ヒト神経幹細胞に選択的なモノクローナル抗体及びこれを用いたスクリーニング方法
【課題】 ヒト神経幹細胞の表面抗原に対して選択性の高い新規抗体を提供し、これを用いた免疫学的方法により、生細胞状態で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞を同定、分離する方法を提供する。
【解決手段】 培養されたヒトニューロスフェアのホモジェネートを用いて免疫された哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、ヒト脳組織を用いてスクリーニングした結果えられた、神経幹細胞に対する選択性の高い新規な抗体（ＨＦＢ１８４抗体）である。この抗体は、未分化の神経幹細胞が発現し、その後の分化の過程で消失していく表面抗原に対して選択的に反応する。
【解決手段】 培養されたヒトニューロスフェアのホモジェネートを用いて免疫された哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、ヒト脳組織を用いてスクリーニングした結果えられた、神経幹細胞に対する選択性の高い新規な抗体（ＨＦＢ１８４抗体）である。この抗体は、未分化の神経幹細胞が発現し、その後の分化の過程で消失していく表面抗原に対して選択的に反応する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（以下、これらを区別しないときは、まとめて「ＮＳＰＣ」という）の細胞表面抗原を選択的に認識する新規な抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びにこのモノクローナル抗体を用いて、生体外での培養により得られるヒトニューロスフェアや、生体から採取したヒトＮＳＰＣを含む不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣをスクリーニングし、選択的に分取する方法、ヒトＮＳＰＣの含有率を評価する方法、当該方法を実施するのに用いられるスクリーニング用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を特徴とする未分化な細胞で、胎児脳のみならず、成体脳にも存在することが判明しており、従来は再生が不可能と考えられてきた中枢神経内で、新生ニューロンおよび新生グリア細胞を作成させるための有用な移植用細胞として、再生医療領域での臨床応用が期待されている。
【０００３】
臨床応用するためには、入手しやすい細胞ソースからの分離、選択的培養方法の確立が重要である。
神経幹細胞が多く含有される組織である神経系細胞については、神経幹細胞、神経前駆細胞といった未分化な細胞だけでなく、分化した神経系細胞が多く含まれている。また神経系以外の細胞で、神経幹細胞が含まれることが報告されており、かつ比較的入手しやすい細胞ソースとしては、臍帯血細胞や骨髄細胞が考えられる。しかし、これらのソースの大部分は神経系以外の種々の細胞である。従って、このような不均一な細胞集団を細胞ソースとして利用し、そこから神経幹細胞を分離するためには、その分離方法、ＮＳＰＣのスクリーニング方法を確立する必要がある。
【０００４】
神経幹細胞の選択的培養方法として、現在、ニューロスフェア法が最も汎用されているが、ニューロスフェア法で増幅された細胞集団も、分化が進んだ細胞を含む不均一な細胞集団である。従って、神経幹細胞、神経前駆細胞の分離、スクリーニング方法が重要となる。
【０００５】
神経幹細胞を同定する方法として、非特許文献１では、ＬｅｎｄａｈｌとＭｃＫａｙらにより同定されたＮｅｓｔｉｎという中間径フィラメントタンパク質であるＮｅｓｔｉｎマーカーを用いる方法が提案されている。しかし、Ｎｅｓｔｉｎは細胞内に存在するため、生細胞のままで神経幹細胞を同定、単離する操作に応用することが困難である。
【０００６】
Ｎｅｓｔｉｎの他、神経幹細胞に対する選択性の高い表現マーカーとしては、ＮａｋａｍｕｒａとＯｋａｎｏらにより同定された分子量約３８ｋＤａのＲＮＡ結合蛋白質であるＭｕｓａｓｈｉ１が知られている。
【０００７】
Ｍｕｓａｓｈｉ１も、Ｎｅｓｔｉｎと同様に、細胞内に存在する蛋白質であるため、生細胞の場合、細胞が生きた状態で外部からこれらの蛋白質の発現状況を把握し、それを可視化することは通常の方法では不可能である。
【０００８】
生細胞でＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉ１の発現程度を可視化し、その発現量に基づいて、神経幹細胞を効率的に分離する方法として、ｍｕｓａｓｈｉ１プロモータ、あるいはｎｅｓｔｉｎエンハンサーの下流に、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を組み込んだレポータ遺伝子を、予め各種方法で人為的に神経幹細胞に遺伝子導入し、ＧＦＰ発現細胞を発現強度（蛍光強度）にしたがって、ＦＡＣＳを用いて分離することが報告されている（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。
【０００９】
しかし、この方法は、人体には存在しないＧＦＰ発現遺伝子の導入を伴っているため、効率的に分離、増殖させたとしても、この分離操作で得られた神経幹細胞を、実際に人体へ移植するといった臨床的応用には安全性の点で問題がある。
【００１０】
このようなことから、遺伝子導入を伴わない方法で神経幹細胞を検出できる細胞表面マーカーを用いた分離技術が望まれている。
【００１１】
近年、選択的細胞表面マーカーを用いたＦＡＣＳによる分離法を行なったものとして、非特許文献３に、ＣＤ１３３抗体を用いたヒト由来神経幹細胞の分離法が報告されている。そして、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−／ＣＤ４５−細胞が高率にニューロスフェアを形成することが報告されている。また特許文献３に、中枢神経の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生する方法として、モノクローナル抗体ＡＣ１３３、またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって、細胞表面マーカーを認識させることを利用する方法が開示されている。ＣＤ１３３抗体（ＡＣ１３３抗体）は、プロミニンホモログを認識する抗体であると予想されている。
【００１２】
さらに、特許文献４に、神経幹細胞の細胞表面マーカーとして、抗ＨＦＢ１１５モノクローナル抗体をはじめ、４種類の人工抗体（１６番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７８）、２７番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７９）、１１５番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８０）、２１１番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８１））を用いて、分離する方法が提案されている。
これらの抗体は、免疫原として、胎児のヒト脳組織のホモジェネートを用いて免疫したマウスの抗体産生細胞とミエローマ細胞とから作製されたハイブリドーマの産生抗体である。
【００１３】
またさらに、特許文献５に、哺乳動物末梢神経系から神経幹細胞の同定、単離方法として、ポジティブマーカーとして抗ｐ７５抗体を使用し、ネガティブマーカーとして抗Ｐ０を用いることが提案されている。
【００１４】
さらにまた、特許文献６及び非特許文献４に、ＧＤ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ、ＭＨＣ クラスＩ、β２マイクログロブリン、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ１５２の発現を神経幹細胞の陽性マーカーとし、ＭＨＣ クラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１５４を神経幹細胞の陰性マーカーとして神経幹細胞を分離する技術が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００１−２９２７６８
【特許文献２】特開２００２−３４５８０
【特許文献３】特開２００４−２３５０
【特許文献４】特表２００２−５３６０２３
【特許文献５】特表２００２−５３７８０２
【特許文献６】ＷＯ０２／０８６０８２
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lehndahlら、Cell 60:585-595(1990年)
【非特許文献２】H.M.Keyoungら、「High-yield selection and extraction of two promotor-defined phenotypes of neural stem cells from the fetal human brain」、Nat.Biotechnol.，19，843-850(2001年)
【非特許文献３】Uchida Nら、「Direct isolation of human central nervous system stem cells」、Proc Natl Acad Sci USA 2000;97;14720-25)
【非特許文献４】Klassen H,Schwartz MR,Bailey AH,Young MJら、「Surface markers expressed by multipotent human and mouse neural progenitor cells include tetraspanins and non-protein epitopes」Neuroscience Letters 2001 Oct.26;312(3):180-2(2001年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
生体に存在しない外来性遺伝子導入等を行なうことなく、生細胞状態で神経幹細胞又は神経前駆細胞の富化集団を同定、分離する方法として、細胞表面抗原、細胞表面マーカーを用いた上記方法のいずれも、ヒトＮＳＰＣに対する選択性は、未だ不十分であり、不均一な細胞集団から純度の高い神経幹細胞及び神経前駆細胞集団を分離、採取する方法の利用としては不十分である。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生細胞状態でヒトＮＳＰＣを、同定、分離できる選択性の高い抗体、及びこれを用いた、不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣを検出、分離することができる方法、当該方法で使用するスクリーニング用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、純度の高い培養ヒトＮＳＰＣの懸濁液で免疫感作した哺乳動物を用いて、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に対する選択性が高い新規な抗体を作製し、本発明を完成した。
【００１９】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、培養ヒト神経幹細胞及び／又は培養ヒト神経前駆細胞のホモジェネートで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応する。
【００２０】
前記ホモジェネートは、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られるニューロスフェアをホモジェナイズしたものであることが好ましく、また、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織、培養ヒト神経幹細胞、及びヒトニューロスフェアを単細胞にした細胞集団からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いてスクリーニングしたものであることが好ましい。
【００２１】
前記抗体が認識する抗原は、非還元状態のタンパク性抗原で、且つグリコシダーゼ又はグリコサミノグリカンによる糖鎖切断及び脱脂処理によって抗原性が損なわれないものであることが好ましい。
【００２２】
また、前記抗体は、具体的には、フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＹＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とはいずれも５％未満しか陽性反応を示さないものであり、より具体的には、寄託番号ＦＲＥＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である。
【００２３】
また、寄託番号ＦＲＥＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマも、本発明の範囲である。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応しないモノクローナル抗体の製造方法であって、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られらニューロスフェアのホモジェネートを免疫原として使用する工程；免疫感作した哺乳動物（ヒトを除く）のリンパ球をミエローマと細胞融合して、ハイブリドーマを得る工程；得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより選択したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する工程；及び産生されたモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織に接触させて陽性反応を示すモノクローナル抗体を選別する工程を含む。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト神経幹細胞、ヒト神経前駆細胞、ネスチン高発現細胞の同定、検出、分離、分取に用いることができる。
【００２６】
すなわち、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の同定方法は、不均一な細胞集団から、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の特性を有する細胞及びその細胞の局在性を同定する方法であって、上記本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行ない、染色された部分を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であると同定する工程を含む。
【００２７】
また、本発明のネスチン高発現細胞のスクリーニング方法は、ヒト神経幹細胞を含有する細胞集団を、上記本発明のモノクローナル抗体と反応させ、該モノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出する工程を含む。前記ネスチン高発現細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であってもよい。
【００２８】
前記細胞集団は、ヒト臍帯血由来細胞を含む集団であってもよいし、ヒト末梢血由来細胞を含む集団であってもよいし、ヒトニューロスフェアを単細胞に分散させてなる細胞集団であってもよい。
【００２９】
本発明の細胞集団の評価方法は、ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を含有する細胞集団において、上記本発明のモノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出し、該細胞集団における該モノクローナル抗体陽性細胞の割合を算出する工程を含む。
【００３０】
本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬は、ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の富化集団をスクリーニングするための試薬であって、上記本発明のモノクローナル抗体と溶媒とを含有する。
【００３１】
本発明において、「抗原と反応する」とは、免疫学でいう抗原抗体反応を示すことであり、抗体と抗原が結合することをいう。ここで、抗原と抗体の結合は、水素結合、イオン結合（クーロン力）、ファンデルワールス力、疎水結合等の化学的に弱い結合様式を含むもので、これらの総和であってもよく、いわゆる鍵と鍵穴の関係のような互いの立体的構造の関係に依存する結合である。
【００３２】
また、「組織と反応する」とは、対象となっているモノクローナル抗体で、該当組織を直接法、間接法又はＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）法で染色し、発色させたときに、発色（蛍光色素を用いた場合は特有の波長の蛍光）が認められることをいう。
【００３３】
本発明にいう「神経幹細胞」とは、ニューロスフェア法による増殖培地で培養したときに、自己複製能を有してニューロスフェアを形成できる多分化能を有する幹細胞をいい、「神経前駆細胞」とは、神経幹細胞よりやや分化の進んだ増殖能を有する未分化な細胞をいう。
【００３４】
また「分化した神経系細胞」とは、神経幹細胞を分化誘導して作成される各種細胞分化マーカー（ＧＦＡＰ、チューブリンβＩＩＩなど）を発現し、神経幹細胞マーカー分子（ｎｅｓｔｉｎ、ｍｕｓａｓｈｉ１など）を発現しない細胞をいい、具体的には、ニューロン細胞、グリア細胞などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明にいう「フローサイトメトリーによる解析での陽性反応」とは、標識一次抗体と反応させた細胞集団をフローサイトメータで測定して反応陽性と判断されるもので、測定の結果を、標識に用いた蛍光色素が発光する特有の波長の蛍光強度についてみたときに、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれるものを、反応陽性と判断する。
【００３６】
「実質的に反応しない」とは、全く反応しない場合だけでなく、免疫染色の染色強度が一次抗体を用いずに評価したバックグラウンドの染色強度程度を示す場合や、肉眼的評価では十分に分別できない程度の弱染色性である場合、さらにフローサイトメトリーによる解析反応で陽性とは認められない場合も含まれる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＮＳＰＣに発現する細胞表面抗原に選択性が高いので、これを用いて、不均一な細胞集団である固体の組織塊や種々の細胞が混在した細胞浮遊液から、細胞を破壊したり、外来性レポータ遺伝子などを導入することなしに、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、検出、同定、スクリーニング、分離、分取することができる。
さらに、上記のような細胞集団について、神経幹細胞、神経前駆細胞の含有率などを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒト８週齢胎児の大脳組織切片におけるＨＦＢ２５抗体反応結果を示す顕微鏡写真（７０倍）である。
【図２】ヒト８週齢胎児の大脳組織切片におけるＨＦＢ１８４抗体反応結果を示す顕微鏡写真（３２倍）である。
【図３】（ａ）はニューロスフェアにおける核染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）、（ｂ）はニューロスフェアにおけるＨＦＢ２５抗体の染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）である。
【図４】（ａ）はニューロスフェアにおける核染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）、（ｂ）はニューロスフェアにおけるＨＦＢ１８４抗体の染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）である。
【図５】ニューロスフェアの単細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体反応性を示すフローサイトメータの測定結果を示すプロファイルである。
【図６】（ａ）ヒトＮＳＰＣ細胞集団、（ｂ）分化誘導２週間後、（ｃ）分化誘導７週間後のＨＦＢ２５抗体との反応性を示す結果を示すフローサイトメータ解析で得られたプロファイルである。
【図７】（ａ）は分化誘導２週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導２週間後の細胞集団の抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）は分化誘導７週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導７週間後の細胞集団の抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図９】（ａ）は分化誘導２週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導２週間後の細胞集団の抗ＧＡＦＰ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）は分化誘導７週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導７週間後の細胞集団の抗ＧＡＦＰ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図１１】未処理のヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真である。
【図１２】クロロホルム処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１３】Ｎ−グリコシダーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１４】Ｏ−グリコシダーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１５】コンドロイチナーゼＡＢＣ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１６】ケラタナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１７】ヘパリチナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１８】ヘパリナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１９】ヒト臍帯血由来の細胞集団のＨＦＢ２５抗体との反応性を示すフローサイトメータ解析により得られるプロファイルである。
【図２０】ヒト臍帯血由来のＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団及び陰性細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量のＬＳＭでの測定結果を示すグラフである。
【図２１】ヒト成人末梢血由来の細胞集団のＨＦＢ２５抗体との反応性を示すフローサイトメータ解析により得られるプロファイルである。
【図２２】ヒト成人末梢血由来のＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団及び陰性細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量のＬＳＭでの測定結果を示すグラフである。
【図２３】各細胞におけるＪＡＭ−１の発現についてのウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図２４】（ａ）はヒトＮＳＰＣの抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイル、（ｂ）分化誘導４週間後の細胞における抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイル、（ｃ）は分化誘導７週間後の細胞における抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
〔モノクローナル抗体及びハイブリドーマの作製方法〕
はじめに本発明の抗体及びこれを産生するハイブリドーマの製造方法について説明する。
本発明の抗体は、通常のモノクローナル抗体作成技術、すなわち、免疫感作した哺乳動物から取り出した抗体産生細胞とミエローマとを融合させ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを調製することにより作製することができるが、免疫原として、培養されたヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を用いたことに特徴がある。
【００４０】
すなわち、本発明で用いた免疫原は、培養ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞のホモジェネートである。具体的には、ヒト胎児前脳部由来のヒトＮＳＰＣを継代培養して得られたニューロスフェアを急速凍結して、ホモジェナイズすることにより得られるホモジェネートである。
【００４１】
脳組織のホモジェネートの場合、神経幹細胞以外に分化が進んだ神経系細胞も多く混在し、また細胞成分以外の間質に含まれる成分も多数混在している。このため、前述の特許文献４に開示されているように、免疫原として脳組織のホモジェネートを用いた場合、未分化のヒトＮＳＰＣにのみ選択的な成分に免疫感作される効率が悪くなり、えられた抗体の神経幹細胞に対する選択性についても、神経幹細胞以外の種々の細胞を含む細胞集団から神経幹細胞を同定、検出、分離、分取するツールとしては不十分であった。この点、本発明で使用したニューロスフェアのホモジェネートでは、細胞成分以外の余計な部分の混在がほとんどなく、含まれる細胞の大部分がヒトＮＳＰＣであることから、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原で免疫感作する抗体を得られる確率が大幅に上昇し、ヒトＮＳＰＣに対して選択性の高い抗体をえることができた。
【００４２】
免疫感作に際しては、免疫原をアジュバントなどと混合した懸濁液を用いることが好ましい。
【００４３】
免疫する哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどを用いることができるが、ヒト抗原に対する抗体作製には、マウス、特に６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを用いることが好ましい。
【００４４】
免疫感作方法は、例えば、マウスを免疫する場合、免疫原を、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮膚内等へ免疫原を注射することにより行なう。接種間隔、接種量などは、接種方法により異なるが、例えば、マウスの皮下に接種する場合、抗原を３〜４日おきに、２週間程度接種した。さらに必要に応じて、ブーストする。このようにして、免疫感作された哺乳動物から、リンパ球等の抗体産生細胞を取り出し、細胞融合操作に供する。
【００４５】
細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、サルベージ経路で必要なＨＧＰＲＴ欠損株が好ましく用いられる。ミエローマは、細胞融合前の準備操作として、通常用いられるイーグル最小基本培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改良ＭＥＭ、ＰＲＭＩ１６４０等の基本培地に、１０％ＣＳ（子ウシ血清）、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加した培地で、予め培養されたものが用いられる。
【００４６】
細胞融合は、ミエローマと抗体産生細胞とを１：５〜１：２０の割合で混合することにより行なう。この際、ポリエチレングリコール、センダイウィルスなどの融合剤を用いる。
細胞融合後、ＨＡＴ選択培地で培養することにより、抗体産生細胞と融合したハイブリドーマだけを増殖させることができる。
【００４７】
得られたハイブリドーマから、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、ラジオイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセイ等の方法で調べることができる。
【００４８】
例えば、セルロースビーズ等の担体に、例えば免疫原に用いたホモジェネートを常法にしたがってカップリングさせておき、これにハイブリドーマの培養上清を加え、一定時間、反応させる。洗浄後、酵素で標識した抗マウスＩｇ抗体（二次抗体）を加えて反応させ、未反応抗体を除去した後、洗浄する。次いで、酵素基質を加える。酵素反応後、反応生成発色物の吸光度又は蛍光度等を測定して、抗体産生の有無を調べることにより、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングできる（一次スクリーニング）。
【００４９】
一次スクリーニングでスクリーニングされた抗体産生ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体について、さらに、ヒト脳組織切片及び培養ヒトＮＳＰＣと反応させて、陽性反応を示す抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした（二次スクリーニング）。陽性反応の検出については、二次抗体として抗マウスＩｇ抗体等のように、抗体産生細胞から産生される抗体に結合できる抗体で標識されたもの（標識二次抗体）と結合した細胞を、フローサイトメータ等を用いて、標識二次抗体の標識を検出することにより、検出する。二次スクリーニングで陽性を示す場合、抗体産生ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に選択的に結合できる抗体である。
【００５０】
以上のような一次スクリーニング及び二次スクリーニングにより、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に選択的に結合できる抗体、該抗体を産生するハイブリドーマを選別することができる。
【００５１】
このようにして選別したハイブリドーマを、限界希釈法等でクローニングを行なって、本発明のハイブリドーマを得る。このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６及び受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７で寄託されている。
得られたハイブリドーマを、液体培地中又は哺乳動物細胞の腹腔内で増殖させることにより、目的の抗体を取得することができる。
【００５２】
〔モノクローナル抗体〕
本発明のモノクローナル抗体は、上記作製方法にて作製されるモノクローナル抗体であって、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応するものである。具体的には、ＨＦＢ１８４抗体と命名された受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生される抗体、ＨＦＢ２５抗体と命名された、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６のハイブリドーマから産生される抗体が挙げられる。
【００５３】
ＨＦＢ２５抗体及びＨＦＢ１８４抗体を代表とする本発明のモノクローナル抗体は、脳発生異常、遺伝性疾患のない健常なヒト胎児期初期の大脳の脳室壁層、脳室壁下層の細胞と反応する。中間層、分子層の細胞と反応することもあるが、皮質板の細胞とは実質的に反応しない。胎児期とは、受精卵が胚葉になるまでの２週間である細胞期、細胞期に続く第３週から２ヶ月の終りまでの胎芽期を除く出生期までの期間をいい、胎児期初期とは、８週齢から１８週齢までの期間をいう。
【００５４】
胎児の大脳組織における層構造は、ヘマトキシリン・エオジン染色、ニッスル染色、ゴルジ染色等により認識することができる。大脳の脳室壁層とは、一側を脳室に接する細胞が作る細胞層で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により核は数層に並んで存在する。脳室壁下層とは脳室壁層に接する部分で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により脳室壁層に接する数列の集束した細胞層からなる領域と定義づけられる。皮質板は将来、神経細胞に分化する細胞（神経芽細胞）が高密度に並ぶ部分で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により数列の細胞が高密度に集積した領域となって現れる部分をいう。中間層は脳室壁下層の外側で、脳室壁下層から皮質板までの細胞密度が比較的疎な領域をいい、分子層は皮質板より外側で脳軟膜より内側の領域をいう。胎児期初期、特に８週齢から１０週齢くらいの脳室壁層、脳室壁下層では、細胞増殖が盛んで、神経幹細胞が大量に局在している。一方、皮質板は、分化が終了した神経芽細胞が多く存在し、神経幹細胞はほとんど存在しない。従って、ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体は、未分化の神経幹細胞、神経前駆細胞のときに発現する表面抗原で、分化が進むにしたがって消失する表面抗原に選択的である。
【００５５】
ここで、組織との反応性は、対象となっているモノクローナル抗体を用いて、該当組織を直接法、間接法又はＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）法で染色し、蛍光顕微鏡、レーザ顕微鏡又は免疫電子顕微鏡などで観察して、発色（蛍光色素を用いた場合は特有の波長の蛍光）の有無で判断する。
【００５６】
本明細書にいう「抗原に選択的」とは、多数の細胞集団の中から、神経幹細胞を選択する際の指標となり得る抗体の特性で、特異性よりも広い概念である。つまり、その抗原が神経幹細胞以外に発現していても、神経幹細胞の分離操作に用いることができる程度に神経幹細胞を選択的に識別できる程度をいう。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＦＢ１８４抗体に限定されず、ＨＦＢ２５抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基又はＨＦＢ１８４抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基の少なくともいずれか一方の抗原決定基と反応する抗体を包含する。換言すると、ＨＦＢ２５抗体又はＨＦＢ１８４抗体と共通する抗原結合部位を有するモノクローナル抗体であれば、他の部分はＨＦＢ２５抗体又はＨＦＢ１８４抗体と異なる構造であってもよい。
【００５８】
ここで、「反応する」とは、免疫学でいう抗原抗体反応を示すことであり、抗体と抗原が結合することをいう。抗原と抗体の結合は、水素結合、イオン結合（クーロン力）、ファンデルワールス力、疎水結合等の化学的に弱い結合様式を含むもので、これらの総和であってもよく、いわゆる鍵と鍵穴の関係のような互いの立体的構造の関係に依存する結合である。
【００５９】
ＨＦＢ２５抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基、ＨＦＢ１８４抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基は、神経幹細胞の細胞表面に発現されるが、分化の過程で、その発現量が変化（減少）し、細胞集団全体としてみれば、陽性細胞の割合が減少していくものである。具体的には、分化誘導開始から７週間後に７０％以上、好ましくは８０％以上、陽性細胞割合が減少していくものである。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体が認識する抗原の抗原性は、いずれもグリコシダーゼやグリコサミノグリカンによる糖鎖切断や、クロロホルム処理等による脱脂等によっては失われないが、通常の還元剤を使用したウエスタンブロットでは喪失するものである。従って、非還元状態のタンパク性抗原であると考えられる。
【００６１】
また、本発明のモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＴＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とは５％未満しか陽性反応を示さない。ＮＥＴＲＡ２とは、奇形腫由来のヒト胎児性癌細胞で、分化能を有する神経系前駆細胞に類似の細胞である。Ｕ−８７ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１，Ｕ２５１ＭＧは、いずれもヒト膠芽細胞腫由来の神経系細胞であり、アストロサイト（分化細胞）に類似の特性を有する細胞である。
【００６２】
上記フローサイトメトリーによる解析とは、抗体を直接的又は間接的、あるいはＡＢＣ法で蛍光標識し、対象となる細胞集団をフローサイトメータで測定して、陽性反応を示す細胞割合を算出している。フローサイトメトリーによる反応が陽性というのは、標識に用いた蛍光色素が発光する特有の波長の蛍光の強度の中で、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれる場合をいう。
【００６３】
〔神経幹細胞のスクリーニング方法〕
本発明の方法は、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法を利用して、不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣあるいはＮｅｓｔｉｎ高発現細胞を同定、検出、分離、分取する方法である。
【００６４】
すなわち、不均一な細胞集団を、上記本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫染色し、染色された部分を検出することにより、当該染色部分を部分をヒトＮＳＰＣであると高確率で同定、あるいは細胞集団におけるヒトＮＳＰＣの局在性を知る方法である。
【００６５】
また、神経幹細胞を含有する細胞集団から、上記本発明のモノクローナル抗体（ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体）陽性細胞をスクリーニングし、必要に応じて分離、採取する方法である。
【００６６】
さらにヒトＮＳＰＣは、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞と等価と考えられていることから、上記同定、スクリーニング、分離、分取方法によって、不均一細胞集団から、Ｎｅｓｔｉ高発現細胞を同定、検出、分離、分取する方法にも適用できる。
【００６７】
本発明の方法を適用できる細胞集団は、特に限定せず、単細胞の細胞集団に限らず、生検による組織塊の切片であってもよいが、好ましくは、単細胞の細胞集団である。ヒトＮＳＰＣを含有する細胞集団としては、ニューロスフェア等の細胞集団；成体の脳、脊椎から採取した固体組織；臍帯血やヒト成人末梢血等の液性の細胞集団などが挙げられる。神経系以外の組織であっても、ヒトＮＳＰＣを含む細胞集団があるので、これらもヒトＮＳＰＣの有無、局在性、含有割合を知る上で、本発明の方法の適用対象となる。また、液性の細胞集団の場合には、単一組織由来の細胞集団に限らず、異種組織由来の細胞集団の混合系であってもよい。
【００６８】
尚、ヒト成人末梢血にも、多能性幹細胞が含まれていることは、Ｉｌｈａｍ Ｓａｌｅｈ Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｕｎｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｏｐｉｎｉｏｎ、２００３，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．５，３５５−３７５）に開示されている。
【００６９】
免疫染色とは、標識された抗体と、対象となる細胞集団を反応させ、標識された抗体が細胞集団に含まれる抗原と反応し、結合したことにより、細胞集団に含まれる該当細胞が染色されることをいう。
【００７０】
抗体の標識付けは、抗体に直接標識を結合させることによって行なってもよいし（直接的）、本発明のモノクローナル抗体を一次抗体として標識二次抗体と結合させることにより間接的に標識してもよい（間接法）。また、二次抗体の代りにビオチンと特異的に結合する性質をもつ蛍光標識アビジンを用いたＡＢＣ法を利用してもよい。
【００７１】
標識としては、従来より標識に用いられているものを使用できる。具体的には、蛍光色素、放射性物質、金コロイド、酵素、化学発光などが挙げられる。これらの標識の検出方法は、標識の種類に応じて、従来より公知の方法から適宜選択される。例えば、酵素標識の場合、二次抗体の代りに基質を加え、その発色を見ることになる。放射性物質の場合にはシンチレーションカウンタなどで、放射能レベルを測定する。蛍光色素の場合、励起光をあてて、放出された蛍光の強度を測定する。
【００７２】
細胞集団として、固定された組織塊の切片を用いた場合は、内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、非特異吸着をブロックした後、抗体と反応させればよい。切片は、パラフィン切片、マイクロスライド切片、凍結切片いずれであってもよい。染色は、酵素抗体法、蛍光抗体法が好ましく用いられ、染色の有無は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡などで観察することにより判断すればよい。
【００７３】
細胞集団が単細胞の細胞集団の場合には、フローサイトメトリーによる解析が好ましく用いられる。
フローサイトメトリーによる解析とは、蛍光色素でモノクローナル抗体を直接法、間接法、又はＡＢＣ法で標識し、細胞集団と反応させた後、フローサイトメータで測定して、個々の細胞の表面上の抗原に結合した抗体から得られる蛍光を光学的にとらえ、さらに電気信号に変換し、標識を検出し、記録する測定方法である。標識に用いた蛍光色素の特有の波長の蛍光強度の中で、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれるものを陽性と判断する。
【００７４】
フローサイトメトリー解析に適用する細胞集団は、細胞１×１０５個以上含まれる集団であることが好ましく、陽性群と判断できる細胞が８０％以上、好ましくは９０％以上であれば、選択的に反応したと考えられる。
【００７５】
フローサイトメトリーによる解析で陽性と判断される細胞は、ソート機能を備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）や、表面抗原特異的抗体と磁気ビーズを併用したＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）システムや、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体と特異的に結合できる抗体を結合させた抗体カラムを通過させて二次抗体結合細胞と結合した細胞を分離する方法などにより、分離、分取することができる。
【００７６】
ＦＡＣＳでは、標識として使用した蛍光強度に応じて陽性細胞と陰性細胞を分離採取することができる。ＭＡＣＳシステムによる分離は、細胞を磁性をもつビーズで標識し、強力な永久磁石上に設置された分離カラムを通し、磁気標識細胞のみをカラムに保持することにより分離する方法である。また、抗体カラムを用いる方法では、本発明のモノクローナル抗体（特にＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体）のエフェクター部位と特異的に結合できる二次抗体や本発明のモノクローナル抗体自体と特異的に結合できる抗体（例えば抗ＨＦＢ２５抗体又は抗ＨＦＢ１８４抗体）を結合させたカラムを通すことで、抗ＨＦＢ２５抗体又は抗ＨＦＢ１８４抗体等が結合した細胞（抗体陽性細胞）と結合していない細胞（抗体陰性細胞）とを分離することができる。
【００７７】
ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性細胞をはじめとする本発明のモノクローナル抗体陽性細胞は、ネスチン高発現細胞である。Ｎｅｓｔｉｎは、神経幹細胞のマーカーとして認識されている細胞内タンパク質であることから、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性細胞等の本発明のモノクローナル抗体陽性細胞を分離、分取することにより、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、すなわちヒトＮＳＰＣを分離、分取することができる。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法では、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性と判定された細胞について、さらに、抗ＪＡＭ−１抗体とも反応させて陰性と判定される細胞を検出することにより、神経幹細胞を選択的に検出することができる。
【００７９】
ここで、抗ＪＡＭ−１抗体の抗原であるＪＡＭ−１は、ヒトＮＳＰＣから分化誘導させた神経系細胞の状態で発現する細胞表面分子で、ヒトＮＳＰＣでほとんど発現していないが、分化の途中で発現し、さらなる分化の進行で発現が低下していく。つまり、神経系細胞の分化の過程で一過的に現れる細胞表面蛋白質分子である。このようなＪＡＭ−１と特異的に結合する抗ＪＡＭ−１抗体は、神経幹細胞及び成熟した分化細胞（アストロサイト）に陰性であるが、神経幹細胞の分化の過程で一過的に陽性反応を示す。従って、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性と判定された細胞集団、すなわち分化傾向を呈したヒト神経系前駆細胞とより未分化なヒトＮＳＰＣの混合集団から、抗ＪＡＭ−１抗体陰性細胞、即ちより未分化なヒトＮＳＰＣを選別することが可能である。
【００８０】
抗ＪＡＭ−１抗体は、細胞表面のタンパク質ＪＡＭ−１（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ―Ａｄｈｅｓｉｏｎ―Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９Ｙ６２４）を認識するモノクローナル抗体、ＪＡＭ−１の細胞表面抗原を認識する抗原結合部位を有する抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２、Ｆａｂなど）、免疫グロブリンを含む概念である。市販品としては、Ｈｙｃｕｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のマウス産生抗ＪＡＭ−１ＩｇＧモノクローナル抗体などを使用することができる。
【００８１】
このように、本発明のモノクローナル抗体と、抗ＪＡＭ−１抗体を併用することにより、細胞集団から、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、すなわちヒトＮＳＰＣ富化集団を分離、採取することができ、さらに抗ＪＡＭ−１抗体と反応させて、陰性と判定された細胞を分離、採取することにより、神経幹細胞富化集団を分離、採取することが可能となる。
【００８２】
本発明のヒトＮＳＰＣスクリーニング用試薬は、ＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体を必須成分として含有するもので、溶媒としては、神経幹細胞培養に用いる培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）やＰＢＳを用いることができる。一方、スクリーニング用試薬には、血清、界面活性剤は含まれないことが好ましい。血清は神経幹細胞を分化誘導させる作用があり、界面活性剤は、細胞表面分子の抗体での認識を妨げる可能性があるからである。
【００８３】
本発明の神経幹細胞スクリーニング用試薬は、さらに抗ＪＡＭ−１抗体を含有してもよい。ＨＦＢ２５抗体と同様の特性を有するＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体に陽性で、且つ抗ＪＡＭ−１抗体陰性の細胞をスクリーニングすることで、神経幹細胞の純度が高い細胞集団を分離、採取することができる。
【００８４】
本発明の細胞集団評価方法は、ヒトＮＳＰＣを含む細胞集団におけるヒトＮＳＰＣの含有率を評価する方法である。本発明の評価方法は、細胞集団を、本発明のスクリーニング用試薬、すなわちＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体と反応させ、陽性細胞の含有率に基づいて評価する方法である。ＨＦＢ１８４抗体陽性細胞がＮｅｓｔｉｎ高発現細胞と相関性があることに基づく方法で、本発明のスクリーニング方法で対象となる細胞集団に適用できる。
【００８５】
さらに抗ＪＡＭ−１抗体との反応性を併用することで、すなわちＨＦＢ２５抗体と同様の特性を有するＨＦＢ１８４抗体に代表される陽性で且つ抗ＪＡＭ−１抗体陰性の細胞を検出することで、細胞集団におけるヒトＮＳＰＣ、神経幹細胞の含有率の評価することができる。
【００８６】
上記評価方法は、ＨＦＢ１８４抗体に代表される本発明の抗体、及び必要に応じて、さらに抗ＪＡＭ−１抗体を蛍光標識し、フローサイトメトリーなどを用いて得られるヒストグラム、サイトグラム（ドットプロット）等のプロファイルなどから、ＨＦＢ１８４抗体陽性細胞（抗ＪＡＭ−１抗体を含有する場合はさらに抗ＪＡＭ−１抗体陰性細胞）の含有割合を求めることによって行なってもよいし、試料となる細胞集団や組織をスライドグラスに貼付けて、免疫細胞・組織化学的手法によって行なってもよいし、ＥＬＩＳＡやＲＩＡなどで行なってもよい。
【実施例】
【００８７】
〔ハイブリドーマの作製〕
（１）免疫原について
国立病院機構大阪医療センター倫理委員会及び産業技術総合研究所倫理委員会承認の下、妊娠９週齢のヒト胎児前脳部由来のＮＳＰＣを、下記神経幹細胞増殖培地を用いて、Ｋａｎｅｍｕｒａらの方法（Ｋａｎｅｍｕｒａ ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｉｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９，８６９−８７９，２００２）により継代培養して得られたヒトニューロスフェアを急速凍結しホモジナイズした。得られたホモジェネートを免疫原として用いた。
【００８８】
ヒトニューロスフェア法の培養に使用した培地組成は、以下の通りである。
ＤＭＥＭ ／Ｆ１２（１：１混合物、シグマ社）
ヒト組換え（以下「ｈｒ−」と略記する）ＥＧＦ（インビトロジェン社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＬＩＦ（ケミコン・インターナショナル社）１０ｎｇ／ｍｌ
ヘパリン（シグマ社）５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ２７（インビトロジェン社）
ＨＥＰＥＳ１５ｍＭ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロゲン社）
【００８９】
（２）動物の免疫
モノクローナル抗体の作製は、Ｏｒｌｉｋ，Ｏ ＆ Ａｌｔａｎｅｒ，Ｃ （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１５：５５−５９，１９９８）による変法に従い、鼡径部リンパ節細胞を用いて行った。
【００９０】
すなわち、（１）で調製した免疫原（２００μｇ）を、ＲＩＢＩアジュバント（フナコシ社）と等量づつ混合したものを、生後６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの両足底に、１回０．２ｍｌを、３〜４日おきに、合計３回接種した。更に５日後に、ブーストとして、同量を免疫した。ラストブースト３日後のマウスを細胞融合操作に用いた。
【００９１】
（３）細胞の融合
（２）により免疫感作したマウス（５匹）の両鼡径部リンパ節を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ライフテクノロジー社）にいれて2枚のスリガラスに挟んですり合わせるようにしてリンパ球を取り出した（約1×１０８個）。一方、株化ミエローマ（ＦＯ−１細胞）を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、８アザグアニン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃で培養し、さらに細胞融合前の２〜３日は、８アザグアニンを除去した同上組成培地で培養し、細胞を準備した（約４×１０７個）。
取り出したマウスリンパ球と株化ミエローマ細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１５％ＦＣＳ）の５０ｍｌ中で混和し、１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間室温で遠心分離し、上清を捨て２０ｍｌの増殖培地に細胞を懸濁した。この細胞懸濁液２０ｍｌに、５０％ポリエチレングリコール水溶液１００μｌを加えて３７℃のＣＯ２インキュベーターに９０分間入れて保温した。その後、１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間室温で遠心分離し、上清を捨て、さらに数秒程度の回転数にて遠心分離し上清を出来るだけ吸い取った。３７℃の恒温水槽の水面に細胞試料の入った容器を軽く打ち付けるようにして温めながら上記遠心分離沈殿をほぐした。３７℃であらかじめ温めた５０％ポリエチレングリコール水溶液１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振盪し、さらに１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振盪した。さらに８ｍｌを２−３分かけて添加して混ぜてから１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間遠心分離した。
【００９２】
えられた沈殿物（細胞）に、ＨＡＴ培地（増殖培地１００ｍｌあたりに５０×ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを２ｍｌくわえる）を５０ｍｌ加えた。この懸濁液を、９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ播種して培養した（５プレート）。この時、胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ細胞（細胞の増殖を助けるための共存させる他の種類の細胞）として、約１×１０５個／ｗｅｌｌの割合で加えた。３日間培養した後に、ＨＡＴ培地を５０μｌ／ウェル加え、以後、ＨＡＴ培地の添加、交換を行ないながら、ハイブリドーマの増殖コロニーがウェルの１／４〜１／３程度になるまで培養した。コロニーが適当な大きさになった時点で培養上清を採取し、以下のスクリーニングに供した。
【００９３】
（４）ハイブリドーマの選定とクローニング
上記（３）で得られたハイブリドーマ由来の抗体について、下記酵素抗体法により、ヒト胎児脳組織標本と免疫反応するハイブリドーマを含むウェルを選別した。
【００９４】
脳奇形等の重症の合併症のない胎齢８−１４週ヒト胎児剖検脳のパラフィン包埋切片を免疫組織化学的スクリーニングに使用した。パラフィン包埋された組織片から５μmの切片を作製し、シランコーテイングスライドに貼付して、３７℃インキュベーターで一晩乾燥させた。染色前に、ヒストクリアおよびエタノールにて脱パラフィンを行った。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで切片を洗浄し、２％過酸化水素加メタノールに３０分室温にて浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。１０％ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて１時間、非特異吸着をブロックした後、（３）で得られたハイブリドーマ培養上清を希釈せず１００μｌ滴下し、４℃で一晩反応させた。翌日、ビオチン化二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体＋抗マウスＩｇＭ抗体）を滴下し、１時間室温にて反応させた。その後、ＡＢＣキット（ニチレイマルチステイン）を使用し、ＤＡＢにて発色させた。必要に応じて核染色を実施し、脱水、透徹後、オイキットにて封入した。
【００９５】
ヒト胎児脳組織切片に対して、陽性反応を示したウェルを、約０．５個ハイブリドーマ／ウェルになるように限界希釈した後、培養液をＨＴ培地＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅ（増殖因子、大日本製薬）に交換し、目的のハイブリドーマ由来の細胞集団を得た。
このようにして得られたハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６及びＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７ある。
【００９６】
（５）マウス腹水の産生
ニードル小 (２３Ｇ ＴＥＲＵＭＯ） を用いて、シリンジ小（１ｍｌ ＴＥＲＵＭＯ）でプリステン（テトラメチルペンタデカン；東京化成）を０．５ｍｌ／マウスの分量でマウス（４週齢の 雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＳＣＬ）の腹腔内に打ち、前処理を実施した。前処理二週間後、ニードル小を用い、シリンジ大（５ｍｌ ＴＥＲＵＭＯ）でＰＢＳ［ＰＢＳ（−）ｐＨ ７．４ フィルター滅菌済み］に懸濁したハイブリドーマ細胞（０．５〜１×１０７個／ｍｌ／マウス）を腹腔内に投与した。数日後、マウスの腹部が膨れてきたことを確認後、ニードル中（１６Ｇ ＴＥＲＵＭＯ）を用いシリンジ大で腹水の採取を実施した。得られた腹水は、チューブ小に２ｍｌずつ分注し、マイナス８０℃で保存した。
えられたモノクローナル抗体を、それぞれＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体と命名した。これらは、いずれもＩｇＭ型抗体である。
【００９７】
〔ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体の性質試験〕
（１）胎児脳についての免疫組織染色
ヒト８週齢胎児の大脳のパラフィン永久組織標本から５μｍの切片を作成し、シランコーテイングスライドに貼付して、３７℃インキュベーターで一晩乾燥させた。染色前に、ヒストクリアおよびエタノールにて脱パラフィンを行った。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで切片を洗浄し、２％過酸化水素加メタノールに３０分室温にて浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。１０％ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて１時間、非特異吸着をブロックした後、（５）で得られたマウス腹水（ＨＦＢ２５およびＨＦＢ１８４抗体）を５００倍希釈して、４℃で一晩反応させた。翌日、ビオチン化二次抗体（抗マウスＩｇＭ抗体）を滴下し、１時間室温にて反応させた。その後、ＡＢＣキット（ニチレイマルチステイン）を使用し、ＤＡＢにて発色させた。必要に応じて核染色を実施し、脱水、透徹後、オイキットにて封入した。
【００９８】
ＨＦＢ２５抗体含有液のヒト８週齢胎児の大脳組織切片との反応結果を示す顕微鏡写真を図１に、ＨＦＢ１８４抗体含有液のヒト８週齢胎児の大脳組織切片との反応結果を示す顕微鏡写真を図２に、それぞれ示す。
【００９９】
図１から、ＨＦＢ２５抗体については、ヒト胎児８週齢大脳では、脳室壁層（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ；ＶＺ）、脳室壁下層（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ；ＳＶＺ）が強く染色され、中間層（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｚｏｎｅ；ＩＭＺ）および分子層（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｙｅｒ；ＭＬ）にも陽性所見が得られたが、皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ；ＣＰ）には明らかな染色性は存在しなかった（図１）。
【０１００】
図２から、ＨＦＢ１８４抗体については、ヒト胎児８週齢大脳では、ほぼ全層に渡って繊維状の染色像を呈した（図２）。その中でもＭＬに比較的強い陽性所見が見られた。
【０１０１】
（２）ヒトニューロスフェアに対する反応性
継代培養されたヒトニューロスフェアを、４％パラホルムアルデヒドで４℃で２０分間固定した。その後、３０％ショ糖／ＰＢＳに４℃で３０分間つけ、ＯＣＴ−コンパウンドに凍結包埋した。その後、クリオスタットを用いて１２μｍの切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。凍結切片を１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体をそれぞれ１次抗体として、一晩４℃反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を反応させ、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させた。染色結果を、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１０２】
核染色結果及びＨＦＢ２５抗体の染色結果を図３に示す。また、核染色結果及びＨＦＢ１８４抗体の染色結果を図４に示す。
図３及び図４のいずれも抗体の染色結果と核染色結果は、ほぼ一致していた。従って、ヒトニューロスフェアを構成するほとんどの細胞、すなわちヒトＮＳＰＣが、両抗体の陽性細胞であることがわかる。
【０１０３】
（３）ＦＡＣＳを用いた解析
ヒトＮＳＰＣをトリプシンを用いて分散し、セルストレーナーを使用して単一細胞の細胞懸濁液を作成した。これらの細胞懸濁液に対して、１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体（マウス腹水）を各々、氷上で３０分間反応させた後、培養液を用いて洗浄した。その後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウス−ＩｇＭ抗体（１：５００、ヤギ産生ポリクローナル抗体，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を３０分間、氷上で反応させた後、培養液で洗浄し、更にＰＩ（プロピジウムイオダイド）染色を行った。解析はベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式を用いて行い、各モノクローナル抗体で各々の標識される細胞（陽性細胞）と非標識細胞（陰性細胞）の割合を算出した。
【０１０４】
ＰＩは二重らせん構造のＤＮＡにインターカレーションするＤＮＡ染色であり、これにより全細胞数を知ることができる。ＨＦＢ２５抗体陽性細胞は、ＨＦＢ２５抗体に結合した二次抗体の標識である緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８の蛍光強度により知ることができる。
【０１０５】
コントロール細胞として、１０種類の培養ヒト株化細胞、すなわち神経系細胞であるＵ−８７ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１，Ｕ２５１ＭＧ（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）Ｄａｏｙ，Ｄ２８３Ｍｅｄ（ｈｕｍａｎ ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）；分化能を有する神経系前駆細胞であるＮＴＥＲＡ２（ｔｅｒａｔｏｍａ由来のｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；血球系細胞であるＪｕｒｋａｔ、Ｋ５６２（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ由来）；非神経系接着細胞である２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の集団について、同様に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＨＦＢ２５陽性細胞とＨＦＢ２５陰性細胞の割合を算出した。
【０１０６】
結果を図５に示す。図５中、縦軸は細胞数カウント、横軸は緑色蛍光の蛍光強度であり、１０以上のシグナルを示すものはＨＦＢ２５抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体陽性細胞とＨＦＢ２５抗体陰性細胞の割合をまとめると、表１のようになる。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ヒトＮＳＰＣ及びヒトＥＣ細胞であるＮＴＥＲＡ２については、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合が非常に高く、他の神経系細胞、非神経系の株化細胞では、起源的にヒトＮＳＰＣに近いとの説があるＤａｏｙ（５４％）と、血球系のＪｕｒｋａｔ（４２．５％）に比較的ＨＦＢ２５陽性細胞が多く存在したが、その他の神経系細胞及び非神経系細胞ではＨＦＢ２５陽性を示す割合は低かった。
【０１０９】
ＨＦＢ１８４抗体を用いて同様にＦＡＣＳによる解析をしたところ、ＨＦＢ１８４陽性細胞の割合はヒトＮＳＰＣで９９．１％、Ｕ２５１ＭＧで０．２％、Ｊｕｒｋａｔで４６．６％であり、ＨＦＢ２５抗体を用いた解析結果とほぼ同傾向であった。
以上から、本発明ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体、いずれも未分化の神経系細胞に発現する表面抗原を選択的に認識する抗体で、分化した神経系細胞、非神経系細胞の表面抗原とは反応しない抗体であることがわかる。
【０１１０】
〔神経幹細胞の分化レベルと抗体の反応性〕
（１）神経幹細胞の分化誘導
分化誘導方法Ａ：
ニューロスフェア法で用いる培地から増殖因子を除去し１０％ＦＢＳを添加した培地にて分化誘導を行ない、分化誘導後、１−２週間ごとに０．０５％トリプシン溶液を用いて単細胞に分散させて継代するという操作を複数回繰り返した。この方法により、グリア細胞ほぼ１００％の細胞集団が得られる。
分化誘導方法Ｂ：
ニューロスフェア法で用いる培地から増殖因子を除去し、１％ＦＢＳを添加した培地にて２週間培養し、分化誘導を行った。この方法では、神経細胞とグリア細胞の混合培養（以下「Ｎ／Ｇ細胞」という）集団（チューブリンβＩＩＩ陽性の神経細胞が約２０％、ＧＡＦＰ陽性のグリア細胞が約８０％）が得られる。
【０１１１】
（２）ＦＡＣＳを用いた解析
２ロット（ロットＮｏ．１、２）のヒトＮＳＰＣ細胞集団を、それぞれＡの方法で分化誘導させた。分化誘導２週間後、７週間後の細胞集団について、前述と同じ方法を用いてＦＡＣＳでＨＦＢ２５抗体陽性細胞の比率を検討した。
分化誘導させなかったヒトＮＳＰＣ、並びに分化誘導２週間後、及び７週間後の結果を、それぞれ図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図６中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は、細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合をまとめると、表２のようになる。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
表２からわかるように、ヒトＮＳＰＣの分化の進行に従い、ＨＦＢ２５抗体陽性を示す割合が次第に減少していくことがわかる。つまり、ＨＦＢ２５抗体は、未分化ヒトＮＳＰＣの表面に存在し、その後、分化の過程で消失していく細胞表面抗原に選択的な抗体であることがわかる。
【０１１４】
（３）抗チューブリンβＩＩＩ抗体とＨＦＢ２５抗体陽性細胞との関係
分化誘導法Ｂを用いて作成した細胞で、分化誘導２週間後、７週間後の各細胞集団について、神経系マーカーである抗チューブリンβＩＩＩ抗体とＨＦＢ２５抗体の二重染色を行なった。細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）と抗ｔｕｂｕｌｉｎβＩＩＩ（ＴｕＪ１）抗体（１：５００；ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ， ＢａｂＣＯ社）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。反応後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたヤギ産生抗ウサギＩｇＭ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で標識されたヤギ産生抗ウサギＩｇＧ抗体，いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温にて１時間反応させた。染色後の観察は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて実施した。
【０１１５】
分化誘導２週間後の蛍光顕微鏡写真を図７（ａ）（ＨＦＢ２５抗体による染色）及び（ｂ）（抗チューブリンβＩＩＩ抗体による染色）に示す。また、分化誘導７週間後の顕微鏡写真を図８（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色）に示す。図７、８中のスケールバーは１００μｍである。
【０１１６】
図７、８から、神経系マーカー（抗チューブリンβＩＩＩ抗体）を用いた検討では、分化誘導初期（２週間）の時点ではＨＦＢ２５（＋）／チューブリンβＩＩＩ（＋）細胞が確認されるが、分化誘導後期（７週間）ではＨＦＢ２５（＋）細胞は殆ど消失し、チューブリンβＩＩＩと共発現する細胞も殆ど見られなかったことがわかる。
【０１１７】
（４）抗ＧＦＡＰ抗体とＨＦＢ２５陽性細胞との関係
Ａ方法による分化誘導２週間後、７週間後の各細胞集団について、グリア系細胞のマーカーである抗ＧＡＦＰ抗体とＨＦＢ２５抗体の二重染色を行なった。方法は、前述と同様に、細胞を固定し、ブロッキングした後、１次抗体として５００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）とウサギ産生抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（シグマ社）（１：８０）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。反応後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＧ抗体，いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とＴＯ−ＰＲＯ−３ ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温にて１時間反応させた。染色後の観察は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて実施した。
【０１１８】
分化誘導２週間後の蛍光顕微鏡写真を図９（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗ＧＡＦＰ抗体染色）に示す。また、分化誘導７週間後の顕微鏡写真を図１０（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗ＧＡＦＰ抗体染色）に示す。図９、１０中のスケールバーは１００μｍである。
【０１１９】
図９ではＨＦＢ２５（＋）／ＧＡＦＰ（＋）細胞が確認されたが、図１０ではＨＦＢ２５（＋）細胞は殆ど消失し、ＧＡＦＰと共発現する細胞も殆ど見られなかった。これらの結果から、ＨＦＢ２５抗体は、グリア細胞とも反応しないことがわかる。
【０１２０】
〔各種酵素処理と抗原性との関係〕
（１）クロロホルム処理による脱脂の影響
脂質性抗原の特性を有するかどうかの検討のため、クロロホルム処理による脱脂の影響を検討した。
【０１２１】
継代培養されたヒトニューロスフェアを０．０５％トリプシン溶液処理して単細胞に分散させてなる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に対して４％パラホルムアルデヒド処理４℃、２０分間の固定後、切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。切片はクロロホルムとメタノールを２：１で混合した溶液で室温１０分間脱脂処理を行った後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした。１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させた。染色結果は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１２２】
コントロールとして、脂質性抗原を認識するＡ２Ｂ５抗体を上記と同様にクロロホルム処理した細胞に反応させ、それぞれ、クロロホルム処理前後での各抗体（ＦＨＢ２５抗体およびＡ２Ｂ５抗体）しなかった以外は上記と同様に処理したものを使用し、顕微鏡観察した。
未処理のＨＦＢ２５抗体との反応結果の顕微鏡写真を図１１に、クロロホルム処理したＨＦＢ２５抗体との反応結果の顕微鏡写真を図１２に示す。
図１１と図１２との比較からわかるように、ＨＦＢ２５抗体をクロロホルム処理しても、ほとんど細胞染色性に影響なく、抗原結合部位に影響がなかった。一方。Ａ２Ｂ５抗体は、脱脂された抗体結合部位が破壊されたために、細胞染色部分がほとんど消失していた。
【０１２３】
（２）グリコシダーゼ及びグリコサミノグリカン分解酵素処理による影響
糖鎖抗原性の検討を行うため、各種糖鎖切断酵素による処理の影響を検討した。
継代培養されたヒトニューロスフェアを０．０５％トリプシン溶液処理液処理して単細胞に分散させてなる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に対して４％パラホルムアルデヒド処理４℃、２０分間の固定後、切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。切片はＮ−グリコシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ケラタナーゼ、ヘパリチナーゼ、又はヘパリナーゼを、表３に示すような濃度となるように添加し、表３に示す時間だけ反応させた。これらの酵素は、表３に示す部分を切断する。酵素処理後、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした。１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温１時間反応させた。染色結果は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
Ｎ−グリコシダーゼ処理、Ｏ−グリコシダーゼ処理、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理、ケラタナーゼ処理、ヘパリチナーゼ処理、ヘパリナーゼ処理の各染色結果の顕微鏡写真を、それぞれ、図１３〜図１８に示す。
いずれも未処理（図１１参照）の場合と同程度に染色されていて、これらの酵素処理では、ＨＦＢ２５抗体の抗原結合部位は、影響を受けないことがわかった。
【０１２６】
〔ヒト臍帯血からの神経幹細胞及び前駆細胞の分離採取〕
（１）ヒト臍帯血から有核球細胞集団の分離
遠心チューブにヒト臍帯血と等量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）を入れ、その上にヒト臍帯血を重層し、２０℃で８００ｇ、２０分間遠心し、有核球の層を採取した。分離細胞はヒトＮＳＰＣの保存と同様の方法で凍結保存（バンバンカー）し、以下の解析に使用した。
【０１２７】
（２）ＨＦＢ２５抗体反応性
（１）で調製したヒト臍帯由来細胞３ロットを、それぞれ１×１０７細胞／１００μｌに希釈した細胞懸濁液（ＵＣＢ１〜ＵＣＢ３）を調製した。
この細胞懸濁液に、ＨＦＢ２５抗体を産生したマウス腹水２μｌを添加混合して、氷上で３０分間反応させた。次いで、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させ、さらにＰＩ染色を行い、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式をフローサイトメーターを用いて測定した。
【０１２８】
ＵＣＢ１〜ＵＣＢ３の結果を、図１９にそれぞれ示す。図１９中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞である。
図１９から、ロット間でばらつきがあるものの、いずれもＨＦＢ２５抗体陽性細胞が、２〜６．７％程度含まれていることがわかった。
さらにセルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ−ＳＥ、ベクトン−ディクソン社製）を用いて、ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞（標識された細胞）とＨＦＢ２５陰性細胞（標識されなかった細胞）とを分取した。
【０１２９】
（３）ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞でのＮｅｓｔｉｎ発現の検討
（２）で分取したヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞及び陰性細胞のそれぞれを、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ｃｙｔｏｓｐｉｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ社）を用いてスライドガラスに貼付けた。１０％ヤギの正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、一次抗体としてウサギ産生抗ヒトＮｅｓｔｉｎポリクローナル抗体（１：５００）を４℃で一晩反応させ、続いて二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５６８（赤色）で標識したヤギ産生抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ（終濃度４μｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と室温で１時間反応させ、免疫細胞染色標本を作製した。上記二次抗体は、ヤギ産生でマウスのＨ鎖及びＬ鎖を認識し、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットの抗体は認識しないものである。
【０１３０】
ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５抗体陽性細胞と陰性細胞のそれぞれの細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現程度を、定量的に検討する目的のために、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体を用いた免疫細胞染色標本をレーザースキャニングサイトメータ（ＬＳＣ２、オリンパス社）を用いて測定した。結果を図２０に示す。図２０中、横軸は抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体蛍光標識強度、縦軸は細胞数である。ＨＦＢ２５抗体陰性細胞集団に対して、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団の方が強い蛍光強度分布を示し、ヒト臍帯血由来細胞中、ＨＦＢ２５抗体に陽性の細胞は、Ｎｅｓｔｉｎの発現量も多いことがわかった。
【０１３１】
さらに、図２０の結果に基づき、ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５抗体陽性細胞と陰性細胞について、レーザースキャニングサイトメータの結果を、Ｎｅｓｔｉｎ発現量に基づいて、蛍光標識強度が０〜５００００をＮｅｓｔｉｎ陰性（−）、５００００〜１０００００をＮｅｓｔｉｎ陽性（＋）、１０００００〜１５００００をＮｅｓｔｉｎ陽性（＋＋）と分類した。結果を表４に示す。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
表４からわかるように、ヒト臍帯血細胞では、ＨＦＢ２５陽性細胞の８８．３％がｎｅｓｔｉｎ発現細胞であり、その１８．２％はｎｅｓｔｉｎを強発現しており、その割合はＨＦＢ２５陰性細胞（８．７％）の約２．１倍であった。
【０１３４】
〔ヒト成人末梢血からの神経幹細胞及び前駆細胞の分離採取〕
（１）ヒト成人末梢血から有核球細胞集団の分離
遠心チューブにヒト成人末梢血と等量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）を入れ、その上にヒト成人末梢血を重層し、２０℃で８００ｇ、２０分遠心し、有核球の層を採取した。分離細胞はヒトＮＳＰＣの保存と同様の方法で凍結保存（バンバンカー）し、以下の解析に使用した。
【０１３５】
（２）ＨＦＢ２５抗体反応性
臍帯血の場合と同様にして、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式をフローサイトメータを用いて、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合を測定した。
結果を図２１に示す。図２１中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞である。
図２１から、ヒト成人末梢血にはＨＦＢ２５抗体陽性が、２５％程度含まれていることがわかった。
さらにセルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ−ＳＥ、ベクトン−ディクソン社製）を用いて、ヒト成人末梢血由来ＨＦＢ２５陽性細胞（標識された細胞）とＨＦＢ２５陰性細胞（標識されなかった細胞）とを分取した。
【０１３６】
（３）ＨＦＢ２５陽性細胞でのＮｅｓｔｉｎ発現の検討
臍帯血の場合と同様にして、Ｎｅｓｔｉｎ発現量を調べた結果、図２２及び表５のようになった。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
表５からわかるように、ヒト成人末梢血中のＨＦＢ２５陽性細胞の７４．５％がＮｅｓｔｉｎ発現細胞であり、その１４．６％はＮｅｓｔｉｎを強発現しており、その割合はＨＦＢ２５陰性細胞（７．７％）の約１．９倍であった。
【０１３９】
〔細胞の分化レベルとＪＡＭ−１の発現との関係〕
（１）抗体チップを用いた神経幹細胞の発現タンパク質のスクリーニング
抗体チップ解析は、５１２種類の既知抗体が固定されたＢＤ ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ５００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて実施した。スライドガラスのスキャンはグラススライドスキャナー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ製）を用いて実施した。
ヒトＮＳＰＣ、および上記Ａの分化誘導方法で得られたグリア細胞集団からそれぞれタンパク質を、ＢＤ ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ５００添付の試薬により抽出し、各サンプルをＣｙ３あるいはＣｙ５蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で標識した後、抗体チップ解析を行ない、各細胞集団におけるＪＡＭ−1発現量を調べた。
グリア細胞集団におけるＪＡＭ−１発現量に対するヒトＮＳＰＣ細胞集団のＪＡＭ−１発現量（ヒトＮＳＰＣ／グリア細胞）は、０．６７３７７２であった。
【０１４０】
（２）ウエスタンブロットによる検討
ＪＡＭ−１の発現様式をさらに検討するため、合計１３種類のヒト株化細胞でのＪＡＭ−１の発現様式を同様にウエスタンブロットで検討した。
神経系細胞として、Ｕ−２５１ＭＧ，Ｕ−８７ＭＧ，Ｕ−３７３ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）、Ｄ２８３ Ｍｅｄ，Ｄａｏｙ（ｈｕｍａｎ ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）；分化能を有する神経系前駆細胞としてＮＴＥＲＡ２（ｔｅｒａｔｏｍａ由来のｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；非神経系細胞としてＪｕｒｋａｔ（ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ由来），２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ），ＨｅｐＧ２，ＨＵＨ−６，ＨＵＨ−７（ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の合計１３種類のヒト株化細胞をそれぞれ標準的な方法で培養し、細胞を調製した。コントロールとして、前述Ｂの分化誘導方法で得られたＮ／Ｇ細胞集団（Ｎ／Ｇ）、及び前述Ａの分化誘導方法で分化させたグリア細胞集団（ＡＳ）を用いた。
【０１４１】
各細胞からタンパク質を抽出し、１０μｇ／ｌａｎｅでＳＤＳポリアクリルアミドゲル（５−２０％勾配ゲル，ＡＴＴＯ）用いて電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェット方式でニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）に転写した。５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキング後、抗ＪＡＭ−１抗体（１％ＢＳＡで１：５００希釈，ベクトンディッキンソン）を１次抗体として室温１時間で反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔ」という）で１５分、３回洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体（１％ＢＳＡで１：１００００希釈）を２次抗体として室温で１時間反応させた。洗浄後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ （アメルシャム・バイオサイエンス社）の方法に従い、化学発光させた。この膜をＸ線フィルムと一緒にカセットに入れて、露光し現像した。
【０１４２】
結果を図２３に示す。ＪＡＭ−１は、３８ｋＤａのバンド（図中、矢印）の位置に現れる。
ＪＡＭ−１の発現は、神経系細胞に関しては、Ｕ−３７３ＭＧでは殆ど見られず、Ｄ２８３Ｍｅｄ，Ｔ９８Ｇでは発現がグリア細胞（ＡＳ）でより低かった。残りの神経系細胞におけるＪＡＭ−１の発現は、グリア細胞（ＡＳ）より高かった。非神経系細胞に関するＪＡＭ−１の発現は、Ｊｕｒｋａｔについてはグリア細胞（ＡＳ）よりやや低かったが、残りの非神経系細胞（２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＨＵＨ−６、ＨＵＨ−７）ではグリア細胞（ＡＳ）より高かった。
【０１４３】
（３）ヒトＮＳＰＣの分化誘導レベルと抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞との関係
ヒトＮＳＰＣの分化誘導におけるＪＡＭ−１陽性細胞の存在率を評価するため、ヒトＮＳＰＣとそこから分化誘導したグリア細胞を用いて、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式で測定して、ＪＡＭ−１陽性細胞の存在率を評価した。
同一ロットのヒトＮＳＰＣ細胞集団を３つのグループに分け、そのうちの２グループを、それぞれＡの方法で分化誘導させた。分化誘導４週間後、７週間後の細胞集団について、０．０５％トリプシン溶液処理により細胞懸濁液を調製した。
【０１４４】
この細胞懸濁液に対して、１０倍希釈した抗ＪＡＭ−１抗体（Ｈｙｃｕｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を氷上で３０分間反応させた後、培養液を用いて洗浄した。その後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウス−ＩｇＧ抗体（１：５００、ヤギ産生ポリクローナル抗体，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を３０分間、氷上で反応させた後、培養液で洗浄し、更にＰＩ（プロピジウムイオダイド）染色を行った。解析はベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式を用いて行い、モノクローナル抗体で各々の標識される細胞（陽性細胞）と非標識細胞（陰性細胞）の割合を算出した。
分化誘導させなかったヒトＮＳＰＣ、並びに分化誘導４週間後、及び７週間後の結果を、それぞれ図２４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図２４中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は、細胞数カウントである。横軸１０以上が抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団における抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞の割合をまとめると、表６のようになる。
【０１４５】
【表６】
【０１４６】
ヒトＮＳＰＣの状態では、ＪＡＭ−１陽性細胞はわずか６．０％であったが、グリア細胞（分化誘導後４週目）では約４０．８％の細胞がＪＡＭ−１陽性となっていた。しかし更なる分化誘導（７週間培養）にてその陽性率は再度低下（１０．５％）した。
これらの結果から、抗ＪＡＭ−１抗体は、神経幹細胞から完全分化の過程で一時的に現れる表面抗原に選択的に結合する。従って、神経前駆細胞及び神経幹細胞の混合集団では、抗ＪＡＭ−１抗体陰性であれば、神経幹細胞であると判定することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明の新規なモノクローナル抗体は、神経幹細胞に選択的な表面抗原に結合するので、神経幹細胞を含有するこ不均一な細胞集団から神経幹細胞又は神経幹細胞富化集団を生細胞のままでスクリーニングできる。従って、再生医療用に生体から採取した神経幹細胞が含まれる細胞集団、具体的には胎児脳組織、臍帯血、ヒト末梢血などの神経幹細胞含有集団から、神経幹細胞富化集団、ひいては神経幹細胞の検出、さらには分離する方法として利用できる。これにより、細胞ソース供給の点で問題があった神経幹細胞について、比較的広範囲のソースを、神経幹細胞の供給源として利用することが可能となる。
【０１４８】
本発明のスクリーニング用試薬は、人体移植用の神経幹細胞をスクリーニングする試薬として用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞（以下、これらを区別しないときは、まとめて「ＮＳＰＣ」という）の細胞表面抗原を選択的に認識する新規な抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びにこのモノクローナル抗体を用いて、生体外での培養により得られるヒトニューロスフェアや、生体から採取したヒトＮＳＰＣを含む不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣをスクリーニングし、選択的に分取する方法、ヒトＮＳＰＣの含有率を評価する方法、当該方法を実施するのに用いられるスクリーニング用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を特徴とする未分化な細胞で、胎児脳のみならず、成体脳にも存在することが判明しており、従来は再生が不可能と考えられてきた中枢神経内で、新生ニューロンおよび新生グリア細胞を作成させるための有用な移植用細胞として、再生医療領域での臨床応用が期待されている。
【０００３】
臨床応用するためには、入手しやすい細胞ソースからの分離、選択的培養方法の確立が重要である。
神経幹細胞が多く含有される組織である神経系細胞については、神経幹細胞、神経前駆細胞といった未分化な細胞だけでなく、分化した神経系細胞が多く含まれている。また神経系以外の細胞で、神経幹細胞が含まれることが報告されており、かつ比較的入手しやすい細胞ソースとしては、臍帯血細胞や骨髄細胞が考えられる。しかし、これらのソースの大部分は神経系以外の種々の細胞である。従って、このような不均一な細胞集団を細胞ソースとして利用し、そこから神経幹細胞を分離するためには、その分離方法、ＮＳＰＣのスクリーニング方法を確立する必要がある。
【０００４】
神経幹細胞の選択的培養方法として、現在、ニューロスフェア法が最も汎用されているが、ニューロスフェア法で増幅された細胞集団も、分化が進んだ細胞を含む不均一な細胞集団である。従って、神経幹細胞、神経前駆細胞の分離、スクリーニング方法が重要となる。
【０００５】
神経幹細胞を同定する方法として、非特許文献１では、ＬｅｎｄａｈｌとＭｃＫａｙらにより同定されたＮｅｓｔｉｎという中間径フィラメントタンパク質であるＮｅｓｔｉｎマーカーを用いる方法が提案されている。しかし、Ｎｅｓｔｉｎは細胞内に存在するため、生細胞のままで神経幹細胞を同定、単離する操作に応用することが困難である。
【０００６】
Ｎｅｓｔｉｎの他、神経幹細胞に対する選択性の高い表現マーカーとしては、ＮａｋａｍｕｒａとＯｋａｎｏらにより同定された分子量約３８ｋＤａのＲＮＡ結合蛋白質であるＭｕｓａｓｈｉ１が知られている。
【０００７】
Ｍｕｓａｓｈｉ１も、Ｎｅｓｔｉｎと同様に、細胞内に存在する蛋白質であるため、生細胞の場合、細胞が生きた状態で外部からこれらの蛋白質の発現状況を把握し、それを可視化することは通常の方法では不可能である。
【０００８】
生細胞でＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉ１の発現程度を可視化し、その発現量に基づいて、神経幹細胞を効率的に分離する方法として、ｍｕｓａｓｈｉ１プロモータ、あるいはｎｅｓｔｉｎエンハンサーの下流に、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を組み込んだレポータ遺伝子を、予め各種方法で人為的に神経幹細胞に遺伝子導入し、ＧＦＰ発現細胞を発現強度（蛍光強度）にしたがって、ＦＡＣＳを用いて分離することが報告されている（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。
【０００９】
しかし、この方法は、人体には存在しないＧＦＰ発現遺伝子の導入を伴っているため、効率的に分離、増殖させたとしても、この分離操作で得られた神経幹細胞を、実際に人体へ移植するといった臨床的応用には安全性の点で問題がある。
【００１０】
このようなことから、遺伝子導入を伴わない方法で神経幹細胞を検出できる細胞表面マーカーを用いた分離技術が望まれている。
【００１１】
近年、選択的細胞表面マーカーを用いたＦＡＣＳによる分離法を行なったものとして、非特許文献３に、ＣＤ１３３抗体を用いたヒト由来神経幹細胞の分離法が報告されている。そして、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−／ＣＤ４５−細胞が高率にニューロスフェアを形成することが報告されている。また特許文献３に、中枢神経の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生する方法として、モノクローナル抗体ＡＣ１３３、またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって、細胞表面マーカーを認識させることを利用する方法が開示されている。ＣＤ１３３抗体（ＡＣ１３３抗体）は、プロミニンホモログを認識する抗体であると予想されている。
【００１２】
さらに、特許文献４に、神経幹細胞の細胞表面マーカーとして、抗ＨＦＢ１１５モノクローナル抗体をはじめ、４種類の人工抗体（１６番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７８）、２７番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７９）、１１５番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８０）、２１１番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８１））を用いて、分離する方法が提案されている。
これらの抗体は、免疫原として、胎児のヒト脳組織のホモジェネートを用いて免疫したマウスの抗体産生細胞とミエローマ細胞とから作製されたハイブリドーマの産生抗体である。
【００１３】
またさらに、特許文献５に、哺乳動物末梢神経系から神経幹細胞の同定、単離方法として、ポジティブマーカーとして抗ｐ７５抗体を使用し、ネガティブマーカーとして抗Ｐ０を用いることが提案されている。
【００１４】
さらにまた、特許文献６及び非特許文献４に、ＧＤ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ、ＭＨＣ クラスＩ、β２マイクログロブリン、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ１５２の発現を神経幹細胞の陽性マーカーとし、ＭＨＣ クラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１５４を神経幹細胞の陰性マーカーとして神経幹細胞を分離する技術が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００１−２９２７６８
【特許文献２】特開２００２−３４５８０
【特許文献３】特開２００４−２３５０
【特許文献４】特表２００２−５３６０２３
【特許文献５】特表２００２−５３７８０２
【特許文献６】ＷＯ０２／０８６０８２
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lehndahlら、Cell 60:585-595(1990年)
【非特許文献２】H.M.Keyoungら、「High-yield selection and extraction of two promotor-defined phenotypes of neural stem cells from the fetal human brain」、Nat.Biotechnol.，19，843-850(2001年)
【非特許文献３】Uchida Nら、「Direct isolation of human central nervous system stem cells」、Proc Natl Acad Sci USA 2000;97;14720-25)
【非特許文献４】Klassen H,Schwartz MR,Bailey AH,Young MJら、「Surface markers expressed by multipotent human and mouse neural progenitor cells include tetraspanins and non-protein epitopes」Neuroscience Letters 2001 Oct.26;312(3):180-2(2001年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
生体に存在しない外来性遺伝子導入等を行なうことなく、生細胞状態で神経幹細胞又は神経前駆細胞の富化集団を同定、分離する方法として、細胞表面抗原、細胞表面マーカーを用いた上記方法のいずれも、ヒトＮＳＰＣに対する選択性は、未だ不十分であり、不均一な細胞集団から純度の高い神経幹細胞及び神経前駆細胞集団を分離、採取する方法の利用としては不十分である。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生細胞状態でヒトＮＳＰＣを、同定、分離できる選択性の高い抗体、及びこれを用いた、不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣを検出、分離することができる方法、当該方法で使用するスクリーニング用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、純度の高い培養ヒトＮＳＰＣの懸濁液で免疫感作した哺乳動物を用いて、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に対する選択性が高い新規な抗体を作製し、本発明を完成した。
【００１９】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、培養ヒト神経幹細胞及び／又は培養ヒト神経前駆細胞のホモジェネートで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応する。
【００２０】
前記ホモジェネートは、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られるニューロスフェアをホモジェナイズしたものであることが好ましく、また、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織、培養ヒト神経幹細胞、及びヒトニューロスフェアを単細胞にした細胞集団からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いてスクリーニングしたものであることが好ましい。
【００２１】
前記抗体が認識する抗原は、非還元状態のタンパク性抗原で、且つグリコシダーゼ又はグリコサミノグリカンによる糖鎖切断及び脱脂処理によって抗原性が損なわれないものであることが好ましい。
【００２２】
また、前記抗体は、具体的には、フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＹＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とはいずれも５％未満しか陽性反応を示さないものであり、より具体的には、寄託番号ＦＲＥＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である。
【００２３】
また、寄託番号ＦＲＥＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマも、本発明の範囲である。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応しないモノクローナル抗体の製造方法であって、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られらニューロスフェアのホモジェネートを免疫原として使用する工程；免疫感作した哺乳動物（ヒトを除く）のリンパ球をミエローマと細胞融合して、ハイブリドーマを得る工程；得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより選択したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する工程；及び産生されたモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織に接触させて陽性反応を示すモノクローナル抗体を選別する工程を含む。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト神経幹細胞、ヒト神経前駆細胞、ネスチン高発現細胞の同定、検出、分離、分取に用いることができる。
【００２６】
すなわち、本発明の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の同定方法は、不均一な細胞集団から、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の特性を有する細胞及びその細胞の局在性を同定する方法であって、上記本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行ない、染色された部分を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であると同定する工程を含む。
【００２７】
また、本発明のネスチン高発現細胞のスクリーニング方法は、ヒト神経幹細胞を含有する細胞集団を、上記本発明のモノクローナル抗体と反応させ、該モノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出する工程を含む。前記ネスチン高発現細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であってもよい。
【００２８】
前記細胞集団は、ヒト臍帯血由来細胞を含む集団であってもよいし、ヒト末梢血由来細胞を含む集団であってもよいし、ヒトニューロスフェアを単細胞に分散させてなる細胞集団であってもよい。
【００２９】
本発明の細胞集団の評価方法は、ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を含有する細胞集団において、上記本発明のモノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出し、該細胞集団における該モノクローナル抗体陽性細胞の割合を算出する工程を含む。
【００３０】
本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬は、ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の富化集団をスクリーニングするための試薬であって、上記本発明のモノクローナル抗体と溶媒とを含有する。
【００３１】
本発明において、「抗原と反応する」とは、免疫学でいう抗原抗体反応を示すことであり、抗体と抗原が結合することをいう。ここで、抗原と抗体の結合は、水素結合、イオン結合（クーロン力）、ファンデルワールス力、疎水結合等の化学的に弱い結合様式を含むもので、これらの総和であってもよく、いわゆる鍵と鍵穴の関係のような互いの立体的構造の関係に依存する結合である。
【００３２】
また、「組織と反応する」とは、対象となっているモノクローナル抗体で、該当組織を直接法、間接法又はＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）法で染色し、発色させたときに、発色（蛍光色素を用いた場合は特有の波長の蛍光）が認められることをいう。
【００３３】
本発明にいう「神経幹細胞」とは、ニューロスフェア法による増殖培地で培養したときに、自己複製能を有してニューロスフェアを形成できる多分化能を有する幹細胞をいい、「神経前駆細胞」とは、神経幹細胞よりやや分化の進んだ増殖能を有する未分化な細胞をいう。
【００３４】
また「分化した神経系細胞」とは、神経幹細胞を分化誘導して作成される各種細胞分化マーカー（ＧＦＡＰ、チューブリンβＩＩＩなど）を発現し、神経幹細胞マーカー分子（ｎｅｓｔｉｎ、ｍｕｓａｓｈｉ１など）を発現しない細胞をいい、具体的には、ニューロン細胞、グリア細胞などが挙げられる。
【００３５】
また、本発明にいう「フローサイトメトリーによる解析での陽性反応」とは、標識一次抗体と反応させた細胞集団をフローサイトメータで測定して反応陽性と判断されるもので、測定の結果を、標識に用いた蛍光色素が発光する特有の波長の蛍光強度についてみたときに、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれるものを、反応陽性と判断する。
【００３６】
「実質的に反応しない」とは、全く反応しない場合だけでなく、免疫染色の染色強度が一次抗体を用いずに評価したバックグラウンドの染色強度程度を示す場合や、肉眼的評価では十分に分別できない程度の弱染色性である場合、さらにフローサイトメトリーによる解析反応で陽性とは認められない場合も含まれる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＮＳＰＣに発現する細胞表面抗原に選択性が高いので、これを用いて、不均一な細胞集団である固体の組織塊や種々の細胞が混在した細胞浮遊液から、細胞を破壊したり、外来性レポータ遺伝子などを導入することなしに、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を、検出、同定、スクリーニング、分離、分取することができる。
さらに、上記のような細胞集団について、神経幹細胞、神経前駆細胞の含有率などを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒト８週齢胎児の大脳組織切片におけるＨＦＢ２５抗体反応結果を示す顕微鏡写真（７０倍）である。
【図２】ヒト８週齢胎児の大脳組織切片におけるＨＦＢ１８４抗体反応結果を示す顕微鏡写真（３２倍）である。
【図３】（ａ）はニューロスフェアにおける核染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）、（ｂ）はニューロスフェアにおけるＨＦＢ２５抗体の染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）である。
【図４】（ａ）はニューロスフェアにおける核染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）、（ｂ）はニューロスフェアにおけるＨＦＢ１８４抗体の染色結果を示す顕微鏡写真（２００倍）である。
【図５】ニューロスフェアの単細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体反応性を示すフローサイトメータの測定結果を示すプロファイルである。
【図６】（ａ）ヒトＮＳＰＣ細胞集団、（ｂ）分化誘導２週間後、（ｃ）分化誘導７週間後のＨＦＢ２５抗体との反応性を示す結果を示すフローサイトメータ解析で得られたプロファイルである。
【図７】（ａ）は分化誘導２週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導２週間後の細胞集団の抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）は分化誘導７週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導７週間後の細胞集団の抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図９】（ａ）は分化誘導２週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導２週間後の細胞集団の抗ＧＡＦＰ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）は分化誘導７週間後の細胞集団のＨＦＢ２５抗体染色結果を示す顕微鏡写真、（ｂ）は分化誘導７週間後の細胞集団の抗ＧＡＦＰ抗体染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図１１】未処理のヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真である。
【図１２】クロロホルム処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１３】Ｎ−グリコシダーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１４】Ｏ−グリコシダーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１５】コンドロイチナーゼＡＢＣ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１６】ケラタナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１７】ヘパリチナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１８】ヘパリナーゼ処理したヒトＮＳＰＣ細胞集団とＨＦＢ２５抗体との反応結果を示す顕微鏡写真（２０倍）である。
【図１９】ヒト臍帯血由来の細胞集団のＨＦＢ２５抗体との反応性を示すフローサイトメータ解析により得られるプロファイルである。
【図２０】ヒト臍帯血由来のＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団及び陰性細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量のＬＳＭでの測定結果を示すグラフである。
【図２１】ヒト成人末梢血由来の細胞集団のＨＦＢ２５抗体との反応性を示すフローサイトメータ解析により得られるプロファイルである。
【図２２】ヒト成人末梢血由来のＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団及び陰性細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現量のＬＳＭでの測定結果を示すグラフである。
【図２３】各細胞におけるＪＡＭ−１の発現についてのウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図２４】（ａ）はヒトＮＳＰＣの抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイル、（ｂ）分化誘導４週間後の細胞における抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイル、（ｃ）は分化誘導７週間後の細胞における抗ＪＡＭ−１抗体染色についてのフローサイトメータの解析結果のプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
〔モノクローナル抗体及びハイブリドーマの作製方法〕
はじめに本発明の抗体及びこれを産生するハイブリドーマの製造方法について説明する。
本発明の抗体は、通常のモノクローナル抗体作成技術、すなわち、免疫感作した哺乳動物から取り出した抗体産生細胞とミエローマとを融合させ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを調製することにより作製することができるが、免疫原として、培養されたヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を用いたことに特徴がある。
【００４０】
すなわち、本発明で用いた免疫原は、培養ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞のホモジェネートである。具体的には、ヒト胎児前脳部由来のヒトＮＳＰＣを継代培養して得られたニューロスフェアを急速凍結して、ホモジェナイズすることにより得られるホモジェネートである。
【００４１】
脳組織のホモジェネートの場合、神経幹細胞以外に分化が進んだ神経系細胞も多く混在し、また細胞成分以外の間質に含まれる成分も多数混在している。このため、前述の特許文献４に開示されているように、免疫原として脳組織のホモジェネートを用いた場合、未分化のヒトＮＳＰＣにのみ選択的な成分に免疫感作される効率が悪くなり、えられた抗体の神経幹細胞に対する選択性についても、神経幹細胞以外の種々の細胞を含む細胞集団から神経幹細胞を同定、検出、分離、分取するツールとしては不十分であった。この点、本発明で使用したニューロスフェアのホモジェネートでは、細胞成分以外の余計な部分の混在がほとんどなく、含まれる細胞の大部分がヒトＮＳＰＣであることから、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原で免疫感作する抗体を得られる確率が大幅に上昇し、ヒトＮＳＰＣに対して選択性の高い抗体をえることができた。
【００４２】
免疫感作に際しては、免疫原をアジュバントなどと混合した懸濁液を用いることが好ましい。
【００４３】
免疫する哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどを用いることができるが、ヒト抗原に対する抗体作製には、マウス、特に６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを用いることが好ましい。
【００４４】
免疫感作方法は、例えば、マウスを免疫する場合、免疫原を、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮膚内等へ免疫原を注射することにより行なう。接種間隔、接種量などは、接種方法により異なるが、例えば、マウスの皮下に接種する場合、抗原を３〜４日おきに、２週間程度接種した。さらに必要に応じて、ブーストする。このようにして、免疫感作された哺乳動物から、リンパ球等の抗体産生細胞を取り出し、細胞融合操作に供する。
【００４５】
細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、サルベージ経路で必要なＨＧＰＲＴ欠損株が好ましく用いられる。ミエローマは、細胞融合前の準備操作として、通常用いられるイーグル最小基本培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改良ＭＥＭ、ＰＲＭＩ１６４０等の基本培地に、１０％ＣＳ（子ウシ血清）、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加した培地で、予め培養されたものが用いられる。
【００４６】
細胞融合は、ミエローマと抗体産生細胞とを１：５〜１：２０の割合で混合することにより行なう。この際、ポリエチレングリコール、センダイウィルスなどの融合剤を用いる。
細胞融合後、ＨＡＴ選択培地で培養することにより、抗体産生細胞と融合したハイブリドーマだけを増殖させることができる。
【００４７】
得られたハイブリドーマから、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、ラジオイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセイ等の方法で調べることができる。
【００４８】
例えば、セルロースビーズ等の担体に、例えば免疫原に用いたホモジェネートを常法にしたがってカップリングさせておき、これにハイブリドーマの培養上清を加え、一定時間、反応させる。洗浄後、酵素で標識した抗マウスＩｇ抗体（二次抗体）を加えて反応させ、未反応抗体を除去した後、洗浄する。次いで、酵素基質を加える。酵素反応後、反応生成発色物の吸光度又は蛍光度等を測定して、抗体産生の有無を調べることにより、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングできる（一次スクリーニング）。
【００４９】
一次スクリーニングでスクリーニングされた抗体産生ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体について、さらに、ヒト脳組織切片及び培養ヒトＮＳＰＣと反応させて、陽性反応を示す抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした（二次スクリーニング）。陽性反応の検出については、二次抗体として抗マウスＩｇ抗体等のように、抗体産生細胞から産生される抗体に結合できる抗体で標識されたもの（標識二次抗体）と結合した細胞を、フローサイトメータ等を用いて、標識二次抗体の標識を検出することにより、検出する。二次スクリーニングで陽性を示す場合、抗体産生ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に選択的に結合できる抗体である。
【００５０】
以上のような一次スクリーニング及び二次スクリーニングにより、ヒトＮＳＰＣの細胞表面抗原に選択的に結合できる抗体、該抗体を産生するハイブリドーマを選別することができる。
【００５１】
このようにして選別したハイブリドーマを、限界希釈法等でクローニングを行なって、本発明のハイブリドーマを得る。このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６及び受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７で寄託されている。
得られたハイブリドーマを、液体培地中又は哺乳動物細胞の腹腔内で増殖させることにより、目的の抗体を取得することができる。
【００５２】
〔モノクローナル抗体〕
本発明のモノクローナル抗体は、上記作製方法にて作製されるモノクローナル抗体であって、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応するものである。具体的には、ＨＦＢ１８４抗体と命名された受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生される抗体、ＨＦＢ２５抗体と命名された、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６のハイブリドーマから産生される抗体が挙げられる。
【００５３】
ＨＦＢ２５抗体及びＨＦＢ１８４抗体を代表とする本発明のモノクローナル抗体は、脳発生異常、遺伝性疾患のない健常なヒト胎児期初期の大脳の脳室壁層、脳室壁下層の細胞と反応する。中間層、分子層の細胞と反応することもあるが、皮質板の細胞とは実質的に反応しない。胎児期とは、受精卵が胚葉になるまでの２週間である細胞期、細胞期に続く第３週から２ヶ月の終りまでの胎芽期を除く出生期までの期間をいい、胎児期初期とは、８週齢から１８週齢までの期間をいう。
【００５４】
胎児の大脳組織における層構造は、ヘマトキシリン・エオジン染色、ニッスル染色、ゴルジ染色等により認識することができる。大脳の脳室壁層とは、一側を脳室に接する細胞が作る細胞層で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により核は数層に並んで存在する。脳室壁下層とは脳室壁層に接する部分で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により脳室壁層に接する数列の集束した細胞層からなる領域と定義づけられる。皮質板は将来、神経細胞に分化する細胞（神経芽細胞）が高密度に並ぶ部分で、通常、層構造を画定するためのヘマトキシリン・エオジン染色により数列の細胞が高密度に集積した領域となって現れる部分をいう。中間層は脳室壁下層の外側で、脳室壁下層から皮質板までの細胞密度が比較的疎な領域をいい、分子層は皮質板より外側で脳軟膜より内側の領域をいう。胎児期初期、特に８週齢から１０週齢くらいの脳室壁層、脳室壁下層では、細胞増殖が盛んで、神経幹細胞が大量に局在している。一方、皮質板は、分化が終了した神経芽細胞が多く存在し、神経幹細胞はほとんど存在しない。従って、ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体は、未分化の神経幹細胞、神経前駆細胞のときに発現する表面抗原で、分化が進むにしたがって消失する表面抗原に選択的である。
【００５５】
ここで、組織との反応性は、対象となっているモノクローナル抗体を用いて、該当組織を直接法、間接法又はＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）法で染色し、蛍光顕微鏡、レーザ顕微鏡又は免疫電子顕微鏡などで観察して、発色（蛍光色素を用いた場合は特有の波長の蛍光）の有無で判断する。
【００５６】
本明細書にいう「抗原に選択的」とは、多数の細胞集団の中から、神経幹細胞を選択する際の指標となり得る抗体の特性で、特異性よりも広い概念である。つまり、その抗原が神経幹細胞以外に発現していても、神経幹細胞の分離操作に用いることができる程度に神経幹細胞を選択的に識別できる程度をいう。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＦＢ１８４抗体に限定されず、ＨＦＢ２５抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基又はＨＦＢ１８４抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基の少なくともいずれか一方の抗原決定基と反応する抗体を包含する。換言すると、ＨＦＢ２５抗体又はＨＦＢ１８４抗体と共通する抗原結合部位を有するモノクローナル抗体であれば、他の部分はＨＦＢ２５抗体又はＨＦＢ１８４抗体と異なる構造であってもよい。
【００５８】
ここで、「反応する」とは、免疫学でいう抗原抗体反応を示すことであり、抗体と抗原が結合することをいう。抗原と抗体の結合は、水素結合、イオン結合（クーロン力）、ファンデルワールス力、疎水結合等の化学的に弱い結合様式を含むもので、これらの総和であってもよく、いわゆる鍵と鍵穴の関係のような互いの立体的構造の関係に依存する結合である。
【００５９】
ＨＦＢ２５抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基、ＨＦＢ１８４抗体が認識する（抗原抗体反応を示す）抗原決定基は、神経幹細胞の細胞表面に発現されるが、分化の過程で、その発現量が変化（減少）し、細胞集団全体としてみれば、陽性細胞の割合が減少していくものである。具体的には、分化誘導開始から７週間後に７０％以上、好ましくは８０％以上、陽性細胞割合が減少していくものである。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体が認識する抗原の抗原性は、いずれもグリコシダーゼやグリコサミノグリカンによる糖鎖切断や、クロロホルム処理等による脱脂等によっては失われないが、通常の還元剤を使用したウエスタンブロットでは喪失するものである。従って、非還元状態のタンパク性抗原であると考えられる。
【００６１】
また、本発明のモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＴＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とは５％未満しか陽性反応を示さない。ＮＥＴＲＡ２とは、奇形腫由来のヒト胎児性癌細胞で、分化能を有する神経系前駆細胞に類似の細胞である。Ｕ−８７ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１，Ｕ２５１ＭＧは、いずれもヒト膠芽細胞腫由来の神経系細胞であり、アストロサイト（分化細胞）に類似の特性を有する細胞である。
【００６２】
上記フローサイトメトリーによる解析とは、抗体を直接的又は間接的、あるいはＡＢＣ法で蛍光標識し、対象となる細胞集団をフローサイトメータで測定して、陽性反応を示す細胞割合を算出している。フローサイトメトリーによる反応が陽性というのは、標識に用いた蛍光色素が発光する特有の波長の蛍光の強度の中で、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれる場合をいう。
【００６３】
〔神経幹細胞のスクリーニング方法〕
本発明の方法は、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法を利用して、不均一な細胞集団から、ヒトＮＳＰＣあるいはＮｅｓｔｉｎ高発現細胞を同定、検出、分離、分取する方法である。
【００６４】
すなわち、不均一な細胞集団を、上記本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫染色し、染色された部分を検出することにより、当該染色部分を部分をヒトＮＳＰＣであると高確率で同定、あるいは細胞集団におけるヒトＮＳＰＣの局在性を知る方法である。
【００６５】
また、神経幹細胞を含有する細胞集団から、上記本発明のモノクローナル抗体（ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体）陽性細胞をスクリーニングし、必要に応じて分離、採取する方法である。
【００６６】
さらにヒトＮＳＰＣは、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞と等価と考えられていることから、上記同定、スクリーニング、分離、分取方法によって、不均一細胞集団から、Ｎｅｓｔｉ高発現細胞を同定、検出、分離、分取する方法にも適用できる。
【００６７】
本発明の方法を適用できる細胞集団は、特に限定せず、単細胞の細胞集団に限らず、生検による組織塊の切片であってもよいが、好ましくは、単細胞の細胞集団である。ヒトＮＳＰＣを含有する細胞集団としては、ニューロスフェア等の細胞集団；成体の脳、脊椎から採取した固体組織；臍帯血やヒト成人末梢血等の液性の細胞集団などが挙げられる。神経系以外の組織であっても、ヒトＮＳＰＣを含む細胞集団があるので、これらもヒトＮＳＰＣの有無、局在性、含有割合を知る上で、本発明の方法の適用対象となる。また、液性の細胞集団の場合には、単一組織由来の細胞集団に限らず、異種組織由来の細胞集団の混合系であってもよい。
【００６８】
尚、ヒト成人末梢血にも、多能性幹細胞が含まれていることは、Ｉｌｈａｍ Ｓａｌｅｈ Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｕｎｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｏｐｉｎｉｏｎ、２００３，Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．５，３５５−３７５）に開示されている。
【００６９】
免疫染色とは、標識された抗体と、対象となる細胞集団を反応させ、標識された抗体が細胞集団に含まれる抗原と反応し、結合したことにより、細胞集団に含まれる該当細胞が染色されることをいう。
【００７０】
抗体の標識付けは、抗体に直接標識を結合させることによって行なってもよいし（直接的）、本発明のモノクローナル抗体を一次抗体として標識二次抗体と結合させることにより間接的に標識してもよい（間接法）。また、二次抗体の代りにビオチンと特異的に結合する性質をもつ蛍光標識アビジンを用いたＡＢＣ法を利用してもよい。
【００７１】
標識としては、従来より標識に用いられているものを使用できる。具体的には、蛍光色素、放射性物質、金コロイド、酵素、化学発光などが挙げられる。これらの標識の検出方法は、標識の種類に応じて、従来より公知の方法から適宜選択される。例えば、酵素標識の場合、二次抗体の代りに基質を加え、その発色を見ることになる。放射性物質の場合にはシンチレーションカウンタなどで、放射能レベルを測定する。蛍光色素の場合、励起光をあてて、放出された蛍光の強度を測定する。
【００７２】
細胞集団として、固定された組織塊の切片を用いた場合は、内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、非特異吸着をブロックした後、抗体と反応させればよい。切片は、パラフィン切片、マイクロスライド切片、凍結切片いずれであってもよい。染色は、酵素抗体法、蛍光抗体法が好ましく用いられ、染色の有無は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡などで観察することにより判断すればよい。
【００７３】
細胞集団が単細胞の細胞集団の場合には、フローサイトメトリーによる解析が好ましく用いられる。
フローサイトメトリーによる解析とは、蛍光色素でモノクローナル抗体を直接法、間接法、又はＡＢＣ法で標識し、細胞集団と反応させた後、フローサイトメータで測定して、個々の細胞の表面上の抗原に結合した抗体から得られる蛍光を光学的にとらえ、さらに電気信号に変換し、標識を検出し、記録する測定方法である。標識に用いた蛍光色素の特有の波長の蛍光強度の中で、一次抗体を用いずに計測したバックグラウンドの強度より高い強度の蛍光域に含まれるものを陽性と判断する。
【００７４】
フローサイトメトリー解析に適用する細胞集団は、細胞１×１０５個以上含まれる集団であることが好ましく、陽性群と判断できる細胞が８０％以上、好ましくは９０％以上であれば、選択的に反応したと考えられる。
【００７５】
フローサイトメトリーによる解析で陽性と判断される細胞は、ソート機能を備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）や、表面抗原特異的抗体と磁気ビーズを併用したＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）システムや、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体と特異的に結合できる抗体を結合させた抗体カラムを通過させて二次抗体結合細胞と結合した細胞を分離する方法などにより、分離、分取することができる。
【００７６】
ＦＡＣＳでは、標識として使用した蛍光強度に応じて陽性細胞と陰性細胞を分離採取することができる。ＭＡＣＳシステムによる分離は、細胞を磁性をもつビーズで標識し、強力な永久磁石上に設置された分離カラムを通し、磁気標識細胞のみをカラムに保持することにより分離する方法である。また、抗体カラムを用いる方法では、本発明のモノクローナル抗体（特にＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体）のエフェクター部位と特異的に結合できる二次抗体や本発明のモノクローナル抗体自体と特異的に結合できる抗体（例えば抗ＨＦＢ２５抗体又は抗ＨＦＢ１８４抗体）を結合させたカラムを通すことで、抗ＨＦＢ２５抗体又は抗ＨＦＢ１８４抗体等が結合した細胞（抗体陽性細胞）と結合していない細胞（抗体陰性細胞）とを分離することができる。
【００７７】
ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性細胞をはじめとする本発明のモノクローナル抗体陽性細胞は、ネスチン高発現細胞である。Ｎｅｓｔｉｎは、神経幹細胞のマーカーとして認識されている細胞内タンパク質であることから、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性細胞等の本発明のモノクローナル抗体陽性細胞を分離、分取することにより、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、すなわちヒトＮＳＰＣを分離、分取することができる。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法では、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性と判定された細胞について、さらに、抗ＪＡＭ−１抗体とも反応させて陰性と判定される細胞を検出することにより、神経幹細胞を選択的に検出することができる。
【００７９】
ここで、抗ＪＡＭ−１抗体の抗原であるＪＡＭ−１は、ヒトＮＳＰＣから分化誘導させた神経系細胞の状態で発現する細胞表面分子で、ヒトＮＳＰＣでほとんど発現していないが、分化の途中で発現し、さらなる分化の進行で発現が低下していく。つまり、神経系細胞の分化の過程で一過的に現れる細胞表面蛋白質分子である。このようなＪＡＭ−１と特異的に結合する抗ＪＡＭ−１抗体は、神経幹細胞及び成熟した分化細胞（アストロサイト）に陰性であるが、神経幹細胞の分化の過程で一過的に陽性反応を示す。従って、ＨＦＢ２５又はＨＦＢ１８４抗体陽性と判定された細胞集団、すなわち分化傾向を呈したヒト神経系前駆細胞とより未分化なヒトＮＳＰＣの混合集団から、抗ＪＡＭ−１抗体陰性細胞、即ちより未分化なヒトＮＳＰＣを選別することが可能である。
【００８０】
抗ＪＡＭ−１抗体は、細胞表面のタンパク質ＪＡＭ−１（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ―Ａｄｈｅｓｉｏｎ―Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９Ｙ６２４）を認識するモノクローナル抗体、ＪＡＭ−１の細胞表面抗原を認識する抗原結合部位を有する抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２、Ｆａｂなど）、免疫グロブリンを含む概念である。市販品としては、Ｈｙｃｕｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のマウス産生抗ＪＡＭ−１ＩｇＧモノクローナル抗体などを使用することができる。
【００８１】
このように、本発明のモノクローナル抗体と、抗ＪＡＭ−１抗体を併用することにより、細胞集団から、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、すなわちヒトＮＳＰＣ富化集団を分離、採取することができ、さらに抗ＪＡＭ−１抗体と反応させて、陰性と判定された細胞を分離、採取することにより、神経幹細胞富化集団を分離、採取することが可能となる。
【００８２】
本発明のヒトＮＳＰＣスクリーニング用試薬は、ＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体を必須成分として含有するもので、溶媒としては、神経幹細胞培養に用いる培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）やＰＢＳを用いることができる。一方、スクリーニング用試薬には、血清、界面活性剤は含まれないことが好ましい。血清は神経幹細胞を分化誘導させる作用があり、界面活性剤は、細胞表面分子の抗体での認識を妨げる可能性があるからである。
【００８３】
本発明の神経幹細胞スクリーニング用試薬は、さらに抗ＪＡＭ−１抗体を含有してもよい。ＨＦＢ２５抗体と同様の特性を有するＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体に陽性で、且つ抗ＪＡＭ−１抗体陰性の細胞をスクリーニングすることで、神経幹細胞の純度が高い細胞集団を分離、採取することができる。
【００８４】
本発明の細胞集団評価方法は、ヒトＮＳＰＣを含む細胞集団におけるヒトＮＳＰＣの含有率を評価する方法である。本発明の評価方法は、細胞集団を、本発明のスクリーニング用試薬、すなわちＨＦＢ１８４抗体をはじめとする本発明のモノクローナル抗体と反応させ、陽性細胞の含有率に基づいて評価する方法である。ＨＦＢ１８４抗体陽性細胞がＮｅｓｔｉｎ高発現細胞と相関性があることに基づく方法で、本発明のスクリーニング方法で対象となる細胞集団に適用できる。
【００８５】
さらに抗ＪＡＭ−１抗体との反応性を併用することで、すなわちＨＦＢ２５抗体と同様の特性を有するＨＦＢ１８４抗体に代表される陽性で且つ抗ＪＡＭ−１抗体陰性の細胞を検出することで、細胞集団におけるヒトＮＳＰＣ、神経幹細胞の含有率の評価することができる。
【００８６】
上記評価方法は、ＨＦＢ１８４抗体に代表される本発明の抗体、及び必要に応じて、さらに抗ＪＡＭ−１抗体を蛍光標識し、フローサイトメトリーなどを用いて得られるヒストグラム、サイトグラム（ドットプロット）等のプロファイルなどから、ＨＦＢ１８４抗体陽性細胞（抗ＪＡＭ−１抗体を含有する場合はさらに抗ＪＡＭ−１抗体陰性細胞）の含有割合を求めることによって行なってもよいし、試料となる細胞集団や組織をスライドグラスに貼付けて、免疫細胞・組織化学的手法によって行なってもよいし、ＥＬＩＳＡやＲＩＡなどで行なってもよい。
【実施例】
【００８７】
〔ハイブリドーマの作製〕
（１）免疫原について
国立病院機構大阪医療センター倫理委員会及び産業技術総合研究所倫理委員会承認の下、妊娠９週齢のヒト胎児前脳部由来のＮＳＰＣを、下記神経幹細胞増殖培地を用いて、Ｋａｎｅｍｕｒａらの方法（Ｋａｎｅｍｕｒａ ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｉｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９，８６９−８７９，２００２）により継代培養して得られたヒトニューロスフェアを急速凍結しホモジナイズした。得られたホモジェネートを免疫原として用いた。
【００８８】
ヒトニューロスフェア法の培養に使用した培地組成は、以下の通りである。
ＤＭＥＭ ／Ｆ１２（１：１混合物、シグマ社）
ヒト組換え（以下「ｈｒ−」と略記する）ＥＧＦ（インビトロジェン社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＬＩＦ（ケミコン・インターナショナル社）１０ｎｇ／ｍｌ
ヘパリン（シグマ社）５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ２７（インビトロジェン社）
ＨＥＰＥＳ１５ｍＭ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロゲン社）
【００８９】
（２）動物の免疫
モノクローナル抗体の作製は、Ｏｒｌｉｋ，Ｏ ＆ Ａｌｔａｎｅｒ，Ｃ （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１５：５５−５９，１９９８）による変法に従い、鼡径部リンパ節細胞を用いて行った。
【００９０】
すなわち、（１）で調製した免疫原（２００μｇ）を、ＲＩＢＩアジュバント（フナコシ社）と等量づつ混合したものを、生後６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの両足底に、１回０．２ｍｌを、３〜４日おきに、合計３回接種した。更に５日後に、ブーストとして、同量を免疫した。ラストブースト３日後のマウスを細胞融合操作に用いた。
【００９１】
（３）細胞の融合
（２）により免疫感作したマウス（５匹）の両鼡径部リンパ節を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ライフテクノロジー社）にいれて2枚のスリガラスに挟んですり合わせるようにしてリンパ球を取り出した（約1×１０８個）。一方、株化ミエローマ（ＦＯ−１細胞）を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、８アザグアニン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃で培養し、さらに細胞融合前の２〜３日は、８アザグアニンを除去した同上組成培地で培養し、細胞を準備した（約４×１０７個）。
取り出したマウスリンパ球と株化ミエローマ細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１５％ＦＣＳ）の５０ｍｌ中で混和し、１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間室温で遠心分離し、上清を捨て２０ｍｌの増殖培地に細胞を懸濁した。この細胞懸濁液２０ｍｌに、５０％ポリエチレングリコール水溶液１００μｌを加えて３７℃のＣＯ２インキュベーターに９０分間入れて保温した。その後、１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間室温で遠心分離し、上清を捨て、さらに数秒程度の回転数にて遠心分離し上清を出来るだけ吸い取った。３７℃の恒温水槽の水面に細胞試料の入った容器を軽く打ち付けるようにして温めながら上記遠心分離沈殿をほぐした。３７℃であらかじめ温めた５０％ポリエチレングリコール水溶液１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振盪し、さらに１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振盪した。さらに８ｍｌを２−３分かけて添加して混ぜてから１０００ｒｐｍ（回転数／分）で５分間遠心分離した。
【００９２】
えられた沈殿物（細胞）に、ＨＡＴ培地（増殖培地１００ｍｌあたりに５０×ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを２ｍｌくわえる）を５０ｍｌ加えた。この懸濁液を、９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ播種して培養した（５プレート）。この時、胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ細胞（細胞の増殖を助けるための共存させる他の種類の細胞）として、約１×１０５個／ｗｅｌｌの割合で加えた。３日間培養した後に、ＨＡＴ培地を５０μｌ／ウェル加え、以後、ＨＡＴ培地の添加、交換を行ないながら、ハイブリドーマの増殖コロニーがウェルの１／４〜１／３程度になるまで培養した。コロニーが適当な大きさになった時点で培養上清を採取し、以下のスクリーニングに供した。
【００９３】
（４）ハイブリドーマの選定とクローニング
上記（３）で得られたハイブリドーマ由来の抗体について、下記酵素抗体法により、ヒト胎児脳組織標本と免疫反応するハイブリドーマを含むウェルを選別した。
【００９４】
脳奇形等の重症の合併症のない胎齢８−１４週ヒト胎児剖検脳のパラフィン包埋切片を免疫組織化学的スクリーニングに使用した。パラフィン包埋された組織片から５μmの切片を作製し、シランコーテイングスライドに貼付して、３７℃インキュベーターで一晩乾燥させた。染色前に、ヒストクリアおよびエタノールにて脱パラフィンを行った。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで切片を洗浄し、２％過酸化水素加メタノールに３０分室温にて浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。１０％ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて１時間、非特異吸着をブロックした後、（３）で得られたハイブリドーマ培養上清を希釈せず１００μｌ滴下し、４℃で一晩反応させた。翌日、ビオチン化二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体＋抗マウスＩｇＭ抗体）を滴下し、１時間室温にて反応させた。その後、ＡＢＣキット（ニチレイマルチステイン）を使用し、ＤＡＢにて発色させた。必要に応じて核染色を実施し、脱水、透徹後、オイキットにて封入した。
【００９５】
ヒト胎児脳組織切片に対して、陽性反応を示したウェルを、約０．５個ハイブリドーマ／ウェルになるように限界希釈した後、培養液をＨＴ培地＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅ（増殖因子、大日本製薬）に交換し、目的のハイブリドーマ由来の細胞集団を得た。
このようにして得られたハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０６及びＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７ある。
【００９６】
（５）マウス腹水の産生
ニードル小 (２３Ｇ ＴＥＲＵＭＯ） を用いて、シリンジ小（１ｍｌ ＴＥＲＵＭＯ）でプリステン（テトラメチルペンタデカン；東京化成）を０．５ｍｌ／マウスの分量でマウス（４週齢の 雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＳＣＬ）の腹腔内に打ち、前処理を実施した。前処理二週間後、ニードル小を用い、シリンジ大（５ｍｌ ＴＥＲＵＭＯ）でＰＢＳ［ＰＢＳ（−）ｐＨ ７．４ フィルター滅菌済み］に懸濁したハイブリドーマ細胞（０．５〜１×１０７個／ｍｌ／マウス）を腹腔内に投与した。数日後、マウスの腹部が膨れてきたことを確認後、ニードル中（１６Ｇ ＴＥＲＵＭＯ）を用いシリンジ大で腹水の採取を実施した。得られた腹水は、チューブ小に２ｍｌずつ分注し、マイナス８０℃で保存した。
えられたモノクローナル抗体を、それぞれＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体と命名した。これらは、いずれもＩｇＭ型抗体である。
【００９７】
〔ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体の性質試験〕
（１）胎児脳についての免疫組織染色
ヒト８週齢胎児の大脳のパラフィン永久組織標本から５μｍの切片を作成し、シランコーテイングスライドに貼付して、３７℃インキュベーターで一晩乾燥させた。染色前に、ヒストクリアおよびエタノールにて脱パラフィンを行った。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで切片を洗浄し、２％過酸化水素加メタノールに３０分室温にて浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。１０％ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにて１時間、非特異吸着をブロックした後、（５）で得られたマウス腹水（ＨＦＢ２５およびＨＦＢ１８４抗体）を５００倍希釈して、４℃で一晩反応させた。翌日、ビオチン化二次抗体（抗マウスＩｇＭ抗体）を滴下し、１時間室温にて反応させた。その後、ＡＢＣキット（ニチレイマルチステイン）を使用し、ＤＡＢにて発色させた。必要に応じて核染色を実施し、脱水、透徹後、オイキットにて封入した。
【００９８】
ＨＦＢ２５抗体含有液のヒト８週齢胎児の大脳組織切片との反応結果を示す顕微鏡写真を図１に、ＨＦＢ１８４抗体含有液のヒト８週齢胎児の大脳組織切片との反応結果を示す顕微鏡写真を図２に、それぞれ示す。
【００９９】
図１から、ＨＦＢ２５抗体については、ヒト胎児８週齢大脳では、脳室壁層（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ；ＶＺ）、脳室壁下層（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ；ＳＶＺ）が強く染色され、中間層（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｚｏｎｅ；ＩＭＺ）および分子層（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｙｅｒ；ＭＬ）にも陽性所見が得られたが、皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ；ＣＰ）には明らかな染色性は存在しなかった（図１）。
【０１００】
図２から、ＨＦＢ１８４抗体については、ヒト胎児８週齢大脳では、ほぼ全層に渡って繊維状の染色像を呈した（図２）。その中でもＭＬに比較的強い陽性所見が見られた。
【０１０１】
（２）ヒトニューロスフェアに対する反応性
継代培養されたヒトニューロスフェアを、４％パラホルムアルデヒドで４℃で２０分間固定した。その後、３０％ショ糖／ＰＢＳに４℃で３０分間つけ、ＯＣＴ−コンパウンドに凍結包埋した。その後、クリオスタットを用いて１２μｍの切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。凍結切片を１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体をそれぞれ１次抗体として、一晩４℃反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を反応させ、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させた。染色結果を、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１０２】
核染色結果及びＨＦＢ２５抗体の染色結果を図３に示す。また、核染色結果及びＨＦＢ１８４抗体の染色結果を図４に示す。
図３及び図４のいずれも抗体の染色結果と核染色結果は、ほぼ一致していた。従って、ヒトニューロスフェアを構成するほとんどの細胞、すなわちヒトＮＳＰＣが、両抗体の陽性細胞であることがわかる。
【０１０３】
（３）ＦＡＣＳを用いた解析
ヒトＮＳＰＣをトリプシンを用いて分散し、セルストレーナーを使用して単一細胞の細胞懸濁液を作成した。これらの細胞懸濁液に対して、１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体（マウス腹水）を各々、氷上で３０分間反応させた後、培養液を用いて洗浄した。その後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウス−ＩｇＭ抗体（１：５００、ヤギ産生ポリクローナル抗体，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を３０分間、氷上で反応させた後、培養液で洗浄し、更にＰＩ（プロピジウムイオダイド）染色を行った。解析はベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式を用いて行い、各モノクローナル抗体で各々の標識される細胞（陽性細胞）と非標識細胞（陰性細胞）の割合を算出した。
【０１０４】
ＰＩは二重らせん構造のＤＮＡにインターカレーションするＤＮＡ染色であり、これにより全細胞数を知ることができる。ＨＦＢ２５抗体陽性細胞は、ＨＦＢ２５抗体に結合した二次抗体の標識である緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８の蛍光強度により知ることができる。
【０１０５】
コントロール細胞として、１０種類の培養ヒト株化細胞、すなわち神経系細胞であるＵ−８７ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１，Ｕ２５１ＭＧ（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）Ｄａｏｙ，Ｄ２８３Ｍｅｄ（ｈｕｍａｎ ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）；分化能を有する神経系前駆細胞であるＮＴＥＲＡ２（ｔｅｒａｔｏｍａ由来のｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；血球系細胞であるＪｕｒｋａｔ、Ｋ５６２（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ由来）；非神経系接着細胞である２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の集団について、同様に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＨＦＢ２５陽性細胞とＨＦＢ２５陰性細胞の割合を算出した。
【０１０６】
結果を図５に示す。図５中、縦軸は細胞数カウント、横軸は緑色蛍光の蛍光強度であり、１０以上のシグナルを示すものはＨＦＢ２５抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体陽性細胞とＨＦＢ２５抗体陰性細胞の割合をまとめると、表１のようになる。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ヒトＮＳＰＣ及びヒトＥＣ細胞であるＮＴＥＲＡ２については、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合が非常に高く、他の神経系細胞、非神経系の株化細胞では、起源的にヒトＮＳＰＣに近いとの説があるＤａｏｙ（５４％）と、血球系のＪｕｒｋａｔ（４２．５％）に比較的ＨＦＢ２５陽性細胞が多く存在したが、その他の神経系細胞及び非神経系細胞ではＨＦＢ２５陽性を示す割合は低かった。
【０１０９】
ＨＦＢ１８４抗体を用いて同様にＦＡＣＳによる解析をしたところ、ＨＦＢ１８４陽性細胞の割合はヒトＮＳＰＣで９９．１％、Ｕ２５１ＭＧで０．２％、Ｊｕｒｋａｔで４６．６％であり、ＨＦＢ２５抗体を用いた解析結果とほぼ同傾向であった。
以上から、本発明ＨＦＢ２５抗体、ＨＦＢ１８４抗体、いずれも未分化の神経系細胞に発現する表面抗原を選択的に認識する抗体で、分化した神経系細胞、非神経系細胞の表面抗原とは反応しない抗体であることがわかる。
【０１１０】
〔神経幹細胞の分化レベルと抗体の反応性〕
（１）神経幹細胞の分化誘導
分化誘導方法Ａ：
ニューロスフェア法で用いる培地から増殖因子を除去し１０％ＦＢＳを添加した培地にて分化誘導を行ない、分化誘導後、１−２週間ごとに０．０５％トリプシン溶液を用いて単細胞に分散させて継代するという操作を複数回繰り返した。この方法により、グリア細胞ほぼ１００％の細胞集団が得られる。
分化誘導方法Ｂ：
ニューロスフェア法で用いる培地から増殖因子を除去し、１％ＦＢＳを添加した培地にて２週間培養し、分化誘導を行った。この方法では、神経細胞とグリア細胞の混合培養（以下「Ｎ／Ｇ細胞」という）集団（チューブリンβＩＩＩ陽性の神経細胞が約２０％、ＧＡＦＰ陽性のグリア細胞が約８０％）が得られる。
【０１１１】
（２）ＦＡＣＳを用いた解析
２ロット（ロットＮｏ．１、２）のヒトＮＳＰＣ細胞集団を、それぞれＡの方法で分化誘導させた。分化誘導２週間後、７週間後の細胞集団について、前述と同じ方法を用いてＦＡＣＳでＨＦＢ２５抗体陽性細胞の比率を検討した。
分化誘導させなかったヒトＮＳＰＣ、並びに分化誘導２週間後、及び７週間後の結果を、それぞれ図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図６中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は、細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団におけるＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合をまとめると、表２のようになる。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
表２からわかるように、ヒトＮＳＰＣの分化の進行に従い、ＨＦＢ２５抗体陽性を示す割合が次第に減少していくことがわかる。つまり、ＨＦＢ２５抗体は、未分化ヒトＮＳＰＣの表面に存在し、その後、分化の過程で消失していく細胞表面抗原に選択的な抗体であることがわかる。
【０１１４】
（３）抗チューブリンβＩＩＩ抗体とＨＦＢ２５抗体陽性細胞との関係
分化誘導法Ｂを用いて作成した細胞で、分化誘導２週間後、７週間後の各細胞集団について、神経系マーカーである抗チューブリンβＩＩＩ抗体とＨＦＢ２５抗体の二重染色を行なった。細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）と抗ｔｕｂｕｌｉｎβＩＩＩ（ＴｕＪ１）抗体（１：５００；ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ， ＢａｂＣＯ社）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。反応後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたヤギ産生抗ウサギＩｇＭ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で標識されたヤギ産生抗ウサギＩｇＧ抗体，いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温にて１時間反応させた。染色後の観察は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて実施した。
【０１１５】
分化誘導２週間後の蛍光顕微鏡写真を図７（ａ）（ＨＦＢ２５抗体による染色）及び（ｂ）（抗チューブリンβＩＩＩ抗体による染色）に示す。また、分化誘導７週間後の顕微鏡写真を図８（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗チューブリンβＩＩＩ抗体染色）に示す。図７、８中のスケールバーは１００μｍである。
【０１１６】
図７、８から、神経系マーカー（抗チューブリンβＩＩＩ抗体）を用いた検討では、分化誘導初期（２週間）の時点ではＨＦＢ２５（＋）／チューブリンβＩＩＩ（＋）細胞が確認されるが、分化誘導後期（７週間）ではＨＦＢ２５（＋）細胞は殆ど消失し、チューブリンβＩＩＩと共発現する細胞も殆ど見られなかったことがわかる。
【０１１７】
（４）抗ＧＦＡＰ抗体とＨＦＢ２５陽性細胞との関係
Ａ方法による分化誘導２週間後、７週間後の各細胞集団について、グリア系細胞のマーカーである抗ＧＡＦＰ抗体とＨＦＢ２５抗体の二重染色を行なった。方法は、前述と同様に、細胞を固定し、ブロッキングした後、１次抗体として５００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）とウサギ産生抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（シグマ社）（１：８０）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。反応後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＧ抗体，いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とＴＯ−ＰＲＯ−３ ｉｏｄｉｄｅ（１μＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温にて１時間反応させた。染色後の観察は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて実施した。
【０１１８】
分化誘導２週間後の蛍光顕微鏡写真を図９（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗ＧＡＦＰ抗体染色）に示す。また、分化誘導７週間後の顕微鏡写真を図１０（ａ）（ＨＦＢ２５抗体染色）及び（ｂ）（抗ＧＡＦＰ抗体染色）に示す。図９、１０中のスケールバーは１００μｍである。
【０１１９】
図９ではＨＦＢ２５（＋）／ＧＡＦＰ（＋）細胞が確認されたが、図１０ではＨＦＢ２５（＋）細胞は殆ど消失し、ＧＡＦＰと共発現する細胞も殆ど見られなかった。これらの結果から、ＨＦＢ２５抗体は、グリア細胞とも反応しないことがわかる。
【０１２０】
〔各種酵素処理と抗原性との関係〕
（１）クロロホルム処理による脱脂の影響
脂質性抗原の特性を有するかどうかの検討のため、クロロホルム処理による脱脂の影響を検討した。
【０１２１】
継代培養されたヒトニューロスフェアを０．０５％トリプシン溶液処理して単細胞に分散させてなる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に対して４％パラホルムアルデヒド処理４℃、２０分間の固定後、切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。切片はクロロホルムとメタノールを２：１で混合した溶液で室温１０分間脱脂処理を行った後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした。１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させた。染色結果は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１２２】
コントロールとして、脂質性抗原を認識するＡ２Ｂ５抗体を上記と同様にクロロホルム処理した細胞に反応させ、それぞれ、クロロホルム処理前後での各抗体（ＦＨＢ２５抗体およびＡ２Ｂ５抗体）しなかった以外は上記と同様に処理したものを使用し、顕微鏡観察した。
未処理のＨＦＢ２５抗体との反応結果の顕微鏡写真を図１１に、クロロホルム処理したＨＦＢ２５抗体との反応結果の顕微鏡写真を図１２に示す。
図１１と図１２との比較からわかるように、ＨＦＢ２５抗体をクロロホルム処理しても、ほとんど細胞染色性に影響なく、抗原結合部位に影響がなかった。一方。Ａ２Ｂ５抗体は、脱脂された抗体結合部位が破壊されたために、細胞染色部分がほとんど消失していた。
【０１２３】
（２）グリコシダーゼ及びグリコサミノグリカン分解酵素処理による影響
糖鎖抗原性の検討を行うため、各種糖鎖切断酵素による処理の影響を検討した。
継代培養されたヒトニューロスフェアを０．０５％トリプシン溶液処理液処理して単細胞に分散させてなる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に対して４％パラホルムアルデヒド処理４℃、２０分間の固定後、切片を作製し、免疫組織学的解析を実施した。切片はＮ−グリコシダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ケラタナーゼ、ヘパリチナーゼ、又はヘパリナーゼを、表３に示すような濃度となるように添加し、表３に示す時間だけ反応させた。これらの酵素は、表３に示す部分を切断する。酵素処理後、１０％ヤギ正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした。１次抗体として１００倍希釈したＨＦＢ２５抗体（マウス腹水）を含む１０％正常ヤギ血清／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを４℃にて一晩反応させた。翌日、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と、核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３（１μＭ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を室温１時間反応させた。染色結果は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
Ｎ−グリコシダーゼ処理、Ｏ−グリコシダーゼ処理、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理、ケラタナーゼ処理、ヘパリチナーゼ処理、ヘパリナーゼ処理の各染色結果の顕微鏡写真を、それぞれ、図１３〜図１８に示す。
いずれも未処理（図１１参照）の場合と同程度に染色されていて、これらの酵素処理では、ＨＦＢ２５抗体の抗原結合部位は、影響を受けないことがわかった。
【０１２６】
〔ヒト臍帯血からの神経幹細胞及び前駆細胞の分離採取〕
（１）ヒト臍帯血から有核球細胞集団の分離
遠心チューブにヒト臍帯血と等量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）を入れ、その上にヒト臍帯血を重層し、２０℃で８００ｇ、２０分間遠心し、有核球の層を採取した。分離細胞はヒトＮＳＰＣの保存と同様の方法で凍結保存（バンバンカー）し、以下の解析に使用した。
【０１２７】
（２）ＨＦＢ２５抗体反応性
（１）で調製したヒト臍帯由来細胞３ロットを、それぞれ１×１０７細胞／１００μｌに希釈した細胞懸濁液（ＵＣＢ１〜ＵＣＢ３）を調製した。
この細胞懸濁液に、ＨＦＢ２５抗体を産生したマウス腹水２μｌを添加混合して、氷上で３０分間反応させた。次いで、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８で標識したヤギ産生抗マウスＩｇＭ−ポリクローナル抗体（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と反応させ、さらにＰＩ染色を行い、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式をフローサイトメーターを用いて測定した。
【０１２８】
ＵＣＢ１〜ＵＣＢ３の結果を、図１９にそれぞれ示す。図１９中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞である。
図１９から、ロット間でばらつきがあるものの、いずれもＨＦＢ２５抗体陽性細胞が、２〜６．７％程度含まれていることがわかった。
さらにセルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ−ＳＥ、ベクトン−ディクソン社製）を用いて、ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞（標識された細胞）とＨＦＢ２５陰性細胞（標識されなかった細胞）とを分取した。
【０１２９】
（３）ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞でのＮｅｓｔｉｎ発現の検討
（２）で分取したヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５陽性細胞及び陰性細胞のそれぞれを、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ｃｙｔｏｓｐｉｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ社）を用いてスライドガラスに貼付けた。１０％ヤギの正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、一次抗体としてウサギ産生抗ヒトＮｅｓｔｉｎポリクローナル抗体（１：５００）を４℃で一晩反応させ、続いて二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５６８（赤色）で標識したヤギ産生抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ（終濃度４μｇ／ｍｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）と室温で１時間反応させ、免疫細胞染色標本を作製した。上記二次抗体は、ヤギ産生でマウスのＨ鎖及びＬ鎖を認識し、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットの抗体は認識しないものである。
【０１３０】
ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５抗体陽性細胞と陰性細胞のそれぞれの細胞集団におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現程度を、定量的に検討する目的のために、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体を用いた免疫細胞染色標本をレーザースキャニングサイトメータ（ＬＳＣ２、オリンパス社）を用いて測定した。結果を図２０に示す。図２０中、横軸は抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体蛍光標識強度、縦軸は細胞数である。ＨＦＢ２５抗体陰性細胞集団に対して、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞集団の方が強い蛍光強度分布を示し、ヒト臍帯血由来細胞中、ＨＦＢ２５抗体に陽性の細胞は、Ｎｅｓｔｉｎの発現量も多いことがわかった。
【０１３１】
さらに、図２０の結果に基づき、ヒト臍帯血由来ＨＦＢ２５抗体陽性細胞と陰性細胞について、レーザースキャニングサイトメータの結果を、Ｎｅｓｔｉｎ発現量に基づいて、蛍光標識強度が０〜５００００をＮｅｓｔｉｎ陰性（−）、５００００〜１０００００をＮｅｓｔｉｎ陽性（＋）、１０００００〜１５００００をＮｅｓｔｉｎ陽性（＋＋）と分類した。結果を表４に示す。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
表４からわかるように、ヒト臍帯血細胞では、ＨＦＢ２５陽性細胞の８８．３％がｎｅｓｔｉｎ発現細胞であり、その１８．２％はｎｅｓｔｉｎを強発現しており、その割合はＨＦＢ２５陰性細胞（８．７％）の約２．１倍であった。
【０１３４】
〔ヒト成人末梢血からの神経幹細胞及び前駆細胞の分離採取〕
（１）ヒト成人末梢血から有核球細胞集団の分離
遠心チューブにヒト成人末梢血と等量のＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ）を入れ、その上にヒト成人末梢血を重層し、２０℃で８００ｇ、２０分遠心し、有核球の層を採取した。分離細胞はヒトＮＳＰＣの保存と同様の方法で凍結保存（バンバンカー）し、以下の解析に使用した。
【０１３５】
（２）ＨＦＢ２５抗体反応性
臍帯血の場合と同様にして、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式をフローサイトメータを用いて、ＨＦＢ２５抗体陽性細胞の割合を測定した。
結果を図２１に示す。図２１中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は細胞数カウントである。強度１０以上がＨＦＢ２５抗体陽性細胞である。
図２１から、ヒト成人末梢血にはＨＦＢ２５抗体陽性が、２５％程度含まれていることがわかった。
さらにセルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ−ＳＥ、ベクトン−ディクソン社製）を用いて、ヒト成人末梢血由来ＨＦＢ２５陽性細胞（標識された細胞）とＨＦＢ２５陰性細胞（標識されなかった細胞）とを分取した。
【０１３６】
（３）ＨＦＢ２５陽性細胞でのＮｅｓｔｉｎ発現の検討
臍帯血の場合と同様にして、Ｎｅｓｔｉｎ発現量を調べた結果、図２２及び表５のようになった。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
表５からわかるように、ヒト成人末梢血中のＨＦＢ２５陽性細胞の７４．５％がＮｅｓｔｉｎ発現細胞であり、その１４．６％はＮｅｓｔｉｎを強発現しており、その割合はＨＦＢ２５陰性細胞（７．７％）の約１．９倍であった。
【０１３９】
〔細胞の分化レベルとＪＡＭ−１の発現との関係〕
（１）抗体チップを用いた神経幹細胞の発現タンパク質のスクリーニング
抗体チップ解析は、５１２種類の既知抗体が固定されたＢＤ ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ５００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて実施した。スライドガラスのスキャンはグラススライドスキャナー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ製）を用いて実施した。
ヒトＮＳＰＣ、および上記Ａの分化誘導方法で得られたグリア細胞集団からそれぞれタンパク質を、ＢＤ ＣｌｏｎｔｅｃｈＴＭ Ａｂ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ５００添付の試薬により抽出し、各サンプルをＣｙ３あるいはＣｙ５蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で標識した後、抗体チップ解析を行ない、各細胞集団におけるＪＡＭ−1発現量を調べた。
グリア細胞集団におけるＪＡＭ−１発現量に対するヒトＮＳＰＣ細胞集団のＪＡＭ−１発現量（ヒトＮＳＰＣ／グリア細胞）は、０．６７３７７２であった。
【０１４０】
（２）ウエスタンブロットによる検討
ＪＡＭ−１の発現様式をさらに検討するため、合計１３種類のヒト株化細胞でのＪＡＭ−１の発現様式を同様にウエスタンブロットで検討した。
神経系細胞として、Ｕ−２５１ＭＧ，Ｕ−８７ＭＧ，Ｕ−３７３ＭＧ，Ｔ９８Ｇ，ＹＫＧ−１（ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）、Ｄ２８３ Ｍｅｄ，Ｄａｏｙ（ｈｕｍａｎ ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ由来）；分化能を有する神経系前駆細胞としてＮＴＥＲＡ２（ｔｅｒａｔｏｍａ由来のｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；非神経系細胞としてＪｕｒｋａｔ（ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ由来），２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ），ＨｅｐＧ２，ＨＵＨ−６，ＨＵＨ−７（ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の合計１３種類のヒト株化細胞をそれぞれ標準的な方法で培養し、細胞を調製した。コントロールとして、前述Ｂの分化誘導方法で得られたＮ／Ｇ細胞集団（Ｎ／Ｇ）、及び前述Ａの分化誘導方法で分化させたグリア細胞集団（ＡＳ）を用いた。
【０１４１】
各細胞からタンパク質を抽出し、１０μｇ／ｌａｎｅでＳＤＳポリアクリルアミドゲル（５−２０％勾配ゲル，ＡＴＴＯ）用いて電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェット方式でニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）に転写した。５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキング後、抗ＪＡＭ−１抗体（１％ＢＳＡで１：５００希釈，ベクトンディッキンソン）を１次抗体として室温１時間で反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔ」という）で１５分、３回洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体（１％ＢＳＡで１：１００００希釈）を２次抗体として室温で１時間反応させた。洗浄後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ （アメルシャム・バイオサイエンス社）の方法に従い、化学発光させた。この膜をＸ線フィルムと一緒にカセットに入れて、露光し現像した。
【０１４２】
結果を図２３に示す。ＪＡＭ−１は、３８ｋＤａのバンド（図中、矢印）の位置に現れる。
ＪＡＭ−１の発現は、神経系細胞に関しては、Ｕ−３７３ＭＧでは殆ど見られず、Ｄ２８３Ｍｅｄ，Ｔ９８Ｇでは発現がグリア細胞（ＡＳ）でより低かった。残りの神経系細胞におけるＪＡＭ−１の発現は、グリア細胞（ＡＳ）より高かった。非神経系細胞に関するＪＡＭ−１の発現は、Ｊｕｒｋａｔについてはグリア細胞（ＡＳ）よりやや低かったが、残りの非神経系細胞（２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＨＵＨ−６、ＨＵＨ−７）ではグリア細胞（ＡＳ）より高かった。
【０１４３】
（３）ヒトＮＳＰＣの分化誘導レベルと抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞との関係
ヒトＮＳＰＣの分化誘導におけるＪＡＭ−１陽性細胞の存在率を評価するため、ヒトＮＳＰＣとそこから分化誘導したグリア細胞を用いて、ベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式で測定して、ＪＡＭ−１陽性細胞の存在率を評価した。
同一ロットのヒトＮＳＰＣ細胞集団を３つのグループに分け、そのうちの２グループを、それぞれＡの方法で分化誘導させた。分化誘導４週間後、７週間後の細胞集団について、０．０５％トリプシン溶液処理により細胞懸濁液を調製した。
【０１４４】
この細胞懸濁液に対して、１０倍希釈した抗ＪＡＭ−１抗体（Ｈｙｃｕｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を氷上で３０分間反応させた後、培養液を用いて洗浄した。その後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウス−ＩｇＧ抗体（１：５００、ヤギ産生ポリクローナル抗体，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を３０分間、氷上で反応させた後、培養液で洗浄し、更にＰＩ（プロピジウムイオダイド）染色を行った。解析はベクトンディッキンソン社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）のＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名：カタログ番号３４３２０２）の４カラー式を用いて行い、モノクローナル抗体で各々の標識される細胞（陽性細胞）と非標識細胞（陰性細胞）の割合を算出した。
分化誘導させなかったヒトＮＳＰＣ、並びに分化誘導４週間後、及び７週間後の結果を、それぞれ図２４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図２４中、横軸は蛍光強度であり、縦軸は、細胞数カウントである。横軸１０以上が抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞に該当する。各細胞集団における抗ＪＡＭ−１抗体陽性細胞の割合をまとめると、表６のようになる。
【０１４５】
【表６】
【０１４６】
ヒトＮＳＰＣの状態では、ＪＡＭ−１陽性細胞はわずか６．０％であったが、グリア細胞（分化誘導後４週目）では約４０．８％の細胞がＪＡＭ−１陽性となっていた。しかし更なる分化誘導（７週間培養）にてその陽性率は再度低下（１０．５％）した。
これらの結果から、抗ＪＡＭ−１抗体は、神経幹細胞から完全分化の過程で一時的に現れる表面抗原に選択的に結合する。従って、神経前駆細胞及び神経幹細胞の混合集団では、抗ＪＡＭ−１抗体陰性であれば、神経幹細胞であると判定することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明の新規なモノクローナル抗体は、神経幹細胞に選択的な表面抗原に結合するので、神経幹細胞を含有するこ不均一な細胞集団から神経幹細胞又は神経幹細胞富化集団を生細胞のままでスクリーニングできる。従って、再生医療用に生体から採取した神経幹細胞が含まれる細胞集団、具体的には胎児脳組織、臍帯血、ヒト末梢血などの神経幹細胞含有集団から、神経幹細胞富化集団、ひいては神経幹細胞の検出、さらには分離する方法として利用できる。これにより、細胞ソース供給の点で問題があった神経幹細胞について、比較的広範囲のソースを、神経幹細胞の供給源として利用することが可能となる。
【０１４８】
本発明のスクリーニング用試薬は、人体移植用の神経幹細胞をスクリーニングする試薬として用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養ヒト神経幹細胞及び／又は培養ヒト神経前駆細胞のホモジェネートで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、
且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ホモジェネートは、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られるニューロスフェアをホモジェナイズしたものである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体が認識する抗原は、非還元状態のタンパク性抗原で、且つグリコシダーゼ又はグリコサミノグリカンによる糖鎖切断及び脱脂処理によって抗原性が損なわれないものである請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＹＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とはいずれも５％未満しか陽性反応を示さない請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織、培養ヒト神経幹細胞、及びヒトニューロスフェアを単細胞にした細胞集団からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いてスクリーニングしたものである請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマ。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
【請求項８】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応しないモノクローナル抗体の製造方法であって、
ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られらニューロスフェアのホモジェネートを免疫原として使用する工程；
免疫感作した哺乳動物（ヒトを除く）のリンパ球をミエローマと細胞融合して、ハイブリドーマを得る工程；
得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより選択したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する工程；及び
産生されたモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織に接触させて陽性反応を示すモノクローナル抗体を選別する工程
を含む製造方法。
【請求項９】
不均一な細胞集団から、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の特性を有する細胞及びその細胞の局在性を同定する方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行ない、染色された部分を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であると同定する工程を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の同定方法。
【請求項１０】
ヒト神経幹細胞を含有する細胞集団を、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体と反応させ、該モノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出する工程を含む、ネスチン高発現細胞のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ネスチン高発現細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記細胞集団は、ヒト臍帯血由来細胞を含む集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記細胞集団は、ヒト末梢血由来細胞を含む集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記細胞集団は、ヒトニューロスフェアを単細胞に分散させてなる細胞集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を含有する細胞集団において、請求項１０又は１１に記載のモノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出し、
該細胞集団における該モノクローナル抗体陽性細胞の割合を算出する工程を含む、細胞集団の評価方法。
【請求項１６】
ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の富化集団をスクリーニングするための試薬であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体と、溶媒とを含有することを特徴とする神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬。
【請求項１】
培養ヒト神経幹細胞及び／又は培養ヒト神経前駆細胞のホモジェネートで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマとのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であって、
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応せず、
且つ胎児期初期の大脳の脳室壁層及び脳室壁下層の細胞と反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ホモジェネートは、ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られるニューロスフェアをホモジェナイズしたものである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体が認識する抗原は、非還元状態のタンパク性抗原で、且つグリコシダーゼ又はグリコサミノグリカンによる糖鎖切断及び脱脂処理によって抗原性が損なわれないものである請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
フローサイトメトリーによる解析で、ヒトニューロスフェアを分散させてなる単細胞集団及びＮＥＴＲＡ２とは８０％以上が陽性反応を示し、Ｕ−８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＹＫＧ−１、Ｕ２５１ＭＧ、及び２９３Ｔ細胞とはいずれも５％未満しか陽性反応を示さない請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織、培養ヒト神経幹細胞、及びヒトニューロスフェアを単細胞にした細胞集団からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いてスクリーニングしたものである請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマ。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０７のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
【請求項８】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の表面抗原と反応するが、分化した神経系細胞の表面抗原とは実質的に反応しないモノクローナル抗体の製造方法であって、
ヒト胎児由来の神経幹細胞及び／又はヒト神経前駆細胞を継代培養して得られらニューロスフェアのホモジェネートを免疫原として使用する工程；
免疫感作した哺乳動物（ヒトを除く）のリンパ球をミエローマと細胞融合して、ハイブリドーマを得る工程；
得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより選択したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生する工程；及び
産生されたモノクローナル抗体を、ヒト胎児脳組織に接触させて陽性反応を示すモノクローナル抗体を選別する工程
を含む製造方法。
【請求項９】
不均一な細胞集団から、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の特性を有する細胞及びその細胞の局在性を同定する方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行ない、染色された部分を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であると同定する工程を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の同定方法。
【請求項１０】
ヒト神経幹細胞を含有する細胞集団を、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体と反応させ、該モノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出する工程を含む、ネスチン高発現細胞のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ネスチン高発現細胞は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記細胞集団は、ヒト臍帯血由来細胞を含む集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記細胞集団は、ヒト末梢血由来細胞を含む集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記細胞集団は、ヒトニューロスフェアを単細胞に分散させてなる細胞集団である請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞を含有する細胞集団において、請求項１０又は１１に記載のモノクローナル抗体との反応が陽性である細胞を検出し、
該細胞集団における該モノクローナル抗体陽性細胞の割合を算出する工程を含む、細胞集団の評価方法。
【請求項１６】
ヒト神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の富化集団をスクリーニングするための試薬であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体と、溶媒とを含有することを特徴とする神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬。
【図５】
【図６】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２３】
【図６】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２３】
【公開番号】特開２０１０−５７５１１（Ｐ２０１０−５７５１１Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８３５５９（Ｐ２００９−２８３５５９）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【分割の表示】特願２００５−２４５５６２（Ｐ２００５−２４５５６２）の分割
【原出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【分割の表示】特願２００５−２４５５６２（Ｐ２００５−２４５５６２）の分割
【原出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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