ヒト胚盤胞由来の幹細胞および前駆体細胞に基づく新規な毒性アッセイ
本発明は、ヒトにおける毒性の検出のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、これはある物質についてのインビトロヒト毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイに比較してより効果的にヒト毒性を検出する。本発明はさらに、種間の差異を示すことが知られており、およびマウスにおける毒物学的実験により毒性効果が検出可能でなかった物質についての毒性の検出を、可能にし得る。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞は、３つ全ての胚葉の派生物に分化する独特の能力を有する。この特徴は、それらが機能的な細胞についての「細胞工場」として作用し得るので、それらを毒物学の分野における優れた道具にする（Ｍｏｏｎ ＳＹら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３（１）：５‐１４、２００６）。さらに、ｈＢＳ細胞分化のプロセスの間に相互作用する化合物の効果が検出され得、これはそれらを、発生毒物学の分野において特に価値あるものにする。
【０００２】
新規な欧州化学物質政策（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｏｌｉｃｙ）（ＲＥＡＣＨ）は、２００７年に効力を生じるので、年間１トンを超える容量で製造または輸入される３０，０００個を超える化学物質について、毒物学的な情報が必要とされる（Ａｎｏｎ、２００７）。従って、約３９０万のさらなる試験動物が潜在的に使用され、そして産業に対する費用は約１５億Ｅｕｒｏであると見積もられ、その３２％は、発生毒性研究に単独に起因する（ＲＰＡ、２００２）。それゆえ、インビトロ発生毒性試験が、緊急に必要とされる。さらに、新規な薬物候補についての信頼できる毒物学的データが開発段階においてできるだけ早期に作製されなくてはならないので、医薬産業は、インビトロ毒性試験におけるハイスループットの必要性に直面する。インビトロ毒性スクリーニングにおける初期の取り込みに起因する高い損耗率の減少は、関連されるコストを大いに減少する。さらに、多くの物質が、例えば、重篤な座瘡の処置において使用される１３‐シスレチノイン酸（イソトレチノイン（Ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）（Ａｃｃｕｔａｎｅ、Ｒｏｃｈｅ）ならびに鎮静剤および抗炎症剤薬物のサリドマイド（Ｃｏｎｔｅｒｇａｎ）が、有意な種間差異を示すことが知られており、ヒトにおいて重篤な奇形を生じるが、マウスまたはラットにおいては明らかにそうではない（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２００３）。従って、ヒト関連の発生毒性試験が必要とされる。
【０００３】
今日最も見込みのあるインビトロ胚毒性試験の１つは、有効な胚性幹細胞試験（ＥＳＴ）であり、これは化学物質の胚毒性の可能性を評価するためにマウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞を用いる。ＥＳＴは、胚毒性物質に対するｍＥＳ細胞およびマウス線維芽細胞の異なる感受性を考慮にいれる。さらに、ｍＥＳ細胞の、機能的な心筋細胞への分化は、毒物学的な評価項目として作用する（Ｇｅｎｓｃｈｏｗ，２００４）。しかし、ＥＳＴは未だ、動物系においてヒト毒性を予測することを目的とする。
【０００４】
発生毒性試験におけるヒト胚性幹細胞の使用は、薬物および化学物質の安全性評価についての既存の毒性試験に対して価値を付加する信頼できる、ヒト関連のデータを提供し得る。しかし、毒性試験におけるｈＢＳ細胞の適用は、これらの細胞が複雑な操作技術を必要とするので困難である。例えば、ｈＢＳ細胞は、それらの増殖を確実にするために、そして高い分散を生じる表面への可変的な付着特性を示すために、単一の細胞のかわりに細胞凝集物中に播種されることを必要とする。さらに、ｈＢＳ細胞の集団２倍化時間は、３６時間であり、ｍＥＳ細胞の２倍化時間の１２時間よりも有意に長い。マウスＢＳ細胞とヒトＢＳ細胞との間の別の重要な差異は、それらの培養要件である。未分化の状態にｍＥＳ細胞を維持するためには、培養培地への白血病抑制因子（ＬＩＦ）の添加で十分であるが、ｈＢＳＣ系統は、マウスまたはヒトの支持細胞層上で培養され、これは、未分化の状態に細胞を安定に維持するための最も信頼できる方法であるようである。多くの研究が支持体非含有培養系を見出すために行われているが、これらは開発の初期段階にある（Ｓｔａｃｅｙら、２００６）。
【０００５】
本発明は、発生毒性および細胞毒性のような、ヒト毒性の予測のためのｈＢＳ細胞に基づく毒性アッセイを表す。本発明は、ｍＥＳ細胞よりも優れた有利さを示し、例えば１３‐シスレチノイン酸のような、そのいくつかが種間差異を示すことが知られるヒト催奇形物質を同定することを補助するヒト関連のデータを与えることを、可能にする。
【発明の概要】
【０００６】
定義および略語
「アッセイ（単数形）」または「アッセイ（複数形）」は、例えば、遺伝子レベル、タンパク質レベル、または機能性レベルにおいて、細胞毒性および／または発生毒性を測定するために行われるインビトロ試験を記載することが意図される。
【０００７】
本明細書中で使用される、用語「胚盤胞由来の幹細胞」は、ＢＳ細胞を示し、そしてヒト形態は「ｈＢＳ細胞」または「ｈＢＳＣ」と呼ばれる。
【０００８】
本明細書中で使用される用語「前駆体」または「前駆体細胞型」は、未分化のｈＢＳ細胞と十分に分化された細胞との間の分化の任意の段階での、ｈＢＳ細胞に由来する任意の細胞である。
【０００９】
用語「支持細胞」または「支持体」は、別のタイプの細胞と同時培養されるある細胞タイプの細胞を意味することが意図され、第２のタイプの細胞が増殖し得る環境を提供する。支持細胞は、必要に応じて、それらが支持する細胞とは異なる種に由来し得る。支持細胞は典型的に、それらが支持する細胞よりも増殖することからそれらを防ぐために、照射またはマイトマイシンｃのような抗分裂剤での処理により、他の細胞と同時培養される場合、不活化され得る。前述を制限しないが、１つの特定のこのような支持細胞層は、本明細書中でｈＦＦとして示される、ヒト皮膚線維芽細胞のような、ヒト支持体であり得る。本発明の情況において、ｈＦＦはまた、成熟細胞型を例示する。別の支持細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）であり得る。
【００１０】
用語「物質」の解釈は、治療剤（または潜在的な治療剤）、または神経毒、肝臓毒、造血細胞の毒、筋毒、発癌物質、催奇形物質、または１つ以上の生殖器官に対する毒性のような、実証された毒性効果を伴う薬剤に制限されることを意図しない。用語、物質はさらに、農薬、例えば、殺虫剤、抗菌剤、肥料のような化学組成物であり得るか、または同様に化粧品において使用される成分であり得る。
【００１１】
用語「ＩＣ５０」値は、本発明の情況において、インビトロで試験した細胞の約５０％の死を導く試験物質の濃度を表す。
【００１２】
「効率」または「効果」は、そうでないと規定されない限り、本発明におけるアッセイの情況において、当該アッセイがヒトにおいて毒性である物質をより検出するようであること、および／または毒性濃度、例えば、対応する分析されたＩＣ５０値が、マウス胚性幹細胞もしくはマウス癌腫細胞に基づくアッセイのような先行技術において記載される方法もしくはアッセイに比較して、利用可能な場合はいつでも、公知のヒトインビボデータに、より近似することを意味することが意図される。
【００１３】
本発明の簡単な説明
本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質の毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。
【００１４】
本発明はまた、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。
【００１５】
本発明の１つのさらなる局面は、インビトロ毒性アッセイであり、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞、ヒト前駆体細胞、およびヒト成熟様細胞からなる群より選択される、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、例えば少なくとも４つの、少なくとも５つのヒト細胞型を含み、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。具体的には、本発明のアッセイは、特異的な毒性：例えば、成熟細胞に対するよりも胚細胞に対する高い程度の毒性、を予測し得る。
【００１６】
本発明のなお１つのさらなる局面は、ヒトにおける毒性の検出のためのヒト胚盤胞幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであり、非ヒトアッセイに比較して１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）の胚毒性のような、これはヒト毒性をより効果的に予測する。
【００１７】
本発明のなお１つのさらなる局面は、ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）のような、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体に基づくインビトロ毒性アッセイであり、これはｈＦＦのような成熟ヒト細胞に比較して、全てのトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）のヒト毒性をより効果的に予測する。
【００１８】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００１９】
本発明はまた、ヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測するさらなる方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００２０】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測するための方法／アッセイに関し、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２１】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２２】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）それぞれ（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２３】
発明の詳細な説明
ヒト胚盤胞幹細胞は、発生毒性試験のための独特な道具を提供し、それゆえ、本発明者らは、本発明に従って、発生毒性アッセイおよび細胞毒性アッセイのような、ｈＢＳ細胞ベースの発生毒性試験を開発した。概念実証として、評価項目の生存度を備える毒性アッセイを、３つの異なる程度の発生的成熟を表す、多能性ｈＢＳ細胞、ｈＢＳ細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ ＭＰ）、およびヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）を用いて開発した。周知のインビボデータを伴う発生毒性物質のセット、すなわち、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）および１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）を、２つの異なる生存度アッセイ、すなわち、ＡＴＰ含量およびレサズリン（ＲＥＳ）還元を用いて試験した。さらに、５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）を、ポジティブコントロールとして、およびサッカリン（Ｓａｃｃｈａｒｉｎ）をネガティブコントロールとして使用した。
【００２４】
レチノイド様ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡは主に、癌、および座瘡または乾癬のような皮膚疾患の処置において使用される。レチノイド誘導性の奇形の特徴的なパターンは、中枢神経系を含む頭蓋顔面構造、手足、胸線、および軸骨格の欠失を含む（Ｒｏｓｓら、２０００）。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡはともに、ヒトにおいて重篤な催奇形物質であるが、マウス系においてそれらの催奇形性は異なる（Ｎａｕら、２００１）。１３ＣＲＡは、ＡＴＲＡよりも、インビボでマウスにおいて非常に低い催奇形性を示し、およびインビトロでマウス奇形腫（Ｐ１９）細胞において低い分化誘導能を示す（Ａｄｌｅｒら、２００５；ＳｏｐｒａｎｏおよびＳｏｐｒａｎｏ １９９５）。それゆえ、これらの構造的に関連される物質が、本発明者らの試験系を試みるために選択された。抗癌薬物の５‐ＦＵは、インビボおよびインビトロの両方での発生毒物であり（Ｊａｃｏｂら、１９８６）、そして個別の報告が、ヒトにおける５‐ＦＵ関連性の出生異常に対して存在する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、１９８０）。
【００２５】
本発明の１つの実施態様は、異なる分化レベルからの細胞を表す、ｈＢＳ細胞、ｈＢＳ細胞由来の前駆体細胞、および／またはヒト包皮線維芽細胞、またはそれらの組み合わせに基づく細胞毒性試験に関する。評価項目として細胞毒性に基づくこの試験は、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）および１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）を含むいくつかのヒト発生毒物の検出に効果的である。これらの物質は、未分化の胚盤胞由来の幹細胞および前駆体細胞においてより低いＩＣ５０値を、成熟ヒト細胞におけるより高い値に比較して、示した。
【００２６】
本発明はまた、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関する。アッセイは、ある物質についての、毒性、詳細には胚細胞または発生中の細胞に対する毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較して、ヒトにおいてより効果的に毒性を検出および／または予測する。
【００２７】
本発明はさらに、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的にヒトにおける毒性を検出および／または予測する。本発明に従う前駆体細胞は、ｈＢＳ細胞と十分に分化した細胞との間の任意の前駆体細胞であり得る。本発明における適切な前駆体細胞は、中胚葉、内胚葉、または外胚葉の細胞型であり得る。前駆体細胞はさらに、間葉前駆体細胞、線維芽様前駆体細胞、心臓前駆体細胞、肝臓前駆体細胞、膵臓前駆体細胞、または神経前駆体であり得る。
【００２８】
本発明の特定の実施態様において、前駆体細胞はヒト胚盤胞幹細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）である。
【００２９】
ＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞およびｈＢＳ由来の前駆体細胞が、５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡのような毒性物質に対して、ｈＦＦ細胞のような成熟細胞型よりも、感受性であることを示す（図３および４を参照のこと）。前駆体細胞は、毒性物質に対してなおより高い感受性を維持しながら、酵素的な継代による大きな規模の培養を可能にする、容易に培養されるｈＢＳ由来の細胞型を表す。
【００３０】
本発明はさらに、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのヒト細胞型を含む。これらのヒト細胞型は、ｈＢＳ細胞、前駆体細胞、および成熟様細胞を含む群から選択され得る。成熟様細胞は、皮膚および筋肉のような異なるヒト組織に由来し得る。成熟様細胞はまた、新生児または成人のような異なる発生の段階に由来し得る。本発明の特定の実施態様において、使用される成熟様細胞は、新生児男子からのヒト包皮線維芽細胞である。
【００３１】
本発明はさらに、インビトロ毒性アッセイに関し、ここで非ヒトのアッセイは、マウス、ラット、またはブタのような任意の非ヒト哺乳動物起源であり得る。次いで、マウスアッセイが、マウス胚性幹細胞に基づくアッセイまたはマウス奇形腫細胞由来のアッセイにより例示され得る。
【００３２】
非ヒトアッセイは、本出願に対する参照系として言及され、これはまた、インビボアッセイであり得る。このようなインビボアッセイは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、またはイヌの動物モデルであり得る。
【００３３】
より詳細には、本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイに比較してより効果的に、例えば、少なくとも５０％より多く、少なくとも７５％より多く、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍より効果的に、毒性を検出する。
【００３４】
本発明の特定の実施態様において、インビトロ毒性アッセイは、マウス奇形腫細胞に基づく非ヒトアッセイに比較して、毒性を少なくとも１２３倍、より効果的に検出する。
【００３５】
同等に、本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、ならびに／またはより効果的に、例えば、ｈＢＳ細胞と前駆体細胞とを比較する場合、少なくとも１．５倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性、胚細胞に対する特異的な毒性を検出し、そしてｈＢＳ細胞と成熟様線維芽細胞とを比較する場合、少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性を検出し、そして前駆体細胞と成熟様細胞とを比較する場合、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性を検出する。
【００３６】
さらに、本発明のアッセイは、生存度の測定のような、細胞毒性の評価項目に基づき得る。このような評価項目についての適切な検出技術は、ＡＴＰ含量分析、ＭＴＴ塩分析、およびレサズリン変換を含む代謝活性を測定する群から選択され得る。
【００３７】
本発明のさらなる適切な評価項目は、胚毒性の評価項目の群から選択され得る。ＲＮＡ、酵素、および抗体レベルのゲノミクスおよびプロテオミクス測定のような、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいずれかにおける生体分子の発現レベルが分析され得る。マイクロＲＮＡレベルがさらに、分析され得る。細胞毒性および胚毒性の両方を測定するための適切な手段は、比色法（可視色における定量可能な変化）または蛍光光度法（蛍光における定量可能な変化）であり得る。測定は、マルチ‐ウェルプレートリーダーにおいて行われ得、ここではいくつかのウェルの内容物が、同時に分析される。試験は、培地についてハイスループット適用に拡張することを許容するように設計される。毒性効果の検出および定量化測定のための１つの他の適切な設定は、ハイコンテントリーダー（Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｒｅａｄｅｒ）において行われ得る。
【００３８】
本発明の１つの実施態様において、強力なスクリーニング技術、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）が使用される。ＨＣＳは、物質の迅速なスクリーニングを許容する様式において、多くの細胞事象に対する化合物の影響を同定および定量する能力を拡張する。ＨＣＳは、単一のスクリーニング基盤内で同時に複数の測定を許容する。これは、マルチ‐ウェルサンプル調製の処理とともに、顕微鏡研究様データ捕獲と関連されるタスク、および特定の細胞事象を定量する能力を備える分析を合わせて自動化することを可能にする。
【００３９】
発生毒性試験において、本発明によれば、ＨＳＣは、関連の生物学的系における１つのおよび同じ試験プレートにおける細胞毒性と並行して、３つ全ての胚葉への分化に対する影響を検出することを可能にする。生存細胞に対する物質の時間依存性の効果が、トキシコキネティクスおよび影響される経路を研究するための価値ある道具を提供するＨＣＳを用いて、同様に試験される。
【００４０】
本発明の１つの実施態様において、毒物学試験においてｈＢＳＣを用いる場合、細胞は、増殖段階に維持されるために、小さな凝集物中に播種される必要性があり得る。このことは一般に、一方のウェルから他方のウェルへの細胞数の高い分散が生じ得るので、毒性試験において支障を引き起こす。ＨＣＳの技術を用いて、測定されるシグナルを、試験ウェル当たりの細胞の数に正規化することが可能である。
【００４１】
本発明の特定の実施態様において、細胞毒性はレサズリン変換により測定される。
【００４２】
本発明の別の実施態様において、細胞毒性は、ＡＴＰ含量分析により測定される。
【００４３】
本発明のなお別の特定の実施態様は、ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、これは非ヒトアッセイに比較して１３ＣＲＡのヒト毒性をより効果的に検出する。
【００４４】
本発明のなお別の実施態様において、未分化のｈＢＳ細胞株、ｈＢＳ由来の前駆体細胞型、または体細胞様ｈＢＳ細胞由来の型のような、遺伝子操作された細胞株が使用され得る。このように操作された細胞株は、発生的に関連するプロモーターの制御下で蛍光または他のマーカーを発現するレポーター細胞株であり得る。
【００４５】
さらに、本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００４６】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は、以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェル、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４７】
さらに、本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４８】
さらに本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程、（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、
（ｉｉ）それぞれ、（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４９】
この時間の間、播種されたｈＢＳ由来の細胞の、例えば、全ての胚葉から、心臓前駆体、肝細胞様前駆体、および神経前駆体のような前駆体タイプへの分化が観察され得る。
【００５０】
本発明の１つの他の実施態様はまた、ヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００５１】
アッセイは、マルチウェルフォーマット１５３６、３８４、９６、４８、２４、１２、または６ウェルにおいて行われ得る。９６ウェルプレートの場合において、工程（ｉ）において播種される細胞の数は、ウェル当たり、１個の細胞〜１Ｍ個の細胞、好ましくは１，０００個〜１００，０００個、およびより好ましくは１０，０００個〜３０，０００個である。任意の工程（ｉ）において、プレートのウェルはさらに、タンパク質、ペプチド、または細胞外マトリクス成分で、予め／または後にコートされ得る。
【００５２】
工程（ｉｉ）における細胞の曝露は、１分間から６０日間、好ましくは５分間から３０日間、１日から２０日間、およびより好ましくは５〜１５日間の期間、行われ得る。
【００５３】
工程（ｉｉｉ）の毒性分析は、本明細書で記載される任意の適切な評価項目により行われ得る。
【００５４】
得られたインビトロデータはさらに、工程（ｉｖ）において、数学的予測モデルまたはそれゆえアルゴリズムにより、インビボデータに比較され得る。
【００５５】
本発明の１つの特定の実施態様は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）未コートのまたはコート化マルチウェルフォーマット組織培養プレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１０日間、ある物質のいくつかの濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）ＡＴＰ含量またはレサズリン変換を測定することにより分析する工程、を包含する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、薬物発見における、および／または安全性評価研究のための、本明細書におけるようなアッセイの使用に関する。
【００５７】
なおさらなる局面において、本発明は、胚毒性、催奇形性研究のための、および／または欧州ＲＥＡＣＨ法により特定される物質の評価のための、本明細書中に記載されるようなアッセイの使用に関する。
【００５８】
本発明はまた、本明細書中に記載されるようなヒトにおける毒性を検出するための、または本明細書中にまた記載されるような方法の使用のための、キットに関し、当該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル、を含む。
【００５９】
本発明のキットはさらに、前駆体細胞および成熟様線維芽細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのさらなるヒト細胞型を含み得る。
【００６０】
本発明はまた、上記されるようなヒトにおける毒性を検出するための、またはまた上記されるような方法における使用のための、キットに関し、当該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル、を含む。
【００６１】
本発明の１つの実施態様は、ｈＢＳ、またはｈＢＳ細胞由来の細胞型を含むキットであり、これは必要に応じて遺伝子操作されるか、または必要に応じて胚葉特異的抗体と組み合わされ、一般的な細胞毒性についての評価項目と組み合わせて発生毒性関連の評価項目のパネルを定量的に検出するためのハイコンテントスクリーニングアルゴリズムのようなアルゴリズムを合わせて備える。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】１０日間での生存細胞の株に正比例する、細胞内ＡＴＰ含量に対する測定により決定されたｈＢＳ細胞（Ａ）、ｈＢＳ ＭＰ（Ｂ）、およびｈＦＦ細胞（Ｃ）についての増殖曲線。増殖試験は、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて４回の独立した試行において（ｎ＝４）、ならびにｈＢＳ細胞について２回の独立した試行において（ｎ＝２）、行われた。エラーバーは平均の標準誤差を記載する。
【図２】（ａ）１日目、（ｂ）４日目、（ｃ）７日目、および（ｄ）１０日目でモニターされた９６ウェルプレートにおけるｈＢＳ細胞の増殖および分化の位相差顕微鏡写真。０日目での播種密度６０．０００細胞／ウェル。
【図３】３つの細胞型、ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、およびｈＢＳ細胞を用いたネガティブコントロール物質のサッカリン（Ｓａｃｃｈａｒｉｎ）（Ａ、Ｂ）およびポジティブコントロール物質の５‐ＦＵ（Ｃ、Ｄ）についての濃度応答曲線。データは、ウェル当たりのＲＥＳ還元（Ａ、Ｃ）、および細胞内ＡＴＰ含量（Ｂ、Ｄ）を測定することにより得られ、そして未処理／溶媒コントロールに対して正規化された。全ての実験は、３回の独立した試行において行われた（ｎ＝３）。エラーバーは、平均の標準誤差を記載する。エラーバーは平均の標準誤差を記載する。すべての実験は、３回の独立した試行において行われた。
【図４】３つの細胞型、ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、ｈＢＳ細胞を用いる、物質ＡＴＲＡ（Ａ、Ｂ）および１３‐ＣＲＡ（Ｃ、Ｄ）についての濃度応答曲線。データは、ウェル当たりのＲＥＳ還元（Ａ、Ｃ）および細胞内ＡＴＰ含量（Ｂ、Ｄ）を測定することにより得られ、そして未処理／溶媒コントロールに対して正規化された。全ての実験は、少なくとも３回の独立した試行において行われた（ｎ×３）。エラーバーは、平均の標準誤差を記載する。ＡＴＲＡおよび１３‐ＣＲＡについて、ｈＢＳ細胞および前駆体細胞は、毒性物質に対して、ｈＦＦよりも高い感受性を示す。ｈＢＳと前駆体細胞との間のＩＣ５０比は、１０ ０００：１（ＡＴＲＡ）および４０００：１（１３‐ＣＲＡ）である。ｈＢＳ細胞とｈＦＦとの間で、ＩＣ５０値は、１：４（ＡＴＲＡ）よりも多く、および１：６（１３‐ＣＲＡ）よりも多かった。
【図５】ａ）は、ＡＴＰアッセイを使用した、１０日間の曝露後の未分化のｈＢＳ細胞におけるＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについての濃度応答曲線を示す。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについてのＩＣ５０値は、それぞれ、３０．３８μＭおよび１５．８５μＭである。ｂ）は、ＡＴＰアッセイを使用した、１０日間の曝露後のｈＦＦにおけるＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡ（１３‐シスレチノイン酸）についての用量応答性曲線を示す。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについてのＩＣ５０値は、それぞれ、２４４．３μＭおよび３０１．６μＭである。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６３】
ｈＢＳ細胞、前駆体細胞、およびｈＦＦ細胞の培養
ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２およびＳＡ００２．５を、以前に記載されるように確立し、そして特徴付けし（Ｈｅｉｎｓら、２００４、国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット）、そしてＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ａｓｐ）およびＵＫ幹細胞バンク（ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｒｅｃｏｒｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ？ｄ＝ＭＲＣ００３２５９）に登録した。細胞株を、４ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を補充したＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中のマイトマイシン‐Ｃ不活化マウス胎児線維芽細胞（ｍＥＦ）上に維持した。未分化のｈＢＳ細胞を、Ｓｗｅｍｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｏｏｌ（Ｓｗｅｍｅｄ Ｌａｂ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｂｉｌｌｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する機械的分離により、４〜５日毎に継代した。
【００６４】
線維芽細胞様前駆体細胞を、ｈＢＳ細胞コロニーの切片を２００×２００μｍの切片に切断し、そして切片を凝集のために、ペトリ皿に、ＫＯ‐ＤＭＥＭ、２０％ ＦＣＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＰＥＳＴ、および０．１ｍＭ β‐メルカプトエタノール（全てＧｉｂｃｏ Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎから）に基づく培地中に置くことにより、作製した。浮遊する凝集物を、４日間に亘って形成し、その後、ウェル当たり約１０凝集物の高密度にて、ゼラチンでコートされた組織培養皿中に播種した。増殖物が観察され、そして細胞をさらに５〜１４日にて分離し、そして最初の継代にて１：１の分割にて継代した。培養物がコンフルエンスに達した場合、分割比を、通常、１：２に設定した。凝集物を播種した後、継代培養のために使用した培地は、ｎａｔｒｉｕｍｐｙｒｕｖａｔ＋ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ ＦＣＳ、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＢＦ、１％ ＰＥＳＴ非含有のＤＭＥＭ高グルコースからなった。
【００６５】
ヒト胚盤胞幹細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）を、ｈＢＳ細胞株 ＳＡ００２．５からの派生物を介して、以下の工程を包含する方法により得た：
ｉ）未分化のｈＢＳ細胞を表面上に播種する工程；
ｉｉ）２〜２１日間、例えば、３〜１０日間、好ましくは７日間、インキュベーションして、分化を許容する工程；
ｉｉｉ）新規な表面に酵素的に継代する工程；
ｉｖ）均一な間葉形態が得られるまで、工程（ｉｉｉ）を反復する工程；
ｖ）得られたｈＢＳ‐ＭＰ細胞を培養する工程。
【００６６】
ｈＢＳ‐ＭＰを、毒性試験の前に、１０％ ＦＣＳ（ともにＧｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから）および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中に培養し、そして分割比１：１０において４日毎に継代培養した。継代について、トリプシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する組織培養Ｔ‐２５フラスコにおける培養。
【００６７】
詳細には、拡張可能なｈＢＳ ＭＰは、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２．５に由来した。それゆえ、ｈＢＳを、Ｔｒｙｐｌｅ ＳｅｌｅｃｔＴＭで酵素的に分離し、そして１ｃｍ２当たり１．５×１０５細胞にて、０．１％ゼラチンコート化細胞培養皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ／ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上に播種した。分化の７日後、ｈＢＳ細胞を単一細胞として、新しいゼラチンコート化培養皿に酵素的に継代した。この手順を、細胞集団が形態において均一になるまで、７日毎に反復した。この細胞集団の十分な特徴付けを、別の研究の一部として行い、ｈＢＳ ＭＰは、形態およびマーカー発現に関して胎児間葉の細胞に類似することを示す（原稿が提出される）。ｈＢＳ ＭＰを、未コートの組織培養フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、１０％ ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン、および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、そして１：１０の分割比にて、４日毎に継代した。
【００６８】
ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＲＬ‐２４２９ ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、そして１０％ ＦＢＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中で培養し、１：５の分割比において４日毎に継代した。継代について、トリプシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する組織培養Ｔ‐２５フラスコにおける培養。
【実施例２】
【００６９】
増殖
１０日間の毒性試験においてウェル当たりに播種される最適な細胞数を決定するために、一連の増殖試験を行った。播種のための最適な細胞数は、細胞の播種される数が、試験の測定日にシグナルに比例する範囲になければならない。ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、およびｈＢＳ細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）コート化９６‐ウェルプレートにおいて、１０％ ＦＢＳおよび５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ中、二倍希釈系列において、三連で播種し、最も高い細胞密度は、単一の細胞懸濁物として播種したｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて、１６．０００細胞／ウェル、および５０〜１００細胞の凝集物中に播種したｈＢＳ細胞について、６０．０００細胞／ウェルであった。ｈＢＳＣを伴うプレートを、ｈＢＳ細胞凝集物の再現可能な付着を支持するために、細胞播種の直後に、５分間、４００ｇにて遠心分離した。培養培地を４日目および７日目に新しくした。１０日目に、個々のウェルにおける細胞内ＡＴＰ含量を、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。試験を、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて４回の独立した試行において、ならびにｈＢＳ細胞について２回の独立した試行において行った。さらに、ｈＢＳ細胞増殖を、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１０日目まで、毎日モニターした。次いで、写真を、デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、１、４、７、および１０日目に撮影した。
【００７０】
ｈＢＳ細胞についての増殖試験（図１Ａ）は、１０日目でのウェル当たりの細胞の量は、０日目で播種した細胞の数に、１５．０００ ｈＢＳ細胞／ウェルの播種密度まで正比例した。最も高い播種密度で、曲線が平らになる。ｈＢＳ ＭＰについての増殖試験の結果（図１Ｂ）は、１０日目でのウェル当たりの細胞数と、播種された細胞数との間に、５００ ｈＢＳ ＭＰ／ウェルの播種密度まで、正比例を示唆する。より高い播種密度にて、曲線は平らになり、そしてさらに４０００細胞／ウェル以降の播種密度から下降する。また、ｈＦＦについての曲線（図１Ｃ）は、１０日目での細胞数と、播種された細胞数との間に、５００ ｈＦＦ／ウェルの播種密度まで正比例を示し、より高い播種密度にて平らになる。しかし、曲線は、４０００細胞／ウェル以降の播種密度から水平状態のままである。これらの結果の比較後、本発明者らは、毒性試験におけるその後の使用のために、グラフの対数期から適切な播種する細胞数、すなわち、ｈＦＦについて５００細胞／ウェル、ｈＢＳ ＭＰについて５００細胞／ウェル、およびｈＢＳ細胞について５０００細胞／ウェル、を選択する。さらに、ｈＢＳ細胞増殖を、位相差顕微鏡を使用して１０日間モニターした（図２）。写真は、１０日間の間に、播種されたｈＢＳ細胞が増殖し、そして種々の組織様構造に分化することを実証する。
【実施例３】
【００７１】
細胞毒性試験
ｈＢＳ細胞コロニーを、約５０〜１００細胞の小さな凝集物に分離し、そしてゼラチンコート化９６‐ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において、２０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン‐ストレプトマイシン、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｎ‐メルカプトエタノール、および１％ 非必須アミノ酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充した、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ ＤＭＥＭを含有する１００Ｍｌ試験培地中に、５０００細胞／ウェルの密度で播種した。ｈＢＳ ＭＰおよびｈＦＦ細胞を単一の細胞に分離し、そしてゼラチンコート化９６‐ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）において、１００Ｍｌ試験培地中に、５００細胞／ウェルの密度で播種した。ｈＢＳＣを伴うプレートを、播種後、５分間、４００ｇにて直接的に遠心分離した。
【００７２】
前駆体細胞およびｈＦＦ細胞を、単一の細胞に分離し、そして９６‐ウェルプレートにおいて、１００μｌ試験培地中に播種した。
【００７３】
２４時間後、細胞毒性試験を、１００μｌの毒性溶液を試験ウェルに添加することにより開始し、これは必要とされる末端濃度の２倍の濃度を有した（０日目）。毒性培地を、アッセイの４日目、７日目に交換し、そして１０日目に、プレートを、細胞毒性についての異なる検出法を測定して、すなわち、製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＡＴＰ含量を測定して、および以前に記載されるように（Ｅｖａｎｓら、２００１）、蛍光物質レゾフリンへのレサズリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ、ＣＡＳ ６２７５８‐１３‐８）の還元を測定して、分析した。両方の評価項目を、マルチ検出リーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキットについては、発光を測定して、およびレサズリンアッセイについては、波長５３０ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）での蛍光を測定して、分析した。
【実施例４】
【００７４】
化学物質の試験および統計学的分析
以下の物質を試験した：ポジティブコントロールとして５‐ＦＵ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ、ＣＡＳ ５１‐２１‐８）、ネガティブコントロールとしてサッカリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ １２８‐４４‐９）、ＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ ３０２‐７９‐４）、１３ＣＲＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ ４７５９‐４８‐２）。サッカリンを、ＰＢＳ中に、１ｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そして４℃にてアリコート中に保存した。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡをＤＭＳＯ中に、０．１Ｍの濃度に溶解し、そして−２０℃にてアリコート中に保存した。５‐ＦＵ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびＤＭＳＯを、試験培地中に直接的に希釈した。全ての化学物質を３倍希釈系列において試験し、最も高い濃度は：５‐ＦＵについて２７ＭＭ、サッカリンについて１ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて１００ＭＭであった。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて、希釈系列はＤＭＳＯ中で行い、次いで希釈物を試験培地に添加して、最終試験濃度を得た。このことは、全ての試験したＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡ試験試行において０．１％の等価なＤＭＳＯ濃度を維持するためにおこなった。全ての実験を、少なくとも３回の独立した試行において行った。
【００７５】
ＩＣ５０値を、４パラメータのヒル関数をデータに近似することにより得た。全ての細胞型は５‐ＦＵに対して毒性反応を示し、そしてサッカリンに対しては毒性を何ら示さなかった（図３を参照のこと）。ＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞および前駆体細胞が、物質５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡに対して、ｈＦＦ細胞よりも非常に感受性であることを示した。前駆体細胞は、容易に培養されるｈＢＳ細胞型を表し、毒性物質に対するより高い感受性を維持しながら、酵素的継代を用いた大きな規模の培養を可能にする。
【００７６】
さらに重要なことに、未分化のｈＢＳ細胞に対するＡＴＲＡについてのＩＣ５０値は、１３ＣＲＡの値よりも高く、ＡＴＰアッセイにおいて、それぞれ、２５．７６μＭおよび１５．８５μＭ（図４を参照のこと）、ならびにレサズリンアッセイにおいて、それぞれ、１７．３１μＭおよび１４．５１μＭであった。同じ結果が、前駆体細胞について見出され、ここではＩＣ５０値は、ｈＦＦおよびｈＢＳ細胞に比較して劇的に減少され、ＡＴＲＡについて０．００２７μＭ、および１３ＣＲＡについて０．０００４μＭ、ならびにレサズリンアッセイにおいて、それぞれ、０．０００９μＭおよび０．００００２μＭであった。
【００７７】
多能性奇形腫Ｐ１９細胞に基づくマウス系において以前に報告された対応するＩＣ５０値（Ａｄｌｅｒら、２００５、遺伝子操作された奇形腫細胞において緑色蛍光タンパク質発現を使用することによる、分化誘導性の化学物質の検出、Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ．２００５ Ａｐｒ；３３（２）：９１‐１０３；Ａｄｌｅｒ論文（ｈｔｔｐ：／／ｗ３．ｕｂ．ｕｎｉｋｏｎｓｔａｎｚ．ｄｅ／ｖ１３／ｖｏｌｌｔｅｘｔｅ ／２００５／１６１９／／ｐｄｆ／Ａｄｌｅｒ．ｐｄｆ）は、それぞれ、０．００５μＭおよび０．３８μＭであり、すなわちマウス系は１２３倍で１３ＣＲＡを検出できない［（ＩＣ５０マウス（１３ＣＲＡ）／（ＩＣ５０マウス（ＡＴＲＡ））は、７６に等しく、すなわち０．３８／０．００５であり、一方（ＩＣ５０ヒト（１３ＣＲＡ）／（ＩＣ５０ヒト（ＡＴＲＡ））は０．６２に等しくすなわち、１５．８５／２５．７６である）。ヒトおよびマウスの比をそれぞれ比較すると、０．６２：７６は１２３倍に等しい。
【００７８】
表１：ヒト胚性幹（ｈＢＳ）細胞、ｈＢＳ ＭＰ、およびヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）についての評価項目として生存度を用いて得られた、試験した化学物質についての平均ＩＣ５０値。測定したパラメータは、ＡＴＰ含量およびレゾフリンへのレサズリンの還元であった。全ての実験を少なくとも３回の独立した試行において行った（ｎ≧３）
【００７９】
【表１】
【００８０】
２つの試験した細胞タイプ（ｈＢＳ細胞およびｈＦＦ）のＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞が、物質５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡに対して、ｈＦＦ細胞よりも非常に感受性であることを示した（ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて、図４〜５を参照のこと）。多能性ｈＢＳ細胞が、ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡに対してｈＦＦよりもはるかに感受性であった。これらの知見は、生存度を測定した、公知の催奇形物質に対するマウス多能性細胞の、線維芽細胞培養物よりも高い感受性を実証する以前の結果（Ｌａｓｃｈｉｎｓｋｉら、１９９１）と一致する。さらに、１３‐ＣＲＡのＩＣ５０値は、本発明者らの試験系において、全ての試験した細胞型について、ＡＴＲＡの値よりも一貫して低かった。多能性マウス細胞に基づいた以前のインビトロ催奇形性試験アッセイにおいて、１３‐ＣＲＡは、ＡＴＲＡよりも明らかに低い細胞毒性および催奇形性能を示した（Ａｄｌｅｒら、２００５）。１３ＣＲＡは、マウス系において催奇形物質として分類されていないが、これはヒトにおいて強力な催奇形物質である。従って、本発明者らの結果は、ヒト発生毒物を検出するための、動物細胞に基づくアッセイを上回る、ヒト細胞ベースの試験系の利点を示す。
【００８１】
２つの細胞型ｈＢＳおよびｈＦＦについての、ＡＴＰ測定におけるＡＴＲＡと１３ＣＲＡとの間の比較について、図４をまた参照のこと。表２および表３は、それぞれ、ＡＴＰアッセイおよびレザスリンアッセイを用いて測定した、ＩＣ５０値間の比を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
評価項目の生存度についての、２つの異なる検出方法、ＡＴＰアッセイおよびレサズリンアッセイ、の統計学的比較が、表４において示される。
【００８５】
表４：評価項目の生存度についての２つの異なる検出方法の統計学的比較。測定したパラメータは、ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）、ｈＢＳ、ＭＰ、およびヒト胚性幹（ｈＢＳ）細胞における化学物質での処理後のウェル当たりの細胞内ＡＴＰ含量およびレサズリン還元であった。濃度応答性曲線間の差異を、二方向ＡＮＯＶＡ検定を使用して統計学的に比較した（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５）。実験を、少なくとも３回の独立した試行において行った（ｎ２３）。
【００８６】
【表４】
【００８７】
ｈＢＳ細胞における、両方の検出法で得られた結果の類似性は、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰに比較して、それらのより低い増殖速度に起因し得る。さらに、他の細胞型に比較して、未分化のｈＢＳ細胞はより少ないミトコンドリアを含み、一方ミトコンドリアの数はそれらの分化の間に増加する（Ｃｈｏら、２００６）。従って、より低い増殖速度、ならびにより低い数のミトコンドリアは、ｈＢＳ細胞におけるＡＴＰアッセイとＲＥＳアッセイとの間の顕著でない差異についての説明を提供し、この差異は、非常に増殖性の、およびより多くのミトコンドリアを含むｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰにおいて増幅される。しかし、両方の検出技術は、ＩＣ５０値を同じ濃度範囲に与え、従って両方ともが、生存度を測定するのに適切である。
【実施例５】
【００８８】
胚毒性を決定するための物質のセットのスクリーニング
選択された多くの試験化合物を、マルチ‐ウェルフォーマット系において、ｈＢＳ細胞もしくは前駆体細胞、またはその組み合わせを使用して試験する。参照系として、異なる胚潜在性を伴う物質のセット、例えば、６〜１０個の物質を選択し、そして分析する。このセットは、非胚毒性、中程度の胚毒性から強力な胚毒性に及ぶ化学物質を含む。さらに、１つのネガティブなコントロール化合物（例えば、サッカリン）および１つのポジティブなコントロール化合物（例えば、５‐フルオロウラシル）を選択する。
【００８９】
参照物質および試験物質を、初期の分化、および中胚葉、内胚葉、および外胚葉への分化に関与されるタンパク質に対して指向される抗体、または遺伝子操作されたｈＢＳＣにおける胚葉特異的プロモータにより駆動される蛍光タンパク質の発現を含む試験プロトコルを使用して分析する。分析のための適切な時期が重要であり、それゆえ選択された発生毒性の評価項目の時間依存性の発現が確立される。試験プレートにおける蛍光シグナルを定量するために、ハイコンテントリーダーを用いる。
【００９０】
細胞毒性の評価項目について、ＩＣ５０値を評価し、これは細胞の５０％死滅を生じる化合物の濃度を記載する。発生毒性の評価項目から、ＩＤ５０値を算出し、これは選択したマーカーの５０％ダウンレギュレーションを導く物質の濃度を与える。これらの値を比較し、そして評価する。化学物質のインビトロ胚毒性を、各物質についてのＩＣ５０とＩＤ５０値との間の差異を評価することにより算定する。胚毒性物質について、ＩＣ５０値は明らかにＩＤ５０値よりも高い。これらの結果を用いて、参照物質および試験物質の順位付けは、公知のインビボデータに対する比較を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００９１】
【非特許文献１】Ａｄｌｅｒ Ｓ、Ｐａｐａｒｅｌｌａ Ｍ、Ｐｅｌｌｉｚｚｅｒ Ｃら、遺伝子操作された奇形腫細胞における緑色蛍光タンパク質発現を用いることによる、分化誘導性の化学物質の検出。実験動物に対する代替：ＡＴＬＡ、２００５；３３（２）：９１‐１０３。
【非特許文献２】欧州議会および諮問委員会のＡｎｏｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）第１９０７／２００６号。欧州委員会。ｈｔｔｐ：／／ｅｕｒｌｅｘ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ＬｅｘＵｒｉＳｅｒｖ／ｓｉｔｅ／ｅｎ／ｏｊ／２００６／ｌ＿３９６／ｌ＿３９６２００６１２３０ｅｎ０００１０８４９．ｐｄｆにて利用可能．２００７年８月７日に評価
【非特許文献３】Ｃｈｏ ＹＭ、Ｋｗｏｎ Ｓ、Ｐａｋ ＹＫら。ミトコンドリア生合成における動的変化およびヒト胚性幹細胞の自発的分化の間の抗酸化酵素。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００６；３４８（４）：１４７２‐８。
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【非特許文献８】Ｇｅｎｓｃｈｏｗ Ｅ、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ、Ｓｃｈｏｌｚ Ｇら、３つのインビトロ胚毒性試験における国際ＥＣＶＡＭ検証研究における胚性幹細胞試験の検証。実験動物に対する代替：ＡＴＬＡ、２００４；３２（３）：２０９‐４４。
【非特許文献９】Ｈｅｉｎｓ Ｎ、Ｅｎｇｌｕｎｄ ＭＣ、Ｓｊｏｅｂｌｏｍ Ｃ、Ｄａｈｌ Ｕ、Ｔｏｎｎｉｎｇ Ａ、Ｂｅｒｇｈ Ｃ、Ｌｉｎｄａｈｌ Ａ、Ｈａｎｓｏｎ Ｃ、Ｓｅｍｂ Ｈ。「ヒト胚性幹細胞の誘導、特徴付け、および分化」。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００４；２２：３６７‐３７６。
【非特許文献１０】Ｌａｓｃｈｉｎｓｋｉ Ｇ、Ｖｏｇｅｌ Ｒ、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ。胚盤胞由来の正倍数性胚性幹細胞を使用する細胞毒性試験：インビトロ催奇形性スクリーニングに対する新規なアプローチ。Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．）、１９９１；５（１）：５７‐６４。
【非特許文献１１】Ｒｏｓｓ ＳＡ、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ＰＪ、Ｄｒａｇｅｒ ＵＣら、胚発生におけるレチノイド。生理学的概説、２０００、８０（３）：１０２１‐５４。
【非特許文献１２】ＲＰＡ ｕｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｓｗｅｄｅｎ。化学部門における新規な規制のビジネス衝撃の見積もり。最終報告。欧州委員会企業総局のために用意された。Ｌｏｎｄｏｎ：ＲＰＡ．２００２；‐２１６ Ｓ。
【非特許文献１３】Ｓｏｐｒａｎｏ ＤＲおよびＳｏｐｒａｎｏ ＫＪ。催奇形物質としてのレチノイド。栄養学の年報、１９９５；１５：１１１‐３２。
【非特許文献１４】Ｓｔａｃｅｙ ＧＮ、Ｃｏｂｏ Ｆ、Ｎｉｅｔｏら、臨床等級のｈＥＳ細胞株の調製のための「支持」細胞の開発：課題および解決。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６；１２５（４）：５８３‐８。Ｅｐｕｂ
【非特許文献１５】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＪＤ、Ｇｏｌｂｕｓ ＭＳ、Ｍｉｌｌｅｒ ＴＲら、妊娠初期の間５‐フルオロウラシルに曝露された胎児における複数の先天性奇形。Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、１９８０；１５；１３７（６）：７４７‐９。
【特許文献】
【００９２】
【特許文献１】国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット、多能性ヒト胚盤胞由来の幹細胞株を確立する方法、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ。
【背景技術】
【０００１】
ヒト胚盤胞由来の幹（ｈＢＳ）細胞は、３つ全ての胚葉の派生物に分化する独特の能力を有する。この特徴は、それらが機能的な細胞についての「細胞工場」として作用し得るので、それらを毒物学の分野における優れた道具にする（Ｍｏｏｎ ＳＹら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３（１）：５‐１４、２００６）。さらに、ｈＢＳ細胞分化のプロセスの間に相互作用する化合物の効果が検出され得、これはそれらを、発生毒物学の分野において特に価値あるものにする。
【０００２】
新規な欧州化学物質政策（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｏｌｉｃｙ）（ＲＥＡＣＨ）は、２００７年に効力を生じるので、年間１トンを超える容量で製造または輸入される３０，０００個を超える化学物質について、毒物学的な情報が必要とされる（Ａｎｏｎ、２００７）。従って、約３９０万のさらなる試験動物が潜在的に使用され、そして産業に対する費用は約１５億Ｅｕｒｏであると見積もられ、その３２％は、発生毒性研究に単独に起因する（ＲＰＡ、２００２）。それゆえ、インビトロ発生毒性試験が、緊急に必要とされる。さらに、新規な薬物候補についての信頼できる毒物学的データが開発段階においてできるだけ早期に作製されなくてはならないので、医薬産業は、インビトロ毒性試験におけるハイスループットの必要性に直面する。インビトロ毒性スクリーニングにおける初期の取り込みに起因する高い損耗率の減少は、関連されるコストを大いに減少する。さらに、多くの物質が、例えば、重篤な座瘡の処置において使用される１３‐シスレチノイン酸（イソトレチノイン（Ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）（Ａｃｃｕｔａｎｅ、Ｒｏｃｈｅ）ならびに鎮静剤および抗炎症剤薬物のサリドマイド（Ｃｏｎｔｅｒｇａｎ）が、有意な種間差異を示すことが知られており、ヒトにおいて重篤な奇形を生じるが、マウスまたはラットにおいては明らかにそうではない（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２００３）。従って、ヒト関連の発生毒性試験が必要とされる。
【０００３】
今日最も見込みのあるインビトロ胚毒性試験の１つは、有効な胚性幹細胞試験（ＥＳＴ）であり、これは化学物質の胚毒性の可能性を評価するためにマウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞を用いる。ＥＳＴは、胚毒性物質に対するｍＥＳ細胞およびマウス線維芽細胞の異なる感受性を考慮にいれる。さらに、ｍＥＳ細胞の、機能的な心筋細胞への分化は、毒物学的な評価項目として作用する（Ｇｅｎｓｃｈｏｗ，２００４）。しかし、ＥＳＴは未だ、動物系においてヒト毒性を予測することを目的とする。
【０００４】
発生毒性試験におけるヒト胚性幹細胞の使用は、薬物および化学物質の安全性評価についての既存の毒性試験に対して価値を付加する信頼できる、ヒト関連のデータを提供し得る。しかし、毒性試験におけるｈＢＳ細胞の適用は、これらの細胞が複雑な操作技術を必要とするので困難である。例えば、ｈＢＳ細胞は、それらの増殖を確実にするために、そして高い分散を生じる表面への可変的な付着特性を示すために、単一の細胞のかわりに細胞凝集物中に播種されることを必要とする。さらに、ｈＢＳ細胞の集団２倍化時間は、３６時間であり、ｍＥＳ細胞の２倍化時間の１２時間よりも有意に長い。マウスＢＳ細胞とヒトＢＳ細胞との間の別の重要な差異は、それらの培養要件である。未分化の状態にｍＥＳ細胞を維持するためには、培養培地への白血病抑制因子（ＬＩＦ）の添加で十分であるが、ｈＢＳＣ系統は、マウスまたはヒトの支持細胞層上で培養され、これは、未分化の状態に細胞を安定に維持するための最も信頼できる方法であるようである。多くの研究が支持体非含有培養系を見出すために行われているが、これらは開発の初期段階にある（Ｓｔａｃｅｙら、２００６）。
【０００５】
本発明は、発生毒性および細胞毒性のような、ヒト毒性の予測のためのｈＢＳ細胞に基づく毒性アッセイを表す。本発明は、ｍＥＳ細胞よりも優れた有利さを示し、例えば１３‐シスレチノイン酸のような、そのいくつかが種間差異を示すことが知られるヒト催奇形物質を同定することを補助するヒト関連のデータを与えることを、可能にする。
【発明の概要】
【０００６】
定義および略語
「アッセイ（単数形）」または「アッセイ（複数形）」は、例えば、遺伝子レベル、タンパク質レベル、または機能性レベルにおいて、細胞毒性および／または発生毒性を測定するために行われるインビトロ試験を記載することが意図される。
【０００７】
本明細書中で使用される、用語「胚盤胞由来の幹細胞」は、ＢＳ細胞を示し、そしてヒト形態は「ｈＢＳ細胞」または「ｈＢＳＣ」と呼ばれる。
【０００８】
本明細書中で使用される用語「前駆体」または「前駆体細胞型」は、未分化のｈＢＳ細胞と十分に分化された細胞との間の分化の任意の段階での、ｈＢＳ細胞に由来する任意の細胞である。
【０００９】
用語「支持細胞」または「支持体」は、別のタイプの細胞と同時培養されるある細胞タイプの細胞を意味することが意図され、第２のタイプの細胞が増殖し得る環境を提供する。支持細胞は、必要に応じて、それらが支持する細胞とは異なる種に由来し得る。支持細胞は典型的に、それらが支持する細胞よりも増殖することからそれらを防ぐために、照射またはマイトマイシンｃのような抗分裂剤での処理により、他の細胞と同時培養される場合、不活化され得る。前述を制限しないが、１つの特定のこのような支持細胞層は、本明細書中でｈＦＦとして示される、ヒト皮膚線維芽細胞のような、ヒト支持体であり得る。本発明の情況において、ｈＦＦはまた、成熟細胞型を例示する。別の支持細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）であり得る。
【００１０】
用語「物質」の解釈は、治療剤（または潜在的な治療剤）、または神経毒、肝臓毒、造血細胞の毒、筋毒、発癌物質、催奇形物質、または１つ以上の生殖器官に対する毒性のような、実証された毒性効果を伴う薬剤に制限されることを意図しない。用語、物質はさらに、農薬、例えば、殺虫剤、抗菌剤、肥料のような化学組成物であり得るか、または同様に化粧品において使用される成分であり得る。
【００１１】
用語「ＩＣ５０」値は、本発明の情況において、インビトロで試験した細胞の約５０％の死を導く試験物質の濃度を表す。
【００１２】
「効率」または「効果」は、そうでないと規定されない限り、本発明におけるアッセイの情況において、当該アッセイがヒトにおいて毒性である物質をより検出するようであること、および／または毒性濃度、例えば、対応する分析されたＩＣ５０値が、マウス胚性幹細胞もしくはマウス癌腫細胞に基づくアッセイのような先行技術において記載される方法もしくはアッセイに比較して、利用可能な場合はいつでも、公知のヒトインビボデータに、より近似することを意味することが意図される。
【００１３】
本発明の簡単な説明
本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質の毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。
【００１４】
本発明はまた、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。
【００１５】
本発明の１つのさらなる局面は、インビトロ毒性アッセイであり、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞、ヒト前駆体細胞、およびヒト成熟様細胞からなる群より選択される、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、例えば少なくとも４つの、少なくとも５つのヒト細胞型を含み、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する。具体的には、本発明のアッセイは、特異的な毒性：例えば、成熟細胞に対するよりも胚細胞に対する高い程度の毒性、を予測し得る。
【００１６】
本発明のなお１つのさらなる局面は、ヒトにおける毒性の検出のためのヒト胚盤胞幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであり、非ヒトアッセイに比較して１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）の胚毒性のような、これはヒト毒性をより効果的に予測する。
【００１７】
本発明のなお１つのさらなる局面は、ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）のような、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体に基づくインビトロ毒性アッセイであり、これはｈＦＦのような成熟ヒト細胞に比較して、全てのトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）のヒト毒性をより効果的に予測する。
【００１８】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００１９】
本発明はまた、ヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測するさらなる方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００２０】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測するための方法／アッセイに関し、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２１】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２２】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）それぞれ（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００２３】
発明の詳細な説明
ヒト胚盤胞幹細胞は、発生毒性試験のための独特な道具を提供し、それゆえ、本発明者らは、本発明に従って、発生毒性アッセイおよび細胞毒性アッセイのような、ｈＢＳ細胞ベースの発生毒性試験を開発した。概念実証として、評価項目の生存度を備える毒性アッセイを、３つの異なる程度の発生的成熟を表す、多能性ｈＢＳ細胞、ｈＢＳ細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ ＭＰ）、およびヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）を用いて開発した。周知のインビボデータを伴う発生毒性物質のセット、すなわち、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）および１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）を、２つの異なる生存度アッセイ、すなわち、ＡＴＰ含量およびレサズリン（ＲＥＳ）還元を用いて試験した。さらに、５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）を、ポジティブコントロールとして、およびサッカリン（Ｓａｃｃｈａｒｉｎ）をネガティブコントロールとして使用した。
【００２４】
レチノイド様ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡは主に、癌、および座瘡または乾癬のような皮膚疾患の処置において使用される。レチノイド誘導性の奇形の特徴的なパターンは、中枢神経系を含む頭蓋顔面構造、手足、胸線、および軸骨格の欠失を含む（Ｒｏｓｓら、２０００）。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡはともに、ヒトにおいて重篤な催奇形物質であるが、マウス系においてそれらの催奇形性は異なる（Ｎａｕら、２００１）。１３ＣＲＡは、ＡＴＲＡよりも、インビボでマウスにおいて非常に低い催奇形性を示し、およびインビトロでマウス奇形腫（Ｐ１９）細胞において低い分化誘導能を示す（Ａｄｌｅｒら、２００５；ＳｏｐｒａｎｏおよびＳｏｐｒａｎｏ １９９５）。それゆえ、これらの構造的に関連される物質が、本発明者らの試験系を試みるために選択された。抗癌薬物の５‐ＦＵは、インビボおよびインビトロの両方での発生毒物であり（Ｊａｃｏｂら、１９８６）、そして個別の報告が、ヒトにおける５‐ＦＵ関連性の出生異常に対して存在する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、１９８０）。
【００２５】
本発明の１つの実施態様は、異なる分化レベルからの細胞を表す、ｈＢＳ細胞、ｈＢＳ細胞由来の前駆体細胞、および／またはヒト包皮線維芽細胞、またはそれらの組み合わせに基づく細胞毒性試験に関する。評価項目として細胞毒性に基づくこの試験は、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）および１３‐シスレチノイン酸（１３ＣＲＡ）を含むいくつかのヒト発生毒物の検出に効果的である。これらの物質は、未分化の胚盤胞由来の幹細胞および前駆体細胞においてより低いＩＣ５０値を、成熟ヒト細胞におけるより高い値に比較して、示した。
【００２６】
本発明はまた、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関する。アッセイは、ある物質についての、毒性、詳細には胚細胞または発生中の細胞に対する毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較して、ヒトにおいてより効果的に毒性を検出および／または予測する。
【００２７】
本発明はさらに、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的にヒトにおける毒性を検出および／または予測する。本発明に従う前駆体細胞は、ｈＢＳ細胞と十分に分化した細胞との間の任意の前駆体細胞であり得る。本発明における適切な前駆体細胞は、中胚葉、内胚葉、または外胚葉の細胞型であり得る。前駆体細胞はさらに、間葉前駆体細胞、線維芽様前駆体細胞、心臓前駆体細胞、肝臓前駆体細胞、膵臓前駆体細胞、または神経前駆体であり得る。
【００２８】
本発明の特定の実施態様において、前駆体細胞はヒト胚盤胞幹細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）である。
【００２９】
ＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞およびｈＢＳ由来の前駆体細胞が、５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡのような毒性物質に対して、ｈＦＦ細胞のような成熟細胞型よりも、感受性であることを示す（図３および４を参照のこと）。前駆体細胞は、毒性物質に対してなおより高い感受性を維持しながら、酵素的な継代による大きな規模の培養を可能にする、容易に培養されるｈＢＳ由来の細胞型を表す。
【００３０】
本発明はさらに、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つのヒト細胞型を含む。これらのヒト細胞型は、ｈＢＳ細胞、前駆体細胞、および成熟様細胞を含む群から選択され得る。成熟様細胞は、皮膚および筋肉のような異なるヒト組織に由来し得る。成熟様細胞はまた、新生児または成人のような異なる発生の段階に由来し得る。本発明の特定の実施態様において、使用される成熟様細胞は、新生児男子からのヒト包皮線維芽細胞である。
【００３１】
本発明はさらに、インビトロ毒性アッセイに関し、ここで非ヒトのアッセイは、マウス、ラット、またはブタのような任意の非ヒト哺乳動物起源であり得る。次いで、マウスアッセイが、マウス胚性幹細胞に基づくアッセイまたはマウス奇形腫細胞由来のアッセイにより例示され得る。
【００３２】
非ヒトアッセイは、本出願に対する参照系として言及され、これはまた、インビボアッセイであり得る。このようなインビボアッセイは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、またはイヌの動物モデルであり得る。
【００３３】
より詳細には、本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイに比較してより効果的に、例えば、少なくとも５０％より多く、少なくとも７５％より多く、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍より効果的に、毒性を検出する。
【００３４】
本発明の特定の実施態様において、インビトロ毒性アッセイは、マウス奇形腫細胞に基づく非ヒトアッセイに比較して、毒性を少なくとも１２３倍、より効果的に検出する。
【００３５】
同等に、本発明は、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、ならびに／またはより効果的に、例えば、ｈＢＳ細胞と前駆体細胞とを比較する場合、少なくとも１．５倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性、胚細胞に対する特異的な毒性を検出し、そしてｈＢＳ細胞と成熟様線維芽細胞とを比較する場合、少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性を検出し、そして前駆体細胞と成熟様細胞とを比較する場合、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍より効果的に、毒性を検出する。
【００３６】
さらに、本発明のアッセイは、生存度の測定のような、細胞毒性の評価項目に基づき得る。このような評価項目についての適切な検出技術は、ＡＴＰ含量分析、ＭＴＴ塩分析、およびレサズリン変換を含む代謝活性を測定する群から選択され得る。
【００３７】
本発明のさらなる適切な評価項目は、胚毒性の評価項目の群から選択され得る。ＲＮＡ、酵素、および抗体レベルのゲノミクスおよびプロテオミクス測定のような、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいずれかにおける生体分子の発現レベルが分析され得る。マイクロＲＮＡレベルがさらに、分析され得る。細胞毒性および胚毒性の両方を測定するための適切な手段は、比色法（可視色における定量可能な変化）または蛍光光度法（蛍光における定量可能な変化）であり得る。測定は、マルチ‐ウェルプレートリーダーにおいて行われ得、ここではいくつかのウェルの内容物が、同時に分析される。試験は、培地についてハイスループット適用に拡張することを許容するように設計される。毒性効果の検出および定量化測定のための１つの他の適切な設定は、ハイコンテントリーダー（Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｒｅａｄｅｒ）において行われ得る。
【００３８】
本発明の１つの実施態様において、強力なスクリーニング技術、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）が使用される。ＨＣＳは、物質の迅速なスクリーニングを許容する様式において、多くの細胞事象に対する化合物の影響を同定および定量する能力を拡張する。ＨＣＳは、単一のスクリーニング基盤内で同時に複数の測定を許容する。これは、マルチ‐ウェルサンプル調製の処理とともに、顕微鏡研究様データ捕獲と関連されるタスク、および特定の細胞事象を定量する能力を備える分析を合わせて自動化することを可能にする。
【００３９】
発生毒性試験において、本発明によれば、ＨＳＣは、関連の生物学的系における１つのおよび同じ試験プレートにおける細胞毒性と並行して、３つ全ての胚葉への分化に対する影響を検出することを可能にする。生存細胞に対する物質の時間依存性の効果が、トキシコキネティクスおよび影響される経路を研究するための価値ある道具を提供するＨＣＳを用いて、同様に試験される。
【００４０】
本発明の１つの実施態様において、毒物学試験においてｈＢＳＣを用いる場合、細胞は、増殖段階に維持されるために、小さな凝集物中に播種される必要性があり得る。このことは一般に、一方のウェルから他方のウェルへの細胞数の高い分散が生じ得るので、毒性試験において支障を引き起こす。ＨＣＳの技術を用いて、測定されるシグナルを、試験ウェル当たりの細胞の数に正規化することが可能である。
【００４１】
本発明の特定の実施態様において、細胞毒性はレサズリン変換により測定される。
【００４２】
本発明の別の実施態様において、細胞毒性は、ＡＴＰ含量分析により測定される。
【００４３】
本発明のなお別の特定の実施態様は、ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイに関し、これは非ヒトアッセイに比較して１３ＣＲＡのヒト毒性をより効果的に検出する。
【００４４】
本発明のなお別の実施態様において、未分化のｈＢＳ細胞株、ｈＢＳ由来の前駆体細胞型、または体細胞様ｈＢＳ細胞由来の型のような、遺伝子操作された細胞株が使用され得る。このように操作された細胞株は、発生的に関連するプロモーターの制御下で蛍光または他のマーカーを発現するレポーター細胞株であり得る。
【００４５】
さらに、本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００４６】
本発明はまた、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法／アッセイに関し、方法は、以下の工程
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェル、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４７】
さらに、本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４８】
さらに本発明は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程、（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、
（ｉｉ）それぞれ、（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する。
【００４９】
この時間の間、播種されたｈＢＳ由来の細胞の、例えば、全ての胚葉から、心臓前駆体、肝細胞様前駆体、および神経前駆体のような前駆体タイプへの分化が観察され得る。
【００５０】
本発明の１つの他の実施態様はまた、ヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１つ以上の物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、を包含する。
【００５１】
アッセイは、マルチウェルフォーマット１５３６、３８４、９６、４８、２４、１２、または６ウェルにおいて行われ得る。９６ウェルプレートの場合において、工程（ｉ）において播種される細胞の数は、ウェル当たり、１個の細胞〜１Ｍ個の細胞、好ましくは１，０００個〜１００，０００個、およびより好ましくは１０，０００個〜３０，０００個である。任意の工程（ｉ）において、プレートのウェルはさらに、タンパク質、ペプチド、または細胞外マトリクス成分で、予め／または後にコートされ得る。
【００５２】
工程（ｉｉ）における細胞の曝露は、１分間から６０日間、好ましくは５分間から３０日間、１日から２０日間、およびより好ましくは５〜１５日間の期間、行われ得る。
【００５３】
工程（ｉｉｉ）の毒性分析は、本明細書で記載される任意の適切な評価項目により行われ得る。
【００５４】
得られたインビトロデータはさらに、工程（ｉｖ）において、数学的予測モデルまたはそれゆえアルゴリズムにより、インビボデータに比較され得る。
【００５５】
本発明の１つの特定の実施態様は、ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、当該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法に関し、方法は、以下の工程
（ｉ）未コートのまたはコート化マルチウェルフォーマット組織培養プレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）１０日間、ある物質のいくつかの濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）ＡＴＰ含量またはレサズリン変換を測定することにより分析する工程、を包含する。
【００５６】
別の局面において、本発明は、薬物発見における、および／または安全性評価研究のための、本明細書におけるようなアッセイの使用に関する。
【００５７】
なおさらなる局面において、本発明は、胚毒性、催奇形性研究のための、および／または欧州ＲＥＡＣＨ法により特定される物質の評価のための、本明細書中に記載されるようなアッセイの使用に関する。
【００５８】
本発明はまた、本明細書中に記載されるようなヒトにおける毒性を検出するための、または本明細書中にまた記載されるような方法の使用のための、キットに関し、当該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル、を含む。
【００５９】
本発明のキットはさらに、前駆体細胞および成熟様線維芽細胞からなる群より選択される、少なくとも１つのさらなるヒト細胞型を含み得る。
【００６０】
本発明はまた、上記されるようなヒトにおける毒性を検出するための、またはまた上記されるような方法における使用のための、キットに関し、当該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル、を含む。
【００６１】
本発明の１つの実施態様は、ｈＢＳ、またはｈＢＳ細胞由来の細胞型を含むキットであり、これは必要に応じて遺伝子操作されるか、または必要に応じて胚葉特異的抗体と組み合わされ、一般的な細胞毒性についての評価項目と組み合わせて発生毒性関連の評価項目のパネルを定量的に検出するためのハイコンテントスクリーニングアルゴリズムのようなアルゴリズムを合わせて備える。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】１０日間での生存細胞の株に正比例する、細胞内ＡＴＰ含量に対する測定により決定されたｈＢＳ細胞（Ａ）、ｈＢＳ ＭＰ（Ｂ）、およびｈＦＦ細胞（Ｃ）についての増殖曲線。増殖試験は、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて４回の独立した試行において（ｎ＝４）、ならびにｈＢＳ細胞について２回の独立した試行において（ｎ＝２）、行われた。エラーバーは平均の標準誤差を記載する。
【図２】（ａ）１日目、（ｂ）４日目、（ｃ）７日目、および（ｄ）１０日目でモニターされた９６ウェルプレートにおけるｈＢＳ細胞の増殖および分化の位相差顕微鏡写真。０日目での播種密度６０．０００細胞／ウェル。
【図３】３つの細胞型、ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、およびｈＢＳ細胞を用いたネガティブコントロール物質のサッカリン（Ｓａｃｃｈａｒｉｎ）（Ａ、Ｂ）およびポジティブコントロール物質の５‐ＦＵ（Ｃ、Ｄ）についての濃度応答曲線。データは、ウェル当たりのＲＥＳ還元（Ａ、Ｃ）、および細胞内ＡＴＰ含量（Ｂ、Ｄ）を測定することにより得られ、そして未処理／溶媒コントロールに対して正規化された。全ての実験は、３回の独立した試行において行われた（ｎ＝３）。エラーバーは、平均の標準誤差を記載する。エラーバーは平均の標準誤差を記載する。すべての実験は、３回の独立した試行において行われた。
【図４】３つの細胞型、ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、ｈＢＳ細胞を用いる、物質ＡＴＲＡ（Ａ、Ｂ）および１３‐ＣＲＡ（Ｃ、Ｄ）についての濃度応答曲線。データは、ウェル当たりのＲＥＳ還元（Ａ、Ｃ）および細胞内ＡＴＰ含量（Ｂ、Ｄ）を測定することにより得られ、そして未処理／溶媒コントロールに対して正規化された。全ての実験は、少なくとも３回の独立した試行において行われた（ｎ×３）。エラーバーは、平均の標準誤差を記載する。ＡＴＲＡおよび１３‐ＣＲＡについて、ｈＢＳ細胞および前駆体細胞は、毒性物質に対して、ｈＦＦよりも高い感受性を示す。ｈＢＳと前駆体細胞との間のＩＣ５０比は、１０ ０００：１（ＡＴＲＡ）および４０００：１（１３‐ＣＲＡ）である。ｈＢＳ細胞とｈＦＦとの間で、ＩＣ５０値は、１：４（ＡＴＲＡ）よりも多く、および１：６（１３‐ＣＲＡ）よりも多かった。
【図５】ａ）は、ＡＴＰアッセイを使用した、１０日間の曝露後の未分化のｈＢＳ細胞におけるＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについての濃度応答曲線を示す。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについてのＩＣ５０値は、それぞれ、３０．３８μＭおよび１５．８５μＭである。ｂ）は、ＡＴＰアッセイを使用した、１０日間の曝露後のｈＦＦにおけるＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡ（１３‐シスレチノイン酸）についての用量応答性曲線を示す。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについてのＩＣ５０値は、それぞれ、２４４．３μＭおよび３０１．６μＭである。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６３】
ｈＢＳ細胞、前駆体細胞、およびｈＦＦ細胞の培養
ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２およびＳＡ００２．５を、以前に記載されるように確立し、そして特徴付けし（Ｈｅｉｎｓら、２００４、国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット）、そしてＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ａｓｐ）およびＵＫ幹細胞バンク（ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｒｅｃｏｒｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ？ｄ＝ＭＲＣ００３２５９）に登録した。細胞株を、４ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を補充したＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中のマイトマイシン‐Ｃ不活化マウス胎児線維芽細胞（ｍＥＦ）上に維持した。未分化のｈＢＳ細胞を、Ｓｗｅｍｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｏｏｌ（Ｓｗｅｍｅｄ Ｌａｂ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｂｉｌｌｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する機械的分離により、４〜５日毎に継代した。
【００６４】
線維芽細胞様前駆体細胞を、ｈＢＳ細胞コロニーの切片を２００×２００μｍの切片に切断し、そして切片を凝集のために、ペトリ皿に、ＫＯ‐ＤＭＥＭ、２０％ ＦＣＳ、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＰＥＳＴ、および０．１ｍＭ β‐メルカプトエタノール（全てＧｉｂｃｏ Ｉｎｉｔｒｏｇｅｎから）に基づく培地中に置くことにより、作製した。浮遊する凝集物を、４日間に亘って形成し、その後、ウェル当たり約１０凝集物の高密度にて、ゼラチンでコートされた組織培養皿中に播種した。増殖物が観察され、そして細胞をさらに５〜１４日にて分離し、そして最初の継代にて１：１の分割にて継代した。培養物がコンフルエンスに達した場合、分割比を、通常、１：２に設定した。凝集物を播種した後、継代培養のために使用した培地は、ｎａｔｒｉｕｍｐｙｒｕｖａｔ＋ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ ＦＣＳ、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＢＦ、１％ ＰＥＳＴ非含有のＤＭＥＭ高グルコースからなった。
【００６５】
ヒト胚盤胞幹細胞由来の間葉前駆体（ｈＢＳ‐ＭＰ）を、ｈＢＳ細胞株 ＳＡ００２．５からの派生物を介して、以下の工程を包含する方法により得た：
ｉ）未分化のｈＢＳ細胞を表面上に播種する工程；
ｉｉ）２〜２１日間、例えば、３〜１０日間、好ましくは７日間、インキュベーションして、分化を許容する工程；
ｉｉｉ）新規な表面に酵素的に継代する工程；
ｉｖ）均一な間葉形態が得られるまで、工程（ｉｉｉ）を反復する工程；
ｖ）得られたｈＢＳ‐ＭＰ細胞を培養する工程。
【００６６】
ｈＢＳ‐ＭＰを、毒性試験の前に、１０％ ＦＣＳ（ともにＧｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから）および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中に培養し、そして分割比１：１０において４日毎に継代培養した。継代について、トリプシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する組織培養Ｔ‐２５フラスコにおける培養。
【００６７】
詳細には、拡張可能なｈＢＳ ＭＰは、ｈＢＳ細胞株ＳＡ００２．５に由来した。それゆえ、ｈＢＳを、Ｔｒｙｐｌｅ ＳｅｌｅｃｔＴＭで酵素的に分離し、そして１ｃｍ２当たり１．５×１０５細胞にて、０．１％ゼラチンコート化細胞培養皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ／ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上に播種した。分化の７日後、ｈＢＳ細胞を単一細胞として、新しいゼラチンコート化培養皿に酵素的に継代した。この手順を、細胞集団が形態において均一になるまで、７日毎に反復した。この細胞集団の十分な特徴付けを、別の研究の一部として行い、ｈＢＳ ＭＰは、形態およびマーカー発現に関して胎児間葉の細胞に類似することを示す（原稿が提出される）。ｈＢＳ ＭＰを、未コートの組織培養フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、１０％ ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン、および４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、そして１：１０の分割比にて、４日毎に継代した。
【００６８】
ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＲＬ‐２４２９ ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、そして１０％ ＦＢＳを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中で培養し、１：５の分割比において４日毎に継代した。継代について、トリプシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する組織培養Ｔ‐２５フラスコにおける培養。
【実施例２】
【００６９】
増殖
１０日間の毒性試験においてウェル当たりに播種される最適な細胞数を決定するために、一連の増殖試験を行った。播種のための最適な細胞数は、細胞の播種される数が、試験の測定日にシグナルに比例する範囲になければならない。ｈＦＦ、ｈＢＳ ＭＰ、およびｈＢＳ細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）コート化９６‐ウェルプレートにおいて、１０％ ＦＢＳおよび５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ中、二倍希釈系列において、三連で播種し、最も高い細胞密度は、単一の細胞懸濁物として播種したｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて、１６．０００細胞／ウェル、および５０〜１００細胞の凝集物中に播種したｈＢＳ細胞について、６０．０００細胞／ウェルであった。ｈＢＳＣを伴うプレートを、ｈＢＳ細胞凝集物の再現可能な付着を支持するために、細胞播種の直後に、５分間、４００ｇにて遠心分離した。培養培地を４日目および７日目に新しくした。１０日目に、個々のウェルにおける細胞内ＡＴＰ含量を、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。試験を、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰについて４回の独立した試行において、ならびにｈＢＳ細胞について２回の独立した試行において行った。さらに、ｈＢＳ細胞増殖を、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して１０日目まで、毎日モニターした。次いで、写真を、デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、１、４、７、および１０日目に撮影した。
【００７０】
ｈＢＳ細胞についての増殖試験（図１Ａ）は、１０日目でのウェル当たりの細胞の量は、０日目で播種した細胞の数に、１５．０００ ｈＢＳ細胞／ウェルの播種密度まで正比例した。最も高い播種密度で、曲線が平らになる。ｈＢＳ ＭＰについての増殖試験の結果（図１Ｂ）は、１０日目でのウェル当たりの細胞数と、播種された細胞数との間に、５００ ｈＢＳ ＭＰ／ウェルの播種密度まで、正比例を示唆する。より高い播種密度にて、曲線は平らになり、そしてさらに４０００細胞／ウェル以降の播種密度から下降する。また、ｈＦＦについての曲線（図１Ｃ）は、１０日目での細胞数と、播種された細胞数との間に、５００ ｈＦＦ／ウェルの播種密度まで正比例を示し、より高い播種密度にて平らになる。しかし、曲線は、４０００細胞／ウェル以降の播種密度から水平状態のままである。これらの結果の比較後、本発明者らは、毒性試験におけるその後の使用のために、グラフの対数期から適切な播種する細胞数、すなわち、ｈＦＦについて５００細胞／ウェル、ｈＢＳ ＭＰについて５００細胞／ウェル、およびｈＢＳ細胞について５０００細胞／ウェル、を選択する。さらに、ｈＢＳ細胞増殖を、位相差顕微鏡を使用して１０日間モニターした（図２）。写真は、１０日間の間に、播種されたｈＢＳ細胞が増殖し、そして種々の組織様構造に分化することを実証する。
【実施例３】
【００７１】
細胞毒性試験
ｈＢＳ細胞コロニーを、約５０〜１００細胞の小さな凝集物に分離し、そしてゼラチンコート化９６‐ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において、２０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン‐ストレプトマイシン、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｎ‐メルカプトエタノール、および１％ 非必須アミノ酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充した、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ ＤＭＥＭを含有する１００Ｍｌ試験培地中に、５０００細胞／ウェルの密度で播種した。ｈＢＳ ＭＰおよびｈＦＦ細胞を単一の細胞に分離し、そしてゼラチンコート化９６‐ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）において、１００Ｍｌ試験培地中に、５００細胞／ウェルの密度で播種した。ｈＢＳＣを伴うプレートを、播種後、５分間、４００ｇにて直接的に遠心分離した。
【００７２】
前駆体細胞およびｈＦＦ細胞を、単一の細胞に分離し、そして９６‐ウェルプレートにおいて、１００μｌ試験培地中に播種した。
【００７３】
２４時間後、細胞毒性試験を、１００μｌの毒性溶液を試験ウェルに添加することにより開始し、これは必要とされる末端濃度の２倍の濃度を有した（０日目）。毒性培地を、アッセイの４日目、７日目に交換し、そして１０日目に、プレートを、細胞毒性についての異なる検出法を測定して、すなわち、製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＡＴＰ含量を測定して、および以前に記載されるように（Ｅｖａｎｓら、２００１）、蛍光物質レゾフリンへのレサズリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ、ＣＡＳ ６２７５８‐１３‐８）の還元を測定して、分析した。両方の評価項目を、マルチ検出リーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキットについては、発光を測定して、およびレサズリンアッセイについては、波長５３０ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）での蛍光を測定して、分析した。
【実施例４】
【００７４】
化学物質の試験および統計学的分析
以下の物質を試験した：ポジティブコントロールとして５‐ＦＵ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ、ＣＡＳ ５１‐２１‐８）、ネガティブコントロールとしてサッカリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ １２８‐４４‐９）、ＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ ３０２‐７９‐４）、１３ＣＲＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＡＳ ４７５９‐４８‐２）。サッカリンを、ＰＢＳ中に、１ｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そして４℃にてアリコート中に保存した。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡをＤＭＳＯ中に、０．１Ｍの濃度に溶解し、そして−２０℃にてアリコート中に保存した。５‐ＦＵ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびＤＭＳＯを、試験培地中に直接的に希釈した。全ての化学物質を３倍希釈系列において試験し、最も高い濃度は：５‐ＦＵについて２７ＭＭ、サッカリンについて１ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて１００ＭＭであった。ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて、希釈系列はＤＭＳＯ中で行い、次いで希釈物を試験培地に添加して、最終試験濃度を得た。このことは、全ての試験したＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡ試験試行において０．１％の等価なＤＭＳＯ濃度を維持するためにおこなった。全ての実験を、少なくとも３回の独立した試行において行った。
【００７５】
ＩＣ５０値を、４パラメータのヒル関数をデータに近似することにより得た。全ての細胞型は５‐ＦＵに対して毒性反応を示し、そしてサッカリンに対しては毒性を何ら示さなかった（図３を参照のこと）。ＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞および前駆体細胞が、物質５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡに対して、ｈＦＦ細胞よりも非常に感受性であることを示した。前駆体細胞は、容易に培養されるｈＢＳ細胞型を表し、毒性物質に対するより高い感受性を維持しながら、酵素的継代を用いた大きな規模の培養を可能にする。
【００７６】
さらに重要なことに、未分化のｈＢＳ細胞に対するＡＴＲＡについてのＩＣ５０値は、１３ＣＲＡの値よりも高く、ＡＴＰアッセイにおいて、それぞれ、２５．７６μＭおよび１５．８５μＭ（図４を参照のこと）、ならびにレサズリンアッセイにおいて、それぞれ、１７．３１μＭおよび１４．５１μＭであった。同じ結果が、前駆体細胞について見出され、ここではＩＣ５０値は、ｈＦＦおよびｈＢＳ細胞に比較して劇的に減少され、ＡＴＲＡについて０．００２７μＭ、および１３ＣＲＡについて０．０００４μＭ、ならびにレサズリンアッセイにおいて、それぞれ、０．０００９μＭおよび０．００００２μＭであった。
【００７７】
多能性奇形腫Ｐ１９細胞に基づくマウス系において以前に報告された対応するＩＣ５０値（Ａｄｌｅｒら、２００５、遺伝子操作された奇形腫細胞において緑色蛍光タンパク質発現を使用することによる、分化誘導性の化学物質の検出、Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ．２００５ Ａｐｒ；３３（２）：９１‐１０３；Ａｄｌｅｒ論文（ｈｔｔｐ：／／ｗ３．ｕｂ．ｕｎｉｋｏｎｓｔａｎｚ．ｄｅ／ｖ１３／ｖｏｌｌｔｅｘｔｅ ／２００５／１６１９／／ｐｄｆ／Ａｄｌｅｒ．ｐｄｆ）は、それぞれ、０．００５μＭおよび０．３８μＭであり、すなわちマウス系は１２３倍で１３ＣＲＡを検出できない［（ＩＣ５０マウス（１３ＣＲＡ）／（ＩＣ５０マウス（ＡＴＲＡ））は、７６に等しく、すなわち０．３８／０．００５であり、一方（ＩＣ５０ヒト（１３ＣＲＡ）／（ＩＣ５０ヒト（ＡＴＲＡ））は０．６２に等しくすなわち、１５．８５／２５．７６である）。ヒトおよびマウスの比をそれぞれ比較すると、０．６２：７６は１２３倍に等しい。
【００７８】
表１：ヒト胚性幹（ｈＢＳ）細胞、ｈＢＳ ＭＰ、およびヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）についての評価項目として生存度を用いて得られた、試験した化学物質についての平均ＩＣ５０値。測定したパラメータは、ＡＴＰ含量およびレゾフリンへのレサズリンの還元であった。全ての実験を少なくとも３回の独立した試行において行った（ｎ≧３）
【００７９】
【表１】
【００８０】
２つの試験した細胞タイプ（ｈＢＳ細胞およびｈＦＦ）のＩＣ５０値の比較は、ｈＢＳ細胞が、物質５‐ＦＵ、ＡＴＲＡ、および１３ＣＲＡに対して、ｈＦＦ細胞よりも非常に感受性であることを示した（ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡについて、図４〜５を参照のこと）。多能性ｈＢＳ細胞が、ＡＴＲＡおよび１３ＣＲＡに対してｈＦＦよりもはるかに感受性であった。これらの知見は、生存度を測定した、公知の催奇形物質に対するマウス多能性細胞の、線維芽細胞培養物よりも高い感受性を実証する以前の結果（Ｌａｓｃｈｉｎｓｋｉら、１９９１）と一致する。さらに、１３‐ＣＲＡのＩＣ５０値は、本発明者らの試験系において、全ての試験した細胞型について、ＡＴＲＡの値よりも一貫して低かった。多能性マウス細胞に基づいた以前のインビトロ催奇形性試験アッセイにおいて、１３‐ＣＲＡは、ＡＴＲＡよりも明らかに低い細胞毒性および催奇形性能を示した（Ａｄｌｅｒら、２００５）。１３ＣＲＡは、マウス系において催奇形物質として分類されていないが、これはヒトにおいて強力な催奇形物質である。従って、本発明者らの結果は、ヒト発生毒物を検出するための、動物細胞に基づくアッセイを上回る、ヒト細胞ベースの試験系の利点を示す。
【００８１】
２つの細胞型ｈＢＳおよびｈＦＦについての、ＡＴＰ測定におけるＡＴＲＡと１３ＣＲＡとの間の比較について、図４をまた参照のこと。表２および表３は、それぞれ、ＡＴＰアッセイおよびレザスリンアッセイを用いて測定した、ＩＣ５０値間の比を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
評価項目の生存度についての、２つの異なる検出方法、ＡＴＰアッセイおよびレサズリンアッセイ、の統計学的比較が、表４において示される。
【００８５】
表４：評価項目の生存度についての２つの異なる検出方法の統計学的比較。測定したパラメータは、ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ）、ｈＢＳ、ＭＰ、およびヒト胚性幹（ｈＢＳ）細胞における化学物質での処理後のウェル当たりの細胞内ＡＴＰ含量およびレサズリン還元であった。濃度応答性曲線間の差異を、二方向ＡＮＯＶＡ検定を使用して統計学的に比較した（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５）。実験を、少なくとも３回の独立した試行において行った（ｎ２３）。
【００８６】
【表４】
【００８７】
ｈＢＳ細胞における、両方の検出法で得られた結果の類似性は、ｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰに比較して、それらのより低い増殖速度に起因し得る。さらに、他の細胞型に比較して、未分化のｈＢＳ細胞はより少ないミトコンドリアを含み、一方ミトコンドリアの数はそれらの分化の間に増加する（Ｃｈｏら、２００６）。従って、より低い増殖速度、ならびにより低い数のミトコンドリアは、ｈＢＳ細胞におけるＡＴＰアッセイとＲＥＳアッセイとの間の顕著でない差異についての説明を提供し、この差異は、非常に増殖性の、およびより多くのミトコンドリアを含むｈＦＦおよびｈＢＳ ＭＰにおいて増幅される。しかし、両方の検出技術は、ＩＣ５０値を同じ濃度範囲に与え、従って両方ともが、生存度を測定するのに適切である。
【実施例５】
【００８８】
胚毒性を決定するための物質のセットのスクリーニング
選択された多くの試験化合物を、マルチ‐ウェルフォーマット系において、ｈＢＳ細胞もしくは前駆体細胞、またはその組み合わせを使用して試験する。参照系として、異なる胚潜在性を伴う物質のセット、例えば、６〜１０個の物質を選択し、そして分析する。このセットは、非胚毒性、中程度の胚毒性から強力な胚毒性に及ぶ化学物質を含む。さらに、１つのネガティブなコントロール化合物（例えば、サッカリン）および１つのポジティブなコントロール化合物（例えば、５‐フルオロウラシル）を選択する。
【００８９】
参照物質および試験物質を、初期の分化、および中胚葉、内胚葉、および外胚葉への分化に関与されるタンパク質に対して指向される抗体、または遺伝子操作されたｈＢＳＣにおける胚葉特異的プロモータにより駆動される蛍光タンパク質の発現を含む試験プロトコルを使用して分析する。分析のための適切な時期が重要であり、それゆえ選択された発生毒性の評価項目の時間依存性の発現が確立される。試験プレートにおける蛍光シグナルを定量するために、ハイコンテントリーダーを用いる。
【００９０】
細胞毒性の評価項目について、ＩＣ５０値を評価し、これは細胞の５０％死滅を生じる化合物の濃度を記載する。発生毒性の評価項目から、ＩＤ５０値を算出し、これは選択したマーカーの５０％ダウンレギュレーションを導く物質の濃度を与える。これらの値を比較し、そして評価する。化学物質のインビトロ胚毒性を、各物質についてのＩＣ５０とＩＤ５０値との間の差異を評価することにより算定する。胚毒性物質について、ＩＣ５０値は明らかにＩＤ５０値よりも高い。これらの結果を用いて、参照物質および試験物質の順位付けは、公知のインビボデータに対する比較を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００９１】
【非特許文献１】Ａｄｌｅｒ Ｓ、Ｐａｐａｒｅｌｌａ Ｍ、Ｐｅｌｌｉｚｚｅｒ Ｃら、遺伝子操作された奇形腫細胞における緑色蛍光タンパク質発現を用いることによる、分化誘導性の化学物質の検出。実験動物に対する代替：ＡＴＬＡ、２００５；３３（２）：９１‐１０３。
【非特許文献２】欧州議会および諮問委員会のＡｎｏｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）第１９０７／２００６号。欧州委員会。ｈｔｔｐ：／／ｅｕｒｌｅｘ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ＬｅｘＵｒｉＳｅｒｖ／ｓｉｔｅ／ｅｎ／ｏｊ／２００６／ｌ＿３９６／ｌ＿３９６２００６１２３０ｅｎ０００１０８４９．ｐｄｆにて利用可能．２００７年８月７日に評価
【非特許文献３】Ｃｈｏ ＹＭ、Ｋｗｏｎ Ｓ、Ｐａｋ ＹＫら。ミトコンドリア生合成における動的変化およびヒト胚性幹細胞の自発的分化の間の抗酸化酵素。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００６；３４８（４）：１４７２‐８。
【非特許文献４】Ｄｅ Ｓｅｓｓｏ ＪＭ、Ｓｃｉａｌｌｉ ＡＲ、Ｇｏｅｒｉｎｇｅｒ ＧＬ。ニュージーランドホワイトウサギにおける５‐フルオロウラシル発生毒性の異常組織発生およびＴＴＩ、一炭素代謝の機能的なアナログ、によるその緩和における観察。Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、１９９５；５１、１７２。
【非特許文献５】Ｅｖａｎｓ ＳＭ、Ｃａｓａｒｔｅｌｌｉ Ａ、Ｈｅｒｒｅｒｏｓ Ｅら、非常に急性のインビボ毒性潜在性を予測するハイスループットインビトロ毒性スクリーニングの開発。Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ。２００１；１５（４‐５）：５７９‐８４。
【非特許文献６】Ｇｅｎｓｃｈｏｗ Ｅ、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ、Ｓｃｈｏｌｚ Ｇら、３つのインビトロ胚毒性試験における国際ＥＣＶＡＭ検証における胚性幹細胞試験の検証。実験動物に対する代替：ＡＴＬＡ、２００４：３２（３）：２０９‐４４。
【非特許文献７】Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＦ。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ。Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、２００３：７５０頁。
【非特許文献８】Ｇｅｎｓｃｈｏｗ Ｅ、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ、Ｓｃｈｏｌｚ Ｇら、３つのインビトロ胚毒性試験における国際ＥＣＶＡＭ検証研究における胚性幹細胞試験の検証。実験動物に対する代替：ＡＴＬＡ、２００４；３２（３）：２０９‐４４。
【非特許文献９】Ｈｅｉｎｓ Ｎ、Ｅｎｇｌｕｎｄ ＭＣ、Ｓｊｏｅｂｌｏｍ Ｃ、Ｄａｈｌ Ｕ、Ｔｏｎｎｉｎｇ Ａ、Ｂｅｒｇｈ Ｃ、Ｌｉｎｄａｈｌ Ａ、Ｈａｎｓｏｎ Ｃ、Ｓｅｍｂ Ｈ。「ヒト胚性幹細胞の誘導、特徴付け、および分化」。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００４；２２：３６７‐３７６。
【非特許文献１０】Ｌａｓｃｈｉｎｓｋｉ Ｇ、Ｖｏｇｅｌ Ｒ、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｈ。胚盤胞由来の正倍数性胚性幹細胞を使用する細胞毒性試験：インビトロ催奇形性スクリーニングに対する新規なアプローチ。Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．）、１９９１；５（１）：５７‐６４。
【非特許文献１１】Ｒｏｓｓ ＳＡ、ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ＰＪ、Ｄｒａｇｅｒ ＵＣら、胚発生におけるレチノイド。生理学的概説、２０００、８０（３）：１０２１‐５４。
【非特許文献１２】ＲＰＡ ｕｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｓｗｅｄｅｎ。化学部門における新規な規制のビジネス衝撃の見積もり。最終報告。欧州委員会企業総局のために用意された。Ｌｏｎｄｏｎ：ＲＰＡ．２００２；‐２１６ Ｓ。
【非特許文献１３】Ｓｏｐｒａｎｏ ＤＲおよびＳｏｐｒａｎｏ ＫＪ。催奇形物質としてのレチノイド。栄養学の年報、１９９５；１５：１１１‐３２。
【非特許文献１４】Ｓｔａｃｅｙ ＧＮ、Ｃｏｂｏ Ｆ、Ｎｉｅｔｏら、臨床等級のｈＥＳ細胞株の調製のための「支持」細胞の開発：課題および解決。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６；１２５（４）：５８３‐８。Ｅｐｕｂ
【非特許文献１５】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＪＤ、Ｇｏｌｂｕｓ ＭＳ、Ｍｉｌｌｅｒ ＴＲら、妊娠初期の間５‐フルオロウラシルに曝露された胎児における複数の先天性奇形。Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、１９８０；１５；１３７（６）：７４７‐９。
【特許文献】
【００９２】
【特許文献１】国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット、多能性ヒト胚盤胞由来の幹細胞株を確立する方法、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項２】
ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項３】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェル、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項４】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項５】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、
（ｉｉ）それぞれ、（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートのウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートにそれぞれ播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項６】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）マルチウェルフォーマットにおいてウェル当たり３，０００‐２０，０００個の細胞、より好ましくはウェル当たり１０，０００‐１５，０００細胞の、ヒト胚盤胞由来の幹細胞と、別個のウェル当たり１００‐５００個の細胞、より好ましくは別個のウェル当たり約２５０個の細胞の胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞、
（ｉｉ）細胞は、１つ以上の物質の１つ以上の濃度に曝露され、
（ｉｉｉ）効果が、細胞毒性および／または胚毒性の評価項目から分析される、アッセイ。
【請求項７】
中胚葉、内胚葉、または外胚葉の細胞型、例えば、線維芽細胞、心筋細胞様前駆体細胞、肝臓および膵臓の前駆体細胞、ならびに神経前駆体のような、胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づく、請求項２〜６に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項８】
毒性がヒト胚毒性のようなヒト分化毒性（発生中のヒト細胞に対して測定される）である、請求項２〜７に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項９】
インビトロ毒性アッセイであって、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞、ヒト前駆体細胞、およびヒト成熟様細胞からなる群より選択される、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、例えば少なくとも４つの、例えば少なくとも５つのヒト細胞型を含み、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項１０】
ヒト前駆体細胞がｈＢＳ‐ＭＰである、請求項３〜９に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイであって、ここで使用される細胞は、１５３９、３８４、９６、４８、２４、１２、または６ウェルフォーマットにおいてウェル当たり、１個の細胞〜１Ｍ個の細胞、好ましくは１，０００個〜１００，０００個、好ましくは１０，０００個〜３０，０００個、およびより好ましくは１０，０００個〜２０，０００個の範囲にある、インビトロ毒性アッセイ。
【請求項１２】
細胞が、１分間〜６０日間、好ましくは１分間〜３０日間、およびより好ましくは５〜１５日間の期間、物質とともにインキュベートされる、請求項１〜１１のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１３】
細胞が、１０日間の期間、物質とともにインキュベートされる、請求項１〜１２のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１４】
非ヒトアッセイが、マウス胚性幹細胞およびマウス奇形腫細胞を含む群から選択されるマウス細胞ベースのアッセイのような、インビトロアッセイである、請求項１〜１３のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１５】
非ヒトアッセイが、マウス、ラット、またはブタのようなインビボアッセイである、請求項１に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１６】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性の毒性を少なくとも２倍、より効果的に検出する、請求項１〜１５のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１７】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性を少なくとも１００倍、より効果的に検出する、請求項１〜１６のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１８】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性を少なくとも１２３倍、より効果的に検出する、請求項１〜１７のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１９】
ヒト成熟様アッセイに比較して、ヒト毒性を少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、より効果的に検出する、請求項１〜１８のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２０】
評価項目が細胞毒性である、請求項１〜１９のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２１】
評価項目が遺伝子および／またはタンパク質発現の分析のような、胚毒性特異的である、請求項１〜２０に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２２】
評価項目が比色法または蛍光光度法により測定される、請求項１〜２１のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２３】
レサズリン変換により毒性が可視化される、請求項１〜２２のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２４】
毒性がＡＴＰ含量分析により可視化される、請求項１〜２３のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２５】
ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、非ヒトアッセイに比較して１３ＣＲＡのヒト毒性をより効果的に検出する、アッセイ。
【請求項２６】
ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質のいくつかの濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）ＡＴＰ含量またはレサズリン変換を測定することにより分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
ある物質をスクリーニングする方法であって、以下
（ａ）（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、および（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された成熟ヒト細胞型、および必要に応じて（ｉｉｉ）（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）のマルチウェルプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体集団の組成物を得る工程；ならびに
（ｂ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；
（ｃ）次いで、細胞と、１つ以上の物質とを合わせる工程；ならびに
（ｄ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；
（ｅ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
物質をスクリーニングする方法であって、以下：ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞のウェル当たり３，０００個〜２０，０００個の細胞、およびより好ましくはウェル当たり１０，０００個〜１５，０００個の細胞からなる組成物を得る工程；ｉｉ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；次いで、ｉｉｉ）細胞と物質とを合わせる工程；ならびにｉｖ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３１】
物質をスクリーニングする方法であって、以下：ａ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞のウェル当たり１００個〜５，０００個の細胞、およびより好ましくはウェル当たり１００個〜５００個の細胞の組成物を得る工程；ｂ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；次いで、ｃ）細胞と物質とを合わせる工程；ならびにｄ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３２】
薬物発見および／または安全性評価試験における、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３３】
胚毒性および／または催奇形性の研究のための、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３４】
欧州ＲＥＡＣＨ法により特定される物質の評価のための、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３５】
請求項２６〜３１に記載されるような方法における使用のための、請求項１〜２５に記載のヒト毒性を検出するためのキットであって、該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル
（ｉｖ）（必要に応じて）媒体
を含む、キット。
【請求項３６】
請求項３５に記載のキットであって、該キットはさらに、前駆体細胞および成熟様細胞からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるヒト細胞型を含む、キット。
【請求項３７】
請求項２２〜２６に記載されるような方法における使用のための、請求項１〜２５に記載のヒトにおける毒性を検出するためのキットであって、該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル
（ｉｖ）（必要に応じて）媒体
を含む、キット。
【請求項１】
ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項２】
ヒトにおける毒性の検出および／または予測のための胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項３】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェル、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された、成熟ヒト細胞型
（ｉｉｉ）必要に応じて、それぞれ、（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）におけるマルチウェルの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項４】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートにそれぞれ播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、
（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチウェルプレートの別個のウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートに播種された、成熟ヒト細胞型、を含み、
但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項５】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、
（ｉｉ）それぞれ、（ｉ）における１つ以上のマルチウェルプレートのウェルに播種されたか、または１つ以上の別個のプレートにそれぞれ播種された、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する１つ以上の前駆体集団、を含み、但し、細胞に曝露されている１つ以上の物質の１つ以上の効果の測定を行う時点まで、播種する密度は、細胞が実質的にその増殖能力を維持することを許容する、アッセイ。
【請求項６】
インビトロ毒性アッセイであって、
（ｉ）マルチウェルフォーマットにおいてウェル当たり３，０００‐２０，０００個の細胞、より好ましくはウェル当たり１０，０００‐１５，０００細胞の、ヒト胚盤胞由来の幹細胞と、別個のウェル当たり１００‐５００個の細胞、より好ましくは別個のウェル当たり約２５０個の細胞の胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞、
（ｉｉ）細胞は、１つ以上の物質の１つ以上の濃度に曝露され、
（ｉｉｉ）効果が、細胞毒性および／または胚毒性の評価項目から分析される、アッセイ。
【請求項７】
中胚葉、内胚葉、または外胚葉の細胞型、例えば、線維芽細胞、心筋細胞様前駆体細胞、肝臓および膵臓の前駆体細胞、ならびに神経前駆体のような、胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞に基づく、請求項２〜６に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項８】
毒性がヒト胚毒性のようなヒト分化毒性（発生中のヒト細胞に対して測定される）である、請求項２〜７に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項９】
インビトロ毒性アッセイであって、ヒトにおける毒性の検出および／または予測のためのヒト胚盤胞由来の幹細胞、ヒト前駆体細胞、およびヒト成熟様細胞からなる群より選択される、少なくとも２つのヒト細胞型、例えば、少なくとも３つの、例えば少なくとも４つの、例えば少なくとも５つのヒト細胞型を含み、ここでアッセイは、ある物質についての毒性の新規な検出を可能にし、および／または非ヒトアッセイもしくは成熟ヒト細胞型に基づくアッセイに比較してより効果的に毒性を検出する、アッセイ。
【請求項１０】
ヒト前駆体細胞がｈＢＳ‐ＭＰである、請求項３〜９に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイであって、ここで使用される細胞は、１５３９、３８４、９６、４８、２４、１２、または６ウェルフォーマットにおいてウェル当たり、１個の細胞〜１Ｍ個の細胞、好ましくは１，０００個〜１００，０００個、好ましくは１０，０００個〜３０，０００個、およびより好ましくは１０，０００個〜２０，０００個の範囲にある、インビトロ毒性アッセイ。
【請求項１２】
細胞が、１分間〜６０日間、好ましくは１分間〜３０日間、およびより好ましくは５〜１５日間の期間、物質とともにインキュベートされる、請求項１〜１１のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１３】
細胞が、１０日間の期間、物質とともにインキュベートされる、請求項１〜１２のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１４】
非ヒトアッセイが、マウス胚性幹細胞およびマウス奇形腫細胞を含む群から選択されるマウス細胞ベースのアッセイのような、インビトロアッセイである、請求項１〜１３のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１５】
非ヒトアッセイが、マウス、ラット、またはブタのようなインビボアッセイである、請求項１に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１６】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性の毒性を少なくとも２倍、より効果的に検出する、請求項１〜１５のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１７】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性を少なくとも１００倍、より効果的に検出する、請求項１〜１６のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１８】
非ヒトアッセイに比較して、ヒト胚毒性を少なくとも１２３倍、より効果的に検出する、請求項１〜１７のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項１９】
ヒト成熟様アッセイに比較して、ヒト毒性を少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、より効果的に検出する、請求項１〜１８のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２０】
評価項目が細胞毒性である、請求項１〜１９のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２１】
評価項目が遺伝子および／またはタンパク質発現の分析のような、胚毒性特異的である、請求項１〜２０に記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２２】
評価項目が比色法または蛍光光度法により測定される、請求項１〜２１のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２３】
レサズリン変換により毒性が可視化される、請求項１〜２２のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２４】
毒性がＡＴＰ含量分析により可視化される、請求項１〜２３のいずれかに記載のインビトロ毒性アッセイ。
【請求項２５】
ヒトにおける毒性の検出のための、ヒト胚盤胞由来の幹細胞に基づくインビトロ毒性アッセイであって、非ヒトアッセイに比較して１３ＣＲＡのヒト毒性をより効果的に検出する、アッセイ。
【請求項２６】
ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
胚盤胞由来の幹細胞に由来するヒト前駆体細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質の１つ以上の濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）細胞毒性および／または胚毒性の評価項目を分析する工程
（ｉｖ）必要に応じて、公知のインビボ毒性データに相関する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
ヒト胚盤胞由来の幹細胞の１つ以上の集団をある物質に曝露することにより、該物質についてのヒトにおけるインビトロ毒性を検出および／または予測する方法であって、方法は、以下の工程
（ｉ）マルチウェルフォーマットプレート中に細胞を播種する工程
（ｉｉ）ある物質のいくつかの濃度に播種された細胞を曝露する工程
（ｉｉｉ）ＡＴＰ含量またはレサズリン変換を測定することにより分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
ある物質をスクリーニングする方法であって、以下
（ａ）（ｉ）１つ以上のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞、および（ｉｉ）（ｉ）におけるマルチプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のプレートの１つ以上のウェルに播種された成熟ヒト細胞型、および必要に応じて（ｉｉｉ）（ｉ）および／もしくは（ｉｉ）のマルチウェルプレートの別個のウェルに、または１つ以上の別個のマルチウェルプレートの１つ以上のウェルに播種されたヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体集団の組成物を得る工程；ならびに
（ｂ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；
（ｃ）次いで、細胞と、１つ以上の物質とを合わせる工程；ならびに
（ｄ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；
（ｅ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
物質をスクリーニングする方法であって、以下：ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞のウェル当たり３，０００個〜２０，０００個の細胞、およびより好ましくはウェル当たり１０，０００個〜１５，０００個の細胞からなる組成物を得る工程；ｉｉ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；次いで、ｉｉｉ）細胞と物質とを合わせる工程；ならびにｉｖ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３１】
物質をスクリーニングする方法であって、以下：ａ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞のウェル当たり１００個〜５，０００個の細胞、およびより好ましくはウェル当たり１００個〜５００個の細胞の組成物を得る工程；ｂ）必要に応じて、細胞を分化させるか、または細胞が分化することを許容する、工程；次いで、ｃ）細胞と物質とを合わせる工程；ならびにｄ）細胞に対する物質の任意の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３２】
薬物発見および／または安全性評価試験における、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３３】
胚毒性および／または催奇形性の研究のための、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３４】
欧州ＲＥＡＣＨ法により特定される物質の評価のための、請求項１〜２５に記載されるようなアッセイの使用。
【請求項３５】
請求項２６〜３１に記載されるような方法における使用のための、請求項１〜２５に記載のヒト毒性を検出するためのキットであって、該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル
（ｉｖ）（必要に応じて）媒体
を含む、キット。
【請求項３６】
請求項３５に記載のキットであって、該キットはさらに、前駆体細胞および成熟様細胞からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるヒト細胞型を含む、キット。
【請求項３７】
請求項２２〜２６に記載されるような方法における使用のための、請求項１〜２５に記載のヒトにおける毒性を検出するためのキットであって、該キットは、
（ｉ）ヒト胚盤胞由来の幹細胞に由来する前駆体細胞
（ｉｉ）（必要に応じて）ポジティブコントロール物質およびネガティブコントロール物質
（ｉｉｉ）使用者マニュアル
（ｉｖ）（必要に応じて）媒体
を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５０５３９９（Ｐ２０１０−５０５３９９Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０７９７（Ｐ２００９−５３０７９７）
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００８５７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０５３２
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０３０７１５９８）セルアーティス アーベー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００８５７６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４０５３２
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（５０３０７１５９８）セルアーティス アーベー (10)
【Ｆターム（参考）】
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