バイオセンサーを用いた測定方法
【課題】 生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことにより、活性を維持した生理活性物質に対する相互作用を分析する方法を提供すること。
【解決手段】 バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法。
【解決手段】 バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いた測定方法に関する。より詳細には、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析において一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００４】
上記の通り、従来の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定においては、測定チップに固定化された生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定が行われていたが、測定チップに固定化された該生理活性物質の生物学的活性の測定が行われていなかったため、必ずしも、本来観察すべき活性を維持した状態での生理活性物質に対する相互作用の測定ができていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことにより、活性を維持した生理活性物質に対する相互作用を分析する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質はタンパク質である。さらに好ましくは、生理活性物質は酵素である。
好ましくは、生理活性物質の基板への固定化量の測定を表面プラズモン共鳴分析により行う。
【０００９】
好ましくは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えている表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるためのバイオセンサーであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが前記ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されたバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴分析を行う。
好ましくは、生理活性物質の生物学的活性の測定を分光測定により行う。
【００１０】
本発明の測定方法は、好ましくは、（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を確認する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で確認した固定化方法により生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む。
【００１１】
本発明の測定方法は、好ましくは、（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を指標として、該バイオセンサー基板への生理活性物質の固定化方法を最適化する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で最適化した固定化方法で生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む。
【００１２】
好ましくは、工程（１）における生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値の測定と、工程（２）における生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定とを同一のバイオセンサー基板において行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の測定方法によれば、測定した蛋白質の固定量と生物学的活性の測定が可能である。また、本測定方法によって決められた活性を維持した固定化蛋白質に対する化合物の相互作用測定を行うことにより、蛋白質に相互作用する化合物を的確に分析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーを用いた測定方法において、該生理活性物質の固定化量と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを、上記した同一のバイオセンサーにおいて行うことを特徴とする方法である。本発明においては、生理活性物質の固定化量と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことにより、該生理活性物質と被験物質の相互作用測定に先立ち、最も理想的な状態に該生理活性物質を固定化することが可能になるため、該生理活性物質と被験物質の相互作用測定を的確に行うことができる。
【００１５】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１６】
本発明で用いるバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００１９】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２０】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は親水性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、親水性高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００２１】
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２２】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２３】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２４】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２５】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００２６】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００２７】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００２８】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００２９】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００３０】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００３１】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００３２】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００３３】
本発明で用いる親水性高分子化合物としては、例えばポリヒドロキシ高分子化合物、具体的には多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００３４】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００３５】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy forchemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００３６】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００３７】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００３８】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００３９】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４０】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００４１】
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４２】
本発明で用いる基板はさらに、一般式（A）で表される化合物を基板に結合するためのリンカーを有していてもよい。
本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ20―Ｌ20―Ｙ20 （４）
（式中、Ｘ20は、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を示し、Ｌ20は２価の連結基を示し、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を示す。）
【００４３】
式（４）において、Ｘ20は疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
【００４４】
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。
【００４５】
また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。
【００４６】
式（４）において、Ｌ20は２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸ20と別の分子のＹ20が結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。
【００４７】
式（４）において、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。
【００４８】
以下に式（４）の化合物の具体例を示すが、本発明で使用できる式（４）の化合物はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
【化１】
【００５０】
本発明におけるバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００５１】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００５２】
バイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用し、かつそれ自体が何らかの生理活性を有する物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。上記の中でもタンパク質が好ましく、酵素が特に好ましい。
【００５３】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００５５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００５６】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００５７】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００５８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００５９】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
【００６０】
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６１】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６２】
本発明では、生理活性物質の固定量の測定及びセンサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００６３】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００６４】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００６５】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００６６】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００６７】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００６８】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００６９】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００７３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００７４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００７５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００７６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００７７】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００７８】
本発明で用いるバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００７９】
本発明の測定方法においては、上記のように表面プラズモン共鳴分析等の手法により生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する前に、該生理活性物質が生物学的活性を有した状態で固定化されているかについて確認を行うことができる。生物学的活性を有していない場合は生物学的活性を示すように固定化方法の最適化を行うことが好ましい。具体的には、同一のバイオセンサー基板において、バイオセンサーを用いて該生理活性物質の固定量の測定と、基板に固定化された生物学的活性値の測定を行い、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を算出する。
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
本発明においては、式１で示された生物学的活性値を確認、あるいは最適化した後に、生理活性物質と被験物質との相互作用の検出又は測定を行うことができる。
【００８０】
生理活性物質の具体例として、タンパク質を挙げた場合、センサー基板に固定化する際の生物学的活性低下の原因としては、（１）固定化緩衝液のｐＨ、（２）蛋白固定化膜の荷電、（３）固定化密度、（４）蛋白固定化膜の官能基とタンパク質の共有結合形成、などの影響によるタンパク質の立体構造変化が考えられる。従って、生理活性物質の生物学的活性を向上させるためには、（式１）で示された生物学的活性値を指標として、これら（１）〜（４）の原因によって、固定化の方法を試行錯誤して決めることになる。
【００８１】
タンパク質の立体構造が変化し生物学的活性を失った状態（変性）で、該タンパク質に対する化合物の相互作用の測定を行った場合は、特異的な結合が検出されず、一方で非特異的な結合が多く検出されるようになる。実質的には、固定化されたタンパク質の１００％が生物学的活性を維持した状態になるように固定化することは困難であるが、５０％以上のタンパク質が生物学的活性を有していることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。
【００８２】
本発明で言う生物学的活性としては、酵素活性、抗体活性、レセプター活性等がある。酵素とは、食物の消化をはじめ体の中で起こるいろいろな化学反応をスムーズに進める触媒の作用を持っているタンパク質の総称である。触媒とは、一般に化学反応を効率よく進めるための仲立ちの働きをもつものを言う。
【００８３】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第ＩＶ章に記載されている。また、検出方法としては （１）分光学的測定法、（２）蛍光法、（３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 タンパク質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００８４】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うころにより酵素活性を測定することができる。
【００８５】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００８６】
例えば、ELISA用プラスチックプレートで抗体活性を測定する場合には、プラスチックプレートの各穴の内壁に目的抗原を結合させ、そこに測定したい抗体を含む被検物を加えて反応させる。抗体は固相の抗原に結合する。その結合量は、被検物中の抗体量が多いほど多くなる。さらに、酵素標識した抗免疫イムノグロブリン抗体をさせる。標識抗体は、固相に結合している抗体に結合する。標識抗体の結合量は抗体が多いほど多くなる。未反応の標識抗体を除去し、その酵素の作用を受けて発色するような基質を加える。基質は酵素量に応じて発色するから結合している酵素標識抗体が多いほど強い色調を呈する。この溶液の色の強さを比色計で測定することで被検物の抗体量を知ることができる。既知量の抗体を段階希釈したものそれぞれについて測定しておけば、その値と比較することで被検物中の抗体量を定量化できる。
【００８７】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出すことができる。
【００８８】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
（１）表面プラズモン共鳴測定装置及び誘電体ブロック
以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。
【００９０】
図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。
【００９１】
なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。
【００９２】
またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。
【００９３】
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。
【００９４】
図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。
【００９５】
この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。
【００９６】
（２）測定チップ
以下の実験では、特開２００５−９８７７０号公報の記載に準じた測定チップ（ヒドロゲル被覆チップ）を用いた。具体的には以下の手順によりヒドロゲルで被覆された測定チップを作成した。
【００９７】
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）で溶解した16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
【００９８】
次に、16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオールで被覆した表面に10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）を接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させた。その後表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをヒドロゲルで被覆された測定チップとした。
【００９９】
また、疎水性ポリマーで被覆したバイオセンサー用チップ（PMMA測定チップ）を以下の通り作製した。
（ｉ）ポリメチルメタクリレートでコーティングしたバイオセンサー用チップの作製 金膜の厚さが50nmになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは20nmであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。
【０１００】
（ｉｉ）PMMA表面へのCOOH基の導入
上記のように作成したポリメチルメタクリレートをコーティングしたカバーガラスをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。
【０１０１】
（ｉｉｉ）リンカーを有する表面の作成
上記（ｉｉ）で作成したPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/PEO-C表面チップと呼ぶ。
【０１０２】
実施例１
上記（２）で作成したヒドロゲル被覆測定チップにトリプシン（Worthington社製）を固定化し、測定は上記（１）に記載の表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
【０１０３】
（１）トリプシンの固定化
表１に記載の組成の溶液に、自己消化防止のためトリプシンの阻害剤であるロイペプチン（ＩＣＮ社製）を10μM溶解したトリプシン溶液を準備した。
【０１０４】
ヒドロゲル被覆チップに、１−エチル−２，３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、10mMリン酸バッファーで洗浄した。次に上記のトリプシン溶液を添加し、表１に記載の時間静置後、10mMリン酸バッファーで一次洗浄後、表１に記載の洗浄液で二次洗浄を行い、さらにその後10mMリン酸バッファーで洗浄した。尚、二次洗浄をNaOH10mMで行うと、非特異吸着したたんぱく質が洗い流され、相互作用測定時のベースラインドリフトが安定化することがわかっている。
【０１０５】
更に、エタノールアミン・HCl溶液（１Ｍ，pH8.5）測定チップに添加後、10mMリン酸バッファーで洗浄することにより、トリプシンと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
【０１０６】
以上の操作により、トリプシンを測定チップ表面に共有結合で固定した。トリプシンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシン固定量（ＲＵ値）とした。トリプシンの固定量を表１に示す。
【０１０７】
（２）トリプシンの生物学的活性の測定
上記（１）でトリプシンを固定化したチップを用いて、トリプシンの酵素活性測定を行った。本実施例のチップは、図２に示されるように井戸状の構造を有しているため、容易に酵素活性測定を行うことができる。具体的には、トリプシンに特異的な基質（ベンゾイルーＬ−アルギニンー４メチルクマリンー７アミド 以下Bz-Arg-MCAと表記する；（株）ペルチド研究所）を反応させ分解物の蛍光測定を行った。
【０１０８】
（３）Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの反応
測定チップ内の10mMリン酸バッファーを抜きとって、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡを添加し、１２０分間反応させた。
【０１０９】
（４）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。測定結果を表１に示す。
【０１１０】
（５）化合物とトリプシンの相互作用測定
測定チップを10mMリン酸バッファーで洗浄後、本実施例の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、ロイペプチン（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）、および下記のキナーゼインヒビタ−、両親媒性化合物（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）を添加し、３分間静置後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を化合物の結合量とした。測定結果を表１に示す。
【０１１１】
【化２】
【０１１２】
【化３】
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
従来の固定化方法の決め方としては、以下の２つの方法があった。
（１）蛋白固定量が最も多い方法に決める。
（２）特異結合する化合物の結合量が最も多い方法に決める。
【０１１５】
今回の結果に対して、方法（１）を適用すると、実験No4の方法が選択され、また方法（２）を適用すると、実験No1の方法が選択される。しかしながら、表１の酵素活性値をみればわかるように、実験No1、No4の方法は、酵素活性が著しく低下している。キナーゼインヒビタ−や両親媒性化合物の結合量をみればわかるように、実験No1、No4の表面は、疎水的な化合物が非特異吸着しやすい状態になっており、ロイペプチンの結合についても非特異的な結合である可能性が高いといえる。本実験においては、特異的な阻害剤であるロイペプチンが結合し、一方で阻害能をもたない化合物が結合しない実験No2の方法が、化合物との相互作用測定に最も適した表面であると結論することができる。
【０１１６】
実施例２
本実施例のPMMA測定チップにトリプシン（Worthington社製）を固定化し、測定はBiacore3000（ビアコア社製）を用いて行った。
【０１１７】
（１）トリプシンの固定化
PMMA測定チップをBiacore 3000にセットし、実施例１と同様の条件でトリプシンを固定した。
【０１１８】
（２）トリプシンの生物学的活性の測定
上記（１）でトリプシンを固定化したチップを用いて、以下の方法でトリプシンの酵素活性測定を行った。チップをSurfacePrepUnit（ビアコア社製）にセットして、チップ表面を10mMリン酸バッファーで３回洗浄した後、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡを２μｌ注入し、１２０分間放置後回収した。
【０１１９】
（３）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。
【０１２０】
（４）化合物とトリプシンの相互作用測定
ロイペプチン溶液（0.00２mM、ＨＢＳ−Ｎバッファー）を添加し、１０分間反応後、共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシンに対するロイペプチン（ＩＣＮ社製）の結合量とした。
【０１２１】
測定チップを10mMリン酸バッファーで洗浄後、Biacore 3000にセットし、ロイペプチン（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）、および下記のキナーゼインヒビタ−、両親媒性化合物（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）を注入し、３分間静置後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を化合物の結合量とした。
【０１２２】
（５）測定結果
実施例１と同様の結論が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、表面プラズモン共鳴測定装置を示す。
【図２】図２は、誘電体ブロックを示す。
【符号の説明】
【０１２４】
１０ 測定ユニット
１１ 誘電体ブロック
１２ 金属膜
１３ 試料保持枠
１４ センシング物質
３１ レーザ光源
３２ 集光レンズ
４０ 光検出器
Ｓ４０ 出力信号
４００ ガイドロッド
４０１ スライドブロック
４０２ 精密ねじ
４０３ パルスモータ
４０４ モータコントローラ
４１０ ユニット連結体
４１１ 連結部材
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーを用いた測定方法に関する。より詳細には、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析において一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００４】
上記の通り、従来の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定においては、測定チップに固定化された生理活性物質と相互作用する物質の検出または測定が行われていたが、測定チップに固定化された該生理活性物質の生物学的活性の測定が行われていなかったため、必ずしも、本来観察すべき活性を維持した状態での生理活性物質に対する相互作用の測定ができていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことにより、活性を維持した生理活性物質に対する相互作用を分析する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明は、生理活性物質のバイオセンサー基板への固定化量の測定と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質はタンパク質である。さらに好ましくは、生理活性物質は酵素である。
好ましくは、生理活性物質の基板への固定化量の測定を表面プラズモン共鳴分析により行う。
【０００９】
好ましくは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えている表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるためのバイオセンサーであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが前記ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されたバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴分析を行う。
好ましくは、生理活性物質の生物学的活性の測定を分光測定により行う。
【００１０】
本発明の測定方法は、好ましくは、（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を確認する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で確認した固定化方法により生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む。
【００１１】
本発明の測定方法は、好ましくは、（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を指標として、該バイオセンサー基板への生理活性物質の固定化方法を最適化する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で最適化した固定化方法で生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む。
【００１２】
好ましくは、工程（１）における生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値の測定と、工程（２）における生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定とを同一のバイオセンサー基板において行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の測定方法によれば、測定した蛋白質の固定量と生物学的活性の測定が可能である。また、本測定方法によって決められた活性を維持した固定化蛋白質に対する化合物の相互作用測定を行うことにより、蛋白質に相互作用する化合物を的確に分析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、生理活性物質を基板に固定化したバイオセンサーを用いた測定方法において、該生理活性物質の固定化量と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを、上記した同一のバイオセンサーにおいて行うことを特徴とする方法である。本発明においては、生理活性物質の固定化量と、該生理活性物質の生物学的活性の測定とを同一のバイオセンサーにおいて行うことにより、該生理活性物質と被験物質の相互作用測定に先立ち、最も理想的な状態に該生理活性物質を固定化することが可能になるため、該生理活性物質と被験物質の相互作用測定を的確に行うことができる。
【００１５】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００１６】
本発明で用いるバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００１９】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２０】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は親水性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、親水性高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００２１】
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２２】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２３】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２４】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００２５】
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
【００２６】
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
【００２７】
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００２８】
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００２９】
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００３０】
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ3)1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。
【００３１】
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００３２】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００３３】
本発明で用いる親水性高分子化合物としては、例えばポリヒドロキシ高分子化合物、具体的には多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００３４】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００３５】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy forchemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００３６】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００３７】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００３８】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００３９】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４０】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００４１】
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４２】
本発明で用いる基板はさらに、一般式（A）で表される化合物を基板に結合するためのリンカーを有していてもよい。
本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ20―Ｌ20―Ｙ20 （４）
（式中、Ｘ20は、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を示し、Ｌ20は２価の連結基を示し、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を示す。）
【００４３】
式（４）において、Ｘ20は疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物又は自己組織化膜における官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
【００４４】
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。
【００４５】
また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。
【００４６】
式（４）において、Ｌ20は２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸ20と別の分子のＹ20が結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。
【００４７】
式（４）において、Ｙ20は一般式（A）で表される化合物と反応して共有結合を形成できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。
【００４８】
以下に式（４）の化合物の具体例を示すが、本発明で使用できる式（４）の化合物はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
【化１】
【００５０】
本発明におけるバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００５１】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＹを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００５２】
バイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用し、かつそれ自体が何らかの生理活性を有する物質であれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。上記の中でもタンパク質が好ましく、酵素が特に好ましい。
【００５３】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００５４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００５５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００５６】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００５７】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００５８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００５９】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
【００６０】
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６１】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６２】
本発明では、生理活性物質の固定量の測定及びセンサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００６３】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００６４】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００６５】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００６６】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００６７】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００６８】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００６９】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００７０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００７１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００７２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００７３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００７４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００７５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００７６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００７７】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００７８】
本発明で用いるバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００７９】
本発明の測定方法においては、上記のように表面プラズモン共鳴分析等の手法により生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する前に、該生理活性物質が生物学的活性を有した状態で固定化されているかについて確認を行うことができる。生物学的活性を有していない場合は生物学的活性を示すように固定化方法の最適化を行うことが好ましい。具体的には、同一のバイオセンサー基板において、バイオセンサーを用いて該生理活性物質の固定量の測定と、基板に固定化された生物学的活性値の測定を行い、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を算出する。
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
本発明においては、式１で示された生物学的活性値を確認、あるいは最適化した後に、生理活性物質と被験物質との相互作用の検出又は測定を行うことができる。
【００８０】
生理活性物質の具体例として、タンパク質を挙げた場合、センサー基板に固定化する際の生物学的活性低下の原因としては、（１）固定化緩衝液のｐＨ、（２）蛋白固定化膜の荷電、（３）固定化密度、（４）蛋白固定化膜の官能基とタンパク質の共有結合形成、などの影響によるタンパク質の立体構造変化が考えられる。従って、生理活性物質の生物学的活性を向上させるためには、（式１）で示された生物学的活性値を指標として、これら（１）〜（４）の原因によって、固定化の方法を試行錯誤して決めることになる。
【００８１】
タンパク質の立体構造が変化し生物学的活性を失った状態（変性）で、該タンパク質に対する化合物の相互作用の測定を行った場合は、特異的な結合が検出されず、一方で非特異的な結合が多く検出されるようになる。実質的には、固定化されたタンパク質の１００％が生物学的活性を維持した状態になるように固定化することは困難であるが、５０％以上のタンパク質が生物学的活性を有していることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。
【００８２】
本発明で言う生物学的活性としては、酵素活性、抗体活性、レセプター活性等がある。酵素とは、食物の消化をはじめ体の中で起こるいろいろな化学反応をスムーズに進める触媒の作用を持っているタンパク質の総称である。触媒とは、一般に化学反応を効率よく進めるための仲立ちの働きをもつものを言う。
【００８３】
酵素活性の測定原理については蛋白質、酵素の基礎実験法（堀尾武一、山下仁平）第ＩＶ章に記載されている。また、検出方法としては （１）分光学的測定法、（２）蛍光法、（３）電極法、（４）発光法等があり、例えば新生化学実験講座 タンパク質 Ｖ、酵素免疫測定法 第３版、エンザイムイムノアッセイ 生化学実験法等に記載されている方法等も使用することができる。
【００８４】
例えば、蛍光法により酵素活性を測定する場合には、酵素に特異的な基質（酵素による分解物のみが蛍光を発する基質）を反応させ、分解物の蛍光測定を行うころにより酵素活性を測定することができる。
【００８５】
分光学的測定法により酵素活性を測定する場合には、基質と生成物との間に分光学的性質の差があることを利用して、その時間的変化を測定し、酵素反応の初速度を求めることで酵素活性を測定することができる。
電極法により酵素活性を測定する場合には、自動滴定装置を利用した方法で、酵素反応を含めて化学反応に伴って生成される酸あるいは塩基による試料溶液のｐＨ変化を電気的に検出することで酵素活性を測定することができる。
発光法により酵素活性を測定する場合には、抗体ないし抗原に酵素標識しておき、抗原抗体反応後、酵素に特異的な化学発光基質（酵素による分解物のみが化学発光する基質）を反応させ、分解物の化学発光測定することで酵素活性を測定することができる。
【００８６】
例えば、ELISA用プラスチックプレートで抗体活性を測定する場合には、プラスチックプレートの各穴の内壁に目的抗原を結合させ、そこに測定したい抗体を含む被検物を加えて反応させる。抗体は固相の抗原に結合する。その結合量は、被検物中の抗体量が多いほど多くなる。さらに、酵素標識した抗免疫イムノグロブリン抗体をさせる。標識抗体は、固相に結合している抗体に結合する。標識抗体の結合量は抗体が多いほど多くなる。未反応の標識抗体を除去し、その酵素の作用を受けて発色するような基質を加える。基質は酵素量に応じて発色するから結合している酵素標識抗体が多いほど強い色調を呈する。この溶液の色の強さを比色計で測定することで被検物の抗体量を知ることができる。既知量の抗体を段階希釈したものそれぞれについて測定しておけば、その値と比較することで被検物中の抗体量を定量化できる。
【００８７】
レセプター活性を測定する場合には、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドと抗原標識されたリガンドまたはレセプターを含む検体とを接触させた後に、支持体上に固定されている１種類以上のレセプターまたはリガンドに結合した抗原標識されたリガンドまたはレセプターと、該抗原に対する抗体（例えば、検出のための酵素で標識した抗体など）とを接触させて抗原抗体反応を行い、これにより結合した抗体の存在を検出することにより、検体中のリガンドまたはレセプターを検出すことができる。
【００８８】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
（１）表面プラズモン共鳴測定装置及び誘電体ブロック
以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。
【００９０】
図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。
【００９１】
なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。
【００９２】
またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。
【００９３】
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。
【００９４】
図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。
【００９５】
この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。
【００９６】
（２）測定チップ
以下の実験では、特開２００５−９８７７０号公報の記載に準じた測定チップ（ヒドロゲル被覆チップ）を用いた。具体的には以下の手順によりヒドロゲルで被覆された測定チップを作成した。
【００９７】
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）で溶解した16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
【００９８】
次に、16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオールで被覆した表面に10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）を接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させた。その後表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをヒドロゲルで被覆された測定チップとした。
【００９９】
また、疎水性ポリマーで被覆したバイオセンサー用チップ（PMMA測定チップ）を以下の通り作製した。
（ｉ）ポリメチルメタクリレートでコーティングしたバイオセンサー用チップの作製 金膜の厚さが50nmになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは20nmであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。
【０１００】
（ｉｉ）PMMA表面へのCOOH基の導入
上記のように作成したポリメチルメタクリレートをコーティングしたカバーガラスをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。
【０１０１】
（ｉｉｉ）リンカーを有する表面の作成
上記（ｉｉ）で作成したPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、α-アミノ-ポリエチレンオキシ-ω-カルボン酸（平均分子量5000）水溶液（１0mM）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/PEO-C表面チップと呼ぶ。
【０１０２】
実施例１
上記（２）で作成したヒドロゲル被覆測定チップにトリプシン（Worthington社製）を固定化し、測定は上記（１）に記載の表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
【０１０３】
（１）トリプシンの固定化
表１に記載の組成の溶液に、自己消化防止のためトリプシンの阻害剤であるロイペプチン（ＩＣＮ社製）を10μM溶解したトリプシン溶液を準備した。
【０１０４】
ヒドロゲル被覆チップに、１−エチル−２，３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、10mMリン酸バッファーで洗浄した。次に上記のトリプシン溶液を添加し、表１に記載の時間静置後、10mMリン酸バッファーで一次洗浄後、表１に記載の洗浄液で二次洗浄を行い、さらにその後10mMリン酸バッファーで洗浄した。尚、二次洗浄をNaOH10mMで行うと、非特異吸着したたんぱく質が洗い流され、相互作用測定時のベースラインドリフトが安定化することがわかっている。
【０１０５】
更に、エタノールアミン・HCl溶液（１Ｍ，pH8.5）測定チップに添加後、10mMリン酸バッファーで洗浄することにより、トリプシンと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
【０１０６】
以上の操作により、トリプシンを測定チップ表面に共有結合で固定した。トリプシンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシン固定量（ＲＵ値）とした。トリプシンの固定量を表１に示す。
【０１０７】
（２）トリプシンの生物学的活性の測定
上記（１）でトリプシンを固定化したチップを用いて、トリプシンの酵素活性測定を行った。本実施例のチップは、図２に示されるように井戸状の構造を有しているため、容易に酵素活性測定を行うことができる。具体的には、トリプシンに特異的な基質（ベンゾイルーＬ−アルギニンー４メチルクマリンー７アミド 以下Bz-Arg-MCAと表記する；（株）ペルチド研究所）を反応させ分解物の蛍光測定を行った。
【０１０８】
（３）Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡの反応
測定チップ内の10mMリン酸バッファーを抜きとって、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡを添加し、１２０分間反応させた。
【０１０９】
（４）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。測定結果を表１に示す。
【０１１０】
（５）化合物とトリプシンの相互作用測定
測定チップを10mMリン酸バッファーで洗浄後、本実施例の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、ロイペプチン（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）、および下記のキナーゼインヒビタ−、両親媒性化合物（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）を添加し、３分間静置後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を化合物の結合量とした。測定結果を表１に示す。
【０１１１】
【化２】
【０１１２】
【化３】
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
従来の固定化方法の決め方としては、以下の２つの方法があった。
（１）蛋白固定量が最も多い方法に決める。
（２）特異結合する化合物の結合量が最も多い方法に決める。
【０１１５】
今回の結果に対して、方法（１）を適用すると、実験No4の方法が選択され、また方法（２）を適用すると、実験No1の方法が選択される。しかしながら、表１の酵素活性値をみればわかるように、実験No1、No4の方法は、酵素活性が著しく低下している。キナーゼインヒビタ−や両親媒性化合物の結合量をみればわかるように、実験No1、No4の表面は、疎水的な化合物が非特異吸着しやすい状態になっており、ロイペプチンの結合についても非特異的な結合である可能性が高いといえる。本実験においては、特異的な阻害剤であるロイペプチンが結合し、一方で阻害能をもたない化合物が結合しない実験No2の方法が、化合物との相互作用測定に最も適した表面であると結論することができる。
【０１１６】
実施例２
本実施例のPMMA測定チップにトリプシン（Worthington社製）を固定化し、測定はBiacore3000（ビアコア社製）を用いて行った。
【０１１７】
（１）トリプシンの固定化
PMMA測定チップをBiacore 3000にセットし、実施例１と同様の条件でトリプシンを固定した。
【０１１８】
（２）トリプシンの生物学的活性の測定
上記（１）でトリプシンを固定化したチップを用いて、以下の方法でトリプシンの酵素活性測定を行った。チップをSurfacePrepUnit（ビアコア社製）にセットして、チップ表面を10mMリン酸バッファーで３回洗浄した後、０．１ｍＭ Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡを２μｌ注入し、１２０分間放置後回収した。
【０１１９】
（３）蛍光測定
各時間の蛍光測定をＢＭＧＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦＬＵＯstar 測定装置を使用し（Excitation380nm,Emission460nm）蛍光測定を行った。
【０１２０】
（４）化合物とトリプシンの相互作用測定
ロイペプチン溶液（0.00２mM、ＨＢＳ−Ｎバッファー）を添加し、１０分間反応後、共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量をトリプシンに対するロイペプチン（ＩＣＮ社製）の結合量とした。
【０１２１】
測定チップを10mMリン酸バッファーで洗浄後、Biacore 3000にセットし、ロイペプチン（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）、および下記のキナーゼインヒビタ−、両親媒性化合物（0.01mM、リン酸バッファーpH7.4）を注入し、３分間静置後の共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量を化合物の結合量とした。
【０１２２】
（５）測定結果
実施例１と同様の結論が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、表面プラズモン共鳴測定装置を示す。
【図２】図２は、誘電体ブロックを示す。
【符号の説明】
【０１２４】
１０ 測定ユニット
１１ 誘電体ブロック
１２ 金属膜
１３ 試料保持枠
１４ センシング物質
３１ レーザ光源
３２ 集光レンズ
４０ 光検出器
Ｓ４０ 出力信号
４００ ガイドロッド
４０１ スライドブロック
４０２ 精密ねじ
４０３ パルスモータ
４０４ モータコントローラ
４１０ ユニット連結体
４１１ 連結部材
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
生理活性物質がタンパク質である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
生理活性物質が酵素である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
生理活性物質の基板への固定化量の測定を表面プラズモン共鳴分析により行う、請求項１から３の何れかに記載の測定方法。
【請求項５】
誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えている表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるためのバイオセンサーであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが前記ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されたバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴分析を行う、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
生理活性物質の生物学的活性の測定を分光測定により行う、請求項１から５の何れかに記載の測定方法。
【請求項７】
（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を確認する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で確認した固定化方法により生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む、請求項１から６の何れかに記載の測定方法。
【請求項８】
（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を指標として、該バイオセンサー基板への生理活性物質の固定化方法を最適化する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で最適化した固定化方法で生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む、請求項１から６の何れかに記載の測定方法。
【請求項９】
工程（１）における生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値の測定と、工程（２）における生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定とを同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする、請求項７又は８に記載の測定方法。
【請求項１】
バイオセンサー基板を用いた測定方法において、生理活性物質の基板への固定化量の測定と、該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性の測定とを、同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
生理活性物質がタンパク質である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
生理活性物質が酵素である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
生理活性物質の基板への固定化量の測定を表面プラズモン共鳴分析により行う、請求項１から３の何れかに記載の測定方法。
【請求項５】
誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えている表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるためのバイオセンサーであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが前記ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されたバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴分析を行う、請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
生理活性物質の生物学的活性の測定を分光測定により行う、請求項１から５の何れかに記載の測定方法。
【請求項７】
（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を確認する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で確認した固定化方法により生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む、請求項１から６の何れかに記載の測定方法。
【請求項８】
（１）同一のバイオセンサー基板において測定された、生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値から、下記式１で示される固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値を指標として、該バイオセンサー基板への生理活性物質の固定化方法を最適化する工程；
式１： 固定化された生理活性物質の単位量当たりの生物学的活性値＝（基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値）／（生理活性物質の基板への固定化量）
（２）上記工程（１）で最適化した固定化方法で生理活性物質を固定化した基板を用いて、生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定する工程を含む、請求項１から６の何れかに記載の測定方法。
【請求項９】
工程（１）における生理活性物質の基板への固定化量、および該基板に固定化された生理活性物質の生物学的活性値の測定と、工程（２）における生理活性物質と被験物質との相互作用を検出又は測定とを同一のバイオセンサー基板において行うことを特徴とする、請求項７又は８に記載の測定方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１０４６９（Ｐ２００７−１０４６９Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９１２６５（Ｐ２００５−１９１２６５）
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００５２０１）富士フイルムホールディングス株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（０００００５２０１）富士フイルムホールディングス株式会社 (7,609)
【Ｆターム（参考）】
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