バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を含む植物病害防除用組成物およびこれらを用いた植物病害防除方法
本発明は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を含む植物病害防除用組成物、およびこれを用いた植物病害防除方法に関し、さらに詳しくは、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の純粋培養物、これらの純粋培養物を有効成分として含有する微生物製剤、およびこれを用いた植物病害防除方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
最近、多くの研究者は、植物の生長およびヒトの健康に有利に利用するために土壌内の微生物相を変化させる努力を行っている。バクテリゼーション(Bacterization)とは、微生物培養物を作物成長または生育部位に接種することを意味し、このような接種は、たまには多大な作物の増収をもたらすこともがある。ところが、実際、その接種された微生物が根圏でどんな役割を果たすかについては未だ明確ではない。微生物は、種類によっては作物生長期間内に根圏で安定して生存生育することによりその密度を維持させる種類もあるが、既存の根圏微生物によって排斥されることにより根圏に定着できないものもある。この際、根の周りで安定して定着および増殖する微生物を「根圏微生物」と呼ぶ。
【０００２】
微生物の根圏定着とは、非常に積極的な過程であって、微生物が種子の表面または土壌内で生存しながら、炭水化物とアミノ酸に富んだ種子分泌物を用いて増殖し、根の表面に付着して、生長する根に沿って移動増殖する全体的な過程である。また、この根圏微生物は、潅水によって主導的に根の下部まで移動する。
【０００３】
代表的な根圏微生物としては、シュードモナス、アゾトバクター、バチルスなどがある。根圏微生物は、その増殖速度が速く、運動性があり、根分泌物を好むという傾向があるが、植物に有益な影響を与える種類を「植物生長促進根圏微生物」という。以前には植物生長促進根圏微生物の有益効果が例えば大根、ジャガイモ、サトウキビなどの根作物についてのみ認識されたが、最近では、例えばオートムギ、豆、綿花、落花生、桃、稲および野菜類などの多様な作物におけるその肯定的効果が認められている。
【０００４】
微生物接種処理による生長促進効果と病害防除効果は、コインの両面として認識されなければならない。すなわち、生長促進効果を持つ微生物が病害抑制効果を示すこともあり、病害抑制機能微生物が植物生長を促進するという事実が多くの研究者によって解明されている。一例として、植物生長促進効果が認められたある微生物（シュードモナス細菌）は、根圏の有害細菌およびカビの密度を低下させて病害を減らすことにより、相対的に作物生育を促進させるという研究結果がある。
【０００５】
すなわち、これまでその作用メカニズムが知られた大部分の植物生長促進根圏微生物は、有害根圏微生物を制御することにより、間接に作物生育を促進するものと知られている。
【０００６】
一方、根圏微生物が、植物生長を促進させる物質（生理活性物質）を生産することにより、植物生長を直接促進させる場合もある。すなわち、これらの生理活性物質は、根による養分吸収を促進させることにより、根毛発育増進や根および茎生長促進などの効果を発揮すると知られている。結局、植物生長促進根圏微生物は、病害防除による生育促進効果の外にも、特殊生理活性物質を生産して作物の生理を変化させることにより、病菌侵入に対する植物体自己防御能力を倍加させて病害防止および生長促進効果を示すのである。
【０００７】
根圏微生物による生物学的防除メカニズムは、抗菌性、競争、溶菌、特定養分の枯渇、シアン生産などによると知られている。
抗菌性の場合、研究室内で病院菌に対する抗菌能（拮抗能）が認められる根圏微生物は、作物栽培現場において必ずしも同じ抗菌力を発揮するのではないが、その大部分が深い相関度を示す。
【０００８】
抗菌力は、主に根圏微生物が分泌する抗生物質とシデロフォア(Siderophore)によると知られているが、病害生物防除の主効果は主に抗生物質による。例えば、ある植物生長促進根圏微生物は、小麦栽培土壌への投与の際に小麦の根の周りにフェナジン(phenazine)という強力な抗生物質を分泌して病原菌を抑制することにより、病害防止だけでなく、増収効果を示している。
【０００９】
競争とは、根圏栄養分と根の病害敏感部位に対して根圏微生物と病原菌間の競争によって病原菌を無力化させることにより、病害抑制効果を得ることをいう。植物生長促進根圏微生物（シュードモナス細菌）は、多様な栄養成分を速い速度で摂取し、病原菌が利用する必須栄養成分を枯渇させることにより、病原菌が根の特定部位を介して侵入して発病させる。ところが、この植物生長促進根圏微生物がその特定部位を先占して定着することにより、病原菌の根内侵入が不可能になって発病を予防することができる。
【００１０】
溶菌とは、植物生長促進根圏微生物が生産するカビ破壊酵素の作用によって病原性カビを死滅させることをいう。すなわち、植物生長促進根圏微生物がキチナーゼというカビ細胞壁溶解酵素を生産して病原性カビ（ピシウム(Pythium)など）の細胞を破壊することにより、病害防止および増収効果を図ることができる。
微量元素の一つである鉄成分は微生物生長の必須元素であるが、土壌中における鉄は主に３価鉄の不溶性状態で存在するので、微生物に直接には利用できない。微生物は、これらの不溶性鉄を吸収して利用するためにシデロフォアという物質を生産し、シデロフォア−鉄が結合したキレート化合物を作ることにより、鉄を利用することができるのである。植物生長促進根圏微生物は、多量または優れた機能のシデロフォアを生産して速い速度で鉄を利用することにより、根圏の有害微生物（病原菌を含む）の生長に必要な鉄成分を枯渇させてしまう。よって、病原菌は、生長および根内侵入を行うことができなくなる。
【００１１】
多くの根圏微生物はシアン化合物を作り、これは病原菌の防除に役に立っている。すなわち、シアン化合物は、根圏の病原菌菌体に致命的な損傷を被らせることにより、その生育を阻止することができる。
【背景技術】
【００１２】
韓国特許出願第１９９８−００１２８０７号、第２００１−００６３４６５号および第２００３−００７９５４６号には、バチルスサブチリスを用いた植物病害防除方法が開示されている。線虫に殺虫効果を持つバチルス菌が、韓国特許出願第２００２−００４３２４号および第２００２−００４３２５号に開示されており、昆虫に殺虫効果を持つバチルスが、韓国特許出願第２００２−００１７１６７号および第２００４−７００７８７１号などに開示されている。また、韓国出願第２００３−０００５３３５号には、バチルスレンチモブス(Bacillus lentimobs)を用いた微生物農薬および前記微生物の突然変異菌株が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、植物病害防除のための新菌株バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)ＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、芝生病害の予防に効果的な新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤、およびこれを用いた植物病害防除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、植物の生長促進のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０を提供する。
本発明は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、植物の病害発生を効率よく抑制した。特に、前記微生物は耐性胞子を形成するから、微生物製剤の製造の容易性および製品の生物学的安定性がある。また、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、現在多く使用している化学農薬に耐性を示すため、化学農薬と交互的または同時に使用可能である。また、多様な病害発生環境条件でも優れた増殖活性を有し、土壌に対する優れた定着能を持っている。したがって、本発明に係る微生物製剤は、植物病害、特に芝生病害の防除に非常に優れた能力を持っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、植物の生長促進のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０を提供する。
本発明は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤を提供する。
【００１９】
本発明のバチルスサブチリス菌株は、菌株自体、またはその培養体、その抽出物またはその胞子単独で担体と混合して粉末、ペレット、顆粒または溶液などに剤形化して植物病害防除用微生物製剤として使用することができる。前記担体としては水、ホワイトカーボン、カオリン、ゼオライトなどを使用することができる。
【００２０】
剤形化された微生物製剤は、植物が生長している土壌、または成長中の植物表面に処理することにより、植物病害による植物成長の抑制およびこれによる枯死を防除することができる。
【００２１】
本発明は、前記微生物製剤を用いた植物病害防除方法を提供する。
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００２２】
実施例１：菌株の単離、同定および特徴
新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ−１０６４０は、全国ゴルフ場のグリーンおよびフェアウェイ表土層（１０ｃｍ内外）から選抜されたが、耐性胞子を形成し、優れた抗菌活性を示す菌株が選抜された。また、既存の化学農薬に対して耐性を示す菌株が選択された。
【００２３】
選択された微生物菌株の中でも、優れた効能を持つ微生物を単離し、同定した。その結果、バチルスサブチリス２種として同定された。これらのそれぞれは２００４年１２月２８日韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれＫＣＣＭ−１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０の寄託番号を与えられた。
【００２４】
新菌株ＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０バチルスサブチリス菌株の共通特徴
[1]ゴルフ場の根圏および葉圏に棲息している土着微生物菌株である。
[2]製造の容易性および製品の生物学的安定性のための耐性胞子形成菌株である。
[3]既存の化学農薬との交互的使用のために、残留農薬に死滅しない。
[4]生物学的防除のために優れた抗菌活性を示す。
[5]多様な病害発生環境条件で優れた増殖活性を持つ。
[6]芝生刈取物と土壌栄養分を餌として生存および繁殖が優れる。
[7]土壌に対する優れた定着能を持っている。
【００２５】
１．新菌株ＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ−１０６４０の培養的な特徴
ＰＤＡ（ジャガイモ抽出液３００ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ）で培養が行われ、生長適正ｐＨの範囲はｐＨ５〜９であり、最適のｐＨはｐＨ７内外である。生長適正温度の範囲は１５〜３０℃であり、最適の生長温度は２５℃内外である。酸素要求度は強好気性であり、培養４８時間以内に耐性胞子の生成が誘導される。
【００２６】
２．形態的特徴
形態が桿状(Rod shape)であり、耐性胞子を生成し、澱粉加水分解能力があり、運動性がある。図１は新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９の電子顕微鏡写真（Ａ）および光学顕微鏡写真（Ｂ）である。耐性胞子に該当する部分を円で示した。図２は新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０の電子顕微鏡写真（Ａ：５，０００倍、Ｂ：１０，０００倍）である。
【００２７】
３．分類
１６ｓｒＤＮＡ塩基配列分析の結果、ＮＣＢＩにあるバチルスサブチリスｒＤＮＡ配列と９９．９％の相同性を示し、いずれもバチルスサブチリスとして同定された。
【００２８】
実施例２：植物病害防除効果の確認
ゴルフ場のグリーンおよびフェアウェイ芝生病害である「リゾクトニア病害（ラージパッチ、ブラウンパッチ、春はげ症）」、「ピシウム病害（ピシウムブライト）」に対する病害抑制効果を試験した。
【００２９】
リゾクトニア病害防除を試験するために、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)を使用し、ピシウム病害に対する防除を試験するために、ピシウム菌(Pythium sp.)を試験菌株として選択した。培養した拮抗菌を火炎滅菌したループに若干浸けてテスト用栄養ブロス寒天(Nutrient Broth Agar)培地上の中央部分に２〜３回若干掻いてやる。対象病原菌であるRhizoctonia spp.およびPythium sp.は、直径８ｍｍのサイズで切り取ってＮＢ培地の両側に載せておく。２５℃で２〜３日間培養した後、各対象病原菌に対する拮抗力を観察した。
【００３０】
図３はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。ＫＣＣＭ１０６３９がプレートの中央に直線形態で接種され、プレートの両端に、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)が成長した寒天プレートを置き、２日生長させた後の写真である。
【００３１】
図４はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のピシウム菌(Pythium sp.)に対する拮抗作用を示す。左は対照区を示し、右はＫＣＣＭ１０６３９が中央に直線形態で接種されたときにピシウム菌(Pythium sp.)の成長を抑制することを示す。
【００３２】
図５はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたものであり、（Ｂ）は対照区である。
【００３３】
図６はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のピシウム菌(Pythium sp.)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたものであり、（Ｂ）は対照区である。
【００３４】
図７はリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９であり、（Ｂ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０である。
【００３５】
実施例３：従来の殺菌剤（化学農薬）に対する耐性の確認
（１）実験方法
[1]Ｎ．Ａ(nutrient broth agar)培地を２〜３日前に作っておく。
[2]滅菌水（蒸留水）を作る。そして、農薬を実際使用量（勧奨使用量）だけの割合で滅菌数（蒸留水）に溶解させる。
[3][2]の１００μＬをろ紙に吸収させ、水分を乾燥させる。そして、拮抗菌を１００μＬスミアリング(smearing)した培地に前記ろ紙を載せる。その後、密封し、２５℃で２日間培養する。対照区は蒸留水とする。
[4]実験結果を観察する。
[5]菌の成長を観察し、紙ディスクの周辺にクリアゾーン（生長阻止帯）生成有無を確認する。
[6]クリアゾーンが生成されていなければ、拮抗菌株はその農薬に耐性があるものであり、クリアゾーンが生成されていれば、農薬に影響を受けるものである。この際には、クリアゾーンの直径を測定してその度合いを記録する。
【００３６】
（２）結果
新菌株ＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、従来の殺菌剤に対して耐性を示す。従来の殺菌剤の種類およびこれに対する耐性の度合いを表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
実施例３：植物病原性の検証
芝生に病原菌と本発明に係る微生物を同時接種して芝生に病気を誘発するか否かを確認し、その結果を図８に示した。芝生に病原菌と本発明に係る微生物を同時接種した結果、病原菌の生長は抑制したが、芝生には感染を誘発しなかった。よって、本発明に係る微生物は、芝生に対して非病原性であり、優れた抗菌活性を持っていることを確認した。
【００３９】
実施例４：微生物製剤の製造方法
（１）液剤の製造
[1]栄養ブロスパウダー(Nutrient Broth powder)８ｇとシリコンオイル０．５〜１．０ｍＬを水１Ｌと均一に混ぜる。
[2]１２１℃で１５分間高温高圧滅菌(Autoclaving)した後、拮抗菌０．１〜２ｍＬを接種する。
[3]２５℃で４日間培養した後、培養液を収去する。
【００４０】
（２）粒剤の製造
[1]ゼオライト５ｋｇに前記収去した液剤１Ｌを均一に混ぜる。
[2]粒剤製造機で４０℃で１日間乾燥させた後、乾燥した粒剤を収去する。
【００４１】
実施例５：本発明に係る微生物製剤を用いた芝生における病害発生抑制の効果
実施例４によって製造された微生物製剤に対し、例えば光度、湿度などの環境要因が実際現場と同様に制御される人工植物生長相自動制御システムで植物病害防除効果を確認した。ピシウム菌(Pythium sp.)およびリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)を接種し、実施例４によって製造された微生物製剤を処理したとき、芝生における病害発生率が８７〜９５％抑制された（図９参照）。また、ピシウム菌に汚染した土壌に、実施例４によって製造された微生物製剤を混合処理したとき、病害発生率が１００％抑制された（図１０参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る新規のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０菌は、植物の病害発生を効率よく抑制した。特に、前記微生物は耐性胞子を形成するから、微生物製剤の製造の容易性および製品の生物学的安定性がある。また、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、現在多く使用している化学農薬に耐性を示すため、化学農薬と交互的或いは同時に使用可能である。また、多様な病害発生環境条件でも優れた増殖活性を有し、土壌に対する優れた定着能を持っている。したがって、本発明に係る微生物製剤は、植物病害、特に芝生病害の防除に非常に優れた能力を持っている。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９の３５００倍の電子顕微鏡写真（Ａ）および４００倍の光学顕微鏡写真（Ｂ）を示す。耐性胞子部分は円で表示した。
【図２】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０の電子顕微鏡写真である。（Ａ）：５０００倍、（Ｂ）：１００００倍。
【図３】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。ＫＣＣＭ１０６３９がプレートの中央に直線形態で接種され、プレートの両端に、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)が成長した寒天プレートを置き、２日生長させた後の写真である。
【図４】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のピシウム菌(Pythium sp.)に対する拮抗作用を示す。左は対照区を示し、右はＫＣＣＭ１０６３９が中央に直線形態で接種されたときにピシウム菌(Pythium sp.)の成長を抑制することを示す。
【図５】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたもの、（Ｂ）：対照区。
【図６】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のピシウム菌(Pythium sp.)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたもの、（Ｂ）：対照区。
【図７】リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、（Ｂ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０。
【図８】本発明に係る微生物製剤が植物病原性を持たないことを示す。
【図９】微生物製剤を用いた芝生における病害発生抑制効果を示す。
【図１０】微生物製剤を病原菌汚染土壌に処理した場合の病害発生抑制効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
最近、多くの研究者は、植物の生長およびヒトの健康に有利に利用するために土壌内の微生物相を変化させる努力を行っている。バクテリゼーション(Bacterization)とは、微生物培養物を作物成長または生育部位に接種することを意味し、このような接種は、たまには多大な作物の増収をもたらすこともがある。ところが、実際、その接種された微生物が根圏でどんな役割を果たすかについては未だ明確ではない。微生物は、種類によっては作物生長期間内に根圏で安定して生存生育することによりその密度を維持させる種類もあるが、既存の根圏微生物によって排斥されることにより根圏に定着できないものもある。この際、根の周りで安定して定着および増殖する微生物を「根圏微生物」と呼ぶ。
【０００２】
微生物の根圏定着とは、非常に積極的な過程であって、微生物が種子の表面または土壌内で生存しながら、炭水化物とアミノ酸に富んだ種子分泌物を用いて増殖し、根の表面に付着して、生長する根に沿って移動増殖する全体的な過程である。また、この根圏微生物は、潅水によって主導的に根の下部まで移動する。
【０００３】
代表的な根圏微生物としては、シュードモナス、アゾトバクター、バチルスなどがある。根圏微生物は、その増殖速度が速く、運動性があり、根分泌物を好むという傾向があるが、植物に有益な影響を与える種類を「植物生長促進根圏微生物」という。以前には植物生長促進根圏微生物の有益効果が例えば大根、ジャガイモ、サトウキビなどの根作物についてのみ認識されたが、最近では、例えばオートムギ、豆、綿花、落花生、桃、稲および野菜類などの多様な作物におけるその肯定的効果が認められている。
【０００４】
微生物接種処理による生長促進効果と病害防除効果は、コインの両面として認識されなければならない。すなわち、生長促進効果を持つ微生物が病害抑制効果を示すこともあり、病害抑制機能微生物が植物生長を促進するという事実が多くの研究者によって解明されている。一例として、植物生長促進効果が認められたある微生物（シュードモナス細菌）は、根圏の有害細菌およびカビの密度を低下させて病害を減らすことにより、相対的に作物生育を促進させるという研究結果がある。
【０００５】
すなわち、これまでその作用メカニズムが知られた大部分の植物生長促進根圏微生物は、有害根圏微生物を制御することにより、間接に作物生育を促進するものと知られている。
【０００６】
一方、根圏微生物が、植物生長を促進させる物質（生理活性物質）を生産することにより、植物生長を直接促進させる場合もある。すなわち、これらの生理活性物質は、根による養分吸収を促進させることにより、根毛発育増進や根および茎生長促進などの効果を発揮すると知られている。結局、植物生長促進根圏微生物は、病害防除による生育促進効果の外にも、特殊生理活性物質を生産して作物の生理を変化させることにより、病菌侵入に対する植物体自己防御能力を倍加させて病害防止および生長促進効果を示すのである。
【０００７】
根圏微生物による生物学的防除メカニズムは、抗菌性、競争、溶菌、特定養分の枯渇、シアン生産などによると知られている。
抗菌性の場合、研究室内で病院菌に対する抗菌能（拮抗能）が認められる根圏微生物は、作物栽培現場において必ずしも同じ抗菌力を発揮するのではないが、その大部分が深い相関度を示す。
【０００８】
抗菌力は、主に根圏微生物が分泌する抗生物質とシデロフォア(Siderophore)によると知られているが、病害生物防除の主効果は主に抗生物質による。例えば、ある植物生長促進根圏微生物は、小麦栽培土壌への投与の際に小麦の根の周りにフェナジン(phenazine)という強力な抗生物質を分泌して病原菌を抑制することにより、病害防止だけでなく、増収効果を示している。
【０００９】
競争とは、根圏栄養分と根の病害敏感部位に対して根圏微生物と病原菌間の競争によって病原菌を無力化させることにより、病害抑制効果を得ることをいう。植物生長促進根圏微生物（シュードモナス細菌）は、多様な栄養成分を速い速度で摂取し、病原菌が利用する必須栄養成分を枯渇させることにより、病原菌が根の特定部位を介して侵入して発病させる。ところが、この植物生長促進根圏微生物がその特定部位を先占して定着することにより、病原菌の根内侵入が不可能になって発病を予防することができる。
【００１０】
溶菌とは、植物生長促進根圏微生物が生産するカビ破壊酵素の作用によって病原性カビを死滅させることをいう。すなわち、植物生長促進根圏微生物がキチナーゼというカビ細胞壁溶解酵素を生産して病原性カビ（ピシウム(Pythium)など）の細胞を破壊することにより、病害防止および増収効果を図ることができる。
微量元素の一つである鉄成分は微生物生長の必須元素であるが、土壌中における鉄は主に３価鉄の不溶性状態で存在するので、微生物に直接には利用できない。微生物は、これらの不溶性鉄を吸収して利用するためにシデロフォアという物質を生産し、シデロフォア−鉄が結合したキレート化合物を作ることにより、鉄を利用することができるのである。植物生長促進根圏微生物は、多量または優れた機能のシデロフォアを生産して速い速度で鉄を利用することにより、根圏の有害微生物（病原菌を含む）の生長に必要な鉄成分を枯渇させてしまう。よって、病原菌は、生長および根内侵入を行うことができなくなる。
【００１１】
多くの根圏微生物はシアン化合物を作り、これは病原菌の防除に役に立っている。すなわち、シアン化合物は、根圏の病原菌菌体に致命的な損傷を被らせることにより、その生育を阻止することができる。
【背景技術】
【００１２】
韓国特許出願第１９９８−００１２８０７号、第２００１−００６３４６５号および第２００３−００７９５４６号には、バチルスサブチリスを用いた植物病害防除方法が開示されている。線虫に殺虫効果を持つバチルス菌が、韓国特許出願第２００２−００４３２４号および第２００２−００４３２５号に開示されており、昆虫に殺虫効果を持つバチルスが、韓国特許出願第２００２−００１７１６７号および第２００４−７００７８７１号などに開示されている。また、韓国出願第２００３−０００５３３５号には、バチルスレンチモブス(Bacillus lentimobs)を用いた微生物農薬および前記微生物の突然変異菌株が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、植物病害防除のための新菌株バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)ＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、芝生病害の予防に効果的な新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤、およびこれを用いた植物病害防除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、植物の生長促進のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０を提供する。
本発明は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、植物の病害発生を効率よく抑制した。特に、前記微生物は耐性胞子を形成するから、微生物製剤の製造の容易性および製品の生物学的安定性がある。また、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、現在多く使用している化学農薬に耐性を示すため、化学農薬と交互的または同時に使用可能である。また、多様な病害発生環境条件でも優れた増殖活性を有し、土壌に対する優れた定着能を持っている。したがって、本発明に係る微生物製剤は、植物病害、特に芝生病害の防除に非常に優れた能力を持っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、植物の生長促進のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０を提供する。
本発明は、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０の純粋培養物を有効成分として含有する植物病害防除用微生物製剤を提供する。
【００１９】
本発明のバチルスサブチリス菌株は、菌株自体、またはその培養体、その抽出物またはその胞子単独で担体と混合して粉末、ペレット、顆粒または溶液などに剤形化して植物病害防除用微生物製剤として使用することができる。前記担体としては水、ホワイトカーボン、カオリン、ゼオライトなどを使用することができる。
【００２０】
剤形化された微生物製剤は、植物が生長している土壌、または成長中の植物表面に処理することにより、植物病害による植物成長の抑制およびこれによる枯死を防除することができる。
【００２１】
本発明は、前記微生物製剤を用いた植物病害防除方法を提供する。
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００２２】
実施例１：菌株の単離、同定および特徴
新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ−１０６３９またはＫＣＣＭ−１０６４０は、全国ゴルフ場のグリーンおよびフェアウェイ表土層（１０ｃｍ内外）から選抜されたが、耐性胞子を形成し、優れた抗菌活性を示す菌株が選抜された。また、既存の化学農薬に対して耐性を示す菌株が選択された。
【００２３】
選択された微生物菌株の中でも、優れた効能を持つ微生物を単離し、同定した。その結果、バチルスサブチリス２種として同定された。これらのそれぞれは２００４年１２月２８日韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれＫＣＣＭ−１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０の寄託番号を与えられた。
【００２４】
新菌株ＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０バチルスサブチリス菌株の共通特徴
[1]ゴルフ場の根圏および葉圏に棲息している土着微生物菌株である。
[2]製造の容易性および製品の生物学的安定性のための耐性胞子形成菌株である。
[3]既存の化学農薬との交互的使用のために、残留農薬に死滅しない。
[4]生物学的防除のために優れた抗菌活性を示す。
[5]多様な病害発生環境条件で優れた増殖活性を持つ。
[6]芝生刈取物と土壌栄養分を餌として生存および繁殖が優れる。
[7]土壌に対する優れた定着能を持っている。
【００２５】
１．新菌株ＫＣＣＭ−１０６３９およびＫＣＣＭ−１０６４０の培養的な特徴
ＰＤＡ（ジャガイモ抽出液３００ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ）で培養が行われ、生長適正ｐＨの範囲はｐＨ５〜９であり、最適のｐＨはｐＨ７内外である。生長適正温度の範囲は１５〜３０℃であり、最適の生長温度は２５℃内外である。酸素要求度は強好気性であり、培養４８時間以内に耐性胞子の生成が誘導される。
【００２６】
２．形態的特徴
形態が桿状(Rod shape)であり、耐性胞子を生成し、澱粉加水分解能力があり、運動性がある。図１は新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９の電子顕微鏡写真（Ａ）および光学顕微鏡写真（Ｂ）である。耐性胞子に該当する部分を円で示した。図２は新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０の電子顕微鏡写真（Ａ：５，０００倍、Ｂ：１０，０００倍）である。
【００２７】
３．分類
１６ｓｒＤＮＡ塩基配列分析の結果、ＮＣＢＩにあるバチルスサブチリスｒＤＮＡ配列と９９．９％の相同性を示し、いずれもバチルスサブチリスとして同定された。
【００２８】
実施例２：植物病害防除効果の確認
ゴルフ場のグリーンおよびフェアウェイ芝生病害である「リゾクトニア病害（ラージパッチ、ブラウンパッチ、春はげ症）」、「ピシウム病害（ピシウムブライト）」に対する病害抑制効果を試験した。
【００２９】
リゾクトニア病害防除を試験するために、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)を使用し、ピシウム病害に対する防除を試験するために、ピシウム菌(Pythium sp.)を試験菌株として選択した。培養した拮抗菌を火炎滅菌したループに若干浸けてテスト用栄養ブロス寒天(Nutrient Broth Agar)培地上の中央部分に２〜３回若干掻いてやる。対象病原菌であるRhizoctonia spp.およびPythium sp.は、直径８ｍｍのサイズで切り取ってＮＢ培地の両側に載せておく。２５℃で２〜３日間培養した後、各対象病原菌に対する拮抗力を観察した。
【００３０】
図３はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。ＫＣＣＭ１０６３９がプレートの中央に直線形態で接種され、プレートの両端に、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)が成長した寒天プレートを置き、２日生長させた後の写真である。
【００３１】
図４はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のピシウム菌(Pythium sp.)に対する拮抗作用を示す。左は対照区を示し、右はＫＣＣＭ１０６３９が中央に直線形態で接種されたときにピシウム菌(Pythium sp.)の成長を抑制することを示す。
【００３２】
図５はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたものであり、（Ｂ）は対照区である。
【００３３】
図６はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のピシウム菌(Pythium sp.)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたものであり、（Ｂ）は対照区である。
【００３４】
図７はリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。（Ａ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９であり、（Ｂ）はバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０である。
【００３５】
実施例３：従来の殺菌剤（化学農薬）に対する耐性の確認
（１）実験方法
[1]Ｎ．Ａ(nutrient broth agar)培地を２〜３日前に作っておく。
[2]滅菌水（蒸留水）を作る。そして、農薬を実際使用量（勧奨使用量）だけの割合で滅菌数（蒸留水）に溶解させる。
[3][2]の１００μＬをろ紙に吸収させ、水分を乾燥させる。そして、拮抗菌を１００μＬスミアリング(smearing)した培地に前記ろ紙を載せる。その後、密封し、２５℃で２日間培養する。対照区は蒸留水とする。
[4]実験結果を観察する。
[5]菌の成長を観察し、紙ディスクの周辺にクリアゾーン（生長阻止帯）生成有無を確認する。
[6]クリアゾーンが生成されていなければ、拮抗菌株はその農薬に耐性があるものであり、クリアゾーンが生成されていれば、農薬に影響を受けるものである。この際には、クリアゾーンの直径を測定してその度合いを記録する。
【００３６】
（２）結果
新菌株ＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、従来の殺菌剤に対して耐性を示す。従来の殺菌剤の種類およびこれに対する耐性の度合いを表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
実施例３：植物病原性の検証
芝生に病原菌と本発明に係る微生物を同時接種して芝生に病気を誘発するか否かを確認し、その結果を図８に示した。芝生に病原菌と本発明に係る微生物を同時接種した結果、病原菌の生長は抑制したが、芝生には感染を誘発しなかった。よって、本発明に係る微生物は、芝生に対して非病原性であり、優れた抗菌活性を持っていることを確認した。
【００３９】
実施例４：微生物製剤の製造方法
（１）液剤の製造
[1]栄養ブロスパウダー(Nutrient Broth powder)８ｇとシリコンオイル０．５〜１．０ｍＬを水１Ｌと均一に混ぜる。
[2]１２１℃で１５分間高温高圧滅菌(Autoclaving)した後、拮抗菌０．１〜２ｍＬを接種する。
[3]２５℃で４日間培養した後、培養液を収去する。
【００４０】
（２）粒剤の製造
[1]ゼオライト５ｋｇに前記収去した液剤１Ｌを均一に混ぜる。
[2]粒剤製造機で４０℃で１日間乾燥させた後、乾燥した粒剤を収去する。
【００４１】
実施例５：本発明に係る微生物製剤を用いた芝生における病害発生抑制の効果
実施例４によって製造された微生物製剤に対し、例えば光度、湿度などの環境要因が実際現場と同様に制御される人工植物生長相自動制御システムで植物病害防除効果を確認した。ピシウム菌(Pythium sp.)およびリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)を接種し、実施例４によって製造された微生物製剤を処理したとき、芝生における病害発生率が８７〜９５％抑制された（図９参照）。また、ピシウム菌に汚染した土壌に、実施例４によって製造された微生物製剤を混合処理したとき、病害発生率が１００％抑制された（図１０参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る新規のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０菌は、植物の病害発生を効率よく抑制した。特に、前記微生物は耐性胞子を形成するから、微生物製剤の製造の容易性および製品の生物学的安定性がある。また、新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９およびＫＣＣＭ１０６４０は、現在多く使用している化学農薬に耐性を示すため、化学農薬と交互的或いは同時に使用可能である。また、多様な病害発生環境条件でも優れた増殖活性を有し、土壌に対する優れた定着能を持っている。したがって、本発明に係る微生物製剤は、植物病害、特に芝生病害の防除に非常に優れた能力を持っている。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９の３５００倍の電子顕微鏡写真（Ａ）および４００倍の光学顕微鏡写真（Ｂ）を示す。耐性胞子部分は円で表示した。
【図２】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０の電子顕微鏡写真である。（Ａ）：５０００倍、（Ｂ）：１００００倍。
【図３】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。ＫＣＣＭ１０６３９がプレートの中央に直線形態で接種され、プレートの両端に、リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)が成長した寒天プレートを置き、２日生長させた後の写真である。
【図４】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９のピシウム菌(Pythium sp.)に対する拮抗作用を示す。左は対照区を示し、右はＫＣＣＭ１０６３９が中央に直線形態で接種されたときにピシウム菌(Pythium sp.)の成長を抑制することを示す。
【図５】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のリゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたもの、（Ｂ）：対照区。
【図６】バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０のピシウム菌(Pythium sp.)に対する抗菌活性を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０が接種されたもの、（Ｂ）：対照区。
【図７】リゾクトニア菌(Rhizoctonia solani)に対する拮抗作用を示す。（Ａ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、（Ｂ）：バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６４０。
【図８】本発明に係る微生物製剤が植物病原性を持たないことを示す。
【図９】微生物製剤を用いた芝生における病害発生抑制効果を示す。
【図１０】微生物製剤を病原菌汚染土壌に処理した場合の病害発生抑制効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害防除のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０。
【請求項２】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の純粋培養物を有効成分として含有する、植物病害防除のための微生物製剤。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の有効量を植物または土壌に撒布することにより、植物病害を防除する方法。
【請求項４】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の有効量と添加剤を混合することを特徴とする、微生物製剤の製造方法。
【請求項１】
植物病害防除のための新菌株バチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９またはＫＣＣＭ１０６４０。
【請求項２】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の純粋培養物を有効成分として含有する、植物病害防除のための微生物製剤。
【請求項３】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の有効量を植物または土壌に撒布することにより、植物病害を防除する方法。
【請求項４】
請求項１に記載のバチルスサブチリスＫＣＣＭ１０６３９、ＫＣＣＭ１０６４０またはこれらの混合物の有効量と添加剤を混合することを特徴とする、微生物製剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５１１０１２（Ｐ２００９−５１１０１２Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４４４０（Ｐ２００８−５３４４４０）
【出願日】平成１８年１０月２日（２００６．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００３９９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４３７７１
【国際公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（５０８０９８４０８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２日（２００６．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００３９９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４３７７１
【国際公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（５０８０９８４０８）
【Ｆターム（参考）】
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