バイオセンサおよびその製造方法
メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料溶液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサを提供する。電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する溶媒を塗布して、前記メディエータの自然酸化を防止する無機ゲル層を形成し、さらに、前記層上に、酸化還元酵素を含む酵素試薬層を形成してバイオセンサを製造できる。このバイオセンサは、前記無機ゲル層によって、測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータが、溶存酸素等により再酸化されることなく、電気化学的に測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象物を電気化学的に測定するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特定の測定対象物を含む試料液について、例えば、試料液の希釈や攪拌等を行わずに、簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオセンサが広く使用されている。このようなバイオセンサは、例えば、電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷等の方法によって作用極（測定極ともいう）と対極とを有する電極系を形成し、その上に、前記測定対象物と反応する酸化還元酵素およびメディエータ（電子伝達物質）等を含む試薬層を形成することにより作製できる（例えば、特許文献１参照）。この試薬層に、前記測定対象物を含む試料液を接触させると、前記酸化還元酵素の触媒作用によって、例えば、前記測定対象物が酸化され、前記メディエータが還元される。この還元されたメディエータ（以下、「還元型メディエータ」という）を、前記電極系を用いた電気化学的手法により再酸化し、これにより得られた酸化電流値から前記試料液中の測定対象物の濃度が算出できる。
【０００３】
しかしながら、反応雰囲気中に酸素が存在したり、試料液中に溶存酸素が存在する場合、前記還元型メディエータは、前述のように電気化学的に再酸化されるだけでなく、前記酸素によっても再酸化されてしまう。このため、電気化学的な再酸化による酸化電流値に誤差が生じ、測定精度が低下するという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避する方法として、例えば、窒素雰囲気下での測定等が考えられるが、これでは手間がかかり操作も煩雑となる。また、全く酸素が無い条件下では、酵素反応に酸素を必要とする酸化還元酵素を使用することができないという問題もあり、適用範囲が非常に狭くなる。
【特許文献１】特開平１−２９１１５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含む製造方法である。
【０００７】
また、本発明のバイオセンサは、前記本発明の製造方法により製造したバイオセンサである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、バイオセンサについて、試料中の測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータ（還元型メディエータ）が自然酸化されることを防止すべく、鋭意研究を行った。その結果、一般に、例えば、層状無機化合物によって無機ゲル層が形成されることは知られているが、無機ゲル層がさらに界面活性剤および緩衝剤を含有することによって、前記還元型メディエータの自然酸化を防止する効果を発揮する無機ゲル層を形成できることを見出した。このような方法によって、前記自然酸化防止の効果が得られることは、本発明者らが初めて見出した事である。前述のような方法で無機ゲル層を形成すれば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための前記還元型メディエータが、例えば、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できる。このため、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消された、測定精度に優れるバイオセンサを提供できる。なお、本発明において、「前記メディエータの自然酸化」とは、例えば、バイオセンサの使用時における液体試料中の溶存酸素や、空気中の水分に吸収された酸素（例えば、保存時に空気中水分が空気中酸素を吸収する）によって、前記メディエータが酸化されることをいう。
【０００９】
界面活性剤および緩衝剤存在下で無機ゲル層を形成することによって、酸化防止機能が発揮されるのは、おそらく以下に示すメカニズムによると推測される。
【００１０】
例えば、前記メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布して形成された前記無機ゲル層内においては、前記メディエータが前記層状無機化合物のシート内にしっかりとはまり込んだ複合体を形成し、前記メディエータが液体試料等に含まれる溶存酸素と接触するのを防止していると考えられる。通常、試料液中には酸素が溶存しているため、前述のように層状無機化合物が水をシャットアウトすることにより、前記メディエータに対する前記溶存酸素の攻撃を防止できるのである。そして、前述のようにさらに界面活性剤が存在することによって、層状無機化合物とメディエータとが重合して不溶化することなく、これらの複合体が分散された状態となり、前記効果を十分に発揮できる無機ゲル層を形成できるのである。
【００１１】
また、前記分散液が緩衝剤を含むことによって、均一な無機ゲル層の形成が可能になり、酸化防止機能をより一層向上することができるのである。これは、前記緩衝剤が、前記メディエータと層状無機化合物との複合体を形成する際にバインダーとして作用するためと考えられる。このバインダーとしての作用によって、メディエータと層状無機化合物との結合がより一層強固となった複合体が形成されるため、例えば、溶存酸素を含む液体をさらにシャットアウトでき、酸素によるメディエータの再酸化が防止できる。一方、この場合、前記界面活性剤は、前記緩衝剤と、層状無機化合物およびメディエータとが、重合体を形成して分散不可能になることを防止する、いわゆるブロック剤としての機能も果たすと考えられる。
【００１２】
本発明のバイオセンサは、前述のような方法で製造することによって、例えば、メディエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できる。このため本発明のバイオセンサは、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消され、測定精度に優れる。
【００１３】
本発明の製造方法によって得られるバイオセンサは、酸化還元酵素からメディエータへの電子の授受は、水ではなく、前記層状無機化合物の層間、つまり電気二重層を介して行われると考えられる。このため、水分が前記無機ゲル層によってシャットアウトされる本発明のバイオセンサによれば、例えば、高湿度環境等においても劣化を防止できるという効果を奏するのである。また、前記層状無機化合物の電気二重層は、水よりも電子を通し易いため、反応速度の増大にもつながると考えられる。
【００１４】
また、本発明の製造方法によるバイオセンサは、上述のような酸素の遮断によって、例えば、酸化による電極の錆の発生等も防止できる。
【００１５】
なお、本発明において、前記メディエータの自然酸化を防止する無機ゲル層を、「酸化防止層」ともいう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
［図１］図１は、本発明の実施形態において、バイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であり、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、各工程を示す。
［図２］図２は、前記実施形態におけるバイオセンサの断面図である。
［図３］図３は、本発明の実施例において、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図（Ａ）が実施例、同図（Ｂ）が比較例の結果をそれぞれ示す。
［図４］図４は、本発明のその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
［図５］図５は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
［図６］図６は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において、前記層状無機化合物は、層状粘土鉱物であることが好ましく、特に好ましくは膨潤性粘土鉱物である。
【００１８】
前記層状無機化合物とは、例えば、無機物の多面体が平面状に連なってシート構造を形成し、このシート構造がさらに層状に重なって結晶構造を形成したものということができる。前記多面体の形状としては、例えば、四面体シート、八面体シート等があり、具体的には、例えば、Ｓｉ四面体、Ａｌ八面体等があげられる。このような層状無機化合物としては、例えば、層状粘土鉱物、ハイドロタルサイト、スメクタイト、ハロイサイト、カオリン鉱物、雲母等が含まれる。
【００１９】
前記層状粘土鉱物とは、一般に、粘土（細かい土状の無機粒状物で、水で湿った状態において可塑性を示すもの）の大半を占めるアルミニウムケイ酸塩鉱物があげられ、これは、通常、Ｓｉが４つの酸素原子（Ｏ）に囲まれたＳｉ四面体と、ＡｌまたはＭｇが６つの水酸基（ＯＨ基）あるいは６つの酸素原子に囲まれたＡｌ八面体またはＭｇ八面体とを最小構成単位としている。
【００２０】
前記層状粘土鉱物の構造としては、例えば、前記Ｓｉ四面体が他のＳｉ四面体と１つの面を共有して、残る頂点の酸素原子を同方向に向けて六角網状のシートを形成し（以下「四面体シート」という）、一方、Ａｌ八面体またはＭｇ八面体が他の八面体と稜角を共有してシートを形成し（八面体シート）、前記四面体シートと前記八面体シートとが層状に積層された構造があげられる。具体的には、例えば、前記四面体シートと前記八面体シートとが１枚ずつ重なった１：１層が、さらに何層も積層された構造の鉱物を１：１型鉱物；２枚の四面体シートで１枚の八面体シートを挟んだ２：１層が、さらに何枚も積層された構造の鉱物を２：１型鉱物；前記２：１層の層間に、さらにもう一枚の八面体シートが挟まれた構造の鉱物を２：１：１型鉱物と、それぞれ呼ばれている。また、例えば、八面体シートが、Ｍｇ（ＯＨ）２で全ての八面体位置に金属イオンを有するものを３八面体型（Ｔｒｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ）といい、八面体シートが、Ａｌ（ＯＨ３）で１／３が空孔になっているものを２八面体型（Ｄｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ）という。この中でも、本発明における前記層状無機化合物としては、２：１型鉱物が好ましい。
【００２１】
前記層状無機化合物を構成する元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、酸素、水素、フッ素、炭素等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上で構成されてもよい。特に制限されないが、具体例として、例えば、下記式（１）〜（９）に示す化合物等があげられ、これらの化合物は、例えば、結晶水を含んでもよい。これらの下記式は、鉱物学的または化学的に純粋な化合物としての式であるが、実際には、例えば、ケイ酸ナトリウムなどの不純物を含む場合がある。このため、元素分析等によって化学式を定めた場合、これらの式と必ずしも一致しないことは、例えば、文献（Ｄ．Ｗ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，１５１，２３６−２４３（１９９２））等においても記載されている。
【００２２】
ＭｘＳｉ４（Ａｌ２−ｘＭｇｘ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（１）
前記式（１）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、は２未満の正数である。
【００２３】
Ｍｘ（Ｓｉ４−ｘＡｌｘ）Ａｌ１２Ｏ１０Ｘ２ ・・・（２）
前記式（２）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは４未満の正数である。
【００２４】
ＭｘＳｉ４（Ｍｇ３−ｘＬｉｘ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（３）
前記式（３）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは３未満の正数である。
【００２５】
Ｍｘ（Ｓｉ４−ｘＡｌｘ）Ｍｇ３Ｏ１０Ｘ２ ・・・（４）
前記式（４）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは４未満の正数である。
【００２６】
ＭＳｉ４Ｍｇ２．５Ｏ１０Ｘ２ ・・・（５）
前記式（５）において、Ｍは、好ましくはＬｉおよびＮａの少なくとも一方であり、より好ましくはＮａであり、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、より好ましくはＦである。
【００２７】
Ｍ２Ｓｉ４Ｍｇ２Ｏ１０Ｘ２ ・・・（６）
前記式（６）において、Ｍは、好ましくはＬｉおよびＮａの少なくとも一方であり、より好ましくはＬｉであり、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、より好ましくはＦである。
【００２８】
Ｍｇ６Ａｌ１２（ＯＨ）１６Ｘｘ ・・・（７）
前記式（７）において、Ｘは、好ましくはハロゲン、ＮＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３およびＯＨからなる群から選択された少なくとも一つの基およびアニオン型有機酸の少なくとも一方であって、より好ましくはＣＯ３であり、ｘは、Ｘがハロゲン、ＯＨ、ＮＯ３または一価有機酸のとき、好ましくは２であって、ＸがＳＯ４、ＣＯ３または二価の有機酸のとき、好ましくは１である。
【００２９】
Ｎａ０．３３Ｓｉ４（Ｍｇ２．６７Ｌｉ０．３３）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（８）
前記式（８）において、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、好ましくはＯＨである。
【００３０】
Ｎａａ−ｂ（Ｓｉ４−ａＡｌａ）（Ｍｇ３−ｂＡｌｂ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（９）
前記式（９）において、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、好ましくはＯＨであり、ａは、好ましくは４未満の正数であり、ｂは、好ましくは３未満の正数であり、ａ−ｂ＞０であることが好ましい。
【００３１】
前記層状無機化合物の具体例としては、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋石等の１：１型粘土鉱物；タルク、パイロフィライト、スメクタイト、バーミキュライト（前記式（２）で表されるもの、以下同様）、フッ素四ケイ素雲母（前記式（５））やテニオナイト（前記式（６））を含む雲母等の２：１型粘土鉱物；クロライト等の２：１：１型粘土鉱物；２：１〜２：１：１型の中間鉱物；イモゴライト等の準晶質粘土鉱物；アロフェン等の非晶質粘土鉱物；ハイドロタルサイト（前記式（７））等が挙げられる。
【００３２】
また、スメクタイトには、例えば、同型置換された四面体、八面体格子中のイオン種によってモンモリロナイト（前記式（１））、モンモリロナイトが４０〜８０％含まれる天然物であるベントナイト、バイデライト（前記式（２））等の２八面体型；ヘクトライト（前記式（３）、好ましくは前記式（８））、サポナイト（前記式（４）、好ましくは前記式（９））、ノントロナイト等の３八面体型等が含まれる。
【００３３】
ハイドロタルサイトは、例えば、前記式（７）で表わされる。具体的には、例えば、Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６ＣＯ３・４Ｈ２Ｏで表される層状鉱物であって、Ｍｇ（ＯＨ）２（ブルーサイト：中心にＭｇ２＋を持つ酸素八面体の層が積み重なった構造を持つ）のＭｇ２＋の一部が、Ａｌ３＋に同型置換している。これは正電荷を有するが、層間のＣＯ３２−によって電気的中性を保っており、陰イオン交換能をもつものである。なお、ケイ酸塩鉱物ではないが、通常、粘土鉱物として取り扱われる。
【００３４】
前述のような層状無機化合物の組成の例を、下記表１に示す。なお、下記表１において、「ＭＩ」は、１価陽イオンで代表させた交換性陽イオンを示し、例えば、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等である。
【００３５】
【００３６】
前記層状無機化合物の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、溶媒に対して均一に分散できる程度の粒径であることが好ましい。前記層状無機化合物は、一般に板状の粒子であり、かつ、複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡にあるため、平均粒径を定義すること自体が困難であるが、例えば、光散乱法や電子顕微鏡を用いた観察等の手段により測定した場合に、水中に分散させた状態で、１ｎｍ〜２０μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜２μｍの範囲である。
【００３７】
これら粘土鉱物等の層状無機化合物は、例えば、４級アンモニウム塩等のピラーを立てて、層間距離や層間の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。
【００３８】
前述のような層状無機化合物のうち、より好ましくは２：１型粘土鉱物であり、特に好ましくはイオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。
【００３９】
前記膨潤性粘土鉱物のうち、より好ましくはベントナイト、スメクタイト、バーミキュライト、合成フッ素雲母等であり、特に好ましくは合成ヘクトライトや合成サポナイト等の合成スメクタイト；合成フッ素雲母に代表される膨潤性合成雲母；Ｎａ型雲母等の合成雲母（天然の雲母は、通常、非膨潤性の粘土鉱物である）等である。これらの層状無機化合物は、単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４０】
このような層状無機化合物としては、例えば、市販品が使用でき、コープケミカル（株）製の商品名ルーセンタイトＳＷＮ、商品名ルーセンタイトＳＷＦ（合成ヘクトライト）、商品名ＭＥ（フッ素雲母）、クニミネ工業（株）製の商品名スメクトンＳＡ（合成サポナイト）、協和化学工業（株）製の商品名チキソピーＷ（合成ヘクトライト）、商品名キョーワード５００（合成ハイドロタルサイト）、ラポー社製の商品名ラポナイト（合成ヘクトライト）、（株）ナカライテスク社製の天然ベントナイト、（株）豊順鉱業社製の商品名マルチゲル（ベントナイト）等が挙げられる。
【００４１】
本発明において、前記界面活性剤としては両性界面活性剤が好ましく、より好ましくは、例えば、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する両性界面活性剤であり、例えば、アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等があげられる。これらの中でも、さらに好ましくは、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している両性界面活性剤であり、例えば、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等である。具体的には、前記カルボキシベタインとして、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン等、前記スルホベタインとして、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびアルキルヒドロキシスルホベタイン等が使用できる。これらの中でも好ましくは、スルホベタインであり、より好ましくはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、特に好ましくはＣＨＡＰＳである。
【００４２】
本発明において、前記緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましく、例えば、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴｒｉｃｉｎｅおよびＡＤＡ等があげられ、好ましくはＡＣＥＳ、Ｔｒｉｓであり、より好ましくはＡＣＥＳである。これらの物質は、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
【００４３】
また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましく、例えば、酢酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、コハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤等があげられ、この中でもコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤が好ましい。
【００４４】
前記アミン系緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、ＴｒｉｓとＣＨＡＰＳ、ＡＣＥＳとＣＨＡＰＳ、ＡＣＥＳとＣＨＡＰＳＯの組み合わせ等があげられ、より好ましくはＣＨＡＰＳとＡＣＥＳである。また、カルボキシル基と有する緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、コハク酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯ、マロン酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳ、リンゴ酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯ、酢酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳ等が挙げられ、好ましくはコハク酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳの組合わせである。
【００４５】
本発明において、前記メディエータとしては、例えば、後述するような酸化還元酵素と測定対象物との反応によって還元型となり、電気化学的に酸化され、酸化電流によって検出できるものが好ましく、従来公知のものが使用できる。
【００４６】
具体的には、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、インドフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール誘導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メチレンブルー、ｃｙｔｏｃｈｔｏｍｅ ｃ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ、銅錯体等が使用できる。これらの中でも、好ましくはフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等が使用できる。
【００４７】
また、この他にも、例えば、１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，１’−ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，４−ジアミノベンゼン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、Ｎ−メチルフェナジニウム塩、１−ヒドロキシ−５−メチルフェナジニウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム塩、９−ジメチルアミノベンゾアルファフェノキサジン−７−イウム塩、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン １０−オキシド、３，７−ジアミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、３−（ジエチルアミノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、１，４−ベンゼンジオール、１，４−ジヒドロキシ−２，３，５−トリメチルベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ベンゼンジアミン、Δ２，２’−ビ−１，３−ジチオール、２，６−ジメチルベンゾキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，３，５，６−テトラメチル−２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジオン、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３−イミノ−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウム塩等がメディエータとして使用できる。
【００４８】
本発明の製造方法において、前記無機ゲル層は、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、形成することが好ましい。
【００４９】
また、本発明においては、前記無機ゲル層の上に、酸化還元酵素を含有する層を形成し、積層体の試薬層としてもよいし、または、前記分散液にさらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を電極表面に形成し、単層の試薬層としてもよい。このように単層の試薬層を形成する場合、酸化還元酵素を含有する層とメディエータを含有する層とを別途形成する必要がないため、製造が一層簡便となる。このようなバイオセンサは、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）のように、酵素反応に、酸素を必要としない酵素を使用する場合、特に好ましい。
【００５０】
前記酸化還元酵素としては、例えば、試料中の測定対象物および前記メディエータと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、測定対象物の種類等に応じて適宜決定できる。
【００５１】
具体的には、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ等があげられる。
【００５２】
前記酸化還元酵素と前記メディエータとの組み合わせは、特に制限されないが、例えば、ＧＯＤとフェリシアン化カリウム、ＧＤＨとルテニウム錯体、コレステロールデヒドロゲナーゼとフェロセン、アルコールデヒドロゲナーゼと銅錯体の組み合わせ等があげられる。
【００５３】
（実施形態１）
本発明の第１のバイオセンサ製造方法の一例について、図１および図２に基づいて説明する。図１（Ａ）〜（Ｆ）は、バイオセンサを製造する一連の工程を示した斜視図である。また、図２は、前記図１（Ｆ）に示すバイオセンサのＩ−Ｉ方向断面図である。なお、図１（Ａ）〜（Ｆ）および図２において、同一箇所には同一符号を付している。
【００５４】
図１（Ｆ）および図２に示すように、このバイオセンサ１は、基板１１、リード部１２ａを有する作用極１２とリード部１３ａを有する対極１３とから構成された電極系、絶縁層１４、メディエータと層状無機化合物と界面活性剤とを含む無機ゲル層（酸化防止層）１６、酸化還元酵素を含む酵素試薬層１７、開口部を有するスペーサー１８および貫通孔２０を有するカバー１９を備えている。図１（Ｂ）に示すように、基板１１の一方の端部（両図において右側）上には、検出部１５が設けられており、検出部１５には、作用極１２と対極１３とが、基板１１の幅方向に並行して配置されている。前記両電極の一端は、それぞれリード部１２ａ、１３ａ（両図において左側）となり、これらと、検出部１５における他端とが、垂直となるように配置されている（図１（Ａ））。また、作用極１２と対極１３との間は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板１１の上には、図１（Ｂ）に示すように、リード部１２ａ、１３ａおよび検出部１５を除いて、絶縁層１４が積層されており、絶縁層１４が積層されていない前記検出部１５上には、無機ゲル層１６および酵素試薬層１７がこの順序で積層されている。そして、絶縁層１４の上には、図１（Ｅ）に示すように、検出部１５に対応する箇所が開口部になっているスペーサー１８が配置されている。さらにスペーサー１８の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔２０を有するカバー１９が配置されている（図１（Ｆ））。このバイオセンサ１において、前記開口部の空間部分であり、かつ、前記酵素試薬層１７および絶縁層１４とカバー１９とに挟まれた空間部分が、キャピラリー構造の試料供給部２１となる。そして、前記貫通孔２０が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
【００５５】
このバイオセンサ１の大きさは、特に制限されず、供給する試料の量等により適宜設定できるが、例えば、全体長さ５〜５０ｍｍ、全体幅１〜５０ｍｍ、最大厚み２０００〜５００μｍ、最小厚み５０〜５００μｍである。なお、「長さ」とは、バイオセンサの長手方向の長さをいい、「幅」とは、幅方向の長さをいう（以下、同じ）。
【００５６】
基板１１の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０００〜１０μｍであり、絶縁層１４の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜２００μｍであり、検出部１５の大きさは、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍであり、無機ゲル層１６の大きさは、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍ、厚み０．００１〜５００μｍであり、酵素試薬層１７の大きさは、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍ、厚み０．００１〜５００μｍである。スペーサーの大きさは、例えば、長さ１〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜１０００μｍであり、その開口部は、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．０１〜１０ｍｍである。カバー１９の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜１０００μｍであり、その貫通孔は、例えば、直径０．１〜１０ｍｍである。
【００５７】
無機ゲル層１６における層状無機化合物の含有量は、供給する試料の種類やその量、検出部１５の面積等に応じて適宜決定できるが、例えば、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、０．００３〜３０ｍｇの範囲、好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。具体的に、前記層状無機化合物がスメクタイトの場合、例えば、前記面積１ｃｍ２当たり、０．００３〜３０ｍｇの範囲、好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。前記含有量が面積１ｃｍ２当たり０．００３ｍｇ以上であれば、例えば、十分に酸素遮断効果を発揮でき、また、面積１ｃｍ２当たり３０ｍｇ以下であれば、酵素遮断効果および再現性、反応性をより一層向上できる。なお、前記面積当たりの層状無機化合物の量は、無機ゲル層１６の厚みに関係しており、前述のように、層の厚みは、０．００１〜５００μｍの範囲が好ましい。
【００５８】
また、無機ゲル層１６における界面活性剤（例えば、両性界面活性剤）の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定できるが、層状無機化合物３００ｍｇに対して、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌの範囲、好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲である。
【００５９】
また、無機ゲル層１６におけるメディエータの含有量は、例えば、測定試料の種類、測定対象物の種類、後述する酵素試薬層における酸化還元酵素の量等によって適宜決定できるが、例えば、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、１０ｍｍｏｌ〜１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１０ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１５ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００６０】
この無機ゲル層１６は、さらに緩衝剤を含有してもよい。無機ゲル層１６における前記緩衝剤の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定でき、層状無機化合物０．３ｇに対して、緩衝剤は、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００６１】
前記酵素試薬層１７における酸化還元酵素の含有量は、特に制限されず、試料の種類やその量、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定できる。具体的には、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、例えば、０．１Ｕ〜１００ＫＵの範囲であり、好ましくは、１Ｕ〜１０ＫＵの範囲であり、より好ましくは１Ｕ〜１００Ｕの範囲である。
【００６２】
また、酵素試薬層１７中の酵素量と前記無機ゲル層１６中のメディエータとの割合は、例えば、酵素１０００Ｕあたり、メディエータ０．０１〜１Ｍの範囲、好ましくは０．０１〜０．５Ｍの範囲、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。
【００６３】
このようなバイオセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。
【００６４】
まず、電極系を形成するための基板１１を準備する。前記基板１１の材料としては、電気絶縁性材料が好ましく、例えば、プラスチック、ガラス、紙、セラミックス、ゴム等があげられる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、アクリル樹脂、ガラスエポキシ等があげられる。
【００６５】
つぎに、図１（Ａ）に示すように、基板１１上にリード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する対極１３からなる電極系を形成する。なお、電極の形状は、図１（Ａ）に示す形状には何ら制限されない。前記電極としては、カーボン電極、金電極、パラジウム電極、白金電極等が好ましく、その種類に応じて、例えば、スクリーン印刷、コーティング法、蒸着法等の公知の方法により形成できる。
【００６６】
カーボン電極の場合は、例えば、カーボンインキを前記基板１１上にスクリーン印刷する手段、コーティングする手段等により形成できる。
【００６７】
また、前記金電極は、例えば、蒸着法、メッキ法、スパッタ法、金箔貼付法等により形成できる。前記蒸着法は、例えば、イオンプレーティング法により、真空度１．３３×１０−４Ｐａ、入力パワー３００Ｗ、レート５×１０−１ｎｍ／秒、時間２分の条件で、例えば、ＰＥＴなどのプラスチックシート上に金を蒸着して、さらにキスカット装置を用いて、前記シート上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。これにより、切れ目部分が絶縁部となり、作用極および対極からなる電極系が形成できる。
【００６８】
続いて、図１（Ｂ）に示すように、前記電極系１２、１３を形成した基板１１上に絶縁層１４を形成する。この絶縁層は、電極のリード部１２ａ、１３ａ（図１（Ｂ）において左側）と、後述する無機ゲル層等を形成する検出部１５を除いた基板１１上に形成する。
【００６９】
前記絶縁層１４は、例えば、絶縁性樹脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板１１上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。
【００７０】
前記絶縁性樹脂としては、例えば、ポリエステル、ブチラール樹脂、フェノール樹脂等があげられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（ＤＢＥソルベント）等があげられる。前記ペーストにおける前記絶縁性樹脂の濃度は、例えば、６５〜９５重量％の範囲が好ましく、より好ましくは７５〜９０重量％の範囲であり、特に好ましくは８０〜８５重量％の範囲である。
【００７１】
前記加熱処理の条件は、使用する前記絶縁性樹脂の種類に応じて適宜決定できる。
【００７２】
なお、前記絶縁層１４は、前記印刷法以外に、例えば、コーティング、膜はりつけ、エッチング等の方法によっても形成できる。
【００７３】
次に、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４が形成されていない検出部１５において、基板１１および電極１２、１３上に、無機ゲル層１６を形成する。無機ゲル層１６は、例えば、メディエータおよび界面活性剤を含み、かつ前記層状無機化合物が分散された分散液を調製し、これを前記検出部１５に分注して、乾燥することによって形成できる。なお、この無機ゲル層１６は、必ずしも常時ゲル状である必要はなく、使用前は、前記乾燥工程によって乾燥した状態であってもよく、液体試料等を含浸した場合に、ゲル状となることが好ましい。
【００７４】
前記分散液の調製に使用する溶媒としては、例えば、水、緩衝液アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用でき、この中でも好ましくは超純水である。
【００７５】
前記分散液における前記層状無機化合物の濃度は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また、前記分散液における前記界面活性剤の濃度は、例えば、１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭの範囲であり、より好ましくは１〜１０ｍＭの範囲である。
【００７６】
また、分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合としては、前記層状無機化合物３００ｍｇに対して、界面活性剤が、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌの範囲、好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲である。
【００７７】
また、前記分散液における前記メディエータの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲であり、好ましくは１００〜８００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２００〜５００ｍＭの範囲であり、特に好ましくは３００ｍＭ付近である。
【００７８】
前記分散液は、さらに、前述のようなアミン系等の緩衝剤を含むことが好ましく、この場合、前記緩衝剤の濃度は、例えば、１〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲である。また、層状無機化合物に対する前記緩衝剤の添加割合としては、前記層状無機化合物０．３ｇに対して、前記緩衝剤が、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００７９】
また、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加量は、例えば、前述のように無機微粒子に対する割合で決定できるため、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、特に制限されないが、例えば、Ａ：Ｂ＝１：１〜１：２５０の範囲であり、好ましくは１：１０〜１：１００の範囲であり、より好ましくは１：２５〜１：５０の範囲である。
【００８０】
前記溶媒に対する、前記メディエータ、前記層状無機化合物および界面活性剤等の各成分の添加順序は特に制限されないが、例えば、まず、前記溶媒に層状無機化合物を添加し、十分に攪拌した後、界面活性剤を添加する。そして、さらに前記緩衝剤を添加してから、最後にメディエータを溶解することが好ましい。この順序によると、メカニズムは不明であるが、より一層均一で、酸素との接触が防止される無機ゲル層を形成することができる。なお、前記緩衝剤は、界面活性剤と共に添加してもよいが、特に好ましくは、界面活性剤の添加後である。
【００８１】
また、前記分散液の調製方法は特に制限されないが、例えば、使用するメディエータの種類等に応じて、ｐＨの調整や使用する緩衝剤の種類を選択することが好ましい。以下に、メディエータの種類に応じた具体的な例をあげる。
【００８２】
まず、中性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合の例を説明する。一般に、スメクタイトのような層状無機化合物（無機ゲル）は、水等の溶媒に溶解すると透明化するが、その分散液のｐＨは高アルカリ性（ｐＨ１０付近）である。一方、中性付近での使用が好ましいメディエータや酵素等は、安定なｐＨ条件下、すなわち、中性付近で添加することが好ましい。ところが、無機ゲルは、中性付近で白濁したり沈殿が生じる場合がある。この場合に、緩衝剤として前述のようなアミン系緩衝剤を添加すれば、前記分散液のｐＨを中性付近に調整でき、且つ、メカニズムは不明であるが、中性付近であるにもかかわらず、沈殿を生じることもなく、メディエータを添加することができるのである。そして、結果として、前述のように、メディエータの再酸化を十分に防止できる無機ゲル層を確実に形成できるのである。なお、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加してから、アミン系緩衝剤を添加することによって、調製する分散液の白濁や沈殿を十分に防止できることも、本発明者らがはじめて見出したことでさる。具体的な添加順序としては、層状無機化合物の分散液に、界面活性剤を添加した後、アミン系緩衝剤を添加することが好ましい。アミノ系緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨは、例えば、９〜５の範囲であり、好ましくは８〜６であり、より好ましくは７．５〜７である。
【００８３】
中性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、ファリシアン化カリウム、シトクロムＣ、ＰＱＱ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、銅錯体等があげられる。
【００８４】
また、酸性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合には、以下のような調製方法が好ましい。前述のように、一般に、層状無機化合物（無機ゲル）を溶媒に溶解すると透明化し、その分散液のｐＨは強アルカリ性となる。この場合、酸性付近での使用が好ましいメディエータを添加するためには、例えば、前記分散液にＨＣｌのような酸を添加して、前記分散液のｐＨを酸性側に調整し、前記界面活性剤を添加した後に、前述のようなカルボキシル基を有する緩衝剤を添加してｐＨ調整を行い、メディエータを添加することが好ましい。
【００８５】
このような方法が好ましいのは以下の理由による。スメクタイトのような無機層状化合物は、その分散液にＨＣｌ等の酸を添加して、強酸性条件とすると（例えば、ｐＨ２付近）、一旦は白濁して凝集を生じるが、さらに攪拌を続けることによって（例えば、２４時間程度）、酸性側であっても分散液を透明化できることを、本発明者らは見出した。しかし、この状態の分散液では、前述のようにバインダーとなる緩衝剤が入っておらず、緩衝剤による効果が得られない上に、酵素を使用することを考慮すると、ｐＨ２等の強酸性では、酵素が失活するおそれがある。そこで、さらなる検討によって、本発明者らは、強酸性付近で透明化している分散液に、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加した後、カルボキシル基を有する緩衝剤を添加して、メディエータや酵素の各成分に支障をきたさないｐＨ（例えば、ｐＨ４．５付近）に設定することで、沈殿の発生を十分に防止し、メディエータや酵素を十分に安定な状態で使用できることを見出したのである。
【００８６】
前記分散液のｐＨは、はじめに１〜３の強酸性とすることが好ましく、より好ましくは１．５〜２である。使用する酸としては、特に制限されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸等である。強酸性下での前記分散液の攪拌条件は、特に制限されないが、攪拌時間が、例えば、１２〜７２時間であり、好ましくは１８〜４８時間であり、特に好ましくは２４〜３０時間である。また、カルボキシル基を有する緩衝剤の添加によって、前記分散液のｐＨは、３〜６に設定することが好ましく、より好ましくは４〜５であり、特に好ましくは４．５〜４．８である。
【００８７】
酸性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フェロセン、フェナジンメトサルフェート、インドフェノール、メチレンブルー等が挙げられる。
【００８８】
前記溶媒に、層状無機化合物、界面活性剤および緩衝剤を添加した後は、一時静置しておくことが好ましく、静置時間は、例えば、２４時間以上が好ましく、より好ましくは３日以上である。
【００８９】
この分散液の検出部１５への注入割合は、例えば、検出部１５の大きさ、分散液における前記層状無機化合物等の含量、前記層状無機化合物の種類等によって適宜決定できる。具体的には、検出部１５の面積当たり（ｃｍ２）、例えば、前記層状無機化合物０．００３〜３０ｍｇの範囲になるように前記分散液を注入することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲であり、特に好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。したがって、分散液の層状無機化合物の濃度が、０．３重量％の場合、検出部の面積当たり（ｃｍ２）、例えば、０．００１〜１０ｍＬの範囲を注入することが好ましく、より好ましくは０．０３〜３．３ｍＬの範囲であり、特に好ましくは０．１〜１ｍＬの範囲である。
【００９０】
また、前記分散液を検出部１５に注入する方法は、特に制限されないが、例えば、自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。
【００９１】
注入した前記分散液を乾燥する手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。また、これらの手段を組み合わせてもよい。その処理温度は、１０〜６０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２５〜５０℃の範囲であり、特に好ましくは３０〜４０℃の範囲である。また、相対湿度ＲＨは、５〜４０％の範囲が好ましく、より好ましくは１０〜２０％の範囲であり、特に好ましくは１０〜１５％の範囲である。なお、処理時間は、例えば、乾燥手段に応じて適宜決定できるが、１〜６０分の範囲が好ましく、より好ましくは５〜３０分の範囲であり、特に好ましくは５〜１０分の範囲である。
【００９２】
さらに、図１（Ｄ）に示すように、前記無機ゲル層１６の上に、酵素試薬層１７を形成する。この酵素試薬層１７は、前記酸化還元酵素を含有する酵素液を調製して、これを前記無機ゲル層１６上に注入し、乾燥することによって形成できる。また、前記酸化還元酵素としては、例えば、前述のようなものが使用できる。
【００９３】
前記酵素液は、例えば、酵素を溶媒に十分に溶解させて調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、エタノール、メタノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等があげられ、そのｐＨは、酵素の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、５〜１０の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲、特に好ましくは７〜８の範囲である。また、水としては、例えば、精製水、蒸留水、超純水等があげられ、この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサが作製可能であることから超純水が好ましい。
【００９４】
前記酵素液中の試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、１〜１０ＫＵ／ｍＬの範囲が好ましく、より好ましくは３〜６ＫＵ／ｍＬの範囲である。
【００９５】
また、前記酵素液は、さらに界面活性剤を含むことが好ましく、特に両性界面活性剤を含むことが好ましい。前記両性界面活性剤としては、例えば、前述と同様のものが使用できる。
【００９６】
この酵素液は、酸化還元酵素の他に、例えば、酸化還元酵素の基質とならない糖類や、アミノ酸およびその誘導体、イミダゾール等のアミン化合物、ベタイン等を含んでもよい。前記糖類としては、例えば、スクロース、ラフィノース、ラクチトール、リビトール、アラビトール等があげられる。これらの中でも、前記糖類は、例えば、酵素の安定性向上に、前記アミノ酸、その誘導体およびベタインは、例えば、試薬の乾燥による固化の防止、イミダゾールは、例えば、メディエータの安定化等の目的で添加することができる。
【００９７】
前記酵素液の注入量は、形成する酵素試薬層１７の大きさ、試薬の濃度、試料の量、測定対象物の種類等により適宜決定できる。
【００９８】
注入した前記酵素液の乾燥手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用でき、これらの手段を組み合わせてもよい。乾燥条件としては、例えば、温度１０〜６０℃の範囲、相対湿度ＲＨ５〜４０％の範囲、時間１〜６０分の範囲である。また、試薬として酵素を使用する場合には、酵素の種類に応じて、失活しないように適宜温度を設定すればよい。
【００９９】
つぎに、図１（Ｅ）に示すように、絶縁層１４上にスペーサー１８を配置する。図示のように、スペーサー１８は、前記酵素試薬層１７に対応する箇所が開口部となっている。
【０１００】
前記スペーサー１８の材料としては、例えば、樹脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜１４との接着だけでなく、後述するカバー１９も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスペーサーを形成してもよい。
【０１０１】
つぎに、図１（Ｆ）に示すように、前記スペーサー１７上にカバー１９を配置する。前記カバー１９の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは、ＰＥＴ等の透明樹脂があげられる。
【０１０２】
このようにして作製したバイオセンサ１は、長期間保存する場合、湿気の影響を防ぐため、例えば、モレキュラーシーブ、シリカゲル、酸化カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。
【０１０３】
このバイオセンサ１は、例えば、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、前記バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合わせて使用できる。
【０１０４】
このバイオセンサ１の使用方法について、試料が全血、測定対象物がグルコース、酸化還元酵素がＧＤＨ、メディエータがフェリシアン化カリウムである例をあげて説明する。
【０１０５】
まず、全血試料をバイオセンサ１の開口部２１の一端に接触させる。この開口部２１は、前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９には空気孔２０が設けられているため、毛管現象によって前記試料が内部に吸引される。吸引された前記試料は、検出部１５上に設けられた酵素試薬層１７に浸透し、酵素試薬層１７中のＧＤＨを溶解して、さらに酵素試薬層１７の下層である無機ゲル層１６表面に達する。そして、表面に達した試料中のグルコースと、ＧＤＨと、無機ゲル層１６中のフェリシアン化カリウムとが反応する。具体的には、測定対象物であるグルコースはＧＤＨにより酸化され、その酸化反応により移動した電子によって、フェリシアン化カリウムが還元され、フェロシアン化カリウム（フェロシアンイオン）が生成される。
【０１０６】
この際、試料は酵素試薬層１７を通過して無機ゲル層１６に達するが、無機ゲル層１６を通過して電極表面に到達することはない。このため、還元されたフェロシアン化カリウムが試料中の溶存酸素によって再酸化することが防止できると考えられ、これによって測定精度の低下が抑制される。なお、電極表面に水分が到達していないことは、電子顕微鏡によって確認されている。また、前記試料中に含まれる赤血球等の不純物も、層状無機化合物の間を通過することができないため、この無機ゲル層１６を通過することなく、電極１２、１３表面への吸着も防止される。
【０１０７】
そして、無機ゲル層１６中で還元されたフェロシアン化カリウムと、無機ゲル層１６の下に位置する電極との間で、電子授受が行われ、これによってグルコース濃度が測定できるのである。具体的には以下のように行うことができる。
【０１０８】
全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極１３と作用極１２との間に電圧を印加して、電極と接触している前記還元型のフェロシアン化カリウム（フェロシアンイオン）を電気化学的にフェリシアン化カリウムに酸化し、その際の酸化電流を、作用極１２のリード部１２ａを介して前記電気信号を測定する手段等によって検出する。この酸化電流の値は、試料中のグルコース濃度に比例するため、これを前記演算手段によりグルコース濃度に演算すれば、試料中のグルコース濃度を求めることができる。
【０１０９】
このようなバイオセンサによれば、前述のように溶存酸素等の影響による、還元型メディエータの再酸化が防止され、測定の精度や再現性が向上できる。
【０１１０】
本実施形態においては、本発明のバイオセンサをグルコース測定に適用する例を示したが、これには制限されず、例えば、測定対象物に応じて試薬を適宜決定し、各種測定対象についてのバイオセンサとすることができる。具体的には、例えば、乳酸測定用バイオセンサの場合はラクテートオキシダーゼ、アルコール測定用バイオセンサの場合はアルコールオキシダーゼ、コレステロール測定用センサの場合はコレステロールオキシダーゼ等が使用できる。また、グルコース測定用バイオセンサの場合、例えば、ピラノースオキシダーゼやグルコースオキシダーゼ等も試薬として使用できる。
【０１１１】
また、前記無機ゲル層と酵素試薬層とを積層する代りに、前述の層状無機化合物等を分散した分散液に、さらに酸化還元酵素を添加して、検出部１５に、酵素試薬層と無機ゲル層を兼ねる単層を形成してもよい。この場合、前記分散液における酸化還元酵素量等は特に制限されず、例えば、前述のような添加量を参考にできる。
【実施例１】
【０１１２】
以下に示すようにして、前記図１（Ｆ）と同じ構造のグルコースセンサを作製した。
【０１１３】
まず、グルコースセンサの絶縁基板１１として、ＰＥＴ製基板（長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部をそれぞれ有する作用極１２および対極１３からなるカーボン電極系を形成した。
【０１１４】
つぎに、以下に示すようにして前記電極上に絶縁層１４を形成した。まず、絶縁性樹脂ポリエステルを、濃度７５重量％になるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。印刷条件は、３００メッシュスクリーン、スキージ圧４０ｋｇであり、印刷する量は、電極面積１ｃｍ２当たり０．００２ｍＬとした。なお、検出部１５上と、リード部１２ａ、１３ａ上には、スクリーン印刷を行わなかった。そして、９０℃で６０分間加熱処理することによって絶縁層１４を形成した。
【０１１５】
続いて、前記絶縁層１４を形成しなかった前記検出部１５に、以下に示すようにして無機ゲル層１６を形成した。まず、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」（コープケミカル社製）０．６ｇを精製水１００ｍＬに懸濁し、約８〜２４時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液のｐＨは、約１０であった。この合成スメクタイト懸濁液１０ｍＬに、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液０．１ｍＬ、１．０Ｍ ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）５．０ｍＬおよび精製水４．０ｍＬをこの順序で添加し、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（アルドリッチ社製）１．０ｇを混合した。この混合液を無機ゲル層形成液とする（ｐＨ７．５）。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。
【０１１６】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３ ５．０％（ｗ／ｖ）
【０１１７】
この無機ゲル形成液１．０μＬを、検出部１５に分注した。なお、検出部１５の表面積は約０．１ｃｍ２であり、前記検出部１５における電極１２、１３の表面積は約０．１２ｃｍ２であった。そして、これを、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて、無機ゲル層１６を形成した。
【０１１８】
さらに、前記無機ゲル層１６の上に、酵素試薬層１７を形成した。これは、５０００Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ水溶液１．０μＬを、検出部１５の前記無機ゲル層１６の上に分注して、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて形成した。
【０１１９】
最後に、開口部を有するスペーサー１８を絶縁層１４上に配置し、さらに、前記スペーサー１８上に空気孔となる貫通孔２０を有するカバー１９を配置してバイオセンサ１を作製した。前記カバー１９と絶縁層１４とに挟まれたスペーサー１８の開口部の空間が、キャピラリー構造となるため、これを試料供給部２１とした。
【０１２０】
なお、比較例１としては、無機ゲル層形成液の調製において、前記合成スメクタイト懸濁液の代りに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。
【実施例２】
【０１２１】
前記実施例１で作製したグルコースセンサを用いて、グルコース濃度に応じた応答電流の経時変化を測定した例である。
【０１２２】
液体試料としては、ヒト全血を用いた。まず、採血後の全血を３７℃で約１日放置して、グルコース濃度０ｍｇ／１００ｍＬに調整した。つぎに、これにグルコースを添加して、各種グルコース濃度（約２００、４００、６００ｍｇ／１００ｍＬ）の試料を調製した。なお、グルコース無添加の全血をグルコース濃度０ｍｇ／１００ｍＬとした。そして、実施例２として、前記グルコースセンサ１に２００ｍＶの電圧を印加してから、試料を試料供給部２１に点着し、その点着５秒後の応答電流のタイムコースを測定した。比較例２として、比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例および比較例ともに、計３回ずつ測定を行った（ｎ＝３）。これらの結果を図３（Ａ）（Ｂ）に示す。図３は、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図（Ａ）が実施例２、同図Ｂが比較例２の結果をそれぞれ示す。
【０１２３】
同図（Ａ）に示すように、実施例１のグルコースセンサによれば、同図（Ｂ）に示す比較例１のグルコースセンサよりも、応答電流値のピークがより早い時間で現れ、かつピーク電流値も高い値が得られた。このように高いピーク電流値が得られたのは、実施例１のグルコースセンサによれば、無機ゲル層において酸素が遮断されるため、グルコースとＧＤＨとの反応によって還元されたメディエータが、酸素によって再酸化されることなく、電気化学的に酸化され、その酸化電流を測定できたからであると考えられる。また、電流値のピークが早い時間で現れたのは、電極上の無機ゲル層中において、スメクタイトのシート内にメディエータである［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３がはまり込んで強固に固定化されているため、電極表面にスメクタイトを介してメディエータがゆるく固定化された状態となり、電極近傍のメディエータ濃度が大きくなって、反応速度が増大したものと考えられる。
【実施例３】
【０１２４】
本発明のグルコースセンサを用いて、試料の点着から一定時間経過後の応答電流値の再現性を確認した例である。
【０１２５】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度０、１０３、４１５、６１６、８２４ｍｇ／１００ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
【０１２６】
実施例３として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度（ルーセンタイトＳＷＮ）を０．２４％（ｗ／ｖ）とした以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。前記グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。前記測定は、同じグルコースセンサを用いて、各試料について、それぞれ計１０回（ｎ＝１０）行った。また、比較例３として、前記比較例１のグルコースセンサを用いて、前記実施例３と同様にして測定を行った（ｎ＝１０）。
【０１２７】
測定した実施例３および比較例３の応答電流値（ｎ−１０）から、測定の再現性を示すＣＶ値を求めた。これらの結果を下記表２に示す。
【０１２８】
【０１２９】
前記表２の結果から、比較例３は、特に試料中のグルコース濃度を８２４ｍｇ／１００ｍＬに増加させたことによって、ＣＶ値が７．３０と大幅に変化したのに対し、実施例３によれば、ＣＶ値は２．３４〜３．０２の間で安定しており、前記グルコース濃度の増加に拘わらず、再現性よく測定できることがわかる。この結果から、実施例のグルコースセンサによれば、スメクタイトを含まない比較例のバイオセンサよりも高い再現性で測定できるといえる。
【実施例４】
【０１３０】
前記実施例３で作製したグルコースセンサについて、一定湿度および温度に曝露することによる影響を確認した例である。
【０１３１】
前記グルコースセンサを、相対湿度８０％、温度４０℃に維持した室内に１７時間放置して曝露した後、電極間に２００ｍＶの電圧を印加した。そして、グルコース濃度０、６００ｍｇ／１００ｍＬとなるようにグルコースを添加したヒト全血試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これを実施例４とする。また、比較例４として、前記比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例４および比較例４のコントロールとして、それぞれ前記グルコースセンサを用いて、前記通常の室温湿度（約２５℃、約６０％Ｒｈ）条件下で、前記試料についての応答電流値を測定した。そして、コントロールの電流値を１００％とした場合の、前記実施例４および比較例４の感度（％）を求めた。以下の表３に結果を示す。
【０１３２】
【０１３３】
前記表３に示すように、実施例３のグルコースセンサによれば、高湿度条件に曝露しても、比較例１のグルコースセンサに比べて曝露後の感度低下が小さいことがわかった。つまり、実施例３のグルコースセンサは、前述のように、無機ゲル層によって、例えば、空気中の水分や試料中の溶存酸素が遮断され、メディエータが酸素と接することを防止できるため、湿度に対する耐性を有しているといえる。
【実施例５】
【０１３４】
本発明のグルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。
【０１３５】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度を１１１ｍｇ／１００ｍＬになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が２５．１ｍｍＨｇ付近（未調整）、９２．０ｍｍＨｇ付近、および１７１．６ｍｍＨｇ付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、溶存酸素未調整（２５．１ｍｍＨｇ）の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度（９２．０ｍｍＨｇ、１７１．６ｍｍＨｇ）に調整した。
【０１３６】
実施例５として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度（ルーセンタイトＳＷＮ）を、０．１２％、０．２４％、０．３６％、０．４８％（ｗ／ｖ）とした以外は、前記実施例１と同様にして４種類のグルコースセンサを作製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整（２５．１ｍｍＨｇ）の試料に対する前記応答電流値を基準として、下記式（１０）より、各試料（溶存酸素９２．０ｍｍＨｇ、１７１．６ｍｍＨｇ）の応答電流値の変化率（％）を求めた。また、比較例５として、前記比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行い、変化率（％）を求めた。これらの結果を図４に示す。図４は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、図において△、○、□、▽はそれぞれ実施例５であり、●は比較例５である。なお、変化率（％）は、絶対値が大きい程、応答電流が変化したことになる。
【０１３７】
変化率（％）＝［（Ａ／Ｂ）−１］×１００ ・・・（１０）
Ａ：溶存酸素調整試料の応答電流
Ｂ：溶存酸素未調整試料の応答電流
【０１３８】
図４に示すように、実施例５によれば、試料の溶存酸素を増加させても、比較例５に比べて、変化率（％）の絶対値は小さかった。このことから、スメクタイトを含む実施例のグルコースセンサによれば、溶存酸素による感度低下が小さく、試料等の溶液中の溶存酸素の影響を軽減できることがわかった。
【実施例６】
【０１３９】
酸化還元酵素としてＧＯＤを用いた本発明のグルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。
【０１４０】
無機ゲル層形成液として、以下の最終濃度となるように調製した分散液を使用し、酵素溶液として、ＧＤＨ水溶液の代りに１２００Ｕ／ｍＬのＧＯＤ溶液（天野社製）を使用し、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３の代りにフェリシアン化カリウム（和光純薬工業社製）を、ＡＣＥＳ緩衝液の代りにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）を使用した以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。
【０１４１】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．１％（ｗ／ｖ）
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝液 １００ｍＭ
フェリシアン化カリウム ３．０％（ｗ／ｖ）
【０１４２】
なお、比較例６としては、無機ゲル層および酵素試薬層を形成する代りに、ＧＯＤ１２００Ｕ／ｍＬおよびフェリシアン化カリウム３．０％（ｗ／ｖ）を含む溶液１μＬを検出部に注入し、乾燥する以外は、前記実施例６と同様にしてバイオセンサを作製した。
【０１４３】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度を６００ｍｇ／１００ｍＬになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が４８．９ｍｍＨｇ（未調整）、１０６．４ｍｍＨｇ、および１８０．４ｍｍＨｇになるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。
【０１４４】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度６００ｍｇ／１００ｍＬの試料を調製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に５００ｍＶの電圧を印加し、試料点着５秒後の応答電流値を測定した。比較例６のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。そして、実施例６および比較例６について、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整（４８．９ｍｍＨｇ）の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（１０）より、各試料（溶存酸素１０６．４ｍｍＨｇ、１８０．４ｍｍＨｇ）に対する応答電流値の変化率（％）を求めた。これらの結果を図５に示す。図５は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、同図において○が実施例６、●が比較例６の結果である。
【０１４５】
図５に示すように、酸化還元酵素としてＧＯＤを用いた実施例６によっても、比較例６に比べて、試料中の溶存酸素による感度低下が小さく、溶存酸素の影響を軽減できたことがわかった。
【実施例７】
【０１４６】
実施例７は、界面活性剤としてＣＨＡＰＳ（両性界面活性剤）を、アミン系緩衝剤としてＡＣＥＳ緩衝液をそれぞれ用いた実施例１で作製したグルコースセンサを使用した。一方、比較例７としては、界面活性剤としてＣＨＡＰＳに代えてコール酸（アニオン系界面活性剤）を使用し、緩衝剤としてＡＣＥＳに代えてリン酸ナトリウムを使用した以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製して、これを用いた。
【０１４７】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度１００ｍｇ／１００ｍＬの試料を調製し、さらに溶存酸素が３４．７ｍｍＨｇ（未調整）、１１７．１ｍｍＨｇ、および１８５．３ｍｍＨｇ付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。
【０１４８】
そして、グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（１０）より、他の試料に対する応答電流値の変化率（％）を求めた。また、比較例７も、前記グルコースセンサを用いて同様にして測定を行い、変化率（％）を求めた。これらの結果を図６に示す。図６は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、同図において○が実施例７、●が比較例７の結果である。
【０１４９】
図６に示すように、両性界面活性剤でなくアニオン性界面活性剤を用い、緩衝剤としてアミン系緩衝剤でなくリン酸ナトリウムを用いた比較例７のグルコースセンサでは、スメクタイトを含有しているにも拘わらず、実施例７と比較して、溶存酸素の影響を多大に受けていることがわかる。このことから、実施例のように、両性界面活性剤およびアミン系緩衝剤の存在下で、スメクタイトを含む無機ゲル層を形成することによって、試料中の酸素による影響を防止できることがわかる。また、比較例のようにアニオン性界面活性剤を用いた場合、分散液を電極上に載せ難く、作製自体が困難であった。
【実施例８】
【０１５０】
以下に示す方法により、無機ゲル形成液を調製した以外は、前記実施例１と同様にしてバイオセンサを作製した。
【０１５１】
合成スメクタイト（商品名ルーセンタイトＳＷＮ：コープケミカル社製）０．６ｇ、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液１ｇおよび精製水９８．４ｇとを混合し（合計１００ｇ）、このスメクタイト懸濁液を一晩攪拌した。攪拌後の懸濁液４０ｇに、２ＮのＨＣｌ（４ｇ）を添加して一晩（約２４時間）攪拌した（攪拌機：商品名マグネチックスターラーＨＳ−３Ｅ；株式会社井内盛栄堂製）。ＨＣｌの添加によって、前記懸濁液は白濁したが、一晩攪拌した後、透明となった。さらに、この懸濁液に、２００ｍＭコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５）を、１：１となるように混合した。この緩衝液を混合した後の懸濁液は、そのｐＨが約４．５であった。前記緩衝剤を加えた懸濁液に、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（アルドリッチ社製）を５％（ｗ／ｖ）となるように添加して、これを無機ゲル層形成液とした。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。
【０１５２】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．３％（ｗ／ｖ）
コハク酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５） １００ｍＭ
［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３ ５．０％（ｗ／ｖ）
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
以上のように、本発明のバイオセンサの製造方法によれば、例えば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための還元型メディエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できるため、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消され、測定精度に優れるバイオセンサを提供できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の測定対象物を電気化学的に測定するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特定の測定対象物を含む試料液について、例えば、試料液の希釈や攪拌等を行わずに、簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオセンサが広く使用されている。このようなバイオセンサは、例えば、電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷等の方法によって作用極（測定極ともいう）と対極とを有する電極系を形成し、その上に、前記測定対象物と反応する酸化還元酵素およびメディエータ（電子伝達物質）等を含む試薬層を形成することにより作製できる（例えば、特許文献１参照）。この試薬層に、前記測定対象物を含む試料液を接触させると、前記酸化還元酵素の触媒作用によって、例えば、前記測定対象物が酸化され、前記メディエータが還元される。この還元されたメディエータ（以下、「還元型メディエータ」という）を、前記電極系を用いた電気化学的手法により再酸化し、これにより得られた酸化電流値から前記試料液中の測定対象物の濃度が算出できる。
【０００３】
しかしながら、反応雰囲気中に酸素が存在したり、試料液中に溶存酸素が存在する場合、前記還元型メディエータは、前述のように電気化学的に再酸化されるだけでなく、前記酸素によっても再酸化されてしまう。このため、電気化学的な再酸化による酸化電流値に誤差が生じ、測定精度が低下するという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避する方法として、例えば、窒素雰囲気下での測定等が考えられるが、これでは手間がかかり操作も煩雑となる。また、全く酸素が無い条件下では、酵素反応に酸素を必要とする酸化還元酵素を使用することができないという問題もあり、適用範囲が非常に狭くなる。
【特許文献１】特開平１−２９１１５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含む製造方法である。
【０００７】
また、本発明のバイオセンサは、前記本発明の製造方法により製造したバイオセンサである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、バイオセンサについて、試料中の測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータ（還元型メディエータ）が自然酸化されることを防止すべく、鋭意研究を行った。その結果、一般に、例えば、層状無機化合物によって無機ゲル層が形成されることは知られているが、無機ゲル層がさらに界面活性剤および緩衝剤を含有することによって、前記還元型メディエータの自然酸化を防止する効果を発揮する無機ゲル層を形成できることを見出した。このような方法によって、前記自然酸化防止の効果が得られることは、本発明者らが初めて見出した事である。前述のような方法で無機ゲル層を形成すれば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための前記還元型メディエータが、例えば、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できる。このため、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消された、測定精度に優れるバイオセンサを提供できる。なお、本発明において、「前記メディエータの自然酸化」とは、例えば、バイオセンサの使用時における液体試料中の溶存酸素や、空気中の水分に吸収された酸素（例えば、保存時に空気中水分が空気中酸素を吸収する）によって、前記メディエータが酸化されることをいう。
【０００９】
界面活性剤および緩衝剤存在下で無機ゲル層を形成することによって、酸化防止機能が発揮されるのは、おそらく以下に示すメカニズムによると推測される。
【００１０】
例えば、前記メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布して形成された前記無機ゲル層内においては、前記メディエータが前記層状無機化合物のシート内にしっかりとはまり込んだ複合体を形成し、前記メディエータが液体試料等に含まれる溶存酸素と接触するのを防止していると考えられる。通常、試料液中には酸素が溶存しているため、前述のように層状無機化合物が水をシャットアウトすることにより、前記メディエータに対する前記溶存酸素の攻撃を防止できるのである。そして、前述のようにさらに界面活性剤が存在することによって、層状無機化合物とメディエータとが重合して不溶化することなく、これらの複合体が分散された状態となり、前記効果を十分に発揮できる無機ゲル層を形成できるのである。
【００１１】
また、前記分散液が緩衝剤を含むことによって、均一な無機ゲル層の形成が可能になり、酸化防止機能をより一層向上することができるのである。これは、前記緩衝剤が、前記メディエータと層状無機化合物との複合体を形成する際にバインダーとして作用するためと考えられる。このバインダーとしての作用によって、メディエータと層状無機化合物との結合がより一層強固となった複合体が形成されるため、例えば、溶存酸素を含む液体をさらにシャットアウトでき、酸素によるメディエータの再酸化が防止できる。一方、この場合、前記界面活性剤は、前記緩衝剤と、層状無機化合物およびメディエータとが、重合体を形成して分散不可能になることを防止する、いわゆるブロック剤としての機能も果たすと考えられる。
【００１２】
本発明のバイオセンサは、前述のような方法で製造することによって、例えば、メディエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できる。このため本発明のバイオセンサは、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消され、測定精度に優れる。
【００１３】
本発明の製造方法によって得られるバイオセンサは、酸化還元酵素からメディエータへの電子の授受は、水ではなく、前記層状無機化合物の層間、つまり電気二重層を介して行われると考えられる。このため、水分が前記無機ゲル層によってシャットアウトされる本発明のバイオセンサによれば、例えば、高湿度環境等においても劣化を防止できるという効果を奏するのである。また、前記層状無機化合物の電気二重層は、水よりも電子を通し易いため、反応速度の増大にもつながると考えられる。
【００１４】
また、本発明の製造方法によるバイオセンサは、上述のような酸素の遮断によって、例えば、酸化による電極の錆の発生等も防止できる。
【００１５】
なお、本発明において、前記メディエータの自然酸化を防止する無機ゲル層を、「酸化防止層」ともいう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
［図１］図１は、本発明の実施形態において、バイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であり、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、各工程を示す。
［図２］図２は、前記実施形態におけるバイオセンサの断面図である。
［図３］図３は、本発明の実施例において、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図（Ａ）が実施例、同図（Ｂ）が比較例の結果をそれぞれ示す。
［図４］図４は、本発明のその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
［図５］図５は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
［図６］図６は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明において、前記層状無機化合物は、層状粘土鉱物であることが好ましく、特に好ましくは膨潤性粘土鉱物である。
【００１８】
前記層状無機化合物とは、例えば、無機物の多面体が平面状に連なってシート構造を形成し、このシート構造がさらに層状に重なって結晶構造を形成したものということができる。前記多面体の形状としては、例えば、四面体シート、八面体シート等があり、具体的には、例えば、Ｓｉ四面体、Ａｌ八面体等があげられる。このような層状無機化合物としては、例えば、層状粘土鉱物、ハイドロタルサイト、スメクタイト、ハロイサイト、カオリン鉱物、雲母等が含まれる。
【００１９】
前記層状粘土鉱物とは、一般に、粘土（細かい土状の無機粒状物で、水で湿った状態において可塑性を示すもの）の大半を占めるアルミニウムケイ酸塩鉱物があげられ、これは、通常、Ｓｉが４つの酸素原子（Ｏ）に囲まれたＳｉ四面体と、ＡｌまたはＭｇが６つの水酸基（ＯＨ基）あるいは６つの酸素原子に囲まれたＡｌ八面体またはＭｇ八面体とを最小構成単位としている。
【００２０】
前記層状粘土鉱物の構造としては、例えば、前記Ｓｉ四面体が他のＳｉ四面体と１つの面を共有して、残る頂点の酸素原子を同方向に向けて六角網状のシートを形成し（以下「四面体シート」という）、一方、Ａｌ八面体またはＭｇ八面体が他の八面体と稜角を共有してシートを形成し（八面体シート）、前記四面体シートと前記八面体シートとが層状に積層された構造があげられる。具体的には、例えば、前記四面体シートと前記八面体シートとが１枚ずつ重なった１：１層が、さらに何層も積層された構造の鉱物を１：１型鉱物；２枚の四面体シートで１枚の八面体シートを挟んだ２：１層が、さらに何枚も積層された構造の鉱物を２：１型鉱物；前記２：１層の層間に、さらにもう一枚の八面体シートが挟まれた構造の鉱物を２：１：１型鉱物と、それぞれ呼ばれている。また、例えば、八面体シートが、Ｍｇ（ＯＨ）２で全ての八面体位置に金属イオンを有するものを３八面体型（Ｔｒｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ）といい、八面体シートが、Ａｌ（ＯＨ３）で１／３が空孔になっているものを２八面体型（Ｄｉｏｃｔａｈｅｄｒａｌ）という。この中でも、本発明における前記層状無機化合物としては、２：１型鉱物が好ましい。
【００２１】
前記層状無機化合物を構成する元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、酸素、水素、フッ素、炭素等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上で構成されてもよい。特に制限されないが、具体例として、例えば、下記式（１）〜（９）に示す化合物等があげられ、これらの化合物は、例えば、結晶水を含んでもよい。これらの下記式は、鉱物学的または化学的に純粋な化合物としての式であるが、実際には、例えば、ケイ酸ナトリウムなどの不純物を含む場合がある。このため、元素分析等によって化学式を定めた場合、これらの式と必ずしも一致しないことは、例えば、文献（Ｄ．Ｗ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，１５１，２３６−２４３（１９９２））等においても記載されている。
【００２２】
ＭｘＳｉ４（Ａｌ２−ｘＭｇｘ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（１）
前記式（１）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、は２未満の正数である。
【００２３】
Ｍｘ（Ｓｉ４−ｘＡｌｘ）Ａｌ１２Ｏ１０Ｘ２ ・・・（２）
前記式（２）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは４未満の正数である。
【００２４】
ＭｘＳｉ４（Ｍｇ３−ｘＬｉｘ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（３）
前記式（３）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは３未満の正数である。
【００２５】
Ｍｘ（Ｓｉ４−ｘＡｌｘ）Ｍｇ３Ｏ１０Ｘ２ ・・・（４）
前記式（４）において、好ましくは、Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、ＮａおよびＫからなる群から選択された少なくとも一つであって、ＸはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、ｘは４未満の正数である。
【００２６】
ＭＳｉ４Ｍｇ２．５Ｏ１０Ｘ２ ・・・（５）
前記式（５）において、Ｍは、好ましくはＬｉおよびＮａの少なくとも一方であり、より好ましくはＮａであり、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、より好ましくはＦである。
【００２７】
Ｍ２Ｓｉ４Ｍｇ２Ｏ１０Ｘ２ ・・・（６）
前記式（６）において、Ｍは、好ましくはＬｉおよびＮａの少なくとも一方であり、より好ましくはＬｉであり、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、より好ましくはＦである。
【００２８】
Ｍｇ６Ａｌ１２（ＯＨ）１６Ｘｘ ・・・（７）
前記式（７）において、Ｘは、好ましくはハロゲン、ＮＯ３、ＳＯ４、ＣＯ３およびＯＨからなる群から選択された少なくとも一つの基およびアニオン型有機酸の少なくとも一方であって、より好ましくはＣＯ３であり、ｘは、Ｘがハロゲン、ＯＨ、ＮＯ３または一価有機酸のとき、好ましくは２であって、ＸがＳＯ４、ＣＯ３または二価の有機酸のとき、好ましくは１である。
【００２９】
Ｎａ０．３３Ｓｉ４（Ｍｇ２．６７Ｌｉ０．３３）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（８）
前記式（８）において、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であって、好ましくはＯＨである。
【００３０】
Ｎａａ−ｂ（Ｓｉ４−ａＡｌａ）（Ｍｇ３−ｂＡｌｂ）Ｏ１０Ｘ２ ・・・（９）
前記式（９）において、Ｘは、好ましくはＯＨおよびＦの少なくとも一方であり、好ましくはＯＨであり、ａは、好ましくは４未満の正数であり、ｂは、好ましくは３未満の正数であり、ａ−ｂ＞０であることが好ましい。
【００３１】
前記層状無機化合物の具体例としては、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋石等の１：１型粘土鉱物；タルク、パイロフィライト、スメクタイト、バーミキュライト（前記式（２）で表されるもの、以下同様）、フッ素四ケイ素雲母（前記式（５））やテニオナイト（前記式（６））を含む雲母等の２：１型粘土鉱物；クロライト等の２：１：１型粘土鉱物；２：１〜２：１：１型の中間鉱物；イモゴライト等の準晶質粘土鉱物；アロフェン等の非晶質粘土鉱物；ハイドロタルサイト（前記式（７））等が挙げられる。
【００３２】
また、スメクタイトには、例えば、同型置換された四面体、八面体格子中のイオン種によってモンモリロナイト（前記式（１））、モンモリロナイトが４０〜８０％含まれる天然物であるベントナイト、バイデライト（前記式（２））等の２八面体型；ヘクトライト（前記式（３）、好ましくは前記式（８））、サポナイト（前記式（４）、好ましくは前記式（９））、ノントロナイト等の３八面体型等が含まれる。
【００３３】
ハイドロタルサイトは、例えば、前記式（７）で表わされる。具体的には、例えば、Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６ＣＯ３・４Ｈ２Ｏで表される層状鉱物であって、Ｍｇ（ＯＨ）２（ブルーサイト：中心にＭｇ２＋を持つ酸素八面体の層が積み重なった構造を持つ）のＭｇ２＋の一部が、Ａｌ３＋に同型置換している。これは正電荷を有するが、層間のＣＯ３２−によって電気的中性を保っており、陰イオン交換能をもつものである。なお、ケイ酸塩鉱物ではないが、通常、粘土鉱物として取り扱われる。
【００３４】
前述のような層状無機化合物の組成の例を、下記表１に示す。なお、下記表１において、「ＭＩ」は、１価陽イオンで代表させた交換性陽イオンを示し、例えば、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等である。
【００３５】
【００３６】
前記層状無機化合物の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、溶媒に対して均一に分散できる程度の粒径であることが好ましい。前記層状無機化合物は、一般に板状の粒子であり、かつ、複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡にあるため、平均粒径を定義すること自体が困難であるが、例えば、光散乱法や電子顕微鏡を用いた観察等の手段により測定した場合に、水中に分散させた状態で、１ｎｍ〜２０μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜２μｍの範囲である。
【００３７】
これら粘土鉱物等の層状無機化合物は、例えば、４級アンモニウム塩等のピラーを立てて、層間距離や層間の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。
【００３８】
前述のような層状無機化合物のうち、より好ましくは２：１型粘土鉱物であり、特に好ましくはイオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。
【００３９】
前記膨潤性粘土鉱物のうち、より好ましくはベントナイト、スメクタイト、バーミキュライト、合成フッ素雲母等であり、特に好ましくは合成ヘクトライトや合成サポナイト等の合成スメクタイト；合成フッ素雲母に代表される膨潤性合成雲母；Ｎａ型雲母等の合成雲母（天然の雲母は、通常、非膨潤性の粘土鉱物である）等である。これらの層状無機化合物は、単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４０】
このような層状無機化合物としては、例えば、市販品が使用でき、コープケミカル（株）製の商品名ルーセンタイトＳＷＮ、商品名ルーセンタイトＳＷＦ（合成ヘクトライト）、商品名ＭＥ（フッ素雲母）、クニミネ工業（株）製の商品名スメクトンＳＡ（合成サポナイト）、協和化学工業（株）製の商品名チキソピーＷ（合成ヘクトライト）、商品名キョーワード５００（合成ハイドロタルサイト）、ラポー社製の商品名ラポナイト（合成ヘクトライト）、（株）ナカライテスク社製の天然ベントナイト、（株）豊順鉱業社製の商品名マルチゲル（ベントナイト）等が挙げられる。
【００４１】
本発明において、前記界面活性剤としては両性界面活性剤が好ましく、より好ましくは、例えば、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する両性界面活性剤であり、例えば、アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等があげられる。これらの中でも、さらに好ましくは、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している両性界面活性剤であり、例えば、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン等である。具体的には、前記カルボキシベタインとして、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン等、前記スルホベタインとして、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびアルキルヒドロキシスルホベタイン等が使用できる。これらの中でも好ましくは、スルホベタインであり、より好ましくはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、特に好ましくはＣＨＡＰＳである。
【００４２】
本発明において、前記緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましく、例えば、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴｒｉｃｉｎｅおよびＡＤＡ等があげられ、好ましくはＡＣＥＳ、Ｔｒｉｓであり、より好ましくはＡＣＥＳである。これらの物質は、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
【００４３】
また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましく、例えば、酢酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、コハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤等があげられ、この中でもコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤が好ましい。
【００４４】
前記アミン系緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、ＴｒｉｓとＣＨＡＰＳ、ＡＣＥＳとＣＨＡＰＳ、ＡＣＥＳとＣＨＡＰＳＯの組み合わせ等があげられ、より好ましくはＣＨＡＰＳとＡＣＥＳである。また、カルボキシル基と有する緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、コハク酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯ、マロン酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳ、リンゴ酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯ、酢酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳ等が挙げられ、好ましくはコハク酸−酢酸ＮａとＣＨＡＰＳの組合わせである。
【００４５】
本発明において、前記メディエータとしては、例えば、後述するような酸化還元酵素と測定対象物との反応によって還元型となり、電気化学的に酸化され、酸化電流によって検出できるものが好ましく、従来公知のものが使用できる。
【００４６】
具体的には、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、インドフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール誘導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メチレンブルー、ｃｙｔｏｃｈｔｏｍｅ ｃ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ、銅錯体等が使用できる。これらの中でも、好ましくはフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等が使用できる。
【００４７】
また、この他にも、例えば、１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，１’−ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，４−ジアミノベンゼン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、Ｎ−メチルフェナジニウム塩、１−ヒドロキシ−５−メチルフェナジニウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム塩、９−ジメチルアミノベンゾアルファフェノキサジン−７−イウム塩、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン １０−オキシド、３，７−ジアミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、３−（ジエチルアミノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、１，４−ベンゼンジオール、１，４−ジヒドロキシ−２，３，５−トリメチルベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ベンゼンジアミン、Δ２，２’−ビ−１，３−ジチオール、２，６−ジメチルベンゾキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，３，５，６−テトラメチル−２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジオン、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３−イミノ−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウム塩等がメディエータとして使用できる。
【００４８】
本発明の製造方法において、前記無機ゲル層は、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、形成することが好ましい。
【００４９】
また、本発明においては、前記無機ゲル層の上に、酸化還元酵素を含有する層を形成し、積層体の試薬層としてもよいし、または、前記分散液にさらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を電極表面に形成し、単層の試薬層としてもよい。このように単層の試薬層を形成する場合、酸化還元酵素を含有する層とメディエータを含有する層とを別途形成する必要がないため、製造が一層簡便となる。このようなバイオセンサは、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）のように、酵素反応に、酸素を必要としない酵素を使用する場合、特に好ましい。
【００５０】
前記酸化還元酵素としては、例えば、試料中の測定対象物および前記メディエータと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、測定対象物の種類等に応じて適宜決定できる。
【００５１】
具体的には、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ等があげられる。
【００５２】
前記酸化還元酵素と前記メディエータとの組み合わせは、特に制限されないが、例えば、ＧＯＤとフェリシアン化カリウム、ＧＤＨとルテニウム錯体、コレステロールデヒドロゲナーゼとフェロセン、アルコールデヒドロゲナーゼと銅錯体の組み合わせ等があげられる。
【００５３】
（実施形態１）
本発明の第１のバイオセンサ製造方法の一例について、図１および図２に基づいて説明する。図１（Ａ）〜（Ｆ）は、バイオセンサを製造する一連の工程を示した斜視図である。また、図２は、前記図１（Ｆ）に示すバイオセンサのＩ−Ｉ方向断面図である。なお、図１（Ａ）〜（Ｆ）および図２において、同一箇所には同一符号を付している。
【００５４】
図１（Ｆ）および図２に示すように、このバイオセンサ１は、基板１１、リード部１２ａを有する作用極１２とリード部１３ａを有する対極１３とから構成された電極系、絶縁層１４、メディエータと層状無機化合物と界面活性剤とを含む無機ゲル層（酸化防止層）１６、酸化還元酵素を含む酵素試薬層１７、開口部を有するスペーサー１８および貫通孔２０を有するカバー１９を備えている。図１（Ｂ）に示すように、基板１１の一方の端部（両図において右側）上には、検出部１５が設けられており、検出部１５には、作用極１２と対極１３とが、基板１１の幅方向に並行して配置されている。前記両電極の一端は、それぞれリード部１２ａ、１３ａ（両図において左側）となり、これらと、検出部１５における他端とが、垂直となるように配置されている（図１（Ａ））。また、作用極１２と対極１３との間は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板１１の上には、図１（Ｂ）に示すように、リード部１２ａ、１３ａおよび検出部１５を除いて、絶縁層１４が積層されており、絶縁層１４が積層されていない前記検出部１５上には、無機ゲル層１６および酵素試薬層１７がこの順序で積層されている。そして、絶縁層１４の上には、図１（Ｅ）に示すように、検出部１５に対応する箇所が開口部になっているスペーサー１８が配置されている。さらにスペーサー１８の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔２０を有するカバー１９が配置されている（図１（Ｆ））。このバイオセンサ１において、前記開口部の空間部分であり、かつ、前記酵素試薬層１７および絶縁層１４とカバー１９とに挟まれた空間部分が、キャピラリー構造の試料供給部２１となる。そして、前記貫通孔２０が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
【００５５】
このバイオセンサ１の大きさは、特に制限されず、供給する試料の量等により適宜設定できるが、例えば、全体長さ５〜５０ｍｍ、全体幅１〜５０ｍｍ、最大厚み２０００〜５００μｍ、最小厚み５０〜５００μｍである。なお、「長さ」とは、バイオセンサの長手方向の長さをいい、「幅」とは、幅方向の長さをいう（以下、同じ）。
【００５６】
基板１１の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０００〜１０μｍであり、絶縁層１４の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜２００μｍであり、検出部１５の大きさは、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍであり、無機ゲル層１６の大きさは、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍ、厚み０．００１〜５００μｍであり、酵素試薬層１７の大きさは、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．１〜１０ｍｍ、厚み０．００１〜５００μｍである。スペーサーの大きさは、例えば、長さ１〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜１０００μｍであり、その開口部は、例えば、長さ０．１〜１０ｍｍ、幅０．０１〜１０ｍｍである。カバー１９の大きさは、例えば、長さ５〜５０ｍｍ、幅１〜５０ｍｍ、厚み１０〜１０００μｍであり、その貫通孔は、例えば、直径０．１〜１０ｍｍである。
【００５７】
無機ゲル層１６における層状無機化合物の含有量は、供給する試料の種類やその量、検出部１５の面積等に応じて適宜決定できるが、例えば、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、０．００３〜３０ｍｇの範囲、好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。具体的に、前記層状無機化合物がスメクタイトの場合、例えば、前記面積１ｃｍ２当たり、０．００３〜３０ｍｇの範囲、好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲、より好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。前記含有量が面積１ｃｍ２当たり０．００３ｍｇ以上であれば、例えば、十分に酸素遮断効果を発揮でき、また、面積１ｃｍ２当たり３０ｍｇ以下であれば、酵素遮断効果および再現性、反応性をより一層向上できる。なお、前記面積当たりの層状無機化合物の量は、無機ゲル層１６の厚みに関係しており、前述のように、層の厚みは、０．００１〜５００μｍの範囲が好ましい。
【００５８】
また、無機ゲル層１６における界面活性剤（例えば、両性界面活性剤）の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定できるが、層状無機化合物３００ｍｇに対して、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌの範囲、好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲である。
【００５９】
また、無機ゲル層１６におけるメディエータの含有量は、例えば、測定試料の種類、測定対象物の種類、後述する酵素試薬層における酸化還元酵素の量等によって適宜決定できるが、例えば、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、１０ｍｍｏｌ〜１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１０ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１５ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００６０】
この無機ゲル層１６は、さらに緩衝剤を含有してもよい。無機ゲル層１６における前記緩衝剤の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定でき、層状無機化合物０．３ｇに対して、緩衝剤は、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００６１】
前記酵素試薬層１７における酸化還元酵素の含有量は、特に制限されず、試料の種類やその量、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定できる。具体的には、検出部１５の面積１ｃｍ２当たり、例えば、０．１Ｕ〜１００ＫＵの範囲であり、好ましくは、１Ｕ〜１０ＫＵの範囲であり、より好ましくは１Ｕ〜１００Ｕの範囲である。
【００６２】
また、酵素試薬層１７中の酵素量と前記無機ゲル層１６中のメディエータとの割合は、例えば、酵素１０００Ｕあたり、メディエータ０．０１〜１Ｍの範囲、好ましくは０．０１〜０．５Ｍの範囲、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。
【００６３】
このようなバイオセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。
【００６４】
まず、電極系を形成するための基板１１を準備する。前記基板１１の材料としては、電気絶縁性材料が好ましく、例えば、プラスチック、ガラス、紙、セラミックス、ゴム等があげられる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、アクリル樹脂、ガラスエポキシ等があげられる。
【００６５】
つぎに、図１（Ａ）に示すように、基板１１上にリード部１２ａを有する作用極１２およびリード部１３ａを有する対極１３からなる電極系を形成する。なお、電極の形状は、図１（Ａ）に示す形状には何ら制限されない。前記電極としては、カーボン電極、金電極、パラジウム電極、白金電極等が好ましく、その種類に応じて、例えば、スクリーン印刷、コーティング法、蒸着法等の公知の方法により形成できる。
【００６６】
カーボン電極の場合は、例えば、カーボンインキを前記基板１１上にスクリーン印刷する手段、コーティングする手段等により形成できる。
【００６７】
また、前記金電極は、例えば、蒸着法、メッキ法、スパッタ法、金箔貼付法等により形成できる。前記蒸着法は、例えば、イオンプレーティング法により、真空度１．３３×１０−４Ｐａ、入力パワー３００Ｗ、レート５×１０−１ｎｍ／秒、時間２分の条件で、例えば、ＰＥＴなどのプラスチックシート上に金を蒸着して、さらにキスカット装置を用いて、前記シート上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。これにより、切れ目部分が絶縁部となり、作用極および対極からなる電極系が形成できる。
【００６８】
続いて、図１（Ｂ）に示すように、前記電極系１２、１３を形成した基板１１上に絶縁層１４を形成する。この絶縁層は、電極のリード部１２ａ、１３ａ（図１（Ｂ）において左側）と、後述する無機ゲル層等を形成する検出部１５を除いた基板１１上に形成する。
【００６９】
前記絶縁層１４は、例えば、絶縁性樹脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板１１上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。
【００７０】
前記絶縁性樹脂としては、例えば、ポリエステル、ブチラール樹脂、フェノール樹脂等があげられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（ＤＢＥソルベント）等があげられる。前記ペーストにおける前記絶縁性樹脂の濃度は、例えば、６５〜９５重量％の範囲が好ましく、より好ましくは７５〜９０重量％の範囲であり、特に好ましくは８０〜８５重量％の範囲である。
【００７１】
前記加熱処理の条件は、使用する前記絶縁性樹脂の種類に応じて適宜決定できる。
【００７２】
なお、前記絶縁層１４は、前記印刷法以外に、例えば、コーティング、膜はりつけ、エッチング等の方法によっても形成できる。
【００７３】
次に、図１（Ｃ）に示すように、絶縁層１４が形成されていない検出部１５において、基板１１および電極１２、１３上に、無機ゲル層１６を形成する。無機ゲル層１６は、例えば、メディエータおよび界面活性剤を含み、かつ前記層状無機化合物が分散された分散液を調製し、これを前記検出部１５に分注して、乾燥することによって形成できる。なお、この無機ゲル層１６は、必ずしも常時ゲル状である必要はなく、使用前は、前記乾燥工程によって乾燥した状態であってもよく、液体試料等を含浸した場合に、ゲル状となることが好ましい。
【００７４】
前記分散液の調製に使用する溶媒としては、例えば、水、緩衝液アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が使用でき、この中でも好ましくは超純水である。
【００７５】
前記分散液における前記層状無機化合物の濃度は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また、前記分散液における前記界面活性剤の濃度は、例えば、１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭの範囲であり、より好ましくは１〜１０ｍＭの範囲である。
【００７６】
また、分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合としては、前記層状無機化合物３００ｍｇに対して、界面活性剤が、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌの範囲、好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌの範囲である。
【００７７】
また、前記分散液における前記メディエータの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲であり、好ましくは１００〜８００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２００〜５００ｍＭの範囲であり、特に好ましくは３００ｍＭ付近である。
【００７８】
前記分散液は、さらに、前述のようなアミン系等の緩衝剤を含むことが好ましく、この場合、前記緩衝剤の濃度は、例えば、１〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは５０〜２００ｍＭの範囲である。また、層状無機化合物に対する前記緩衝剤の添加割合としては、前記層状無機化合物０．３ｇに対して、前記緩衝剤が、例えば、０．１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１ｍｍｏｌ〜５０ｍｍｏｌ、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ〜２０ｍｍｏｌの範囲である。
【００７９】
また、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加量は、例えば、前述のように無機微粒子に対する割合で決定できるため、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、特に制限されないが、例えば、Ａ：Ｂ＝１：１〜１：２５０の範囲であり、好ましくは１：１０〜１：１００の範囲であり、より好ましくは１：２５〜１：５０の範囲である。
【００８０】
前記溶媒に対する、前記メディエータ、前記層状無機化合物および界面活性剤等の各成分の添加順序は特に制限されないが、例えば、まず、前記溶媒に層状無機化合物を添加し、十分に攪拌した後、界面活性剤を添加する。そして、さらに前記緩衝剤を添加してから、最後にメディエータを溶解することが好ましい。この順序によると、メカニズムは不明であるが、より一層均一で、酸素との接触が防止される無機ゲル層を形成することができる。なお、前記緩衝剤は、界面活性剤と共に添加してもよいが、特に好ましくは、界面活性剤の添加後である。
【００８１】
また、前記分散液の調製方法は特に制限されないが、例えば、使用するメディエータの種類等に応じて、ｐＨの調整や使用する緩衝剤の種類を選択することが好ましい。以下に、メディエータの種類に応じた具体的な例をあげる。
【００８２】
まず、中性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合の例を説明する。一般に、スメクタイトのような層状無機化合物（無機ゲル）は、水等の溶媒に溶解すると透明化するが、その分散液のｐＨは高アルカリ性（ｐＨ１０付近）である。一方、中性付近での使用が好ましいメディエータや酵素等は、安定なｐＨ条件下、すなわち、中性付近で添加することが好ましい。ところが、無機ゲルは、中性付近で白濁したり沈殿が生じる場合がある。この場合に、緩衝剤として前述のようなアミン系緩衝剤を添加すれば、前記分散液のｐＨを中性付近に調整でき、且つ、メカニズムは不明であるが、中性付近であるにもかかわらず、沈殿を生じることもなく、メディエータを添加することができるのである。そして、結果として、前述のように、メディエータの再酸化を十分に防止できる無機ゲル層を確実に形成できるのである。なお、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加してから、アミン系緩衝剤を添加することによって、調製する分散液の白濁や沈殿を十分に防止できることも、本発明者らがはじめて見出したことでさる。具体的な添加順序としては、層状無機化合物の分散液に、界面活性剤を添加した後、アミン系緩衝剤を添加することが好ましい。アミノ系緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨは、例えば、９〜５の範囲であり、好ましくは８〜６であり、より好ましくは７．５〜７である。
【００８３】
中性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、ファリシアン化カリウム、シトクロムＣ、ＰＱＱ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、銅錯体等があげられる。
【００８４】
また、酸性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合には、以下のような調製方法が好ましい。前述のように、一般に、層状無機化合物（無機ゲル）を溶媒に溶解すると透明化し、その分散液のｐＨは強アルカリ性となる。この場合、酸性付近での使用が好ましいメディエータを添加するためには、例えば、前記分散液にＨＣｌのような酸を添加して、前記分散液のｐＨを酸性側に調整し、前記界面活性剤を添加した後に、前述のようなカルボキシル基を有する緩衝剤を添加してｐＨ調整を行い、メディエータを添加することが好ましい。
【００８５】
このような方法が好ましいのは以下の理由による。スメクタイトのような無機層状化合物は、その分散液にＨＣｌ等の酸を添加して、強酸性条件とすると（例えば、ｐＨ２付近）、一旦は白濁して凝集を生じるが、さらに攪拌を続けることによって（例えば、２４時間程度）、酸性側であっても分散液を透明化できることを、本発明者らは見出した。しかし、この状態の分散液では、前述のようにバインダーとなる緩衝剤が入っておらず、緩衝剤による効果が得られない上に、酵素を使用することを考慮すると、ｐＨ２等の強酸性では、酵素が失活するおそれがある。そこで、さらなる検討によって、本発明者らは、強酸性付近で透明化している分散液に、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加した後、カルボキシル基を有する緩衝剤を添加して、メディエータや酵素の各成分に支障をきたさないｐＨ（例えば、ｐＨ４．５付近）に設定することで、沈殿の発生を十分に防止し、メディエータや酵素を十分に安定な状態で使用できることを見出したのである。
【００８６】
前記分散液のｐＨは、はじめに１〜３の強酸性とすることが好ましく、より好ましくは１．５〜２である。使用する酸としては、特に制限されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸等である。強酸性下での前記分散液の攪拌条件は、特に制限されないが、攪拌時間が、例えば、１２〜７２時間であり、好ましくは１８〜４８時間であり、特に好ましくは２４〜３０時間である。また、カルボキシル基を有する緩衝剤の添加によって、前記分散液のｐＨは、３〜６に設定することが好ましく、より好ましくは４〜５であり、特に好ましくは４．５〜４．８である。
【００８７】
酸性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フェロセン、フェナジンメトサルフェート、インドフェノール、メチレンブルー等が挙げられる。
【００８８】
前記溶媒に、層状無機化合物、界面活性剤および緩衝剤を添加した後は、一時静置しておくことが好ましく、静置時間は、例えば、２４時間以上が好ましく、より好ましくは３日以上である。
【００８９】
この分散液の検出部１５への注入割合は、例えば、検出部１５の大きさ、分散液における前記層状無機化合物等の含量、前記層状無機化合物の種類等によって適宜決定できる。具体的には、検出部１５の面積当たり（ｃｍ２）、例えば、前記層状無機化合物０．００３〜３０ｍｇの範囲になるように前記分散液を注入することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｍｇの範囲であり、特に好ましくは０．３〜３ｍｇの範囲である。したがって、分散液の層状無機化合物の濃度が、０．３重量％の場合、検出部の面積当たり（ｃｍ２）、例えば、０．００１〜１０ｍＬの範囲を注入することが好ましく、より好ましくは０．０３〜３．３ｍＬの範囲であり、特に好ましくは０．１〜１ｍＬの範囲である。
【００９０】
また、前記分散液を検出部１５に注入する方法は、特に制限されないが、例えば、自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。
【００９１】
注入した前記分散液を乾燥する手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。また、これらの手段を組み合わせてもよい。その処理温度は、１０〜６０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２５〜５０℃の範囲であり、特に好ましくは３０〜４０℃の範囲である。また、相対湿度ＲＨは、５〜４０％の範囲が好ましく、より好ましくは１０〜２０％の範囲であり、特に好ましくは１０〜１５％の範囲である。なお、処理時間は、例えば、乾燥手段に応じて適宜決定できるが、１〜６０分の範囲が好ましく、より好ましくは５〜３０分の範囲であり、特に好ましくは５〜１０分の範囲である。
【００９２】
さらに、図１（Ｄ）に示すように、前記無機ゲル層１６の上に、酵素試薬層１７を形成する。この酵素試薬層１７は、前記酸化還元酵素を含有する酵素液を調製して、これを前記無機ゲル層１６上に注入し、乾燥することによって形成できる。また、前記酸化還元酵素としては、例えば、前述のようなものが使用できる。
【００９３】
前記酵素液は、例えば、酵素を溶媒に十分に溶解させて調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、エタノール、メタノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等があげられ、そのｐＨは、酵素の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、５〜１０の範囲が好ましく、より好ましくは６〜９の範囲、特に好ましくは７〜８の範囲である。また、水としては、例えば、精製水、蒸留水、超純水等があげられ、この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサが作製可能であることから超純水が好ましい。
【００９４】
前記酵素液中の試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、１〜１０ＫＵ／ｍＬの範囲が好ましく、より好ましくは３〜６ＫＵ／ｍＬの範囲である。
【００９５】
また、前記酵素液は、さらに界面活性剤を含むことが好ましく、特に両性界面活性剤を含むことが好ましい。前記両性界面活性剤としては、例えば、前述と同様のものが使用できる。
【００９６】
この酵素液は、酸化還元酵素の他に、例えば、酸化還元酵素の基質とならない糖類や、アミノ酸およびその誘導体、イミダゾール等のアミン化合物、ベタイン等を含んでもよい。前記糖類としては、例えば、スクロース、ラフィノース、ラクチトール、リビトール、アラビトール等があげられる。これらの中でも、前記糖類は、例えば、酵素の安定性向上に、前記アミノ酸、その誘導体およびベタインは、例えば、試薬の乾燥による固化の防止、イミダゾールは、例えば、メディエータの安定化等の目的で添加することができる。
【００９７】
前記酵素液の注入量は、形成する酵素試薬層１７の大きさ、試薬の濃度、試料の量、測定対象物の種類等により適宜決定できる。
【００９８】
注入した前記酵素液の乾燥手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用でき、これらの手段を組み合わせてもよい。乾燥条件としては、例えば、温度１０〜６０℃の範囲、相対湿度ＲＨ５〜４０％の範囲、時間１〜６０分の範囲である。また、試薬として酵素を使用する場合には、酵素の種類に応じて、失活しないように適宜温度を設定すればよい。
【００９９】
つぎに、図１（Ｅ）に示すように、絶縁層１４上にスペーサー１８を配置する。図示のように、スペーサー１８は、前記酵素試薬層１７に対応する箇所が開口部となっている。
【０１００】
前記スペーサー１８の材料としては、例えば、樹脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜１４との接着だけでなく、後述するカバー１９も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスペーサーを形成してもよい。
【０１０１】
つぎに、図１（Ｆ）に示すように、前記スペーサー１７上にカバー１９を配置する。前記カバー１９の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは、ＰＥＴ等の透明樹脂があげられる。
【０１０２】
このようにして作製したバイオセンサ１は、長期間保存する場合、湿気の影響を防ぐため、例えば、モレキュラーシーブ、シリカゲル、酸化カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。
【０１０３】
このバイオセンサ１は、例えば、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、前記バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合わせて使用できる。
【０１０４】
このバイオセンサ１の使用方法について、試料が全血、測定対象物がグルコース、酸化還元酵素がＧＤＨ、メディエータがフェリシアン化カリウムである例をあげて説明する。
【０１０５】
まず、全血試料をバイオセンサ１の開口部２１の一端に接触させる。この開口部２１は、前述のようにキャピラリー構造となっており、その他端に対応するカバー１９には空気孔２０が設けられているため、毛管現象によって前記試料が内部に吸引される。吸引された前記試料は、検出部１５上に設けられた酵素試薬層１７に浸透し、酵素試薬層１７中のＧＤＨを溶解して、さらに酵素試薬層１７の下層である無機ゲル層１６表面に達する。そして、表面に達した試料中のグルコースと、ＧＤＨと、無機ゲル層１６中のフェリシアン化カリウムとが反応する。具体的には、測定対象物であるグルコースはＧＤＨにより酸化され、その酸化反応により移動した電子によって、フェリシアン化カリウムが還元され、フェロシアン化カリウム（フェロシアンイオン）が生成される。
【０１０６】
この際、試料は酵素試薬層１７を通過して無機ゲル層１６に達するが、無機ゲル層１６を通過して電極表面に到達することはない。このため、還元されたフェロシアン化カリウムが試料中の溶存酸素によって再酸化することが防止できると考えられ、これによって測定精度の低下が抑制される。なお、電極表面に水分が到達していないことは、電子顕微鏡によって確認されている。また、前記試料中に含まれる赤血球等の不純物も、層状無機化合物の間を通過することができないため、この無機ゲル層１６を通過することなく、電極１２、１３表面への吸着も防止される。
【０１０７】
そして、無機ゲル層１６中で還元されたフェロシアン化カリウムと、無機ゲル層１６の下に位置する電極との間で、電子授受が行われ、これによってグルコース濃度が測定できるのである。具体的には以下のように行うことができる。
【０１０８】
全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極１３と作用極１２との間に電圧を印加して、電極と接触している前記還元型のフェロシアン化カリウム（フェロシアンイオン）を電気化学的にフェリシアン化カリウムに酸化し、その際の酸化電流を、作用極１２のリード部１２ａを介して前記電気信号を測定する手段等によって検出する。この酸化電流の値は、試料中のグルコース濃度に比例するため、これを前記演算手段によりグルコース濃度に演算すれば、試料中のグルコース濃度を求めることができる。
【０１０９】
このようなバイオセンサによれば、前述のように溶存酸素等の影響による、還元型メディエータの再酸化が防止され、測定の精度や再現性が向上できる。
【０１１０】
本実施形態においては、本発明のバイオセンサをグルコース測定に適用する例を示したが、これには制限されず、例えば、測定対象物に応じて試薬を適宜決定し、各種測定対象についてのバイオセンサとすることができる。具体的には、例えば、乳酸測定用バイオセンサの場合はラクテートオキシダーゼ、アルコール測定用バイオセンサの場合はアルコールオキシダーゼ、コレステロール測定用センサの場合はコレステロールオキシダーゼ等が使用できる。また、グルコース測定用バイオセンサの場合、例えば、ピラノースオキシダーゼやグルコースオキシダーゼ等も試薬として使用できる。
【０１１１】
また、前記無機ゲル層と酵素試薬層とを積層する代りに、前述の層状無機化合物等を分散した分散液に、さらに酸化還元酵素を添加して、検出部１５に、酵素試薬層と無機ゲル層を兼ねる単層を形成してもよい。この場合、前記分散液における酸化還元酵素量等は特に制限されず、例えば、前述のような添加量を参考にできる。
【実施例１】
【０１１２】
以下に示すようにして、前記図１（Ｆ）と同じ構造のグルコースセンサを作製した。
【０１１３】
まず、グルコースセンサの絶縁基板１１として、ＰＥＴ製基板（長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部をそれぞれ有する作用極１２および対極１３からなるカーボン電極系を形成した。
【０１１４】
つぎに、以下に示すようにして前記電極上に絶縁層１４を形成した。まず、絶縁性樹脂ポリエステルを、濃度７５重量％になるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。印刷条件は、３００メッシュスクリーン、スキージ圧４０ｋｇであり、印刷する量は、電極面積１ｃｍ２当たり０．００２ｍＬとした。なお、検出部１５上と、リード部１２ａ、１３ａ上には、スクリーン印刷を行わなかった。そして、９０℃で６０分間加熱処理することによって絶縁層１４を形成した。
【０１１５】
続いて、前記絶縁層１４を形成しなかった前記検出部１５に、以下に示すようにして無機ゲル層１６を形成した。まず、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」（コープケミカル社製）０．６ｇを精製水１００ｍＬに懸濁し、約８〜２４時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液のｐＨは、約１０であった。この合成スメクタイト懸濁液１０ｍＬに、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液０．１ｍＬ、１．０Ｍ ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）５．０ｍＬおよび精製水４．０ｍＬをこの順序で添加し、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（アルドリッチ社製）１．０ｇを混合した。この混合液を無機ゲル層形成液とする（ｐＨ７．５）。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。
【０１１６】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ
［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３ ５．０％（ｗ／ｖ）
【０１１７】
この無機ゲル形成液１．０μＬを、検出部１５に分注した。なお、検出部１５の表面積は約０．１ｃｍ２であり、前記検出部１５における電極１２、１３の表面積は約０．１２ｃｍ２であった。そして、これを、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて、無機ゲル層１６を形成した。
【０１１８】
さらに、前記無機ゲル層１６の上に、酵素試薬層１７を形成した。これは、５０００Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ水溶液１．０μＬを、検出部１５の前記無機ゲル層１６の上に分注して、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて形成した。
【０１１９】
最後に、開口部を有するスペーサー１８を絶縁層１４上に配置し、さらに、前記スペーサー１８上に空気孔となる貫通孔２０を有するカバー１９を配置してバイオセンサ１を作製した。前記カバー１９と絶縁層１４とに挟まれたスペーサー１８の開口部の空間が、キャピラリー構造となるため、これを試料供給部２１とした。
【０１２０】
なお、比較例１としては、無機ゲル層形成液の調製において、前記合成スメクタイト懸濁液の代りに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。
【実施例２】
【０１２１】
前記実施例１で作製したグルコースセンサを用いて、グルコース濃度に応じた応答電流の経時変化を測定した例である。
【０１２２】
液体試料としては、ヒト全血を用いた。まず、採血後の全血を３７℃で約１日放置して、グルコース濃度０ｍｇ／１００ｍＬに調整した。つぎに、これにグルコースを添加して、各種グルコース濃度（約２００、４００、６００ｍｇ／１００ｍＬ）の試料を調製した。なお、グルコース無添加の全血をグルコース濃度０ｍｇ／１００ｍＬとした。そして、実施例２として、前記グルコースセンサ１に２００ｍＶの電圧を印加してから、試料を試料供給部２１に点着し、その点着５秒後の応答電流のタイムコースを測定した。比較例２として、比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例および比較例ともに、計３回ずつ測定を行った（ｎ＝３）。これらの結果を図３（Ａ）（Ｂ）に示す。図３は、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図（Ａ）が実施例２、同図Ｂが比較例２の結果をそれぞれ示す。
【０１２３】
同図（Ａ）に示すように、実施例１のグルコースセンサによれば、同図（Ｂ）に示す比較例１のグルコースセンサよりも、応答電流値のピークがより早い時間で現れ、かつピーク電流値も高い値が得られた。このように高いピーク電流値が得られたのは、実施例１のグルコースセンサによれば、無機ゲル層において酸素が遮断されるため、グルコースとＧＤＨとの反応によって還元されたメディエータが、酸素によって再酸化されることなく、電気化学的に酸化され、その酸化電流を測定できたからであると考えられる。また、電流値のピークが早い時間で現れたのは、電極上の無機ゲル層中において、スメクタイトのシート内にメディエータである［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３がはまり込んで強固に固定化されているため、電極表面にスメクタイトを介してメディエータがゆるく固定化された状態となり、電極近傍のメディエータ濃度が大きくなって、反応速度が増大したものと考えられる。
【実施例３】
【０１２４】
本発明のグルコースセンサを用いて、試料の点着から一定時間経過後の応答電流値の再現性を確認した例である。
【０１２５】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度０、１０３、４１５、６１６、８２４ｍｇ／１００ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
【０１２６】
実施例３として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度（ルーセンタイトＳＷＮ）を０．２４％（ｗ／ｖ）とした以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。前記グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。前記測定は、同じグルコースセンサを用いて、各試料について、それぞれ計１０回（ｎ＝１０）行った。また、比較例３として、前記比較例１のグルコースセンサを用いて、前記実施例３と同様にして測定を行った（ｎ＝１０）。
【０１２７】
測定した実施例３および比較例３の応答電流値（ｎ−１０）から、測定の再現性を示すＣＶ値を求めた。これらの結果を下記表２に示す。
【０１２８】
【０１２９】
前記表２の結果から、比較例３は、特に試料中のグルコース濃度を８２４ｍｇ／１００ｍＬに増加させたことによって、ＣＶ値が７．３０と大幅に変化したのに対し、実施例３によれば、ＣＶ値は２．３４〜３．０２の間で安定しており、前記グルコース濃度の増加に拘わらず、再現性よく測定できることがわかる。この結果から、実施例のグルコースセンサによれば、スメクタイトを含まない比較例のバイオセンサよりも高い再現性で測定できるといえる。
【実施例４】
【０１３０】
前記実施例３で作製したグルコースセンサについて、一定湿度および温度に曝露することによる影響を確認した例である。
【０１３１】
前記グルコースセンサを、相対湿度８０％、温度４０℃に維持した室内に１７時間放置して曝露した後、電極間に２００ｍＶの電圧を印加した。そして、グルコース濃度０、６００ｍｇ／１００ｍＬとなるようにグルコースを添加したヒト全血試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これを実施例４とする。また、比較例４として、前記比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例４および比較例４のコントロールとして、それぞれ前記グルコースセンサを用いて、前記通常の室温湿度（約２５℃、約６０％Ｒｈ）条件下で、前記試料についての応答電流値を測定した。そして、コントロールの電流値を１００％とした場合の、前記実施例４および比較例４の感度（％）を求めた。以下の表３に結果を示す。
【０１３２】
【０１３３】
前記表３に示すように、実施例３のグルコースセンサによれば、高湿度条件に曝露しても、比較例１のグルコースセンサに比べて曝露後の感度低下が小さいことがわかった。つまり、実施例３のグルコースセンサは、前述のように、無機ゲル層によって、例えば、空気中の水分や試料中の溶存酸素が遮断され、メディエータが酸素と接することを防止できるため、湿度に対する耐性を有しているといえる。
【実施例５】
【０１３４】
本発明のグルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。
【０１３５】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度を１１１ｍｇ／１００ｍＬになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が２５．１ｍｍＨｇ付近（未調整）、９２．０ｍｍＨｇ付近、および１７１．６ｍｍＨｇ付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、溶存酸素未調整（２５．１ｍｍＨｇ）の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度（９２．０ｍｍＨｇ、１７１．６ｍｍＨｇ）に調整した。
【０１３６】
実施例５として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度（ルーセンタイトＳＷＮ）を、０．１２％、０．２４％、０．３６％、０．４８％（ｗ／ｖ）とした以外は、前記実施例１と同様にして４種類のグルコースセンサを作製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整（２５．１ｍｍＨｇ）の試料に対する前記応答電流値を基準として、下記式（１０）より、各試料（溶存酸素９２．０ｍｍＨｇ、１７１．６ｍｍＨｇ）の応答電流値の変化率（％）を求めた。また、比較例５として、前記比較例１のグルコースセンサについても同様にして測定を行い、変化率（％）を求めた。これらの結果を図４に示す。図４は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、図において△、○、□、▽はそれぞれ実施例５であり、●は比較例５である。なお、変化率（％）は、絶対値が大きい程、応答電流が変化したことになる。
【０１３７】
変化率（％）＝［（Ａ／Ｂ）−１］×１００ ・・・（１０）
Ａ：溶存酸素調整試料の応答電流
Ｂ：溶存酸素未調整試料の応答電流
【０１３８】
図４に示すように、実施例５によれば、試料の溶存酸素を増加させても、比較例５に比べて、変化率（％）の絶対値は小さかった。このことから、スメクタイトを含む実施例のグルコースセンサによれば、溶存酸素による感度低下が小さく、試料等の溶液中の溶存酸素の影響を軽減できることがわかった。
【実施例６】
【０１３９】
酸化還元酵素としてＧＯＤを用いた本発明のグルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。
【０１４０】
無機ゲル層形成液として、以下の最終濃度となるように調製した分散液を使用し、酵素溶液として、ＧＤＨ水溶液の代りに１２００Ｕ／ｍＬのＧＯＤ溶液（天野社製）を使用し、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３の代りにフェリシアン化カリウム（和光純薬工業社製）を、ＡＣＥＳ緩衝液の代りにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４：同仁化学研究所製）を使用した以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製した。
【０１４１】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．１％（ｗ／ｖ）
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝液 １００ｍＭ
フェリシアン化カリウム ３．０％（ｗ／ｖ）
【０１４２】
なお、比較例６としては、無機ゲル層および酵素試薬層を形成する代りに、ＧＯＤ１２００Ｕ／ｍＬおよびフェリシアン化カリウム３．０％（ｗ／ｖ）を含む溶液１μＬを検出部に注入し、乾燥する以外は、前記実施例６と同様にしてバイオセンサを作製した。
【０１４３】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度を６００ｍｇ／１００ｍＬになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が４８．９ｍｍＨｇ（未調整）、１０６．４ｍｍＨｇ、および１８０．４ｍｍＨｇになるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。
【０１４４】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度６００ｍｇ／１００ｍＬの試料を調製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に５００ｍＶの電圧を印加し、試料点着５秒後の応答電流値を測定した。比較例６のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。そして、実施例６および比較例６について、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整（４８．９ｍｍＨｇ）の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（１０）より、各試料（溶存酸素１０６．４ｍｍＨｇ、１８０．４ｍｍＨｇ）に対する応答電流値の変化率（％）を求めた。これらの結果を図５に示す。図５は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、同図において○が実施例６、●が比較例６の結果である。
【０１４５】
図５に示すように、酸化還元酵素としてＧＯＤを用いた実施例６によっても、比較例６に比べて、試料中の溶存酸素による感度低下が小さく、溶存酸素の影響を軽減できたことがわかった。
【実施例７】
【０１４６】
実施例７は、界面活性剤としてＣＨＡＰＳ（両性界面活性剤）を、アミン系緩衝剤としてＡＣＥＳ緩衝液をそれぞれ用いた実施例１で作製したグルコースセンサを使用した。一方、比較例７としては、界面活性剤としてＣＨＡＰＳに代えてコール酸（アニオン系界面活性剤）を使用し、緩衝剤としてＡＣＥＳに代えてリン酸ナトリウムを使用した以外は、前記実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製して、これを用いた。
【０１４７】
ヒト全血にグルコースを添加して、グルコース濃度１００ｍｇ／１００ｍＬの試料を調製し、さらに溶存酸素が３４．７ｍｍＨｇ（未調整）、１１７．１ｍｍＨｇ、および１８５．３ｍｍＨｇ付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例５と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。
【０１４８】
そして、グルコースセンサの電極間に２００ｍＶの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着５秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（１０）より、他の試料に対する応答電流値の変化率（％）を求めた。また、比較例７も、前記グルコースセンサを用いて同様にして測定を行い、変化率（％）を求めた。これらの結果を図６に示す。図６は、試料中における溶存酸素濃度と変化率（％）との関係を示すグラフであり、同図において○が実施例７、●が比較例７の結果である。
【０１４９】
図６に示すように、両性界面活性剤でなくアニオン性界面活性剤を用い、緩衝剤としてアミン系緩衝剤でなくリン酸ナトリウムを用いた比較例７のグルコースセンサでは、スメクタイトを含有しているにも拘わらず、実施例７と比較して、溶存酸素の影響を多大に受けていることがわかる。このことから、実施例のように、両性界面活性剤およびアミン系緩衝剤の存在下で、スメクタイトを含む無機ゲル層を形成することによって、試料中の酸素による影響を防止できることがわかる。また、比較例のようにアニオン性界面活性剤を用いた場合、分散液を電極上に載せ難く、作製自体が困難であった。
【実施例８】
【０１５０】
以下に示す方法により、無機ゲル形成液を調製した以外は、前記実施例１と同様にしてバイオセンサを作製した。
【０１５１】
合成スメクタイト（商品名ルーセンタイトＳＷＮ：コープケミカル社製）０．６ｇ、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液１ｇおよび精製水９８．４ｇとを混合し（合計１００ｇ）、このスメクタイト懸濁液を一晩攪拌した。攪拌後の懸濁液４０ｇに、２ＮのＨＣｌ（４ｇ）を添加して一晩（約２４時間）攪拌した（攪拌機：商品名マグネチックスターラーＨＳ−３Ｅ；株式会社井内盛栄堂製）。ＨＣｌの添加によって、前記懸濁液は白濁したが、一晩攪拌した後、透明となった。さらに、この懸濁液に、２００ｍＭコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５）を、１：１となるように混合した。この緩衝液を混合した後の懸濁液は、そのｐＨが約４．５であった。前記緩衝剤を加えた懸濁液に、さらにメディエータとして［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（アルドリッチ社製）を５％（ｗ／ｖ）となるように添加して、これを無機ゲル層形成液とした。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。
【０１５２】
ルーセンタイトＳＷＮ ０．３％（ｗ／ｖ）
ＣＨＡＰＳ ０．３％（ｗ／ｖ）
コハク酸−酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．５） １００ｍＭ
［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３ ５．０％（ｗ／ｖ）
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
以上のように、本発明のバイオセンサの製造方法によれば、例えば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための還元型メディエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できるため、前記還元型メディエータの再酸化による測定誤差が解消され、測定精度に優れるバイオセンサを提供できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサの製造方法であって、
電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含むバイオセンサの製造方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が両性界面活性剤である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する界面活性剤である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記両性界面活性剤が、アルキルアミノカルボン酸塩、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している界面活性剤である請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤が、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記両性界面活性剤が、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタインである請求項２記載の製造方法。
【請求項８】
前記両性界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびアルキルヒドロキシスルホベタインからなる群から選択された少なくとも一つのスルホベタインである請求項２記載の製造方法。
【請求項９】
前記緩衝剤がアミン系緩衝剤である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１０】
前記アミン系緩衝剤が、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴｒｉｃｉｎｅおよびＡＤＡからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記緩衝剤がカルボキシル基を有する緩衝剤である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１２】
前記カルボキシル基を有する緩衝剤が、酢酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸−酢酸Ｎａ緩衝剤およびコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤である請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、前記無機ゲル層を形成する請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１４】
界面活性剤と層状無機化合物とを分散媒に分散させた後、緩衝剤を添加し、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
層状無機化合物を分散媒に分散させた後、界面活性剤を添加し、続いて、アミン系緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
前記メディエータが、ファリシアン化カリウム、シトクロムＣ、ＰＱＱ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、銅錯体およびルテニウム錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
前記アミン系緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨが、５〜９の範囲である請求項１５記載の製造方法。
【請求項１８】
層状無機化合物を分散媒に分散させ、強酸性条件下で攪拌した後、界面活性剤を添加し、続いてカルボキシル基を有する緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１４記載の製造方法。
【請求項１９】
前記メディエータが、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フェロセン、フェナジンメトサルフェート、インドフェノールおよびメチレンブルーからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
前記強酸性条件が、ｐＨ１〜３の範囲である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２１】
カルボキシル基を有する緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨが、３〜６の範囲である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２２】
前記無機ゲル層が、前記メディエータの自然酸化を防止する層である請求項１記載の製造方法。
【請求項２３】
前記無機ゲル層の上に、さらに酸化還元酵素を含有する層を形成する請求項１記の製造方法。
【請求項２４】
前記分散液に、さらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を形成する請求項１３記載の製造方法。
【請求項２５】
前記層状無機化合物が、層状粘土鉱物である請求項１記載の製造方法。
【請求項２６】
前記層状粘土鉱物が、膨潤性層状粘土鉱物である請求項２５記載の製造方法。
【請求項２７】
前記分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合が、層状無機化合物０．３ｇに対して、界面活性剤１〜２００ｍｍｏｌの範囲である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２８】
前記分散液における層状無機化合物と緩衝剤との添加割合が、層状無機化合物０．３ｇに対して、緩衝剤１〜１０００ｍＭの範囲である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２９】
前記酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼおよびウリカーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酵素である請求項２３または２４記載の製造方法。
【請求項３０】
前記メディエータが、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンならびにその誘導体、インドフェノール誘導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メチレンブルー、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂおよび銅錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１記載の製造方法。
【請求項３１】
請求項１記載のバイオセンサの製造方法により製造したバイオセンサ。
【請求項１】
バイオセンサの製造方法であって、
電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含むバイオセンサの製造方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が両性界面活性剤である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する界面活性剤である請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記両性界面活性剤が、アルキルアミノカルボン酸塩、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している界面活性剤である請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
前記両性界面活性剤が、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記両性界面活性剤が、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタインである請求項２記載の製造方法。
【請求項８】
前記両性界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびアルキルヒドロキシスルホベタインからなる群から選択された少なくとも一つのスルホベタインである請求項２記載の製造方法。
【請求項９】
前記緩衝剤がアミン系緩衝剤である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１０】
前記アミン系緩衝剤が、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＴｒｉｃｉｎｅおよびＡＤＡからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記緩衝剤がカルボキシル基を有する緩衝剤である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１２】
前記カルボキシル基を有する緩衝剤が、酢酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸−酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸−酢酸Ｎａ緩衝剤およびコハク酸−酢酸Ｎａ緩衝剤からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝剤である請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、前記無機ゲル層を形成する請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１４】
界面活性剤と層状無機化合物とを分散媒に分散させた後、緩衝剤を添加し、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
層状無機化合物を分散媒に分散させた後、界面活性剤を添加し、続いて、アミン系緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
前記メディエータが、ファリシアン化カリウム、シトクロムＣ、ＰＱＱ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、銅錯体およびルテニウム錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
前記アミン系緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨが、５〜９の範囲である請求項１５記載の製造方法。
【請求項１８】
層状無機化合物を分散媒に分散させ、強酸性条件下で攪拌した後、界面活性剤を添加し、続いてカルボキシル基を有する緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項１４記載の製造方法。
【請求項１９】
前記メディエータが、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フェロセン、フェナジンメトサルフェート、インドフェノールおよびメチレンブルーからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
前記強酸性条件が、ｐＨ１〜３の範囲である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２１】
カルボキシル基を有する緩衝剤を添加した後の分散液のｐＨが、３〜６の範囲である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２２】
前記無機ゲル層が、前記メディエータの自然酸化を防止する層である請求項１記載の製造方法。
【請求項２３】
前記無機ゲル層の上に、さらに酸化還元酵素を含有する層を形成する請求項１記の製造方法。
【請求項２４】
前記分散液に、さらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を形成する請求項１３記載の製造方法。
【請求項２５】
前記層状無機化合物が、層状粘土鉱物である請求項１記載の製造方法。
【請求項２６】
前記層状粘土鉱物が、膨潤性層状粘土鉱物である請求項２５記載の製造方法。
【請求項２７】
前記分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合が、層状無機化合物０．３ｇに対して、界面活性剤１〜２００ｍｍｏｌの範囲である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２８】
前記分散液における層状無機化合物と緩衝剤との添加割合が、層状無機化合物０．３ｇに対して、緩衝剤１〜１０００ｍＭの範囲である請求項１３記載の製造方法。
【請求項２９】
前記酸化還元酵素が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼおよびウリカーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酵素である請求項２３または２４記載の製造方法。
【請求項３０】
前記メディエータが、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンならびにその誘導体、インドフェノール誘導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メチレンブルー、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂおよび銅錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１記載の製造方法。
【請求項３１】
請求項１記載のバイオセンサの製造方法により製造したバイオセンサ。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４３１４６
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【発行日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５１６１（Ｐ２００５−５１５１６１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６０８５
【国際出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【発行日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６０８５
【国際出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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