の酵素であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するトリプシン様酵素が提供される。本発明のトリプシン様酵素を用いれば、これまで酵素的にほとんど分解されなかったＩＶ型コラーゲンを分解することができる。したがって、食品、医薬品などの分野において、基底膜コラーゲンを含む素材のさらなる利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来の精製トリプシン様酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動写真である。レーン１は分子量マーカーであり、そしてレーン２は、２μｇの精製酵素である。
【図２】ＳＯＴの遺伝子のヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を示す図である。推定−３５および−１０配列ならびに推定リボソーム結合部位（ＳＤ）を、ヌクレオチド配列中に下線を引いた。精製酵素を用いて決定したＮ末端および内部配列を、それぞれ太字および二重下線で示す。停止コドンをアステリスクで示す。
【図３】ストレプトマイセス由来の成熟トリプシンおよびトリプシノーゲンの一次構造のアラインメントを示す図である。
【図４】組換えＳＯＴおよびＳＧＴの活性とカルシウムイオン濃度との関係を示すグラフである。
【図５】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーの構造を示す。Ｘａａは、Ｃｙｓ以外の１９の天然アミノ酸のそれぞれが組み込まれた固定位置を示す。５アミノ酸残基（Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、およびＤ）の混合物を、各固定されたＸａａに対するＺａａ位の５アミノ酸残基（Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ、およびＲ）の混合物とともにＹａａ位に組み込んだ。
【図６】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーを用いた組換えＳＯＴ（上）およびＳＧＴ（下）のＰ１優先性（すなわち、好ましいＸａａ）を示すグラフである。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１００％として比較した割合で示す。
【図７】組換えＳＯＴおよびＳＧＴのＰ２およびＰ３優先性を示すグラフである。ＸａａをＡｒｇで固定したＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇを基質とし、加水分解産物を、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１として比較したピーク面積から算出した。
【図８】天然コラーゲンに対する組換えＳＯＴおよびＳＧＴの加水分解活性を示すグラフである。Ａは、ウシアキレス腱由来の不溶性Ｉ型コラーゲン、およびＢは、ヒト胎盤由来のＩＶ型コラーゲン基質とした場合の結果を示す。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。
【図９】種々のフルオレセイン結合した基質、すなわち、（Ａ）ウシ皮膚Ｉ型ＤＱ−コラーゲン、（Ｂ）ヒト胎盤ＩＶ型ＤＱ−コラーゲン、（Ｃ）ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチン、および（Ｄ）フルオレセインカゼインに対するＳＯＴ、ＳＧＴ、ウシ膵臓トリプシン、およびＣｏｌＩについての比活性を示すグラフである。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有する新規トリプシン様酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚、腱、および軟骨の主成分ならびに骨、歯、および角膜の有機成分であり、細胞外マトリクスの主要成分である。コラーゲンは、すべての高等生物において、最も豊富なタンパク質であり、哺乳動物のタンパク質の約２５〜３３％を構成する。コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を有しており、ポリペプチド鎖は、繰り返しトリペプチド配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙを含む。このＸおよびＹの位置のアミノ酸は、プロリンおよび翻訳後改変の４−ヒドロキシプロリンであることが多く、したがって、コラーゲンは、プロリンリッチなタンパク質である。コラーゲン分子は、ヒドロキシプロリンによってその三重らせんが非常に安定化されており（非特許文献１）、水不溶性繊維またはシートに組み立てられ、そしてほとんどのプロテアーゼに抵抗性である。
【０００３】
このようなコラーゲンタンパク質ファミリーとして、現在までに、少なくとも２５種が同定されている（非特許文献２）。これらは、三重らせんを形成しているドメインの長さおよび連続性、加水分解される残基と加水分解されない残基との割合、ヒドロキシリジングリコシル化の程度の差などによって区別されている。例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、およびＩＸ型コラーゲンは、非らせん端を有する連続する三重らせんを含む古典的繊維状コラーゲンである。一方、ＩＶ型コラーゲンは、より多くの非らせん領域を含みそして球形のドメインによって相互作用し得るテトラマーに組み立てられて、基底膜の構造足場になるシート様ネットワークを形成している。
【０００４】
コラーゲンは、多くの細胞事象に関連するため、種々の適用の可能性を有する生体材料である。さらに、コラーゲン分解物であるコラーゲンペプチドは、工業および医療目的の種々の生物学的活性を有することが報告されており、急速に広範な適用が確立されている。例えば、骨粗鬆症、胃潰瘍、および高血圧用の薬剤、皮膚保湿剤、保存剤などの用途が挙げられる。コラーゲンペプチドの調製のために現在使用される化学的切断方法は、非常に反応性の高いＣＮＢｒを必要とする（非特許文献３）。したがって、強力な活性を有しそして使用に安全であるコラーゲン分解酵素が、食品や医薬品産業への利用に所望される。
【０００５】
種々のコラーゲンの分子構造の差異は、各タイプを切断し得るコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）の性質に影響を及ぼす。コラーゲン分解酵素として、哺乳動物マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーが一般的に知られている。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−１３は、Ｉ〜ＩＩＩ型コラーゲンの三重らせんドメイン内で加水分解する（非特許文献４および５）。一方、ＭＭＰ−９は、Ｖ型およびＸＩ型コラーゲンの三重らせんを切断するが、Ｉ〜ＩＩＩ型コラーゲンを切断しない（非特許文献６および７）。ＭＭＰ−２は、ＩＶ型コラーゲンを切断し、そして変性コラーゲンであるゼラチンも分解することが知られている（非特許文献８）。近年、ＭＭＰのコラーゲン特異性が、基質配列と熱安定性との組み合わせに基づくことが報告されている（非特許文献９）。
【０００６】
コラーゲン分解については、３つのメカニズムが知られている：（１）上記のＭＭＰのような哺乳動物間質コラゲナーゼによるメカニズムであり、単一の部位でコラーゲンの安定な三重らせんを切断する；（２）システインプロテイナーゼのような広い特異性を有するプロテイナーゼよるメカニズムであり、天然のコラーゲンの非らせんテロペプチドを切断し、そして変性コラーゲン、すなわち、ゼラチンも分解する；および（３）細菌のコラゲナーゼによるメカニズムであり、天然の三重らせんを多数の部位で切断する。
【０００７】
非特許文献１０では、細菌のコラゲナーゼが、カテプシンＫ、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３よりも非常に高いコラーゲン分解活性を有することが示されている。細菌コラゲナーゼの中でも、クロストリジウム・ヒストリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼは、広く研究され、そして組織分散酵素として広く使用される（非特許文献１１）。好熱性のジオバシラス・コラゲノボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｖｏｒａｎｓ）ＭＯ−１株由来のプロテアーゼが、コラーゲンを分解し得ることも報告されている（非特許文献１２）。最近、クロストリジウム・ヒストリティカムのコラゲナーゼ（ＣｏｌＨ）およびジオバシラス・コラゲノボランスＭＯ−１プロテアーゼのコラーゲン結合ドメインが決定されている（非特許文献１３および１４）。しかし、これらは、基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンに対する分解活性があまり強くない。
【０００８】
また、近年、プロテアーゼの基質優先性について、ＦＲＥＴＳコンビナトリアルライブラリーを用いて検討されている（非特許文献１５〜１７および特許文献１）。この手法は、プロリンおよびヒドロキシプロリンを多く含むコラーゲンに対して加水分解活性を有するプロテアーゼについての検討に応用できる。しかし、網目構造を有するＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するプロテアーゼについての報告はない。
【特許文献１】特開２００６−１９７８０２号公報
【非特許文献１】Ramshaw, J. A.ら、J. Struct. Biol.，1998年，122巻，86-91頁
【非特許文献２】Kielty, C. M.およびGrant, M. E.、Connective Tissue and Its Heritable Disorders，Royce, P. M.およびSteinmann, B.編，Wiley-Liss, Inc.，New York，2002年，159-221頁
【非特許文献３】Watanabe, K.、Appl. Microbiol. Biotechnol.，2004年，63巻，520-526頁
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【非特許文献２４】Hatanaka, T.ら、Arch. Biochem. Biophys.，2005年，434巻，289-298頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、コラーゲンおよびそのペプチドは、生化学的および医学的機能のため、産業上興味深い生体材料であり、基底膜を形成するＩＶ型コラーゲンに対して高い分解活性を有するプロテアーゼが、その処理に必要とされている。したがって、本発明は、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するプロテアーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する、トリプシン様酵素を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記トリプシン様酵素は、以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；
（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；
（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および
（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；
を有する。
【００１２】
ある実施態様では、トリプシン様酵素は、上記ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）により産生される。
【００１３】
さらなる実施態様では、上記トリプシン様酵素は、
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
別の実施態様では、上記トリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項１から４のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素であって、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１５】
本発明はまた、トリプシン様酵素をコードする遺伝子を提供し、該トリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００１６】
１つの実施態様では、上記遺伝子において、上記メトリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する。
【００１７】
本発明はさらに、上記のいずれかの遺伝子を含む、発現用担体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、上記のいずれかの遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記の形質転換細胞により産生される、組換えトリプシン様酵素を提供する。
【００２０】
本発明はまた、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するトリプシン様酵素が提供される。本発明のトリプシン様酵素を用いれば、これまで酵素的にほとんど分解されなかったＩＶ型コラーゲンを分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字または１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、ＡｌａまたはＡ；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ；システインは、ＣｙｓまたはＣ；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥ；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ；グリシンは、ＧｌｙまたはＧ；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ；リジンは、ＬｙｓまたはＫ；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ；フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ；プロリンは、ＰｒｏまたはＰ；セリンは、ＳｅｒまたはＳ；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴ；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ；チロシンは、ＴｙｒまたはＹ；そしてバリンは、ＶａｌまたはＶを示す。また、任意のアミノ酸は、ＸａａまたはＸ、あるいはＹａａまたはＺａａと表記する場合がある。
【００２３】
本明細書において、「置換、欠失、挿入または付加」を有するアミノ酸配列とは、天然由来の変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的な変異を導入されたアミノ酸配列であってもよい。「アミノ酸配列の置換、欠失、挿入または付加」は、当該技術分野で通常用いられる部位特異的変異導入法などにより、アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸に対して生じさせ得る。得られたアミノ酸配列を有するペプチドが、元のペプチドと同等またはそれ以上の活性を示せばよい。
【００２４】
本発明のトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する。
【００２５】
本発明において、酵素のコラーゲン分解活性は、任意の方法で測定され得る。例えば、天然のコラーゲンを基質として用いて、酵素により遊離されたアミノ基の増加の初期速度を、ニンヒドリン法によって測定する（非特許文献１８）。また、酵素のタンパク質分解活性を、蛍光標識されたＤＱ−ゼラチン、ＤＱ−コラーゲン、またはフルオレセインカゼイン（いずれもMolecular Probesより入手可能）を用いて測定してもよい。これらの基質は、フルオレセインで大量に標識されており、その分子内ではほぼ完全に消光しているが、酵素加水分解により分子内自己消光が緩和され、明るい蛍光反応産物を生成する。あるいは、酵素の加水分解活性は、トリプシンのコンセンサス基質であるベンジル−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロフェノール・ＨＣｌ（Ａｒｇ−ｐＮＡ）を基質として用いて、ｐ−ニトロアニリンの放出による４０５ｎｍの吸光度を測定してもよい。
【００２６】
本発明のトリプシン様酵素は、至適反応ｐＨが、好ましくはｐＨ８．０〜９．０であり、至適反応温度が、カルシウムイオン不在下で約５０℃、およびカルシウムイオン存在下で約５５℃である。また、本発明のトリプシン様酵素は、９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃の熱安定性、およびカルシウムイオン存在下で５０℃の熱安定性を示す。本発明のトリプシン様酵素は、カルシウムイオンの存在下で、安定化される。
【００２７】
本発明のトリプシン様酵素の酵素活性は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって阻害され、そしてＥＤＴＡによってわずかに阻害される。例えば、５ｍＭのＰＭＳＦの存在下では７１％阻害され、そして５０ｍＭのＥＤＴＡの存在下では、Ａｒｇ−ｐＮＡに対する加水分解活性が１４％阻害される。
【００２８】
本発明のトリプシン様酵素は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、好ましくは、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対して、３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性についての基質優先性を有する。
【００２９】
本発明のトリプシン様酵素は、好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に基づいて算出された分子量が約２４ｋＤａであり、単量体である。
【００３０】
さらに、本発明のトリプシン様酵素は、基質としてＡｒｇ−ｐＮＡを用いる場合、好ましくは、Ｋｍ値は約０．０１４ｍＭ、そしてｋｃａｔ値は約１２．７（ｓ−１）である。
【００３１】
本発明のトリプシン様酵素としては、ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）［Streptomyces omiyaensis 84A06と命名・表示され、受託番号：（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）（寄託日：２００７年１１月３０日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］により産生されるトリプシン様酵素が挙げられる。
【００３２】
本発明のストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株は、土壌より分離された放線菌であり、ＩＳＰ培地Ｎｏ．２（「ダイゴ」日本製薬株式会社）にて３０℃で４８時間培養した場合、以下の（ｉ）〜（iii）の性質を有する。
【００３３】
（ｉ）形態的性質（ＩＳＰ培地Ｎｏ．２で生育）
コロニーサイズ：φ４．０〜５．０ｍｍ
コロニー表面の形状：綿状（７２時間培養）および湿潤状（１週間以上培養）
コロニーの色調：表面（気菌糸）灰色および裏面（基生菌糸）黄土色
水溶性色素産生：−
なお、ＩＳＰ培地Ｎｏ．３で生育させた場合、表面：淡黄色（湿潤）および基底：淡黄色（綿状）；ＩＳＰ培地Ｎｏ．４で生育させた場合、表面：白色（綿状）および基底：白色；およびＩＳＰ培地Ｎｏ．５で生育させた場合、表面：白色（綿状）および基底：淡黄色であった。
【００３４】
（ii）微視的性質
気菌糸の形状：分岐あり、幅０．８〜０．９μｍ
【００３５】
（iii）生理・生化学的性質（＋は陽性、−は陰性を示す）
ゼラチンの液化： ＋
デンプンの加水分解： ＋
硝酸還元反応： ＋
脱脂粉乳のペプトン化・凝固： ペプトン化
生育温度の範囲（℃）：
２０ ＋
２５ ＋
３０ ＋
３７ ＋
４５ −
耐塩性（％）：
４．０ ＋
７．０ −
１０．０ −
１３．０ −
炭素源の利用性：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．９ −
グルコース ＋
Ｌ−ラムノース ＋
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−フラクトース ＋
Ｌ−アラビノース −
ラフィノース −
シュクロース ＋
Ｄ−キシロース ＋
イノシトール −
メラニン様色素産生：
ＩＳＰ培地Ｎｏ．６ −
ＩＳＰ培地Ｎｏ．７ −
【００３６】
このストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株を培養し、培養上清から単離・精製することによって、トリプシン様酵素を容易に得ることができる。ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株の培養条件は、特に限定されず、約３０℃、例えば、２５〜３４℃で、６日間前後、例えば、３〜１０日間撹拌しながら培養する条件が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株を、２％(w/v)グルコース、０．５％(w/v)ポリペプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．８％(w/v)Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０５％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培養培地（ＰＧ培地）に接種し、そして１２５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃にて６日間培養する。
【００３８】
得られた培養物は、細胞と培地成分とを分離し得る手段、例えば、遠心分離、限外ろ過などに供し、培養上清を得る。得られた培養上清は、適切な緩衝液などに対して透析してもよい。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの当該技術分野で通常用いられるタンパク質精製法により、本発明のトリプシン様酵素を精製することができる。
【００３９】
より具体的には、４℃にて、７０％(w/v)飽和硫酸アンモニウム分画に供し、沈殿物を回収する。沈殿物を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析した後、上記イオン交換カラムにかけ、結合したタンパク質を、０．２５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出し、そして２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析する。上清を、さらにイオン交換カラムにかけて、ＮａＣｌグラジエントにより活性の高い画分を溶出させることにより、目的のトリプシン様酵素を得ることができる。
【００４０】
このようにして得られるストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来のトリプシン様酵素（ＳＯＴ）の一次構造は、ストレプトマイセス・ファラディアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）由来のトリプシノーゲン（ＳＦＴ：非特許文献１９）、ストレプトマイセス・エクスフォリアタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ）由来のトリプシン様プロテアーゼ前駆体（ＳＥＴ：非特許文献２０）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のトリプシン（ＳＧＴ：非特許文献２１〜２３）と、それぞれ８２％、８２％、および７７％の配列同一性を示す。また、ＳＯＴの推定アミノ酸配列では、ＳＧＴ中の活性なＳｅｒ１９５およびＨｉｓ５７残基、ならびに正荷電した基質の結合に重要な役割を果たすことが知られているＡｓｐ１８９が保存されている。
【００４１】
本発明のトリプシン様酵素としては、より具体的には、
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、トリプシン様酵素が挙げられる。
【００４２】
上記（Ａ）の配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列は、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株のトリプシン様酵素（ＳＯＴ）のアミノ酸配列である。なお、配列表の配列番号２の１位から３４位のアミノ酸配列は、ＳＯＴのシグナル配列である。
【００４３】
本発明においては、上記ＳＯＴの活性の測定法の条件下に、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有するものであれば、本発明のトリプシン様酵素には、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントの配列を有するポリペプチドも含まれる。配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントとしては、上記（Ｂ）または（Ｃ）のアミノ酸配列が挙げられる。また、後述の核酸によりコードされるポリペプチドであって、上記トリプシン様酵素活性の測定法の条件下に同様の活性（特に、ＩＶ型コラーゲン加水分解活性）を示すものであれば、本発明のトリプシン様酵素に含まれる。
【００４４】
上記（Ｂ）および（Ｃ）のアミノ酸配列のバリアントの天然の供給源となる生物は、特に限定されるものではなく、ストレプトマイセス・オミヤエンシスに分類される他の株などが挙げられる。
【００４５】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加（以下、「変異」ともいう）の数は、上記メタロエンドペプチダーゼ活性の測定法の条件下に同様の活性を示す範囲であればよく、少なくとも１個、好ましくは、１個〜複数個、より好ましくは、１個〜数個である。上記変異を有するアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に、所望の部位またはアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列のバリアントに準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異の導入は、例えば、慣用のＰＣＲを用いた部位特異的変異導入方法などにより行われ得る。なお、ＳＯＴのシグナル配列は、他の適切なシグナル配列に置き換えられていてもよい。
【００４６】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、類似した物理学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換（保存的置換）されたアミノ酸配列が挙げられる。保存的置換は、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などに類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換、本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみ該ポリペプチドの立体構造や折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換などが挙げられる。より具体的には、上記（Ｂ）のアミノ酸配列としては、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸と保存的置換されたアミノ酸配列を有し、該保存的置換が、以下のアミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシンおよびアラニン、
（２）バリン、イソロイシンおよびロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、
（４）セリンおよびスレオニン、
（５）リジンおよびアルギニン、および
（６）フェニルアラニンおよびチロシン
からなる群より選択されるアミノ酸群に属するアミノ酸残基内で行われたものであるアミノ酸配列が挙げられる。
【００４７】
上記（Ｃ）において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、本明細書においては、配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００４８】
本発明においては、配列同一性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上である。
【００４９】
本発明のトリプシン様酵素はまた、以下に詳述する本発明の遺伝子を用いて、遺伝子工学的に製造することができる。例えば、ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株とは異なる異種細胞において、本発明のトリプシン様酵素を発現させることができる。
【００５０】
本発明のトリプシン様酵素をコードする遺伝子は、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００５１】
このうち（ａ）〜（ｃ）の塩基配列は、それぞれ、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、そして（ｄ）の塩基配列は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列であり得る。この遺伝子によってコードされるトリプシン様酵素は、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する。
【００５２】
上記（ｄ）の「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(v/v)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、さらに０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃または６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃または６５℃以上の温度条件で洗浄することなどの、より厳しい条件も含む。また、本発明においては、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に関して、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも８５％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であり、該塩基配列に関して、配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列との配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列との特異的なハイブリダイゼーションが達成され得る条件であることが望ましい。
【００５３】
なお、本明細書においては、塩基配列の配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００５４】
また、本発明の遺伝子に基づき、本発明のトリプシン様酵素と同等の生理活性を示すアイソザイムをスクリーニングするための、プローブおよびプライマー対も提供できる。
【００５５】
さらに、本発明の遺伝子を含むトリプシン様酵素の発現用担体を用いて、本発明の遺伝子によりコードされる組換えトリプシン様酵素を製造することもできる。本明細書において、「発現用担体」とは、慣用の生物ベクターなどを基本骨格として含有し、かつ適切な位置に本発明の遺伝子が作動可能に連結された核酸構築物；金粒子、リポソーム、デキストラン、リン酸カルシウムなどの担体に、細胞内での発現に適したエレメントなどを有する本発明の遺伝子を担持させた構築物などを意味する。
【００５６】
本発明のトリプシン様酵素の発現用担体を用いて、本発明のトリプシン様酵素をストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株以外の細胞に導入することができ、それにより、異種細胞において本発明のトリプシン様酵素を発現させることができる。したがって、本発明のトリプシン様酵素の工業的な生産のための手段が提供される。
【００５７】
上記生物ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＴｋｍＳ２（Mishima, N.ら、Biotechnol. Prog.、第13巻、864-868頁、1997年）、ｐＯＭａｌ（New England Biolabs）などの大腸菌用プラスミドベクター；λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などの大腸菌用ファージベクター；ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＩＣＺα（インビトロジェン株式会社）などの酵母用ベクター；ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet.、203巻、468-478頁、1986年）、ｐＫＣ１０６４（Gene、103巻、97-99頁、1991年）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene、165巻、149-150頁、1995年）、ｐＩＪ７０２（Katz, E.ら、J. Gen. Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）、およびｐＩＪ８６００（Sun, J.ら、Microbiology、145巻、2221-2227頁、1999年）などの放線菌用ベクター；ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどの昆虫細胞用ベクター；ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４などの動物細胞用ベクターなどが挙げられる。このようなベクターには、適切なプロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなど）、選択マーカー遺伝子、ターミネーターなどのエレメントを適宜有していてもよい。
【００５８】
また、上記ベクターは、本発明のトリプシン様酵素を、慣用のタグ（例えば、Ｈｉｓタグなど）や融合パートナー（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）と融合した状態で発現させ得るベクターであってもよい。
【００５９】
このようなベクターの調製に用いられる菌としては、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌が挙げられ、具体的には、例えば、放線菌、大腸菌などが挙げられる。より具体的には、放線菌としては、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２３など、そして大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９などが挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、安全性などの観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９が望ましい。
【００６０】
本発明のトリプシン様酵素の発現用担体は、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞を形質転換して、形質転換細胞を作製する。形質転換法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクル銃によるボンバードメント法など、当業者に周知の方法が採用される。
【００６１】
本発明においては、宿主細胞として、好適には微生物（宿主菌）が用いられる。宿主菌としては、放線菌、大腸菌、バシラス属菌、シュードモナス属菌、サーマス属菌、アグロバクテリウム属菌、酵母（例えば、メタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａなど）などが挙げられる。中でも、本発明においては、放線菌が好適に用いられる。
【００６２】
本発明において、放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌をいう。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌などに生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、およびノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。本発明において放線菌とは、好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓ．ｓｅｐｔａｔｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本発明においては、宿主菌として、特にストレプトマイセス・リビダンスが好適に用いられる。このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、種々のカタログに記載されており、当業者であれば容易に入手可能である。
【００６３】
宿主細胞への本発明の発現用担体の導入により得られた細胞が、目的の形質転換細胞であることは、細胞または該細胞の培養上清について、上記トリプシン様酵素の活性の測定法により、トリプシン様酵素活性、特にＩＶ型コラーゲン加水分解活性が検出されることを指標として、確認され得る。
【００６４】
本発明の形質転換細胞を培養して増殖させることにより、本発明のトリプシン様酵素を遺伝子工学的に容易に精製できる状態で発現させることができ、それにより、該トリプシン様酵素を工業的に製造することができる。
【００６５】
本発明の組換えトリプシン様酵素の製造においては、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間などについて、トリプシン様酵素の発現の最適な条件を決定することによって、効率よく組換えトリプシン様酵素を生産させることができる。
【００６６】
本発明の形質転換細胞の培養に通常用いられる培地としては、天然培地および合成培地のいずれを用いてもよい。液体培地または固体培地を使用することができる。例えば、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であればよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸などを含んでいてもよい。その他に、無機塩として、微量のカリウム、ナトリウム、鉄などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩などを含んでいてもよい。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００６７】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、宿主細胞が増殖し、目的のタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振とう培養または攪拌培養などの好気的条件下で、１０℃〜４０℃、好ましくは２８℃で１２〜１２０時間行われる。ｐＨは、４から１０、好ましくは６から８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【００６８】
形質転換細胞が生産する組換えトリプシン様酵素は、それが細胞内に生産されるときは細胞内の他のタンパク質、他のポリペプチドなどが共存するが、これらは発現されるトリプシン様酵素の量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、トリプシン様酵素が菌体外に分泌される。
【００６９】
形質転換細胞の培養物からトリプシン様酵素活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換細胞が大腸菌のように細胞内にトリプシン様酵素活性を有するポリペプチドが蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を集め、得られた細胞を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。用いる形質転換細胞によっては、発現産物が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行えばよい。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、実施例により限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第２版（ザンブルーク（Sambrook, J）ら、1989年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。
【００７１】
以下の実施例における一般的なタンパク質は、蛍光性ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチンを用いて決定した。ＤＱ−ゼラチンは、フルオレセインで大量に標識されており、その分子内ではほぼ完全に消光しているが、酵素加水分解により分子内自己消光が緩和され、明るい蛍光反応産物を生成する。代表的には、アッセイを、以下のように行った：１０μＬの酵素溶液および１０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＤＱ−ゼラチンを、蛍光用のマイクロタイタープレートのウェル中の１００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に添加し、そして３７℃にてインキュベートした。反応を、酵素溶液の添加によって開始した。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いてλｅｘ５３５ｎｍおよびλｅｍ４８５ｎｍでの蛍光強度の増加によってモニターした。反応速度を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：和光純薬工業株式会社）溶液を用いてプロットした標準曲線から推定した。１ユニットの活性を、アッセイ条件下で１分当たり１ｎｍｏｌのＦＩＴＣを放出するに必要とされる酵素量として定義した。
【００７２】
（実施例１：ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株の培養物からのトリプシン様酵素の精製および生化学的特徴）
土壌より分離された放線菌ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６株を、２％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．８％Ｋ２ＨＰＯ４、および０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む培養培地（ＰＧ培地）に接種し、そして１２５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃にて６日間培養した。
【００７３】
次いで、培養上清を、４℃にて７０％飽和硫酸アンモニウム分画に付し、沈殿物を４℃にて２００００ｒｐｍで１００分間の遠心分離によって回収した。沈殿物を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析した。得られた試料を、上記緩衝液で平衡化したVivapure Sスピンカラム（VIVASCIENCE）に供した。結合したタンパク質を、０．２５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出し、そして溶出液を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。遠心分離後、上清を、透析緩衝液で予め平衡化したMono S HR5/5カラム（Pharmacia Biotech）に供した。緩衝液中０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線グラジエントにより酵素を溶出した。精製過程を表１に示す。精製工程において、酵素活性を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中３７℃にて８３μｇ／ｍＬのＤＱ−ゼラチン（Molecular Probes）を用いて決定した。１ユニットの活性を、上記の条件下で１分当たり１ｎｍｏｌのＦＩＴＣを放出するに必要とされる酵素の量として定義した。
【００７４】
【表１】
【００７５】
１０００ｍＬの培養上清から、トリプシン様酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ均一にまで精製し（図１）、０．７％の収率で９９．３倍に精製し、そしてゼラチン加水分解の高い比活性（１１４６Ｕ／ｍｇ）を得た。このストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来のトリプシン様酵素を、以下、ＳＯＴと記載する場合がある。ＳＯＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量が約２４ｋＤａであることを確認した。また、精製ＳＯＴは、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）により酵素活性が７１％阻害され、そしてＥＤＴＡによっても１４％阻害された。
【００７６】
（実施例２：トリプシン様酵素の遺伝子の取得）
精製ＳＯＴを、ＰＶＤＦメンブラン（Bio-Rad社）上にエレクトロブロットし、次いでプロテインシークエンサーにかけて、Ｎ末端アミノ酸配列（ＶＶＧＧＴＲＡＡＱＧＥＦＰ：配列番号４）を同定した。また、精製ＳＯＴを、通常試薬として用いられるトリプシン（Sigma）で処理し、トリプシン処理ペプチド断片を得た。得られたトリプシン処理ペプチド断片を、ＬＣ−ＭＳにより解析し、内部アミノ酸配列（ＬＡＥＴＴＡＹＮＳＧＴＦ：配列番号５、ＧＫＤＷＡＬＩＫ：配列番号６、およびＬＡＳＰＩＴＳＬＰＴＬ：配列番号７）を同定した。
【００７７】
次に、ゲノムＤＮＡを、Hopwoodらの方法（D.A. Hopwoodら、A Laboratory Manual, The John Ines Foundation，Norwich，1985年，70-84頁）を用いてストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株から調製した。ＳＯＴのＮ末端配列（ＶＶＧＧＴＲＡＡＱＧＥＦＰ：配列番号４）および内部配列（ＬＡＥＴＴＡＹＮＳＧＴＦ：配列番号５）から縮重ＰＣＲプライマー（フォワード：５’−ＣＧ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＣＡＧＧＧ（ＣＧ）ＧＡＧＴＴＣＣＣ−３’（配列番号８）およびリバース：５’−ＴＴＧＴＡ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）ＧＴ（ＣＧ）ＧＴＣＴＣ（ＣＧ）ＧＣ（ＣＧ）Ａ−３’（配列番号９））を設計し、これらを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、９４℃にて１分のインキュベーションの後、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて３０秒を３５サイクル行い、次いで７２℃にて５分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Promega）中にクローニングし、そして配列決定した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したプローブを、ＳＯＴ遺伝子配列の一部およびＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて合成した。このプローブを、ＳｍａＩで切断したゲノムＤＮＡの約１．２ｋｂフラグメントにハイブリダイズさせた。次に、これらのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて回収し、そして自己ライゲートさせた。ライゲーション産物を、ＳＯＴ遺伝子の部分ＤＮＡフラグメントから設計したプライマーセットを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。結果を図２に示す。
【００７８】
図２に、ＳＯＴ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、ＤＤＢＪデータベースアクセッション番号：ＡＢ３６２８３７）およびその推定アミノ酸配列を示す。オープンリーディングフレームは７８６ヌクレオチド長であり、推定分子量２６７０４を有する２６１アミノ酸をコードすると予測した。成熟酵素について算出した分子量は、２２８９２であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した実測分子量（約２４ｋＤａ）と一致した。推定−３５および−１０配列ならびに推定リボソーム結合部位（ＳＤ）を、ヌクレオチド配列中に下線を引いた。精製ＳＯＴを用いて決定したＮ末端および内部配列を、それぞれ太字および二重下線で示す。停止コドンをアステリスクで示す。
【００７９】
また、成熟ＳＯＴの一次構造について、マルチプル配列アラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムを用いて行った。アラインメントを図３に示す。図３においては、ＳＧＴ（ストレプトマイセス・グリセウス由来のトリプシン）、ＳＦＴ（ストレプトマイセス・ファラディアエ由来のトリプシノーゲン）、およびＳＥＴ（ストレプトマイセス・エクスフォリアタスのトリプシン様プロテアーゼ前駆体）と並べた。すべての配列で保存された残基を、白抜き文字で示す。ＳＯＴは、ＳＧＴ、ＳＦＴ、およびＳＥＴとそれぞれ７７％、８２％、および８２％の配列同一性を示し、トリプシンファミリーに属することがわかった。また、ＳＯＴの推定アミノ酸配列では、ＳＧＴ中の活性中心にあるＳｅｒ１９５およびＨｉｓ５７残基、ならびに正荷電した基質の結合に重要な役割を果たすことが知られているＡｓｐ１８９が保存されていた。
【００８０】
（参考例１：発現ベクターｐＴＯＮＡ５の作製）
大腸菌と放線菌との間の遺伝子間結合によって、ストレプトマイセスのメタロエンドペプチダーゼのプロモーターを含む発現ベクターｐＴＯＮＡ５ａを構築した。
【００８１】
まず、pBluescript II KS (-)（TOYOBO）を鋳型に大腸菌ＪＭ１０９のｏｒｉ（０．６ｋｂ）の部分をプライマー１および２（配列番号１０および１１）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分の後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分を３０サイクル繰り返し、その後４℃に冷却した。ＰＣＲには、KOD plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いた。次いで、ｐＴＹＭ１８（オナカ（Onaka,H.）ら、J. Antibiotics、56巻、950-956頁、2003年）を鋳型に、ａｐｈＩＩ（大腸菌−放線菌カナマイシン耐性遺伝子：１．３ｋｂ）を、プライマー３および４（配列番号１２および１３）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。
【００８２】
得られた２つの断片をそれぞれ制限酵素SspIおよびPstIで処理し、２つの断片を互いにライゲーションした後、大腸菌に導入した。大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１％ＮａＣｌ、１％ポリペプトン、および０．５％酵母エキス）中３７℃にてカナマイシンを選択マーカーにして、ライゲーションした断片を含むプラスミドｐＢＳａｐｈＩＩを得た。ｐＩＪ７０２（モルナー（Molnar）ら、J. Ferment. Bioeng.、72巻、368-372頁、1991年）および得られたｐＢＳａｐｈＩＩをそれぞれ制限酵素PstIで処理し、２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥ７０２を得た。
【００８３】
次に、ｐＴＹＭ１８を鋳型にｏｒｉＴ（０．８ｋｂ）をプライマー５および６（配列番号１４および１５）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。得られた断片を制限酵素HincIIおよびSmaIで処理し、そしてｐＩＪＥ７０２を制限酵素SspIで処理した。得られた２つの断片をライゲーションした後、大腸菌に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＩＪＥＣ７０２を得た。次いで、ｐＩＪＥＣ７０２のNdeI部位を、QuikChange II Kit（Stratagene）ならびにプライマー７および８（配列番号１６および１７）を用いてサイレント変異によって欠失させ、ｐＩＪＥＣ’７０２を得た。
【００８４】
次に、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを、S. septatus TH-2［Streptomyces septatus TH-2と命名・表示され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センター（現：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている］から、サイトウ・ミウラ法（サイトウ（Saito,H.）ら、Biochem. Biophys. Acta.，72巻、619-629頁、1963年）により調製した。ＳＳＭＰプロモーター（０．４ｋｂ）を、S. septatus TH-2ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー９および１０（配列番号１８および１９）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。また、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡをS. aureofaciens TH-3（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４３）から上記と同様の方法により調製した。ＴＨ−３ ｃｏｌｌターミネーター（０．５ｋｂ）を、S. aureofaciens TH-3ゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１１および１２（それぞれ配列番号２０および２１）を用いて上記と同様にＰＣＲで増幅した。ＳＳＭＰプロモーター断片を、AseIおよびEcoRIで処理し、ターミネーター断片をEcoRIおよびBglIIで処理し、そしてｐＩＪＥＣ’７０２を制限酵素AseIおよびBglIIで処理した。得られた３つの断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。カナマイシンを選択マーカーにして、プラスミドｐＴＯＮＡ５を得た。プラスミドｐＴＯＮＡ５の構成（制限酵素地図）を図８に示す。このプラスミドｐＴＯＮＡ５には、ＳＳＭＰプロモーター配列（配列番号２２）およびＴＨ−３ ｃｏｌｌターミネーター（配列番号２３）が含まれている。
【００８５】
（実施例３：組換えＳＯＴ発現ベクターおよび組換えＳＧＴ発現ベクターの構築）
ＳＯＴの生化学的研究のために、株の入手可能性の点でＳＧＴ（ストレプトマイセス・グリセウス由来のトリプシン）を比較酵素として選択した。そこで、組換え酵素を、活性形態として細胞外培地中に分泌するように、S. lividans 1326株をＳＯＴまたはＳＧＴ発現用の宿主株として用いて、ＳＯＴおよびＳＧＴについて、それぞれ以下のようにして発現ベクターを構築した。
【００８６】
まず、ＳＯＴ遺伝子を、ＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマー（５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＣ−３’：配列番号２４（ＡＴＧが開始コドン））と停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧ−３’：配列番号２５（ＴＴＡが停止コドン））とのセットおよびＫＯＤ ｖｅｒ．２ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントを、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングして配列決定した。ＳＯＴをコードするＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＴＯＮＡ５ａのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結し、発現ベクターｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｏｔ）を得た。
【００８７】
次に、ＳＧＴをコードする遺伝子を、ＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマー（５’−ＣＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＣ−３’：配列番号２６（ＡＴＧが開始コドン））とＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧ−３’：配列番号２７（ＴＣＡが停止コドン））とのセットならびにストレプトマイセス・グリセウスＡＴＣＣ １０１３７株のゲノムを用いて、ＤＮＡＫＯＤ−ｐｌｕｓ Ｖｅｒ．２キット（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーは、非特許文献２２に開示されているトリプシン遺伝子（ｓｐｒＴ）のヌクレオチド配列から設計した。ＳＧＴをコードする遺伝子を有する発現ベクター（ｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｇｔ））の構築は、上記のｐＴＯＮＡ５ａ（ｓｏｔ）と同様の操作で行った。
【００８８】
（実施例４：組換えＳＯＴおよびＳＧＴの発現ならびに精製）
上記実施例３で得られた組換えＳＯＴおよびＳＧＴの発現ベクターを、それぞれ大腸菌Ｓ１７−１に導入して形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地中で３７℃にて８時間培養した。細胞を回収し、ピペットを用いてＬＢ培地で３回洗浄して、カナマイシンを除去した。細胞を５００μＬのＬＢ培地に懸濁し、次いで放線菌S. lividans 1326株の胞子懸濁液と混合した。混合物をＩＳＰ Ｎｏ．４寒天プレート上に塗布し、３０℃にて１８〜２２時間培養した。カナマイシン２０μｇ／ｍＬおよびナリジキシン酸ナトリウム６７μｇ／ｍＬを含むソフトアガー栄養培地の４．５ｍＬを、寒天プレート上に分配し、３０℃にてさらに３日間インキュベートした。単一コロニーを、水道水中に２．０％大豆ミール、２．０％マンニトール、カナマイシン（２０ μｇ／ｍＬ）およびナリジキシン酸ナトリウム（５μｇ／ｍＬ）を含む培地を含む寒天プレート上に画線した。得られたS. lividans 1326形質転換体を、５００ｍｌ容バッフル付フラスコ中のＰＧ培地５０ｍＬに接種し、そして１８０ｒｐｍで回転振とうしながら３０℃にて６日間増殖させた。
【００８９】
組換えＳＯＴの培養上清を、４℃にて２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。組換えＳＯＴの精製は、上記の野生型と同様に行った。一方、組換えＳＧＴについては、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いることおよびVivapure Sスピンカラムから０．１５Ｍ ＮａＣｌで溶出することを除いて、組換えＳＯＴと同様に精製を行った。得られたそれぞれの酵素溶液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、精製組換えＳＯＴおよび組換えＳＧＴを得た。
【００９０】
（実施例５：組換えＳＯＴおよびＳＧＴについての生化学的特徴の比較検討）
トリプシンのコンセンサス基質であるＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（Ａｒｇ−ｐＮＡ）を、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの生化学的研究に用いた。標準的なアッセイを以下のように行った：１０μＬの酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中２ｍＭのＡｒｇ−ｐＮＡの９０μＬに添加し、そしてサーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃にて３０分間インキュベートした。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。インキュベーション後、反応混合物を９８℃にて１分間加熱して、酵素反応を停止した。次いで、２５μＬの反応混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中の７５μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加した。加水分解アッセイを、マイクロプレートリーダーを用いてｐ−ニトロアニリンの放出による４０５ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。
【００９１】
酵素活性に対するｐＨの影響については、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜６）、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜９）、およびグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ９〜１０．６）中で検討した。酵素の至適温度については、１０ｍＭ ＣａＣｌ２の存在または不在下で適切な加熱処理（３０〜７０℃）で上記の条件下で決定した。
【００９２】
熱安定性試験を、以下のように行った：１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含むまたは含まない酵素溶液を、サーマルサイクラーを用いて種々の温度（３０〜７０℃）で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、残存活性を、上記の条件下で測定し、そして４℃での活性に対する比として算出した。酵素安定性に対するカルシウムの影響を、０〜１００ｍＭのＣａＣｌ２での熱安定性試験に基づいて検討した。相対活性を、カルシウムイオンを含まない場合の酵素活性に対する比として算出した。
【００９３】
加水分解活性の速度論的アッセイでは、反応を１．５ｍＬキュベット中で行った：０．８ｍＬの反応混合物は、３７℃にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．０６〜０．３ｍＭの範囲の最終濃度のＡｒｇ−ｐＮＡと精製酵素とを含む。１分当たりの４０５ｎｍでの吸光度の上昇を、U2800分光光度計（Hitachi）を用いてモニターした。初期速度を、光学密度プロファイルの直線部分から決定した（ε４０５ｎｍ=１０６００Ｍ−１ｃｍ−１）。酵素活性の１ユニットを、アッセイ条件下で１分当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを放出するに必要とされる酵素量として定義した。
【００９４】
至適ｐＨおよび温度、熱およびｐＨ安定性、インビビターなどの生化学的特性について検討した。結果を表２に示す。
【００９５】
【表２】
【００９６】
精製した組換えＳＯＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の野生型ＳＯＴと同じ分子量として約２４ｋＤａの分子量に対応する単一バンドを示した。ＳＯＴの特性は、至適ｐＨおよび至適温度ならびに熱安定性についてＳＧＴと同様であった。これらの組換え体は、熱安定性試験において、カルシウムイオンによって非常に安定化された（図４）。組換えＳＯＴは、カルシウムによって実質的に約８０倍安定化され、一方、組換えＳＧＴは、カルシウムによって約２０倍安定化された。なお、これらの活性は、カルシウムの存在によってわずかに増強された（ＳＯＴ：１．４倍、ＳＧＴ：１．２倍）。
【００９７】
基質としてＡｒｇ−ｐＮＡを用いる組換えＳＯＴおよびＳＧＴの見かけのＫｍおよびｋｃａｔ値を決定した（表２）。Ｋｍ値は、組換えＳＯＴおよびＳＧＴについて、それぞれ０．０１４ｍＭおよび０．０２６ｍＭであった。ｋｃａｔ値は、ＳＯＴおよびＳＧＴについてそれぞれ１２．７（ｓ−１）および５．８（ｓ−１）であった。したがって、ＳＯＴのｋｃａｔ／Ｋｍは、ＳＧＴよりも４．１倍高かった。
【００９８】
（実施例６：基質特異性の検討）
蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴＳ）コンビナトリアルライブラリーにより、基質特異性の解析を行った。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリー（株式会社ペプチド研究所：配列番号３）は、図５に示される構造を有する基質のライブラリーである。これは、アミノ末端のＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ａ２ｐｒ）残基の側鎖に連結された高蛍光の２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）基を含む。このＮｍａは、Ｌｙｓのε−アミノ官能基に連結した２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基によって効率的に消光されている。ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａライブラリーを基質として、上記実施例４で得た精製ＳＯＴおよびＳＧＴについて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて３７℃にて酵素反応を行った。
【００９９】
一次スクリーニングに、５０ｎｇの組換えＳＯＴおよびＳＧＴを用いた。ＦＲＥＴＳを用いる手順は、非特許文献２４に従って行った。反応を、ARVO 1420マルチラベルカウンター（Perkin Elmer）を用いてλｅｘ３５５ｎｍおよびλｅｍ４６０ｎｍでの蛍光強度の増加によってモニターした。組換えＳＯＴおよびＳＧＴのＰ１位での優先性を、図６に示す。図６から、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの両方とも、Ｐ１位で主にＡｒｇおよびＬｙｓ残基を優先することがわかった。
【０１００】
次いで、二次スクリーニングについては、ライブラリー中から最良の基質としてＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇ（配列番号３の４位のアミノ酸がＡｒｇである）を選択した。それぞれ１２ｎｇの組換えＳＯＴおよび３５ｎｇの組換えＳＧＴを用いて、３７℃にて５分間の酵素反応を行って、Ｐ２位およびＰ３位についての酵素の優先性を決定した。反応混合物へ酢酸を添加し、９５℃にて５分間加熱して、酵素反応を停止させ、そして基質の切断速度を決定した。得られた試料の約２５％の量が切断されていた。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−マススペクトロメトリー（ＭＳ）により、組換えＳＯＴおよびＳＧＴによって切断されたＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇに由来する配列を同定した。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１として比較したピーク面積から算出した。結果を図７に示す。
【０１０１】
図７に示すように、組換えＳＯＴおよびＳＧＴはいずれも、Ｐ２位でＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓを降順で優先し、そしてＰ３位でＡｒｇを優先した。両方の酵素とも、Ｐ２およびＰ３位で酸性残基を優先しなかった。
【０１０２】
（実施例７：組換えＳＯＴおよびＳＧＴによる種々のコラーゲンの加水分解の検討）
組換えＳＯＴおよびＳＧＴの天然コラーゲンに対する分解活性を、ウシアキレス腱由来の天然の不溶性Ｉ型コラーゲン（Sigma）およびヒト胎盤由来のＩＶ型コラーゲン（Sigma）を用いて、非特許文献１８に記載の手順に基づいて検討した。反応混合物は、２ｍｇコラーゲン、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．４ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および０．１ｍＬの酵素溶液を含んでいた。３７℃でのプレインキュベーション後、反応を、３７℃にて振とう（１０００ｒｐｍ）しながら３０〜６０分間行った。コントロール混合物は、酵素を含まなかった。反応を、１μＬの０．２Ｍ ＨＣｌの添加によって停止した。遊離アミノ基の増加の初期速度を、ニンヒドリン法によって測定した。４℃にて１００００ｇでの１０分間の遠心分離後、０．１ｍｌの上清を、０．４ｍＬのニンヒドリン呈色試薬溶液（ナカライテスク株式会社）と混合し、そして９７℃にて１０分間加熱し、次いで、氷上で混合物を冷却した。次いで、２−プロパノール（１ｍＬ）を混合物に添加し、そして５７０ｎｍでの上清の吸光度の上昇を測定した。参照酵素として、クロストリジウム・ヒストリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のＩ型コラゲナーゼ（ＣｏｌＩ：Sigma）を用いた。１コラーゲン切断ユニットは、カルシウムイオンの存在下、３７℃にてｐＨ７．４で５時間インキュベートしたときのＩ型コラゲナーゼ（ＣｏｌＩ）によるコラーゲンからペプチドの遊離が、１．０μｍｏｌのロイシンに対するニンヒドリン呈色に相当する酵素量である。
【０１０３】
図８に示すように、組換えＳＯＴおよびＳＧＴは両方とも、繊維状のＩ型コラーゲンを顕著に分解した。これらのコラーゲン分解活性は、参照酵素としてのＣｏｌＩよりも非常に高かった（６．４〜８．３倍）（図８Ａ）。ＩＶ型コラーゲンについては、組換えＳＯＴのコラーゲン分解活性は組換えＳＧＴよりも５．６倍高かった（図８Ｂ）。このように、ＳＯＴは、Ｉ型およびＩＶ型の両方のコラーゲンを非常によく加水分解するが、ＳＧＴはＩＶ型コラーゲンを加水分解する能力に乏しいことを見出した。
【０１０４】
次に、組換えＳＯＴおよびＳＧＴの基質特異性をさらに検討するために、フルオレセイン標識したウシ皮膚ＤＱ−Ｉ型コラーゲン、ヒト胎盤ＤＱ−ＩＶ型コラーゲン、ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチン、およびフルオレセインカゼイン（いずれもMolecular Probes）を基質として用いて決定した。３７℃にて５分間のプレインキュベーションの後、アッセイを、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝液を用いて、上記と同様に行った。参照酵素として、ＴＰＣＫ処理したウシ膵臓トリプシン（Sigma）およびＣｏｌＩを用いた。結果を図９に示す。
【０１０５】
上記の組換えＳＯＴの蛍光標識Ｉ型コラーゲンに対する加水分解活性は、組換えＳＧＴと同様であり、ＣｏｌＩよりも９．６倍高かった（図９Ａ）。これに対して、図９Ｂに示すように、ＩＶ型コラーゲンに対しては、組換えＳＯＴのみが非常に高い加水分解活性を有し、組換えＳＯＴの活性は、ＳＧＴよりも６．５倍高かった。蛍光標識したコラーゲンに対する加水分解の結果は、天然のコラーゲンに対する加水分解の結果とよく一致していた（図８および９）。ＳＯＴはまた、ゼラチンに対してもＳＧＴよりも高い加水分解活性を示した（図９Ｃ）。なお、カゼイン加水分解は、ウシ膵臓トリプシンがＳＯＴおよびＳＧＴよりもかなり高かった（図９Ｄ）。これらの結果は、構造タンパク質基質に対して、組換えＳＯＴは広い基質特異性を有することを示す。したがって、ＳＯＴは、ヘリックスコラーゲンおよび多くの切断を有する非ヘリックスコラーゲンの両方を分解し得、そして繊維状および基底膜コラーゲンを攻撃する能力を有する、独特の酵素であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、ＩＶ型コラーゲンに対して高い加水分解活性を有するトリプシン様酵素が提供される。本発明のトリプシン様酵素を用いれば、これまで酵素的にほとんど分解されなかったＩＶ型コラーゲンを分解することができる。したがって、食品、医薬品などの分野において、基底膜コラーゲンを含む素材のさらなる利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ストレプトマイセス・オミヤエンシス８４Ａ０６株由来の精製トリプシン様酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動写真である。レーン１は分子量マーカーであり、そしてレーン２は、２μｇの精製酵素である。
【図２】ＳＯＴの遺伝子のヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を示す図である。推定−３５および−１０配列ならびに推定リボソーム結合部位（ＳＤ）を、ヌクレオチド配列中に下線を引いた。精製酵素を用いて決定したＮ末端および内部配列を、それぞれ太字および二重下線で示す。停止コドンをアステリスクで示す。
【図３】ストレプトマイセス由来の成熟トリプシンおよびトリプシノーゲンの一次構造のアラインメントを示す図である。
【図４】組換えＳＯＴおよびＳＧＴの活性とカルシウムイオン濃度との関係を示すグラフである。
【図５】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーの構造を示す。Ｘａａは、Ｃｙｓ以外の１９の天然アミノ酸のそれぞれが組み込まれた固定位置を示す。５アミノ酸残基（Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、およびＤ）の混合物を、各固定されたＸａａに対するＺａａ位の５アミノ酸残基（Ｆ、Ａ、Ｖ、Ｅ、およびＲ）の混合物とともにＹａａ位に組み込んだ。
【図６】ＦＲＥＴＳ−２５Ｘａａコンビナトリアルライブラリーを用いた組換えＳＯＴ（上）およびＳＧＴ（下）のＰ１優先性（すなわち、好ましいＸａａ）を示すグラフである。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１００％として比較した割合で示す。
【図７】組換えＳＯＴおよびＳＧＴのＰ２およびＰ３優先性を示すグラフである。ＸａａをＡｒｇで固定したＦＲＥＴＳ−２５Ａｒｇを基質とし、加水分解産物を、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。相対蛍光強度を、最も多い生成物を１として比較したピーク面積から算出した。
【図８】天然コラーゲンに対する組換えＳＯＴおよびＳＧＴの加水分解活性を示すグラフである。Ａは、ウシアキレス腱由来の不溶性Ｉ型コラーゲン、およびＢは、ヒト胎盤由来のＩＶ型コラーゲン基質とした場合の結果を示す。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。
【図９】種々のフルオレセイン結合した基質、すなわち、（Ａ）ウシ皮膚Ｉ型ＤＱ−コラーゲン、（Ｂ）ヒト胎盤ＩＶ型ＤＱ−コラーゲン、（Ｃ）ブタ皮膚ＤＱ−ゼラチン、および（Ｄ）フルオレセインカゼインに対するＳＯＴ、ＳＧＴ、ウシ膵臓トリプシン、およびＣｏｌＩについての比活性を示すグラフである。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する、トリプシン様酵素。
【請求項２】
以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；
（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；
（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および
（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；
を有する、請求項１に記載のトリプシン様酵素。
【請求項３】
ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）により産生される、請求項１または２に記載のトリプシン様酵素。
【請求項４】
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項１から４のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素であって、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、トリプシン様酵素。
【請求項６】
トリプシン様酵素をコードする遺伝子であって、該トリプシン様酵素が、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する、遺伝子。
【請求項７】
前記メトリプシン様酵素が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項６または７に記載の遺伝子を含む、発現用担体。
【請求項９】
請求項６または７に記載の遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換細胞により産生される、組換えトリプシン様酵素。
【請求項１１】
ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株。
【請求項１】
ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有する、トリプシン様酵素。
【請求項２】
以下の性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０；
（２）至適反応温度：カルシウムイオン不在下で５０℃、およびカルシウムイオン存在下で５５℃；
（３）熱安定性：９０％熱不活性化温度として、カルシウムイオン不在下で３５℃、およびカルシウムイオン存在下で５０℃；および
（４）フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される；
を有する、請求項１に記載のトリプシン様酵素。
【請求項３】
ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）により産生される、請求項１または２に記載のトリプシン様酵素。
【請求項４】
（Ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有する、請求項１から４のいずれかの項に記載のトリプシン様酵素であって、該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、トリプシン様酵素。
【請求項６】
トリプシン様酵素をコードする遺伝子であって、該トリプシン様酵素が、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、およびゼラチンに対して加水分解活性を有し、そして該遺伝子が、
（ａ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｂ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列に対し、配列同一性が、少なくとも８５％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列、および
（ｄ）配列表の配列番号２の１位から２６１位までのアミノ酸配列をコードする塩基配列のアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する、遺伝子。
【請求項７】
前記メトリプシン様酵素が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の３位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基との間のペプチド結合に対する加水分解活性を有し、そして該配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、２位がＡｒｇのアミノ酸残基であり、３位がＴｙｒ、Ｉｌｅ、およびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり、そして４位がＡｒｇおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるペプチドに対する基質優先性を有する、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項６または７に記載の遺伝子を含む、発現用担体。
【請求項９】
請求項６または７に記載の遺伝子が組み込まれている、形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換細胞により産生される、組換えトリプシン様酵素。
【請求項１１】
ストレプトマイセス・オミヤエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｍｉｙａｅｎｓｉｓ）８４Ａ０６（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４５３）株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−１７１８７０（Ｐ２００９−１７１８７０Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２０４４（Ｐ２００８−１２０４４）
【出願日】平成２０年１月２２日（２００８．１．２２）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２２日（２００８．１．２２）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５９１０６０９８０）岡山県 (96)
【Ｆターム（参考）】
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