ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物
【課題】より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化等させた、遺伝的に改変された微生物を提供する。
【解決手段】本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、欠失若しくは不活性化された微生物である。当該欠失又は不活性化は、例えば、所定の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われ得る。
【解決手段】本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、欠失若しくは不活性化された微生物である。当該欠失又は不活性化は、例えば、所定の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物に関する。また、当該微生物及びその形質転換体を利用した異種ニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００４】
ロドコッカス属細菌は、一般的に、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏洩しにくいため、触媒として使用することに適している。ロドコッカス属細菌の中でも、特にＪ１株は、アクリルアミドの工業生産での実績からアミド化合物を始めとする種々の化合物の生産のための宿主として有用である。
【０００５】
一方、触媒として作用する酵素は、基質特異性や反応条件により最適な酵素を選抜することが必要であり、ニトリルヒドラターゼにおいても基質特異性、熱安定性及びシアン耐性など、様々な性能を有する酵素が見出されている（特許文献２〜６参照）。
【０００６】
工業生産においては、活性が高くかつ安定な触媒が求められ、そのためには目的とするニトリルヒドラターゼ遺伝子を工業生産の実績がある宿主菌に導入した遺伝子組換え体を作製することが有効である。特に、アミド化合物を製造するための宿主としてはロドコッカス属細菌の使用が適しているが、ニトリルヒドラターゼ活性を有しているロドコッカス属細菌を宿主として使用した場合、導入したプラスミドから発現する異種ニトリルヒドラターゼと、ゲノムDNAから発現する宿主由来の（野生型の）ニトリルヒドラターゼが菌体内に混在することになり、発現目的とする異種ニトリルヒドラターゼの性能が十分に発揮できない場合がある（特許文献７参照）。
【０００７】
このような場合、ニトリルヒドラターゼ活性を有しない他の宿主微生物を用いる、あるいは宿主微生物からニトリルヒドラターゼ活性を欠失させた変異株を用いることが有効であり、これまでにもNTG（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物からニトリルヒドラターゼの生産を低下又は阻害させた例が報告されている（特許文献８参照）。しかしながら、変異誘起化合物を用いたニトリルヒドラターゼ遺伝子の変異（欠失や不活性化等）は、植え継ぎ（継代）により当該変異が復帰する（活性を有する状態に戻る）ことがあるため、変異体を長期に安定して使用することは容易なことではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第3162091号
【特許文献２】米国特許第5827699号明細書
【特許文献３】特許第3380133号
【特許文献４】国際公開第2004/108942号
【特許文献５】国際公開第2005/054456号
【特許文献６】国際公開第2005/002689号
【特許文献７】国際公開第06/062189号
【特許文献８】特開2001-120290号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化することにより、改変することが効果的である。
【００１０】
ゲノム上に存在する遺伝子を欠失又は不活性化する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
【００１１】
ロドコッカス属細菌において相同組換えを行う際の遺伝子導入法として、エレクトロポレーション法等が知られている。エレクトロポレーション法はロドコッカス属細菌における代表的な形質転換法であるが、相同組換えに適用した場合、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。相同組換えを行う際の他の遺伝子導入法としては、接合伝達を利用する方法（接合伝達法）が挙げられるが、当該方法はロドコッカス属細菌に対しては殆ど適用されていない。従って、ロドコッカス属細菌において、標的遺伝子を効率的且つ汎用的に欠失若しくは不活性化、又は他の遺伝子を導入する方法は確立していない状況である。従って、ロドコッカス属細菌等のもともとニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物について、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたもの（特に、より効率的且つ汎用的に当該耐性遺伝子が欠失又は不活性化されたもの）は、十分に得られていないのが現状である。
【００１２】
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。より詳細には、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換えを利用した遺伝子改変技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ること、さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物、その形質転換微生物、当該微生物等を用いたニトリルヒドラターゼの製造方法、及び当該ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(１)ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物。
【００１５】
本発明の微生物において、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としては、例えば、ロドコッカス属細菌が挙げられ、具体的には、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株又はその変異株が挙げられる。
【００１６】
本発明の微生物において、欠失又は不活性化されるニトリルヒドラターゼ遺伝子としては、例えば、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子が挙げられる。
【００１７】
本発明の微生物は、前記欠失又は不活性化が、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものが挙げられる。
【００１８】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００１９】
ここで、上記形質転換方法において、ドナー微生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。さらに、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、カナマイシンが挙げられる。
(２)上記(1)に記載の微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物。
(３)上記(1)に記載の微生物及び／又は上記(2)に記載の形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
(４)上記(1)に記載の微生物及び／又は上記(2)に記載の形質転換微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
【００２１】
また、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換えを利用した遺伝子改変技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。
【図２】本実施例における、プラスミドpBKNH01の構造を示す模式図である。
【図３】（Ａ）は相同組換えの概念図であり、（Ｂ）はニトリルヒドラターゼ欠失株のPCRの結果（得られた増幅断片の電気泳動の結果）を示す図である。
【図４】異種ニトリルヒドラターゼを発現させたDN1株組換え菌のSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図５−１】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−２】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−３】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−４】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−１】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−２】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−３】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−４】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−１】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−２】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−３】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−４】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−１】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−２】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−３】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−４】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−５】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２４】
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変（欠失又は不活性化（以下、「欠失等」ということがある））された微生物（以下、「本発明の微生物」ということがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物である。
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼを産生し、その活性を示すものであればよく、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
【００２５】
ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）及びロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Rhodococcus pyridinivorans）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1、ロドコッカス・ロドクロウス M8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウス M33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウス NCIMB41164（国際公開第05/054456号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
【００２６】
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカス M16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィス B23（特開昭58- 86093）シュードモナス・プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス・マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア sp.JBRs（GenBankアクセッション番号: AY141130）が好ましく挙げられる。
ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
【００２７】
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物等のニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物等をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
本発明の微生物は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものであるが、この欠失等される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００２８】
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウスJ1株の場合は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子として、高分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号1）と低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号5）との２種のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。なお、上記高分子量型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhhG）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号2〜4に示した。同様に、上記低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子のαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhlE）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号6〜8に示した。
【００２９】
本発明における、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、前記対象微生物が有するニトリルヒドラターゼ遺伝子と翻訳後のアミノ酸配列が異なるニトリルヒドラーゼ遺伝子を意味する。すなわち、異種ニトリルヒドラターゼは、前記対象微生物のゲノムDNAにコードされたニトリルヒドラターゼと比較して、そのアミノ酸配列中、１残基以上のアミノ酸が異なる（置換、挿入又は欠失等）ものも含まれる。具体的には、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株を対象微生物とした場合は、国際公開第2005/116206号、特開2007-43910号、特開2007-143409号及び特開2008-253182号等に記載の改良型ニトリルヒドラターゼなどが、異種ニトリルヒドラターゼとして好ましく挙げられ、また、ロドコッカス・ロドクロウスM8、ロドコッカス・ロドクロウス NCIMB 41164、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス Q-6、シュードモナス・マルギナリスDSM16275等により産生されるニトリルヒドラターゼも、異種ニトリルヒドラターゼとして好ましく挙げられる。これらの異種ニトリルヒドラターゼの遺伝子は、例えば、それを産生し得る微生物を培養し、培養した菌からゲノムDNAを調製し、PCR増幅することによって得ることができる。
【００３０】
上述のように、本発明のニトリルヒドラターゼ活性を欠失した微生物に異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現プラスミドとして導入した形質転換微生物や、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子がゲノム中に挿入された形質転換微生物は、所望の異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物とすることができる。
２．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明において、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
【００３１】
上記欠失等する方法については、本発明では以下の方法により行われるものであることが特に好ましい。
【００３２】
すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法（詳しくは、当該形質転換方法を用いることを含むニトリルヒドラターゼ遺伝子の欠失又は不活性化方法）により、本発明の微生物が得られることが好ましい。
【００３３】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv) レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
上記欠失又は不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物であれば、特に限定はされず、中でもロドコッカス属細菌が、前述した理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
【００３４】
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な要件を満たす微生物であれば、特に限定はされず、例えば、大腸菌が好ましい。
【００３５】
接合伝達可能な要件を満たす微生物とは、mob遺伝子及びtra遺伝子（群）を最小限有する微生物のことを指す。mobはoriT特異的ニック酵素をコードする遺伝子で、この酵素がoriTに働くことによりドナー微生物からレシピエント微生物への（遺伝子改変プラスミドの）移行が開始される。traは多数の遺伝子群の総称で、性繊毛形成、接合管形成、接合制御に関与する遺伝子群で構成されている。mob遺伝子及びtra遺伝子（群）は必ずしも遺伝子改変プラスミド上になくてもよく、別のプラスミド（ヘルパープラスミド）、もしくはドナーとなる微生物ゲノム上に組み込まれていてもよい（蛋白質 核酸 酵素, vol. 38, p. 60-68 (1993)）。
2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強化することをいう。
【００３６】
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリン等がより好ましい。
【００３７】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００３８】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。レシピエント微生物の薬剤耐性をどの程度まで強化するかについては、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物及び選択する薬剤により異なるため適宜調整することができるが、レシピエント微生物の生育が抑制されず、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を基準に強化することが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミド（接合用プラスミド）を用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
【００３９】
ここで、前記(i)の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。
なお、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、特に限定はされないが、当該ロドコッカス属細菌ゲノムとの相同領域（ニトリルヒドラターゼ遺伝子周辺の塩基配列）が長いほどより効率よく相同組換えを起こすことが出来るため、クローニングに支障が出ない範囲でより長い配列を用いることが好ましい。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好ましく、より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前記(i)の配列を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除又は置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００４０】
上記欠失又は不活性化されたニトリルヒドラターゼ遺伝子としては、レシピエント微生物のゲノムDNAにコードされる当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００４１】
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、特に限定はされず、例えば、Fプラスミド由来の接合伝達開始領域を含む配列、プラスミドR6K由来のoriT、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
【００４２】
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、特に限定はされず、例えば、プラスミドpMB1及び広宿主域プラスミドRK2由来の複製開始点並びにその派生物等を含む領域の使用が好ましい。
【００４３】
前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
【００４４】
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。
【００４５】
接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、その種類は特に限定はされない。使用するベクターとしては、例えば、pBR322、pSC101、pACYC184、pACYC177、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298、pHSG299、pSP64、pSP65、pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4p、GEM-4Z、Bluescript M13+、Bluescript M13-、pK19mob、pK18mob、pK18mobsacB等が挙げられる。中でも、プラスミド内部に既にRP4由来のoriT及びmobを有しているpK19mob、pK18mob、pK18mobsacB（Schaefer等, Gene, vol. 45, p. 69-73(1994)）を用いることがより好ましい。
【００４６】
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、その配置については特に限定されず、如何なる順番で配置されていてもよい。前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の配列、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
【００４７】
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
【００４８】
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換えが起こり、遺伝子改変用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体、すなわち相同組換え株が作製される。
【００４９】
本工程（ｃ）における所望の相同組換え株は、1重交差により標的遺伝子の上流又は下流に当該遺伝子改変用プラスミドが導入されたものである。
【００５０】
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が用いられる。
【００５１】
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得る（選抜する）ことができる。
【００５２】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子が、当初の目的の通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のニトリルヒドラターゼ遺伝子の機能が復活したもの）とが含まれている。
【００５３】
よって、通常は、さらに別の培養条件でも培養したり、培養物を用いてニトリルヒドラターゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００５４】
別の形質転換微生物の選抜方法としては、上記ニトリルヒドラターゼ活性の有無を確認することもできる。例えば、尿素を含んだ培地で培養し、生育した菌のニトリルヒドラターゼ活性を確認することができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性を有していない株が所望の形質転換微生物、すなわちニトリルヒドラターゼ遺伝子が遺伝的に改変された本発明の微生物として選択することができる。
３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法、詳しくは、異種ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物に異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
【００５５】
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、上記ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を当該微生物の遺伝子に挿入（付加）させたものであってもよいし、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクターを導入することによりなされたものであってもよいし、これら両方の特徴を兼ね備えたものであってもよい。
【００５６】
組換えベクターを用いる場合は、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等から異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。
【００５７】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。
【００５８】
当該発現ベクターには、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５９】
前述の通り、本発明においては、異種ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換微生物を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
【００６０】
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の異種ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００６１】
形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００６２】
培養中、発現ベクターや目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合には、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
【００６３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００６４】
形質転換微生物の培養条件は、発現目的の異種ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。
【００６５】
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
【００６６】
また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
【００６７】
上記培養条件で培養すると、高収率で異種ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これら異種ニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。
【００６８】
培養後、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的の異種ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
【００６９】
破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（菌体抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、菌体抽出液可溶性画分であり、粗精製した異種ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
【００７０】
また、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００７１】
異種ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
【００７２】
形質転換微生物を培養して得られた異種ニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、異種ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造された異種ニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、異種ニトリルヒドラターゼを接触させ、当該接触によりニトリル化合物が変換されて生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
【００７３】
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内で異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００７４】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
【００７５】
反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、特に限定はされず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
【００７６】
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
ニトリルヒドラターゼ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
プラスミドpDNR-1r（clontech社製）を鋳型とし、当該pDNR-1r中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号9）及びSAC-02（配列番号10）を使用したPCRにより増幅して、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。
【００７８】
プライマー：
SAC-01： 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号9）
SAC-02： 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号10）
反応液組成：
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR（タカラバイオ社製） 25 μl
プライマーSAC-01(配列番号9) 1 μl
プライマーSAC-02(配列番号10) 1 μl
pDNR-1r（clontech社製）（100倍希釈） 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル、72℃ 300秒の反応を1サイクル
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNspVサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob NspV切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子NspV切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）を、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。
（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株(以下、J1株と称する)を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、1％グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
【００７９】
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
【００８０】
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ml）加えて37℃で1時間振盪した。
【００８１】
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００８２】
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００８３】
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、J1株のゲノムDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号1に示すニトリルヒドラターゼ遺伝子を有している。
（３）ニトリルヒドラターゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
実施例1(1)で得られたJ1株のゲノムDNAを鋳型として使用し、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
NH-121: 5'-GGCCTGCAGGagctgctgacgatgttcatcc-3'（配列番号11）(下線部はSse8387Iサイト)
NH-122: 5'-tcttcgctgattcctcattcctttcatcgg-3'（配列番号12）
反応液組成：
鋳型DNA（J1株ゲノムDNA） 1μl
プライマーNH-121(配列番号11) 0.5μl
プライマーNH-122(配列番号12) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
同様に、下記のプライマーNH-123（配列番号13）、NH-124（配列番号14）を使用し、上記と同じ条件でPCRを実施した。
プライマー：
NH-123: 5'-gaatgaggaatcagcgaagatgagatccgc-3'（配列番号13）
NH-124: 5'-CCTCTAGAtggcacgactgatcgatgcc-3'（配列番号14）（下線部はXbaIサイト）
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約2kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
次に上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の反応条件でAssembly PCRを行った。
反応液組成：
鋳型DNA 1（NH-121＋NH-122の増幅産物） 0.5μl
鋳型DNA 2（NH-123＋NH-124の増幅産物） 0.5μl
プライマーNH-121(配列番号11) 0.5μl
プライマーNH-124(配列番号14) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒 及び72℃ 40秒の反応を30サイクル
PCR終了後、約4kbの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
【００８４】
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI、Sse8387Iで切断し、約4kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドはニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKNH01と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKNH01の構造を示す模式図を示した。
【実施例２】
【００８５】
薬剤耐性を有するJ1株の作製（１）
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するJ1株の変異株を下記の方法で取得した。
【００８６】
2μg/mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天）にJ1株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約2週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg/mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。
【００８７】
次に、2μg/mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、5μg/mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg/ml→15μg/ml→50μg/ml→100μg/mlに高めながら繰り返し、100μg/mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
【実施例３】
【００８８】
接合伝達による遺伝子欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に、大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlとプラスミドpBKHN01 1μlとを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
【００８９】
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1mlで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
（２）レシピエントの調整
J1-Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例3(1)と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
（３）接合伝達
実施例3(1)で調製したドナー溶液と、実施例3(2)で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
【００９０】
翌日、生育したコロニーは1mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mｌとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
【００９１】
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ1個のコロニーが出現した。得られたコロニーを、＃54と命名し、以後の実験に使用した。
（４）ニトリルヒドラターゼ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組み換え菌：＃54は、ゲノムのニトリルヒドラターゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である（図３（Ａ）参照）。そこで、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
【００９２】
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃54のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて16個のコロニーからゲノムDNAを調製し、各コロニー由来のゲノムDNAを鋳型として以下の反応条件でPCRを行い、得られた増幅断片のサイズをアガロース電気泳動で調べた。その結果を図３（Ｂ）に示した。
プライマー：
NH-09: 5'-CGAGAGATCGGAGACGCAGA-3'（配列番号39）
NH-23: 5'-CGCACTGCTGCTAGATGGAGACACAGG-3'（配列番号40）
反応液組成：
鋳型DNA（ゲノムDNA） 1μl
プライマーNH-09(配列番号39) 0.5μl
プライマーNH-23(配列番号40) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒 及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
その結果、16個の内、6個のコロニーはニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失していることが確認された。これらのコロニーから得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失株を、それぞれDN1〜DN6株と命名した。
【実施例４】
【００９３】
DN1〜DN6株の培養
DN1〜DN6株とJ1株とを下記の培地で培養し、ニトリルヒドラターゼ活性を確認した。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
［前培養培地組成］
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1g/L
(pH 7.0)
［本培養液組成］
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・６H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
(pH 7.0)
菌体を含む培養液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
【００９４】
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに5.0％（w/v）のアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で10分間反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて、生成したアクリルアミドの量を定量し、アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。なお、分析条件は、以下に示す通りであった。
（分析条件）
分析機器 ガスクロマトグラフGC-14B(島津製作所製)
検出器 FID(200℃にて検出)
カラム ポラパックPS（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した1mガラスカラム
カラム温度 190℃
その結果、J1株の菌体活性（ニトリルヒドラターゼ活性）は27U/mg cellであったが、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失したDN1〜DN6株ではニトリルヒドラターゼ活性は検出されなかった。以上の結果より、DN1〜DN6株はゲノム由来ニトリルヒドラターゼが欠失している（ゲノムDNAにおいてニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失している）ことを確認した。
【実施例５】
【００９５】
薬剤耐性を有するJ1株の作製（２）
実施例2と同様の手法を用いて、クロラムフェニコール濃度を2μg/ml→5μg/ml→10μg/mlに高めながら繰り返し、10μg/mlのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株（J1-Cm株）を得た。
【００９６】
次に、実施例3と同様の手法を用いてニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失株DN7〜DN12株を取得した。
これらの得られた欠失株について、実施例4と同様の方法で培養し、ニトリルヒドラターゼ活性を確認したところ、いずれの欠失株においてもニトリルヒドラターゼ活性が確認できなかった。
【実施例６】
【００９７】
ロドコッカス・ロドクロウス M8株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
（１）M8株由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミドの作製
実施例1(2)と同様の手法により、ロドコッカス・ロドクロウス M8株（以下、M8株と称する）のゲノムDNAを得た。なお、M8株(SU1731814)は、ロシア菌株センターIBFM（VKPM S-926）から入手することができる。
【００９８】
M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)は、非特許文献（Veiko,V.P. et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.), 5, 3-5 (1995)）に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号24、配列番号25及び配列番号26に示した。これらの配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号15、16）を合成し、調製したM8株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
【００９９】
プライマー：
M8-1： 5'-GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC-3'（配列番号15）
M8-2： 5'-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3'（配列番号16）
反応液組成：
鋳型DNA（M8株ゲノムDNA） 1μl
プライマーM8-1(配列番号15) 0.5μl
プライマーM8-2(配列番号16) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
次に、得られたプラスミドDNAを制限酵素XbaIとSse8387Iで切断後、0.7％アガロースゲルにより電気泳動を行い、1.6kbのニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（配列番号23）を回収し、プラスミドpSJ042のXbaI-Sse8387Iサイトに導入した。得られたプラスミドをpSJ-N01Aと命名した。なお、pSJ042はロドコッカス菌においてJ1株由来ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開2008-154552号公報に示す方法で作製されたものであり、pSJ042の作製に使用したプラスミドpSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-6232）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成9年3月4日付けで寄託されている。
（２）ATCC12674形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株の対数増殖期の菌体を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
【０１００】
上記で調製したプラスミドDNA（pSJ-N01A） 1μlとATCC12674コンピテントセル10μlを混合し、30分間氷冷した。キュベットにDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser (BIO RAD)により20kV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショクを行い、MYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）500μlを加え30℃、24時間静置した後、10μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養した。
【０１０１】
得られたコロニーのプラスミドを確認し、形質転換体（ATCC12674/pSJ-N01A）を得た。
（３）DN1を宿主とした形質転換体の作製
実施例3で取得したDN1株を使用し、以下の方法でコンピテントセルを作製した。
【０１０２】
10mlのMYKG培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％マルツエキス、0.2％ KH2PO4、0.2％ K2HPO4、1％グルコース）にJ1株を植菌し30℃で培養した。15〜17時間後、終濃度2％となるように滅菌した20％グリシン溶液を添加し、さらに24時間培養した。この培養液を、1％グリシンを含んだ10mlのMYKG培地に2％植菌し、さらに30℃で48時間培養を行った。この培養液を滅菌水で3回洗浄し、最後に滅菌水500μlに再懸濁した。これをコンピテントセルとして用いた。
【０１０３】
次に、実施例1(2)に記載の方法で、上記DN1株のコンピテントセルに形質転換を行い、M8株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N01A）を得た。
【実施例７】
【０１０４】
シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
プラスミドpPT-DB1は、特開平9-275978で得られたシュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095株（以下、JCM3095株と称する）由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドであり、大腸菌HB101に導入された形質転換株（MT-10822株）として独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【０１０５】
JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）は、特開平9-275978に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に，配列番号28、配列番号29及び配列番号30に示した。これらの配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号11、12）を合成し、pPT-DB1を鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。鋳型に用いたpRT-DB1は定法によりMT-10822株から調製した。
プライマー：
PSN-1： 5'-GGTCTAGAATGAACGGCGTGTACGACGTCGGC-3'（配列番号17）
PSN-2： 5'-ccCCTGCAGGTCAGGACCGCACGGCCGGGTGGAC-3'（配列番号18）
反応液組成：
鋳型DNA（pPT-DB1） 1μl
プライマーPSN-1(配列番号17) 0.5μl
プライマーPSN-2(配列番号18) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号28）を用いて、実施例5(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N02Aと命名した。
（２）DN1を宿主とした形質転換体の作製
上記プラスミド（pSJ-N02A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N02A）を作製した。
【実施例８】
【０１０６】
ジオバチルス・グルコシダシアス Q-6株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
ジオバチルス・グルコシダシアス Q-6株（以下、Q-6株と称する）はWO 2004/108942で取得されており、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）から番号FERM BP-08658として、入手することができる。
【０１０７】
Q-6株を100mlのMYK（0.5％ ポリペプトン、0.3％ バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）培地(pH 7.0)中、65℃にて72時間振盪培養し、実施例1(2)と同様の手法により、Q-6株のゲノムDNAを得た。
【０１０８】
Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）は、WO 2004/108942に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号32、配列番号33及び配列番号34に示した。これら配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号19、20）を合成し、Q-6株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
GT-1： 5'-GGTCTAGAatgaacggcccgcacgattt-3'（配列番号19）
GT-2： 5'-CCCCTGCAGGCTAGCAACTTTTTCTTAT-3'（配列番号20）
反応液組成:
鋳型DNA（Q-6株ゲノムDNA） 1μl
プライマーGT-1(配列番号19) 0.5μl
プライマーGT-2(配列番号20) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号31）を用いて、実施例1(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N03Aと命名した。
【０１０９】
さらに、上記プラスミド（pSJ-N02A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、Q-6株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N03A）を作製した。
【実施例９】
【０１１０】
シュードモナス・マルギナリス DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼを発現するＤＮ１形質転換体の作製
シュードモナス・マルギナリス DSM16275株（以下、DSM16275株と称する）は、DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手した。
【０１１１】
DSM16275株のゲノムDNAは、実施例1(2)と同様の手法により得た。
【０１１２】
DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）は、WO2005/002689に記載されており、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号36、配列番号37及び配列番号38に示した。これらの配列情報に基づいてプライマー（配列番号21, 22）を合成し、DSM16275株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
PM-1： 5'-GGTCTAGAatgagtacagctacttcaac-3'（配列番号21）
PM-2： 5'-CCCCTGCAGGCTATCTCGGATCAAATGG-3'（配列番号22）
反応液組成：
鋳型DNA（DSM16275株ゲノムDNA） 1μl
プライマーPM-3(配列番号21) 0.5μl
プライマーPM-4(配列番号22) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号35）を用いて、実施例1(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N04Aと命名した。
【０１１３】
さらに、上記プラスミド（pSJ-N04A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N04A）を作製した。
【実施例１０】
【０１１４】
実施例6〜9で作製したロドコッカス属組換え菌を、実施例4と同様の方法で培養し、実施例4と同様の方法でニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果を下記表に示した。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
また、上記各組換え菌の菌体破砕液上清についてSDS-PAGEを行った結果を、図４に示した。
【０１１７】
以上の結果より、DN1株を宿主とした組換え菌では、プラスミドにより導入した各種異種ニトリルヒドラターゼが発現していることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号９〜２２：合成DNA
配列番号３９：合成DNA
配列番号４０：合成DNA
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物に関する。また、当該微生物及びその形質転換体を利用した異種ニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００４】
ロドコッカス属細菌は、一般的に、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏洩しにくいため、触媒として使用することに適している。ロドコッカス属細菌の中でも、特にＪ１株は、アクリルアミドの工業生産での実績からアミド化合物を始めとする種々の化合物の生産のための宿主として有用である。
【０００５】
一方、触媒として作用する酵素は、基質特異性や反応条件により最適な酵素を選抜することが必要であり、ニトリルヒドラターゼにおいても基質特異性、熱安定性及びシアン耐性など、様々な性能を有する酵素が見出されている（特許文献２〜６参照）。
【０００６】
工業生産においては、活性が高くかつ安定な触媒が求められ、そのためには目的とするニトリルヒドラターゼ遺伝子を工業生産の実績がある宿主菌に導入した遺伝子組換え体を作製することが有効である。特に、アミド化合物を製造するための宿主としてはロドコッカス属細菌の使用が適しているが、ニトリルヒドラターゼ活性を有しているロドコッカス属細菌を宿主として使用した場合、導入したプラスミドから発現する異種ニトリルヒドラターゼと、ゲノムDNAから発現する宿主由来の（野生型の）ニトリルヒドラターゼが菌体内に混在することになり、発現目的とする異種ニトリルヒドラターゼの性能が十分に発揮できない場合がある（特許文献７参照）。
【０００７】
このような場合、ニトリルヒドラターゼ活性を有しない他の宿主微生物を用いる、あるいは宿主微生物からニトリルヒドラターゼ活性を欠失させた変異株を用いることが有効であり、これまでにもNTG（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物からニトリルヒドラターゼの生産を低下又は阻害させた例が報告されている（特許文献８参照）。しかしながら、変異誘起化合物を用いたニトリルヒドラターゼ遺伝子の変異（欠失や不活性化等）は、植え継ぎ（継代）により当該変異が復帰する（活性を有する状態に戻る）ことがあるため、変異体を長期に安定して使用することは容易なことではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第3162091号
【特許文献２】米国特許第5827699号明細書
【特許文献３】特許第3380133号
【特許文献４】国際公開第2004/108942号
【特許文献５】国際公開第2005/054456号
【特許文献６】国際公開第2005/002689号
【特許文献７】国際公開第06/062189号
【特許文献８】特開2001-120290号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に欠失又は不活性化することにより、改変することが効果的である。
【００１０】
ゲノム上に存在する遺伝子を欠失又は不活性化する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
【００１１】
ロドコッカス属細菌において相同組換えを行う際の遺伝子導入法として、エレクトロポレーション法等が知られている。エレクトロポレーション法はロドコッカス属細菌における代表的な形質転換法であるが、相同組換えに適用した場合、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。相同組換えを行う際の他の遺伝子導入法としては、接合伝達を利用する方法（接合伝達法）が挙げられるが、当該方法はロドコッカス属細菌に対しては殆ど適用されていない。従って、ロドコッカス属細菌において、標的遺伝子を効率的且つ汎用的に欠失若しくは不活性化、又は他の遺伝子を導入する方法は確立していない状況である。従って、ロドコッカス属細菌等のもともとニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物について、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたもの（特に、より効率的且つ汎用的に当該耐性遺伝子が欠失又は不活性化されたもの）は、十分に得られていないのが現状である。
【００１２】
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。より詳細には、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換えを利用した遺伝子改変技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ること、さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物、その形質転換微生物、当該微生物等を用いたニトリルヒドラターゼの製造方法、及び当該ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(１)ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物。
【００１５】
本発明の微生物において、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としては、例えば、ロドコッカス属細菌が挙げられ、具体的には、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株又はその変異株が挙げられる。
【００１６】
本発明の微生物において、欠失又は不活性化されるニトリルヒドラターゼ遺伝子としては、例えば、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子が挙げられる。
【００１７】
本発明の微生物は、前記欠失又は不活性化が、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものが挙げられる。
【００１８】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００１９】
ここで、上記形質転換方法において、ドナー微生物としては、例えば大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。さらに、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤としては、例えば、カナマイシンが挙げられる。
(２)上記(1)に記載の微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物。
(３)上記(1)に記載の微生物及び／又は上記(2)に記載の形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
(４)上記(1)に記載の微生物及び／又は上記(2)に記載の形質転換微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
【００２１】
また、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換えを利用した遺伝子改変技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し得る微生物を作製し、当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。
【図２】本実施例における、プラスミドpBKNH01の構造を示す模式図である。
【図３】（Ａ）は相同組換えの概念図であり、（Ｂ）はニトリルヒドラターゼ欠失株のPCRの結果（得られた増幅断片の電気泳動の結果）を示す図である。
【図４】異種ニトリルヒドラターゼを発現させたDN1株組換え菌のSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図５−１】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−２】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−３】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図５−４】M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−１】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−２】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−３】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図６−４】JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−１】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−２】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−３】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図７−４】Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）の塩基配列と、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−１】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−２】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−３】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−４】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【図８−５】DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）の塩基配列と、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２４】
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変（欠失又は不活性化（以下、「欠失等」ということがある））された微生物（以下、「本発明の微生物」ということがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物である。
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼを産生し、その活性を示すものであればよく、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
【００２５】
ここで、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）及びロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Rhodococcus pyridinivorans）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1、ロドコッカス・ロドクロウス M8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウス M33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウス NCIMB41164（国際公開第05/054456号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
【００２６】
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカス M16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィス B23（特開昭58- 86093）シュードモナス・プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス・マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア sp.JBRs（GenBankアクセッション番号: AY141130）が好ましく挙げられる。
ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
【００２７】
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。本発明の微生物等のニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物等をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
本発明の微生物は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものであるが、この欠失等される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００２８】
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウスJ1株の場合は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子として、高分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号1）と低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号5）との２種のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。なお、上記高分子量型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhhG）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号2〜4に示した。同様に、上記低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子のαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhlE）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号6〜8に示した。
【００２９】
本発明における、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、前記対象微生物が有するニトリルヒドラターゼ遺伝子と翻訳後のアミノ酸配列が異なるニトリルヒドラーゼ遺伝子を意味する。すなわち、異種ニトリルヒドラターゼは、前記対象微生物のゲノムDNAにコードされたニトリルヒドラターゼと比較して、そのアミノ酸配列中、１残基以上のアミノ酸が異なる（置換、挿入又は欠失等）ものも含まれる。具体的には、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株を対象微生物とした場合は、国際公開第2005/116206号、特開2007-43910号、特開2007-143409号及び特開2008-253182号等に記載の改良型ニトリルヒドラターゼなどが、異種ニトリルヒドラターゼとして好ましく挙げられ、また、ロドコッカス・ロドクロウスM8、ロドコッカス・ロドクロウス NCIMB 41164、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス Q-6、シュードモナス・マルギナリスDSM16275等により産生されるニトリルヒドラターゼも、異種ニトリルヒドラターゼとして好ましく挙げられる。これらの異種ニトリルヒドラターゼの遺伝子は、例えば、それを産生し得る微生物を培養し、培養した菌からゲノムDNAを調製し、PCR増幅することによって得ることができる。
【００３０】
上述のように、本発明のニトリルヒドラターゼ活性を欠失した微生物に異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現プラスミドとして導入した形質転換微生物や、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子がゲノム中に挿入された形質転換微生物は、所望の異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物とすることができる。
２．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明において、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
【００３１】
上記欠失等する方法については、本発明では以下の方法により行われるものであることが特に好ましい。
【００３２】
すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法（詳しくは、当該形質転換方法を用いることを含むニトリルヒドラターゼ遺伝子の欠失又は不活性化方法）により、本発明の微生物が得られることが好ましい。
【００３３】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv) レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
上記欠失又は不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物であれば、特に限定はされず、中でもロドコッカス属細菌が、前述した理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
【００３４】
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な要件を満たす微生物であれば、特に限定はされず、例えば、大腸菌が好ましい。
【００３５】
接合伝達可能な要件を満たす微生物とは、mob遺伝子及びtra遺伝子（群）を最小限有する微生物のことを指す。mobはoriT特異的ニック酵素をコードする遺伝子で、この酵素がoriTに働くことによりドナー微生物からレシピエント微生物への（遺伝子改変プラスミドの）移行が開始される。traは多数の遺伝子群の総称で、性繊毛形成、接合管形成、接合制御に関与する遺伝子群で構成されている。mob遺伝子及びtra遺伝子（群）は必ずしも遺伝子改変プラスミド上になくてもよく、別のプラスミド（ヘルパープラスミド）、もしくはドナーとなる微生物ゲノム上に組み込まれていてもよい（蛋白質 核酸 酵素, vol. 38, p. 60-68 (1993)）。
2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強化することをいう。
【００３６】
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリン等がより好ましい。
【００３７】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００３８】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。レシピエント微生物の薬剤耐性をどの程度まで強化するかについては、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物及び選択する薬剤により異なるため適宜調整することができるが、レシピエント微生物の生育が抑制されず、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を基準に強化することが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミド（接合用プラスミド）を用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
【００３９】
ここで、前記(i)の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。
なお、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、特に限定はされないが、当該ロドコッカス属細菌ゲノムとの相同領域（ニトリルヒドラターゼ遺伝子周辺の塩基配列）が長いほどより効率よく相同組換えを起こすことが出来るため、クローニングに支障が出ない範囲でより長い配列を用いることが好ましい。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好ましく、より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前記(i)の配列を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除又は置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００４０】
上記欠失又は不活性化されたニトリルヒドラターゼ遺伝子としては、レシピエント微生物のゲノムDNAにコードされる当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられる。これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００４１】
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、特に限定はされず、例えば、Fプラスミド由来の接合伝達開始領域を含む配列、プラスミドR6K由来のoriT、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
【００４２】
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、特に限定はされず、例えば、プラスミドpMB1及び広宿主域プラスミドRK2由来の複製開始点並びにその派生物等を含む領域の使用が好ましい。
【００４３】
前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
【００４４】
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。
【００４５】
接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、その種類は特に限定はされない。使用するベクターとしては、例えば、pBR322、pSC101、pACYC184、pACYC177、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298、pHSG299、pSP64、pSP65、pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4p、GEM-4Z、Bluescript M13+、Bluescript M13-、pK19mob、pK18mob、pK18mobsacB等が挙げられる。中でも、プラスミド内部に既にRP4由来のoriT及びmobを有しているpK19mob、pK18mob、pK18mobsacB（Schaefer等, Gene, vol. 45, p. 69-73(1994)）を用いることがより好ましい。
【００４６】
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、その配置については特に限定されず、如何なる順番で配置されていてもよい。前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の配列、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
【００４７】
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
【００４８】
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換えが起こり、遺伝子改変用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体、すなわち相同組換え株が作製される。
【００４９】
本工程（ｃ）における所望の相同組換え株は、1重交差により標的遺伝子の上流又は下流に当該遺伝子改変用プラスミドが導入されたものである。
【００５０】
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が用いられる。
【００５１】
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得る（選抜する）ことができる。
【００５２】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子が、当初の目的の通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のニトリルヒドラターゼ遺伝子の機能が復活したもの）とが含まれている。
【００５３】
よって、通常は、さらに別の培養条件でも培養したり、培養物を用いてニトリルヒドラターゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００５４】
別の形質転換微生物の選抜方法としては、上記ニトリルヒドラターゼ活性の有無を確認することもできる。例えば、尿素を含んだ培地で培養し、生育した菌のニトリルヒドラターゼ活性を確認することができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性を有していない株が所望の形質転換微生物、すなわちニトリルヒドラターゼ遺伝子が遺伝的に改変された本発明の微生物として選択することができる。
３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法、詳しくは、異種ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物に異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
【００５５】
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、上記ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を当該微生物の遺伝子に挿入（付加）させたものであってもよいし、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクターを導入することによりなされたものであってもよいし、これら両方の特徴を兼ね備えたものであってもよい。
【００５６】
組換えベクターを用いる場合は、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等から異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。
【００５７】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。
【００５８】
当該発現ベクターには、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５９】
前述の通り、本発明においては、異種ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換微生物を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
【００６０】
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の異種ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００６１】
形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００６２】
培養中、発現ベクターや目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合には、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
【００６３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００６４】
形質転換微生物の培養条件は、発現目的の異種ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。
【００６５】
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
【００６６】
また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
【００６７】
上記培養条件で培養すると、高収率で異種ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これら異種ニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。
【００６８】
培養後、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的の異種ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
【００６９】
破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（菌体抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、菌体抽出液可溶性画分であり、粗精製した異種ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
【００７０】
また、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００７１】
異種ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
【００７２】
形質転換微生物を培養して得られた異種ニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、異種ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造された異種ニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、異種ニトリルヒドラターゼを接触させ、当該接触によりニトリル化合物が変換されて生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
【００７３】
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内で異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００７４】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
【００７５】
反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、特に限定はされず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
【００７６】
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
ニトリルヒドラターゼ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
プラスミドpDNR-1r（clontech社製）を鋳型とし、当該pDNR-1r中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号9）及びSAC-02（配列番号10）を使用したPCRにより増幅して、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。
【００７８】
プライマー：
SAC-01： 5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号9）
SAC-02： 5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号10）
反応液組成：
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR（タカラバイオ社製） 25 μl
プライマーSAC-01(配列番号9) 1 μl
プライマーSAC-02(配列番号10) 1 μl
pDNR-1r（clontech社製）（100倍希釈） 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル、72℃ 300秒の反応を1サイクル
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNspVサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob NspV切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子NspV切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）を、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。
（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株(以下、J1株と称する)を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、1％グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
【００７９】
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
【００８０】
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ml）加えて37℃で1時間振盪した。
【００８１】
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００８２】
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００８３】
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、J1株のゲノムDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号1に示すニトリルヒドラターゼ遺伝子を有している。
（３）ニトリルヒドラターゼ遺伝子の増幅と発現プラスミドの構築
実施例1(1)で得られたJ1株のゲノムDNAを鋳型として使用し、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
NH-121: 5'-GGCCTGCAGGagctgctgacgatgttcatcc-3'（配列番号11）(下線部はSse8387Iサイト)
NH-122: 5'-tcttcgctgattcctcattcctttcatcgg-3'（配列番号12）
反応液組成：
鋳型DNA（J1株ゲノムDNA） 1μl
プライマーNH-121(配列番号11) 0.5μl
プライマーNH-122(配列番号12) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
同様に、下記のプライマーNH-123（配列番号13）、NH-124（配列番号14）を使用し、上記と同じ条件でPCRを実施した。
プライマー：
NH-123: 5'-gaatgaggaatcagcgaagatgagatccgc-3'（配列番号13）
NH-124: 5'-CCTCTAGAtggcacgactgatcgatgcc-3'（配列番号14）（下線部はXbaIサイト）
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約2kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
次に上記で増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の反応条件でAssembly PCRを行った。
反応液組成：
鋳型DNA 1（NH-121＋NH-122の増幅産物） 0.5μl
鋳型DNA 2（NH-123＋NH-124の増幅産物） 0.5μl
プライマーNH-121(配列番号11) 0.5μl
プライマーNH-124(配列番号14) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒 及び72℃ 40秒の反応を30サイクル
PCR終了後、約4kbの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングした。
【００８４】
続いて、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI、Sse8387Iで切断し、約4kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドはニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失プラスミド：pBKNH01と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKNH01の構造を示す模式図を示した。
【実施例２】
【００８５】
薬剤耐性を有するJ1株の作製（１）
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するJ1株の変異株を下記の方法で取得した。
【００８６】
2μg/mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天）にJ1株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約2週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg/mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。
【００８７】
次に、2μg/mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、5μg/mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg/ml→15μg/ml→50μg/ml→100μg/mlに高めながら繰り返し、100μg/mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
【実施例３】
【００８８】
接合伝達による遺伝子欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に、大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlとプラスミドpBKHN01 1μlとを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
【００８９】
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1mlで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
（２）レシピエントの調整
J1-Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例3(1)と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
（３）接合伝達
実施例3(1)で調製したドナー溶液と、実施例3(2)で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
【００９０】
翌日、生育したコロニーは1mlのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mｌとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
【００９１】
その結果、100μg/mlアンピシリン、10μg/mlカナマイシンを含んだプレートにのみ1個のコロニーが出現した。得られたコロニーを、＃54と命名し、以後の実験に使用した。
（４）ニトリルヒドラターゼ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組み換え菌：＃54は、ゲノムのニトリルヒドラターゼ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失するには2段階の相同組換えが必要である（図３（Ａ）参照）。そこで、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
【００９２】
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃54のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて16個のコロニーからゲノムDNAを調製し、各コロニー由来のゲノムDNAを鋳型として以下の反応条件でPCRを行い、得られた増幅断片のサイズをアガロース電気泳動で調べた。その結果を図３（Ｂ）に示した。
プライマー：
NH-09: 5'-CGAGAGATCGGAGACGCAGA-3'（配列番号39）
NH-23: 5'-CGCACTGCTGCTAGATGGAGACACAGG-3'（配列番号40）
反応液組成：
鋳型DNA（ゲノムDNA） 1μl
プライマーNH-09(配列番号39) 0.5μl
プライマーNH-23(配列番号40) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒 及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
その結果、16個の内、6個のコロニーはニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失していることが確認された。これらのコロニーから得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失株を、それぞれDN1〜DN6株と命名した。
【実施例４】
【００９３】
DN1〜DN6株の培養
DN1〜DN6株とJ1株とを下記の培地で培養し、ニトリルヒドラターゼ活性を確認した。前培養は30℃で3日間、本培養は30℃で2日間、振とう培養した。
［前培養培地組成］
グルコース 20 g/L
味液 20 g/L
ポリペプトン 5 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1g/L
(pH 7.0)
［本培養液組成］
グルコース 15 g/L
ポリペプトン 3 g/L
酵母エキス 3 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
エタノール 2 g/L
CoCl2・６H2O 0.025 g/L
チアミン 0.002
ビタミンK 0.002 g/L
尿素 15 g/L
(pH 7.0)
菌体を含む培養液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、以下の方法に従って行った。
【００９４】
まず、本培養後に得られた培養液1 mlと50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）4 mlとを混合し、さらに5.0％（w/v）のアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.7）5 mlを混合液に加えて、10 ℃で10分間反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて、生成したアクリルアミドの量を定量し、アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。なお、分析条件は、以下に示す通りであった。
（分析条件）
分析機器 ガスクロマトグラフGC-14B(島津製作所製)
検出器 FID(200℃にて検出)
カラム ポラパックPS（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した1mガラスカラム
カラム温度 190℃
その結果、J1株の菌体活性（ニトリルヒドラターゼ活性）は27U/mg cellであったが、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失したDN1〜DN6株ではニトリルヒドラターゼ活性は検出されなかった。以上の結果より、DN1〜DN6株はゲノム由来ニトリルヒドラターゼが欠失している（ゲノムDNAにおいてニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失している）ことを確認した。
【実施例５】
【００９５】
薬剤耐性を有するJ1株の作製（２）
実施例2と同様の手法を用いて、クロラムフェニコール濃度を2μg/ml→5μg/ml→10μg/mlに高めながら繰り返し、10μg/mlのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株（J1-Cm株）を得た。
【００９６】
次に、実施例3と同様の手法を用いてニトリルヒドラターゼ遺伝子欠失株DN7〜DN12株を取得した。
これらの得られた欠失株について、実施例4と同様の方法で培養し、ニトリルヒドラターゼ活性を確認したところ、いずれの欠失株においてもニトリルヒドラターゼ活性が確認できなかった。
【実施例６】
【００９７】
ロドコッカス・ロドクロウス M8株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
（１）M8株由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミドの作製
実施例1(2)と同様の手法により、ロドコッカス・ロドクロウス M8株（以下、M8株と称する）のゲノムDNAを得た。なお、M8株(SU1731814)は、ロシア菌株センターIBFM（VKPM S-926）から入手することができる。
【００９８】
M8株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号23)は、非特許文献（Veiko,V.P. et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.), 5, 3-5 (1995)）に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号24、配列番号25及び配列番号26に示した。これらの配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号15、16）を合成し、調製したM8株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
【００９９】
プライマー：
M8-1： 5'-GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC-3'（配列番号15）
M8-2： 5'-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3'（配列番号16）
反応液組成：
鋳型DNA（M8株ゲノムDNA） 1μl
プライマーM8-1(配列番号15) 0.5μl
プライマーM8-2(配列番号16) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
次に、得られたプラスミドDNAを制限酵素XbaIとSse8387Iで切断後、0.7％アガロースゲルにより電気泳動を行い、1.6kbのニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（配列番号23）を回収し、プラスミドpSJ042のXbaI-Sse8387Iサイトに導入した。得られたプラスミドをpSJ-N01Aと命名した。なお、pSJ042はロドコッカス菌においてJ1株由来ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開2008-154552号公報に示す方法で作製されたものであり、pSJ042の作製に使用したプラスミドpSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-6232）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成9年3月4日付けで寄託されている。
（２）ATCC12674形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株の対数増殖期の菌体を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
【０１００】
上記で調製したプラスミドDNA（pSJ-N01A） 1μlとATCC12674コンピテントセル10μlを混合し、30分間氷冷した。キュベットにDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser (BIO RAD)により20kV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショクを行い、MYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）500μlを加え30℃、24時間静置した後、10μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養した。
【０１０１】
得られたコロニーのプラスミドを確認し、形質転換体（ATCC12674/pSJ-N01A）を得た。
（３）DN1を宿主とした形質転換体の作製
実施例3で取得したDN1株を使用し、以下の方法でコンピテントセルを作製した。
【０１０２】
10mlのMYKG培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％マルツエキス、0.2％ KH2PO4、0.2％ K2HPO4、1％グルコース）にJ1株を植菌し30℃で培養した。15〜17時間後、終濃度2％となるように滅菌した20％グリシン溶液を添加し、さらに24時間培養した。この培養液を、1％グリシンを含んだ10mlのMYKG培地に2％植菌し、さらに30℃で48時間培養を行った。この培養液を滅菌水で3回洗浄し、最後に滅菌水500μlに再懸濁した。これをコンピテントセルとして用いた。
【０１０３】
次に、実施例1(2)に記載の方法で、上記DN1株のコンピテントセルに形質転換を行い、M8株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N01A）を得た。
【実施例７】
【０１０４】
シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
プラスミドpPT-DB1は、特開平9-275978で得られたシュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095株（以下、JCM3095株と称する）由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドであり、大腸菌HB101に導入された形質転換株（MT-10822株）として独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【０１０５】
JCM3095株のニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号27）は、特開平9-275978に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に，配列番号28、配列番号29及び配列番号30に示した。これらの配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号11、12）を合成し、pPT-DB1を鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。鋳型に用いたpRT-DB1は定法によりMT-10822株から調製した。
プライマー：
PSN-1： 5'-GGTCTAGAATGAACGGCGTGTACGACGTCGGC-3'（配列番号17）
PSN-2： 5'-ccCCTGCAGGTCAGGACCGCACGGCCGGGTGGAC-3'（配列番号18）
反応液組成：
鋳型DNA（pPT-DB1） 1μl
プライマーPSN-1(配列番号17) 0.5μl
プライマーPSN-2(配列番号18) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号28）を用いて、実施例5(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N02Aと命名した。
（２）DN1を宿主とした形質転換体の作製
上記プラスミド（pSJ-N02A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N02A）を作製した。
【実施例８】
【０１０６】
ジオバチルス・グルコシダシアス Q-6株由来ニトリルヒドラターゼを発現するDN1形質転換体の作製
ジオバチルス・グルコシダシアス Q-6株（以下、Q-6株と称する）はWO 2004/108942で取得されており、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）から番号FERM BP-08658として、入手することができる。
【０１０７】
Q-6株を100mlのMYK（0.5％ ポリペプトン、0.3％ バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）培地(pH 7.0)中、65℃にて72時間振盪培養し、実施例1(2)と同様の手法により、Q-6株のゲノムDNAを得た。
【０１０８】
Q-6株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号31）は、WO 2004/108942に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号32、配列番号33及び配列番号34に示した。これら配列情報に基づいて下記のプライマー（配列番号19、20）を合成し、Q-6株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
GT-1： 5'-GGTCTAGAatgaacggcccgcacgattt-3'（配列番号19）
GT-2： 5'-CCCCTGCAGGCTAGCAACTTTTTCTTAT-3'（配列番号20）
反応液組成:
鋳型DNA（Q-6株ゲノムDNA） 1μl
プライマーGT-1(配列番号19) 0.5μl
プライマーGT-2(配列番号20) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号31）を用いて、実施例1(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N03Aと命名した。
【０１０９】
さらに、上記プラスミド（pSJ-N02A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、Q-6株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N03A）を作製した。
【実施例９】
【０１１０】
シュードモナス・マルギナリス DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼを発現するＤＮ１形質転換体の作製
シュードモナス・マルギナリス DSM16275株（以下、DSM16275株と称する）は、DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)から入手した。
【０１１１】
DSM16275株のゲノムDNAは、実施例1(2)と同様の手法により得た。
【０１１２】
DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号35）は、WO2005/002689に記載されており、αサブユニット、βサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ順に、配列番号36、配列番号37及び配列番号38に示した。これらの配列情報に基づいてプライマー（配列番号21, 22）を合成し、DSM16275株のゲノムDNAを鋳型として、以下の反応条件でPCRを行った。
プライマー：
PM-1： 5'-GGTCTAGAatgagtacagctacttcaac-3'（配列番号21）
PM-2： 5'-CCCCTGCAGGCTATCTCGGATCAAATGG-3'（配列番号22）
反応液組成：
鋳型DNA（DSM16275株ゲノムDNA） 1μl
プライマーPM-3(配列番号21) 0.5μl
プライマーPM-4(配列番号22) 0.5μl
滅菌水 8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ） 10μl
総量 20μl
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 30秒の反応を30サイクル
得られたPCR産物（配列番号35）を用いて、実施例1(2)と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N04Aと命名した。
【０１１３】
さらに、上記プラスミド（pSJ-N04A）を使用し、実施例5(2),(3)と同様の手法により、DSM16275株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（DN1/pSJ-N04A）を作製した。
【実施例１０】
【０１１４】
実施例6〜9で作製したロドコッカス属組換え菌を、実施例4と同様の方法で培養し、実施例4と同様の方法でニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果を下記表に示した。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
また、上記各組換え菌の菌体破砕液上清についてSDS-PAGEを行った結果を、図４に示した。
【０１１７】
以上の結果より、DN1株を宿主とした組換え菌では、プラスミドにより導入した各種異種ニトリルヒドラターゼが発現していることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号９〜２２：合成DNA
配列番号３９：合成DNA
配列番号４０：合成DNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物。
【請求項２】
前記微生物がロドコッカス属細菌である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
欠失又は不活性化されるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【請求項６】
ドナー微生物が大腸菌である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
レシピエント微生物が感受性を示す薬剤がカナマイシンである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及び／又は請求項９記載の形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及び／又は請求項９記載の形質転換微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が欠失又は不活性化された微生物。
【請求項２】
前記微生物がロドコッカス属細菌である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
欠失又は不活性化されるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
前記欠失又は不活性化が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【請求項６】
ドナー微生物が大腸菌である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
レシピエント微生物が感受性を示す薬剤がカナマイシンである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換微生物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及び／又は請求項９記載の形質転換微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及び／又は請求項９記載の形質転換微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【公開番号】特開２０１１−２００１３２（Ｐ２０１１−２００１３２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６８４０４（Ｐ２０１０−６８４０４）
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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