バイオセンサ、その製造方法、その使用方法
【課題】検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度に基質量を定量する。
【解決手段】バイオセンサ１は、絶縁性基板１０１と、絶縁性基板１０１に設けられている作用極１０２、対極１０３および参照極１０５からなる電極と、電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４と、を備える。電子受容体は、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含む。
【解決手段】バイオセンサ１は、絶縁性基板１０１と、絶縁性基板１０１に設けられている作用極１０２、対極１０３および参照極１０５からなる電極と、電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４と、を備える。電子受容体は、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、その製造方法よびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のバイオセンサとしては、例えば特許文献１に記載されたものがある。このバイオセンサは、フェロセン電解質由来のフェリシウムイオンを電子受容体として用いる。フェリシウムイオンは、グルコースの酸化反応から生じた電子と直接反応して、フェロセンに還元される。そのため、あらかじめ電極上で電子受容体を酸化体に変換させる必要がない。したがって、検出感度を低下させることなく、酵素反応を短時間で進行させることができる。
【０００３】
フェリシウムイオンを電子受容体として用いることにより、生体試料や食品などの試料中のグルコースを迅速に定量することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−３０４３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
【０００６】
第一に、フェロセンの酸化電流を得るためには、印加電圧を高くしなければならないという問題があった。
【０００７】
特許文献１記載のバイオセンサでは、フェロセンの酸化電流の大きさを応答電流値として測定する。これにより得られた応答電流値の大きさは、試料中に存在するグルコース濃度に比例する。したがって、応答電流値を測定することにより試料中のグルコースを定量することができる。
【０００８】
ところが、フェロセンの酸化には、高い印加電圧が必要とされる。そうすると、試料中に含まれる干渉物質、たとえば尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、アセトアミノフェンなど）の影響を受けやすいこととなる。その結果として、測定精度が低下することとなる。
【０００９】
第二に、フェリシウムイオンは高価な試薬であり、使い捨てのバイオセンサではコストがかかりすぎてしまうという問題があった。
【００１０】
以上のことから、安価で酸化電流を得るための印加電圧のより低い電子受容体が望まれていた。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質量を定量することができるバイオセンサを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、基板と、
前記基板に設けられている電極と、
前記電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層と、
を備え、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサ
が提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、基板を準備する工程と、
前記基板に電極を設ける工程と、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層を前記電極に接するように設ける工程と、
を含み、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサの製造方法
が提供される。
【００１４】
また、本発明によれば、上記のバイオセンサの使用方法であって、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層に試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と前記酸化還元酵素とを反応させるステップと、
反応した前記酸化還元酵素と前記電子受容体とを反応させるステップと、
反応した前記電子受容体に電位を印加するステップと、
前記電位を印加された前記電子受容体から発生する電流を測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法
が提供される。
【００１５】
この発明によれば、電子受容体として酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を用いる。これにより、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体は、基質と反応して還元された酸化還元酵素と直接反応することができる。したがって、電極に電圧を印加することで検出される電流値は、酸化還元酵素と電子受容体との反応によって生成された還元体の応答電流のみが検出されることとなり、還元型の電子受容体を仕込んだときよりもベース電流を低くすることができる。よって、検出感度を低下させることなく、試料中の基質量を迅速に精度よく測定することが可能となる。
【００１６】
また、酸化電流を得るための印加電圧は、フェロシアンよりもテトラチアフルバレンまたはテトラチアフルバレン誘導体の方が低い。そのため、酸化還元酵素との反応により酸化型から還元型に変換した電子受容体を再酸化するための印加電圧を低くすることができ、干渉物質の影響を受けにくくすることができる。したがって、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度に試料中の基質量を測定することが可能となる。
【００１７】
さらに、テトラチアフルバレン等の酸化体は、テトラチアフルバレン等を過酸化物等の酸化剤と作用させて容易に調製することができる。したがって、フェリシウムイオンよりもコストの点で有利である。そのため、本発明の構成は、ディスポーザブル式のバイオセンサに適している。
【００１８】
また、本発明は、電子受容体がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することができる。これにより、電子受容体の親水性を向上させることができる。したがって、電子受容体を容易に電極に塗布することが可能となる。
【００１９】
また、本発明は、反応層に界面活性剤が含まれている構成を採用することができる。これにより、酸化型テトラチアフルバレンが酸化還元酵素と反応することで得られたテトラチアフルバレンの水に対する溶解性を向上させることができる。また、酸化型テトラチアフルバレン誘導体が酸化還元酵素と反応することで得られた還元体のテトラチアフルバレン誘導体も同様に、水に対する溶解性を向上させることができる。
【００２０】
また、本発明は、反応層が、酸化還元酵素を含む酵素層と、電子受容体を含むメディエーター層と、を含み、酵素層はメディエーター層に接しており、電極の表面にメディエーター層が設けられている構成を採用することができる。こうすることにより、基質と反応した酵素が、酵素層とメディエーター層との界面で酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。したがって酵素および電子受容体間の電子の送受を効率よく行うことができ、より迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２１】
また、本発明は、反応層に含有される酸化型のテトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体が反応層の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、基質と反応した酵素が、酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。したがって酵素および電子受容体間の電子の送受を効率よく行うことができ、より迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、メディエーター層に含まれる酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体がメディエーター層の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、基質と反応した酵素が、酵素層とメディエーター層との界面で酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。そして、還元型となった電子受容体は濃度勾配差を利用して迅速に電極の表面に向かって移動することができる。したがってより迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２３】
また、本発明は、酸化還元酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素である構成を採用することができる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼまたはグルコースオキシゲナーゼを用いることができる。これにより、本発明は、グルコースセンサとして利用することが可能となる。
【００２４】
さらに本発明の構成は、電子受容体が二電子酸化体である構成を採用することができる。これにより、試料中の基質と反応した酵素はより迅速に電子受容体と反応することができる。したがって、試料中に含まれる基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質量を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施の形態に係るバイオセンサを模式的に示した断面図である。
【図２】実施の形態に係るバイオセンサを模式的に示した平面図である。
【図３】変形例に係るバイオセンサを模式的に示した断面図である。
【図４】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図５】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図６】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図７】実施例に係る酸化型の電子受容体を精製する方法を説明する図である。
【図８】実施例に係る酸化型の電子受容体を精製した後の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図９】実施例に係るバイオセンサを用いた測定結果を示す図である。
【図１０】実施例に係るバイオセンサを用いた測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２８】
図２は、本実施の形態のバイオセンサ１を示す模式的な平面図である。図１は、図２のＡ−Ａ'断面図である。バイオセンサ１は、絶縁性基板１０１と、絶縁性基板１０１に設けられている電極１０６と、電極１０６と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４と、を備える。また、バイオセンサ１は、電子受容体として、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を反応層１０４に含有する。「テトラチアフルバレン」（ｔｅｔｒａｔｈｉａｆｕｌｖａｌｅｎｅ（ＴＴＦ））またはテトラチアフルバレン誘導体」は、総称して、以下、「ＴＴＦ化合物」ともいう。反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物は反応層１０４の全体にわたって分布している。
【００２９】
絶縁性基板１０１には、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用することができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド及びポリカーボネードなどの合成樹脂板を用いることができる。
【００３０】
電極１０６として、作用極１０２および対極１０３からなる二極系電極を採用することができる。作用極１０２、対極１０３は、導電性材料を用いて形成させることができる。導電性材料とは、炭素、またはパラジウム、銀、白金、金、銅、ニッケル、それらの合金等の金属材料である。また、電極１０６として、図１および図２で示すような、作用極１０２、対極１０３および参照極１０５からなる三極系電極を採用することもできる。三極系電極を採用することで、安定に応答電流を得ることができ、測定精度を安定化させることができる。参照極１０５も、作用極１０２及び対極１０３と同様に、導電性材料を用いて形成させることができる。電極は１種の導電性材料により形成させてもよいし、２種以上の導電性材料により形成させてもよい。これにより、安定した応答電流が得られ、精度がさらに安定化する。作用極１０２、対極１０３および参照極１０５は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法により絶縁性基板１０１に塗布することにより形成させることができる。電極１０６には、表面が絶縁膜３０で覆われている絶縁領域と、反応層１０４で覆われている測定領域と、電圧を印加するための印加領域と、が設けられている。印加領域では、電極１０６の表面が露出している。
【００３１】
反応層１０４は、少なくとも１種の酸化還元酵素および少なくとも１種の電子受容体を含有する。
【００３２】
電子受容体としては、少なくとも一種の酸化型ＴＴＦ化合物を用いるが、二種以上の酸化型ＴＴＦ化合物を用いてもよい。酸化型ＴＴＦ化合物（酸化型ＴＴＦおよび酸化型ＴＴＦ誘導体）とは、ＴＴＦ化合物の１電子酸化体または２電子酸化体をいう。ＴＴＦ化合物が１電子放出することで１電子酸化体となり、ＴＴＦ化合物から２電子放出されることで２電子酸化体となる。ＴＴＦ誘導体として、たとえば、４−エトキシカルボニル−４'，５，５'−トリメチルテトラチアフルバレン（Ｍｅ３ＴＴＦ−ＣＯ２Ｅｔ）、８−メルカプトオクチルテトラチアフルバレンカルボキシレートなどを例示することができる。
【００３３】
酸化型ＴＴＦ化合物は、ＴＴＦ化合物を適当な溶媒に溶解し、酸化剤と作用させることで調整することができる。溶媒は、ＴＴＦ化合物、および、その酸化体が溶解する溶媒であればどのようなものであっても用いることができるが、たとえば、アセトニトリルを例示することができる。酸化剤には、過酸化物を例示することができる。過酸化物として、たとえば、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）を用いることができる。
【００３４】
反応式１にＴＴＦの酸化還元反応を示す。化合物１がＴＴＦであり、ＴＴＦが１電子放出することによりＴＴＦの１電子酸化体であるテトラチアフルバレン・カチオンラジカル（ＴＴＦ・＋）（化合物２）となる。さらに化合物２から１電子放出されることにより、ＴＴＦの２電子酸化体であるテトラチアフルバレン・カチオンラジカル（ＴＴＦ・２＋）（化合物３）となる。換言すると、化合物２および化合物３が酸化型ＴＴＦである。それぞれの反応は可逆反応であり、化合物２及び化合物３は、還元剤と作用させることにより化合物１に還元することができる。還元剤としてたとえば、アスコルビン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などを用いることができる。
【００３５】
（反応式１）
【００３６】
反応層１０４中の酸化型ＴＴＦ化合物の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができるが、好ましくは、ＴＴＦ化合物の１電子酸化体を０．０５〜１０ｍＭを含む。
【００３７】
酸化還元酵素は、測定対象となる様々な基質と反応して酸化される。酸化された酵素が、ＴＴＦ化合物の酸化体と酸化還元反応をすることで、基質量を定量することができる。
【００３８】
たとえば、酸化還元酵素には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。また、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）、およびこれらの組合せを用いることができる。
【００３９】
バイオセンサ１をグルコースセンサとする場合、酸化還元酵素として、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）またはグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。
【００４０】
酸化還元酵素として、ＧＯＤを用いる場合の測定メカニズムは反応式２に基づく。
【００４１】
（反応式２）
グルコース ＋ ＧＯＤ（酸化体） → グルコン酸 ＋ ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体） ＋ 酸化型ＴＴＦ化合物 → ＧＯＤ（酸化体）＋ＴＴＦ化合物（還元体）
【００４２】
反応式２で示すように、測定試料中のグルコースは、ＧＯＤの触媒反応によりＧＯＤを還元させることで、グルコースがグルコン酸に酸化される。そしてＧＯＤは電子を酸化型ＴＴＦ化合物に伝達して元の状態に戻り、酸化型ＴＴＦ化合物が還元されてＴＴＦ化合物（還元体）となる。ＴＴＦ化合物が電気化学的に酸化されることで、酸化型ＴＴＦ化合物になるが、このとき、得られる酸化電流を応答電流値として測定する。この応答電流値は、測定試料中に存在するグルコース濃度に比例する。
【００４３】
反応層１０４中の酸化還元酵素の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができる。たとえば、グルコースオキシダーゼを用いる場合、その含有量は、０．１〜４０ユニット／μＬが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させるために必要な、酸化還元酵素の量をいう。
【００４４】
バイオセンサ１は、酸化型ＴＴＦ化合物がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することができる。これにより親水性が向上するため、電極に塗布しやすくなる。
【００４５】
シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリン等を使用することができる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが好ましい。これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４６】
酸化型ＴＴＦ化合物は１モルあたり、例えば、４０重量％以下のシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは０．１〜２０重量％であり、特に好ましくは１〜１０重量％である。シクロデキストリンの濃度が高すぎると粘性が高くなるという点で問題があり、低すぎると可溶化が難しくなるという点で問題がある。
【００４７】
酸化型ＴＴＦ化合物は、シクロデキストリンを用いた公知の包接方法により包接することができる。例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、酸化型ＴＴＦ化合物を懸濁した酸化体懸濁液と、を準備し、両者を混合させることで当該酸化型ＴＴＦ化合物を包接させることができる。
【００４８】
シクロデキストリン溶液に対する酸化型ＴＴＦ化合物の割合は、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解できれば特に制限されないが、たとえば、４０重量％以下のシクロデキストリンの溶液に当該酸化型ＴＴＦ化合物を５ｍＭとなるように溶解させることができる。シクロデキストリンの溶液は、１〜１０重量％であるとより好ましい。
【００４９】
水性溶媒としては、たとえば、水、緩衝液等が使用できる。緩衝液としては、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液などを用いることができる。緩衝液は、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００５０】
溶媒のｐＨは４〜８とすると好ましい。ｐＨが大きすぎたり小さすぎたりすると酵素が失活してしまうため好ましくない。
【００５１】
また、反応層１０４は、界面活性剤を含むことができる。
【００５２】
電子受容体として酸化型ＴＴＦ化合物を使用することで、反応式２で示すように、酸化還元酵素の還元体と酸化型ＴＴＦ化合物とが反応し、酸化還元酵素が酸化されるとともに酸化型ＴＴＦ化合物からＴＴＦ化合物（還元体）が生成される。ＴＴＦ化合物は、水に対する溶解度が低い。そのため、測定試料中に含まれる水によって生成した還元体が反応層上に析出することがある。そこで、反応層１０４に界面活性剤を含ませることにより、生成したＴＴＦ化合物（還元体）の水に対する溶解性を向上させることができる。
【００５３】
界面活性剤としては、たとえば、レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘ（登録商標）、Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（登録商標）、ＤＫ−エステル（登録商標）、ＢＩＧＣＨＡＰ（登録商標）、ＤｅｏｘＣＨＡＰ（登録商標）、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、およびＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を用いることができる。Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎ２０を用いると特に好ましい。
【００５４】
測定試料には、血液、尿、唾液等の体液等や、果汁等の食品を例示することができる。
【００５５】
つづいて、バイオセンサ１の製造方法の一例について説明する。
【００５６】
まず、基板を準備し、基板にスクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法等、公知の方法により、作用極１０２を形成させる。ついで、基板上に絶縁性ペーストをスクリーン印刷して絶縁膜３０を形成し、絶縁性基板１０１を得る。絶縁層３０は作用極１０２の外周を覆うように形成させる。そして、作用極１０２に並列するように、対極１０３および参照極１０５を設ける。
【００５７】
その後、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４を絶縁性基板１０１上に設ける。具体的には、反応層１０４は、以下のようにして絶縁性基板１０１上に形成させることができる。
【００５８】
酸化型ＴＴＦ化合物、シクロデキストリン、界面活性剤及び酸化還元酵素を水性溶媒に混合調整し、絶縁性基板１０１の表面に塗布した後、乾燥させてバイオセンサ１を完成する。乾燥は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下で行うと好ましい。
【００５９】
つづいて、バイオセンサ１を用いて試料液中に含まれる基質濃度を測定する方法について説明する。
【００６０】
まず、測定試料を反応層１０４に添加する。測定試料の添加により反応層１０４が溶解し、試料中の基質と酸化還元酵素との反応、および、この反応に続く酸化還元酵素と電子受容体との反応が進行する。これら反応を進行させるため、バイオセンサ１を所定時間放置した後、対極１０３に対して作用極１０２にアノード方向にパルス電圧（０〜＋０．３Ｖ）を印加する。応答電流が発生し、応答電流値が公知の方法で測定される。あらかじめ既知の濃度の基質を用いて作成した基質濃度と応答電流値との検量線を用いて、得られた応答電流値から基質濃度を求める。
【００６１】
つづいて、バイオセンサ１の作用および効果について図１、２を用いて説明する。
【００６２】
バイオセンサ１によれば、電子受容体として酸化型ＴＴＦ化合物を用いる。これにより、酸化型ＴＴＦ化合物は、基質と反応して還元された酸化還元酵素と直接反応することができる。したがって、酸化還元酵素との反応によって生成されたＴＴＦ化合物の酸化電流のみが応答電流値として検出されることとなり、還元型の電子受容体を仕込んだときによりもベース電流を低くすることができる。よって、検出感度を低下させることなく、試料中の基質量を迅速に精度よく測定することが可能となる。
【００６３】
従来、ＴＴＦ化合物は電子受容体として用いられていた。しかしながら、酸化還元酵素は、酸化型ＴＴＦ化合物としか反応しない。そのため、ＴＴＦ化合物をそのまま反応層に仕込むと、ＴＴＦ化合物をいったん酸化型ＴＴＦ化合物に変換する必要があった。その結果、酸化反応時に発生する電流により、ベース電流が高くなるという問題があった。つまり、ベース電流が高くなることで、基質に対する応答電流が相対的に小さくなり、結果として検出感度が低下するという問題があった。
【００６４】
また、使用時に酸化型ＴＴＦ化合物を生成させると、酸化反応にばらつきがあり、バイオセンサの性能を低下させる原因にもなっていた。また、どの程度ＴＴＦ化合物が酸化されているのか予測することができず、どの程度電子受容体を仕込んでおけばよいかを見通しを立てることができなかった。
【００６５】
ところが、バイオセンサ１では、あらかじめ酸化型ＴＴＦ化合物を仕込んでおく。これにより、仕込みに必要な電子受容体の量を予測して、バイオセンサを設計することができる。これにより、個々のバイオセンサの性能を均一にすることができ、各チップ間でのばらつきを少なくすることができる。したがって、使い捨てのバイオチップであっても、安定した測定結果を得ることができる。また、所望の性能を有するバイオセンサを用意することも可能となる。
【００６６】
また、ＴＴＦ化合物を再び酸化型ＴＴＦ化合物に酸化するための印加電圧は、０〜＋０．３Ｖであって、フェロシアンを酸化するための印加電圧（＋０．４〜＋０．７Ｖ）よりも低い。したがって、ＴＴＦ化合物は、試料中に含まれる干渉物質の影響を受けにくく、高精度に試料中の基質濃度を定量することが可能となる。
【００６７】
さらに、酸化型ＴＴＦ化合物は、ＴＴＦ化合物を過酸化物と作用させて容易に調製することができる。したがって、フェリシウムイオンよりもコストの点で有利である。そのため、バイオセンサ１は、ディスポーザブル式のバイオセンサとして利用することが可能である。
【００６８】
また、バイオセンサ１は、反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物としてＴＴＦ化合物の２電子酸化体を採用することができる。２電子酸化体を用いることにより酵素反応により生じた電子とより迅速に反応することができる。したがって、試料中に含まれるグルコース等の基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【００６９】
また、バイオセンサ１は、反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物が反応層１０４の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、反応層１０４の全体にわたって、基質と作用した酸化還元酵素と迅速に反応することができる。したがって、試料中の基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【００７０】
さらに、バイオセンサ１は、電子受容体がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することもできる。これにより、電子受容体の親水性を向上させることができる。したがって、電子受容体を電極に容易に塗布することが可能となる。
【００７１】
以上のように、バイオセンサ１によれば、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質を定量することができる。
【００７２】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００７３】
たとえば、図３で示すバイオセンサ２の構成を採用することもできる。バイオセンサ２は、反応層２０４が、酸化還元酵素を含む酵素層２０４ｂと、電子受容体を含むメディエーター層２０４ａと、を備える。酵素層２０４ｂはメディエーター層２０４ａに接しており、電極１０６の表面にメディエーター層２０４ａが設けられている。バイオセンサ２とバイオセンサ１とは、反応層１０４のかわりに反応層２０４を備える点で異なっている。メディエーター層２０４ａに含まれる酸化型ＴＴＦ化合物がメディエーター層２０４ａの全体にわたって分布している。
【００７４】
酸化還元酵素および電子受容体は反応層内を拡散するため、メディエーター層２０４ａが酸化還元酵素を含むこともあるし、酵素層２０４ｂが電子受容体を含むこともある。しかしながら、メディエーター層２０４ａは酵素層２０４ｂよりも高濃度かつ均一に酸化型ＴＴＦ化合物を含んでいる。また、酵素層２０４ｂはメディエーター層２０４ａよりも高濃度かつ均一に酸化還元酵素を含んでいる。
【００７５】
バイオセンサ２は、酸化型ＴＴＦ化合物がシクロデキストリン、ナフィオン（登録商標）や有機溶媒で包接されている構成を採用することができる。バイオセンサ１と同様に、シクロデキストリンで包摂させると特に好ましい。これにより親水性が向上するため、電極に塗布しやすくなる。
【００７６】
また、バイオセンサ２は、メディエーター層２０４ａと酵素層２０４ｂとの間に、界面活性剤を含む界面活性層を形成してもよい。界面活性剤としては、バイオセンサ１で用いられる界面活性剤と同様のものを採用することができる。
【００７７】
バイオセンサ２ではたとえば、以下のようにして絶縁性基板１０１上に反応層２０４を形成させることができる。
【００７８】
酸化型ＴＴＦ化合物を溶媒に溶解し、得られた酸化型ＴＴＦ化合物溶液を絶縁性基板１０１の表面に塗布して乾燥する。その後、作用極１０２、対極１０３、参照極１０５のそれぞれに酸化型ＴＴＦ化合物溶液を塗布し、再び乾燥させる。乾燥後、形成されたメディエーター層２０４ａの表面に、繰り返し、酸化型ＴＴＦ化合物溶液を塗布することで、均等にメディエーター層２０４ａを形成させることができる。塗布後、デシケーターに入れる等してメディエーター層２０４ａを念入りに乾燥させる。
【００７９】
ここで、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解させる溶媒は、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解し、かつ、揮発しやすいものを用いると好ましい。たとえば、水、揮発性有機溶媒を用いることができ、アセトニトリルを使用するとより好ましい。
【００８０】
その後、界面活性剤の溶液を塗布し、さらにデシケーターに入れる等して乾燥させる。これにより、界面活性剤の層を形成させることができる。界面活性剤の存在により、メディエーター層２０４ａと酵素層２０４ｂとの界面に発生した還元型ＴＴＦ化合物の析出を防止することができる。
【００８１】
ついで、酸化還元酵素の溶液を塗布し、酵素層２０４ｂを形成させる。酸化還元酵素としてＧＯＤまたはグルコースデヒドロゲナーゼとすることにより、バイオセンサ２をグルコースセンサとすることができる。最後に、低温下で乾燥させてバイオセンサ２を完成させる。なお、乾燥時の温度は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下とすると好ましい。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明のバイオチップの実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８３】
（酸化型ＴＴＦの調整方法、および、その測定方法）
１．アセトニトリル中でのＴＴＦの酸化
テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）を１ｍＭとなるようアセトニトリルで調整した（以下、「ＴＴＦ溶液１」という）。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＣｌＯ４）３）を５００ｍＭとなるようアセトニトリルで調整した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１」という）。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１に、さらにアセトニトリルを加え、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）の濃度が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるように希釈した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液１」という）。ついで、ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるようアセトニトリルで希釈した（以下、「混合液１」という）。混合液１を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００８４】
結果を図４に示す。図４（ａ）は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液１の濃度別の吸収スペクトルを示す。図４（ｂ）は、混合液１の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。
【００８５】
ここで、ＴＴＦの１電子酸化体（化合物２）には４５０ｎｍおよび６００ｎｍのそれぞれに吸収があり、ＴＴＦの２電子酸化体（化合物３）には３７５ｎｍに吸収があることが報告されている。（Ｍ．Ａｓａｋａｗａ，Ｐ．Ｒ．Ａｓｈｔｏｎ，Ｖ．Ｂａｌｚａｎｉ，ｅｔ．ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１９９８，３７，Ｎｏ．３，３３３−３３７）。また、ＴＴＦは、３００ｎｍ付近ｎｍに吸収があることが知られている（Ｓ．Ｈｎｉｇ，Ｇ．Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ，Ｈ．Ｑｕａｓｔ，Ｄ．Ｓｃｈｅｕｔｚｏｗ，Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，３１０−３２３）。そこで、図４（ｂ）をみると、４３５ｎｍ、５８０ｎｍ、３６０ｎｍにそれぞれ吸収が認められる。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）の濃度が増加により、４３５ｎｍ、５８０ｎｍの吸収が強くなり、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）５０ｍＭでは、３６０ｎｍの吸収も認められる。一方、３００ｎｍ付近の吸収は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により、減少している。
【００８６】
以上のことから、混合液１中でＴＴＦが過塩素酸鉄（ＩＩＩ）により酸化されていることがわかった。よって、アセトニトリル中でＴＴＦの酸化は可能であった。
【００８７】
２．９０％アセトニトリル＋１０％超純水中でのＴＴＦの酸化
ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるよう、アセトニトリル、および、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液２」という）。混合液２を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。ついで、アスコルビン酸（ＡｓＡ）による再還元も行った。超純水で５ｍＭとなるようＡｓＡを調製した（以下、「ＡｓＡ溶液１」という）。ＡｓＡ溶液は、さらに０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度になるように調整した（以下、「ＡｓＡ希釈液」という。ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とＡｓＡ溶液とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度が５０ｍＭ、ＡｓＡ濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度となるようアセトニトリル、および、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液３」という）。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１およびＡｓＡ溶液１を混合し、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３が５０ｍＭ、ＡｓＡが０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度となるようアセトニトリル及び、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液４」という）。また、ＴＴＦ溶液１とＡｓＡ溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、ＡｓＡが０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるよう、アセトニトリル及び、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液５」という）。混合液３〜５を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００８８】
結果を図５に示す。図５（ａ）は、混合液２の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｂ）は、ＡｓＡ希釈液の濃度別溶液の吸収スペクトルを示す。図５（ｃ）は、混合液４のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｄ）は、混合液５のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｅ）は、混合液３のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。
【００８９】
図５（ａ）で示すように、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収がそれぞれ増加した。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度が２５ｍＭ、５０ｍＭでは、それぞれ、３６０ｎｍに吸収が認められた。一方、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により３００ｎｍ付近の吸収は減少した。また、図５（ｅ）で示すように、ＡｓＡ濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収が減少した。一方、３００ｎｍ付近の吸収が増加した。
【００９０】
以上の結果から、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）によって酸化されたＴＴＦの１電子酸化体は、ＡｓＡによってＴＴＦに還元され、可逆的に酸化還元することがわかった。
【００９１】
３．超純水系でのＴＴＦの酸化
１０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）を含む超純水にてＴＴＦを１ｍＭ（以下、「ＴＴＦ溶液２」という）、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３を５００ｍＭ（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２」という）に調整した。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２は、さらに０、１、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍＭの各濃度になるように調整した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液２」という。ＴＴＦ溶液２と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２とを混合し、１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水でＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍＭの各濃度になるよう調整した（以下、「混合液６」という）。混合液６を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。ついで、アスコルビン酸による再還元を行った。１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水でＡｓＡ溶液を調製した。（以下、「ＡｓＡ溶液２」という）ＴＴＦ溶液２、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２、及び、ＡｓＡ溶液２を混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が１０ｍＭ、ＡｓＡが各濃度となるよう１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水で調整した（以下、「混合液７」という）。ついで、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２とＡｓＡ溶液２とを混合し、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２が１０ｍＭ、ＡｓＡが０、０．０１、０．０２、０．０５ｍＭの各濃度になるようアセトニトリルで希釈した（以下、「混合液８」という）。混合液６〜８を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００９２】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液２の濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｂ）は、混合液６の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｃ）は、ＡｓＡ溶液２の濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｄ）は、混合液８のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｅ）は、混合液７のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。
【００９３】
図６（ｂ）で示すように、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍ、３６０ｎｍにおける吸収が増加している。一方、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３濃度の増加により３００ｎｍ付近における吸収は減少している。また、図６（ｅ）で示すように、ＡｓＡ濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収が減少している。一方、ＡｓＡ濃度の増加により３００ｎｍ付近における吸収は増加している。したがって、水系でもＴＴＦを過塩素酸鉄（ＩＩＩ）により可逆的に酸化することが可能であった。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）によって酸化されたＴＴＦの１電子酸化体（化合物２）は、ＡｓＡによってＴＴＦ（化合物１）に還元され、可逆的に酸化還元することがわかった。
【００９４】
（酸化型ＴＴＦの精製方法）
図７は、固相抽出法を用いて酸化型ＴＴＦの精製方法を説明する図である。固相担体は、Ｃ１８（３００ｍｇ）を用い、アセトニトリル（２ｍＬ）を通液した（図７（ａ））ついで、超純水（３ｍＬ）を通液した（図７（ｂ））。その後、４０％アセトニトリルに溶解させたＴＴＦ（１０ｍＭ）、および、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）（１Ｍ）の混液を３００μＬを添加した（図７（ｃ））。通液後、超純水（２〜３ｍＬ）で洗浄し、抽出液を５００μＬずつ分取した（図７（ｄ））。最後に、アセトニトリル（１−１．５ｍＬ）で溶出し、溶出液を５００μＬずつ分取した（図７（ｅ））。分取した各フラクションを分光光度計にてスペクトル測定した。また、アセトニトリルにより抽出した各フラクションを合わせて濃縮後乾燥し、残渣を得た。使用したＴＴＦが１００％酸化型ＴＴＦになったものとして、得られた残渣中の酸化型ＴＴＦの量を換算し、残渣にアセトニトリルを適量加えて酸化型ＴＴＦのアセトニトリル溶液を所望の濃度に調整した。各濃度に調整されたアセトニトリル溶液を４３５ｎｍにて吸光度測定し、酸化型ＴＴＦの換算濃度と吸光度との相関を調べた。
【００９５】
結果を図８に示す。図８（ａ）は、図７（ｄ）で示すステップにおいて、超純水により抽出した各フラクションの吸収スペクトルを示す。図８（ｂ）は、図７（ｅ）で示すステップにおいて、アセトニトリルにより抽出した各フラクションの吸収スペクトルを示す。図８（ｃ）は、４３５ｎｍの吸光度と酸化型ＴＴＦの換算濃度との関係を示したグラフである。
【００９６】
図８（ａ）から、超純水では酸化型ＴＴＦは溶出されにくいことがわかった。また、図８（ｂ）から、アセトニトリルで酸化型ＴＴＦを溶出できることがわかった。また、固相抽出してもＴＴＦは酸化された状態で存在することがわかった。さらに、４３５ｎｍの吸光度と換算した酸化型ＴＴＦ濃度との関係は十分な直線性が得られた。これを検量線として用い、ＴＴＦの一電子酸化体の濃度の指標とした。
【００９７】
（バイオセンサの作製方法）
１．メディエーター・酵素混合系
バイオセンサ１の構成と同様の構成を有するグルコースセンサＡ１、Ａ２を以下の方法により作製した。まず、カーボン作用極、銀／塩化銀参照極、カーボン対極が設けられたＰＥＴ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）基板を用意した。ついで、ＴＴＦまたはＴＴＦ１電子酸化体を超純水に溶解し、ｈｐ−β−ＣＤ（５％）、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（１％）、ＧＯＤ（１０Ｕ／μＬ）をそれぞれ添加した。その後、各溶液をそれぞれ５μＬチップ上に塗布することにより反応層を形成し、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。ＴＴＦ含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＡ１とし、ＴＴＦ１電子酸化体含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＡ２とした。
【００９８】
なお、ＴＴＦ１電子酸化体の溶液は、以下の方法により、所定の濃度に調整した。図７（ｅ）で示すステップで得られたアセトニトリルの溶出液の吸光度を測定する。図８（ｃ）で示す検量線を用い、吸光度の測定値から濃度に変換する。溶出液の容量を正確に量りとり、溶出液を乾燥させる。これにより、所定量の１電子酸化体の粉末を得る。この粉末を溶媒に溶解し、所定濃度に調整する。
【００９９】
２．メディエーター、酵素二層系
バイオセンサ２の構成と同様の構成を有するグルコースセンサＢ１、Ｂ２を以下の方法により作製した。まず、カーボン作用極、銀／塩化銀参照極、カーボン対極が設けられたＰＥＴ基板を用意した。ついで、ＴＴＦまたはＴＴＦ１電子酸化体それぞれの４ｍＭアセトニトリル溶液を１μＬずつ５回に分けて５μＬチップ上に塗布した。具体的には、１μＬ塗布し、乾燥後に再度１μＬを電極系上に塗布し、これを５回繰り返した。デシケーター内で乾燥後、５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００の水溶液１μＬを塗布した。その後、デシケーター内で乾燥し、脱塩した２０Ｕ／μＬのＧＯＤ溶液を２．５μＬ塗布し、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。ＴＴＦ含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＢ１とし、ＴＴＦ１電子酸化体含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＢ２とした。
【０１００】
（電気化学測定）
標準サンプルとして、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．５）で調製したグルコース溶液を用意した。また、ボランティアによって採取されたヒト尿、およびこのヒト尿にグルコースを添加したもの尿サンプルとして用意した。サンプル５μＬを反応層に添加し、サンプル添加後１０秒後に、対極に対して作用極にアノード方向に電圧（０．３ｍＶ／ｖｓ）を印加し、応答電流の測定を開始した。開始後１分の電流値を測定値とした。測定に用いたグルコースセンサＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２は測定ごとに交換した。
【０１０１】
図９にグルコースセンサＡ１、Ａ２の結果を示す。図９（ａ）は、標準サンプルの結果を示す図である。図９（ｂ）は、図９（ａ）の拡大図である。図９（ｃ）は、尿サンプルの結果を示す図である。図９（ｄ）は、図９（ｃ）の拡大図である。○はグルコースセンサＡ１、△はグルコースセンサＡ２の結果を示す。各グラフの横軸はグルコース濃度（ｍＭ）を示し、縦軸は電流値（μＡ）を示す。図９で示すように、ＴＴＦ１電子酸化体を超純水で調製したチップは、ベース電流が低下した。
【０１０２】
図１０にグルコースセンサＢ１、Ｂ２の結果を示す。図１０（ａ）は、標準サンプルの結果を示す図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）の拡大図である。図１０（ｃ）は、尿サンプルの結果を示す図である。図１０（ｄ）は、図１０（ｃ）の拡大図である。○はグルコースセンサＢ１、□はグルコースセンサＢ２の結果を示す。各グラフの横軸はグルコース濃度（ｍＭ）を示し、縦軸は電流値（μＡ）を示す。グルコースセンサＢ２は、標準サンプルを用いた場合、４〜１０ｍＭの範囲で、良好な直線性が得られた。したがって、グルコースセンサＢ２は、低濃度グルコースを定量的に測定できることが示唆された。
【符号の説明】
【０１０３】
１ バイオセンサ
２ バイオセンサ
１０１ 絶縁性基板
１０２ 作用極
１０３ 対極
１０４ 反応層
１０５ 参照極
１０６ 電極
２０４ 反応層
２０４ａ メディエーター層
２０４ｂ 酵素層
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、その製造方法よびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のバイオセンサとしては、例えば特許文献１に記載されたものがある。このバイオセンサは、フェロセン電解質由来のフェリシウムイオンを電子受容体として用いる。フェリシウムイオンは、グルコースの酸化反応から生じた電子と直接反応して、フェロセンに還元される。そのため、あらかじめ電極上で電子受容体を酸化体に変換させる必要がない。したがって、検出感度を低下させることなく、酵素反応を短時間で進行させることができる。
【０００３】
フェリシウムイオンを電子受容体として用いることにより、生体試料や食品などの試料中のグルコースを迅速に定量することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−３０４３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
【０００６】
第一に、フェロセンの酸化電流を得るためには、印加電圧を高くしなければならないという問題があった。
【０００７】
特許文献１記載のバイオセンサでは、フェロセンの酸化電流の大きさを応答電流値として測定する。これにより得られた応答電流値の大きさは、試料中に存在するグルコース濃度に比例する。したがって、応答電流値を測定することにより試料中のグルコースを定量することができる。
【０００８】
ところが、フェロセンの酸化には、高い印加電圧が必要とされる。そうすると、試料中に含まれる干渉物質、たとえば尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、アセトアミノフェンなど）の影響を受けやすいこととなる。その結果として、測定精度が低下することとなる。
【０００９】
第二に、フェリシウムイオンは高価な試薬であり、使い捨てのバイオセンサではコストがかかりすぎてしまうという問題があった。
【００１０】
以上のことから、安価で酸化電流を得るための印加電圧のより低い電子受容体が望まれていた。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質量を定量することができるバイオセンサを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、基板と、
前記基板に設けられている電極と、
前記電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層と、
を備え、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサ
が提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、基板を準備する工程と、
前記基板に電極を設ける工程と、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層を前記電極に接するように設ける工程と、
を含み、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサの製造方法
が提供される。
【００１４】
また、本発明によれば、上記のバイオセンサの使用方法であって、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層に試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と前記酸化還元酵素とを反応させるステップと、
反応した前記酸化還元酵素と前記電子受容体とを反応させるステップと、
反応した前記電子受容体に電位を印加するステップと、
前記電位を印加された前記電子受容体から発生する電流を測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法
が提供される。
【００１５】
この発明によれば、電子受容体として酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を用いる。これにより、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体は、基質と反応して還元された酸化還元酵素と直接反応することができる。したがって、電極に電圧を印加することで検出される電流値は、酸化還元酵素と電子受容体との反応によって生成された還元体の応答電流のみが検出されることとなり、還元型の電子受容体を仕込んだときよりもベース電流を低くすることができる。よって、検出感度を低下させることなく、試料中の基質量を迅速に精度よく測定することが可能となる。
【００１６】
また、酸化電流を得るための印加電圧は、フェロシアンよりもテトラチアフルバレンまたはテトラチアフルバレン誘導体の方が低い。そのため、酸化還元酵素との反応により酸化型から還元型に変換した電子受容体を再酸化するための印加電圧を低くすることができ、干渉物質の影響を受けにくくすることができる。したがって、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度に試料中の基質量を測定することが可能となる。
【００１７】
さらに、テトラチアフルバレン等の酸化体は、テトラチアフルバレン等を過酸化物等の酸化剤と作用させて容易に調製することができる。したがって、フェリシウムイオンよりもコストの点で有利である。そのため、本発明の構成は、ディスポーザブル式のバイオセンサに適している。
【００１８】
また、本発明は、電子受容体がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することができる。これにより、電子受容体の親水性を向上させることができる。したがって、電子受容体を容易に電極に塗布することが可能となる。
【００１９】
また、本発明は、反応層に界面活性剤が含まれている構成を採用することができる。これにより、酸化型テトラチアフルバレンが酸化還元酵素と反応することで得られたテトラチアフルバレンの水に対する溶解性を向上させることができる。また、酸化型テトラチアフルバレン誘導体が酸化還元酵素と反応することで得られた還元体のテトラチアフルバレン誘導体も同様に、水に対する溶解性を向上させることができる。
【００２０】
また、本発明は、反応層が、酸化還元酵素を含む酵素層と、電子受容体を含むメディエーター層と、を含み、酵素層はメディエーター層に接しており、電極の表面にメディエーター層が設けられている構成を採用することができる。こうすることにより、基質と反応した酵素が、酵素層とメディエーター層との界面で酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。したがって酵素および電子受容体間の電子の送受を効率よく行うことができ、より迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２１】
また、本発明は、反応層に含有される酸化型のテトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体が反応層の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、基質と反応した酵素が、酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。したがって酵素および電子受容体間の電子の送受を効率よく行うことができ、より迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、メディエーター層に含まれる酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体がメディエーター層の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、基質と反応した酵素が、酵素層とメディエーター層との界面で酸化型の電子受容体に即座に作用することができる。そして、還元型となった電子受容体は濃度勾配差を利用して迅速に電極の表面に向かって移動することができる。したがってより迅速に試料中の基質量を測定することができる。
【００２３】
また、本発明は、酸化還元酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素である構成を採用することができる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼまたはグルコースオキシゲナーゼを用いることができる。これにより、本発明は、グルコースセンサとして利用することが可能となる。
【００２４】
さらに本発明の構成は、電子受容体が二電子酸化体である構成を採用することができる。これにより、試料中の基質と反応した酵素はより迅速に電子受容体と反応することができる。したがって、試料中に含まれる基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質量を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施の形態に係るバイオセンサを模式的に示した断面図である。
【図２】実施の形態に係るバイオセンサを模式的に示した平面図である。
【図３】変形例に係るバイオセンサを模式的に示した断面図である。
【図４】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図５】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図６】実施例に係る酸化型の電子受容体の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図７】実施例に係る酸化型の電子受容体を精製する方法を説明する図である。
【図８】実施例に係る酸化型の電子受容体を精製した後の紫外可視近赤外光吸収スペクトルの結果である。
【図９】実施例に係るバイオセンサを用いた測定結果を示す図である。
【図１０】実施例に係るバイオセンサを用いた測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２８】
図２は、本実施の形態のバイオセンサ１を示す模式的な平面図である。図１は、図２のＡ−Ａ'断面図である。バイオセンサ１は、絶縁性基板１０１と、絶縁性基板１０１に設けられている電極１０６と、電極１０６と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４と、を備える。また、バイオセンサ１は、電子受容体として、酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を反応層１０４に含有する。「テトラチアフルバレン」（ｔｅｔｒａｔｈｉａｆｕｌｖａｌｅｎｅ（ＴＴＦ））またはテトラチアフルバレン誘導体」は、総称して、以下、「ＴＴＦ化合物」ともいう。反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物は反応層１０４の全体にわたって分布している。
【００２９】
絶縁性基板１０１には、セラミック、プラスチック、シリコン、アルミナガラス板または高分子材料を使用することができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド及びポリカーボネードなどの合成樹脂板を用いることができる。
【００３０】
電極１０６として、作用極１０２および対極１０３からなる二極系電極を採用することができる。作用極１０２、対極１０３は、導電性材料を用いて形成させることができる。導電性材料とは、炭素、またはパラジウム、銀、白金、金、銅、ニッケル、それらの合金等の金属材料である。また、電極１０６として、図１および図２で示すような、作用極１０２、対極１０３および参照極１０５からなる三極系電極を採用することもできる。三極系電極を採用することで、安定に応答電流を得ることができ、測定精度を安定化させることができる。参照極１０５も、作用極１０２及び対極１０３と同様に、導電性材料を用いて形成させることができる。電極は１種の導電性材料により形成させてもよいし、２種以上の導電性材料により形成させてもよい。これにより、安定した応答電流が得られ、精度がさらに安定化する。作用極１０２、対極１０３および参照極１０５は、スクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法により絶縁性基板１０１に塗布することにより形成させることができる。電極１０６には、表面が絶縁膜３０で覆われている絶縁領域と、反応層１０４で覆われている測定領域と、電圧を印加するための印加領域と、が設けられている。印加領域では、電極１０６の表面が露出している。
【００３１】
反応層１０４は、少なくとも１種の酸化還元酵素および少なくとも１種の電子受容体を含有する。
【００３２】
電子受容体としては、少なくとも一種の酸化型ＴＴＦ化合物を用いるが、二種以上の酸化型ＴＴＦ化合物を用いてもよい。酸化型ＴＴＦ化合物（酸化型ＴＴＦおよび酸化型ＴＴＦ誘導体）とは、ＴＴＦ化合物の１電子酸化体または２電子酸化体をいう。ＴＴＦ化合物が１電子放出することで１電子酸化体となり、ＴＴＦ化合物から２電子放出されることで２電子酸化体となる。ＴＴＦ誘導体として、たとえば、４−エトキシカルボニル−４'，５，５'−トリメチルテトラチアフルバレン（Ｍｅ３ＴＴＦ−ＣＯ２Ｅｔ）、８−メルカプトオクチルテトラチアフルバレンカルボキシレートなどを例示することができる。
【００３３】
酸化型ＴＴＦ化合物は、ＴＴＦ化合物を適当な溶媒に溶解し、酸化剤と作用させることで調整することができる。溶媒は、ＴＴＦ化合物、および、その酸化体が溶解する溶媒であればどのようなものであっても用いることができるが、たとえば、アセトニトリルを例示することができる。酸化剤には、過酸化物を例示することができる。過酸化物として、たとえば、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）を用いることができる。
【００３４】
反応式１にＴＴＦの酸化還元反応を示す。化合物１がＴＴＦであり、ＴＴＦが１電子放出することによりＴＴＦの１電子酸化体であるテトラチアフルバレン・カチオンラジカル（ＴＴＦ・＋）（化合物２）となる。さらに化合物２から１電子放出されることにより、ＴＴＦの２電子酸化体であるテトラチアフルバレン・カチオンラジカル（ＴＴＦ・２＋）（化合物３）となる。換言すると、化合物２および化合物３が酸化型ＴＴＦである。それぞれの反応は可逆反応であり、化合物２及び化合物３は、還元剤と作用させることにより化合物１に還元することができる。還元剤としてたとえば、アスコルビン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などを用いることができる。
【００３５】
（反応式１）
【００３６】
反応層１０４中の酸化型ＴＴＦ化合物の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができるが、好ましくは、ＴＴＦ化合物の１電子酸化体を０．０５〜１０ｍＭを含む。
【００３７】
酸化還元酵素は、測定対象となる様々な基質と反応して酸化される。酸化された酵素が、ＴＴＦ化合物の酸化体と酸化還元反応をすることで、基質量を定量することができる。
【００３８】
たとえば、酸化還元酵素には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。また、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯＤ）、およびこれらの組合せを用いることができる。
【００３９】
バイオセンサ１をグルコースセンサとする場合、酸化還元酵素として、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）またはグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。
【００４０】
酸化還元酵素として、ＧＯＤを用いる場合の測定メカニズムは反応式２に基づく。
【００４１】
（反応式２）
グルコース ＋ ＧＯＤ（酸化体） → グルコン酸 ＋ ＧＯＤ（還元体）
ＧＯＤ（還元体） ＋ 酸化型ＴＴＦ化合物 → ＧＯＤ（酸化体）＋ＴＴＦ化合物（還元体）
【００４２】
反応式２で示すように、測定試料中のグルコースは、ＧＯＤの触媒反応によりＧＯＤを還元させることで、グルコースがグルコン酸に酸化される。そしてＧＯＤは電子を酸化型ＴＴＦ化合物に伝達して元の状態に戻り、酸化型ＴＴＦ化合物が還元されてＴＴＦ化合物（還元体）となる。ＴＴＦ化合物が電気化学的に酸化されることで、酸化型ＴＴＦ化合物になるが、このとき、得られる酸化電流を応答電流値として測定する。この応答電流値は、測定試料中に存在するグルコース濃度に比例する。
【００４３】
反応層１０４中の酸化還元酵素の含有量は、特に限定されず、必要に応じて適切な量を選択することができる。たとえば、グルコースオキシダーゼを用いる場合、その含有量は、０．１〜４０ユニット／μＬが好ましい。ここで、「１ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させるために必要な、酸化還元酵素の量をいう。
【００４４】
バイオセンサ１は、酸化型ＴＴＦ化合物がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することができる。これにより親水性が向上するため、電極に塗布しやすくなる。
【００４５】
シクロデキストリンとしては、特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンやγ−シクロデキストリン等を使用することができる。また、化学修飾されたシクロデキストリンであってもよく、例えば、ヒドロキシシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン等の化学修飾体があげられ、中でも、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが好ましい。これらは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４６】
酸化型ＴＴＦ化合物は１モルあたり、例えば、４０重量％以下のシクロデキストリンによって包接されていることが好ましく、より好ましくは０．１〜２０重量％であり、特に好ましくは１〜１０重量％である。シクロデキストリンの濃度が高すぎると粘性が高くなるという点で問題があり、低すぎると可溶化が難しくなるという点で問題がある。
【００４７】
酸化型ＴＴＦ化合物は、シクロデキストリンを用いた公知の包接方法により包接することができる。例えば、シクロデキストリンを水性溶媒に溶解したシクロデキストリン溶液と、酸化型ＴＴＦ化合物を懸濁した酸化体懸濁液と、を準備し、両者を混合させることで当該酸化型ＴＴＦ化合物を包接させることができる。
【００４８】
シクロデキストリン溶液に対する酸化型ＴＴＦ化合物の割合は、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解できれば特に制限されないが、たとえば、４０重量％以下のシクロデキストリンの溶液に当該酸化型ＴＴＦ化合物を５ｍＭとなるように溶解させることができる。シクロデキストリンの溶液は、１〜１０重量％であるとより好ましい。
【００４９】
水性溶媒としては、たとえば、水、緩衝液等が使用できる。緩衝液としては、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液などを用いることができる。緩衝液は、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００５０】
溶媒のｐＨは４〜８とすると好ましい。ｐＨが大きすぎたり小さすぎたりすると酵素が失活してしまうため好ましくない。
【００５１】
また、反応層１０４は、界面活性剤を含むことができる。
【００５２】
電子受容体として酸化型ＴＴＦ化合物を使用することで、反応式２で示すように、酸化還元酵素の還元体と酸化型ＴＴＦ化合物とが反応し、酸化還元酵素が酸化されるとともに酸化型ＴＴＦ化合物からＴＴＦ化合物（還元体）が生成される。ＴＴＦ化合物は、水に対する溶解度が低い。そのため、測定試料中に含まれる水によって生成した還元体が反応層上に析出することがある。そこで、反応層１０４に界面活性剤を含ませることにより、生成したＴＴＦ化合物（還元体）の水に対する溶解性を向上させることができる。
【００５３】
界面活性剤としては、たとえば、レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘ（登録商標）、Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（登録商標）、ＤＫ−エステル（登録商標）、ＢＩＧＣＨＡＰ（登録商標）、ＤｅｏｘＣＨＡＰ（登録商標）、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、およびＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を用いることができる。Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎ２０を用いると特に好ましい。
【００５４】
測定試料には、血液、尿、唾液等の体液等や、果汁等の食品を例示することができる。
【００５５】
つづいて、バイオセンサ１の製造方法の一例について説明する。
【００５６】
まず、基板を準備し、基板にスクリーン印刷、スパッタ法、または蒸着法等、公知の方法により、作用極１０２を形成させる。ついで、基板上に絶縁性ペーストをスクリーン印刷して絶縁膜３０を形成し、絶縁性基板１０１を得る。絶縁層３０は作用極１０２の外周を覆うように形成させる。そして、作用極１０２に並列するように、対極１０３および参照極１０５を設ける。
【００５７】
その後、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層１０４を絶縁性基板１０１上に設ける。具体的には、反応層１０４は、以下のようにして絶縁性基板１０１上に形成させることができる。
【００５８】
酸化型ＴＴＦ化合物、シクロデキストリン、界面活性剤及び酸化還元酵素を水性溶媒に混合調整し、絶縁性基板１０１の表面に塗布した後、乾燥させてバイオセンサ１を完成する。乾燥は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下で行うと好ましい。
【００５９】
つづいて、バイオセンサ１を用いて試料液中に含まれる基質濃度を測定する方法について説明する。
【００６０】
まず、測定試料を反応層１０４に添加する。測定試料の添加により反応層１０４が溶解し、試料中の基質と酸化還元酵素との反応、および、この反応に続く酸化還元酵素と電子受容体との反応が進行する。これら反応を進行させるため、バイオセンサ１を所定時間放置した後、対極１０３に対して作用極１０２にアノード方向にパルス電圧（０〜＋０．３Ｖ）を印加する。応答電流が発生し、応答電流値が公知の方法で測定される。あらかじめ既知の濃度の基質を用いて作成した基質濃度と応答電流値との検量線を用いて、得られた応答電流値から基質濃度を求める。
【００６１】
つづいて、バイオセンサ１の作用および効果について図１、２を用いて説明する。
【００６２】
バイオセンサ１によれば、電子受容体として酸化型ＴＴＦ化合物を用いる。これにより、酸化型ＴＴＦ化合物は、基質と反応して還元された酸化還元酵素と直接反応することができる。したがって、酸化還元酵素との反応によって生成されたＴＴＦ化合物の酸化電流のみが応答電流値として検出されることとなり、還元型の電子受容体を仕込んだときによりもベース電流を低くすることができる。よって、検出感度を低下させることなく、試料中の基質量を迅速に精度よく測定することが可能となる。
【００６３】
従来、ＴＴＦ化合物は電子受容体として用いられていた。しかしながら、酸化還元酵素は、酸化型ＴＴＦ化合物としか反応しない。そのため、ＴＴＦ化合物をそのまま反応層に仕込むと、ＴＴＦ化合物をいったん酸化型ＴＴＦ化合物に変換する必要があった。その結果、酸化反応時に発生する電流により、ベース電流が高くなるという問題があった。つまり、ベース電流が高くなることで、基質に対する応答電流が相対的に小さくなり、結果として検出感度が低下するという問題があった。
【００６４】
また、使用時に酸化型ＴＴＦ化合物を生成させると、酸化反応にばらつきがあり、バイオセンサの性能を低下させる原因にもなっていた。また、どの程度ＴＴＦ化合物が酸化されているのか予測することができず、どの程度電子受容体を仕込んでおけばよいかを見通しを立てることができなかった。
【００６５】
ところが、バイオセンサ１では、あらかじめ酸化型ＴＴＦ化合物を仕込んでおく。これにより、仕込みに必要な電子受容体の量を予測して、バイオセンサを設計することができる。これにより、個々のバイオセンサの性能を均一にすることができ、各チップ間でのばらつきを少なくすることができる。したがって、使い捨てのバイオチップであっても、安定した測定結果を得ることができる。また、所望の性能を有するバイオセンサを用意することも可能となる。
【００６６】
また、ＴＴＦ化合物を再び酸化型ＴＴＦ化合物に酸化するための印加電圧は、０〜＋０．３Ｖであって、フェロシアンを酸化するための印加電圧（＋０．４〜＋０．７Ｖ）よりも低い。したがって、ＴＴＦ化合物は、試料中に含まれる干渉物質の影響を受けにくく、高精度に試料中の基質濃度を定量することが可能となる。
【００６７】
さらに、酸化型ＴＴＦ化合物は、ＴＴＦ化合物を過酸化物と作用させて容易に調製することができる。したがって、フェリシウムイオンよりもコストの点で有利である。そのため、バイオセンサ１は、ディスポーザブル式のバイオセンサとして利用することが可能である。
【００６８】
また、バイオセンサ１は、反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物としてＴＴＦ化合物の２電子酸化体を採用することができる。２電子酸化体を用いることにより酵素反応により生じた電子とより迅速に反応することができる。したがって、試料中に含まれるグルコース等の基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【００６９】
また、バイオセンサ１は、反応層１０４に含有される酸化型ＴＴＦ化合物が反応層１０４の全体にわたって分布している構成を採用することができる。これにより、反応層１０４の全体にわたって、基質と作用した酸化還元酵素と迅速に反応することができる。したがって、試料中の基質濃度をさらに迅速に測定することができる。
【００７０】
さらに、バイオセンサ１は、電子受容体がシクロデキストリンで包接されている構成を採用することもできる。これにより、電子受容体の親水性を向上させることができる。したがって、電子受容体を電極に容易に塗布することが可能となる。
【００７１】
以上のように、バイオセンサ１によれば、検出感度を低下させることなく、迅速かつ高精度にグルコース等の基質を定量することができる。
【００７２】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００７３】
たとえば、図３で示すバイオセンサ２の構成を採用することもできる。バイオセンサ２は、反応層２０４が、酸化還元酵素を含む酵素層２０４ｂと、電子受容体を含むメディエーター層２０４ａと、を備える。酵素層２０４ｂはメディエーター層２０４ａに接しており、電極１０６の表面にメディエーター層２０４ａが設けられている。バイオセンサ２とバイオセンサ１とは、反応層１０４のかわりに反応層２０４を備える点で異なっている。メディエーター層２０４ａに含まれる酸化型ＴＴＦ化合物がメディエーター層２０４ａの全体にわたって分布している。
【００７４】
酸化還元酵素および電子受容体は反応層内を拡散するため、メディエーター層２０４ａが酸化還元酵素を含むこともあるし、酵素層２０４ｂが電子受容体を含むこともある。しかしながら、メディエーター層２０４ａは酵素層２０４ｂよりも高濃度かつ均一に酸化型ＴＴＦ化合物を含んでいる。また、酵素層２０４ｂはメディエーター層２０４ａよりも高濃度かつ均一に酸化還元酵素を含んでいる。
【００７５】
バイオセンサ２は、酸化型ＴＴＦ化合物がシクロデキストリン、ナフィオン（登録商標）や有機溶媒で包接されている構成を採用することができる。バイオセンサ１と同様に、シクロデキストリンで包摂させると特に好ましい。これにより親水性が向上するため、電極に塗布しやすくなる。
【００７６】
また、バイオセンサ２は、メディエーター層２０４ａと酵素層２０４ｂとの間に、界面活性剤を含む界面活性層を形成してもよい。界面活性剤としては、バイオセンサ１で用いられる界面活性剤と同様のものを採用することができる。
【００７７】
バイオセンサ２ではたとえば、以下のようにして絶縁性基板１０１上に反応層２０４を形成させることができる。
【００７８】
酸化型ＴＴＦ化合物を溶媒に溶解し、得られた酸化型ＴＴＦ化合物溶液を絶縁性基板１０１の表面に塗布して乾燥する。その後、作用極１０２、対極１０３、参照極１０５のそれぞれに酸化型ＴＴＦ化合物溶液を塗布し、再び乾燥させる。乾燥後、形成されたメディエーター層２０４ａの表面に、繰り返し、酸化型ＴＴＦ化合物溶液を塗布することで、均等にメディエーター層２０４ａを形成させることができる。塗布後、デシケーターに入れる等してメディエーター層２０４ａを念入りに乾燥させる。
【００７９】
ここで、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解させる溶媒は、酸化型ＴＴＦ化合物を溶解し、かつ、揮発しやすいものを用いると好ましい。たとえば、水、揮発性有機溶媒を用いることができ、アセトニトリルを使用するとより好ましい。
【００８０】
その後、界面活性剤の溶液を塗布し、さらにデシケーターに入れる等して乾燥させる。これにより、界面活性剤の層を形成させることができる。界面活性剤の存在により、メディエーター層２０４ａと酵素層２０４ｂとの界面に発生した還元型ＴＴＦ化合物の析出を防止することができる。
【００８１】
ついで、酸化還元酵素の溶液を塗布し、酵素層２０４ｂを形成させる。酸化還元酵素としてＧＯＤまたはグルコースデヒドロゲナーゼとすることにより、バイオセンサ２をグルコースセンサとすることができる。最後に、低温下で乾燥させてバイオセンサ２を完成させる。なお、乾燥時の温度は、酸化還元酵素が失活しない温度であり、かつ、至適温度以下とすると好ましい。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明のバイオチップの実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８３】
（酸化型ＴＴＦの調整方法、および、その測定方法）
１．アセトニトリル中でのＴＴＦの酸化
テトラチアフルバレン（ＴＴＦ）を１ｍＭとなるようアセトニトリルで調整した（以下、「ＴＴＦ溶液１」という）。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＣｌＯ４）３）を５００ｍＭとなるようアセトニトリルで調整した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１」という）。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１に、さらにアセトニトリルを加え、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）の濃度が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるように希釈した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液１」という）。ついで、ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるようアセトニトリルで希釈した（以下、「混合液１」という）。混合液１を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００８４】
結果を図４に示す。図４（ａ）は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液１の濃度別の吸収スペクトルを示す。図４（ｂ）は、混合液１の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。
【００８５】
ここで、ＴＴＦの１電子酸化体（化合物２）には４５０ｎｍおよび６００ｎｍのそれぞれに吸収があり、ＴＴＦの２電子酸化体（化合物３）には３７５ｎｍに吸収があることが報告されている。（Ｍ．Ａｓａｋａｗａ，Ｐ．Ｒ．Ａｓｈｔｏｎ，Ｖ．Ｂａｌｚａｎｉ，ｅｔ．ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１９９８，３７，Ｎｏ．３，３３３−３３７）。また、ＴＴＦは、３００ｎｍ付近ｎｍに吸収があることが知られている（Ｓ．Ｈｎｉｇ，Ｇ．Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ，Ｈ．Ｑｕａｓｔ，Ｄ．Ｓｃｈｅｕｔｚｏｗ，Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，３１０−３２３）。そこで、図４（ｂ）をみると、４３５ｎｍ、５８０ｎｍ、３６０ｎｍにそれぞれ吸収が認められる。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）の濃度が増加により、４３５ｎｍ、５８０ｎｍの吸収が強くなり、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）５０ｍＭでは、３６０ｎｍの吸収も認められる。一方、３００ｎｍ付近の吸収は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により、減少している。
【００８６】
以上のことから、混合液１中でＴＴＦが過塩素酸鉄（ＩＩＩ）により酸化されていることがわかった。よって、アセトニトリル中でＴＴＦの酸化は可能であった。
【００８７】
２．９０％アセトニトリル＋１０％超純水中でのＴＴＦの酸化
ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるよう、アセトニトリル、および、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液２」という）。混合液２を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。ついで、アスコルビン酸（ＡｓＡ）による再還元も行った。超純水で５ｍＭとなるようＡｓＡを調製した（以下、「ＡｓＡ溶液１」という）。ＡｓＡ溶液は、さらに０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度になるように調整した（以下、「ＡｓＡ希釈液」という。ＴＴＦ溶液１と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１とＡｓＡ溶液とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度が５０ｍＭ、ＡｓＡ濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度となるようアセトニトリル、および、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液３」という）。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液１およびＡｓＡ溶液１を混合し、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３が５０ｍＭ、ＡｓＡが０．１、０．２、０．５ｍＭの各濃度となるようアセトニトリル及び、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液４」という）。また、ＴＴＦ溶液１とＡｓＡ溶液１とを混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、ＡｓＡが０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０ｍＭの各濃度になるよう、アセトニトリル及び、超純水（最終濃度１０％）で調整した（以下、「混合液５」という）。混合液３〜５を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００８８】
結果を図５に示す。図５（ａ）は、混合液２の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｂ）は、ＡｓＡ希釈液の濃度別溶液の吸収スペクトルを示す。図５（ｃ）は、混合液４のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｄ）は、混合液５のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図５（ｅ）は、混合液３のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。
【００８９】
図５（ａ）で示すように、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収がそれぞれ増加した。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度が２５ｍＭ、５０ｍＭでは、それぞれ、３６０ｎｍに吸収が認められた。一方、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により３００ｎｍ付近の吸収は減少した。また、図５（ｅ）で示すように、ＡｓＡ濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収が減少した。一方、３００ｎｍ付近の吸収が増加した。
【００９０】
以上の結果から、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）によって酸化されたＴＴＦの１電子酸化体は、ＡｓＡによってＴＴＦに還元され、可逆的に酸化還元することがわかった。
【００９１】
３．超純水系でのＴＴＦの酸化
１０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ｈｐ−β−ＣＤ）を含む超純水にてＴＴＦを１ｍＭ（以下、「ＴＴＦ溶液２」という）、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３を５００ｍＭ（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２」という）に調整した。過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２は、さらに０、１、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍＭの各濃度になるように調整した（以下、「過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液２」という。ＴＴＦ溶液２と過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２とを混合し、１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水でＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が０、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０、１００ｍＭの各濃度になるよう調整した（以下、「混合液６」という）。混合液６を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。ついで、アスコルビン酸による再還元を行った。１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水でＡｓＡ溶液を調製した。（以下、「ＡｓＡ溶液２」という）ＴＴＦ溶液２、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２、及び、ＡｓＡ溶液２を混合し、ＴＴＦが０．１ｍＭ、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）が１０ｍＭ、ＡｓＡが各濃度となるよう１０％ｈｐ−β−ＣＤ含有超純水で調整した（以下、「混合液７」という）。ついで、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２とＡｓＡ溶液２とを混合し、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）溶液２が１０ｍＭ、ＡｓＡが０、０．０１、０．０２、０．０５ｍＭの各濃度になるようアセトニトリルで希釈した（以下、「混合液８」という）。混合液６〜８を超純水で１０倍に希釈し、分光光度計にてスペクトル測定した。
【００９２】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）希釈液２の濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｂ）は、混合液６の過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｃ）は、ＡｓＡ溶液２の濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｄ）は、混合液８のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。図６（ｅ）は、混合液７のＡｓＡ濃度別吸収スペクトルを示す。
【００９３】
図６（ｂ）で示すように、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍ、３６０ｎｍにおける吸収が増加している。一方、Ｆｅ（ＣｌＯ４）３濃度の増加により３００ｎｍ付近における吸収は減少している。また、図６（ｅ）で示すように、ＡｓＡ濃度の増加により４３５ｎｍ、５８０ｎｍにおける吸収が減少している。一方、ＡｓＡ濃度の増加により３００ｎｍ付近における吸収は増加している。したがって、水系でもＴＴＦを過塩素酸鉄（ＩＩＩ）により可逆的に酸化することが可能であった。また、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）によって酸化されたＴＴＦの１電子酸化体（化合物２）は、ＡｓＡによってＴＴＦ（化合物１）に還元され、可逆的に酸化還元することがわかった。
【００９４】
（酸化型ＴＴＦの精製方法）
図７は、固相抽出法を用いて酸化型ＴＴＦの精製方法を説明する図である。固相担体は、Ｃ１８（３００ｍｇ）を用い、アセトニトリル（２ｍＬ）を通液した（図７（ａ））ついで、超純水（３ｍＬ）を通液した（図７（ｂ））。その後、４０％アセトニトリルに溶解させたＴＴＦ（１０ｍＭ）、および、過塩素酸鉄（ＩＩＩ）（１Ｍ）の混液を３００μＬを添加した（図７（ｃ））。通液後、超純水（２〜３ｍＬ）で洗浄し、抽出液を５００μＬずつ分取した（図７（ｄ））。最後に、アセトニトリル（１−１．５ｍＬ）で溶出し、溶出液を５００μＬずつ分取した（図７（ｅ））。分取した各フラクションを分光光度計にてスペクトル測定した。また、アセトニトリルにより抽出した各フラクションを合わせて濃縮後乾燥し、残渣を得た。使用したＴＴＦが１００％酸化型ＴＴＦになったものとして、得られた残渣中の酸化型ＴＴＦの量を換算し、残渣にアセトニトリルを適量加えて酸化型ＴＴＦのアセトニトリル溶液を所望の濃度に調整した。各濃度に調整されたアセトニトリル溶液を４３５ｎｍにて吸光度測定し、酸化型ＴＴＦの換算濃度と吸光度との相関を調べた。
【００９５】
結果を図８に示す。図８（ａ）は、図７（ｄ）で示すステップにおいて、超純水により抽出した各フラクションの吸収スペクトルを示す。図８（ｂ）は、図７（ｅ）で示すステップにおいて、アセトニトリルにより抽出した各フラクションの吸収スペクトルを示す。図８（ｃ）は、４３５ｎｍの吸光度と酸化型ＴＴＦの換算濃度との関係を示したグラフである。
【００９６】
図８（ａ）から、超純水では酸化型ＴＴＦは溶出されにくいことがわかった。また、図８（ｂ）から、アセトニトリルで酸化型ＴＴＦを溶出できることがわかった。また、固相抽出してもＴＴＦは酸化された状態で存在することがわかった。さらに、４３５ｎｍの吸光度と換算した酸化型ＴＴＦ濃度との関係は十分な直線性が得られた。これを検量線として用い、ＴＴＦの一電子酸化体の濃度の指標とした。
【００９７】
（バイオセンサの作製方法）
１．メディエーター・酵素混合系
バイオセンサ１の構成と同様の構成を有するグルコースセンサＡ１、Ａ２を以下の方法により作製した。まず、カーボン作用極、銀／塩化銀参照極、カーボン対極が設けられたＰＥＴ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）基板を用意した。ついで、ＴＴＦまたはＴＴＦ１電子酸化体を超純水に溶解し、ｈｐ−β−ＣＤ（５％）、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（１％）、ＧＯＤ（１０Ｕ／μＬ）をそれぞれ添加した。その後、各溶液をそれぞれ５μＬチップ上に塗布することにより反応層を形成し、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。ＴＴＦ含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＡ１とし、ＴＴＦ１電子酸化体含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＡ２とした。
【００９８】
なお、ＴＴＦ１電子酸化体の溶液は、以下の方法により、所定の濃度に調整した。図７（ｅ）で示すステップで得られたアセトニトリルの溶出液の吸光度を測定する。図８（ｃ）で示す検量線を用い、吸光度の測定値から濃度に変換する。溶出液の容量を正確に量りとり、溶出液を乾燥させる。これにより、所定量の１電子酸化体の粉末を得る。この粉末を溶媒に溶解し、所定濃度に調整する。
【００９９】
２．メディエーター、酵素二層系
バイオセンサ２の構成と同様の構成を有するグルコースセンサＢ１、Ｂ２を以下の方法により作製した。まず、カーボン作用極、銀／塩化銀参照極、カーボン対極が設けられたＰＥＴ基板を用意した。ついで、ＴＴＦまたはＴＴＦ１電子酸化体それぞれの４ｍＭアセトニトリル溶液を１μＬずつ５回に分けて５μＬチップ上に塗布した。具体的には、１μＬ塗布し、乾燥後に再度１μＬを電極系上に塗布し、これを５回繰り返した。デシケーター内で乾燥後、５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００の水溶液１μＬを塗布した。その後、デシケーター内で乾燥し、脱塩した２０Ｕ／μＬのＧＯＤ溶液を２．５μＬ塗布し、２４時間以上冷蔵庫にて乾燥させた。ＴＴＦ含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＢ１とし、ＴＴＦ１電子酸化体含有溶液を塗布したものをグルコースセンサＢ２とした。
【０１００】
（電気化学測定）
標準サンプルとして、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．５）で調製したグルコース溶液を用意した。また、ボランティアによって採取されたヒト尿、およびこのヒト尿にグルコースを添加したもの尿サンプルとして用意した。サンプル５μＬを反応層に添加し、サンプル添加後１０秒後に、対極に対して作用極にアノード方向に電圧（０．３ｍＶ／ｖｓ）を印加し、応答電流の測定を開始した。開始後１分の電流値を測定値とした。測定に用いたグルコースセンサＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２は測定ごとに交換した。
【０１０１】
図９にグルコースセンサＡ１、Ａ２の結果を示す。図９（ａ）は、標準サンプルの結果を示す図である。図９（ｂ）は、図９（ａ）の拡大図である。図９（ｃ）は、尿サンプルの結果を示す図である。図９（ｄ）は、図９（ｃ）の拡大図である。○はグルコースセンサＡ１、△はグルコースセンサＡ２の結果を示す。各グラフの横軸はグルコース濃度（ｍＭ）を示し、縦軸は電流値（μＡ）を示す。図９で示すように、ＴＴＦ１電子酸化体を超純水で調製したチップは、ベース電流が低下した。
【０１０２】
図１０にグルコースセンサＢ１、Ｂ２の結果を示す。図１０（ａ）は、標準サンプルの結果を示す図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）の拡大図である。図１０（ｃ）は、尿サンプルの結果を示す図である。図１０（ｄ）は、図１０（ｃ）の拡大図である。○はグルコースセンサＢ１、□はグルコースセンサＢ２の結果を示す。各グラフの横軸はグルコース濃度（ｍＭ）を示し、縦軸は電流値（μＡ）を示す。グルコースセンサＢ２は、標準サンプルを用いた場合、４〜１０ｍＭの範囲で、良好な直線性が得られた。したがって、グルコースセンサＢ２は、低濃度グルコースを定量的に測定できることが示唆された。
【符号の説明】
【０１０３】
１ バイオセンサ
２ バイオセンサ
１０１ 絶縁性基板
１０２ 作用極
１０３ 対極
１０４ 反応層
１０５ 参照極
１０６ 電極
２０４ 反応層
２０４ａ メディエーター層
２０４ｂ 酵素層
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板に設けられている電極と、
前記電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層と、
を備え、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記酸化還元酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記反応層に含有される前記酸化型テトラチアフルバレンまたは前記酸化型テトラチアフルバレン誘導体が前記反応層の全体にわたって分布していることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記反応層は、前記酸化還元酵素を含む酵素層と、前記電子受容体を含むメディエーター層と、を含み、
前記酵素層は前記メディエーター層に接しており、
前記電極の表面に前記メディエーター層が設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記メディエータ層に含まれる前記酸化型テトラチアフルバレンまたは前記酸化型テトラチアフルバレン誘導体が前記メディエーター層の全体にわたって分布していることを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記電子受容体がシクロデキストリンで包接されていることを特徴とする請求項１乃至５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層に界面活性剤が含まれていることを特徴とする請求項１乃至６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記電子受容体が二電子酸化体であることを特徴とする請求項１乃至７いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項９】
基板を準備する工程と、
前記基板に電極を設ける工程と、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層を前記電極に接するように設ける工程と、
を含み、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８いずれかに記載のバイオセンサの使用方法であって、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層に試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と前記酸化還元酵素とを反応させるステップと、
反応した前記酸化還元酵素と前記電子受容体とを反応させるステップと、
反応した前記電子受容体に電位を印加するステップと、
前記電位を印加された前記電子受容体から発生する電流を測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法。
【請求項１】
基板と、
前記基板に設けられている電極と、
前記電極と接するように設けられ、酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層と、
を備え、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記酸化還元酵素がグルコース酸化酵素またはグルコース還元酵素であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記反応層に含有される前記酸化型テトラチアフルバレンまたは前記酸化型テトラチアフルバレン誘導体が前記反応層の全体にわたって分布していることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記反応層は、前記酸化還元酵素を含む酵素層と、前記電子受容体を含むメディエーター層と、を含み、
前記酵素層は前記メディエーター層に接しており、
前記電極の表面に前記メディエーター層が設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記メディエータ層に含まれる前記酸化型テトラチアフルバレンまたは前記酸化型テトラチアフルバレン誘導体が前記メディエーター層の全体にわたって分布していることを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記電子受容体がシクロデキストリンで包接されていることを特徴とする請求項１乃至５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層に界面活性剤が含まれていることを特徴とする請求項１乃至６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記電子受容体が二電子酸化体であることを特徴とする請求項１乃至７いずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項９】
基板を準備する工程と、
前記基板に電極を設ける工程と、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層を前記電極に接するように設ける工程と、
を含み、
前記電子受容体が酸化型テトラチアフルバレンまたは酸化型テトラチアフルバレン誘導体を含むことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８いずれかに記載のバイオセンサの使用方法であって、
酸化還元酵素および電子受容体を含む反応層に試料を添加するステップと、
添加された前記試料中の基質と前記酸化還元酵素とを反応させるステップと、
反応した前記酸化還元酵素と前記電子受容体とを反応させるステップと、
反応した前記電子受容体に電位を印加するステップと、
前記電位を印加された前記電子受容体から発生する電流を測定するステップと、
を含むバイオセンサの使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１３−６８６４３（Ｐ２０１３−６８６４３Ａ）
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−１０７６５（Ｐ２０１３−１０７６５）
【出願日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【分割の表示】特願２００８−２２０４１４（Ｐ２００８−２２０４１４）の分割
【原出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（０００１３３１７９）株式会社タニタ (303)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【分割の表示】特願２００８−２２０４１４（Ｐ２００８−２２０４１４）の分割
【原出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（０００１３３１７９）株式会社タニタ (303)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
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