ニワトリキメラ抗体およびその利用
【課題】 分子量の小さい２価のニワトリ型モノクローナル抗体と、その代表的な利用技術とを提供する。
【解決手段】 本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、ニワトリ抗体のヒンジ領域に相当する領域の代わりに哺乳動物、好ましくはヒト由来のヒンジ領域を付加している。これにより、分子量の小さい２価の抗体を得ることができるとともに、当該２価抗体を大腸菌等の原核生物で発現させることが可能となる。さらに、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているため、抗体のフレキシビリティをより一層向上させることが可能となる。
【解決手段】 本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、ニワトリ抗体のヒンジ領域に相当する領域の代わりに哺乳動物、好ましくはヒト由来のヒンジ領域を付加している。これにより、分子量の小さい２価の抗体を得ることができるとともに、当該２価抗体を大腸菌等の原核生物で発現させることが可能となる。さらに、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているため、抗体のフレキシビリティをより一層向上させることが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくともニワトリ由来の可変領域を有するニワトリキメラ抗体とその代表的な利用に関するものであり、特に、２価を実現することが可能であり、一般的なニワトリ抗体と比べて抗原認識のフレキシビリティに優れ、より実用性を有するニワトリキメラ抗体と、その生産方法等の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、抗原の特定部分のみを認識する単一抗体であり、ポリクローナル抗体（抗血清）と比較して、抗原特異性が均一で抗体の力価が高いといった利点を有する。それゆえ、モノクローナル抗体は、バイオサイエンスの研究全般において広く汎用される研究試薬として重要であるが、近年では、研究開発レベルから、例えばヒトの各種疾患の診断薬や治療薬等のような実用化レベルにまでその技術が進歩している。
【０００３】
上記モノクローナル抗体の中でも、近年、本発明者らにより提案されているニワトリ型のものが注目されている。ニワトリ（Gallus gallus）を含む鳥類は、系統発生学的に哺乳動物より下等であるものの、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を有している。特に、ニワトリは食用家畜として古くから飼育されており、特に、鶏卵は、食用ではなくタンパク質という素材を生産するという観点から見れば、高い生産性を有する原料として用いることができる。それゆえ、ニワトリは、免疫動物としての信頼性を有し、かつ、抗体生産の効率性も有しているため、免疫動物として好適に用いることができる。
【０００４】
ニワトリを免疫動物としてニワトリ型モノクローナル抗体を生産する技術としては、まず、ニワトリハイブリドーマを用いた方法が本発明者らのグループによって報告されている（非特許文献１参照）。また、遺伝子組換えを利用した技術も種々提案されている。例えば、本発明者らは、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入されている発現用ベクターを用いる方法を提案している（特許文献１参照）。
【０００５】
さらに、遺伝子組換えを利用した技術としては、ファージディスプレイを応用して単鎖抗体を得る技術も知られている。例えば、ニワトリＶＬ遺伝子とヒトＣκ遺伝子、ニワトリＶＨ遺伝子とヒトＣＨ遺伝子とをＰＣＲにて連結し、ファージディスプレイ用のベクターであるｐＣｏｂ３に組み込んでＦａｂ型のニワトリ−ヒトキメラ抗体を発現させる方法が知られている（非特許文献２参照）。また、本発明者らも、ファージディスプレイ法による調製が可能なニワトリ型モノクローナル抗体についての技術を提案している（上記特許文献１および特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００１−２３８６７６号公報（平成１３（２００１）年９月４日公開）
【特許文献２】特開２００４−２８３１１１号公報（平成１６年（２００４）１０月１４日公開）
【非特許文献１】Nishinaka et al., 1989. Arch. Allergy Appl. Immunol., 89, 416-419
【非特許文献２】Andris-Widhopf et al., 2000. J Immunol Methods 242, 159-181
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ニワトリ型モノクローナル抗体の抗体分子は、哺乳動物の抗体分子（ＩｇＧ）よりも分子量が大きい。そのため、用途によっては実用性が不十分となる場合がある。具体的には、例えば、サンプル中において特定の分子の存在を抗体で認識して検出する用途の場合、当該特定の分子の含有量が微量であれば、十分な検出ができない場合がある。
【０００７】
そこで、ニワトリ型モノクローナル抗体の抗体分子から一部の重鎖定常領域を削除して分子量を小さくすることが考えられるが、本発明者らが鋭意検討した結果、このようにして得られる抗体ΔＦｃは構造的に不安定となるため、２価ではなく１価のものが多くできることが明らかとなった。
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、例えば微量物質の高感度検出等に好適に用いることが可能な、分子量の小さい２価のニワトリ型モノクローナル抗体と、その代表的な利用技術とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ニワトリキメラ抗体において２価抗体を実現するためには、ヒンジ部が非常に重要であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来であることを特徴としている。
【００１１】
上記ニワトリキメラ抗体においては、上記ヒンジ部がヒト由来であることが好ましい。また、上記ニワトリキメラ抗体は２価の抗体とすることができる。さらに、上記ニワトリキメラ抗体は、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、ヒト由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することにより生産することができる。なお、上記原核細胞は特に限定されないが大腸菌であることが好ましい。
【００１２】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とする抗体、すなわち、ヒンジ部がヒト由来のニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができるが、もちろん本発明はこれに限定されるものではない。
【００１３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法は、少なくともニワトリ由来の可変領域を含むニワトリキメラ抗体の生産方法であって、例えば、宿主細胞として原核細胞を用いるとともに、原核細胞内で機能するプロモーターと、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを含んでいる発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換する方法を挙げることができる。
【００１４】
上記生産方法においては、上記原核細胞が大腸菌であり、プロモーターがlacプロモーターである場合を挙げることができるが、特に限定されるものではない。なお、上記ヒンジ部はヒト由来であることが好ましい。
【００１５】
上記発現ベクターには、さらに、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００１６】
本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキットや、ニワトリキメラ抗体の生産方法あるいはキットに用いられる発現ベクターも含まれる。これら生糸や発現ベクターの具体的な構成は特に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、上記のように、ニワトリ抗体のヒンジ領域に相当する領域の代わりに哺乳動物のヒンジ領域を付加している。これにより、分子量の小さい２価の抗体を得ることができる。特に、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、通常のニワトリ抗体に比べてサイズが小さくなるため、当該２価抗体を大腸菌等の原核生物で発現させることが可能となる上に、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているため、ニワトリ抗体の一般的な欠点として知られているフレキシビリティの低さを解消し、抗体のフレキシビリティをより一層向上させることが可能となる。それゆえ、本発明では、安価で実用性の高い２価抗体を容易に得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について図１ないし図６に基づいて説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
〔１〕本発明にかかるニワトリキメラ抗体
本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来である構造を有している。具体的には、図１に示すように、例えば、ヒンジ部がヒト由来であり、重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬが少なくともニワトリ由来であるニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができる。なお、図１に示すニワトリ−ヒトキメラ抗体では、ヒンジ部を除く重鎖定常領域ＣＨおよび軽鎖定常領域ＣＬがニワトリ由来となっているが、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の構造は特にこの構造に限定されるものではなく、その利用分野等に応じて適宜設計することができる。
【００２０】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、図１に示すように２価の抗体（ニワトリＦ(ａｂ’)2 ）となっていることが非常に好ましい。ニワトリ由来のＦａｂ抗体に、哺乳動物由来のヒンジ部を付加すれば、当該ヒンジ部に存在するシステイン残基により、２価抗体Ｆ(ａｂ’)2 ）となる。前述したように、本発明者らはニワトリ抗体（ニワトリ型モノクローナル抗体）の分子量を小さくして実用化を図る検討を行ってきたが、一部の重鎖定常領域を削除する手法で得られる抗体はほとんど１価となる。これに対して本発明では２価抗体を得ることができるため、ニワトリキメラ抗体の実用性をより優れたものとすることができる。
【００２１】
本発明において、ヒンジ部の由来となる哺乳動物としては特に限定されるものではなく、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の用途等に応じて適宜選択することができるが、汎用性や医療分野への応用を考慮すれば、ヒト由来であることが好ましい。
【００２２】
ところで、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、ヒンジ部を哺乳動物由来とすることで２価抗体を実現しているが、さらに、抗体のフレキシビリティも向上させることが可能となっている。ニワトリ由来の抗体では、ヒンジ部に相当する領域はＣＨ２であるが、この領域のフレキシビリティは哺乳動物由来の抗体のヒンジ部と比較してもフレキシビリティに劣ることが知られていた。これに対して、本発明にかかるニワトリキメラ抗体では、ヒンジ部が哺乳動物由来であるため、２価を実現できるだけでなく、抗体そのもののフレキシビリティを高めることができるという利点も有している。
【００２３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の具体例は特に限定されるものではないが、後述する実施例に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とするニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができる。このニワトリ−ヒトキメラ抗体は、重鎖が２７８個のアミノ酸残基から、軽鎖が２２９個のアミノ酸残基からなり、同図中に示すように、可変領域ＶＬおよびＶＨ、並びにヒンジ部、後述するタグ（StrepTagII）に相当するアミノ酸配列には下線を引いている。
【００２４】
また、上記配列番号１および２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。このＤＮＡにおいては、図２ないし図５に示すように、１〜１９番目までの塩基配列がgene IIIのシグナル配列となっており、２０〜８５６番目までの塩基配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードしており、１１０１〜１７９０番目までの塩基配列が配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードしている。なお、当該塩基配列に含まれる制限酵素の認識部位は、同図中の塩基配列において下線を引いた配列であり、対応する制限酵素については、同下線部の下方に名称を記載している。
【００２５】
〔２〕本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法
上記ニワトリヒトキメラ抗体の生産方法は特に限定されるものではないが、特に本発明では、原核細胞に発現ベクターを導入して原核細胞内で生産させることができる。これは、一般的なニワトリ抗体に比べて、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の分子量が小さいためである。一般的なニワトリキメラ抗体の分子量は、２価の場合、約１８０ｋＤａであるが、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の分子量は、例えば、約９５ｋＤａ程度とすることができる（後述する実施例参照）。
【００２６】
上記原核細胞としては、通常は大腸菌（E. coli）を非常に好ましく用いることができる。周知の通り、大腸菌は分子生物学の分野で極めて広く用いられている原核細胞であり、かつ、形質転換や遺伝子組換えについて十分な技術的蓄積がある上に、さらに、培養動物細胞等と比べると培養や形質転換が簡便であるという利点も有している。そのため、本発明にかかるニワトリキメラ抗体を容易に生産することが可能となる。
【００２７】
なお、用いられる大腸菌の株については特に限定されるものではない。後述する実施例ではＪＭ１０９株を用いているが、公知の他の株であっても好適に用いることができる。また、用途等によって大腸菌以外の原核細胞を用いてもよいことや、各種真核細胞（酵母等の単細胞生物や、各種培養動物細胞等）を用いてもよいことは言うまでもない。
【００２８】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体を生産するために用いられる発現ベクターとしては、特に限定されるものではなく、用途に応じた所望のニワトリキメラ抗体の構造と、宿主の種類とに応じて適切なセグメントを有する発現ベクターを設計すればよい。基本的には、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物（好ましくはヒト）由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いればよい。
【００２９】
ここで、プロモーターとしては、宿主となる細胞に応じた公知のものを選択すればよく、特に限定されるものではない。宿主が原核細胞であれば原核細胞内で機能するプロモーターを選択すればよい。後述する実施例では、宿主が大腸菌であるため、プロモーターとしてはlacプロモーターを用いている。
【００３０】
また、抗体となる各領域をコードするポリヌクレオチドについても特に限定されるものではなく、構築しようとするニワトリキメラ抗体の構造に応じて、ニワトリおよび哺乳動物由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いればよい。
【００３１】
上記発現ベクターには、抗体となる各領域をコードするポリヌクレオチドおよびプロモーター以外のセグメントが含まれていてもよい。具体的には、例えば、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。後述する実施例に示すように、生産されたニワトリキメラ抗体にタグとなるアミノ酸配列を含ませることにより、当該ニワトリキメラ抗体の精製をより容易とすることができる。なお、タグの具体的な種類は特に限定されるものではなく、精製方法や精製に用いるカラム担体の種類等に応じて適切なタグを選択すればよい。後述する実施例では、図３にも示すように、タグとしてStrepTagIIを用いている。
【００３２】
他のセグメントの例としては、例えば、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。このようなセグメントを含んでいることで、当該発現ベクターをファージディスプレイ法にも利用することができる。後述する実施例では、gene IIIリーダー配列を用いている。
【００３３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体に用いられるより具体的な発現ベクターとしては、ｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして構築した、図６に示す構造のプラスミドｐＦａｂＨＬ−２を挙げることができるが、本発明はもちろんこれに限定されるものではない。
【００３４】
〔３〕本発明の利用
本発明の利用分野は特に限定されるものではなく、ニワトリキメラ抗体およびその生産方法抗体を用いたあらゆる用途に利用することができる。
【００３５】
例えば、本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキットが含まれる。キットの具体的な構成は特に限定されるものではなく、上記発現ベクターや宿主細胞、形質転換用の試薬類等を含むものであればよい。したがって、本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクターも含めることができる。
【００３６】
本発明により得られるニワトリキメラ抗体は、２価を実現することができ、一般的なニワトリ抗体よりも分子量が小さく、さらには、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているためフレキシビリティにも優れている。それゆえ、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、例えば、サンプル中に特定の物質が含まれているか否かを検出するような用途には、特に好適に用いることができる。サンプル中に含まれている物質が微量であるとしても本発明によれば、従来よりも高感度で物質を検出することが可能となる。
【００３７】
また、もともとニワトリ抗体は、免疫寛容により哺乳動物では抗体の生じにくい抗原についてもモノクローナル抗体を作製することが可能である。しかも、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、２価で分子量が小さく、フレキシビリティにも優れているため、より一層実用性を高めることが可能である。それゆえ、本発明にかかるキメラ抗体は、臨床分野への応用が期待される。
【００３８】
より具体的には、応用可能な技術・製品としては、抗体医薬品や診断薬を挙げることができる。抗体は特定の抗原に対して特異的に結合する能力を有する。そのため、例えば、抗体医薬品として用いる場合は、患部の特定細胞（がん細胞等）に生じている抗原に対する抗体を作製すれば、当該特定細胞のみを殺すことができるので、高い治療効果を発揮できるとともに、副作用も軽減することが可能となる。また、診断薬として用いる場合には、特定の疾患に特異的なタンパク質を抗原として、これに対する抗体を作製すれば、抗原抗体反応により検体中に抗原が存在するか否かを確認することができる。
【００３９】
本発明は、これまで免疫寛容により抗体を作製することが困難であった、哺乳動物間で相同性の高い抗原に対しても抗体を作製することができるので、上記抗体医薬品や診断薬として幅広い応用が期待される。
【００４０】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
本発明について、実施例および比較例、並びに図２ないし図９に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【００４２】
〔発現用ベクターｐＦａｂＨＬ−２の構築〕
本発明で用いられる発現用ベクターであるプラスミドｐＦａｂＨＬ−２は、図６に示すように、Ｌ鎖をコードする配列（便宜上、Ｌ鎖フラグメントと称し、図中ではＶＬおよびＣＬと表記）およびＨ鎖をコードする配列（便宜上、Ｈ鎖フラグメントと称し、図中ではＶＨおよびＣＨと表記）のそれぞれ上流にgene IIIリーダー配列（図中Ｌ）を有しており、さらにその上流にlacプロモーター（図中Ｐ）を有している。また、Ｈ鎖フラグメントの下流にはヒト由来のヒンジ部をコードする配列（ヒンジ配列）にStrepTagIIをつないだ配列（図中Ｈ）を有している。
【００４３】
上記ｐＦａｂＨＬ−２は、プラスミドｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして、図７に示すプラスミドｐＦａｂＬＨ−１を用いて構築した。そこで、まず、プラスミドｐＦａｂＬＨ−１について説明する。
【００４４】
図７に示すように、ｐＦａｂＬＨ−１は、Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントのそれぞれ上流にＳＤ配列（図中ＳＤ）およびgene IIIリーダー配列を有しており、さらにＬ鎖フラグメントの最上流にはlacプロモーターを有している。また、Ｈ鎖フラグメントの下流にはヒト由来のヒンジ配列にStrepTagIIをつないだ配列を有している。このｐＦａｂＬＨ−１も、プラスミドｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして構築した。
【００４５】
なお、図８に示すように、ｐＦａｂＨＬ−２を構築するに当って、制限酵素ＳａｌＩの認識部位を導入するため、ＣＨ１をコードする配列とヒンジ配列との間に２個の塩基置換を生じさせており（ＣＴをＧＡに置換）、その結果コードされるアミノ酸も置換している（ＬがＤに置換）。
【００４６】
まず、次の表１に示すLeaderLF-SacIおよびLeaderLR-Eag/Nheのプライマーペア（便宜上、プライマーペア１と称する）と、LeaderHF-BamおよびLeaderHR-EcoRI/SacIIのプライマーペア（便宜上、プライマーペア２と称する）により、ｐＰＤＳ（Accession number：D50401）をテンプレートとしてＳＤ配列およびgene IIIリーダー配列を含む領域をＰＣＲにより増幅した。なお、表中の下線部を引いた塩基配列はその直下に記載している制限酵素が認識する部位を示している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
得られたＰＣＲ産物のうち、プライマーペア１による増幅産物は、ＳａｃＩおよびＥａｇＩで両端を切断し、プライマーペア２による増幅産物は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで両端を切断し、それぞれｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。これにより得られたプラスミドをｐＦａｂＶＬＶＨと称する。
【００４９】
次に、表２に示す４本のオリゴヌクレオチドを合成し、Hinge1およびHinge2、並びに、StrepTag1およびStrepTag2をペアとしてそれぞれ表２に示すようにアニールさせた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチド断片をリン酸化した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
また、別途、上記ｐＦａｂＶＬＶＨをＳａｌＩおよびＫｐｎＩで切断した上で、脱リン酸化し、上記リン酸化した二本鎖オリゴヌクレオチド断片と連結した。得られたプラスミドをｐＦａｂ−ＨＳと称する。このｐＦａｂ−ＨＳには、ヒンジ配列およびStrepTagIIが挿入されていることになる。
【００５２】
次に、表３に示すプライマーペアを用いて、２価抗体発現用のＨ鎖プラスミド（ｐｃＤＨＦ３−１５、本発明者らにより先に構築されたニワトリ型組換え２価抗体の重鎖発現用プラスミド、特願２００５−０５６６７０号（２００５年３月１日出願）の明細書および図面参照）をテンプレートとしてＰＣＲによりＨ鎖フラグメントを増幅した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
また、別途、ｐBluescriptＳＫ(-)をＨｉｎｃIIで切断しておき、これに上記ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製し、シークエンスによりＨ鎖フラグメントの塩基配列を確認した。その後、上記プラスミドをＨｉｎｃIIおよびＳａｃIIで切断し、同じ制限酵素で切断した上記ｐＦａｂ−ＨＳに挿入した。得られたプラスミドをｐＦａｂＨ−１と称する。
【００５５】
次に、表４に示すプライマーペアを用い、２価抗体発現用のＬ鎖プラスミド（ｐｃＣＫＬ３−１５、本発明者らにより先に構築されたニワトリ型組換え２価抗体の軽鎖発現用プラスミド、特願２００５−０５６６７０号（２００５年３月１日出願）の明細書および図面参照）をテンプレートとしてＰＣＲによりＬ鎖フラグメントを増幅した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
また、別途、ｐBluescriptＳＫ(-)をＸｂａＩで切断しておき、これに上記ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製し、シークエンスによりＬ鎖フラグメントの塩基配列を確認した。その後、上記プラスミドをＸｂａＩおよびＮｈｅＩで切断し、同じ制限酵素で切断した上記ｐＦａｂＨ−１に挿入した。これにより、プラスミドｐＦａｂＬＨ−１を得た。このｐＦａｂＬＨ−１はシークエンスによりその塩基配列を確認した。
【００５８】
次に、ｐＦａｂＨＬ−２の構築について説明する。まず、次の表５に示すLSD-EcoRIおよびLST-XhoIのプライマーペアにより上記ｐＦａｂＬＨ−１をテンプレートとしてＬ鎖フラグメントを増幅した。また、次の表６にHSD-SacIおよびHTA-XbaIのプライマーペアにより上記ｐＦａｂＬＨ−１をテンプレートとしてＨ鎖フラグメントを増幅した。なお、表中の下線部を引いた塩基配列はプライマーの名称に含まれている制限酵素が認識する部位を示している。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【００６１】
次に、上記各ＰＣＲ産物、すなわちＬ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントをｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。なお、ｐBluescriptＳＫ(-)は、予め上記Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントに対応した制限酵素で切断しておき、Ｌ鎖フラグメントから順にｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。得られたプラスミドは、シークエンスにより塩基配列を確認した。
【００６２】
次に、表７に示すプライマーペアを用いて、ｐBluescriptＳＫ(-)をテンプレートとしてlacプロモーターを増幅し、ＢａｍＨＩにて切断した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
そして、上記Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントを挿入したプラスミドもＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸価処理を行った後、上記lacプロモーターのＢａｍＨＩフラグメントを挿入した。これによりプラスミドｐＦａｂＨＬ−２を得た。なお、ｐＦａｂＨＬ−２は、シークエンスによりプロモーターの向きおよび塩基配列を確認した。
【００６５】
〔ニワトリ−ヒトキメラ抗体の発現および精製〕
上記ｐＦａｂＨＬ−２を用いて大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９株を形質転換し、本発明にかかるニワトリ−ヒトキメラ抗体を大腸菌で発現させた。大腸菌のペリプラスミの画分を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティングにより抗体を検出した。約９０ｋＤａの２価の抗体（Ｆ(ａｂ’)2 ）と約５０ｋＤａのＦａｂを検出することができた。
【００６６】
なお、形質転換の方法は公知のE. coliの形質転換方法にしたがったが、形質転換後の細胞の培養については、ニワトリ−ヒトキメラ抗体のより効率的な生産条件を検討するために、培養温度および培養時間を変化させた。その結果、ＬＢ培地で３０℃、２４時間という培養条件であれば、抗体の生産量が最も多かった。
【００６７】
また、上記抗体の精製は、Ｃ末端に付加したStrepTagIIによるアフィニティーカラムを用いて以下手順で行った。なお、精製に用いた緩衝液の組成を表８に示す。
【００６８】
【表８】
【００６９】
まず、培養した大腸菌を集菌した後、上記ＰＥ緩衝液に懸濁し、氷上で３０分間静置した。遠心後、沈殿を５ｍＭのＭｇＳＯ4 に懸濁し、氷上で３０分間静置した。さらに遠視後、上清をペリプラズム画分とし、カラムに供与した。
【００７０】
上清にリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）およびＮａＣｌをそれぞれ最終濃度５０ｍＭおよび３００ｍＭになるように加え、あらかじめlysis緩衝液で平衡化したstreptactinと４℃で混ぜた。その後、lysis緩衝液で洗浄し、２．５ｍＭのdestiobiotinを含むlysis緩衝液で溶出した。
【００７１】
カラムによる精製の結果を図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動結果（銀染色）として示す。同図から明らかなように、本発明では、１ステップで抗体をほぼ精製することが可能であった。本発明にかかる抗体は２価抗体であり、１価の抗体とは分子量よりも分子量が大きいため、ゲル濾過カラムにかけることにより容易に分離できると考えられる。
【００７２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７３】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上のように、本発明によれば、２価でより分子量の小さいニワトリキメラ抗体を得ることが可能となる。そのため、ニワトリモノクローナル抗体の実用性をより一層向上させることができる。したがって、本発明は、抗体を用いた物質検出等の試薬関連だけでなく、医薬品、特に、抗体医薬品や診断薬に関わる産業にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の具体的な構造の一例を示す模式図である。
【図２】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図である。
【図３】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図２の続きを示す。
【図４】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図３の続きを示す。
【図５】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図４の続きを示す。
【図６】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクターの一例を示す模式図である。
【図７】図６に示す発現ベクターの作製に用いられたベクターの構成を示す模式図である。
【図８】図６に示す発現ベクターに含まれるＣ末端のヒンジ配列とStrepTagIIの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図９】実施例において大腸菌で発現させた本発明にかかるニワトリ−ヒトキメラ抗体の精製結果を示す電気泳動図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくともニワトリ由来の可変領域を有するニワトリキメラ抗体とその代表的な利用に関するものであり、特に、２価を実現することが可能であり、一般的なニワトリ抗体と比べて抗原認識のフレキシビリティに優れ、より実用性を有するニワトリキメラ抗体と、その生産方法等の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、抗原の特定部分のみを認識する単一抗体であり、ポリクローナル抗体（抗血清）と比較して、抗原特異性が均一で抗体の力価が高いといった利点を有する。それゆえ、モノクローナル抗体は、バイオサイエンスの研究全般において広く汎用される研究試薬として重要であるが、近年では、研究開発レベルから、例えばヒトの各種疾患の診断薬や治療薬等のような実用化レベルにまでその技術が進歩している。
【０００３】
上記モノクローナル抗体の中でも、近年、本発明者らにより提案されているニワトリ型のものが注目されている。ニワトリ（Gallus gallus）を含む鳥類は、系統発生学的に哺乳動物より下等であるものの、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を有している。特に、ニワトリは食用家畜として古くから飼育されており、特に、鶏卵は、食用ではなくタンパク質という素材を生産するという観点から見れば、高い生産性を有する原料として用いることができる。それゆえ、ニワトリは、免疫動物としての信頼性を有し、かつ、抗体生産の効率性も有しているため、免疫動物として好適に用いることができる。
【０００４】
ニワトリを免疫動物としてニワトリ型モノクローナル抗体を生産する技術としては、まず、ニワトリハイブリドーマを用いた方法が本発明者らのグループによって報告されている（非特許文献１参照）。また、遺伝子組換えを利用した技術も種々提案されている。例えば、本発明者らは、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）をコードする遺伝子が導入されている発現用ベクターを用いる方法を提案している（特許文献１参照）。
【０００５】
さらに、遺伝子組換えを利用した技術としては、ファージディスプレイを応用して単鎖抗体を得る技術も知られている。例えば、ニワトリＶＬ遺伝子とヒトＣκ遺伝子、ニワトリＶＨ遺伝子とヒトＣＨ遺伝子とをＰＣＲにて連結し、ファージディスプレイ用のベクターであるｐＣｏｂ３に組み込んでＦａｂ型のニワトリ−ヒトキメラ抗体を発現させる方法が知られている（非特許文献２参照）。また、本発明者らも、ファージディスプレイ法による調製が可能なニワトリ型モノクローナル抗体についての技術を提案している（上記特許文献１および特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００１−２３８６７６号公報（平成１３（２００１）年９月４日公開）
【特許文献２】特開２００４−２８３１１１号公報（平成１６年（２００４）１０月１４日公開）
【非特許文献１】Nishinaka et al., 1989. Arch. Allergy Appl. Immunol., 89, 416-419
【非特許文献２】Andris-Widhopf et al., 2000. J Immunol Methods 242, 159-181
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ニワトリ型モノクローナル抗体の抗体分子は、哺乳動物の抗体分子（ＩｇＧ）よりも分子量が大きい。そのため、用途によっては実用性が不十分となる場合がある。具体的には、例えば、サンプル中において特定の分子の存在を抗体で認識して検出する用途の場合、当該特定の分子の含有量が微量であれば、十分な検出ができない場合がある。
【０００７】
そこで、ニワトリ型モノクローナル抗体の抗体分子から一部の重鎖定常領域を削除して分子量を小さくすることが考えられるが、本発明者らが鋭意検討した結果、このようにして得られる抗体ΔＦｃは構造的に不安定となるため、２価ではなく１価のものが多くできることが明らかとなった。
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、例えば微量物質の高感度検出等に好適に用いることが可能な、分子量の小さい２価のニワトリ型モノクローナル抗体と、その代表的な利用技術とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ニワトリキメラ抗体において２価抗体を実現するためには、ヒンジ部が非常に重要であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来であることを特徴としている。
【００１１】
上記ニワトリキメラ抗体においては、上記ヒンジ部がヒト由来であることが好ましい。また、上記ニワトリキメラ抗体は２価の抗体とすることができる。さらに、上記ニワトリキメラ抗体は、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、ヒト由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することにより生産することができる。なお、上記原核細胞は特に限定されないが大腸菌であることが好ましい。
【００１２】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とする抗体、すなわち、ヒンジ部がヒト由来のニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができるが、もちろん本発明はこれに限定されるものではない。
【００１３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法は、少なくともニワトリ由来の可変領域を含むニワトリキメラ抗体の生産方法であって、例えば、宿主細胞として原核細胞を用いるとともに、原核細胞内で機能するプロモーターと、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを含んでいる発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換する方法を挙げることができる。
【００１４】
上記生産方法においては、上記原核細胞が大腸菌であり、プロモーターがlacプロモーターである場合を挙げることができるが、特に限定されるものではない。なお、上記ヒンジ部はヒト由来であることが好ましい。
【００１５】
上記発現ベクターには、さらに、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００１６】
本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキットや、ニワトリキメラ抗体の生産方法あるいはキットに用いられる発現ベクターも含まれる。これら生糸や発現ベクターの具体的な構成は特に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、上記のように、ニワトリ抗体のヒンジ領域に相当する領域の代わりに哺乳動物のヒンジ領域を付加している。これにより、分子量の小さい２価の抗体を得ることができる。特に、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、通常のニワトリ抗体に比べてサイズが小さくなるため、当該２価抗体を大腸菌等の原核生物で発現させることが可能となる上に、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているため、ニワトリ抗体の一般的な欠点として知られているフレキシビリティの低さを解消し、抗体のフレキシビリティをより一層向上させることが可能となる。それゆえ、本発明では、安価で実用性の高い２価抗体を容易に得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について図１ないし図６に基づいて説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
〔１〕本発明にかかるニワトリキメラ抗体
本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来である構造を有している。具体的には、図１に示すように、例えば、ヒンジ部がヒト由来であり、重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬが少なくともニワトリ由来であるニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができる。なお、図１に示すニワトリ−ヒトキメラ抗体では、ヒンジ部を除く重鎖定常領域ＣＨおよび軽鎖定常領域ＣＬがニワトリ由来となっているが、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の構造は特にこの構造に限定されるものではなく、その利用分野等に応じて適宜設計することができる。
【００２０】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、図１に示すように２価の抗体（ニワトリＦ(ａｂ’)2 ）となっていることが非常に好ましい。ニワトリ由来のＦａｂ抗体に、哺乳動物由来のヒンジ部を付加すれば、当該ヒンジ部に存在するシステイン残基により、２価抗体Ｆ(ａｂ’)2 ）となる。前述したように、本発明者らはニワトリ抗体（ニワトリ型モノクローナル抗体）の分子量を小さくして実用化を図る検討を行ってきたが、一部の重鎖定常領域を削除する手法で得られる抗体はほとんど１価となる。これに対して本発明では２価抗体を得ることができるため、ニワトリキメラ抗体の実用性をより優れたものとすることができる。
【００２１】
本発明において、ヒンジ部の由来となる哺乳動物としては特に限定されるものではなく、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の用途等に応じて適宜選択することができるが、汎用性や医療分野への応用を考慮すれば、ヒト由来であることが好ましい。
【００２２】
ところで、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、ヒンジ部を哺乳動物由来とすることで２価抗体を実現しているが、さらに、抗体のフレキシビリティも向上させることが可能となっている。ニワトリ由来の抗体では、ヒンジ部に相当する領域はＣＨ２であるが、この領域のフレキシビリティは哺乳動物由来の抗体のヒンジ部と比較してもフレキシビリティに劣ることが知られていた。これに対して、本発明にかかるニワトリキメラ抗体では、ヒンジ部が哺乳動物由来であるため、２価を実現できるだけでなく、抗体そのもののフレキシビリティを高めることができるという利点も有している。
【００２３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体の具体例は特に限定されるものではないが、後述する実施例に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とするニワトリ−ヒトキメラ抗体を挙げることができる。このニワトリ−ヒトキメラ抗体は、重鎖が２７８個のアミノ酸残基から、軽鎖が２２９個のアミノ酸残基からなり、同図中に示すように、可変領域ＶＬおよびＶＨ、並びにヒンジ部、後述するタグ（StrepTagII）に相当するアミノ酸配列には下線を引いている。
【００２４】
また、上記配列番号１および２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。このＤＮＡにおいては、図２ないし図５に示すように、１〜１９番目までの塩基配列がgene IIIのシグナル配列となっており、２０〜８５６番目までの塩基配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードしており、１１０１〜１７９０番目までの塩基配列が配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードしている。なお、当該塩基配列に含まれる制限酵素の認識部位は、同図中の塩基配列において下線を引いた配列であり、対応する制限酵素については、同下線部の下方に名称を記載している。
【００２５】
〔２〕本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法
上記ニワトリヒトキメラ抗体の生産方法は特に限定されるものではないが、特に本発明では、原核細胞に発現ベクターを導入して原核細胞内で生産させることができる。これは、一般的なニワトリ抗体に比べて、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の分子量が小さいためである。一般的なニワトリキメラ抗体の分子量は、２価の場合、約１８０ｋＤａであるが、本発明にかかるニワトリキメラ抗体の分子量は、例えば、約９５ｋＤａ程度とすることができる（後述する実施例参照）。
【００２６】
上記原核細胞としては、通常は大腸菌（E. coli）を非常に好ましく用いることができる。周知の通り、大腸菌は分子生物学の分野で極めて広く用いられている原核細胞であり、かつ、形質転換や遺伝子組換えについて十分な技術的蓄積がある上に、さらに、培養動物細胞等と比べると培養や形質転換が簡便であるという利点も有している。そのため、本発明にかかるニワトリキメラ抗体を容易に生産することが可能となる。
【００２７】
なお、用いられる大腸菌の株については特に限定されるものではない。後述する実施例ではＪＭ１０９株を用いているが、公知の他の株であっても好適に用いることができる。また、用途等によって大腸菌以外の原核細胞を用いてもよいことや、各種真核細胞（酵母等の単細胞生物や、各種培養動物細胞等）を用いてもよいことは言うまでもない。
【００２８】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体を生産するために用いられる発現ベクターとしては、特に限定されるものではなく、用途に応じた所望のニワトリキメラ抗体の構造と、宿主の種類とに応じて適切なセグメントを有する発現ベクターを設計すればよい。基本的には、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物（好ましくはヒト）由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いればよい。
【００２９】
ここで、プロモーターとしては、宿主となる細胞に応じた公知のものを選択すればよく、特に限定されるものではない。宿主が原核細胞であれば原核細胞内で機能するプロモーターを選択すればよい。後述する実施例では、宿主が大腸菌であるため、プロモーターとしてはlacプロモーターを用いている。
【００３０】
また、抗体となる各領域をコードするポリヌクレオチドについても特に限定されるものではなく、構築しようとするニワトリキメラ抗体の構造に応じて、ニワトリおよび哺乳動物由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いればよい。
【００３１】
上記発現ベクターには、抗体となる各領域をコードするポリヌクレオチドおよびプロモーター以外のセグメントが含まれていてもよい。具体的には、例えば、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。後述する実施例に示すように、生産されたニワトリキメラ抗体にタグとなるアミノ酸配列を含ませることにより、当該ニワトリキメラ抗体の精製をより容易とすることができる。なお、タグの具体的な種類は特に限定されるものではなく、精製方法や精製に用いるカラム担体の種類等に応じて適切なタグを選択すればよい。後述する実施例では、図３にも示すように、タグとしてStrepTagIIを用いている。
【００３２】
他のセグメントの例としては、例えば、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。このようなセグメントを含んでいることで、当該発現ベクターをファージディスプレイ法にも利用することができる。後述する実施例では、gene IIIリーダー配列を用いている。
【００３３】
本発明にかかるニワトリキメラ抗体に用いられるより具体的な発現ベクターとしては、ｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして構築した、図６に示す構造のプラスミドｐＦａｂＨＬ−２を挙げることができるが、本発明はもちろんこれに限定されるものではない。
【００３４】
〔３〕本発明の利用
本発明の利用分野は特に限定されるものではなく、ニワトリキメラ抗体およびその生産方法抗体を用いたあらゆる用途に利用することができる。
【００３５】
例えば、本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキットが含まれる。キットの具体的な構成は特に限定されるものではなく、上記発現ベクターや宿主細胞、形質転換用の試薬類等を含むものであればよい。したがって、本発明には、上記ニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクターも含めることができる。
【００３６】
本発明により得られるニワトリキメラ抗体は、２価を実現することができ、一般的なニワトリ抗体よりも分子量が小さく、さらには、哺乳動物由来のヒンジ部を有しているためフレキシビリティにも優れている。それゆえ、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、例えば、サンプル中に特定の物質が含まれているか否かを検出するような用途には、特に好適に用いることができる。サンプル中に含まれている物質が微量であるとしても本発明によれば、従来よりも高感度で物質を検出することが可能となる。
【００３７】
また、もともとニワトリ抗体は、免疫寛容により哺乳動物では抗体の生じにくい抗原についてもモノクローナル抗体を作製することが可能である。しかも、本発明にかかるニワトリキメラ抗体は、２価で分子量が小さく、フレキシビリティにも優れているため、より一層実用性を高めることが可能である。それゆえ、本発明にかかるキメラ抗体は、臨床分野への応用が期待される。
【００３８】
より具体的には、応用可能な技術・製品としては、抗体医薬品や診断薬を挙げることができる。抗体は特定の抗原に対して特異的に結合する能力を有する。そのため、例えば、抗体医薬品として用いる場合は、患部の特定細胞（がん細胞等）に生じている抗原に対する抗体を作製すれば、当該特定細胞のみを殺すことができるので、高い治療効果を発揮できるとともに、副作用も軽減することが可能となる。また、診断薬として用いる場合には、特定の疾患に特異的なタンパク質を抗原として、これに対する抗体を作製すれば、抗原抗体反応により検体中に抗原が存在するか否かを確認することができる。
【００３９】
本発明は、これまで免疫寛容により抗体を作製することが困難であった、哺乳動物間で相同性の高い抗原に対しても抗体を作製することができるので、上記抗体医薬品や診断薬として幅広い応用が期待される。
【００４０】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
本発明について、実施例および比較例、並びに図２ないし図９に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【００４２】
〔発現用ベクターｐＦａｂＨＬ−２の構築〕
本発明で用いられる発現用ベクターであるプラスミドｐＦａｂＨＬ−２は、図６に示すように、Ｌ鎖をコードする配列（便宜上、Ｌ鎖フラグメントと称し、図中ではＶＬおよびＣＬと表記）およびＨ鎖をコードする配列（便宜上、Ｈ鎖フラグメントと称し、図中ではＶＨおよびＣＨと表記）のそれぞれ上流にgene IIIリーダー配列（図中Ｌ）を有しており、さらにその上流にlacプロモーター（図中Ｐ）を有している。また、Ｈ鎖フラグメントの下流にはヒト由来のヒンジ部をコードする配列（ヒンジ配列）にStrepTagIIをつないだ配列（図中Ｈ）を有している。
【００４３】
上記ｐＦａｂＨＬ−２は、プラスミドｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして、図７に示すプラスミドｐＦａｂＬＨ−１を用いて構築した。そこで、まず、プラスミドｐＦａｂＬＨ−１について説明する。
【００４４】
図７に示すように、ｐＦａｂＬＨ−１は、Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントのそれぞれ上流にＳＤ配列（図中ＳＤ）およびgene IIIリーダー配列を有しており、さらにＬ鎖フラグメントの最上流にはlacプロモーターを有している。また、Ｈ鎖フラグメントの下流にはヒト由来のヒンジ配列にStrepTagIIをつないだ配列を有している。このｐＦａｂＬＨ−１も、プラスミドｐBluescriptＳＫ(-)をベースとして構築した。
【００４５】
なお、図８に示すように、ｐＦａｂＨＬ−２を構築するに当って、制限酵素ＳａｌＩの認識部位を導入するため、ＣＨ１をコードする配列とヒンジ配列との間に２個の塩基置換を生じさせており（ＣＴをＧＡに置換）、その結果コードされるアミノ酸も置換している（ＬがＤに置換）。
【００４６】
まず、次の表１に示すLeaderLF-SacIおよびLeaderLR-Eag/Nheのプライマーペア（便宜上、プライマーペア１と称する）と、LeaderHF-BamおよびLeaderHR-EcoRI/SacIIのプライマーペア（便宜上、プライマーペア２と称する）により、ｐＰＤＳ（Accession number：D50401）をテンプレートとしてＳＤ配列およびgene IIIリーダー配列を含む領域をＰＣＲにより増幅した。なお、表中の下線部を引いた塩基配列はその直下に記載している制限酵素が認識する部位を示している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
得られたＰＣＲ産物のうち、プライマーペア１による増幅産物は、ＳａｃＩおよびＥａｇＩで両端を切断し、プライマーペア２による増幅産物は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで両端を切断し、それぞれｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。これにより得られたプラスミドをｐＦａｂＶＬＶＨと称する。
【００４９】
次に、表２に示す４本のオリゴヌクレオチドを合成し、Hinge1およびHinge2、並びに、StrepTag1およびStrepTag2をペアとしてそれぞれ表２に示すようにアニールさせた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチド断片をリン酸化した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
また、別途、上記ｐＦａｂＶＬＶＨをＳａｌＩおよびＫｐｎＩで切断した上で、脱リン酸化し、上記リン酸化した二本鎖オリゴヌクレオチド断片と連結した。得られたプラスミドをｐＦａｂ−ＨＳと称する。このｐＦａｂ−ＨＳには、ヒンジ配列およびStrepTagIIが挿入されていることになる。
【００５２】
次に、表３に示すプライマーペアを用いて、２価抗体発現用のＨ鎖プラスミド（ｐｃＤＨＦ３−１５、本発明者らにより先に構築されたニワトリ型組換え２価抗体の重鎖発現用プラスミド、特願２００５−０５６６７０号（２００５年３月１日出願）の明細書および図面参照）をテンプレートとしてＰＣＲによりＨ鎖フラグメントを増幅した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
また、別途、ｐBluescriptＳＫ(-)をＨｉｎｃIIで切断しておき、これに上記ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製し、シークエンスによりＨ鎖フラグメントの塩基配列を確認した。その後、上記プラスミドをＨｉｎｃIIおよびＳａｃIIで切断し、同じ制限酵素で切断した上記ｐＦａｂ−ＨＳに挿入した。得られたプラスミドをｐＦａｂＨ−１と称する。
【００５５】
次に、表４に示すプライマーペアを用い、２価抗体発現用のＬ鎖プラスミド（ｐｃＣＫＬ３−１５、本発明者らにより先に構築されたニワトリ型組換え２価抗体の軽鎖発現用プラスミド、特願２００５−０５６６７０号（２００５年３月１日出願）の明細書および図面参照）をテンプレートとしてＰＣＲによりＬ鎖フラグメントを増幅した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
また、別途、ｐBluescriptＳＫ(-)をＸｂａＩで切断しておき、これに上記ＰＣＲ産物を挿入したプラスミドを作製し、シークエンスによりＬ鎖フラグメントの塩基配列を確認した。その後、上記プラスミドをＸｂａＩおよびＮｈｅＩで切断し、同じ制限酵素で切断した上記ｐＦａｂＨ−１に挿入した。これにより、プラスミドｐＦａｂＬＨ−１を得た。このｐＦａｂＬＨ−１はシークエンスによりその塩基配列を確認した。
【００５８】
次に、ｐＦａｂＨＬ−２の構築について説明する。まず、次の表５に示すLSD-EcoRIおよびLST-XhoIのプライマーペアにより上記ｐＦａｂＬＨ−１をテンプレートとしてＬ鎖フラグメントを増幅した。また、次の表６にHSD-SacIおよびHTA-XbaIのプライマーペアにより上記ｐＦａｂＬＨ−１をテンプレートとしてＨ鎖フラグメントを増幅した。なお、表中の下線部を引いた塩基配列はプライマーの名称に含まれている制限酵素が認識する部位を示している。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】
【００６１】
次に、上記各ＰＣＲ産物、すなわちＬ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントをｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。なお、ｐBluescriptＳＫ(-)は、予め上記Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントに対応した制限酵素で切断しておき、Ｌ鎖フラグメントから順にｐBluescriptＳＫ(-)に挿入した。得られたプラスミドは、シークエンスにより塩基配列を確認した。
【００６２】
次に、表７に示すプライマーペアを用いて、ｐBluescriptＳＫ(-)をテンプレートとしてlacプロモーターを増幅し、ＢａｍＨＩにて切断した。
【００６３】
【表７】
【００６４】
そして、上記Ｌ鎖フラグメントおよびＨ鎖フラグメントを挿入したプラスミドもＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸価処理を行った後、上記lacプロモーターのＢａｍＨＩフラグメントを挿入した。これによりプラスミドｐＦａｂＨＬ−２を得た。なお、ｐＦａｂＨＬ−２は、シークエンスによりプロモーターの向きおよび塩基配列を確認した。
【００６５】
〔ニワトリ−ヒトキメラ抗体の発現および精製〕
上記ｐＦａｂＨＬ−２を用いて大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９株を形質転換し、本発明にかかるニワトリ−ヒトキメラ抗体を大腸菌で発現させた。大腸菌のペリプラスミの画分を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティングにより抗体を検出した。約９０ｋＤａの２価の抗体（Ｆ(ａｂ’)2 ）と約５０ｋＤａのＦａｂを検出することができた。
【００６６】
なお、形質転換の方法は公知のE. coliの形質転換方法にしたがったが、形質転換後の細胞の培養については、ニワトリ−ヒトキメラ抗体のより効率的な生産条件を検討するために、培養温度および培養時間を変化させた。その結果、ＬＢ培地で３０℃、２４時間という培養条件であれば、抗体の生産量が最も多かった。
【００６７】
また、上記抗体の精製は、Ｃ末端に付加したStrepTagIIによるアフィニティーカラムを用いて以下手順で行った。なお、精製に用いた緩衝液の組成を表８に示す。
【００６８】
【表８】
【００６９】
まず、培養した大腸菌を集菌した後、上記ＰＥ緩衝液に懸濁し、氷上で３０分間静置した。遠心後、沈殿を５ｍＭのＭｇＳＯ4 に懸濁し、氷上で３０分間静置した。さらに遠視後、上清をペリプラズム画分とし、カラムに供与した。
【００７０】
上清にリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）およびＮａＣｌをそれぞれ最終濃度５０ｍＭおよび３００ｍＭになるように加え、あらかじめlysis緩衝液で平衡化したstreptactinと４℃で混ぜた。その後、lysis緩衝液で洗浄し、２．５ｍＭのdestiobiotinを含むlysis緩衝液で溶出した。
【００７１】
カラムによる精製の結果を図８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動結果（銀染色）として示す。同図から明らかなように、本発明では、１ステップで抗体をほぼ精製することが可能であった。本発明にかかる抗体は２価抗体であり、１価の抗体とは分子量よりも分子量が大きいため、ゲル濾過カラムにかけることにより容易に分離できると考えられる。
【００７２】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７３】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上のように、本発明によれば、２価でより分子量の小さいニワトリキメラ抗体を得ることが可能となる。そのため、ニワトリモノクローナル抗体の実用性をより一層向上させることができる。したがって、本発明は、抗体を用いた物質検出等の試薬関連だけでなく、医薬品、特に、抗体医薬品や診断薬に関わる産業にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の具体的な構造の一例を示す模式図である。
【図２】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図である。
【図３】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図２の続きを示す。
【図４】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図３の続きを示す。
【図５】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の代表例であるニワトリ−ヒトキメラ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の対応を示す図であり、図４の続きを示す。
【図６】本発明にかかるニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクターの一例を示す模式図である。
【図７】図６に示す発現ベクターの作製に用いられたベクターの構成を示す模式図である。
【図８】図６に示す発現ベクターに含まれるＣ末端のヒンジ配列とStrepTagIIの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図９】実施例において大腸菌で発現させた本発明にかかるニワトリ−ヒトキメラ抗体の精製結果を示す電気泳動図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来であることを特徴とするニワトリキメラ抗体。
【請求項２】
上記ヒンジ部がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項３】
２価の抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項４】
ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、ヒト由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することにより生産されることを特徴とする請求項２または３に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項５】
上記原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とすることを特徴とするニワトリ−ヒトキメラ抗体。
【請求項７】
少なくともニワトリ由来の可変領域を含むニワトリキメラ抗体の生産方法であって、
宿主細胞として原核細胞を用いるとともに、
原核細胞内で機能するプロモーターと、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを含んでいる発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することを特徴とするニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項８】
上記原核細胞が大腸菌であり、プロモーターがlacプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項９】
上記ヒンジ部がヒト由来であることを特徴とする請求項７または８に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１０】
上記発現ベクターには、さらに、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれていることを特徴する請求項７ないし９の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１１】
上記発現ベクターには、さらに、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドが含まれていることを特徴とする請求項７ないし１０の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１２】
請求項７ないし１１の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキット。
【請求項１３】
請求項７ないし１１の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクター。
【請求項１】
少なくとも可変領域がニワトリ由来であるとともに、ヒンジ部が哺乳動物由来であることを特徴とするニワトリキメラ抗体。
【請求項２】
上記ヒンジ部がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項３】
２価の抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項４】
ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、ヒト由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを少なくとも有する発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することにより生産されることを特徴とする請求項２または３に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項５】
上記原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４に記載のニワトリキメラ抗体。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、または、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを重鎖とし、
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを軽鎖とすることを特徴とするニワトリ−ヒトキメラ抗体。
【請求項７】
少なくともニワトリ由来の可変領域を含むニワトリキメラ抗体の生産方法であって、
宿主細胞として原核細胞を用いるとともに、
原核細胞内で機能するプロモーターと、ニワトリ由来の可変領域をコードするポリヌクレオチドと、哺乳動物由来のヒンジ部をコードするポリヌクレオチドとを含んでいる発現ベクターを用いて、原核細胞を形質転換することを特徴とするニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項８】
上記原核細胞が大腸菌であり、プロモーターがlacプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項９】
上記ヒンジ部がヒト由来であることを特徴とする請求項７または８に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１０】
上記発現ベクターには、さらに、タグとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれていることを特徴する請求項７ないし９の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１１】
上記発現ベクターには、さらに、ファージディスプレイ法で利用可能なファージをコードするポリヌクレオチドが含まれていることを特徴とする請求項７ないし１０の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法。
【請求項１２】
請求項７ないし１１の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法を行うためのキット。
【請求項１３】
請求項７ないし１１の何れか１項に記載のニワトリキメラ抗体の生産方法に用いられる発現ベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−２８２５２１（Ｐ２００６−２８２５２１Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１０１２９６（Ｐ２００５−１０１２９６）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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