ヒト胚細胞系遺伝子構造を具えたヒト抗体構造及びその誘導フラグメント
【課題】 ヒト胚細胞系遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体構造及びその誘導フラグメントの提供。
【解決手段】 ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子構造を具えた新規ヒト抗体であって、それが個別で、或いは組み合わされてなる単株抗体が遺伝子組換えの可溶性ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）抗原と特異的に結合可能で、また、ＣＤ１５２表現を上昇する活性化周辺ヒトＴ細部との反応が可能である。
【解決手段】 ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子構造を具えた新規ヒト抗体であって、それが個別で、或いは組み合わされてなる単株抗体が遺伝子組換えの可溶性ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）抗原と特異的に結合可能で、また、ＣＤ１５２表現を上昇する活性化周辺ヒトＴ細部との反応が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系（ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトＣＤ１５２抗原と特異的結合可能で、ヒトＣＤ１５２抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応の目的を達成する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は血清或いは体液中に存在する一種の糖蛋白（ｇｌｉｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。早期の抗体の研究過程では抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）をマウスに注射した後にその抗体生成細胞を取得し、更にマウス骨髄腫細胞株と融合することにより長期に特定単一株免疫グロブリンを分泌できる融合腫（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）を創造する必要があった。しかし、マウス蛋白配列を有する抗体投薬は経常的に患者の免疫反応（ヒト抗マウス反応）を誘発しうる。このため、非ヒト配列を排除した完全なヒト抗体を製造する必要があり、それによってこそ臨床応用価値がある。この目的を達成するため、特許文献１にはヒト免疫グロブリン遺伝子をマウス単株抗体に移植することで、ヒト化抗体を獲得する方法が記載されている。図１は周知の抗体構造表示図であり、この抗体構造は、可変領域（１ａ）と定常領域（１ｂ）を包含する。該可変領域（１ａ）の内部にはそれぞれ三つの高度可変ドメイン（１ｆ）があり、該高度可変ドメインに抗原と結合可能なアミノ酸が満たされている。周知のヒト化マウス由来抗体はマウス由来の可変領域或いは高度可変ドメインを遺伝工程の方式でヒト抗体の骨格中に挿入する。この技術は少数の非ヒト配列の抗体しか含有せず、当時の最も先進の製品であって、後の治療性単株抗体の追従する標準となった。
【０００３】
ヒト化したマウス由来抗体は既に各種疾病の治療薬物として成功しており、特に呼吸融合ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）等の伝統的感染性疾病のような治療薬物とされている。但し最近ますます多くの抗体がその他の疾病、例えば自己免疫疾病及び悪性腫瘍例えば転移性乳ガン、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病等である場合に用いられるようになった。抗体はまた器官排斥予防或いは動脈整形時の凝血阻止に用いられる。但しこのようなヒト化抗体は多少のマウス配列を含有しているため、患者が使用後に経常的に副作用が発生し、軽ければ発熱、悪寒、偏頭痛、嘔吐、むかつき、吐瀉、低血圧、全身疼痛、心身疲労感を引き起し、重ければ厳重な排斥現象を引き起し患者を死亡させてしまう。
【０００４】
非ヒト配列を含有しない抗体を達成するため、すでに実験マウスの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子を遺伝工程の方式で置換して一組のヒトの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子となした後、抗原を使用してこのような遺伝子をマウスに移植して完全ヒト抗体を獲得することに成功した者がいる。但し実験マウス遺伝子空間は有限であり、全てのヒト抗体胚細胞系遺伝子をカバーすることはできず、軽鎖遺伝子ではヒトのκ胚細胞系遺伝子しか入れることはできず（非特許文献１）、このため生成できる抗体の多様反応性が制限される。特許文献２には具体的にヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに移植することにより有限な完全ヒト抗体を獲得する方法が記載されている。
【０００５】
非特許文献２及び３に記載されているように、本件発明者は１９９４年に体外定位免疫法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を開発し、ヒト周辺血を材料として完全ヒト抗体を取得している。近年、上述の従来の技術の欠点に対して、ヒトＣＤ１５２抗原を例として一系列の細心の技術を開発し、特許文献３にそれが記載されている。
【０００６】
本発明は、上述の体外定位免疫法と特許文献３に記載の技術に基づき、ヒトＣＤ１５２抗原を材料としてヒト胚細胞系アミノ酸構造を具備する新規ヒト抗体構造を鑑別し、異なるヒト血液固有の多様性、独特の体外培養技術と分子生物学方法を融合し、これにより新規構造の完全ヒト抗体を取得する。それはヒトＶＨ３及びＶλ胚細胞系遺伝子の独特の構造を具えているため、トランスジェニックマウスを使用しても獲得できない。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，０８９号明細書
【特許文献２】ＷＯ ０１／１４４２４号明細書
【特許文献３】台湾特許出願第０９３１２８３２８号
【非特許文献１】Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５６１，１９９５
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ ＬＴ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：４２８，１９９４
【非特許文献３】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：６５７，１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
図１に示されるように、１分子の抗体蛋白質は２本の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ）ポリペプチドと２本の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ）ポリペプチドで構成され、重鎖と軽鎖は更に可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を包含し、重鎖と軽鎖の可変領域が共同で光源結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を構成し、抗原と決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合可能であり、分子の抗体と二つの分子の抗原決定部位結合の最良の効果を達成できる。重鎖は定常領域により更に、μ、β、γ、δ、εの五種類に細分され、軽鎖はλとκの二種類を有する。抗体の遺伝子は多くのフラグメントで構成され、ヒト抗体を例に挙げると、κ軽鎖、λ軽鎖と重鎖の遺伝子はそれぞれ第２、第２２及び第１４染色体に位置する。図２に示されるように、抗原との結合に関係のある抗体可変領域は、それぞれＶ、（Ｄ）とＪ等の２〜３種類の胚細胞系遺伝子フラグメントで構成され、そのうち、Ｖ胚細胞系遺伝子の貢献度は最大で、これらのフラグメントが配列組合せの方式により、各種の抗体を生成する。Ｖ−（Ｄ）−Ｊ遺伝情報は並びにこのような組合せにより生成した抗体即ち胚細胞系抗体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と称される。現在既に重鎖の胚細胞系遺伝子がＶＨ１からＶＨ７の７大類型に分けられて軽鎖の胚細胞系遺伝子にλとκの二大類型があることが公認されている。
【０００９】
生理状態下で、胚細胞系抗体の「高度可変ドメイン」とその他の可変領域は続けて体細胞遺伝子の突然変異を進行し、不断に新たに修飾された抗体群及び新たな多様性を発生するのみならず、抗原と更に緊密に結合できる高親和力抗体を選択できる。本発明の主要な目的は、上述の胚細胞系抗体の特性を利用し、マウス由来抗体ヒト化の欠点を防止することにあり、ゆえに本発明はヒト胚細胞系抗体アミノ酸を再設計し、特にヒトＣＤ１５２抗原との結合の親和力を高める。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１の発明は、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントとしている。
請求項２の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子を具備し、ヒトＣＤ１５２抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項３の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項４の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系（ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトＣＤ１５２抗原と特異的結合可能で、ヒトＣＤ１５２抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応の目的を達成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上述の目的を達成するため、本発明は二種類の新規なヒト胚細胞系抗体アミノ酸の構造を提供する。この構造はそれぞれ重鎖アミノ酸配列（配列番号１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とされ、且つ図３及び図４に示されるように、両者はＶＨ３及びＶλ由来のヒト胚細胞系抗体アミノ酸配列である。
【００１３】
本発明の重鎖アミノ酸配列（配列番号１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，代表番号ＶＨｎｏｖｅｌ）に、図３を組み合わせた詳細な説明は、以下のようである。ＶＨｎｏｖｅｌのアミノ酸配列と全ての既知の抗体一級構造対比後にＶＨｎｏｖｅｌは遺伝子バンクデータベース登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）がＡＢ０１９４３９のＶＨ３−３０及びＶＨ３−３３の二種類のヒト胚細胞系抗体より誘導されたものであり、９８個のアミノ酸中に、僅かに１０個の差異がだけであることが分かった。
【００１４】
図４に示されるように、配列分析対比により、我々は本発明の軽鎖構造内容（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，代表番号ＶＬｎｏｖｅｌ）配列が、遺伝子バンクデータベース登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）がＢＡＣ０１１８、Ｓ７８０５８及びＣＡＡ３８３１３）等の三つのヒト胚細胞系Ｖλ軽鎖構造の抗体に対応し、これによりＶＬｎｏｖｅｌもＶλ軽鎖家族の一員であり、８９個のアミノ酸中に僅かに７個の差異があることが分かった。
【００１５】
前述の新規な配列構造はヒトＣＤ１５２抗原と専用に結合される（図５）。且つ前述の新規な構造は活性化（図６）されたヒトＴ細胞専用に作用し、ＣＤ１５２がＴ細胞活性化後に生成される蛋白質である事実が反映されている。
【００１６】
実施方式：
一．抗−ＣＤ１５２類抗体の生成
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）密度遠心（４００ｘｇ）方式で、献血者より分離した周辺血単核細胞を、ＣＤ４５ＲＯ ＭＡＣＳ マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）で磁気標定し、その後、ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）機器で分離する。すすいだＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞をフラスコ中で培養し、その密度は２×１０6 細胞／ミリリットルのＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＱTM；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、並びに１×不必要アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１０％ヒト血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン／カナマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ／ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び１０μｇ／ｍｌポケウィードミトゲン（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）（ＰＷＭ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充する。２４時間培養した後、細胞を４００ｘｇ遠心にかけ、並びに移出して上清を収集し、ＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞置換因子を製造し、０．４５ｍｍフィルタ膜で濾過し並びに摂氏−２０度で冷凍保存する。
このほか、磁性細胞除去技術で周辺血単核細胞内の体外免疫反応を抑制できるキラー細胞族群を除去する。コロイド超磁性マイクロビーズが単株抗マウスＣＤ８と抗−ＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と結合する用法は前述したとおりである。キラー細胞除去の周辺血単核細胞の体外でのツーステップ免疫法で免疫作用を進行する。一次免疫作用の進行は、細胞を１０ｎＭのＣＤ１５２抗原を含有する培養基で６日培養し、そのうち、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０％熱非活性化ヒト血清、０．０５ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び２５％（ｖ／ｖ）ＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞置換因子が含有される。第７日目に、一次免疫細胞を取り出し並びに４０％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅで遠心分離する。二次免疫反応に対して、３×１０7 個の細胞とＣＤ１５２抗原をフラスコ中で混合し、それは事前に５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４；Ｖｉｎｃｉ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｉｎｃｉ，Ｉｔａｌｙ）で固定する。細胞を３−５日培養し、その培養基に５％ヒト血清、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭ免疫抗原（ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ）を補充する。
体外免疫の細胞をその後にＥＢウイルスに感染させる。簡単に述べると、１０7 個のリンパ細胞と１ｍｌのＥＢウイルス含有の上清を摂氏３７度で２時間培養し、この上清はＥＢＶ発生のマーモセット細胞株Ｂ９５−８（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２；Ｔｒｉ−Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔａｉｐｅｉより提供）より誘導される。感染した細胞を１０5 ／孔の数量で、９６孔盤にシードし、並びにｍｙｔｏｍｙｃｉｎ（協和発酵，東京，日本）処理したＰＢＭＣをフィード細胞（１０4 ／孔）として加える。抗体特異性を酵素免疫分析法で確定する。
【００１７】
二．本発明の新規構造と組換えヒトＣＤ１５２抗原の結合性
図４は本発明の独特ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造と組換えヒトＣＤ１５２抗原の結合性を示す。酵素免疫分析法を使用し、まず室温で１μｇ／ｍｌの、ＢＨＫ細胞表現の組換えヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）−ｍｕＩｇ融合蛋白（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、１μｇ／ｍｌ単株マウスＩｇＧ２ａ（Ａｎｃｅｌｌ）、１０μｇ／孔の牛血清白蛋白（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）或いは破傷風類ウイルス（ＡＤＩｍｍｕｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｃｈｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）をマイクロ滴定盤上に塗布して一晩置く。新規構造抗体を０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ液、ｐＨ８．０で濃度が１μｇ／ｍｌとなるまで希釈する。塗布処理後の滴定盤を希釈した培養基上清で培養し、洗浄後に、過酸化酵素標定したヒトＩｇＧ或いはλ軽鎖を認識する山羊抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）でインキュベートし、１００μｌのクロモゲニック基質ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）を加えて現像する。３０分反応させた後、１Ｍ硫酸を加えて停止し、且つその発生する吸光を４９０ｎｍ下において判読する。図示されるように、本発明のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造は組換えヒトＣＤ１５２抗原と特異的に結合し、関係のない抗原と単株マウスＩｇＧ２ａ、牛血清白蛋白或いは破傷風ウイルスとは、いずれとも明らかな結合反応を認められない。
【００１８】
三．新規構造アミノ酸配列の鑑別
抗体新規構造はクローン非ＣＤ１５２特異性細胞よりｃＤＮＡ配列により得られる。簡単に述べると、２×１０4 個の組換えヒトＣＤ１５２抗原特異性反応を有する単株抗体分泌細胞より、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｄｙｊｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で、メーカーが提供するステップによりｍＲＮＡを抽出し、分離されたｍＲＮＡを直接ＲＴ−ＰＣＲ中に加えてテンプレートとなす。ＲＴ−ＰＣＲはＴｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用し行なう。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるように、反応に使用する二組のプライマーはヒト抗体遺伝子重鎖可変領域拡散配列中の第１組ＨｕＶＨＢａｃｋとＨｕＪＨＦＯＲを拡大でき、及びヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域拡散配列中の第２組ＨｕＶλＢａｃｋとＨｕＶλＦＯＲを拡大できる。ＲＴ−ＰＣＲは全部で３７個の循環拡大ステップを採用する。それぞれ摂氏９４度で２分間の第１サイクル、摂氏９４度で３分間、摂氏５１度で３０秒、及び摂氏６８度で１分間の第２から第３６サイクル、最終サイクルには摂氏６８度で１０分間の反応条件を使用する。
電気泳動で確定された単一族群に属するＤＮＡフラグメントをヌクレオチド配列する。ヌクレオチド類似物（ａｎａｌｏｇ）には３’−ヒドロキシ族がないために特定的にＤＮＡ鎖複製を終了できる原理により配列反応を行なう。類似物上に標定された異なる蛍光を、電気泳動を用いて長さの異なるフラグメントに分離し、レーザー色光で異なる蛍光を検出し、コンピュータでＤＮＡ配列を読み出す。得られた配列を更に確認（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＤＲ．Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）し並びにアミノ酸配列に変換する。
【００１９】
四．新規構造と活性化されたヒトＴ細胞作用
図５は本発明の特異ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の、フロー細胞分析機により測定した活性化されたヒトＴ細胞に対する反応性を示す。健康血液より分離した周辺血単核リンパ細胞を、４００ｘｇ密度遠心分離の方式でＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配上で分離する。細胞をその後リン酸ナトリウムバッファで二度洗浄し、並びに１００ｘｇ遠心分離し収集する。分離したリンパ細胞は濃度が５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＧＥ Ｈｅａｔｔｈ ｃａｒｅ）で刺激する。摂氏３７度の５％ＣＯ2 の湿った環境中で７２時間培養し、そのうちのヒトＴ細胞を活性化する。活性化Ｔ細胞の本発明のヒト抗体構造の反応を評価する。それは、活性化細胞を２００ｘｇで遠心分離し、更に冷たい８０％アルコールに懸濁させ、並びに激烈に振動、混合して最終密度が１×１０6 ／ｍｌとなるようにする。更に細胞を摂氏４度で少なくとも３０分間培養する。アルコールで固定した細胞をその後、遠心分離し並びに１μｇの本発明のヒト抗体構造或いは非関係対照ヒト抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）で１５分間作用させてＦＩＴＣ標定したマウス抗ヒト抗体（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で１５分間再作用させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ フロー細胞分析機にＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）でその反応比例を決定する。
【００２０】
上述の実施方式は本発明の説明のために提示されたものであり、本発明の主張する権利範囲はその特許請求の範囲の記載に準じ、上述の実施例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】周知の抗体蛋白質構造表示図である。
【図２】周知のヒト抗体遺伝子構造表示図である。
【図３】本発明のヒト抗体重鎖構造と既知のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の比較図である。
【図４】本発明のヒト抗体軽鎖構造と既知のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の比較図である。
【図５】本発明のヒト抗体構造を連続１０倍希釈した後に酵素免疫分析法で測定したヒトＣＤ１５２抗原に対する反応性吸光度表示図である。
【図６】本発明のヒト抗体構造のフロー細胞分析機で測定したヒト活性化Ｔ細胞に対する反応性表示図である。
【符号の説明】
【００２２】
１１ 可変領域 １２ 軽鎖
１３ 定常領域 １４ 重鎖
１５ 高度可変ドメイン １７ Ｓ−Ｓ結合
２０ カッパ（κ）軽鎖 ２２ ラムダ（λ）軽鎖
２４ 重鎖
３０ 重鎖第１ボーンフレームドメイン ３１ 重鎖第１高度可変ドメイン
３２ 重鎖第２ボーンフレームドメイン ３３ 重鎖第２高度可変ドメイン
３４ 重鎖第３ボーンフレームドメイン １〜９８ 重鎖アミノサン順序
※： 上列アミノ酸形式と同じ
４０ 軽鎖第１ボーンフレームドメイン ４１ 軽鎖第１高度可変ドメイン
４２ 軽鎖第２ボーンフレームドメイン ４３ 軽鎖第２高度可変ドメイン
４４ 重鎖第３ボーンフレームドメイン １〜８９ 軽鎖アミノサン順序
● ヒトＣＤ１５２抗原 □ 単株マウスＩｇＧ２ａ
◇ 牛血清白蛋白 ▲ 破傷風ウイルス
６０ 非関係対照ヒト抗体と未活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６２ 新規構造と未活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６４ 非関係対照ヒト抗体と活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６６ 新規構造と活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系（ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトＣＤ１５２抗原と特異的結合可能で、ヒトＣＤ１５２抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応の目的を達成する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は血清或いは体液中に存在する一種の糖蛋白（ｇｌｉｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。早期の抗体の研究過程では抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）をマウスに注射した後にその抗体生成細胞を取得し、更にマウス骨髄腫細胞株と融合することにより長期に特定単一株免疫グロブリンを分泌できる融合腫（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）を創造する必要があった。しかし、マウス蛋白配列を有する抗体投薬は経常的に患者の免疫反応（ヒト抗マウス反応）を誘発しうる。このため、非ヒト配列を排除した完全なヒト抗体を製造する必要があり、それによってこそ臨床応用価値がある。この目的を達成するため、特許文献１にはヒト免疫グロブリン遺伝子をマウス単株抗体に移植することで、ヒト化抗体を獲得する方法が記載されている。図１は周知の抗体構造表示図であり、この抗体構造は、可変領域（１ａ）と定常領域（１ｂ）を包含する。該可変領域（１ａ）の内部にはそれぞれ三つの高度可変ドメイン（１ｆ）があり、該高度可変ドメインに抗原と結合可能なアミノ酸が満たされている。周知のヒト化マウス由来抗体はマウス由来の可変領域或いは高度可変ドメインを遺伝工程の方式でヒト抗体の骨格中に挿入する。この技術は少数の非ヒト配列の抗体しか含有せず、当時の最も先進の製品であって、後の治療性単株抗体の追従する標準となった。
【０００３】
ヒト化したマウス由来抗体は既に各種疾病の治療薬物として成功しており、特に呼吸融合ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）等の伝統的感染性疾病のような治療薬物とされている。但し最近ますます多くの抗体がその他の疾病、例えば自己免疫疾病及び悪性腫瘍例えば転移性乳ガン、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病等である場合に用いられるようになった。抗体はまた器官排斥予防或いは動脈整形時の凝血阻止に用いられる。但しこのようなヒト化抗体は多少のマウス配列を含有しているため、患者が使用後に経常的に副作用が発生し、軽ければ発熱、悪寒、偏頭痛、嘔吐、むかつき、吐瀉、低血圧、全身疼痛、心身疲労感を引き起し、重ければ厳重な排斥現象を引き起し患者を死亡させてしまう。
【０００４】
非ヒト配列を含有しない抗体を達成するため、すでに実験マウスの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子を遺伝工程の方式で置換して一組のヒトの免疫グロブリン胚細胞系遺伝子となした後、抗原を使用してこのような遺伝子をマウスに移植して完全ヒト抗体を獲得することに成功した者がいる。但し実験マウス遺伝子空間は有限であり、全てのヒト抗体胚細胞系遺伝子をカバーすることはできず、軽鎖遺伝子ではヒトのκ胚細胞系遺伝子しか入れることはできず（非特許文献１）、このため生成できる抗体の多様反応性が制限される。特許文献２には具体的にヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに移植することにより有限な完全ヒト抗体を獲得する方法が記載されている。
【０００５】
非特許文献２及び３に記載されているように、本件発明者は１９９４年に体外定位免疫法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を開発し、ヒト周辺血を材料として完全ヒト抗体を取得している。近年、上述の従来の技術の欠点に対して、ヒトＣＤ１５２抗原を例として一系列の細心の技術を開発し、特許文献３にそれが記載されている。
【０００６】
本発明は、上述の体外定位免疫法と特許文献３に記載の技術に基づき、ヒトＣＤ１５２抗原を材料としてヒト胚細胞系アミノ酸構造を具備する新規ヒト抗体構造を鑑別し、異なるヒト血液固有の多様性、独特の体外培養技術と分子生物学方法を融合し、これにより新規構造の完全ヒト抗体を取得する。それはヒトＶＨ３及びＶλ胚細胞系遺伝子の独特の構造を具えているため、トランスジェニックマウスを使用しても獲得できない。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，０８９号明細書
【特許文献２】ＷＯ ０１／１４４２４号明細書
【特許文献３】台湾特許出願第０９３１２８３２８号
【非特許文献１】Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５６１，１９９５
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ ＬＴ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：４２８，１９９４
【非特許文献３】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：６５７，１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
図１に示されるように、１分子の抗体蛋白質は２本の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ）ポリペプチドと２本の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ）ポリペプチドで構成され、重鎖と軽鎖は更に可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を包含し、重鎖と軽鎖の可変領域が共同で光源結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を構成し、抗原と決定部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合可能であり、分子の抗体と二つの分子の抗原決定部位結合の最良の効果を達成できる。重鎖は定常領域により更に、μ、β、γ、δ、εの五種類に細分され、軽鎖はλとκの二種類を有する。抗体の遺伝子は多くのフラグメントで構成され、ヒト抗体を例に挙げると、κ軽鎖、λ軽鎖と重鎖の遺伝子はそれぞれ第２、第２２及び第１４染色体に位置する。図２に示されるように、抗原との結合に関係のある抗体可変領域は、それぞれＶ、（Ｄ）とＪ等の２〜３種類の胚細胞系遺伝子フラグメントで構成され、そのうち、Ｖ胚細胞系遺伝子の貢献度は最大で、これらのフラグメントが配列組合せの方式により、各種の抗体を生成する。Ｖ−（Ｄ）−Ｊ遺伝情報は並びにこのような組合せにより生成した抗体即ち胚細胞系抗体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と称される。現在既に重鎖の胚細胞系遺伝子がＶＨ１からＶＨ７の７大類型に分けられて軽鎖の胚細胞系遺伝子にλとκの二大類型があることが公認されている。
【０００９】
生理状態下で、胚細胞系抗体の「高度可変ドメイン」とその他の可変領域は続けて体細胞遺伝子の突然変異を進行し、不断に新たに修飾された抗体群及び新たな多様性を発生するのみならず、抗原と更に緊密に結合できる高親和力抗体を選択できる。本発明の主要な目的は、上述の胚細胞系抗体の特性を利用し、マウス由来抗体ヒト化の欠点を防止することにあり、ゆえに本発明はヒト胚細胞系抗体アミノ酸を再設計し、特にヒトＣＤ１５２抗原との結合の親和力を高める。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１の発明は、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントとしている。
請求項２の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子を具備し、ヒトＣＤ１５２抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項３の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
請求項４の発明は、請求項１記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明はヒト抗体の新規なヒト胚細胞系遺伝子配列構造に関する。その提示する配列は側鎖或いは特別に定義されるアミノ酸配列を含有せず、特にヒト胚細胞系（ｈｕｍａｎ ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子構造を具えた新規なヒト抗体を指し、それはヒトＣＤ１５２抗原と特異的結合可能で、ヒトＣＤ１５２抗原異常に関係がある疾病の診断或いは治療に用いられる時に、有効に異種抗体の免疫性を低減し、抗体利用率を増し患者の副作用を減らすとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応の目的を達成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上述の目的を達成するため、本発明は二種類の新規なヒト胚細胞系抗体アミノ酸の構造を提供する。この構造はそれぞれ重鎖アミノ酸配列（配列番号１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、軽鎖アミノ酸配列（配列番号２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とされ、且つ図３及び図４に示されるように、両者はＶＨ３及びＶλ由来のヒト胚細胞系抗体アミノ酸配列である。
【００１３】
本発明の重鎖アミノ酸配列（配列番号１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，代表番号ＶＨｎｏｖｅｌ）に、図３を組み合わせた詳細な説明は、以下のようである。ＶＨｎｏｖｅｌのアミノ酸配列と全ての既知の抗体一級構造対比後にＶＨｎｏｖｅｌは遺伝子バンクデータベース登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）がＡＢ０１９４３９のＶＨ３−３０及びＶＨ３−３３の二種類のヒト胚細胞系抗体より誘導されたものであり、９８個のアミノ酸中に、僅かに１０個の差異がだけであることが分かった。
【００１４】
図４に示されるように、配列分析対比により、我々は本発明の軽鎖構造内容（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，代表番号ＶＬｎｏｖｅｌ）配列が、遺伝子バンクデータベース登録番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）がＢＡＣ０１１８、Ｓ７８０５８及びＣＡＡ３８３１３）等の三つのヒト胚細胞系Ｖλ軽鎖構造の抗体に対応し、これによりＶＬｎｏｖｅｌもＶλ軽鎖家族の一員であり、８９個のアミノ酸中に僅かに７個の差異があることが分かった。
【００１５】
前述の新規な配列構造はヒトＣＤ１５２抗原と専用に結合される（図５）。且つ前述の新規な構造は活性化（図６）されたヒトＴ細胞専用に作用し、ＣＤ１５２がＴ細胞活性化後に生成される蛋白質である事実が反映されている。
【００１６】
実施方式：
一．抗−ＣＤ１５２類抗体の生成
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）密度遠心（４００ｘｇ）方式で、献血者より分離した周辺血単核細胞を、ＣＤ４５ＲＯ ＭＡＣＳ マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）で磁気標定し、その後、ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）機器で分離する。すすいだＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞をフラスコ中で培養し、その密度は２×１０6 細胞／ミリリットルのＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＱTM；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、並びに１×不必要アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１０％ヒト血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン／カナマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ／ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び１０μｇ／ｍｌポケウィードミトゲン（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）（ＰＷＭ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充する。２４時間培養した後、細胞を４００ｘｇ遠心にかけ、並びに移出して上清を収集し、ＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞置換因子を製造し、０．４５ｍｍフィルタ膜で濾過し並びに摂氏−２０度で冷凍保存する。
このほか、磁性細胞除去技術で周辺血単核細胞内の体外免疫反応を抑制できるキラー細胞族群を除去する。コロイド超磁性マイクロビーズが単株抗マウスＣＤ８と抗−ＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と結合する用法は前述したとおりである。キラー細胞除去の周辺血単核細胞の体外でのツーステップ免疫法で免疫作用を進行する。一次免疫作用の進行は、細胞を１０ｎＭのＣＤ１５２抗原を含有する培養基で６日培養し、そのうち、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０％熱非活性化ヒト血清、０．０５ｎｇ／ｍｌ ｒＩＬ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び２５％（ｖ／ｖ）ＣＤ４５ＲＯ+ Ｔ細胞置換因子が含有される。第７日目に、一次免疫細胞を取り出し並びに４０％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅで遠心分離する。二次免疫反応に対して、３×１０7 個の細胞とＣＤ１５２抗原をフラスコ中で混合し、それは事前に５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４；Ｖｉｎｃｉ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｉｎｃｉ，Ｉｔａｌｙ）で固定する。細胞を３−５日培養し、その培養基に５％ヒト血清、５０μＭ ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭ免疫抗原（ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ）を補充する。
体外免疫の細胞をその後にＥＢウイルスに感染させる。簡単に述べると、１０7 個のリンパ細胞と１ｍｌのＥＢウイルス含有の上清を摂氏３７度で２時間培養し、この上清はＥＢＶ発生のマーモセット細胞株Ｂ９５−８（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２；Ｔｒｉ−Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔａｉｐｅｉより提供）より誘導される。感染した細胞を１０5 ／孔の数量で、９６孔盤にシードし、並びにｍｙｔｏｍｙｃｉｎ（協和発酵，東京，日本）処理したＰＢＭＣをフィード細胞（１０4 ／孔）として加える。抗体特異性を酵素免疫分析法で確定する。
【００１７】
二．本発明の新規構造と組換えヒトＣＤ１５２抗原の結合性
図４は本発明の独特ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造と組換えヒトＣＤ１５２抗原の結合性を示す。酵素免疫分析法を使用し、まず室温で１μｇ／ｍｌの、ＢＨＫ細胞表現の組換えヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）−ｍｕＩｇ融合蛋白（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、１μｇ／ｍｌ単株マウスＩｇＧ２ａ（Ａｎｃｅｌｌ）、１０μｇ／孔の牛血清白蛋白（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）或いは破傷風類ウイルス（ＡＤＩｍｍｕｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｃｈｕｎｇ，Ｔａｉｗａｎ）をマイクロ滴定盤上に塗布して一晩置く。新規構造抗体を０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ液、ｐＨ８．０で濃度が１μｇ／ｍｌとなるまで希釈する。塗布処理後の滴定盤を希釈した培養基上清で培養し、洗浄後に、過酸化酵素標定したヒトＩｇＧ或いはλ軽鎖を認識する山羊抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）でインキュベートし、１００μｌのクロモゲニック基質ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）を加えて現像する。３０分反応させた後、１Ｍ硫酸を加えて停止し、且つその発生する吸光を４９０ｎｍ下において判読する。図示されるように、本発明のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造は組換えヒトＣＤ１５２抗原と特異的に結合し、関係のない抗原と単株マウスＩｇＧ２ａ、牛血清白蛋白或いは破傷風ウイルスとは、いずれとも明らかな結合反応を認められない。
【００１８】
三．新規構造アミノ酸配列の鑑別
抗体新規構造はクローン非ＣＤ１５２特異性細胞よりｃＤＮＡ配列により得られる。簡単に述べると、２×１０4 個の組換えヒトＣＤ１５２抗原特異性反応を有する単株抗体分泌細胞より、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｄｙｊｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）で、メーカーが提供するステップによりｍＲＮＡを抽出し、分離されたｍＲＮＡを直接ＲＴ−ＰＣＲ中に加えてテンプレートとなす。ＲＴ−ＰＣＲはＴｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用し行なう。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるように、反応に使用する二組のプライマーはヒト抗体遺伝子重鎖可変領域拡散配列中の第１組ＨｕＶＨＢａｃｋとＨｕＪＨＦＯＲを拡大でき、及びヒト抗体遺伝子軽鎖可変領域拡散配列中の第２組ＨｕＶλＢａｃｋとＨｕＶλＦＯＲを拡大できる。ＲＴ−ＰＣＲは全部で３７個の循環拡大ステップを採用する。それぞれ摂氏９４度で２分間の第１サイクル、摂氏９４度で３分間、摂氏５１度で３０秒、及び摂氏６８度で１分間の第２から第３６サイクル、最終サイクルには摂氏６８度で１０分間の反応条件を使用する。
電気泳動で確定された単一族群に属するＤＮＡフラグメントをヌクレオチド配列する。ヌクレオチド類似物（ａｎａｌｏｇ）には３’−ヒドロキシ族がないために特定的にＤＮＡ鎖複製を終了できる原理により配列反応を行なう。類似物上に標定された異なる蛍光を、電気泳動を用いて長さの異なるフラグメントに分離し、レーザー色光で異なる蛍光を検出し、コンピュータでＤＮＡ配列を読み出す。得られた配列を更に確認（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＤＲ．Ｃｈｉｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）し並びにアミノ酸配列に変換する。
【００１９】
四．新規構造と活性化されたヒトＴ細胞作用
図５は本発明の特異ヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の、フロー細胞分析機により測定した活性化されたヒトＴ細胞に対する反応性を示す。健康血液より分離した周辺血単核リンパ細胞を、４００ｘｇ密度遠心分離の方式でＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配上で分離する。細胞をその後リン酸ナトリウムバッファで二度洗浄し、並びに１００ｘｇ遠心分離し収集する。分離したリンパ細胞は濃度が５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＧＥ Ｈｅａｔｔｈ ｃａｒｅ）で刺激する。摂氏３７度の５％ＣＯ2 の湿った環境中で７２時間培養し、そのうちのヒトＴ細胞を活性化する。活性化Ｔ細胞の本発明のヒト抗体構造の反応を評価する。それは、活性化細胞を２００ｘｇで遠心分離し、更に冷たい８０％アルコールに懸濁させ、並びに激烈に振動、混合して最終密度が１×１０6 ／ｍｌとなるようにする。更に細胞を摂氏４度で少なくとも３０分間培養する。アルコールで固定した細胞をその後、遠心分離し並びに１μｇの本発明のヒト抗体構造或いは非関係対照ヒト抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）で１５分間作用させてＦＩＴＣ標定したマウス抗ヒト抗体（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で１５分間再作用させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ フロー細胞分析機にＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）でその反応比例を決定する。
【００２０】
上述の実施方式は本発明の説明のために提示されたものであり、本発明の主張する権利範囲はその特許請求の範囲の記載に準じ、上述の実施例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】周知の抗体蛋白質構造表示図である。
【図２】周知のヒト抗体遺伝子構造表示図である。
【図３】本発明のヒト抗体重鎖構造と既知のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の比較図である。
【図４】本発明のヒト抗体軽鎖構造と既知のヒト胚細胞系抗体アミノ酸構造の比較図である。
【図５】本発明のヒト抗体構造を連続１０倍希釈した後に酵素免疫分析法で測定したヒトＣＤ１５２抗原に対する反応性吸光度表示図である。
【図６】本発明のヒト抗体構造のフロー細胞分析機で測定したヒト活性化Ｔ細胞に対する反応性表示図である。
【符号の説明】
【００２２】
１１ 可変領域 １２ 軽鎖
１３ 定常領域 １４ 重鎖
１５ 高度可変ドメイン １７ Ｓ−Ｓ結合
２０ カッパ（κ）軽鎖 ２２ ラムダ（λ）軽鎖
２４ 重鎖
３０ 重鎖第１ボーンフレームドメイン ３１ 重鎖第１高度可変ドメイン
３２ 重鎖第２ボーンフレームドメイン ３３ 重鎖第２高度可変ドメイン
３４ 重鎖第３ボーンフレームドメイン １〜９８ 重鎖アミノサン順序
※： 上列アミノ酸形式と同じ
４０ 軽鎖第１ボーンフレームドメイン ４１ 軽鎖第１高度可変ドメイン
４２ 軽鎖第２ボーンフレームドメイン ４３ 軽鎖第２高度可変ドメイン
４４ 重鎖第３ボーンフレームドメイン １〜８９ 軽鎖アミノサン順序
● ヒトＣＤ１５２抗原 □ 単株マウスＩｇＧ２ａ
◇ 牛血清白蛋白 ▲ 破傷風ウイルス
６０ 非関係対照ヒト抗体と未活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６２ 新規構造と未活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６４ 非関係対照ヒト抗体と活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
６６ 新規構造と活性化のヒトＴ細胞作用のフロー細胞分析図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメント。
【請求項２】
請求項１記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子を具備し、ヒトＣＤ１５２抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体。
【請求項３】
請求項１記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
【請求項４】
請求項１記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
【請求項１】
ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメントであって、その重鎖アミノ酸配列と軽鎖アミノ酸配列がヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子より誘導されたものであることを特徴とする、ヒトＣＤ１５２抗原との結合特性を具えたヒト抗体或いはその誘導フラグメント。
【請求項２】
請求項１記載のヒト抗体において、ヒト胚細胞系ＶＨ３とＶλ遺伝子を具備し、ヒトＣＤ１５２抗原表現過多或いは不足に関係する疾病の診断又は治療に用いられるとともに、自己抗原ＣＤ１５２との反応を達成することを特徴とする、ヒト抗体。
【請求項３】
請求項１記載のヒト抗体において、重鎖アミノ酸配列と配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
【請求項４】
請求項１記載のヒト抗体において、軽鎖アミノ酸配列と配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）のアミノ酸配列順序が少なくとも７０％の配列同一性を有することを特徴とする、ヒト抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−３２７９３７（Ｐ２００６−３２７９３７Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４８９３１（Ｐ２００５−１４８９３１）
【出願日】平成１７年５月２３日（２００５．５．２３）
【出願人】（５０５１８８７５５）
【出願人】（５０５１８８７７７）
【出願人】（５０５１８８７８８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２３日（２００５．５．２３）
【出願人】（５０５１８８７５５）
【出願人】（５０５１８８７７７）
【出願人】（５０５１８８７８８）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]