【課題】ニュートロカインαタンパク質をコードした、単離された核酸分子を提供する
。
【解決手段】以下の配列に少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドを含
む、単離された核酸分子：（ａ）図１における完全なアミノ酸配列を有するニュートロカ
インαポリペプチドをコードする配列；（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に
含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロ
カインαをコードする配列；（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインをコ
ードする配列；（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインをコードする配列
；（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインをコードする配列；（ｆ）膜貫
通ドメインを欠除する溶解性ニュートロカインαポリペプチドをコードする配列；（ｇ）
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）の任意の配列に相補的な配列。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球により発現される新規のサイトカイン（これは、それゆえニュートロ
カインαタンパク質（「ニュートロカインα」）と称されている）に関する。詳細には、
ニュートロカインαタンパク質をコードした、単離された核酸分子が提供される。ニュー
トロカインαポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびこれを産生する組換え方
法として提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）および（ＴＮＦ−β、またはリンホトキシン）は、ポ
リペプチドメディエーターの幅広いクラスの関連メンバーであり、このクラスはインター
フェロン、インターロイキン、および増殖因子を含み、総称してサイトカインと呼ばれる
（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ， Ａ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｔ．， Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，７：６２５−６５５（１９８９））。サイトカインレセプターの配列分析
は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブファミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーフ
ァミリー、（２）ヘマトポエチン（サイトカインレセプタースーパーファミリー）、およ
び（３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリ
ー（ＴＮＦスーパーファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ， Ｂｌ
ｏｏｄ ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌお
よびＮａｔａｒａｊａｎ， Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．， ７（２）：９
３−１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリー
は、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。
これらのレセプターのリガンドは同定され、そして少なくとも２つのサイトカインスーパ
ーファミリーに属する。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの混合物）は、もともとその抗腫瘍活性の
結果として発見されたが、現在は、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞の活
性化および細胞増殖の媒介を含む、ならびにまた免疫調節および炎症における重要な役割
を果たすような、多数の生物学的活性が可能な多面的なサイトカインとして認識されてい
る。
【０００４】
今日まで、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの既知のメンバーには、ＴＮＦ−α、Ｔ
ＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ３０Ｌ
、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、および４−ＩＢＢＬが含まれる。ＴＮＦリガンドスーパーフ
ァミリーのリガンドは、酸性、細胞外ドメインにおいて約２０％の配列相同性（１２％〜
３６％の範囲）を有するＴＮＦ様分子であり、そして三量体／多量体複合体である生物学
的活性形態を有する膜結合形態として主に存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファミリー
の溶解性形態は、これまでＴＮＦ、ＬＴ、β、およびＦａｓリガンドについて同定されて
いるのみであり（一般的な概説として、Ｇｒｕｓｓ， Ｈ．およびＤｏｗｅｒ， Ｓ．Ｋ
．， Ｂｌｏｏｄ， ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）を参照のこと、こ
れは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。これらのタンパク質は、細胞増
殖、活性化および分化の調節（細胞生存またはアポトーシスもしくは細胞傷害性による細
胞死の制御を含む）に関与関する（Ａｒｍｉｔａｇｅ， Ｒ．Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ
ｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：４０７（１９９４）、およびＳｍｉｔｈ， Ｃ．Ａ．
， Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９４））。
【０００５】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される；本明細書中以下「ＴＮＦ」）
は、エンドトキシン、または１７ｋＤタンパク質サブユニットの溶解性ホモ三量体のよう
な他の刺激の応答において単球およびマクロファージによって主に分泌される（Ｓｍｉｔ
ｈ， Ｒ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：６９５１−６９５４（１９
８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ
， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８））。
【０００６】
蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカインであるこ
とを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ合成（「カケクチ
ン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．らＮａｔｕｒｅ ３１６：５５２（１９８５
））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ， Ｂら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． １３８：７６５（１９８７））、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃ
ｅｋ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒ
ｍａｎ， Ｂ． Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａ
ｎ， Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：２９１３（１９８７））、特定の
形質転換細胞タイプにおける細胞傷害性活性（Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．Ｂ．ら、前出；Ｄ
ａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｚ．ら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４４：８３（１９８４）
）、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ， Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４５：６５９（１９８６）；
Ｗｏｎｇ， Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８１９（１９８６））、骨再吸収
刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ， Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）
；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６））、コ
ラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ， Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ
． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（Ｔ細
胞（Ｙｏｋｏｔａ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：５３１（１９８８））
、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ， Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：７８６（１
９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６（１９８６）
）、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ， Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１４
７２（１９８８））の活性化、ならびに腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよび
クラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒ
ｒｅｌ， Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３０４（１９８７））を含む）。
【０００７】
ＴＮＦは、以下のような組織創傷を生じるそのプロ炎症性作用について示されている：
血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の増強した接着（Ｐ
ｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：３３１９（１９８７））、
ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の
刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ， Ｇ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３９０（１９
８７））。
【０００８】
最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ， Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば、いくつかの悪性
を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ． Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５（１９８７）
）の病原体、ならびに自己免疫症状および移植片対宿主症状（Ｐｉｇｕｅｔ， Ｐ．−Ｆ
．ら、Ｊ． Ｅｃｐ． Ｍｅｄ． １６６：１２８０（１９８７））に関連づける。ガン
および感染症状とのＴＮＦの関連は、しばしば宿主代謝状態に相関する。ガン患者の主な
問題は体重の減少であり、通常摂食障害と関連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」
として知られる（Ｋｅｒｎ， Ｋ．Ａ．ら、Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｅｎｔｅｒ． Ｎｕ
ｔｒ． １２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重減少、摂食障害
、および悪性増殖の応答における体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態は顕著な
死亡率と関連し、そして多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が、ＴＮＦが、ガン
、感染症状、および他の代謝性状態における悪液質の重要なメディエーターであることを
示唆している。
【０００９】
ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症およびエ
ンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． ７
６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｅｓ， Ｊ． Ｍ． Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎ
ｄ， Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ， ４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉ
ｍｐｓｏｎ， Ｓ． Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ． ５：２７−４７（１
９８９））の病理生理学的結果における中心的役割を果たすと考えられている。エンドト
キシンは、強力な単球／マクロファージアクチベーターであり、これは、ＴＮＦの産生お
よび分泌（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ， Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：２５
８５−２５９１（１９８６））、ならびに他のサイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エン
ドトキシンの多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床的徴候
に応答可能な中心的メディエーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよび他の単球誘導
性サイトカインは、エンドトキシンに対する代謝性応答および神経ホルモン性応答を媒介
する（Ｍｉｃｈｉｅ， Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８：１４８
１−１４８６（１９８８））。ヒトボランティアへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻
脈、代謝速度の上昇、およびストレスホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴う急
病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ， Ａ．ら、Ａｒｃｈ． Ｓｕｒｇ． １２３：１６２−１
７０（１９８８））。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性敗血症に罹患し
た患者において見い出されている（Ｗａａｇｅ， Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ １：３５５−
３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ， Ａ． Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ
Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁、（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ， Ｊ．
Ｍ． Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １７：４８９−４９７（１９８９）；
Ｃａｌａｎｄｒａ， Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １６１：９８２−９８７
（１９９０））。
【００１０】
ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態における
増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性敗血症およびエン
ドトキシンにおける毒性効果を有し得る。カケクチン（後にＴＮＦと同一であることが見
い出された）として特徴付けられた「モジュレーター」物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍ
ｉらによって開示された（欧州特許公開０，２１２，４８９、１９８７年３月４日）。こ
のような抗体は、診断的免疫アッセイにおいて、および細菌性感染におけるショックの試
料において有用であるといわれた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８、１
９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このような抗体を分
泌するハイブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびにＴＮＦの免疫アッセイ
におけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（欧州特許公開０，２８８，０８
８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体（ ｍＡｂを含む）および症状の免疫ア
ッセイ診断における（特に川崎病の症状および細菌感染）それらの有用性を開示した。川
崎病の症状を有する患者の体液（小児急性熱病粘膜皮膚リンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋ
ｉ， Ｔ．， Ａｌｌｅｒｇｙ １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｔ．
， Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９８５））は、症状の進
行に関連して上昇したＴＮＦレベルを有するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。
【００１１】
他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを記載
した（Ｌｉａｎｇ， Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍ． １３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ， Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６
：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ， Ｔ Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
６：４８９−５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍ
ｅｔｈ． ９６：５７−６２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒ， Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
２：１６２−１６９（１９９０）））。これらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエ
ピトープをマッピングし、酵素免疫アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒ
ａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製において補助す
る（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの研究は、免疫原性
、特異性の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、インビボ診断的使用またはヒ
トにおける治療的使用のために使用され得る抗体を中和するＴＮＦを産生するための基礎
を提供しない。
【００１２】
中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理
学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的チャレンジ後の死
から予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ歯類致死率アッセイにおい
て、および霊長類病理学モデル系において実証されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ， Ｊ．Ｃ
．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂ
ｅｕｔｌｅｒ， Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒ
ａｃｅｙ， Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉ
ｍａｍｏｔｏ， Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７：３１１−３１８（１９
８８）；Ｓｉｌｖａ， Ａ． Ｔ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６２：４２
１−４２７（１９９０）Ｏｐａｌ， Ｓ． Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．
１６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ， Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．
Ｓｈｏｃｋ ６０：２７９−２９２（１９９０））。
【００１３】
今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ ｍＡｂ治療の経験は限られているが、有用な治療
結果を示している（例えば、関節炎および敗血症）。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ．Ｊ
．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ９：６３３−５２（
１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍら、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ， Ｔ．ら、Ｓｈ
ｏｃｋ ３：１−１２（１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ． Ｍｅｄ
． ２１：Ｓ４３６−４０（１９９３）；Ｔｒａｃｅｙ Ｋ． Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ． Ｃ
ａｒｅ Ｍｅｄ． ２１ Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと。
【００１４】
哺乳動物の発生は、細胞の増殖および分化の両方ならびにアポトーシスの間におこるプ
ログラムされた細胞死に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｃｈｉｅｖ．
Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． １３：１８（１９８８））。アポトーシスは、自己抗原を認
識する免疫胸腺細胞の破壊に重要な役割を担う。この正常な除去プロセルの欠失は、自己
免疫疾患における役割を果たし得る（Ｇａｍｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ １２：１９３（１９９１））。
【００１５】
Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））は、アポトーシスを媒介し、そし
てＴ細胞のクローン性欠失に関与する、細胞表面抗原、Ｆａｓ／ＣＤ２３を記載する。Ｆ
ａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球に加えて、成体マウスにおける活性化Ｔ細胞、Ｂ
細胞、好中球において、ならびに胸腺、肝臓、心臓、および肺ならびに卵巣において、発
現される（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：
１２７４（１９９２））。モノクローナルＡｂがＦａｓに対して架橋する実験において、
アポトーシスは誘導される（Ｙｏｎｅｈａｒａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９：
１７４７（１９８９）；Ｔｒａｕｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１（１９８９）
）。さらに、ＦａｓへのモノクローナルＡｂの結合は特定の条件下でＴ細胞に対して刺激
性である例がある（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：２２３１
（１９９３））。
【００１６】
Ｆａｓ抗原は、４５Ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓのヒトおよ
びマウス両方の遺伝子は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａらによってクローン化さ
れている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１２７４（１９９２）およびＩｔｏｈら（
Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））。これらの遺伝子によってコードされるタンパク
質は、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（２つのＴＮＦレセプ
ター、低親和性神経成長因子レセプター、ならびにＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、およ
びＯＸ４０を含む）に構造的相同性を有する両方の膜貫通タンパク質である。
【００１７】
最近、Ｆａｓリガンドが記載されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１１６９（１
９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリーに属するＩＩ型膜
貫通タンパク質であることを示す。従って、Ｆａｓリガンドポリペプチドは、３つの主要
ドメインを含む：疎水性膜貫通ドメインによって結合された、アミノ末端での短い細胞内
ドメインおよびカルボキシ末端での長い細胞外ドメイン。Ｆａｓリガンドは脾臓細胞およ
び胸腺細胞において発現され、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性と一致する。精製Ｆａｓリガンド
は４０ｋＤの分子量を有する。
【００１８】
最近では、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化後のアポトーシスに必要
とされることが示されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４（１９９５）；Ｂ
ｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５））。Ｔ細胞の活性化は、細
胞表面上の両タンパク質を誘導する。リガンドとレセプター間の続く相互作用は、細胞の
アポトーシスを生じる。これは、正常な免疫応答の間の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作
用によって誘導されるアポトーシスへの可能な調節的役割を支持する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必要がある
。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様サイトカインに関連した障害の治療へのこ
れらのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の抗体または他のアンタゴニストを作成する
ために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＮＦおよび関連サイトカインに構造的に類似し、そして類似の生物学的効
果および活性を有すると考えられるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子を提供する。このサイトカインは、ニュートロカインαと命名され、そ
して本発明は、少なくとも図１におけるアミノ酸配列（配列番号２）または１９９６年１
０月２２日にＡＴＣＣ寄託として細菌宿主において寄託されたｃＤＮＡクローンによりコ
ードされるアミノ酸配列の一部を有するニュートロカインαポリペプチドを含む。寄託さ
れたニュートロカインαクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列（これは
、図１（配列番号１）に示される）は、Ｎ末端メチオニン、約４６アミノ酸残基の推定細
胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン、約２１３アミノ酸の推定細胞外ド
メイン、および約３１ｋＤａの完全タンパク質についての推定分子量を含む２８５アミノ
酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ
型膜貫通タンパク質について、ニュートロカインαの可溶性形態は、膜貫通ドメインから
切断された細胞外ドメインのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュー
トロカインαポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した細
胞外ドメイン）を含む。
【００２１】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）図１（配列番号２）
におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローン
によりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有するニュートロカインα全長ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）におけるか、または１９
９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとお
りのアミノ酸配列７３位〜２８５位を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞
外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαの細胞内ドメイン
を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１（配列番号２）におけるか、ま
たは１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードさ
れるとおりのアミノ酸残基約１位〜約４６位）；（ｄ）ニュートロカインαの膜貫通ドメ
インを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図１（配列番号２）におけるか
、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
ドされるとおりのアミノ酸残基約４７〜約７２）；（ｅ）細胞外ドメインおよび細胞内ド
メイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュートロカインαポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；および（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または
（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも９０％同一の、および
より好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
または（ｆ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。ハ
イブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下ではハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカイン
αポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含
む単離された核酸分子に関する。
【００２３】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換え
ベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製するための
方法および組換え技術によりニュートロカインαポリペプチドまたはペプチドの産生のた
めにこれらを使用する方法に関する。
【００２４】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたニュー
トロカインαポリペプチドを提供する：（ａ）図１（配列番号２）に示されるか、または
１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる
とおりの完全アミノ酸配列を有するニュートロカインα全長ポリペプチドのアミノ酸配列
；（ｂ）図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託
に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位
を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｃ）
ニュートロカインαの細胞内ドメインのアミノ酸配列（図１（配列番号２）におけるか、
または１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
されるとおりのアミノ酸残基約１位〜約４６位）；（ｄ）ニュートロカインαの推定膜貫
通ドメインのアミノ酸配列（図１（配列番号２）におけるか、または１９９６年１０月２
２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸残
基約４７位〜約７２位）；および（ｅ）これらのドメインの各々が上記のように規定され
る、細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュート
ロカインαポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２５】
本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）
に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは、
少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の
アミノ酸配列に少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、およびな
おより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、アミノ酸
配列を有するポリペプチドを含む。
【００２６】
本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、ま
たは（ｅ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピト
ープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のニ
ュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドま
たはポリペプチドは、少なくとも６もしくは７、好ましくは少なくとも９、そしてより好
ましくは少なくとも約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部
分を含むが、上記に記載される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体までおよびそ
れを含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。別の実施
態様において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）に記載
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する
。
【００２７】
本発明はさらに、本明細書中に記載のとおりのアミノ酸配列を有するニュートロカイン
αポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離する方法を提供する。このような抗体は、
以下に記載されるように診断的または治療的に有用である。
【００２８】
本発明はまた、可溶性ニュートロカインαポリペプチド、特にヒトニュートロカインα
ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。可溶性ニュートロカインαポリペプチドは
、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルス、または他の寄生生物による感染、免疫
不全症、炎症性疾患、リンパ腺腫、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患を処置するため、な
らびに末梢寛容を刺激し、いくつかの形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および増殖を
媒介するために、使用され得、そして免疫調節および炎症応答の最初の媒介物として機能
的に連結している。
【００２９】
本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボで細胞に
、または多細胞生物に投与するためのニュートロカインαポリヌクレオチドまたはニュー
トロカインαポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特定の特に好ま
しい実施態様において、組成物は、疾患の処置のための宿主生物におけるニュートロカイ
ンαポリペプチドの発現のためのニュートロカインαポリヌクレオチドを含む。この点に
関して特に好ましいのは、ニュートロカインα遺伝子の異常な内因性活性に関連する機能
不全の処置のためのヒト患者における発現である。
【００３０】
本発明はまた、候補化合物とニュートロカインを発現する細胞とを接触させること、細
胞応答をアッセイすること、および標準的な細胞応答（ここで、標準は、接触が候補化合
物の非存在下でなされる場合にアッセイされる）とこの細胞応答とを比較することを含む
、ニュートロカインαにより誘導される細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定す
るためのスクリーニング方法を提供し、この標準は候補化合物の非存在下で接触される場
合にアッセイされる。ここで、標準よりも増強された細胞応答は、化合物がアゴニストで
あることを示し、そして標準よりも減少した細胞応答は、化合物がアンタゴニストである
ことを示す。
【００３１】
別の局面において、ニュートロカインαレセプターを同定するための方法、ならびにこ
のようなレセプターを使用するアゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニング
アッセイが提供される。このアッセイは、ニュートロカインαレセプターに対する、ニュ
ートロカインαの結合における候補化合物の影響を決定することを含む。特に、本方法は
、ニュートロカインαレセプターをニュートロカインαポリペプチドおよび候補化合物と
接触させる工程、ならびに候補化合物の存在に起因してニュートロカインαレセプターに
結合するニュートロカインαポリペプチドが増加するかまたは減少するかを決定する工程
を包含する。アンタゴニストは、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイル
スの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸収、関節炎リウマチ、および悪液質（老廃物または
貧栄養）を予防するために使用され得る。
【００３２】
本発明者ら、は、ニュートロカインαが好中球のみならず、腎臓、肺、末梢生白血球、
骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃ガン、平滑筋、マクロファー
ジ、臍帯血液組織にもまた発現されることを見出した。多数のこれらの組織および細胞の
障害（例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルス、および他の寄生生物の感染、免疫
不全、敗血症生性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片対宿
主拒絶、骨再吸収、関節炎リウマチ、および悪液質（老廃物または貧栄養）について、「
標準的な」ニュートロカインα遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有していない固体か
らの組織または体液におけるニュートロカインαの発現レベル）と比較して、有意により
高いかまたはより低いレベルのニュートロカインα遺伝子発現が、そのような障害を有す
る固体から取られた特定の組織（例えば骨髄）または体液（例えば、血清、血漿、尿、関
節液、または髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、障害の診断
の間に有用である診断方法を提供する。これは、以下を含む：（ａ）個体の細胞または体
液のニュートロカインα遺伝子発現レベルをアッセイすること；（ｂ）ニュートロカイン
α遺伝子発現レベルを、標準的なニュートロカインα遺伝子発現レベルと比較し、それに
より標準的な発現レベルと比較した、アッセイされたニュートロカインα遺伝子発現レベ
ルにおける増加または減少を障害の指標とすること。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、体内のニュートロカインα活性レベルの上昇を必要とする個
体を処置するための方法であって、治療有効量の、本発明の単離されたニュートロカイン
αポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包
含する方法に関する。
【００３４】
本発明のなおさらなる局面は、体内のニュートロカインα活性レベルの減少を必要とす
る個体を処置するための方法であって、治療有効量の、ニュートロカインαアンタゴニス
トを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方法に関する。本発明におけ
る使用のための好ましいアンタゴニストは、ニュートロカインα特異的抗体である。
【００３５】
本発明は、以下を提供する。
【００３６】
（１）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）図１における完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカインαポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαをコードするヌクレオチド配
列；
（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列
；
（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列
；
（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列
；
（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠除する溶解
性ニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド；
（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）における任意の
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００３７】
（２）前記ポリヌクレオチドが図１における完全なヌクレオチド配列（配列番号１）を
有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００３８】
（３）前記ポリヌクレオチドが、図１における完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有
するニュートロカインαポリペプチドをコードする図１におけるヌクレオチド配列（配列
番号１）を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００３９】
（４）前記ポリヌクレオチドが、図１に示される細胞外ドメインを含む溶解性ニュート
ロカインαをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を有する、項目（１）に記載の
核酸分子。
【００４０】
（５）以下からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）配列番号２の残基ｎ〜２８５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎは２〜１９０の範囲の整数である、配列；
（ｂ）配列番号２の残基１〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列であって、ここで、ｍは２７４〜２８４の範囲の整数である、配列；
（ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列であって、ここで、ｎおよびｍはそれぞれ上記の（ａ）および（ｂ）
に規定される整数である、配列；
（ｄ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされる完全なニュートロカインαアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列であって、ここで、該一部分が、該完全なアミノ酸配列のアミノ
末端から１〜１９０アミノ酸およびＣ末端から１〜１１アミノ酸を含まない、ヌクレオチ
ド配列。
【００４１】
（６）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃ
ＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４２】
（７）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４３】
（８）前記ポリヌクレオチドが、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃ
ＤＮＡクローンによってコードされる細胞外ドメインを含む溶解性ニュートロカインαポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、項目（１）に記載の核酸分子。
【００４４】
（９）項目（１）の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）における
ヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単
離された核酸分子であって、ここで、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基
のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
【００４５】
（１０）項目（１）の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけ
るアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ
酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【００４６】
（１１）以下からなる群から選択されるニュートロカインαポリペプチドのエピトープ
保有部分をコードする、項目（１０）に記載の単離された核酸分子：約Ｐｈｅ １１５〜
約Ｌｅｕ １４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ １５０
〜約Ｔｙｒ １６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；
約Ｓｅｒ １７１〜約Ｐｈｅ １９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド
；約Ｇｌｕ ２２３〜約Ｔｙｒ ２４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチ
ド；および約Ｓｅｒ ２７１〜約Ｐｈｅ ２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポ
リペプチド。
【００４７】
（１２）項目（１）に記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入する工程を包含す
る、組換えベクターを作製するための方法。
【００４８】
（１３）項目（１２）に記載の方法によって産生される、組換えベクター。
【００４９】
（１４）項目（１３）に記載の組換えベクターを宿主細胞中に導入する工程を包含する
、組換え宿主細胞を作製する方法。
【００５０】
（１５）項目（１４）に記載の方法によって産生される組換え宿主細胞。
【００５１】
（１６）ニュートロカインαポリペプチドを産生するための組換え方法であって、該ポ
リペプチドが発現され、そして該ポリペプチドを回収するような条件下で、項目（１５）
に記載の該組換え宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００５２】
（１７）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を
含む、単離されたニュートロカインαポリペプチド：
（ａ）図１（配列番号２）における完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカインα
のアミノ酸配列；
（ｂ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされる完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカインαのアミノ酸配列；
（ｃ）ニュートロカインαポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）ニュートロカインαポリペプチド膜貫通ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）ニュートロカインαポリペプチド細胞内ドメインのアミノ酸配列；
（ｆ）ドメインを含む溶解性ニュートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのいず
れか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
【００５３】
（１８）ニュートロカインαのエピトープ保有部分を含む項目（１７）に記載の単離さ
れたポリペプチドであって、ここで、前記部分は以下からなる群から選択される：約Ｐｈ
ｅ １１５〜約Ｌｅｕ １４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｉ
ｌｅ １５０〜約Ｔｙｒ １６３のアミノ酸残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド；約Ｓｅｒ １７１〜約Ｐｈｅ １９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含む
ポリペプチド；約Ｇｌｕ ２２３〜約Ｔｙｒ ２４７のアミノ酸残基（配列番号２）を含
むポリペプチド；および約Ｓｅｒ ２７１〜約Ｐｈｅ ２７８のアミノ酸残基（配列番号
２）を含むポリペプチド。
【００５４】
（１９）項目（１７）に記載のニュートロカインαポリペプチドに特異的に結合する、
単離された抗体。
【００５５】
（２０）項目（１７）に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む
、薬学的組成物。
【００５６】
（２１）以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一の配列を有するポ
リヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）クローンＨＳＯＡＤ５５Ｒのヌクレオチド配列（配列番号７）；
（ｂ）クローンＨＳＬＡＨ８４Ｒのヌクレオチド配列（配列番号８）；
（ｃ）クローンＨＬＴＢＭ０８Ｒのヌクレオチド配列（配列番号９）；
（ｄ）図１に示される配列（配列番号１）の部分のヌクレオチド配列であって、ここで
、前記部分は、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド８０９の少なくとの３０の連続したヌクレ
オチドを含む；および
（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるヌクレオチド配列のいず
れかに相補的なヌクレオチド配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
（詳細な説明）
本発明は、クローン化されたｃＤＮＡニュートロカインαを配列決定することによって
決定された、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１（
配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９６年１０月２２日にアメリカンタイ
プカルチャーコレクション、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託された、ＨＮＥＤＵ１５クローンの配列決定によ
って得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に含まれる。
【００５８】
本発明のニュートロカインαタンパク質は、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびＦａｓリ
ガンドのヒトｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有している（図２）。上記のように、
ＴＮＦαは、細胞傷害性、壊死、アポトーシス、副刺激、増殖、リンパ節形成、免疫グロ
ブリンクラススイッチ、分化、抗ウイルス活性、接着分子ならびに他のサイトカインおよ
び増殖因子の調節において役割を果たす重要なサイトカインであると考えられる。
【００５９】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定された
すべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本
明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸
配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、この自
動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のよ
うに、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自
動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレ
オチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも
約９５％から少なくとも約９９．９％の同一である。実際の配列は、当該分野において周
知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当
該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列
における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引
き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミ
ノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実
際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００６０】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子または
ポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子また
はポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド（Ａ， Ｇ， Ｃ， およびＵ）の対応
する配列（ここで特定されるデオキシリボヌクレオチド配列における各チミジンデオキシ
リボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる
）が意図される。
【００６１】
本明細書中で提供される情報（例えば、図１のヌクレオチド配列）を用いて、ニュート
ロカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよび
スクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニング
するための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、図１（配列番号１）において
記載される核酸分子は、好中球由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。ニュートロ
カインα ｃＤＮＡの一部に対応する発現された配列タグもまた、好中球において見出さ
れた。
【００６２】
ニュートロカインα遺伝子は、約２８５アミノ酸残基（約４６アミノ酸の細胞内ドメイ
ン（図１（配列番号２）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の膜貫通
ドメイン（図１（配列番号２）のほぼ４７〜ほぼ７２のアミノ酸残基），約２１３アミノ
酸の細胞外ドメイン（図１（配列番号２）のほぼ７３〜ほぼ２８５のアミノ酸残基））の
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み；そして約３１ｋＤａの推
定分子量である。図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαタンパク質は、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ登録番号３３９７６４としてアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約２０％類似
しそして約１０％同一である。
【００６３】
当業者が理解するように、上記の配列決定の誤りの可能性に起因して、寄託されたｃＤ
ＮＡによってコードされる実際の完全なニュートロカインαポリペプチド（約２８５のア
ミノ酸を含む）は、いくらかより小さいかもしれない。特に、決定されたニュートロカイ
ンαコード配列は、図１（配列番号１）のヌクレオチド２１０−２１３位で、オープンリ
ーディングフレームの翻訳のための選択的な開始コドンとして役立ち得る第２のメチオニ
ンコドンを含む。より一般的には、実際のオープンリーディングフレームは、図１（配列
番号１）に示されるＮ末端からの第１または第２のメチオニンコドンのいずれかから予測
される、±２０アミノ酸の範囲、より可能性が高いのは±１０アミノ酸の範囲のどこかに
存在し得る。種々の機能的ドメインを同定するために使用される分析的基準に依存して、
ニュートロカインαポリペプチドの細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメ
インの正確な「アドレス」は、僅かに異なり得ることがさらに理解される。例えば、図１
（配列番号２）の、ニュートロカインα細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定
するために使用した基準に依存して、僅かに変化し得る（例えば、アドレスは、約１〜約
２０残基、より可能性が高いのは約１〜約５残基「シフト」し得る）。この場合、膜貫通
ドメインの末端、および細胞外ドメインの開始部は、図３に示されるように、上記の位置
における疎水性アミノ酸配列の同定に基づいて予測される。いずれにしても、以下でさら
に考察されるように、本発明はさらに、完全なポリペプチドのＮ末端から種々の残基が欠
失されたポリペプチド（ニュートロカインαタンパク質の可溶型の細胞外ドメインを構築
する、本明細書中に記載の細胞外ドメインのＮ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失するポ
リペプチドを含む）を提供する。
【００６４】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤ
ＮＡの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成されるｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る
。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、
またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００６５】
「単離された」核酸分子（単数または複数）によって、天然の環境から取り出された核
酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮ
Ａ分子は、本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたＤＮＡ分子の
さらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（
部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明
のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従って単離
された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。
【００６６】
本発明の単離される核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の１
４７〜１４９位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤ
ＮＡ分子を含む。さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列と実質的に異なる
が、遺伝暗号の縮重に起因してなおニュートロカインαタンパク質をコードする配列を含
むＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において周知である。従って、上記
の縮重変異体を生成することは、当業者にとって日常的である。別の局面において、本発
明は、１９９６年１０月２２日に寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコー
ドされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードする単離された
核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローン
によってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする配列を含む。
【００６７】
本発明はさらに、図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列、または上記
の寄託されたクローンに含まれるニュートロカインαｃＤＮＡ、もしくは上記の配列の１
つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離される分子、特にＤＮＡ
分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため
、および例えばノーザンブロット分析によるヒト組織中のニュートロカインα遺伝子の発
現を検出するためのプローブとして有用である。
【００６８】
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核酸分子、
ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関する。詳細には、本
発明は配列番号１の部分を示すヌクレオチド配列（配列番号１の１〜１００１位からなる
）を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００６９】
さらに、本発明は、図１（配列番号１）のヌクレオチド１からヌクレオチド８０９の配
列の内、少なくとも約３０の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレ
オチドの任意の部分と少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
より一般的には、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に
示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、本明細書
中で考察されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１
５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さであるフラグメント
を意図される。もちろん、本発明による５０〜３００ｎｔの長さのより大きいフラグメン
トもまた、有用である。なぜなら、これらのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡまたは
図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列の、全てではないかもしれないが
、大部分の対応するフラグメントだからである。例えば、少なくとも２０ｎｔの長さのフ
ラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡの、または図１（配列番号１）に示されるよう
なヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。本
発明の好ましい核酸フラグメントは、図１に同定され、そして以下により詳細に記載され
るようなニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保持部分をコードする核酸分子を
含む。
【００７１】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、
上記の本発明の核酸分子（例えば、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託中に含まれる
ｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件」によって、括弧内を含む溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）
、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子
ＤＮＡ ）中４２℃での一晩のインキュベーション、続く約６５℃にて０．１×ＳＳＣに
おいてフィルターを洗浄することが意図される。
【００７２】
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照の
ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少な
くとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ま
しくは約３０〜７０（例えば、５０）ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考
察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【００７３】
例えば、「少なくとも２０ｎｔの長さ」のポリヌクレオチドの一部によって、参照ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号１
）に示されるようなヌクレオチド配列）からの配列の２０以上の連続するヌクレオチドが
意図される。当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるニ
ュートロカインα ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）区域）、またはＴ（もしくはＵ）残基
の相補的領域にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイ
ブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、
このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）領域またはその相補体（例えば、特に任意の
二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
【００７４】
示されるように、ニュートロカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、
以下をコードする核酸分子を含み得るが、それらに限定されない：それ自体によって、ポ
リペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；および、ポリペプチドの細胞外ドメインの
コード配列およびさらなる配列（例えば細胞内および膜貫通ドメイン配列、またはプレタ
ンパク質配列もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列をコードする
配列）；上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まないポリペプチドの細胞外ドメイ
ンのコード配列。
【００７５】
また、本発明の核酸によってコードされるのは、さらなる非コード配列を伴う上記のタ
ンパク質配列であり、例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転
写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定
性）を担う転写される非翻訳配列（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む
））；さらなる機能性を提供する配列のようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコ
ード配列を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペ
プチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局
面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒ
スチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９
Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）において提
供されるタグ）であり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４ （１９８
９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提
供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対
応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３
７： ７６７ （１９８４）によって記載されている。以下で考察されるように、他のそ
のような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合されるニュートロカインαを
含む。
【００７７】
（改変体および変異体ポリヌクレオチド）
本発明は、さらに、ニュートロカインαタンパク質の一部、アナログ、または誘導体を
コードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子改変体のよ
うに、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子
座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，
Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （
１９８５）。天然に存在しない変異体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成さ
れ得る。
【００７８】
このような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって産生され
た改変体が挙げられる。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る
。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード
領域における変化は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を生
じ得る。これらの中で特に好ましいのは、ニュートロカインαタンパク質、またはその部
分の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加、および欠失である。また
、このことについて特に好ましいのは保存的置換である。
【００７９】
最も好ましくは、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤ
ＮＡクローンによってコードされるニュートロカインαアミノ酸配列の細胞外ドメインを
有するタンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸分子である。さらなる実施態様は、
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも９０％同一、そしてより
好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）図１（配列番
号２）中の完全アミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；（ｂ）図１（配列番号２）中の７３〜２８５位でアミノ酸配列を有するニ
ュートロカインαポリペプチドの推定される細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣに含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされる完全アミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列；（ｄ）１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡクロー
ンによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドの細胞外
ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
または（ｄ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００８０】
ニュートロカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例
えば、９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌク
レオチド配列が、ニュートロカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の
各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照
ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは
別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％まで
の多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照
ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置でか、または参照配列内のヌクレオチドの
中で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群でのいずれかで散在されて、こ
れらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
【００８１】
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配列または
寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉ
ｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュ
ータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈおよ
びＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉ
ｃｓ． ２：４８２−４８９ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つ
の配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。Ｂｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列
プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一である
か否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド
配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％まで
の相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【００８２】
本出願は、ニュートロカインα活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係な
く、図１（配列番号１）において示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列
と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分
子に関する。これは、特定の核酸分子がニュートロカインα活性を有するポリペプチドを
コードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイ
ゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用す
るかをなお知るからである。ニュートロカインα活性を有するポリペプチドをコードしな
い本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ（１）ニュートロカインα遺伝子またはそ
の対立遺伝子改変体をｃＤＮＡライブラリーにおいて単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら
， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８
８）に記載の、ニュートロカインα遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期
染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；およ
び、（３）特定の組織におけるニュートロカインα ｍＲＮＡ発現を検出するためのノー
ザンブロット分析、が挙げられる。
【００８３】
しかし、実際に、ニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードす
る図１（配列番号１）示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に少なくと
も９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する核酸
分子が好ましい。「ニュートロカインα活性を有するポリペプチド」によって、特定の生
物学的アッセイにおいて測定される場合、本発明のニュートロカインαタンパク質の細胞
外ドメインまたは全長ニュートロカインαタンパク質の活性と類似する（しかし、必ずし
も同一ではない）活性を示すポリペプチドが意図される。例えば、本発明のニュートロカ
インαタンパク質は、細胞増殖、細胞傷害性、および細胞死を調節する。特定の細胞に対
するタンパク質の作用を測定するためのインビトロ細胞増殖アッセイ、細胞傷害性アッセ
イ、および細胞死アッセイは、周知の、ならびに細胞複製および／または細胞死を検出す
るために当該分野で通常に利用可能な試薬を用いることによって行われ得る。例えば、Ｔ
ＮＦ関連タンパク質活性についての多数のそのようなアッセイが、上記の本開示の背景の
セクションにおける種々の参考文献に記載されている。手短に言えば、そのようなアッセ
イは、ヒトまたは動物（例えば、マウス）細胞を回収し、そして（１）ニュートロカイン
αタンパク質（または候補ポリペプチド）を含むトランスフェクトされた宿主細胞上清、
または（２）トランスフェクトされていない宿主細胞上清コントロールと混合すること、
ならびに特定の期間のインキュベーション後に細胞数または生存率に対する作用を測定す
ることを含む。このタイプのアッセイにおいて測定され得るようなこのような細胞増殖調
節活性は、腫瘍、腫瘍転移、感染、自己免疫疾患炎症、および他の免疫関連疾患の処置に
有用である。
【００８４】
ニュートロカインαは、上記のアッセイにおいて用量依存的様式で細胞増殖および分化
を調節する。従って、「ニュートロカインαタンパク質活性を有するポリペプチド」はま
た、上記のアッセイにおいて用量依存的様式で同じ細胞調節（特に免疫調節）活性のいず
れかを示すポリペプチドを含む。用量依存活性の程度は、ニュートロカインαタンパク質
の活性と同一である必要はないが、好ましくは「ニュートロカインαタンパク質活性を有
するポリペプチド」は、ニュートロカインαタンパク質と比較して所定の活性において実
質的に類似の用量依存を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ニュートロカインα
タンパク質と比較して約２５倍より大きい活性か、またはより小さい活性、そして好まし
くは、約１０倍以下の活性を示す）。
【００８５】
ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、ニュートロカインαは、例えば、単球、リ
ンパ球、および好中球を含む白血球に対する活性を示す。こういう訳で、ニュートロカイ
ンαは、これらの細胞タイプの増殖、分化、および動員を指示することにおいて活性であ
る。このような活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の
炎症の制御、ならびに白血病の処置に有用である。このような活性を測定するためのアッ
セイは、当該分野で公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら， Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ
１７：２７３（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８２：１１１
１（１９９５）；Ｃａｕｘら， Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２５８（１９９２）；およびＳ
ａｎｔｉａｇｏ−Ｓｈｗａｒｚら， Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ． ３７８：７
（１９９５）を参照のこと。
【００８６】
もちろん、遺伝暗号の縮重のために、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列または
図１（配列番号１）に示される核酸配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が、「ニュートロカインα
タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、こ
れらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、これ
は上記の比較アッセイを実施することなしでさえ当業者に明らかである。縮重改変体でな
いそのような核酸分子について、合理的な数がまたニュートロカインαタンパク質活性を
有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、下記で
さらに記載されるように、当業者が、タンパク質の機能に有意な影響をあまり与えそうに
ないか、または有意な影響を与えそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つ
の脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知っているからである。
【００８７】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝
子操作された宿主細胞、および組換え技術によるニュートロカインαポリペプチドまたは
そのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミド
、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクタ
ーは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に
、相補宿主細胞においてのみ生じる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のため
の選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン
酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入され
る。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いて
インビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００８８】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファージλＰ
Ｌプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプ
ロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモー
ター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきであ
る。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始
、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む
。構築物によって発現される転写物の細胞外ドメインのコード部分は、好ましくは、翻訳
されるべきポリペプチドの始めに転写開始を含み、そして終わりに適切に配置された終止
コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。
【００８９】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。
このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、
Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養
についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン
耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が
挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条
件は当該分野で公知である。
【００９０】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱ
Ｅ−９（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．から入手可能、前出）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅ
ｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐ
ＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９
９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、
ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手
可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００９１】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキ
ストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレク
トロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような
方法は、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００９２】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シ
グナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、
特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の
間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。ま
た、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような
領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じ
るため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプ
チドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融
合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製に有用な免疫グロブリン由来の異種領域
を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３（カナダ対応出願２０４５８６９）は、
別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分
を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療お
よび診断における使用に全く有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を
生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク
質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にＦｃ部分が
欠失され得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害
であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用される場
合）である。薬物発見において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−
５のアンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニングアッセイの目的でＦｃ部分
と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎ
ｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら， Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照のこと。
【００９３】
ニュートロカインαタンパク質は、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン
または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって
組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマ
トグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天
然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、
細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え
技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して
、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。
さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として
、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００９４】
（ニュートロカインαポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、もしくは図
１（配列番号２）のアミノ酸配列を有する単離されたニュートロカインαポリペプチド、
または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。
【００９５】
（改変体および変異体ポリペプチド）
ニュートロカインαポリペプチドの特徴を改善または改変するために、タンパク質操作
を用い得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規な変異体タンパク質または「単一
または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含むムテイン、または融合タンパク質」を作製
するために用いられ得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、増強された活
性または増加した安定性を示し得る。さらに、これらは、高収量で精製され得、そして少
なくとも特定の精製条件および保存条件下で対応する天然のポリペプチドよりも良好な溶
解度を示し得る。
【００９６】
（Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体）
例えば、分泌タンパク質の細胞外ドメインまたは成熟形態を含む多くのタンパク質につ
いて、１個以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失を伴わずにＮ末端またはＣ末
端から欠失され得ることが当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ．， ２６８：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個
のアミノ末端アミノ酸残基が失われたとしてもヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧ
Ｆタンパク質を報告した。
【００９７】
この場合、本発明のタンパク質はＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので
、図１（配列番号２）の１９１位のＧｌｙ（Ｇ）残基までのＮ末端アミノ酸の欠失は、い
くらかの生物学的活性（例えば、適切な標的細胞に対する細胞傷害性）を保持し得る。
【００９８】
Ｇｌｙ（Ｇ）残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物
学的活性を保持するとは考えられない。なぜなら、この残基は、ＴＮＦ関連ポリペプチド
において、生物学的活性に必要とされる保存されたドメインの始まりであるからである。
しかし、タンパク質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上
の生物学的機能の喪失の改変をもたらしたとしても、他の生物学的活性は依然として保持
され得る。従って、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインを認識する抗体を誘導する
かおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、一般に、タンパク質の完全なまた
は細胞外ドメインの大多数よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合、保持される。
完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を
保持するか否かは、本明細書中に記載の日常的な方法および他の当該分野で公知の日常的
な方法により容易に決定され得る。
【００９９】
従って、本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαのアミノ
酸配列のアミノ末端からの１個以上の残基より、アミノ末端からのＧｌｙ１９１残基まで
を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供する。特に、本発明は、配列番号２の残基ｎ〜１９０のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを提供し、ここで、ｎは、２〜１９０の範囲の整数であり、そして１９１は、ニュ
ートロカインαタンパク質の活性に必要とされると考えられる、完全なニュートロカイン
αポリペプチド（配列番号２に示す）のＮ末端からの最初の残基の位置である。より詳細
には、本発明は、配列番号２の以下の残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する：
【０１００】
【化１】

【０１０１】

【０１０２】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０３】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、イ
ンターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を
欠失させることにより、１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら， Ｊ． Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。本タンパク質は、ＴＮＦポ
リペプチドファミリーのメンバーであるので、２８４位のＬｅｕまでのＣ末端アミノ酸の
欠失は、全てではなくても大部分の生物学的活性（例えば、レセプター結合および細胞複
製の調整）を保持すると考えられる。約１０個までのさらなるＣ末端残基の欠失を有する
ポリペプチドはまた、いくらかの活性（例えば、レセプター結合）を保持し得るが、この
ようなポリペプチドは、ほぼＬｅｕ２８４で始まる保存されたＴＮＦドメインの部分を欠
く。しかし、タンパク質のＣ末端の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上
の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る
。従って、短縮化タンパク質が完全なまたは成熟タンパク質を認識する抗体を誘導および
／または結合する能力は、一般に、完全なまたは成熟タンパク質の大部分よりも少ない残
基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定
のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される
日常的な方法および他の当該分野で公知の日常的な方法により容易に決定され得る。
【０１０４】
従って、本発明はさらに、図１（配列番号２）に示されるニュートロカインαのアミノ
酸配列のカルボキシ末端からの１個以上の残基より、カルボキシ末端からのＧｌｙ２７４
残基までを有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍを有するポ
リペプチドを提供し、ここで、ｍは、２７４〜２８４の範囲の任意の整数である。より詳
細には、本発明は、配列番号２の残基１〜２７４、１〜２７５、１〜２７６、１〜２７７
、１〜２７８、１〜２７９、１〜２８０、１〜２８１、１〜２８２、１〜２８３、および
１〜２８４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す
る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０５】
また、１個以上のアミノ酸がアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から欠失されたポ
リペプチドが提供され、これは、一般に、配列番号２のアミノ酸配列の残基ｎ〜ｍを有し
、ここでｎおよびｍが上記のような整数であるとして記載され得る。また、１９９６年１
０月２２日のＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なニュ
ートロカインαアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチドであって、ここでこの部分は
、寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端
からの１〜１９０アミノ酸またはＣ末端からの１〜１１アミノ酸（またはこれらのＮ末端
欠失およびＣ末端欠失の任意の組合せ）から排除されるポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列も含まれる。上記の欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提
供される。
【０１０６】
（他の変異体）
上記のタンパク質の末端欠失形態に加えて、ニュートロカインαポリペプチドのいくつ
かのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に有意な効果を有さずに変化し得るこ
とが当業者に認識される。このような配列の相違が意図される場合、活性を決定するタン
パク質の重要な領域が存在することを思い出すべきである。
【０１０７】
従って、本発明はさらに、実質的なニュートロカインαポリペプチド活性を示すかまた
はニュートロカインαタンパク質の領域（例えば、以下で議論するタンパク質部分）を含
む、ニュートロカインαポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は、活性にほと
んど影響を有さないことが当該分野で公知の一般的規則に従って選択される、欠失、挿入
、逆転、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換
を作製することに関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐ
ｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：
Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に提供される。ここで、著
者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主なアプローチが存
在することを示す。第１の方法は、進化のプロセスにより、ここで、変異は、自然選択に
より受け入れられるかまたは拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝
子操作を使用してアミノ酸変化を、クローン化された遺伝子の特異の位置に導入し、そし
て選択またはスクリーニングにより機能性を保持する配列が同定される。
【０１０８】
著者の述べるところによれば、これらの研究は、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほ
ど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸置換が、タンパク質の
特異の位置で許容されるようであるかを示す。例えば、ほとんどの埋没アミノ酸残基は、
非極性側鎖を必要とし、一方表面側鎖の特徴は、一般に、ほとんど保存されない。他のこ
のような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら、前出およびその中
での引用文献に記載される。保存的置換として代表的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａ
ｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；
ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミ
ド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに
芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１０９】
従って、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードさ
れるポリペプチドのフラグメント、誘導体、もしくはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミ
ノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換
されるものであり、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるも
のであるかそうでなくてもよく、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む
もの、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加
させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されるもの
、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーも
しくは分泌配列あるいはポリペプチドまたはプロタンパク質配列の細胞外ドメインの精製
に使用される配列のようなポリペプチドの細胞外ドメインに融合されるもの、であり得る
。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の
範囲内であると考えられる。
【０１１０】
従って、本発明のニュートロカインαは、天然の変異または人工操作のいずれかに由来
する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、タンパク
質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、重要でない性
質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。
【０１１１】
【表１】

【０１１２】
機能に必須である本発明のニュートロカインαタンパク質中のアミノ酸は、当該分野で
公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発）によっ
て同定され得る （ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４
：１０８１−１０８５ （１９８９））。後者の手順は、分子中の全ての残基に単一のア
ラニン変異を誘導する。次いで、得られる変異分子は、レセプター結合またはインビトロ
もしくはインビボ増殖活性のような生物学的活性について試験される。
【０１１３】
特に問題であることは、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での置
換である。これは非常に望ましい改善された特性（例えば凝集が少ない）を有するタンパ
ク質を生じ得る。凝集は、活性の減少を生じ得るだけでなく、薬学的処方物を調製する際
に凝集物が免疫原性であり得るため問題である（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘ
ｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）； Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６： ８３８−８４５ （１９８７）； Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １
０：３０７−３７７ （１９９３））。
【０１１４】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変化させ得
る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８ （１９９３）は
、２つの既知型のＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦαの選択的結合を生じる特定の
変異を記載している。ニューロカインαは、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーで
あるので、ＴＮＦ−αのそれに類似した変異は、ニューロカインαにおいて類似した効果
を有するようである。
【０１１５】
リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性
標識のような構造分析により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２
２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３
０６−３１２（１９９２））。ニューロカインαは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーの
メンバーであるので、ニューロカインαの生物学的活性を完全に除去するのではなく調節
するためには、好ましくは変異は、ＴＮＦ保存ドメインのアミノ酸をコードする配列（す
なわち、図１（配列番号２）の１９１〜２８４位）内に、より好ましくはＴＧＦファミリ
ーの全てのメンバーには保存されていないこの領域内の残基に作製される。このような保
存アミノ酸が、関連するＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカインα中に特
異的変異を作製することによって、ニュートロカインαは、アンタゴニストとして作用し
、これにより血管形成活性を保有する。従って、本発明のポリペプチドは、ニューロカイ
ンα変異体を含む。このようなニュートロカインα変異体は、図１（配列番号２）に示さ
れるニュートロカインαアミノ酸配列の全長または好ましくは細胞外ドメインからなる。
さらに、本発明の形成部はまた、上記のニュートロカインα変異体をコードする核酸配列
を含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０１１６】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、そして好ましくは実質的
に精製される。ニュートロカインαポリペプチドの組換え産生型は、ＳｍｉｔｈおよびＪ
ｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８）に記載されるような１工程
法によって実質的に精製され得る。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細
胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコ
ードされる完全なポリペプチド、このタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメイン
を引いた細胞外ドメイン、図１（配列番号２）の完全なポリペプチド、細胞内ドメインお
よび膜貫通ドメインを引いた図１（配列番号２）の細胞外ドメイン、ならびに上記のポリ
ペプチドに少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、およ
びさらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有
するポリペプチドを含む。
【０１１８】
発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドまたは図１（配列番号２）のポリペプチドに、少なくとも８０％同一、より好ましくは
少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、
９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミ
ノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの
部分を含む。
【０１１９】
２つのポリペプチドについての「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓ
ｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）および類似性を決定す
るための初期設定（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いて２つのポリペプチドのア
ミノ酸配列を比較することによって生じる類似性の値が意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔ
ｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを
、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
【０１２０】
ニュートロカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「
同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列がニュートロカイ
ンαポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を
含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図
される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失される
かもしくは別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列における５％までの総アミノ
酸残基の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照ア
ミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で
個々に、もしくは参照配列内で１つ以上の近接したグループ内のいずれかに分散される末
端位置の間のどこかで、起こり得る。
【０１２１】
実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示されるアミ
ノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に対して
、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどう
かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ
， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）の
ような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が
、例えば、本発明の参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百
分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の
総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される
。
【０１２２】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは
分子ふるいゲル濾過カラムにおいて分子量マーカーとして使用され得る。
【０１２３】
下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、下記のようにニュートロ
カインαタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用である、またはニュート
ロカインαタンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストと
して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。さ
らに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあ
るニュートロカインαタンパク質結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリ
ッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、Ｆｉｅｌｄｓお
よびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０１２４】
（エピトープ保有部分）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む、ペ
プチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明の
ポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タ
ンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義され
る。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義
され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よ
りも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０１２５】
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得
るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較
的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発
し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎ
ｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６」
を参照のこと。タンパク質−反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列
に頻繁に存在し、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタ
クトなタンパク質（すなわち、免疫原性エピトープ）の免疫ドミナント領域にも、アミノ
末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。本発明の抗原性エピトープ保有ペプチ
ドおよびポリペプチドは、それゆえ、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
３７：７６７−７７８ （１９８４）の７７７を参照のこと。
【０１２６】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチド
のアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも
９、そして最も好ましくは約１５〜約３０アミノ酸の配列を含む。ニュートロカイン特異
的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたペプチドの非限定的な例と
しては以下が挙げられる：図１（配列番号２）の約Ｐｈｅ１１５〜約Ｌｅｕ１４７のアミ
ノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｉｌｅ１５０〜約Ｔｙｒ１６
３のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｓｅｒ１７１〜約Ｐ
ｈｅ１９４のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｇｌｕ２２
３〜約Ｔｙｒ２４７のアミノ酸残基を含有するポリペプチド；図１（配列番号２）の約Ｓ
ｅｒ２７１〜約Ｌｅｕ２７８のアミノ酸残基を含有するポリペプチド。これらのポリペプ
チドフラグメントは、上記の図３に示されるようなＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数
の分析によってニュートロカインαタンパク質の抗原性エピトープを保有するように決定
された。
【０１２７】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の簡便な手段によって産
生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ．Ａ． （１９８５） Ｇｅｎｅｒａｌ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ
ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏｓ ａｃｉｄｓ． Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５； この「複数
ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８６）の米国特許
第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。
【０１２８】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方法によっ
て抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏ
ｎら、前出；Ｃｈｏｗ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性
エピトープ保有ペプチド（すなわち、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）は、タンパ
ク質全体が免疫原である場合、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅ
ｙｓｅｎら、上述。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３
９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの
位相幾何学的等価物すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化
合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓ
ｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガ
ンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出
または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐ
ｔｉｄｅ ＭｉｘｔｕｒｅｓにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． Ａ．ら（１９９６）の
米国特許第５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａ
ｌｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライブラリ
ー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アルキル化オリゴペプチ
ドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用す
る方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはま
た、これらの方法により日常的に作成され得る。
【０１２９】
（融合タンパク質）
当業者が理解するように、本発明のニュートロカインαポリペプチドならびに上記のそ
れらのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部
と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を促進し、そし
てインビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初
の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のド
メインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔ
ｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分
によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合お
よび中和において、モノマーニュートロカインαタンパク質またはタンパク質フラグメン
ト単独よりも有効であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１３０】
（免疫系関連障害の診断）
ニュートロカインαが種々の組織および特に好中球において発現されることを本発明者
らは発見した。多数の免疫系関連障害について、「標準的」ニューロカインα遺伝子発現
レベル（すなわち、免疫系障害を有さない個体由来の免疫系組織または体液におけるニュ
ートロカインα発現レベル）と比較して、実質的に変化（増大または減少）したレベルの
ニュートロカインα遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取された免疫系組
織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において検
出され得る。従って、本発明は、系障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、これは、
個体由来の免疫系組織または他の細胞または体液中のニュートロカインαタンパク質をコ
ードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定された遺伝子発現レベルと標準
ニュートロカインα遺伝子発現レベルとを比較することを含み、それによって標準と比較
した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が免疫系障害の指標となる。
【０１３１】
詳細には、免疫のガンを有する哺乳動物における特定の組織が、対応する「標準」レベ
ルと比較した場合、ニュートロカインαタンパク質、およびニュートロカインαタンパク
質をコードするｍＲＮＡの有意に増大または減少したレベルを発現すると考えられる。さ
らに、増強または抑制したレベルのニュートロカインαタンパク質が、ガンを有さない同
じ種の哺乳動物由来の血清と比較した場合、このようなガンを有する哺乳動物からの特定
の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）中に検出され得る。
【０１３２】
従って、本発明は免疫系障害（この系のガンを含む）の診断の間に有用な診断方法を提
供する。この方法は、個体由来の免疫系組織または他の細胞または体液中のニュートロカ
インαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定された遺
伝子発現レベルと標準ニュートロカインα遺伝子発現レベルとを比較することを含み、そ
れによって標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が免疫系障害の指標
となる。
【０１３３】
免疫系における障害の診断（腫瘍の診断を含む）が、従来の方法に従ってすでに行われ
た場合、本発明は、予後の指標として有用であり、それによって増強または抑圧されたニ
ュートロカインα遺伝子発現を示す患者は、標準レベルにより近いレベルでこの遺伝子を
発現する患者と比較してより悪い臨床結果を経験する。
【０１３４】
「ニュートロカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること
」により、第一の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベル
またはｍＲＮＡレベルを決定または評価することにより）または相対的（例えば、第二の
生物学的サンプルにおけるニュートロカインαタンパク質タンパク質レベルまたはｍＲＮ
Ａレベルと比較することにより）のいずれかで、ニュートロカインαタンパク質のレベル
またはニュートロカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの定性的測定もしくは
定量的測定または評価が意図される。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるニュ
ートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標
準ニュートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較される。標準は、障
害を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから得られるか、または免疫系の
障害を有さない個体の集団からの平均レベルにより決定され得る。当該分野において評価
されるように、一旦標準ニュートロカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが公
知になると、それは比較のための標準として繰り返して使用され得る。
【０１３５】
「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはニュートロ
カインαタンパク質もしくはｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サン
プルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、ニュートロカインαタンパク
質の遊離した細胞外ドメインを含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）
、免疫系組織、および完全なまたは遊離したニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメ
インあるいはニュートロカインαレセプターを発現することが見出された他の組織供給源
を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生
物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０１３６】
本発明は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障害の診断または処
置に有用である。このような障害としては、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび
他の寄生体による感染、免疫不全症、炎症性疾患、リンパ節腫脹、自己免疫疾患、および
対宿主性移植片疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
全細胞ＲＮＡが、任意の適切な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃ
ｈｉ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９ （１９８７）に記載
されている一工程のグアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法）を使用
して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ニュートロカインαタンパク質をコー
ドするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノー
ザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポ
リメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と
組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０１３８】
生物学的サンプル中のニュートロカインαタンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づ
く技術を用いて起こり得る。例えば、組織におけるニュートロカインαタンパク質発現は
、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５ （１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６ （１９８７））。ニュー
トロカインαタンパク質遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体に基づく方法は、免
疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ））を含む。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野において公知であり、
そしてグルコースオキシダーゼ、および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（^１２５Ｉ、^１
２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、イオウ（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１
１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン）ならびにビオチンのような酵素、標識が挙げられる。
【０１３９】
個体から得られる生物学的サンプル中のニュートロカインαタンパク質レベルをアッセ
イすることに加えて、ニュートロカインαタンパク質はまた、画像解析によってインビボ
で検出され得る。ニュートロカインαタンパク質のインビボでの画像解析のための抗体標
識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが
挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが
、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位
元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連のハイブリ
ドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴
的な回転を有するものが挙げられる。
【０１４０】
放射性同位元素（例えば、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９ｍＴｃ）、放射性不透明体（ｒ
ａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切
な検出可能な画像解析部分で標識されている、ニュートロカインαタンパク質−特異的抗
体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験される哺乳動物中に（例えば、非
経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析シ
ステムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定され
ることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、
注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の^９９ｍＴｃである。次
いで、標識抗体または抗体フラグメントは、ニュートロカインαタンパク質を含む細胞の
位置にそれぞれ優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈ
ｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂ
ｅｌｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕ
ｍｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ 第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ．Ｗ． ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ． Ｒｈｏ
ｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２））に記載され
ている。
【０１４１】
（抗体）
本発明での使用のためのニュートロカインαタンパク質特異的抗体は、完全なニュート
ロカインαタンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得る
。これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質と共に、またはそれが充分に長い（少
なくとも約２５アミノ酸）場合はキャリアを伴わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマ
ウス）に対して提示され得る。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（
Ｍａｂ）は、ニュートロカインαタンパク質に特異的に結合し得る完全な分子および抗体
フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントのような）を含むこと
を意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメント
を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結
合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４：３１６−３
２５ （１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１４３】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ニュートロカイン
αタンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含
む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、ニュートロ
カインαタンパク質の調製物は、それが天然の混入物を実質的に含まないように、上記の
ように調製され、そして精製される。次いで、このような調製物は、より大きな特異的活
性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０１４４】
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（あるいはそのニュー
トロカインαタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）；
Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１ （１９７６）；Ｋｏ
ｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２ （１９７６）；Ｈａｍｍ
ｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１） ｐｐ５６
３−６８１）を用いて調製され得る。一般に、このような手順は、ニュートロカインαタ
ンパク質抗原、またはより好ましくはニュートロカインαタンパク質発現細胞で動物（好
ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗ニュートロカインαタ
ンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の
適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活化
した）を補充し、約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、
および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地
中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切
な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得
る；しかし、アメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒ
ｙｌａｎｄから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ましい。融合
後、得られたハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓ
ら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））に記載
されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような選択によっ
て得られたハイブリドーマ細胞は、ニュートロカインαタンパク質抗原に結合し得る抗体
を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０１４５】
あるいは、ニュートロカインαタンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディ
オタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体はそれ
自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可
能である。この方法に従って、ニュートロカインαタンパク質特異的抗体は、動物（好ま
しくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイ
ブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、ニュートロカ
インαタンパク質−特異的抗体に結合する能力が、それぞれニュートロカインαタンパク
質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニン
グされる。このような抗体は、ニュートロカインαタンパク質−特異的抗体に対する抗イ
ディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるニュートロカインαタンパク質−特異的抗体の
形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１４６】
本発明の抗体のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントおよび他のフラ
グメントが、本明細書中に開示される方法に従って用いられ得ることが認識される。この
ようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）ま
たはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生成するため）のような酵素を用いるタン
パク質分解切断により生成される。あるいは、ニュートロカインαタンパク質結合フラグ
メントは、組換えＤＮＡ技術の適用を通して、または合成化学を通して生成され得る。
【０１４７】
ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、増強されたレベルの
ニュートロカインαタンパク質を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を
使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成
するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成する
ための方法は、当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２９：１２０２ （１９８５）； Ｏｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
４：２１４ （１９８６）； Ｃａｂｉｌｌｙら， 米国特許第４，８１６，５６７号；
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら， ＥＰ １７１４９６； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， ＥＰ １７
３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， ＷＯ ８６０１５３３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，
ＷＯ ８７０２６７１； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３
（１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８ （１９８５
）を参照のこと。
【０１４８】
（免疫系関連障害の処置）
上記のように、ニュートロカインαポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ニュート
ロカインα活性の異常に高いまたは低い発現に関与する状態の診断に有用である。ニュー
トロカインαが発現される細胞および組織、ならびにニュートロカインαによって調整さ
れる活性が与えられると、標準または「正常」レベルと比較して個体における実質的に変
化（増大または減少）したレベルのニュートロカインαの発現は、ニュートロカインαが
発現され、そして／または活性である身体系に関連する病理状態を生じる。
【０１４９】
本発明のニュートロカインαタンパク質はＴＮＦファミリーのメンバーであるので、タ
ンパク質の細胞外ドメインが、タンパク質分解切断によってニュートロカインαを発現す
る細胞から可溶性形態で放出され得、それゆえ、ニュートロカインαタンパク質（特に可
溶性形態の細胞外ドメイン）が、個体の細胞、組織または身体に外来性供給源から添加さ
れる場合、このタンパク質は、その個体の任意の標的細胞においてその調整活性を発揮す
ることもまた当業者に理解される。さらに、このＩＩ型膜貫通タンパク質を発現する細胞
は、個体の細胞、組織または身体に添加され得、それによって、添加された細胞はニュー
トロカインαのレセプターを発現する細胞に結合し、それによってニュートロカインαを
発現する細胞は、レセプター保有標的細胞において作用（例えば、細胞傷害性）を引き起
こし得る。
【０１５０】
それゆえ、個体におけるニュートロカインα活性の標準または正常なレベルにおける減
少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニュートロカインαタンパク
質（可溶性細胞外ドメインの形態または完全なタンパク質を発現する細胞）の投与によっ
て処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニュートロカインαのレベル
の増大を必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法は、このような個体における
ニュートロカインα活性レベルを増大するのに効果的な量の本発明の単離されたニュート
ロカインαポリペプチドを含有する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を含む。
【０１５１】
ニュートロカインαは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するので、血管形成をも調整す
るはずである。さらに、ニュートロカインαは、免疫細胞機能を阻害するので、広範な範
囲の抗炎症活性を有する。ニュートロカインαは、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害Ｔ細
胞およびマクロファージ）の浸潤および活性化を刺激し、そして腫瘍の血管形成を阻害す
ることによって固相腫瘍を処置するための抗新血管新生因子として使用され得る。血管増
殖が望まれない他の非ガン徴候を当業者は認識している。それらはまた、耐性の慢性およ
び急性感染（例えば、殺菌白血球の誘引および活性化を介するミコバクテリア感染）に対
して宿主防御を増大するために使用され得る。ニュートロカインαはまた、Ｔ細胞媒介性
自己免疫疾患およびリンパ性白血病の処置のために、ＩＬ−２生合成の阻害によりＴ細胞
増殖を阻害するために使用され得る。ニュートロカインαはまた、細片除去および結合組
織促進炎症細胞の漸加の両方を介して、創傷治癒を刺激するために使用され得る。この同
じ様式で、ニュートロカインαはまた、他の線維性障害（肝硬変、骨関節炎、および肺線
維症を含む）を処置するのに使用され得る。ニュートロカインαはまた、住血吸虫症、旋
毛虫病、回虫症にような場合に、組織に侵入する寄生体の幼生を死滅させる特有の機能を
有する好酸球の存在を増大させる。例えば、化学療法の後に骨髄から成熟白血球を放出す
るために（すなわち、幹細胞動員において）、種々の造血前駆細胞の活性化および分化を
調節することによって、造血を調節するために使用され得る。ニュートロカインαはまた
、敗血症を処置するために使用され得る。
【０１５２】
（処方物）
ニュートロカインαポリペプチド組成物（特に、可溶性形態の細胞外ドメインであるポ
リペプチドを含む）は、個々の患者の臨床状態（特にニュートロカインαポリペプチド単
独での処置の副作用）、ニュートロカインαポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、
投与スケジュール、および実施者に公知の他の要素を考慮して、良好な医療行為と一致し
た様式で処方および投薬される。従って、本明細書中の目的のためのニュートロカインα
ポリペプチドの「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０１５３】
一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるニュートロカインαポリペプチド
の総薬学的有効量は、患者の体重あたり、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範
囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、この用
量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトについてホルモン
で、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、ニュートロカイン
αポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量
速度で、１日あたり１〜４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入
のいずれかにより投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。変化を観察するた
めに必要とされる処置の長さ、および処置後に応答が起きるまでの間隔は、所望される効
果に従って変化するようである。
【０１５４】
本発明のニュートロカインαポリペプチドを含む薬学的組成物は、経口、直腸、非経口
、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、点眼薬
、または経皮パッチによるような）、頬に、または経口もしくは鼻腔内スプレーとして投
与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の型の非毒性の固体、半固体、
または液体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、または処方助剤を意味する。本明細書中
で用いられる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮下、および関節内
の注射および注入を含む投与態様をいう。
【０１５５】
ニュートロカインαポリペプチドはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放
出組成物の適切な例は、造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半
透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許
第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−
グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ．ら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２
２：５４７−５５６ （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（
Ｒ． Ｌａｎｇｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７
−２７７ （１９８１）およびＲ． Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：
９８−１０５ （１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒら，
同書）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む
。持続放出ニュートロカインαポリペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたニュ
ートロカインαポリペプチドを含む。ニュートロカインαポリペプチドを含むリポソーム
は、それ自体が公知の方法により調製される（ＤＥ ３，２１８，１２１； Ｅｐｓｔｅ
ｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８２：３６８
８−３６９２ （１９８５）； Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ７７：４０３０−４０３４ （１９８０）； ＥＰ ５２，３
２２； ＥＰ ３６，６７６； ＥＰ ８８，０４６； ＥＰ １４３，９４９； ＥＰ
１４２， ６４１； 日本国特許出願第８３−１１８００８号； 米国特許第４，４８
５，０４５号および同第４，５４４，５４５号； ならびにＥＰ １０２，３２４）。通
常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものであり、
ここで脂肪含量は約３０ｍｏｌ．％コレステロールより高く、選択される比率は、最適な
ニュートロカインαポリペプチド治療のために調整される。
【０１５６】
非経口投与のために、１つの実施態様では、ニュートロカインαポリペプチドは、一般
的に、所望の程度の純度で単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）
のこのポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、用いられる投薬量およ
び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、処方物の他の成分と適合性であるキャリア
）と混合することにより処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポ
リペプチドに対して有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１５７】
一般的に、処方物は、ニュートロカインαポリペプチドを、液体キャリアまたは微細に
分割された固体キャリアまたはその両方と均一にかつ直接接触させることにより調製され
る。次いで、必要に応じて、産物は、所望の処方物に成形される。好ましくは、キャリア
は、非経口キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。この
ようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース
溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルはまた、ならびにリ
ポソームは、本明細書中で有用である。
【０１５８】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加剤を適切
に含む。このような物質は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性
であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩
のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペ
プチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、ま
たは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー
；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セル
ロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたは
ソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ならびに／あるいは
ポリソルベート、ポロオキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧのような非イオン
性界面活性剤を含む。
【０１５９】
ニュートロカインαポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクルに、約０．１ｍｇ
／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで
処方される。上述の賦形剤、キャリア、または安定化剤の特定のものの使用が、ニュート
ロカインαポリペプチド塩の処方をもたらすことが理解される。
【０１６０】
治療的投与のために用いられるニュートロカインαポリペプチドは、無菌でなければな
らない。無菌は、無菌の濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通して
の濾過により容易に達成される。治療的ニュートロカインαポリペプチド組成物は、一般
的に、無菌の出入り口を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が貫通
し得るストッパーを有するバイアル）に入れられる。
【０１６１】
ニュートロカインαポリペプチドは、通常、単位用量のまたは多回用量の容器（例えば
、シールされたアンプルまたはバイアル）において、水溶液または再構成のための凍結乾
燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の１例として、１０ｍｌバイアルが、無菌濾
過された１％（ｗ／ｖ）水性ニュートロカインαポリペプチド溶液５ｍｌで満たされ、そ
して得られた混合物は凍結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥されたニュートロカインα
ポリペプチドを、静菌性の注射用蒸留水を用いて再構成することにより調製される。
【０１６２】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む、薬学的パックおよびキットを提供する。このような容器に、薬品または生物学的製
品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方された形態での注意書であっ
て、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または販売の機関による認可を反映する注
意書が付随し得る。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と組み合わせて用
いられ得る。
【０１６３】
（アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子）
本発明はまた、細胞におけるニュートロカインαの作用（例えば、レセプター分子のよ
うなニュートロカインα結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を同定
するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、ニュートロカイ
ンαの天然の生物学的機能を増大するか、またはニュートロカインと類似した様式で機能
する化合物であり、一方、アンタゴニストは、そのような機能を減少または除去する。
【０１６４】
この実施態様の別の局面では、本発明は、ニュートロカインαポリペプチドに特異的に
結合するレセプタータンパク質またはリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提
供する。例えば、細胞区画（例えば、膜またはその調製物）は、ニュートロカインαに結
合する分子を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、標識されたニュートロカイ
ンαとともにインキュベートされ、そしてこのレセプターまたは他の結合タンパク質に結
合したニュートロカインαの複合体が、当該分野において公知の日常的な方法に従って単
離され、そして特徴付けられる。あるいは、ニュートロカインαポリペプチドは、細胞か
ら可溶化された結合分子がカラムに結合し、次いで日常的な方法に従って溶出され、そし
て特徴付けられるように固相支持体に結合され得る。
【０１６５】
アゴニストまたはアンタゴニストに関する本発明のアッセイにおいて、細胞区画（例え
ば、膜またはその調製物）は、ニュートロカインαに結合する分子（例えば、ニュートロ
カインαによって調整されるシグナル伝達または調節経路の分子）を発現する細胞から調
製され得る。この調製物は、ニュートロカインαアゴニストまたはアンタゴニストであり
得る候補分子の非存在下または存在下で、標識されたニュートロカインαとともにインキ
ュベートされる。結合分子に結合する候補分子の能力は、標識されたリガンドの減少した
結合において反映される。理由なく（すなわち、ニュートロカインα結合分子を結合する
ことに対するニュートロカインαの効果を誘導することなく）結合する分子は、ほとんど
良好なアンタゴニストである。十分に結合し、そしてニュートロカインαと同一か、また
は密接に関連した効果を誘発する分子は、アゴニストである。
【０１６６】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのニュートロカインα様効果は、例えば、候
補分子の、細胞または適切な細胞調製物との相互作用後の第２のメッセンジャー系の活性
を決定すること、そしてその効果を、ニュートロカインα、またはニュートロカインαと
同じ効果を誘発する分子の効果と比較することによって測定され得る。この点において有
用であり得る第２のメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネ
ル、またはホスホイノシチド加水分解第２メッセンジャー系を含むが、これらに限定され
ない。
【０１６７】
ニュートロカインαアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合阻害アッセイ
に適切な条件下で、ニュートロカインαと、膜結合レセプター分子または組換えニュート
ロカインαレセプター分子を有する潜在的なアンタゴニストと組み合わせる、競合アッセ
イである。ニュートロカインαは、レセプター分子に結合するニュートロカインα分子の
数が、潜在的なアンタゴニストの効果を評価するために正確に決定され得るように、例え
ば放射能によって標識され得る。
【０１６８】
潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれによってその
活性を阻害または失活させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を含む。
潜在的なアンタゴニストはまた、ニュートロカインα誘導活性を誘導することなしに結合
分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に結合し、それによりニュートロカインα
が結合するのを妨げることによってニュートロカインαの作用を妨げる、密接に関連した
タンパク質または抗体のような、小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであり得る。
【０１６９】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術を使用し
て、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して、または三重らせん形成を介して遺伝子
発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えばＯｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ． ５６：５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）において
議論されている。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１：１３６０ （１９９１）において議論されている。本方法は、ポリヌクレオチドの、
相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明のポリペプチドの細胞外
ドメインをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長のア
ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドは、転写に関連する遺伝子領域に相補的であるように設計され、それによってニ
ュートロカインαの転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは
、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の、ニュートロカインα
ポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達さ
れ得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、インビボで発現され、ニュートロカ
インαの産生を阻害し得る。
【０１７０】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば上記のような薬学的に受容可能なキャリア
を有する組成物において使用され得る。
【０１７１】
アンタゴニストは、例えば、マクロファージおよびそれらの前駆体、ならびに好中球、
好塩基球、Ｂリンパ球、およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、特定の自己免疫疾
患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、活性化ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞および
ナチュラルキラー細胞）のニュートロカインα走化性および活性を阻害するために使用さ
れ得る。自己免疫疾患の例は、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病を含む。アン
タゴニストはまた、単球食細胞の補充および活性化を妨げることによって、感染性疾患（
珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む）を処置するために使用され得る。そ
れらはまた、好酸球産生および移動を妨げることによって、好酸球増多症候群を処置する
ために使用され得る。内毒素ショックもまた、マクロファージの移動および本発明のヒト
ケモカインポリペプチドの産生を妨げることによって、アンタゴニストによって処置され
得る。アンタゴニストはまた、動脈壁における単球浸潤を妨げることによってアテローム
性硬化症を処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導肥満細
胞および好酸球脱顆粒およびヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介
アレルギー反応および免疫学的障害（後期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピ
ー性皮膚炎を含む）を処置するために使用され得る。ＩｇＥ媒介アレルギー反応（例えば
、アレルギー性ぜん息、鼻炎、および湿疹）もまた、処置され得る。アンタゴニストはま
た、単球の創傷領域への誘引を妨げることによって慢性および急性の炎症を処置するため
に使用され得る。それらはまた、正常な肺性マクロファージ集団を制御するために使用さ
れ得る。なぜなら、慢性および急性の炎症性肺疾患は、肺における単核食細胞の壊死巣分
離と関連するからである。アンタゴニストはまた、単球の、患者の関節中の関節液への誘
引を妨げることによって慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球流入およ
び活性化は、変性および炎症性の両方の関節症の病原において有意な役割を果たす。アン
タゴニストは、ＩＬ−１およびＴＮＦ（これらは、他の炎症性サイトカインの生合成を妨
げる）に主に起因する有害なカスケードを妨げるために使用され得る。この様にして、ア
ンタゴニストは炎症を妨げるために使用され得る。アンタゴニストはまた、ケモカインに
よって誘導されるプロスタグランジン依存性熱を阻害するために使用され得る。アンタゴ
ニストはまた、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群）の症例を
処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸球蓄積を妨げるこ
とによってぜん息およびアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはま
た、ぜん息肺の顕著な特徴である、上皮下基底膜線維症を処置するために使用され得る。
【０１７２】
ニュートロカインαに対する抗体は、傷害後の肺への好中球の浸潤を妨げることによっ
て、ニュートロカインαに結合し、そしてニュートロカインα活性を阻害し、ＡＲＤＳを
処置するために使用され得る。アンタゴニストは、例えば本明細書中下記のような薬学的
に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。
【０１７３】
（染色体アッセイ）
本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染色体上の
特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現
在、染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、実際の配列データ（反復多型
）に基づいた染色体標識化試薬はほとんどが、染色体位置の標識に利用可能でない。本発
明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相
関付けにおいて重要な第１工程である。
【０１７４】
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるｃＤＮＡは
、ニュートロカインαタンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために使用さ
れる。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達
成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、この目的のための周知の技術を使用してインサイ
チュ染色体マッピングのために使用される。
【０１７５】
さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましく
は１５〜２５ｂｐ）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非翻訳
領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソンにまたがらず、従っ
て増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、こ
れらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニン
グに使用される。ｃＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイ
ブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１つの工程において正確な染色体位置を提供す
るために使用され得る。この技術は、５０または６０ｂｐほど短いｃＤＮＡ由来のプロー
ブとともに使用され得る。本技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
【０１７６】
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺
伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ
， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐ
ｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙから
オンラインで入手可能である）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップさ
れた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によ
り同定される。
【０１７７】
次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における相違を決
定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常
な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。
【０１７８】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示のために提供され、そして限定する
ことを意図しない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。
【実施例】
【０１７９】
（実施例１ａ：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ニュートロカインαの発現およ
び精製）
細菌発現ベクターｐＱＥ９ （ｐＤ１０）を、本実施例における細菌発現のために使用
する。（ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． 前出）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性
（「Ａｍｐｒ」）をコードし、細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導プロモータ
ー、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出によって
販売されるニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を用い
てアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適
切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードする
挿入ＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６つのＨｉ
ｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように整列さ
れる。
【０１８０】
細胞外ドメイン配列を含むニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤ
ＮＡ配列は、ニュートロカインαタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列に、およびｃ
ＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅される。ｐＱＥ
９ベクターにおけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、
それぞれ５’および３’プライマー配列に付加される。
【０１８１】
タンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、配列５’
ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧ ３’（配列番号１０）を
有し、これは、下線を付したＢａｍＨ Ｉ制限部位、続いて図１におけるニュートロカイ
ンα配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１８ヌクレオチドを含む。当然のこ
とながら、当業者は、タンパク質コード配列中の５’プライマーが始まる点は、形態の細
胞外ドメインより短いかまたは長い完全なニュートロカインαタンパク質の任意の所望の
部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するように変更され得ることを理解する。３’
プライマーは、配列５’ ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴ
ＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１１）を有し、これは、下線を付したＨｉｎｄ ＩＩＩ制限
部位、続いて２つの終止コドン、および図１におけるニュートロカインαＤＮＡ配列のコ
ード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０１８２】
増幅されたニュートロカインαＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ９０をＢａｍ
Ｈ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡを一緒に連結する。ニュ
ートロカインαＤＮＡの制限されたｐＱＥ９０ベクターへの挿入は、ニュートロカインα
タンパク質のコード領域を、ＩＰＴＧ誘導プロモーターの下流に、そして開始ＡＵＧおよ
び６つのヒスチジンコドンにインフレームに配置する。
【０１８３】
連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントのＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換す
る。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されている。複数のコピーのプラスミドｐＲＥＰ４（こ
れは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（「Ｋａｎ^ｒ」）を付
与する）を含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書に記載の例示的な実施
例を行うにあたって使用する。この株（これは、ニュートロカインαタンパク質を発現す
るために適切である多くの株の内の唯一である）は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ． 前出か
ら市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレ
ート上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単
離し、そしてクローン化ＤＮＡの同定を制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定により
確認する。所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマ
イシン（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（「Ｏ／
Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約１：２５〜１：２５０の希釈で大規模培養に
接種する。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの吸光度（「ＯＤ６００」）に
まで増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ
」）を加えて１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、
ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間
引き続きインキュベートする。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により採集す
る。
【０１８４】
次いで、細胞を６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ ８中で３〜４時間、４℃で撹拌する。細
胞細片を、遠心分離によって除去し、そしてニュートロカインαを含有する上清をニッケ
ルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，
Ｉｎｃ．， 前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質を、
Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高親和性で結合させ、そして単回の１工程手順（詳細については、Ｔ
ｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ， １９９５， ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，
前出）で精製し得る。簡単には、上清を１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で
洗浄し、カラムをまず６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８中でロードし、次いで１０容量の６
ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、そして最後にニュートロカインαで６Ｍグアニジ
ンＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０１８５】
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ
Ｎａ−アセテート、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによ
って再生する。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定化する間に、首尾
良く再折り畳みし得る。推奨される条件は、以下の通りである：直線６Ｍ−１Ｍ尿素勾配
を使用して、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
、ｐＨ７．４（プロテアーゼインヒビターを含有する）中で再生する。再生は、１．５時
間以上の時間行われるべきである。再生した後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの
添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
６）緩衝液プラス２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最後の透析工程によって除去する。精
製されたタンパク質を４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０１８６】
（実施例１ｂ： ニュートロカインαのＥ． ｃｏｌｉ中での発現および精製）
細菌発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例において細菌発現について使用する。（ＱＩ
ＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ
， ＣＡ， ９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）
をコードし、そして複製の細菌起源（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボ
ソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．（前出）から市販されるニッ
ケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を用いるアフィニティー
精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一制限酵素
切断部位を含む。このようなエレメントは、ポリぺプチドをコードするＤＮＡフラグメン
トが、そのペプチドのカルボキシ末端に共有結合された６つのＨｉｓ残基（すなわち、「
６ Ｘ Ｈｉｓタグ」）を有するそのポリぺプチドを生成するような様式で挿入され得る
ように配置される。しかし、この実施例では、６つのＨｉｓコドンの翻訳が防止され、そ
れゆえポリぺプチドが６ Ｘ Ｈｉｓタグなしに産生されるように、ポリぺプチドコード
配列を挿入する。
【０１８７】
細胞外ドメイン配列を含むニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤ
ＮＡ配列を、寄託されているｃＤＮＡクローンから、ニュートロカインαタンパク質の所
望の部分のアミノ末端配列、およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の
配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ｐＱ
Ｅ６０ベクターへのクローニングを容易にするための制限部位を含有するさらなるヌクレ
オチドを、５’および３’配列のそれぞれに付加する。
【０１８８】
タンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマーは、下線を付
したＢｓｐＨ制限部位、続いて図１のニュートロカインα配列の細胞外ドメインのアミノ
末端コード配列の１７ヌクレオチドを含有する配列５’ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣ
ＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧ ３’（配列番号１２）を有する。当業者は、当然に、５’プラ
イマーが開始するタンパク質コード配列中の点が、その形態の細胞外ドメインよりも短い
か長い完全なタンパク質の所望の部分を増幅するように変化され得ることを理解する。３
’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて２つの終止コドン、およ
び図１のニュートロカインαＤＮＡ配列中のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレ
オチドを含有する配列５’ＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴ
ＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１３）を有する。
【０１８９】
増幅されたニュートロカインαＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０は、Ｂｓ
ｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、次いで消化されたＤＮＡは、一緒に連結される
。ニュートロカインαＤＮＡの、制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、その付随す
る終止コドンを含むニュートロカインαタンパク質コード領域を、ＩＰＴＧ誘導性プロモ
ーターから下流に、そして開始ＡＵＧとインフレームに配置する。付随する終止コドンは
、挿入点の下流の６つのヒスチジンコドンの翻訳を防止する。
【０１９０】
連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ
（１９８９）に記載されるような標準的な手順を使用して、コンピテントなＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞中に形質転換する。ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋ
ａｎｒ」）を付与する、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含有するＥ． ｃｏｌｉ
株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される例示的な実施例を行うために使用する。
この株（これは、ニュートロカインαタンパク質を発現するために適した多くのもののう
ちの唯一のものである）は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．（前出）から市販されている。形
質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖する能力
によって同定する。耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そしてクローンＤＮＡ
の同定を制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１９１】
所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマ
イシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補充したＬＢ培地中の液体培養物中で一晩（「Ｏ／Ｎ
」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、約１：２５〜１：２５０の希釈で大培養物を
接種する。細胞を、０．４と０．６の間の６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）ま
で培養させる。次いで、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」
）を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することによって、
ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。続いて、細胞をさらに３
〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって回収する。
【０１９２】
次いで、細胞を、６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ８）中で４℃で３〜４時間撹拌する。細
胞細片を、遠心分離によって除去し、そしてニュートロカインαを含有する上清を、２０
０ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６）に対して透析す
る。あるいは、タンパク質を、５００ｍＭ ＮａＣｌ， ２０％グリセロール、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ７．４（プロテアーゼインヒビターを含有する）に対して透
析することによって首尾良く再折り畳みし得る。再生した後、タンパク質をイオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフ
ィーによって精製し得る。あるいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフ
ィー工程を、純粋なニュートロカインαタンパク質を得るために使用し得る。精製された
タンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０１９３】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるニュートロカインαタンパク質のクロー
ニングおよび発現）
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ ＧＰを使用して、
その天然に付随する細胞内配列および膜貫通配列を欠失するタンパク質の細胞外ドメイン
をコードするクローン化したＤＮＡを、バキュロウイルスに挿入して、バキュロウイルス
リーダーおよびＳｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５ （１９８７）
に記載される標準的な方法を使用して、ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメイン
を発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多
角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウ
イルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）、およびＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような都合の良い制限部位を含有する。シミアンウイルス
４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化に使用する。組
換えウイルスの簡単な選択のために、プラスミドは、同じ方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポ
リヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する。挿入された遺伝子は、クローン
化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成するための、野生型ウイルスＤ
ＮＡでの細胞媒介性相同組換えのための、ウイルス配列が両側に隣接する。
【０１９４】
多くの他のバキュロウイルスベクターは、当業者が容易に理解するように、構築物が、
転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナル（必要であれば、シグナルペプ
チドおよびインフレームのＡＵＧを含む）を提供する限り、上記のベクター（例えば、ｐ
Ａｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）の代わりに使用され得る。このような
ベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９
８９）に記載される。
【０１９５】
寄託されたクローンのニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインをコードし、Ａ
ＵＧ開始コドン、ならびに図１（配列番号２）に示される天然に付随する細胞内ドメイン
配列および膜貫通ドメイン配列を欠くｃＤＮＡ配列を、遺伝子の５’および３’配列に対
応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマーは、下
線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１に示すニュートロカインαタンパク質の
細胞外ドメインの配列の１８ヌクレオチド（タンパク質の細胞外ドメインの示された末端
で始まる）を含有する配列５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧ
ＧＧＣ ３’（配列番号１４）を有する。３’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制
限部位、続いて２つの終結コドン、および図１の３’コード配列に相補的なの１８ヌクレ
オチドを含有する配列５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡ
ＴＧＣＡＣＣ ３’（配列番号１５）を有する。
【０１９６】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」， ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離
する。次いで、フラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そして再び１％アガロースゲル上で
精製する。このフラグメントを本明細書中でＦ１と命名する。
【０１９７】
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、そして必要に応じて、ウシ腸ホスファター
ゼを使用して、当該分野で公知の日常的な手順を使用して、脱リン酸化し得る。次いで、
ＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ
Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮ
Ａを、本明細書中で「Ｖ１」と命名する。
【０１９８】
フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと一緒に
連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主（例えば、ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ， ＣＡ）細胞）を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に拡大した
。個々のコロニーからのＤＮＡを、ＢａｍＨＩを使用して消化し、次いでゲル電気泳動に
よって消化産物を分析することによって、ヒトニュートロカインα遺伝子を有するプラス
ミドを含有する細菌を同定する。クローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定に
よって確認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＡ２ＧＰニュートロカインαと命名
する。
【０１９９】
５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７ （１９８
７）によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュ
ロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）とともに同時トランスフェ
クトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミド
ｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタ
イタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９
０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。
次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍ
ｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴
下する。次いで、プレートを、５時間２７℃でインキュベートする。次いで、トランスフ
ェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグ
レース昆虫培地を添加する。次いで、２７℃で４日間培養を続ける。
【０２００】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載される
ようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するｇａｌ発現クローン
の容易な同定および単離を可能にするために、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲル
を用いる。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養
およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
適切なインキュベーションの後、青く染色されたプラークをマイクロピペッター（エッペ
ンドルフ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレー
ス培地を含むマイクロ遠心チューブ中に再懸濁し、そして組換えバキュロウイルスを含有
する懸濁物を使用して、３５ｍｍのディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させる。４日
後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。この組換
えウイルスを、Ｖ−ニュートロカインαと呼ぶ。
【０２０１】
ニュートロカインα遺伝子の発現を評価するために、１０％熱不活化ＦＢＳを補充した
Ｓｆ９細胞をグレース培地中で増殖させる。細胞を、組み換えバキュロウイルスＶ−ニュ
ートロカインαで、約２の感染の多重度（「ＭＯＩ」）で感染させる。放射標識されたタ
ンパク質が所望の場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイ
ンを含まないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可能）で置き換える。４２時間後に、５μＣｉの^３
５Ｓメチオニンおよび５μＣｉの^３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を
添加する。細胞を１６時間さらにインキュベートし、次いで遠心分離によって回収する。
上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてオート
ラジオグラフィー（放射標識されている場合）により分析する。
【０２０２】
精製されたタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列のミクロシークエンシングは、タン
パク質の細胞外ドメインのアミノ末端配列、従って分泌シグナルペプチドの切断点および
長さを決定するために使用され得る。
【０２０３】
（実施例３：哺乳動物細胞中でのニュートロカインαのクローニングおよび発現）
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写の開始を
媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化
に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列
、およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位が隣接する介在配
列が挙げられる。非常に有効な転写を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レ
トロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、
ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで達成し得る。しかし、細
胞性エレメントもまた使用され得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実
施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３
７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（Ａ
ＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞とし
ては、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３および
Ｃ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞
、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０２０４】
あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株において発
現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシ
ン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を
可能にする。
【０２０５】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパク質を発
現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝子の数百また
は数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別の有用な選択
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用し
て、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択
する。これらの細胞株は染色体に取り込まれる増幅遺伝子（単数または複数）を含む。チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしば
しば使用される。
【０２０６】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴ
Ｒ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， ４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント
（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のク
ローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８
）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットのプレプロ
インシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化、および終結シグナルを含む。
【０２０７】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドｐニュートロカインα ＨＡを、ニュートロカインαタンパク質の細胞
外ドメインをコードする寄託されたｃＤＮＡの部分を、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．から入手し得る）内へク
ローニングすることによって作製する。ポリぺプチドの可溶性の、分泌された形態を生成
するために、細胞外ドメインをヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リーダー配列に融合する。
【０２０８】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細
胞における増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の
選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４
０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）血
液凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易にする、「ＨＡ」タグ）をコードするいく
つかのコドン、続いて終結コドンおよび配列されたポリアデニル化シグナルを含み、その
結果ｃＤＮＡは、都合良くＣＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカ
ーにおける制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可
能に連結し得る。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７ （１９８４）
によって記載されたインフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応す
る。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合体は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用い
て組み換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩは、さら
に、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０２０９】
ニュートロカインαポリぺプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを
、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって導かれるように、ベクターのポリ
リンカー領域へクローン化する。プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。寄託
されたクローンのニュートロカインα ｃＤＮＡを、上記のＥ．ｃｏｌｉにおけるニュー
トロカインαの発現のためのベクターの構築についてと同様に、都合の良い制限部位を含
むプライマーを用いて増幅する。本実施例において使用される適切なプライマーは、以下
を含む。下線のＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝
子からの分泌リーダーペプチドをコードする配列、およびニュートロカインαタンパク質
の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下の
配列を有する： ５’ ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣ
ＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧ
ＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡ
ＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣ ３’ （配列番号１６）。下線のＢａｍＨ
Ｉ制限部位、終止コドンの直前の３’コード配列に相補的なヌクレオチドの１８を含む３
’プライマーは以下の配列を有する：５’ ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴ
ＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’ （配列番号１７）。
【０２１０】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩで
消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥへ形質転換し（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒ
ｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７から入手可能
）、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニーの増
殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミドＤＮＡを耐
性コロニーから単離し、ニュートロカインα細胞外ドメインをコードするフラグメントの
存在について制限分析または他の手段によって試験する。
【０２１１】
組換えニュートロカインαの発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載のＤＥＡＥ−ＤＥＸＴ
ＲＡＮを用いて、上記のように発現ベクターで形質転換する。細胞をベクターによるニュ
ートロカインαの発現のための条件下でインキュベートする。
【０２１２】
ニュートロカインα−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら， Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて放射標識
化および免疫沈降法によって検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの
２日後に、細胞を、^３５Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることに
よって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら
（上記に引用された）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩ
Ｓ、ｐＨ ７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細
胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物が細
胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては観察されない。
【０２１３】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
ベクターｐＣ４を、ニュートロカインαタンパク質の発現のために使用する。プラスミ
ドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体で
ある。ニュートロカインαポリぺプチドの可溶性の、分泌された形態を生成するために、
細胞外ドメインをコードする寄託されたｃＤＮＡの部分を、ヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リ
ーダー配列に融合する。このベクタープラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下
で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドで形質転換されるチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞または他のジヒドロ葉酸活性を欠如する細胞は、化学治療剤メトトレキ
サートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性で
ある細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ， Ｆ
．Ｗ．， Ｋｅｌｌｅｍｓ， Ｒ．Ｍ．， Ｂｅｒｔｉｎｏ， Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉ
ｍｋｅ， Ｒ．Ｔ．， １９７８， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：１３５７−
１３７０、Ｈａｍｌｉｎ， Ｊ．Ｌ．およびＭａ， Ｃ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３（１９９０）、Ｐａｇｅ，
Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ， Ｍ．Ａ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６
４−６８（１９９１）を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨ
ＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への
耐性を生じる。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、
そして過剰発現される。このアプローチは、増幅遺伝子（単数または複数）の１，０００
を越えるコピーを有する細胞株を開発するために使用され得ることは、当該分野で公知で
ある。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、細胞株は、宿主細胞の染色体（単
数または複数）に取り込まれる増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０２１４】
プラスミドｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８５年３月： ４３８−４４７）の長
末端反復（ＬＴＲ）の目的の強力なプロモーターの遺伝子、およびヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））の
最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントの遺伝子の発現を含む。プロモ
ーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする以下の単一制限酵素切断部位である：Ｂ
ａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミ
ドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を
含む。他の高効率プロモーターもまた、発現（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、Ｓ
Ｖ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよ
びＨＴＬＶＩ）からの長末端反復のために使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−Ｏｆ
ｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならびに類似の系を使用して、哺乳動物細胞中で調節
された方法でニュートロカインαを発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．およびＢｕｊａｒ
ｄ， Ｈ． １９９２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：
５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒ
ト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使用し得る。染色体に挿入された目
的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、ま
たはハイグロマイシン）での同時トランスフェクションに基づいて選択し得る。開始にお
いて２つ以上の選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用するこ
とが有用である。
【０２１５】
プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ついでウシ小腸ホスファターゼを用
いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロ
ースゲルから単離する。
【０２１６】
ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列（リーダー配
列を含む）を、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅する。下線を付したＢａｍＨＩ部位、続いてＫｏｚａｋ配列、ＡＵＧ開
始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダーペプチドをコードする配列、およびニ
ュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８ヌクレオチドを含
む５’プライマーは、以下の配列を含む： ５’ ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴ
ＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣ
ＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＧ
ＣＣＣＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣ ３’ （配列番
号１６） 。下線を付したＢａｍＨＩ、および終結コドンの直前の３’コード配列に相補
的なヌクレオチドの１８を含む３’プライマーは、以下の配列を含む： ５’ ＧＴＧＧ
ＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＣ ３’ （配列番号１７）。
【０２１７】
増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１％アガロ
ースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをＴ
４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１
Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４
に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０２１８】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェク
ションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン（Ｆｅｌｇ
ｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ−ｎｅｏとともに同時トラン
スフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群
の抗生物質への耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞
を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をト
リプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートと１ｍｇ
／ｍｌ Ｇ４１８で補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート
（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日の後、単一のクロー
ンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、
２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラ
スコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高
濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）含む新たな６
ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローンが１００〜２００μＭの濃度で増殖するク
ローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびウエスタンブロット分析によってか、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２１９】
（実施例４：ニュートロカインα ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用される）に
よって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるニュートロカインα遺伝子の発現を試
験した。ニュートロカインαタンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブ
（配列番号１）を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^ＴＭＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の説明書に従って、^３２Ｐで標識した。標識後、
プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^ＴＭカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１
に従って、精製した。次いで、精製した標識化プローブを使用して、ニュートロカインα
ｍＲＮＡについて、種々のヒト組織を試験した。
【０２２０】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多組織ノーザン（ＭＴＮ）
ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^ＴＭ ハイブリダ
イゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１１９
０−１に従って、標識化プローブで試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続い
て、ブロットを取り付け、そして−７０℃にて一晩フィルムに暴露し、そして標準的な手
順に従ってフィルムを現像した。
【０２２１】
本発明が、上記説明および実施例に特に記載したものとは別のやり方で実施され得るこ
とは明らかである。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示に照らして可能であり
、それゆえ添付の請求の範囲内にある。
【０２２２】
本明細書中で引用された全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌文献、研究室マニュアル
、本、または他の文献を含む）の開示が、本明細書中に参考として援用される。
【０２２３】
（配列表）
【０２２４】
【化２】

【０２２５】

【０２２６】

【０２２７】

【０２２８】

【０２２９】

【０２３０】

【０２３１】

【０２３２】

【０２３３】

【０２３４】

【０２３５】

【０２３６】

【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】図１は、ニュートロカインαタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は膜貫通ドメイン（下線を引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２８５は細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。
【図２】図２は、「Ｍｅｇａｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡＳｔａｒ」と呼ばれるコンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカインαタンパク質およびＴＮＦ−α（配列番号３）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）（配列番号４）、およびＦＡＳリガンド（配列番号５）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。
【図３】図３は、ニュートロカインαアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原指数および表面確率を示す。「抗原指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフは、ニュートロカインαタンパク質の高度に抗原性の領域の位置、すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、１９９６年１０月２２日のＡＴＣＣ寄託において寄託されたヒトｃＤＮＡから決定されたニュートロカインαヌクレオチド配列の、本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローン（これらは、ＨＳＯＡＤ５５Ｒ（配列番号７）、ＨＳＬＡＨ８４Ｒ（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８Ｒ（配列番号９）と命名された）とのアラインメントを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（ａ）図２〜４における完全なアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【公開番号】特開２００７−２２２１７４（Ｐ２００７−２２２１７４Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８９９５４（Ｐ２００７−８９９５４）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【分割の表示】特願平１０−５２０４１１の分割
【原出願日】平成８年１０月２５日（１９９６．１０．２５）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９４１０　Ｋｅｙ　Ｗｅｓｔ　Ａｖｅｎｕｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５０，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】