ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、及びヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット
【課題】生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを正確かつ簡便に測定する方法、該方法に好適な検出用ポリペプチド及び測定キットの提供。
【解決手段】反応溶液に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと生体試料と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、検出用ポリペプチドと特異的抗体との結合体を形成し、当該結合体中の検出用ポリペプチド量を測定する工程と、反応溶液に、検出用ポリペプチドと濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と特異的抗体とを添加して検出用ポリペプチドと特異的抗体との結合体を形成し、当該結合体中の検出用ポリペプチド量を測定し、反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と結合体中の検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、得られた相関に基づき、前記工程で測定された検出用ポリペプチド量から、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出する工程と、を有するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法。
【解決手段】反応溶液に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと生体試料と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、検出用ポリペプチドと特異的抗体との結合体を形成し、当該結合体中の検出用ポリペプチド量を測定する工程と、反応溶液に、検出用ポリペプチドと濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と特異的抗体とを添加して検出用ポリペプチドと特異的抗体との結合体を形成し、当該結合体中の検出用ポリペプチド量を測定し、反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と結合体中の検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、得られた相関に基づき、前記工程で測定された検出用ポリペプチド量から、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出する工程と、を有するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａの安定型であるＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ３ａは、血中の体液性免疫成分である補体の一種であり、Ｃ５ａとともに、アナフィラトキシンと呼ばれている分子量９０００、７８アミノ酸からなるタンパク質である。１９７５年にＴｏｎｙ Ｅ．らによってクローニングされた分子であり、感染症や炎症性疾患に罹患することにより、血中濃度が上昇することが報告されている。近年、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ；Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いた解析により、大腸癌等の特定の種類の癌患者において、血中のＣ３ａ濃度が上昇することが報告されており、血液中の疾患マーカーとしても期待されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。
【０００３】
Ｃ３ａは、巨大な補体成分のＣ３から、古典経路（Ｃ１酵素）又はレクチン経路（ＭＡＳＰ酵素）によって、それぞれ切り出されて産生されるタンパク質の、αへリックスの一部である。このため、Ｃ３を認識せず、Ｃ３ａのみを特異的に認識する抗体の作製は非常に困難であり、Ｃ３とＣ３ａを免疫学的方法で区別して、検出・定量することは難しかった。その後、Ｃ３ａは、血液中において、Ｃ末端のアルギニンが欠損した状態（Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ）で最も安定に存在することがわかった。そこで、Ｂｕｒｇｅｒらは、このＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａのＣ末端の８アミノ酸（アミノ酸一文字表記でＲＡＳＨＬＧＬＡ）をエピトープとし、これにキャリアタンパク質ＫＬＨを付加させたものを抗原として動物に免疫し、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａに特異的な抗体を作成することに成功した（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａの測定法としては、前述の８アミノ酸からなるペプチドをエピトープとしてマウスに免疫して作製された抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体（Ｈ４５３）を用いたｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法が報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。この方法では、まず、抗Ｃ３ａポリクローナル抗体をプレートに固相化し、この固相化された抗Ｃ３ａポリクローナル抗体に、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを結合させた後、洗浄する。その後、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３をプレート中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａに結合させた後、洗浄し、さらに、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３と結合させる。洗浄後、ペルオキシダーゼの基質の発色を測定することにより、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を測定することができる。このｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３を一次抗体として用いることにより、Ｃ３ａの前駆体であるＣ３との交差性がなく、血漿等の生体試料中の１〜５ｎｇ／ｍｌ濃度のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを検出し定量することが可能であった。また、近年では、さらにステップを簡略化され、例えば、Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）等のように、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体をマルチウェルプレートに固相化し、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体にてｓａｎｄｗｉｃｈし、ＨＲＰの基質ＴＭＢの発色により、試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを検出するキットが市販されている。これらの市販のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出キットの感度は、一般的に０．２〜１．１ｎｇ／ｍｌと良好である。
【０００５】
これらのｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、固相化した第１抗体と試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとの抗原抗体反応、及びこれにより得られた複合体中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと第２抗体との抗原抗体反応の２回の抗原抗体反応が必要である。通常、十分な精度の検査をするためには、１回の抗原抗体反応には、１時間程度の反応時間とその後の洗浄工程を要する。つまり、上記ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、１時間の抗原抗体反応と洗浄工程を２回ずつ要することから、計３時間程度を要する。
【０００６】
一方で、血液試料中には、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａだけではなく、血中に存在するＣ３とセリンプロテアーゼの両方が含まれている。このため、血液試料を室温でインキュベーションした場合には、セリンプロテアーゼにより、血液試料中のＣ３からＣ３ａが生じ、すぐさま内因性の血清カルボキシペプチダーゼＮにてＣ末端のアルギニンが除去されＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが生じるため、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が時間経過に伴い増大することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。つまり、約３時間程度の測定時間を要するｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、測定中に試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が上昇している可能性が高く、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を正確に測定するために、より迅速な測定法の開発が求められている。
【０００７】
より短時間の測定が可能となるように、測定法のステップを簡略化する方法としては、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと競合的に結合する人工物質を用いた免疫的測定法がある。例えば、トレーサーとして１２５Ｉを用いて標識したＣ３ａ（１２５Ｉ−Ｃ３ａ）を用いた競合的放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）によるＣ３ａ測定法では、抗Ｃ３ａポリクローナル抗体を固相化し、１２５Ｉ−Ｃ３ａと結合させる。この結合を血液試料中のＣ３ａが阻害し、この阻害作用により生じた遊離の１２５Ｉ−Ｃ３ａ量を測定することにより、高感度に（例えば、６ｎｇ／ｍｌ、０．６６ｎＭ）血液試料中のＣ３ａ量を測定することが可能である（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
安全性の観点から、近年、放射性同位体の利用が避けられるようになっており、放射免疫測定に換えて、発色反応等のより安全な検出方法を利用した測定方法も開発されている。例えば、Ａｓｓａｙｄｅｓｉｇｎ社のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡキットのように、トレーサーとしてアルカリフォスファターゼ標識した全長のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを用いるキットも市販されている。この方法では、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａポリクローナル抗体に、アルカリフォスファターゼ標識した全長のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが結合することに対し、生体試料中に存在するＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが競合的に阻害することを利用し、アルカリフォスファターゼの基質の発色を検出することによって、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する。
【０００９】
これらの競合的ＥＬＩＳＡ法では、２種類の抗体によりＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａをｓａｎｄｗｉｃｈする必要がないため、抗原抗体反応ステップと洗浄ステップをそれぞれ一つずつ除くことが可能であり、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩSＡ法よりも短時間で測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５０９４０９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ヘイバーマン（Habermann）、外１６名、ガストロエンテロロジー（GASTROENTEROLOGY）、２００６年、第１３１巻、１０２０〜１０２９ページ。
【非特許文献２】バーガー（Burger）、外４名、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（The Journal of Immunology）、１９８８年、第１４１巻、５５３〜５５８ページ。
【非特許文献３】モルネス（Mollnes）、外２名、クリニカル・エクスペリメンタル・イミュノロジー（Clinical and Experimental Immunology）、１９８８年、第７３巻、４８４〜４８８ページ。
【非特許文献４】ハック（Hack）、外６名、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Journal of Immunological Methods）、１９８８年、第１０８巻、７７〜８４ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記の競合的ＥＬＩＳＡ法においても、１時間程度の抗原抗体反応の反応時間とその後の洗浄工程が必要であり、依然として、計１．５〜２時間程度の測定時間を要するため、測定時間の迅速化は十分ではない、という問題がある。
さらに、トレーサーとして、Ｃ３ａ又はＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを標識したものを用いているが、これらのタンパク質に対して、抗体に対する特異性を維持したまま標識を行うことは困難である、という問題がある。さらに、これらのタンパク質を、測定前まで安定に保つことも難しい、という問題もある。
【００１３】
本発明は、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａを測定する方法であって、生体内において安定的に存在し得るＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを正確かつ簡便に測定する方法、並びに、該方法に好適なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド及び測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、競合的免疫測定方法において、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａのＣ末端の８アミノ酸からなるペプチドをＣ末端に有し、かつＮ末端アミノ酸残基に標識を行ったポリペプチド又はＮ末端アミノ酸同士を結合させたポリペプチドをトレーサーとして用いて、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと該ポリペプチドとを競合的に結合させることにより、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１） 競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する方法であって、（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を算出する工程と、を有し、前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであり、前記競合用ポリペプチドが、ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドであることを特徴とするヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド、
（２） 前記工程（１ａ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であり、かつ、前記工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間と等しいことを特徴とする前記（１）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（３） 前記（ｐ１）又は（ｐ３）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（４） 前記（ｐ２）又は（ｐ４）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（５） 前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）であり、前記工程（ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程、（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドとヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程、（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程、（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程、
（６） 前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
【００１６】
（７） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ１）又は（ｐ２）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、吸光度法による濁度測定により行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（８） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記いずれかのポリペプチドであることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｐ’１）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ’２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド、
（９） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応により結合させたものであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応、（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応、（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応、
（１０） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１１） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、並びに、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチドであることを特徴とする前記（１０）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１２） 前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする前記（１０）又は（１１）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１３） 前記標識物質が蛍光物質であり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする前記（１２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１４） 前記一分子蛍光分析法が蛍光相関分光法（ＦＣＳ）であることを特徴とする前記（１３）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１５） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うものであり、前記標識物質が酵素又は放射性同位体であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１６） 前記標識物質がアルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、酵素反応によって生じる前記酵素の基質の変化による発色又は発光を検出することを特徴とする前記（１５）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
【００１７】
（１７） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（１８） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（１９） ９〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はＮ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする前記（１７）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２０） ８〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする前記（１８）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２１） 配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２２） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２３） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種のポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２４） 前記ポリペプチド同士の結合が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応によるものであることを特徴とする前記（２３）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド；（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応、（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応、（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応、
（２５） 前記（１８）又は（２０）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２６） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士の結合が、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応によるものであることを特徴とする前記（２５）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
【００１８】
（２７） 生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するためのキットであって、前記（１７）〜（２６）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチド、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体、並びに、濃度既知のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法を用いることにより、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で簡便に測定することができる。すなわち、測定に要する時間が短時間で済むため、測定中の時間経過に伴うＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量の上昇の影響を抑えることができ、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量をより正確に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】参考例１において、測定試料中の抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度と拡散時間との関係を示した図である。
【図２】参考例２において、測定試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物濃度と拡散時間との関係を示した図である。
【図３】実施例１において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを混合した各溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの濃度が０ｎＭである溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値を差し引いた値（△ＯＤ（６００ｎｍ）値）を示した図である。
【図４】実施例２において、各試料の拡散時間から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【図５】比較例１において、各試料のＯＤ（４５０ｎｍ）値から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【図６】比較例２において、各試料のＯＤ（４５０ｎｍ）値から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法」ということがある。）は、競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ３ａ濃度を測定する方法であって、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド」ということがある。）をトレーサーとする競合的免疫反応を利用した方法であり、前記Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであることを特徴とする。
（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ１）」ということがある。）。
（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ２）」ということがある。）。
（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ３）」ということがある。）。
（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ４）」ということがある。）。
（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ５）」ということがある。）。
（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ６）」ということがある。）。
【００２２】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、前記ポリペプチド（ｐ１）〜（ｐ６）に示すように、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有するポリペプチドである。配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ」ということがある。）のＣ末端の８アミノ酸（アミノ酸一文字表記でＲＡＳＨＬＧＬＡ）に相当する。前述したように、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端の８アミノ酸は、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体（以下、「抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体」ということがある。）のエピトープであり、したがって、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、このＣ末端領域において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合する。
【００２３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法においては、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合して抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合するトレーサーとして、全長のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇタンパク質（配列番号６）ではなく、該抗体のエピトープを含むポリペプチドを用いることにより、合成の手間が簡便であり、比較的安価に調製することができる。このようなポリペプチドは、一般的に汎用されているペプチド合成機を用いて合成することが可能である。また、標識物質により標識する場合にも、タンパク質に比べて簡便かつ効率よく標識することが可能である。つまり、測定全体にかかる費用を抑えることが可能である。さらに、タンパク質よりもポリペプチドのほうが比較的安定であるため、より測定間の誤差等を低減させることができる。
【００２４】
＜ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）＞
前記ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合部位である配列番号１のアミノ酸配列をＣ末端に有しているポリペプチド同士が結合したものであり、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２以上有する多価のポリペプチドである。なお、本発明において、多価ポリペプチドとは、特定の物質との結合領域を、一分子に２以上有するポリペプチドを意味する。
【００２５】
システイン残基は、側鎖に反応性の高いＳＨ基を有するため、ポリペプチド同士を架橋させた多価ポリペプチドを作製しやすい。また、ポリペプチドのＮ末端の一級アミン（α−アミノ基）も、比較的反応性が高く、このため、当該アミノ基を介することにより、当該ポリペプチドを他の物質等（例えば、リガンドや他のポリペプチド等）と比較的容易に結合させることができる。しかしながら、ポリペプチド中のＳＨ基やアミノ基を介して２以上のポリペプチドを結合させるにあたって、当該ポリペプチドの配列内部にＳＨ基や一級アミン、特にリジン残基の側鎖のアミノ基がある場合には、Ｎ末端よりもエピトープ部位に近いこれらのＳＨ基やアミノ基において架橋反応が生じてしまい、エピトープの認識障害が起る可能性がある。
【００２６】
これに対して、ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域をＣ末端に有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基又はＮ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドである。このため、Ｃ末端側のエピトープ部位の認識障害が生じにくく、ポリペプチド同士を結合させて得られる多価ポリペプチドであるにも関わらず、精度良く抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合することができる。
【００２７】
具体的には、前記ポリペプチド（ｐ１）は、前記ポリペプチド（ｐ３）同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチドであり、前記ポリペプチド（ｐ２）は、前記ポリペプチド（ｐ４）同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドである。なお、本発明及び本願明細書において、「Ｎ末端のシステイン残基を介して結合する」とは、システイン残基の側鎖（例えば、ＳＨ基）を介して結合するものと、Ｎ末端のアミノ基を介して結合するもののいずれをも含む。すなわち、ポリペプチド（ｐ１）としては、ポリペプチド（ｐ３）同士を、それぞれのシステイン残基の側鎖同士を介して結合した多価ポリペプチドであってもよく、ポリペプチド（ｐ３）同士を、それぞれのＮ末端のアミノ基同士を介して結合した多価ポリペプチドであってもよく、一ポリペプチド（ｐ３）のシステイン残基の側鎖と他方のポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のアミノ基とを結合させた多価ポリペプチドであってもよい。
【００２８】
ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）を得るための、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士の結合方法としては、当該ポリペプチド同士が不可逆的に結合されたものであってもよく、可逆的に結合されたものであってもよい。可逆的な結合としては、例えば、ポリペプチドのＮ末端のシステイン残基のＳＨ基、Ｎ末端の一級アミンのアミノ基、Ｎ末端にリジン残基を有する場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基等にリガンドを結合させた２以上のポリペプチドと、２以上の前記リガンドと特異的に結合する受容体との結合反応により、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士を可逆的に結合したものであってもよい。このようなリガンドと受容体としては、タンパク質やポリペプチドの標識に一般的に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、リガンドとしてビオチンを、受容体としてストレプトアビジンを用いることにより、４価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に４つ有する）ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。その他、１のビーズに２以上の受容体を結合させたものを用いることによっても、ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。
【００２９】
また、ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基同士を共有結合により結合させる等により、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士を、不可逆的に結合させることによっても、ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基同士を共有結合により結合させる反応は、特に限定されるものではなく、有機合成の分野で公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。
【００３０】
例えば、ポリペプチド（ｐ３）のシステイン残基のＳＨ基同士をＳ−Ｓ結合（架橋反応）により、２価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２つ有する）ポリペプチド（ｐ１）を作製することができる。また、ポリペプチド内にリジン残基を有していないポリペプチド（ｐ３）同士を結合させる場合には、一のポリペプチド（ｐ３）のＮ末端の一級アミンであるアミノ基と、他のポリペプチド（ｐ３）のＳＨ基との架橋反応により互いに結合させることにより、多価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２つ以上有する）ポリペプチド（ｐ１）を作成することができる。その他、やはり、ポリペプチド内にリジン残基を有していないポリペプチド（ｐ３）の場合には、例えば、複数のポリペプチド（ｐ３）を、マレイミドとアミン反応性基を有する架橋剤としてＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を用いて、マレイミドヒンジ法等によって架橋させることにより、Ｎ末端のシステイン残基のＳＨ基とアミノ基を架橋させた、多価のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドを得ることもできる。
【００３１】
また、ポリペプチド（ｐ４）同士のＮ末端のアミノ基同士を共有結合により結合させる方法としては、例えば、一のポリペプチドのＮ末端の一級アミンであるアミノ基又はＮ末端のアミノ酸残基がリジン残基である場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基とリガンドとを結合させたポリペプチド（ｐ４）同士を、２以上のリガンドと結合可能な受容体と結合させることにより、ポリペプチド（ｐ２）を作製することができる。
【００３２】
一般的に、システイン残基を含むポリペプチドを汎用されているペプチド合成法により合成した場合には、通常、ポリペプチド中のＳＨ基同士が架橋した２価以上の多価ポリペプチドが得られる。ＳＨ基が単独で存在している状態よりも、ＳＨ基同士が架橋した状態のほうが安定であるためである。したがって、ポリペプチド（ｐ３）を汎用されているペプチド合成法により合成して得られるポリペプチドは、特別な処理等をすることなく、そのままポリペプチド（ｐ１）として用いることができる。
【００３３】
その他、ポリペプチド（ｐ３）を汎用されているペプチド合成法により合成して得られるＳＨ基同士が結合したポリペプチドに対して還元剤を作用させてＳ−Ｓ結合を切断した後に、マレイミドヒンジ法等により架橋させるという、比較的簡単な作業により、ポリペプチド（ｐ１）を得ることもできる。
【００３４】
ポリペプチド（ｐ１）としては、後述するポリペプチド（ｐ３）同士をＮ末端のシステイン残基を介して結合させた多価ポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜４１アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることが好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜２０アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがより好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがさらに好ましい。特に、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＮ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチドは、塩基性に富むため、凝集性が良好であり、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法が、後述するように凝集系において行われる場合にも好適である。
【００３５】
ポリペプチド（ｐ２）としては、後述するポリペプチド（ｐ４）同士をＮ末端のアミノ基を介して結合させた多価ポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜４１アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることが好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００３６】
＜ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）＞
前記ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合部位である配列番号１のアミノ酸配列をＣ末端に有しているポリペプチドであり、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に１つ有する一価のポリペプチドである。
【００３７】
ポリペプチド（ｐ３）としては、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン残基を付加した配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列と、Ｎ末端のシステイン残基との間にさらにアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
同様に、ポリペプチド（ｐ４）としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末側に、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するアミノ酸配列をさらに付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００３８】
ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）の長さは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（エピトープ部位）と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しない長さであれば特に限定されるものではなく、アミノ酸配列の種類、後述する標識物質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。ポリペプチド（ｐ３）としては、９〜４１アミノ酸であることが好ましく、９〜２８アミノ酸であることがより好ましく、９〜２１アミノ酸であることがさらに好ましく、２０アミノ酸であることが特に好ましい。一方、ポリペプチド（ｐ４）としては、８〜４１アミノ酸であることが好ましく、８〜２０アミノ酸であることがより好ましく、２０アミノ酸であることがさらに好ましい。
【００３９】
なお、Ｃ末端の８アミノ酸以外のアミノ酸配列は、特に限定されるものではなく、適宜設計したアミノ酸配列であってもよく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ（配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質）中のアミノ酸配列であってもよい。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長アミノ酸配列（配列番号２）中の配列の一部を有するポリペプチドを用いることにより、生体内に存在しない人工的なアミノ酸配列を有する合成ペプチドを用いた場合に起こる生体反応等の影響について考慮することなく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを測定することができる。特に、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのように、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのアミノ酸配列中のシステイン残基を先頭としたアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることにより、該システイン残基をそのまま、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）}のＮ末端のシステイン残基として利用することができる。
【００４０】
具体的には、ポリペプチド（ｐ３）としては、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることが好ましく、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドであることがより好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端にシステイン残基を１個のみ有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列とＮ末端のシステイン残基の間に、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側９〜１９アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列のみを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００４１】
一方、ポリペプチド（ｐ４）としては、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はＣ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドであることがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００４２】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドが、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして好適である理由は明らかではないが、以下のように推察される。これらのポリペプチドは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体のエピトープであるＣ末端の８アミノ酸からなる領域（エピトープ部位）が最も親水性に富むため、その他の部分がエピトープを包埋させることがなく、トレーサーとして感度よく働くことが可能となる。また、抗原抗体反応は、一般的に水溶液中で行われるが、これらのポリペプチドは容易に水に溶解するため、特別な緩衝液による調整の必要がないという利点もある。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、特に、配列番号１、３及び４からなる群より選択される１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがより好ましい。
【００４３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが特に好ましい。配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのアミノ酸配列中のシステイン残基を先頭としたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの部分ペプチドであるため、合成ペプチドを用いた場合に起こる生体反応等の影響を考慮しなくてもよい。また、Ｎ末端のシステイン残基をそのまま、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのＮ末端のシステイン残基として利用することができる。また、Ｎ末端にのみシステイン残基を有し、かつアミノ酸配列中にリジン残基を有していないため、ＳＨ基を介した結合反応と、アミノ基を介した結合反応のいずれの反応を用いても、Ｎ末端に標識物質を結合させることができる。さらに、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｃ末側のエピトープ部位が最も親水性が高いため、反応溶液中において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が非常に高く、このため、当該ポリペプチドをＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして用いた場合には、より短時間のアッセイで、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００４４】
＜ポリペプチド（ｐ５）及びポリペプチド（ｐ６）＞
ポリペプチド（ｐ５）は、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端を標識物質で標識したポリペプチドであり、ポリペプチド（ｐ６）は、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端を標識物質で標識したポリペプチドである。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、前記ポリペプチド（ｐ５）又はリペプチド（ｐ６）のように、標識物質が結合したものであることが好ましい。当該標識物質を指標として、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの検出・測定を容易に行うことができるためである。
【００４５】
具体的には、ポリペプチド（ｐ５）は、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドである。一方、ポリペプチド（ｐ６）は、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドである。このように、Ｎ末端のアミノ酸残基に標識物質を結合させることにより、標識物質による立体障害が生じにくく、Ｃ末端の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（エピトープ部位）と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合が阻害されにくい。すなわち、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、エピトープ認識障害を十分に抑制しつつ、標識物質を結合させることができる。
【００４６】
ポリペプチド（ｐ３）は、システイン残基をＮ末端アミノ酸残基として１個のみ有しているポリペプチドであり、システイン残基は、側鎖に反応性の高いＳＨ基を有する。このため、ポリペプチド（ｐ３）への標識物質の結合を、システイン残基のＳＨ基を介して行うことによって、当該ポリペプチドのＮ末端にのみ標識物質が結合されたポリペプチドを、効率よく作製することができる。
【００４７】
システイン残基の側鎖に標識物質を結合させる反応としては、システイン残基（主にＳＨ基）と標識物質とを結合させる場合に一般的に用いられている結合反応のいずれであってもよい。例えば、ポリペプチドのシステイン残基のＳＨ基と、標識物質等のＳＨ基又はアミノ基との架橋反応であってもよく、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基又はアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応であってもよい。このようなリガンドと受容体としては、タンパク質やポリペプチドの標識に一般的に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、リガンドとしてビオチンを、受容体としてストレプトアビジンを挙げることができる。本発明においては、ポリペプチド（ｐ５）としては、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基のＳＨ基とマレイミド化された標識物質とを結合させたポリペプチドであることが好ましい。
【００４８】
一方、ポリペプチド（ｐ４）は、リジン残基を有さないポリペプチド又はリジン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドである。リジン残基は、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸の中でも比較的反応性の高いアミノ酸残基である。このようなリジン残基を有さない、又はＮ末端に１個のみ有することにより、当該ポリペプチド中で十分な反応性を有するアミノ基は、Ｎ末端のアミノ酸の一級アミンのみとすることができる。このため、ポリペプチド（ｐ４）への標識物質の結合を、アミノ基を介して結合させる反応により行うことによって、当該ポリペプチドのＮ末端にのみ標識物質が結合されたポリペプチド（ｐ６）を、効率よく作製することができる。
【００４９】
アミノ基に標識物質を結合させる反応としては、アミノ基と標識物質とを結合させる場合に一般的に用いられている結合反応のいずれであってもよい。例えば、ポリペプチドのＮ末端のアミノ基（Ｎ末端のアミノ酸残基がリジン残基である場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基であってもよい）と、標識物質等のＳＨ基との架橋反応であってもよく、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応であってもよい。本発明においては、ポリペプチド（ｐ６）としては、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ酸の一級アミンとＮＨＳエステル化された標識物質とを結合させたポリペプチドであることが好ましい。
【００５０】
このように、Ｎ末端の一級アミン又はシステイン残基が有するＳＨ基と、標識物質とを反応させることにより、ポリペプチドに標識物質を付加するための官能基を別途設ける必要がなく、簡便に標識物質と結合したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを得ることができる。中でも、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）又はポリペプチド（ｐ４）}と標識物質との結合は、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸の一級アミンとＮＨＳエステル化された標識物質との結合、又はＮ末端のシステイン残基のＳＨ基とマレイミド化された標識物質を介した結合であることが好ましい。
【００５１】
ポリペプチド（ｐ５）としては、前述したポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであることが好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであることがより好ましい。
【００５２】
ポリペプチド（ｐ６）としては、前述したポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであることが好ましく、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであることがより好ましい。
【００５３】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）又はポリペプチド（ｐ４）}に結合させる標識物質としては、通常ポリペプチドの標識に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではなく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの測定方法等を考慮して適宜選択して用いることができる。このような標識物質として、例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位体、化学発光物質、及び磁気物質等がある。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識物質としては、蛍光物質、酵素、放射性同位体、化学発光物質等であることが好ましく、蛍光物質又は酵素であることがより好ましい。
【００５４】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる化学発光物質としては、ルミノール等のように無機反応により発光する物質であってもよく、ルシフェリン、セランテラジン等の酵素によって触媒される発光物質であってもよい。
【００５５】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる酵素としては、酵素反応を利用した標的物質の検出等において、特に、抗原抗体反応の検出において、通常用いられている酵素から適宜選択して用いることができる。このような酵素として、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等がある。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる酵素としては、アルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであることが好ましい。
【００５６】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものでなく、ペプチドやタンパク質等の標識において通常用いられている蛍光物質から適宜選択して用いることができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、Ｃｙ ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、Ａｔｔｏ ｄｙｅシリーズ（Ａｔｔｏ ｔｅｃ社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ユーロピウム等の希土類錯体等がある。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合に対する影響を抑えることができるため、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。特に、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発する色素であることが好ましい。このように退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの測定時における光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した測定結果を得ることができる。
【００５７】
＜Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法＞
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に供される生体試料は、ヒトＣ３ａを含有することが期待できる生体試料、すなわち、ヒト由来の生体試料であれば、特に限定されるものではない。該生体試料として、例えば、ヒトから採取された、血液、骨髄液、リンパ液、唾液、腹水、滲出液、喀痰、精液、胆汁、膵液、羊膜液、糞便、尿、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、又は膀胱洗浄液等が挙げられる。本発明においては、生体試料は、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。Ｃ３の分解により生体試料中のＣ３ａ量は変動しやすいため、採取後に生体試料を保存する場合には、冷凍保存又は冷蔵保存であることが好ましく、冷凍保存であることがより好ましい。
【００５８】
また、該生体試料は、ヒトから採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該試料中に含有されているヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料等に対してなされている調製方法を行うことができる。該調製方法として、例えば、粘液等の洗浄除去や、生理食塩水等を用いた希釈、細胞性構成要素の分離又は濃縮等がある。なお、生体試料の希釈液としては、セリンプロテアーゼ阻害剤等を含有するバッファー等を用いることが好ましい。
【００５９】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に供される生体試料としては、特に、定期健診や診断等のためにヒトから採取された血液、血清、血漿、リンパ液、骨髄液、及びこれらの希釈液等であることが好ましく、血液、血清、血漿等であることがより好ましく、血清であることがさらに好ましい。
【００６０】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法において用いられる抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと結合し得る抗体であって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端の８アミノ酸をエピトープとし、Ｃ３と交差しない抗体であれば、特に限定されるものではなく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抗体（ａｂｃａｍ社製）等の市販の抗体を用いてもよく、非特許文献２に記載の方法に準じて製造されたものであってもよい。
【００６１】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、具体的には、下記の工程（１ａ）〜（１ｆ）を有する。
（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、
（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ度を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００６２】
まず、工程（１ａ）として、反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体（以下、「検出用ポリペプチド含有結合体」ということがある。）を形成した後、工程（１ｂ）として、工程（１ａ）において得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。
【００６３】
反応溶液中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が多いほど、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量が少なくなる。つまり、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量は、反応溶液中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量に依存して、すなわち、生体試料中に含まれていたヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量に依存して変動する。
【００６４】
そこで、反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量と、形成された検出用ポリペプチド含有結合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量との相関関係を調べ、得られた相関に基づいて、生体試料中に含まれていたヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量を算出することができる。
【００６５】
前記相関は、具体的には、工程（１ｃ）として、工程（１ａ）とは別の反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体（検出用ポリペプチド含有結合体）を形成した後、工程（１ｄ）として、工程（１ｃ）において得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定し、さらに工程（１ｅ）として、工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させる。その後、工程（１ｆ）として、工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が算出されることにより、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００６６】
競合用ポリペプチドとは、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと識別可能なものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同様に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を競合的に阻害し得るポリペプチドであれば特に限定されるものではない。このような競合用ポリペプチドとしては、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチド等が挙げられる。用いられるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが、標識物質で結合されたものである場合には、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと同じアミノ酸配列からなる未標識のポリペプチドであることが好ましい。その他、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドからＮ末端のシステイン残基が欠損した未標識のポリペプチドであってもよい。
【００６７】
工程（１ｃ）においては、濃度既知の競合用ポリペプチド溶液を反応溶液に添加することにより、反応溶液中の競合用ポリペプチドの濃度又は量が算出できる。そこで、この算出された競合用ポリペプチドの濃度又は量と、工程（１ｄ）で測定された当該反応溶液中の検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とから、両者を相関させることができる。なお、本発明において、反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度と当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させるとは、当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定値から、大凡の反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度が推定できるものであればよく、複数の濃度の競合用ポリペプチド溶液を用いて測定することにより、競合用ポリペプチドによる阻害曲線を作成し、これを検量線として相関を決定するものであってもよく、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液のみを用いて測定することにより、いわゆる基準値を決定する半定量的なものであってもよい。
【００６８】
例えば、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液を段階的に希釈した複数の希釈溶液を、それぞれ別個の反応溶液に添加し、当該反応溶液中の検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度（又は量）と測定された当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とから、両者の相関関係を近似する検量線を作成することができる。この作成された検量線に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出することができる。なお、工程（１ｃ）において、複数の競合用ポリペプチド溶液に対して反応を行う場合には、各競合用ポリペプチド溶液における反応の反応時間等の条件が等しいことを要する。
【００６９】
また、例えば、工程（１ｃ）において、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液を反応溶液に添加し、工程（１ｄ）において、得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定した場合には、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定値が、工程（１ｄ）において得られた測定値よりも小さい場合には、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、工程（１ｃ）において調製した反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度未満であり、逆に、工程（１ｄ）において得られた測定値以上である場合には、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、工程（１ｃ）において調製した反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度以上であることが求められる。
【００７０】
なお、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度をより精確に求めるために、工程（１ｃ）における反応溶液中において検出用ポリペプチド含有結合体を形成させる反応は、工程（１ａ）における反応とほぼ同じ条件であることが好ましい。ここで、当該反応は、反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの種類と濃度、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の種類と濃度、反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とに影響を受ける。このため、工程（１ａ）と工程（１ｃ）は、同種の、好ましくは同じロットのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドや抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を用いることが好ましく、工程（１ａ）における反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド及び抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度は、工程（１ｃ）における反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド及び抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度と等しいことが好ましい。さらに、工程（１ｂ）における測定と工程（１ｄ）における測定とは、同じ測定方法により行うことを要する。
【００７１】
特に、工程（１ａ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しいことが好ましい。
【００７２】
工程（１ａ）と工程（１ｃ）を行う順番は特に限定されるものではなく、工程（１ａ）を行った後に工程（１ｃ）を行ってもよく、工程（１ｃ）を行った後に工程（１ａ）を行ってもよく、両者を同時に行ってもよい。さらに、工程（１ａ）と工程（１ｃ）を一連の操作として行ってもよく、独立して別個に行ってもよい。
【００７３】
また、一の生体試料に対して工程（１ａ）及び（１ｂ）を行うごとに、工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行うことにより、より精度よく当該生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００７４】
一方、反応条件を整えた実験系であれば、実験ごとの測定値の変動は小さい。このため、生体試料ごとに工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行う必要はなく、既に同じ反応条件において工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行って求められている、反応溶液中の競合用ポリペプチドと検出用ポリペプチド含有結合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量との相関（例えば、前述の検量線や基準値）を利用して、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出することもできる。
【００７５】
本発明においては、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、競合的に結合させることができればよく、三者を同時に反応させてもよく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを反応させ、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との複合体を形成させた後に、当該複合体に対してＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを反応させてもよく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとを反応させた後に、形成された検出用ポリペプチド含有結合体とヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを反応させてもよい。
【００７６】
本発明においては、予め形成された生体試料由来ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との複合体に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを反応させることが好ましい。具体的には、前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）からなり、工程（１ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）からなる方法である。
（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドとヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成する工程。
（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成する工程。
【００７７】
工程（１ａ）及び（１ｃ）と同様に、工程（１ａ’−１）における生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合反応と、工程（１ｃ’−１）における競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体との結合反応とは、同じ反応条件で行うことが好ましい。特に、工程（１ａ’−１）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇａと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ’−１）における反応溶液中の競合用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しく、かつ工程（１ａ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しいことが好ましい。
【００７８】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法においては、抗原抗体反応の時間、すなわち、反応溶液中の生体試料由来ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと、当該抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。抗原抗体反応に要する時間が短時間であるほど、生体試料中のＣ３の分解等によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量の変動の影響を低減することができるためである。
【００７９】
具体的には、工程（１ａ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。
また、工程（１ａ’−１）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、前記工程（１ａ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間との和が３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。
【００８０】
得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定方法は、特に限定されるものではなく、一般的に２種類の物質の相互作用を、定量的又は半定量的に測定するために用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。
【００８１】
例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして、ポリペプチド（ｐ１）やポリペプチド（ｐ２）のような多価ポリペプチドを用いた場合には、検出用ポリペプチド含有結合体は凝集体として形成される。そこで、この生じた凝集体量を、一般的に抗原抗体反応による凝集を検出する際に用いられる免疫比濁法等を用いて測定することにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。
【００８２】
また、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして、ポリペプチド（ｐ５）やポリペプチド（ｐ６）のような標識された一価のポリペプチドを用いた場合には、当該標識物質から発されるシグナル又は標識物質により発されるシグナルを検出することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。例えば、標識物質が蛍光物質である場合には、該蛍光物質から発される蛍光強度を測定することにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。一方、標識物質が酵素である場合には、該酵素の基質や酵素反応により呈色する物質等を添加し、酵素反応によって変換された色素量等を測定することにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。なお、これらの蛍光強度や色素量等の定量的又は半定量的測定は、分光光度計を用いた測定法等の常法により行うことができる。
【００８３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、固相法のアッセイ系でも行うことができる。例えば、ビーズ等の担体に固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に、生体試料を接触させることにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させた後、標識物質により標識された所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と競合的に結合させる。ここで、固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に、生体試料と標識されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとを同時に接触させて、反応させてもよい。 測定試料毎にあらかじめ定めた時間が経過した後、ビーズ等の担体を洗浄して遊離の（未結合の）Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを除去する。そして、担体に固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に結合したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識物質から発されるシグナル又は標識物質により発されるシグナルを検出することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。
【００８４】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、洗浄工程を要しないホモジニアスなアッセイ系であること、すなわち、前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることが好ましい。ホモジニアスなアッセイ系を用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等の試薬を混ぜるだけの単一ステップによる迅速な測定が可能となる。また、データのばらつきの原因の一つである洗浄工程がないため、短時間でデータを得られるのみならず、ばらつきの少ないより信頼性の高い測定結果が得られる。さらに、工程が少ないため、作業者によるデータの差や日差が少ないことに加えて、測定工程の自動化が容易となる。
【００８５】
ホモジニアスなアッセイ系の中でも、抗原抗体反応による凝集を検出する免疫比濁法によるアッセイ系（以下、「凝集系」ということがある。）で行うことがより好ましい。具体的には、ポリペプチド（ｐ５）又はポリペプチド（ｐ６）と、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させ、生じる凝集体量を、濁度を測定することにより行う。
【００８６】
得られた凝集体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）}量の測定方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、凝集体が形成された反応溶液の濁度を、吸光度法により測定することによって行うことができる。なお、凝集系による測定方法は、臨床検査で通常用いられている方法である。このため、凝集系を用いた本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、簡便な検査法として臨床検査への適応が可能となる。また、特に配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を結合させた多価のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、塩基性に富み、凝集を容易に起こすため、アッセイ系の最適化が容易である。
【００８７】
また、標識物質で標識されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ５）又はポリペプチド（ｐ６）}を用いた場合のホモジニアスなアッセイ系としては、例えば、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出する方法が挙げられる。一分子蛍光分析法とは、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析する方法であり、例えば、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）法等がある。本発明の反応系としては、分子の大きさの変化や分子間の距離の変化を効率よく検出し得るＦＣＳ、ＦＩＤＡ−ＰＯ、又はＦＲＥＴであることが好ましく、ＦＣＳ又はＦＲＥＴであることがより好ましく、ＦＣＳであることがさらに好ましい。なお、各方法を利用したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定は、それぞれ常法により行うことができる。
【００８８】
ＦＲＥＴとは、分子をそれぞれ分光特性の異なる複数の蛍光物質で標識し、複数の蛍光物質間のエネルギートランスファーによって、分子から発せられる蛍光の波長や蛍光量が、分子同士の距離が非常に近づいた場合に、単独の場合から変化することを利用した反応系であり、分子間の距離や結合を測定するのに用いられる。例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを、蛍光エネルギーを与える蛍光物質（ドナー）を用いて標識し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を、ドナーからのエネルギーを励起エネルギーとして受け取る蛍光物質（アクセプター）を用いて標識する。予め形成させたドナー標識済み抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの複合体に対し、アクセプター標識済みＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用のポリペプチドを添加すると、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合することにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が高いほど、ドナー標識済み抗体とアクセプター標識Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの結合が阻害される。そのため、ドナーとアクセプターが近接した場合に発せらせるＦＲＥＴによる蛍光波長の発生が阻害される。すなわち、ＦＲＥＴにより発生される蛍光波長の蛍光強度を測定することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
さらに、ドナー蛍光物質に長時間蛍光を発するユーロピウム等の希土類錯体を用いた時間に、分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を用いて、励起光による生体試料中の夾雑物の蛍光が、退色した後のドナー蛍光物質の長時間蛍光を測定することにより、バックグラウンド値の低い生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定を行うことができる。
【００８９】
ＦＣＳは、細いレーザー光の中の一定時間の分子のゆらぎを計測する方法である。透明な媒体中を拡散している分子は、焦点（極微小空間）を通過する際に、共焦点光学系で検出可能な蛍光強度の変動（分子のゆらぎ）を発生させる。大きな分子は遅く、小さな分子は早く動くことから、自己相関法により、分子の大きさに換算し、分子間の結合を測定することが可能な方法である。例えば、配列番号４のアミノ酸からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（約９ｋＤａ）を、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はアミノ基に蛍光物質を結合させることにより蛍光標識した場合は、該蛍光標識ポリペプチドが抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（約１８７ｋＤａ）と結合すると、分子の大きさが大きくなり、未結合の蛍光標識ポリペプチドよりも拡散時間（分子が焦点を通過する時間）が長くなる。この反応溶液中に、生体試料が添加されている場合には、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが競合的に抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチドの割合が減少し、測定時間中の平均された拡散時間が短くなる。すなわち、ＦＣＳにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９０】
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度と分子数を求めることができる解析法であり、試料溶液中に蛍光強度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光強度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドに蛍光物質を結合させて蛍光標識した場合であって、該蛍光標識ポリペプチドが未結合である場合と、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している場合とにおいて、一分子あたりの蛍光強度が異なる場合には、ＦＩＤＡにより一分子当たりの蛍光強度を観測することによって、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９１】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、ＦＩＤＡと蛍光偏光解析を複合させた解析法であり、蛍光分子の蛍光偏光度と分子数を求めることができる。試料溶液中に蛍光偏光度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光偏光度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。具体的には、大きい分子は、回転運動がゆっくりとなるため、小さい分子よりも、蛍光偏光度が大きくなる。つまり、ＦＣＳと同様に、ＦＩＤＡ−ＰＯにより一分子当たりの蛍光偏光度を観測することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９２】
一分子蛍光分析法では、測定に蛍光を用いているため、使用する抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体や、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが低濃度である場合であっても、高感度に測定することが可能である。特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＦＩＤＡ−ＰＯにおいては、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのみを、蛍光物質等の標識物質で標識すればよいため、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体も標識する必要のあるＦＲＥＴよりも、測定全体に要する費用を低減させることができる。
【００９３】
ＦＣＳやＦＲＥＴ等の一分子蛍光分析法のように、一分子当たりの結合の有無を検出する方法の場合には、洗浄工程が不要であるばかりではなく、固相法で用いられるような酵素標識による化学発光検出のような間接的測定法ではなく、抗体に結合している標識されたペプチドの標識量を直接測定するため、反応とのタイムラグがなく、抗原抗体反応の直後の迅速な反応を経時的にモニターすることが可能となる。
【００９４】
ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法や競合的ＥＬＩＳＡ法等のように、従来のプレートを用いた固相法のアッセイ系では、プレートのウェル間で反応溶液を分注する時間差があることにより、抗体と抗原の結合反応のような迅速な反応を、反応が平衡に達する前に測定しようとすると、ウェルごとに反応時間に差が生じ、正確な測定試料濃度の測定ができなかった。このため、従来法では、抗原抗体反応等の結合反応が平衡化してウェル間の差をなくす必要があり、それぞれの反応を１時間以上かけて行っていた。
本発明においては、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識を直接的に検出することにより、抗体と抗原の結合反応を経時的にモニター可能であり、さらに測定試料ごとに反応時間を一定にして測定すれば、抗原抗体反応が平衡に達する前に測定しても、正確な測定試料の濃度が測定できる。
さらに一分子蛍光分析法は高感度測定であるため、平衡に達する前の抗原抗体反応の立ち上がりの部分で測定しても、標識ポリペプチドと抗体の結合量の微量な差を検出することが可能となる。
【００９５】
これらの理由により、本発明においては、必ずしも抗原抗体反応が平衡に達するまで待つ必要がないため、抗原抗体反応を短時間で行うことが可能となる。例えば、凝集系を用いた測定法では、抗原抗体反応が１５分間以下、例えば５分間以下である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。一方、ＦＲＥＴを用いた測定法でも、抗原抗体反応が１５分間以下である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。同様に、ＦＣＳを用いた測定法では、抗原抗体反応が５〜１０分間である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。
【００９６】
＜ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定キット＞
また、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、前記記載のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ１）〜（ｐ６）}と、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と、濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ又はその部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定キットを用いることにより、より簡便に行うことができる。これらのキットは、トレーサーである標識された物質として、Ｃ３ａやＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質に代えてポリペプチドを用いていることにより、安定であり保存性がよく、特別な保存法を開発しなくても、抗原性が長期間保持し得る。また、より安価な試薬キットを提供できる。
【００９７】
これらのキットに含まれるヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液とは、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質溶液であってもよく、Ｃ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチド溶液であってもよい。濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ等の標準溶液は、前記記載の競合用ポリペプチドとして用いることができる。なお、当該標準溶液としては、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同様に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を競合的に阻害し得る化合物の溶液であればよく、例えば、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ標準溶液として、該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドからＮ末端のシステイン残基が欠損した未標識のポリペプチドの溶液であってもよい。
【００９８】
さらに、これらのキットは、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に用いられる他の試薬等を適宜含んでいてもよい。該試薬として、例えば、生体試料の希釈や、抗原抗体反応の反応溶液の調製に用いられる緩衝液等が挙げられる。
【実施例】
【００９９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１００】
［参考例１］ Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを用いたＦＣＳ計測での結合反応測定
抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（ａｂｃａｍ社製、製品番号：ａｂ１１８７３）と、配列番号４のアミノ酸配列からなり、ＴＡＭＲＡをＮ末端のシステイン残基に結合させたＴＡＭＲＡ蛍光標識済みＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（シグマ社により合成；以下、蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を用いて、ＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。測定機としてはＭＦ２０（オリンパス社製）を用いた。
まず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の希釈系列（０、１、１０、１００ｎＭ）と、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解して混合し、５分間放置した後、各反応溶液をＦＣＳ計測にて５秒間５回の条件で測定し、拡散時間の平均値を算出した。
この結果、図１に示すように、拡散時間は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度依存的に増大し、１００ｎＭの場合に最大となった。拡散時間は分子の大きさと相関するため、蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドが抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と濃度依存的に結合していることが確認された。
【０１０１】
［参考例２］ 蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合に対するＣ３a−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の競合的結合阻害の測定
次に、１０ｎＭの抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（ａｂｃａｍ社製）と、濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の希釈系列（１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、７．８１２５ｎＭ）とを混合し、室温で５分間放置した後、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを加えてさらに室温１０分間インキュベーションし、参考例１と同様にしてＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。
この結果、図２に示すように、約１０ｎＭのヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を添加した場合に結合阻害反応が検出され、また、拡散時間は、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の濃度依存的に減少し、競合的な抗原抗体反応の阻害がおきていることが確認された。
【０１０２】
［実施例１］
凝集系を用いた遅延型競合的抗原抗体反応において、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が測定可能であることを確認した。
まず、参考例１において用いた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を、ラテックスビーズに常法により結合させて、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズを作製した。
また、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（未標識品；以下、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を、シグマ社に依頼して合成した。合成されたポリペプチドは、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖を介したＳ−Ｓ結合により、２価のポリペプチドであった。
一方、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（未標識品；以下、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を、シグマ社に依頼して合成した。合成されたポリペプチドは配列内部に複数のシステインを含んでいる。
それぞれのペプチドをＤＴＴにてＳ−Ｓ結合を還元したのち、ＥＭＣＳ（同人化学社製）の架橋反応により、システインのＳＨ基とＮＨ２基を架橋させる反応を行った。
配列４のポリペプチドは、Ｎ末端のシステインがそれぞれ架橋した規則正しい構造となったが、配列５のポリペプチドは、Ｎ末端のシステインと配列内部のシステインがランダムにＮ末端のＮＨ２基と結合する複雑な構造となった。
抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド（０、２、４、８、１６ｎＭ）とを混合して室温で５分間放置した後、各溶液の６００ｎｍの波長の吸光度を測定した。各溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの濃度が０ｎＭである溶液（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを添加していない溶液）のＯＤ（６００ｎｍ）値を差し引いた値（△ＯＤ（６００ｎｍ）値）を図３に示す。
この結果、図３に示すように、ポリペプチドの濃度依存的にＯＤ（６００ｎｍ）値が上昇していた。これらの結果から、いずれのポリペプチドも、感作ビーズ中の抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合し、凝集体を形成するが、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの架橋物では、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの架橋物を用いた場合よりも、より低濃度のポリペプチドで十分量の凝集体を形成できること、また、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドのほうが、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドよりも、溶液中に添加するポリペプチド濃度依存的なＯＤ（６００ｎｍ）値の上昇の割合が大きいことが確認された。これらの結果から、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドのような本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド濃度をより精度よく検出し得ることが明らかである。
【０１０３】
次に、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液の希釈系列を作製し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと混合させて５分間放置した後、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを添加して、さらに５分間放置した。その後、これらの各反応溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値を測定した。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約１５分間と非常に短時間であった。
この結果、いずれのポリペプチドを用いた場合であっても、添加したヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液の濃度依存的に、ＯＤ（６００ｎｍ）値の上昇が抑制されており、凝集体形成が阻害されていることが確認された。また、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物を添加した場合よりも、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物を添加した場合のほうが、高濃度のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液を添加しないと、凝集体形成阻害が生じないことも分かった。
【０１０４】
これらの結果から、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド等の本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドは、凝集系においても、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合的に結合し、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定におけるトレーサーとして好適であることが明らかとなった。中でも、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドは、Ｎ末端以外の配列内部にシステインを含む配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドよりも低濃度で感度よく機能することが分かった。これは、配列番号５のアミノ酸配列中には、複数のシステイン残基が含まれており、このため、それぞれのシステイン残基を介したＳ−ＮＨ２結合が形成され、得られるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物は複雑な立体構造をとる結果、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が低下する可能性があるためと推察される。その他、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体のエピトープであるＣ末端領域が最も親水性が高い領域であるのに対して、配列番号５のアミノ酸配列中には、Ｎ末端から９〜２６番目のアミノ酸からなる領域が、エピトープであるＣ末端領域よりもはるかに親水性が高いため、Ｃ末端領域が包埋される結果、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が低下している可能性もある。
【０１０５】
［実施例２］
抗原抗体反応時間を１５分間で行った場合に、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が上昇するか否かを、確認した。
まず、参考例１で用いた１０ｎＭの抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と、表１記載の物質とを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解して混合して試料１〜６を調製し、これらの試料を５分間インキュベーションした後、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを加えてさらに室温１０分間インキュベーションすることにより遅延競合抗原抗体反応阻害を起こし、参考例１と同様にしてＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。同時に、検量線作成用に、参考例２から阻害反応に直線性のある領域として算出した３１．２５、１５．６２５、７．８１２５、及び０ｎＭのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ希釈系列を調整し、試料と同様に反応させて、ＦＣＳ計測を行った。得られた検量線の拡散時間とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の近似直線を算出し、試料１−１〜１−６の拡散時間をその近時直線式に代入して試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。なお、表１中、「−」とは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の他に何も加えなかったことを意味する。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約３０分間であり、アッセイコストは一試料あたり約１０円（１０円／ｗｅｌｌ）と非常に安価であった。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
この結果、図４に示すように、競合物のない試料１と比較して、試料２では抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドに対する抗原抗体反応の完全な阻害が起こっており、存在するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は３０ｎＭ以上と算出された。これに対して、ヒトＣ３を添加した試料３では、全く抗原抗体反応の阻害が起こらず、ヒトＣ３は抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しないことが確認された。一方、ヒト血清の希釈物を加えた試料４では弱い結合阻害が生じており、このことから、該ヒト血清には、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが存在していることが示唆された。ヒト血清の希釈物にさらにヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料５では、試料２と同様に強い抗原抗体反応阻害が起きていたが、ヒト血清の希釈物にさらにヒトＣ３抽出物を加えた試料６では、ヒト血清の希釈物のみを加えた試料４と同等の阻害活性であった。
【０１０８】
これらの結果から、抗原抗体反応阻害はＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的に生じていることから、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いることにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定できることが明らかとなった。
特に、Ｃ３ａ前駆体のＣ３では阻害が起こらなかったことから、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体がヒトＣ３ａと交差せず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドとの結合は極めてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇに特異的であると考えられた。
【０１０９】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇは、血液中に存在する前駆体のＣ３とＣ３切断セリンプロテアーゼの存在のため、採血後の血液サンプル中で時間経過とともに上昇し、それは、通常のＥＬＩＳＡアッセイの血液サンプルと抗体との反応時間（室温、１〜２時間）でも起こることがわかっている。これに対して、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いた本実施例においては、試料６と試料４との阻害活性が同等で試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は検出限界以下と算出されたことから、全１５分間の抗原抗体反応においては、血清中のプロテアーゼにより、血清中のヒトＣ３が切断されて新たにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが生じることがなく、したがって、血清中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を正確に測定することができることが明らかとなった。
【０１１０】
［比較例１］ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＳＩＡ法によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定
Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いて、実施例１の表１記載の添加物中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した。
まず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体が固相化されたプレートの各ウェルに、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解した表２記載の添加物及び検量線作成用のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を、それぞれ分注した後、室温で１時間インキュベーションし、抗原抗体反応を行った。
次に、洗浄工程を行った。具体的には、各ウェル中の添加物含有ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ溶液を吸引除去し、２００μＬの洗浄Ｂｕｆｆｅｒを注ぎ、１分間インキュベートした後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒを吸引除去した。さらに同じ洗浄工程を２回繰り返した。
次に、各ウェルに、１００μＬのＨＲＰ標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体溶液を分注し、室温で１時間インキュベーションして抗原抗体反応を行った後、前記と同様に洗浄工程を３回行った。さらに、ペーパータオル上でプレート内の水滴をたたき落とし、各ウェルに、１００μＬのＴＭＢ溶液を分注し、暗下で１５分間インキュベートした後、１００μＬのｓｔｏｐ溶液を分注して発色反応を停止させた。さらに、各ウェルの発色量を調べるため、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した。該アッセイ系では、各ウェルに添加した試料溶液中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが存在している場合には、ＯＤ（４５０ｎｍ）値が上昇する。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約４時間であり、洗浄工程を含むため、操作も煩雑であった。さらに、アッセイコストは一試料あたり約３００円（３００円／ｗｅｌｌ）であり、実施例１の場合と比べて高額であった。
【０１１１】
【表２】
【０１１２】
検量線作成用のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物濃度とＯＤ値から近似直線を作成し、各試料のＯＤ値を近似直線（検量線）に代入して、試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。この結果、図５に示すように、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料２、ヒト血清を加えた試料４、及び、ヒト血清にヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料５では、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ溶液のみを添加した試料２−１と比べて、顕著にＯＤ（４５０ｎｍ）値が上昇しており、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇がみられていたが、ヒトＣ３抽出物を加えた試料３では、ＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇は観察されなかった。これらの結果から、ＥＬＩＳＡ法においても、実施例１と同様に、試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが特異的に検出されていることが確認された。
一方、ヒト血清にヒトＣ３抽出物を加えた試料６では、ヒトＣ３抽出物のみを加えた試料３とは異なり、試料４よりも大きなＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇が観察され、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量がヒト血清よりも増大していることが確認された。これは、血清中のプロテアーゼにより、添加されたヒトＣ３が切断されて新たにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが生じたためと考えられる。また、試料４においても、測定中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が上昇している可能性が示唆された。これらの結果から抗原抗体反応が室温で１時間程度のＥＬＩＳＡ法では、測定中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が上昇し、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を正確に測定できない可能性が高いことが明らかである。
【０１１３】
［比較例２］ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定２
Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定を、抗原抗体反応時間を、比較例１よりも短時間として行った。
具体的には、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体が固相化されたプレートの各ウェルに、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解した表２記載の添加物を、それぞれ分注した後、室温で１５分間インキュベーションし、抗原抗体反応を行った。比較例１と同様にして洗浄工程を行った後、各ウェルに、１００μＬのＨＲＰ標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体溶液を分注し、室温で１５分間インキュベーションして抗原抗体反応を行った。その後、さらに比較例１と同様にして洗浄工程及び発色反応を行い、各ウェルの４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した。
この結果、いずれの試料においても、測定されたＯＤ（４５０ｎｍ）値は比較例１の結果よりもはるかに小さく、このため、バックグランドとシグナルとの比が小さく反応を正確に検出することが難しかった。特に検量線は、３１．２５〜１５．６１５ｎＭの領域しか作成することができず、低濃度は測定できなかった。
この作成された検量線と測定されたＯＤ（４５０ｎｍ）値から、各試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。算出結果を図６に示す。この結果、試料６では、ＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇は確認されず、Ｃ３からのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの切り出しが生じていないようであったが、ウェル間のばらつきが大きく、正確には判定できなかった。
【０１１４】
以上の実施例及び比較例より、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法により、血液試料等の生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を、非常に短時間で正確に測定できること、及び、測定コストも、従来のｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩSＡ法の１／１０以下に抑えることが可能であり、経済的にも好ましいことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いることにより、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定することができるため、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａの安定型であるＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ３ａは、血中の体液性免疫成分である補体の一種であり、Ｃ５ａとともに、アナフィラトキシンと呼ばれている分子量９０００、７８アミノ酸からなるタンパク質である。１９７５年にＴｏｎｙ Ｅ．らによってクローニングされた分子であり、感染症や炎症性疾患に罹患することにより、血中濃度が上昇することが報告されている。近年、飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ；Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)を用いた解析により、大腸癌等の特定の種類の癌患者において、血中のＣ３ａ濃度が上昇することが報告されており、血液中の疾患マーカーとしても期待されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。
【０００３】
Ｃ３ａは、巨大な補体成分のＣ３から、古典経路（Ｃ１酵素）又はレクチン経路（ＭＡＳＰ酵素）によって、それぞれ切り出されて産生されるタンパク質の、αへリックスの一部である。このため、Ｃ３を認識せず、Ｃ３ａのみを特異的に認識する抗体の作製は非常に困難であり、Ｃ３とＣ３ａを免疫学的方法で区別して、検出・定量することは難しかった。その後、Ｃ３ａは、血液中において、Ｃ末端のアルギニンが欠損した状態（Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ）で最も安定に存在することがわかった。そこで、Ｂｕｒｇｅｒらは、このＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａのＣ末端の８アミノ酸（アミノ酸一文字表記でＲＡＳＨＬＧＬＡ）をエピトープとし、これにキャリアタンパク質ＫＬＨを付加させたものを抗原として動物に免疫し、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａに特異的な抗体を作成することに成功した（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
血液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａの測定法としては、前述の８アミノ酸からなるペプチドをエピトープとしてマウスに免疫して作製された抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体（Ｈ４５３）を用いたｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法が報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。この方法では、まず、抗Ｃ３ａポリクローナル抗体をプレートに固相化し、この固相化された抗Ｃ３ａポリクローナル抗体に、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを結合させた後、洗浄する。その後、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３をプレート中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａに結合させた後、洗浄し、さらに、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３と結合させる。洗浄後、ペルオキシダーゼの基質の発色を測定することにより、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を測定することができる。このｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体Ｈ４５３を一次抗体として用いることにより、Ｃ３ａの前駆体であるＣ３との交差性がなく、血漿等の生体試料中の１〜５ｎｇ／ｍｌ濃度のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを検出し定量することが可能であった。また、近年では、さらにステップを簡略化され、例えば、Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）等のように、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体をマルチウェルプレートに固相化し、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体にてｓａｎｄｗｉｃｈし、ＨＲＰの基質ＴＭＢの発色により、試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを検出するキットが市販されている。これらの市販のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出キットの感度は、一般的に０．２〜１．１ｎｇ／ｍｌと良好である。
【０００５】
これらのｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、固相化した第１抗体と試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとの抗原抗体反応、及びこれにより得られた複合体中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと第２抗体との抗原抗体反応の２回の抗原抗体反応が必要である。通常、十分な精度の検査をするためには、１回の抗原抗体反応には、１時間程度の反応時間とその後の洗浄工程を要する。つまり、上記ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、１時間の抗原抗体反応と洗浄工程を２回ずつ要することから、計３時間程度を要する。
【０００６】
一方で、血液試料中には、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａだけではなく、血中に存在するＣ３とセリンプロテアーゼの両方が含まれている。このため、血液試料を室温でインキュベーションした場合には、セリンプロテアーゼにより、血液試料中のＣ３からＣ３ａが生じ、すぐさま内因性の血清カルボキシペプチダーゼＮにてＣ末端のアルギニンが除去されＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが生じるため、血液試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が時間経過に伴い増大することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。つまり、約３時間程度の測定時間を要するｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法では、測定中に試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量が上昇している可能性が高く、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量を正確に測定するために、より迅速な測定法の開発が求められている。
【０００７】
より短時間の測定が可能となるように、測定法のステップを簡略化する方法としては、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと競合的に結合する人工物質を用いた免疫的測定法がある。例えば、トレーサーとして１２５Ｉを用いて標識したＣ３ａ（１２５Ｉ−Ｃ３ａ）を用いた競合的放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）によるＣ３ａ測定法では、抗Ｃ３ａポリクローナル抗体を固相化し、１２５Ｉ−Ｃ３ａと結合させる。この結合を血液試料中のＣ３ａが阻害し、この阻害作用により生じた遊離の１２５Ｉ−Ｃ３ａ量を測定することにより、高感度に（例えば、６ｎｇ／ｍｌ、０．６６ｎＭ）血液試料中のＣ３ａ量を測定することが可能である（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
安全性の観点から、近年、放射性同位体の利用が避けられるようになっており、放射免疫測定に換えて、発色反応等のより安全な検出方法を利用した測定方法も開発されている。例えば、Ａｓｓａｙｄｅｓｉｇｎ社のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓＡｒｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＩＡキットのように、トレーサーとしてアルカリフォスファターゼ標識した全長のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを用いるキットも市販されている。この方法では、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａポリクローナル抗体に、アルカリフォスファターゼ標識した全長のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが結合することに対し、生体試料中に存在するＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａが競合的に阻害することを利用し、アルカリフォスファターゼの基質の発色を検出することによって、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する。
【０００９】
これらの競合的ＥＬＩＳＡ法では、２種類の抗体によりＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａをｓａｎｄｗｉｃｈする必要がないため、抗原抗体反応ステップと洗浄ステップをそれぞれ一つずつ除くことが可能であり、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩSＡ法よりも短時間で測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５０９４０９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ヘイバーマン（Habermann）、外１６名、ガストロエンテロロジー（GASTROENTEROLOGY）、２００６年、第１３１巻、１０２０〜１０２９ページ。
【非特許文献２】バーガー（Burger）、外４名、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（The Journal of Immunology）、１９８８年、第１４１巻、５５３〜５５８ページ。
【非特許文献３】モルネス（Mollnes）、外２名、クリニカル・エクスペリメンタル・イミュノロジー（Clinical and Experimental Immunology）、１９８８年、第７３巻、４８４〜４８８ページ。
【非特許文献４】ハック（Hack）、外６名、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Journal of Immunological Methods）、１９８８年、第１０８巻、７７〜８４ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記の競合的ＥＬＩＳＡ法においても、１時間程度の抗原抗体反応の反応時間とその後の洗浄工程が必要であり、依然として、計１．５〜２時間程度の測定時間を要するため、測定時間の迅速化は十分ではない、という問題がある。
さらに、トレーサーとして、Ｃ３ａ又はＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを標識したものを用いているが、これらのタンパク質に対して、抗体に対する特異性を維持したまま標識を行うことは困難である、という問題がある。さらに、これらのタンパク質を、測定前まで安定に保つことも難しい、という問題もある。
【００１３】
本発明は、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａを測定する方法であって、生体内において安定的に存在し得るＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを正確かつ簡便に測定する方法、並びに、該方法に好適なＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド及び測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、競合的免疫測定方法において、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａのＣ末端の８アミノ酸からなるペプチドをＣ末端に有し、かつＮ末端アミノ酸残基に標識を行ったポリペプチド又はＮ末端アミノ酸同士を結合させたポリペプチドをトレーサーとして用いて、抗Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａと該ポリペプチドとを競合的に結合させることにより、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１） 競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する方法であって、（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を算出する工程と、を有し、前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであり、前記競合用ポリペプチドが、ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドであることを特徴とするヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド、
（２） 前記工程（１ａ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であり、かつ、前記工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間と等しいことを特徴とする前記（１）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（３） 前記（ｐ１）又は（ｐ３）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（４） 前記（ｐ２）又は（ｐ４）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、前記（１）又は（２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（５） 前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）であり、前記工程（ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程、（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドとヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程、（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程、（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程、
（６） 前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
【００１６】
（７） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ１）又は（ｐ２）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、吸光度法による濁度測定により行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（８） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記いずれかのポリペプチドであることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｐ’１）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド、（ｐ’２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド、
（９） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応により結合させたものであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法；（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応、（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応、（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応、
（１０） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１１） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、並びに、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチドであることを特徴とする前記（１０）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１２） 前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする前記（１０）又は（１１）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１３） 前記標識物質が蛍光物質であり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする前記（１２）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１４） 前記一分子蛍光分析法が蛍光相関分光法（ＦＣＳ）であることを特徴とする前記（１３）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１５） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うものであり、前記標識物質が酵素又は放射性同位体であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
（１６） 前記標識物質がアルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、酵素反応によって生じる前記酵素の基質の変化による発色又は発光を検出することを特徴とする前記（１５）記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、
【００１７】
（１７） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（１８） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（１９） ９〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はＮ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする前記（１７）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２０） ８〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする前記（１８）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２１） 配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２２） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２３） Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種のポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２４） 前記ポリペプチド同士の結合が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応によるものであることを特徴とする前記（２３）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド；（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応、（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応、（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応、
（２５） 前記（１８）又は（２０）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
（２６） 前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士の結合が、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応によるものであることを特徴とする前記（２５）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、
【００１８】
（２７） 生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するためのキットであって、前記（１７）〜（２６）記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチド、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体、並びに、濃度既知のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法を用いることにより、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａを、短時間で簡便に測定することができる。すなわち、測定に要する時間が短時間で済むため、測定中の時間経過に伴うＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量の上昇の影響を抑えることができ、生体試料中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ量をより正確に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】参考例１において、測定試料中の抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度と拡散時間との関係を示した図である。
【図２】参考例２において、測定試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物濃度と拡散時間との関係を示した図である。
【図３】実施例１において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを混合した各溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの濃度が０ｎＭである溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値を差し引いた値（△ＯＤ（６００ｎｍ）値）を示した図である。
【図４】実施例２において、各試料の拡散時間から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【図５】比較例１において、各試料のＯＤ（４５０ｎｍ）値から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【図６】比較例２において、各試料のＯＤ（４５０ｎｍ）値から算出されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度（ｎＭ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法」ということがある。）は、競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ３ａ濃度を測定する方法であって、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド」ということがある。）をトレーサーとする競合的免疫反応を利用した方法であり、前記Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであることを特徴とする。
（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ１）」ということがある。）。
（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ２）」ということがある。）。
（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ３）」ということがある。）。
（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ４）」ということがある。）。
（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ５）」ということがある。）。
（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ｐ６）」ということがある。）。
【００２２】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、前記ポリペプチド（ｐ１）〜（ｐ６）に示すように、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを有するポリペプチドである。配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ（以下、「Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ」ということがある。）のＣ末端の８アミノ酸（アミノ酸一文字表記でＲＡＳＨＬＧＬＡ）に相当する。前述したように、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端の８アミノ酸は、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体（以下、「抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体」ということがある。）のエピトープであり、したがって、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、このＣ末端領域において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合する。
【００２３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法においては、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合して抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合するトレーサーとして、全長のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇタンパク質（配列番号６）ではなく、該抗体のエピトープを含むポリペプチドを用いることにより、合成の手間が簡便であり、比較的安価に調製することができる。このようなポリペプチドは、一般的に汎用されているペプチド合成機を用いて合成することが可能である。また、標識物質により標識する場合にも、タンパク質に比べて簡便かつ効率よく標識することが可能である。つまり、測定全体にかかる費用を抑えることが可能である。さらに、タンパク質よりもポリペプチドのほうが比較的安定であるため、より測定間の誤差等を低減させることができる。
【００２４】
＜ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）＞
前記ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合部位である配列番号１のアミノ酸配列をＣ末端に有しているポリペプチド同士が結合したものであり、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２以上有する多価のポリペプチドである。なお、本発明において、多価ポリペプチドとは、特定の物質との結合領域を、一分子に２以上有するポリペプチドを意味する。
【００２５】
システイン残基は、側鎖に反応性の高いＳＨ基を有するため、ポリペプチド同士を架橋させた多価ポリペプチドを作製しやすい。また、ポリペプチドのＮ末端の一級アミン（α−アミノ基）も、比較的反応性が高く、このため、当該アミノ基を介することにより、当該ポリペプチドを他の物質等（例えば、リガンドや他のポリペプチド等）と比較的容易に結合させることができる。しかしながら、ポリペプチド中のＳＨ基やアミノ基を介して２以上のポリペプチドを結合させるにあたって、当該ポリペプチドの配列内部にＳＨ基や一級アミン、特にリジン残基の側鎖のアミノ基がある場合には、Ｎ末端よりもエピトープ部位に近いこれらのＳＨ基やアミノ基において架橋反応が生じてしまい、エピトープの認識障害が起る可能性がある。
【００２６】
これに対して、ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域をＣ末端に有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基又はＮ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドである。このため、Ｃ末端側のエピトープ部位の認識障害が生じにくく、ポリペプチド同士を結合させて得られる多価ポリペプチドであるにも関わらず、精度良く抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合することができる。
【００２７】
具体的には、前記ポリペプチド（ｐ１）は、前記ポリペプチド（ｐ３）同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチドであり、前記ポリペプチド（ｐ２）は、前記ポリペプチド（ｐ４）同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドである。なお、本発明及び本願明細書において、「Ｎ末端のシステイン残基を介して結合する」とは、システイン残基の側鎖（例えば、ＳＨ基）を介して結合するものと、Ｎ末端のアミノ基を介して結合するもののいずれをも含む。すなわち、ポリペプチド（ｐ１）としては、ポリペプチド（ｐ３）同士を、それぞれのシステイン残基の側鎖同士を介して結合した多価ポリペプチドであってもよく、ポリペプチド（ｐ３）同士を、それぞれのＮ末端のアミノ基同士を介して結合した多価ポリペプチドであってもよく、一ポリペプチド（ｐ３）のシステイン残基の側鎖と他方のポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のアミノ基とを結合させた多価ポリペプチドであってもよい。
【００２８】
ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）を得るための、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士の結合方法としては、当該ポリペプチド同士が不可逆的に結合されたものであってもよく、可逆的に結合されたものであってもよい。可逆的な結合としては、例えば、ポリペプチドのＮ末端のシステイン残基のＳＨ基、Ｎ末端の一級アミンのアミノ基、Ｎ末端にリジン残基を有する場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基等にリガンドを結合させた２以上のポリペプチドと、２以上の前記リガンドと特異的に結合する受容体との結合反応により、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士を可逆的に結合したものであってもよい。このようなリガンドと受容体としては、タンパク質やポリペプチドの標識に一般的に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、リガンドとしてビオチンを、受容体としてストレプトアビジンを用いることにより、４価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に４つ有する）ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。その他、１のビーズに２以上の受容体を結合させたものを用いることによっても、ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。
【００２９】
また、ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基同士を共有結合により結合させる等により、ポリペプチド（ｐ３）同士又はポリペプチド（ｐ４）同士を、不可逆的に結合させることによっても、ポリペプチド（ｐ１）及びポリペプチド（ｐ２）を得ることができる。ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基同士を共有結合により結合させる反応は、特に限定されるものではなく、有機合成の分野で公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。
【００３０】
例えば、ポリペプチド（ｐ３）のシステイン残基のＳＨ基同士をＳ−Ｓ結合（架橋反応）により、２価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２つ有する）ポリペプチド（ｐ１）を作製することができる。また、ポリペプチド内にリジン残基を有していないポリペプチド（ｐ３）同士を結合させる場合には、一のポリペプチド（ｐ３）のＮ末端の一級アミンであるアミノ基と、他のポリペプチド（ｐ３）のＳＨ基との架橋反応により互いに結合させることにより、多価の（抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に２つ以上有する）ポリペプチド（ｐ１）を作成することができる。その他、やはり、ポリペプチド内にリジン残基を有していないポリペプチド（ｐ３）の場合には、例えば、複数のポリペプチド（ｐ３）を、マレイミドとアミン反応性基を有する架橋剤としてＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を用いて、マレイミドヒンジ法等によって架橋させることにより、Ｎ末端のシステイン残基のＳＨ基とアミノ基を架橋させた、多価のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドを得ることもできる。
【００３１】
また、ポリペプチド（ｐ４）同士のＮ末端のアミノ基同士を共有結合により結合させる方法としては、例えば、一のポリペプチドのＮ末端の一級アミンであるアミノ基又はＮ末端のアミノ酸残基がリジン残基である場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基とリガンドとを結合させたポリペプチド（ｐ４）同士を、２以上のリガンドと結合可能な受容体と結合させることにより、ポリペプチド（ｐ２）を作製することができる。
【００３２】
一般的に、システイン残基を含むポリペプチドを汎用されているペプチド合成法により合成した場合には、通常、ポリペプチド中のＳＨ基同士が架橋した２価以上の多価ポリペプチドが得られる。ＳＨ基が単独で存在している状態よりも、ＳＨ基同士が架橋した状態のほうが安定であるためである。したがって、ポリペプチド（ｐ３）を汎用されているペプチド合成法により合成して得られるポリペプチドは、特別な処理等をすることなく、そのままポリペプチド（ｐ１）として用いることができる。
【００３３】
その他、ポリペプチド（ｐ３）を汎用されているペプチド合成法により合成して得られるＳＨ基同士が結合したポリペプチドに対して還元剤を作用させてＳ−Ｓ結合を切断した後に、マレイミドヒンジ法等により架橋させるという、比較的簡単な作業により、ポリペプチド（ｐ１）を得ることもできる。
【００３４】
ポリペプチド（ｐ１）としては、後述するポリペプチド（ｐ３）同士をＮ末端のシステイン残基を介して結合させた多価ポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜４１アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることが好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜２０アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがより好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがさらに好ましい。特に、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＮ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチドは、塩基性に富むため、凝集性が良好であり、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法が、後述するように凝集系において行われる場合にも好適である。
【００３５】
ポリペプチド（ｐ２）としては、後述するポリペプチド（ｐ４）同士をＮ末端のアミノ基を介して結合させた多価ポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜４１アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることが好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチド同士を結合させた多価ポリペプチドであることがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００３６】
＜ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）＞
前記ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合部位である配列番号１のアミノ酸配列をＣ末端に有しているポリペプチドであり、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合領域を、一分子に１つ有する一価のポリペプチドである。
【００３７】
ポリペプチド（ｐ３）としては、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン残基を付加した配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列と、Ｎ末端のシステイン残基との間にさらにアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
同様に、ポリペプチド（ｐ４）としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末側に、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するアミノ酸配列をさらに付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００３８】
ポリペプチド（ｐ３）及びポリペプチド（ｐ４）の長さは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（エピトープ部位）と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しない長さであれば特に限定されるものではなく、アミノ酸配列の種類、後述する標識物質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。ポリペプチド（ｐ３）としては、９〜４１アミノ酸であることが好ましく、９〜２８アミノ酸であることがより好ましく、９〜２１アミノ酸であることがさらに好ましく、２０アミノ酸であることが特に好ましい。一方、ポリペプチド（ｐ４）としては、８〜４１アミノ酸であることが好ましく、８〜２０アミノ酸であることがより好ましく、２０アミノ酸であることがさらに好ましい。
【００３９】
なお、Ｃ末端の８アミノ酸以外のアミノ酸配列は、特に限定されるものではなく、適宜設計したアミノ酸配列であってもよく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ（配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質）中のアミノ酸配列であってもよい。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長アミノ酸配列（配列番号２）中の配列の一部を有するポリペプチドを用いることにより、生体内に存在しない人工的なアミノ酸配列を有する合成ペプチドを用いた場合に起こる生体反応等の影響について考慮することなく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを測定することができる。特に、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのように、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのアミノ酸配列中のシステイン残基を先頭としたアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることにより、該システイン残基をそのまま、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）}のＮ末端のシステイン残基として利用することができる。
【００４０】
具体的には、ポリペプチド（ｐ３）としては、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることが好ましく、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、システイン残基をＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドであることがより好ましい。中でも、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端にシステイン残基を１個のみ有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列とＮ末端のシステイン残基の間に、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側９〜１９アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列のみを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００４１】
一方、ポリペプチド（ｐ４）としては、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はＣ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドであることがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００４２】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有する８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドが、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして好適である理由は明らかではないが、以下のように推察される。これらのポリペプチドは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体のエピトープであるＣ末端の８アミノ酸からなる領域（エピトープ部位）が最も親水性に富むため、その他の部分がエピトープを包埋させることがなく、トレーサーとして感度よく働くことが可能となる。また、抗原抗体反応は、一般的に水溶液中で行われるが、これらのポリペプチドは容易に水に溶解するため、特別な緩衝液による調整の必要がないという利点もある。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、特に、配列番号１、３及び４からなる群より選択される１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがより好ましい。
【００４３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが特に好ましい。配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのアミノ酸配列中のシステイン残基を先頭としたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの部分ペプチドであるため、合成ペプチドを用いた場合に起こる生体反応等の影響を考慮しなくてもよい。また、Ｎ末端のシステイン残基をそのまま、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのＮ末端のシステイン残基として利用することができる。また、Ｎ末端にのみシステイン残基を有し、かつアミノ酸配列中にリジン残基を有していないため、ＳＨ基を介した結合反応と、アミノ基を介した結合反応のいずれの反応を用いても、Ｎ末端に標識物質を結合させることができる。さらに、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｃ末側のエピトープ部位が最も親水性が高いため、反応溶液中において、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が非常に高く、このため、当該ポリペプチドをＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして用いた場合には、より短時間のアッセイで、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００４４】
＜ポリペプチド（ｐ５）及びポリペプチド（ｐ６）＞
ポリペプチド（ｐ５）は、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端を標識物質で標識したポリペプチドであり、ポリペプチド（ｐ６）は、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端を標識物質で標識したポリペプチドである。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとしては、前記ポリペプチド（ｐ５）又はリペプチド（ｐ６）のように、標識物質が結合したものであることが好ましい。当該標識物質を指標として、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの検出・測定を容易に行うことができるためである。
【００４５】
具体的には、ポリペプチド（ｐ５）は、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドである。一方、ポリペプチド（ｐ６）は、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドである。このように、Ｎ末端のアミノ酸残基に標識物質を結合させることにより、標識物質による立体障害が生じにくく、Ｃ末端の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（エピトープ部位）と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合が阻害されにくい。すなわち、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、エピトープ認識障害を十分に抑制しつつ、標識物質を結合させることができる。
【００４６】
ポリペプチド（ｐ３）は、システイン残基をＮ末端アミノ酸残基として１個のみ有しているポリペプチドであり、システイン残基は、側鎖に反応性の高いＳＨ基を有する。このため、ポリペプチド（ｐ３）への標識物質の結合を、システイン残基のＳＨ基を介して行うことによって、当該ポリペプチドのＮ末端にのみ標識物質が結合されたポリペプチドを、効率よく作製することができる。
【００４７】
システイン残基の側鎖に標識物質を結合させる反応としては、システイン残基（主にＳＨ基）と標識物質とを結合させる場合に一般的に用いられている結合反応のいずれであってもよい。例えば、ポリペプチドのシステイン残基のＳＨ基と、標識物質等のＳＨ基又はアミノ基との架橋反応であってもよく、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基又はアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応であってもよい。このようなリガンドと受容体としては、タンパク質やポリペプチドの標識に一般的に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、リガンドとしてビオチンを、受容体としてストレプトアビジンを挙げることができる。本発明においては、ポリペプチド（ｐ５）としては、ポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基のＳＨ基とマレイミド化された標識物質とを結合させたポリペプチドであることが好ましい。
【００４８】
一方、ポリペプチド（ｐ４）は、リジン残基を有さないポリペプチド又はリジン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドである。リジン残基は、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸の中でも比較的反応性の高いアミノ酸残基である。このようなリジン残基を有さない、又はＮ末端に１個のみ有することにより、当該ポリペプチド中で十分な反応性を有するアミノ基は、Ｎ末端のアミノ酸の一級アミンのみとすることができる。このため、ポリペプチド（ｐ４）への標識物質の結合を、アミノ基を介して結合させる反応により行うことによって、当該ポリペプチドのＮ末端にのみ標識物質が結合されたポリペプチド（ｐ６）を、効率よく作製することができる。
【００４９】
アミノ基に標識物質を結合させる反応としては、アミノ基と標識物質とを結合させる場合に一般的に用いられている結合反応のいずれであってもよい。例えば、ポリペプチドのＮ末端のアミノ基（Ｎ末端のアミノ酸残基がリジン残基である場合には当該リジン残基の側鎖のアミノ基であってもよい）と、標識物質等のＳＨ基との架橋反応であってもよく、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応であってもよい。本発明においては、ポリペプチド（ｐ６）としては、ポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ酸の一級アミンとＮＨＳエステル化された標識物質とを結合させたポリペプチドであることが好ましい。
【００５０】
このように、Ｎ末端の一級アミン又はシステイン残基が有するＳＨ基と、標識物質とを反応させることにより、ポリペプチドに標識物質を付加するための官能基を別途設ける必要がなく、簡便に標識物質と結合したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを得ることができる。中でも、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）又はポリペプチド（ｐ４）}と標識物質との結合は、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸の一級アミンとＮＨＳエステル化された標識物質との結合、又はＮ末端のシステイン残基のＳＨ基とマレイミド化された標識物質を介した結合であることが好ましい。
【００５１】
ポリペプチド（ｐ５）としては、前述したポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチド（ｐ３）のＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであることが好ましく、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチドであることがより好ましい。
【００５２】
ポリペプチド（ｐ６）としては、前述したポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであれば、特に限定されるものではないが、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチド（ｐ４）のＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであることが好ましく、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドであることがより好ましい。
【００５３】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ３）又はポリペプチド（ｐ４）}に結合させる標識物質としては、通常ポリペプチドの標識に用いられるものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を阻害しないものであれば、特に限定されるものではなく、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの測定方法等を考慮して適宜選択して用いることができる。このような標識物質として、例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位体、化学発光物質、及び磁気物質等がある。本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識物質としては、蛍光物質、酵素、放射性同位体、化学発光物質等であることが好ましく、蛍光物質又は酵素であることがより好ましい。
【００５４】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる化学発光物質としては、ルミノール等のように無機反応により発光する物質であってもよく、ルシフェリン、セランテラジン等の酵素によって触媒される発光物質であってもよい。
【００５５】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる酵素としては、酵素反応を利用した標的物質の検出等において、特に、抗原抗体反応の検出において、通常用いられている酵素から適宜選択して用いることができる。このような酵素として、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等がある。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる酵素としては、アルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであることが好ましい。
【００５６】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものでなく、ペプチドやタンパク質等の標識において通常用いられている蛍光物質から適宜選択して用いることができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、Ｃｙ ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、Ａｔｔｏ ｄｙｅシリーズ（Ａｔｔｏ ｔｅｃ社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ユーロピウム等の希土類錯体等がある。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合に対する影響を抑えることができるため、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。特に、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発する色素であることが好ましい。このように退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの測定時における光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した測定結果を得ることができる。
【００５７】
＜Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法＞
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に供される生体試料は、ヒトＣ３ａを含有することが期待できる生体試料、すなわち、ヒト由来の生体試料であれば、特に限定されるものではない。該生体試料として、例えば、ヒトから採取された、血液、骨髄液、リンパ液、唾液、腹水、滲出液、喀痰、精液、胆汁、膵液、羊膜液、糞便、尿、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、又は膀胱洗浄液等が挙げられる。本発明においては、生体試料は、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。Ｃ３の分解により生体試料中のＣ３ａ量は変動しやすいため、採取後に生体試料を保存する場合には、冷凍保存又は冷蔵保存であることが好ましく、冷凍保存であることがより好ましい。
【００５８】
また、該生体試料は、ヒトから採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該試料中に含有されているヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料等に対してなされている調製方法を行うことができる。該調製方法として、例えば、粘液等の洗浄除去や、生理食塩水等を用いた希釈、細胞性構成要素の分離又は濃縮等がある。なお、生体試料の希釈液としては、セリンプロテアーゼ阻害剤等を含有するバッファー等を用いることが好ましい。
【００５９】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に供される生体試料としては、特に、定期健診や診断等のためにヒトから採取された血液、血清、血漿、リンパ液、骨髄液、及びこれらの希釈液等であることが好ましく、血液、血清、血漿等であることがより好ましく、血清であることがさらに好ましい。
【００６０】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法において用いられる抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと結合し得る抗体であって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端の８アミノ酸をエピトープとし、Ｃ３と交差しない抗体であれば、特に限定されるものではなく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抗体（ａｂｃａｍ社製）等の市販の抗体を用いてもよく、非特許文献２に記載の方法に準じて製造されたものであってもよい。
【００６１】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、具体的には、下記の工程（１ａ）〜（１ｆ）を有する。
（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、
（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ度を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００６２】
まず、工程（１ａ）として、反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体（以下、「検出用ポリペプチド含有結合体」ということがある。）を形成した後、工程（１ｂ）として、工程（１ａ）において得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。
【００６３】
反応溶液中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が多いほど、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量が少なくなる。つまり、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量は、反応溶液中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量に依存して、すなわち、生体試料中に含まれていたヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量に依存して変動する。
【００６４】
そこで、反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量と、形成された検出用ポリペプチド含有結合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量との相関関係を調べ、得られた相関に基づいて、生体試料中に含まれていたヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量を算出することができる。
【００６５】
前記相関は、具体的には、工程（１ｃ）として、工程（１ａ）とは別の反応溶液に、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合体（検出用ポリペプチド含有結合体）を形成した後、工程（１ｄ）として、工程（１ｃ）において得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定し、さらに工程（１ｅ）として、工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させる。その後、工程（１ｆ）として、工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が算出されることにより、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００６６】
競合用ポリペプチドとは、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと識別可能なものであって、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同様に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を競合的に阻害し得るポリペプチドであれば特に限定されるものではない。このような競合用ポリペプチドとしては、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチド等が挙げられる。用いられるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが、標識物質で結合されたものである場合には、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと同じアミノ酸配列からなる未標識のポリペプチドであることが好ましい。その他、当該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドからＮ末端のシステイン残基が欠損した未標識のポリペプチドであってもよい。
【００６７】
工程（１ｃ）においては、濃度既知の競合用ポリペプチド溶液を反応溶液に添加することにより、反応溶液中の競合用ポリペプチドの濃度又は量が算出できる。そこで、この算出された競合用ポリペプチドの濃度又は量と、工程（１ｄ）で測定された当該反応溶液中の検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とから、両者を相関させることができる。なお、本発明において、反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度と当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とを相関させるとは、当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定値から、大凡の反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度が推定できるものであればよく、複数の濃度の競合用ポリペプチド溶液を用いて測定することにより、競合用ポリペプチドによる阻害曲線を作成し、これを検量線として相関を決定するものであってもよく、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液のみを用いて測定することにより、いわゆる基準値を決定する半定量的なものであってもよい。
【００６８】
例えば、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液を段階的に希釈した複数の希釈溶液を、それぞれ別個の反応溶液に添加し、当該反応溶液中の検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度（又は量）と測定された当該複合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量とから、両者の相関関係を近似する検量線を作成することができる。この作成された検量線に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出することができる。なお、工程（１ｃ）において、複数の競合用ポリペプチド溶液に対して反応を行う場合には、各競合用ポリペプチド溶液における反応の反応時間等の条件が等しいことを要する。
【００６９】
また、例えば、工程（１ｃ）において、１の濃度の競合用ポリペプチド溶液を反応溶液に添加し、工程（１ｄ）において、得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定した場合には、工程（１ｂ）において測定されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定値が、工程（１ｄ）において得られた測定値よりも小さい場合には、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、工程（１ｃ）において調製した反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度未満であり、逆に、工程（１ｄ）において得られた測定値以上である場合には、前記生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は、工程（１ｃ）において調製した反応溶液中の競合用ポリペプチド濃度以上であることが求められる。
【００７０】
なお、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度をより精確に求めるために、工程（１ｃ）における反応溶液中において検出用ポリペプチド含有結合体を形成させる反応は、工程（１ａ）における反応とほぼ同じ条件であることが好ましい。ここで、当該反応は、反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの種類と濃度、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の種類と濃度、反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とに影響を受ける。このため、工程（１ａ）と工程（１ｃ）は、同種の、好ましくは同じロットのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドや抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を用いることが好ましく、工程（１ａ）における反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド及び抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度は、工程（１ｃ）における反応溶液のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド及び抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度と等しいことが好ましい。さらに、工程（１ｂ）における測定と工程（１ｄ）における測定とは、同じ測定方法により行うことを要する。
【００７１】
特に、工程（１ａ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しいことが好ましい。
【００７２】
工程（１ａ）と工程（１ｃ）を行う順番は特に限定されるものではなく、工程（１ａ）を行った後に工程（１ｃ）を行ってもよく、工程（１ｃ）を行った後に工程（１ａ）を行ってもよく、両者を同時に行ってもよい。さらに、工程（１ａ）と工程（１ｃ）を一連の操作として行ってもよく、独立して別個に行ってもよい。
【００７３】
また、一の生体試料に対して工程（１ａ）及び（１ｂ）を行うごとに、工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行うことにより、より精度よく当該生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定することができる。
【００７４】
一方、反応条件を整えた実験系であれば、実験ごとの測定値の変動は小さい。このため、生体試料ごとに工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行う必要はなく、既に同じ反応条件において工程（１ｃ）〜（１ｅ）を行って求められている、反応溶液中の競合用ポリペプチドと検出用ポリペプチド含有結合体中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量との相関（例えば、前述の検量線や基準値）を利用して、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出することもできる。
【００７５】
本発明においては、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、競合的に結合させることができればよく、三者を同時に反応させてもよく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを反応させ、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との複合体を形成させた後に、当該複合体に対してＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを反応させてもよく、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとを反応させた後に、形成された検出用ポリペプチド含有結合体とヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを反応させてもよい。
【００７６】
本発明においては、予め形成された生体試料由来ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との複合体に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを反応させることが好ましい。具体的には、前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）からなり、工程（１ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）からなる方法である。
（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドとヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成する工程。
（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成する工程。
【００７７】
工程（１ａ）及び（１ｃ）と同様に、工程（１ａ’−１）における生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合反応と、工程（１ｃ’−１）における競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体複合体との結合反応とは、同じ反応条件で行うことが好ましい。特に、工程（１ａ’−１）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇａと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ’−１）における反応溶液中の競合用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しく、かつ工程（１ａ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、工程（１ｃ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間とが等しいことが好ましい。
【００７８】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法においては、抗原抗体反応の時間、すなわち、反応溶液中の生体試料由来ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと、当該抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。抗原抗体反応に要する時間が短時間であるほど、生体試料中のＣ３の分解等によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量の変動の影響を低減することができるためである。
【００７９】
具体的には、工程（１ａ）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。
また、工程（１ａ’−１）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間と、前記工程（１ａ’−２）における反応溶液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させる反応時間との和が３０分間以内であることが好ましく、１５分間以内であることがより好ましく、１０分間以内であることがさらに好ましい。
【００８０】
得られた検出用ポリペプチド含有結合体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定方法は、特に限定されるものではなく、一般的に２種類の物質の相互作用を、定量的又は半定量的に測定するために用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。
【００８１】
例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして、ポリペプチド（ｐ１）やポリペプチド（ｐ２）のような多価ポリペプチドを用いた場合には、検出用ポリペプチド含有結合体は凝集体として形成される。そこで、この生じた凝集体量を、一般的に抗原抗体反応による凝集を検出する際に用いられる免疫比濁法等を用いて測定することにより、検出用ポリペプチド含有結合体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。
【００８２】
また、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとして、ポリペプチド（ｐ５）やポリペプチド（ｐ６）のような標識された一価のポリペプチドを用いた場合には、当該標識物質から発されるシグナル又は標識物質により発されるシグナルを検出することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。例えば、標識物質が蛍光物質である場合には、該蛍光物質から発される蛍光強度を測定することにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。一方、標識物質が酵素である場合には、該酵素の基質や酵素反応により呈色する物質等を添加し、酵素反応によって変換された色素量等を測定することにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することができる。なお、これらの蛍光強度や色素量等の定量的又は半定量的測定は、分光光度計を用いた測定法等の常法により行うことができる。
【００８３】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、固相法のアッセイ系でも行うことができる。例えば、ビーズ等の担体に固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に、生体試料を接触させることにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体とを結合させた後、標識物質により標識された所定量のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを添加し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と競合的に結合させる。ここで、固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に、生体試料と標識されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドとを同時に接触させて、反応させてもよい。 測定試料毎にあらかじめ定めた時間が経過した後、ビーズ等の担体を洗浄して遊離の（未結合の）Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを除去する。そして、担体に固相化させた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に結合したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識物質から発されるシグナル又は標識物質により発されるシグナルを検出することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定する。
【００８４】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、洗浄工程を要しないホモジニアスなアッセイ系であること、すなわち、前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることが好ましい。ホモジニアスなアッセイ系を用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等の試薬を混ぜるだけの単一ステップによる迅速な測定が可能となる。また、データのばらつきの原因の一つである洗浄工程がないため、短時間でデータを得られるのみならず、ばらつきの少ないより信頼性の高い測定結果が得られる。さらに、工程が少ないため、作業者によるデータの差や日差が少ないことに加えて、測定工程の自動化が容易となる。
【００８５】
ホモジニアスなアッセイ系の中でも、抗原抗体反応による凝集を検出する免疫比濁法によるアッセイ系（以下、「凝集系」ということがある。）で行うことがより好ましい。具体的には、ポリペプチド（ｐ５）又はポリペプチド（ｐ６）と、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとを、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して競合的に結合させ、生じる凝集体量を、濁度を測定することにより行う。
【００８６】
得られた凝集体を形成するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ１）又はポリペプチド（ｐ２）}量の測定方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、凝集体が形成された反応溶液の濁度を、吸光度法により測定することによって行うことができる。なお、凝集系による測定方法は、臨床検査で通常用いられている方法である。このため、凝集系を用いた本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、簡便な検査法として臨床検査への適応が可能となる。また、特に配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を結合させた多価のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドは、塩基性に富み、凝集を容易に起こすため、アッセイ系の最適化が容易である。
【００８７】
また、標識物質で標識されたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ５）又はポリペプチド（ｐ６）}を用いた場合のホモジニアスなアッセイ系としては、例えば、検出用ポリペプチド含有結合体を形成しているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出する方法が挙げられる。一分子蛍光分析法とは、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析する方法であり、例えば、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＤＡ−ＰＯ）、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）法等がある。本発明の反応系としては、分子の大きさの変化や分子間の距離の変化を効率よく検出し得るＦＣＳ、ＦＩＤＡ−ＰＯ、又はＦＲＥＴであることが好ましく、ＦＣＳ又はＦＲＥＴであることがより好ましく、ＦＣＳであることがさらに好ましい。なお、各方法を利用したＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量の測定は、それぞれ常法により行うことができる。
【００８８】
ＦＲＥＴとは、分子をそれぞれ分光特性の異なる複数の蛍光物質で標識し、複数の蛍光物質間のエネルギートランスファーによって、分子から発せられる蛍光の波長や蛍光量が、分子同士の距離が非常に近づいた場合に、単独の場合から変化することを利用した反応系であり、分子間の距離や結合を測定するのに用いられる。例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを、蛍光エネルギーを与える蛍光物質（ドナー）を用いて標識し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を、ドナーからのエネルギーを励起エネルギーとして受け取る蛍光物質（アクセプター）を用いて標識する。予め形成させたドナー標識済み抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの複合体に対し、アクセプター標識済みＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用のポリペプチドを添加すると、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合することにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が高いほど、ドナー標識済み抗体とアクセプター標識Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの結合が阻害される。そのため、ドナーとアクセプターが近接した場合に発せらせるＦＲＥＴによる蛍光波長の発生が阻害される。すなわち、ＦＲＥＴにより発生される蛍光波長の蛍光強度を測定することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
さらに、ドナー蛍光物質に長時間蛍光を発するユーロピウム等の希土類錯体を用いた時間に、分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を用いて、励起光による生体試料中の夾雑物の蛍光が、退色した後のドナー蛍光物質の長時間蛍光を測定することにより、バックグラウンド値の低い生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定を行うことができる。
【００８９】
ＦＣＳは、細いレーザー光の中の一定時間の分子のゆらぎを計測する方法である。透明な媒体中を拡散している分子は、焦点（極微小空間）を通過する際に、共焦点光学系で検出可能な蛍光強度の変動（分子のゆらぎ）を発生させる。大きな分子は遅く、小さな分子は早く動くことから、自己相関法により、分子の大きさに換算し、分子間の結合を測定することが可能な方法である。例えば、配列番号４のアミノ酸からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（約９ｋＤａ）を、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はアミノ基に蛍光物質を結合させることにより蛍光標識した場合は、該蛍光標識ポリペプチドが抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（約１８７ｋＤａ）と結合すると、分子の大きさが大きくなり、未結合の蛍光標識ポリペプチドよりも拡散時間（分子が焦点を通過する時間）が長くなる。この反応溶液中に、生体試料が添加されている場合には、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが競合的に抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチドの割合が減少し、測定時間中の平均された拡散時間が短くなる。すなわち、ＦＣＳにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９０】
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度と分子数を求めることができる解析法であり、試料溶液中に蛍光強度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光強度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドに蛍光物質を結合させて蛍光標識した場合であって、該蛍光標識ポリペプチドが未結合である場合と、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している場合とにおいて、一分子あたりの蛍光強度が異なる場合には、ＦＩＤＡにより一分子当たりの蛍光強度を観測することによって、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９１】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、ＦＩＤＡと蛍光偏光解析を複合させた解析法であり、蛍光分子の蛍光偏光度と分子数を求めることができる。試料溶液中に蛍光偏光度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光偏光度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。具体的には、大きい分子は、回転運動がゆっくりとなるため、小さい分子よりも、蛍光偏光度が大きくなる。つまり、ＦＣＳと同様に、ＦＩＤＡ−ＰＯにより一分子当たりの蛍光偏光度を観測することにより、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合している蛍光標識ポリペプチド量を求めることができる。
【００９２】
一分子蛍光分析法では、測定に蛍光を用いているため、使用する抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体や、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドが低濃度である場合であっても、高感度に測定することが可能である。特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＦＩＤＡ−ＰＯにおいては、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドのみを、蛍光物質等の標識物質で標識すればよいため、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体も標識する必要のあるＦＲＥＴよりも、測定全体に要する費用を低減させることができる。
【００９３】
ＦＣＳやＦＲＥＴ等の一分子蛍光分析法のように、一分子当たりの結合の有無を検出する方法の場合には、洗浄工程が不要であるばかりではなく、固相法で用いられるような酵素標識による化学発光検出のような間接的測定法ではなく、抗体に結合している標識されたペプチドの標識量を直接測定するため、反応とのタイムラグがなく、抗原抗体反応の直後の迅速な反応を経時的にモニターすることが可能となる。
【００９４】
ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法や競合的ＥＬＩＳＡ法等のように、従来のプレートを用いた固相法のアッセイ系では、プレートのウェル間で反応溶液を分注する時間差があることにより、抗体と抗原の結合反応のような迅速な反応を、反応が平衡に達する前に測定しようとすると、ウェルごとに反応時間に差が生じ、正確な測定試料濃度の測定ができなかった。このため、従来法では、抗原抗体反応等の結合反応が平衡化してウェル間の差をなくす必要があり、それぞれの反応を１時間以上かけて行っていた。
本発明においては、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドの標識を直接的に検出することにより、抗体と抗原の結合反応を経時的にモニター可能であり、さらに測定試料ごとに反応時間を一定にして測定すれば、抗原抗体反応が平衡に達する前に測定しても、正確な測定試料の濃度が測定できる。
さらに一分子蛍光分析法は高感度測定であるため、平衡に達する前の抗原抗体反応の立ち上がりの部分で測定しても、標識ポリペプチドと抗体の結合量の微量な差を検出することが可能となる。
【００９５】
これらの理由により、本発明においては、必ずしも抗原抗体反応が平衡に達するまで待つ必要がないため、抗原抗体反応を短時間で行うことが可能となる。例えば、凝集系を用いた測定法では、抗原抗体反応が１５分間以下、例えば５分間以下である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。一方、ＦＲＥＴを用いた測定法でも、抗原抗体反応が１５分間以下である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。同様に、ＦＣＳを用いた測定法では、抗原抗体反応が５〜１０分間である場合であっても、十分にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド量を測定することが可能である。
【００９６】
＜ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定キット＞
また、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法は、前記記載のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド{ポリペプチド（ｐ１）〜（ｐ６）}と、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と、濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ又はその部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定キットを用いることにより、より簡便に行うことができる。これらのキットは、トレーサーである標識された物質として、Ｃ３ａやＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質に代えてポリペプチドを用いていることにより、安定であり保存性がよく、特別な保存法を開発しなくても、抗原性が長期間保持し得る。また、より安価な試薬キットを提供できる。
【００９７】
これらのキットに含まれるヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液とは、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの全長タンパク質溶液であってもよく、Ｃ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチド溶液であってもよい。濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ等の標準溶液は、前記記載の競合用ポリペプチドとして用いることができる。なお、当該標準溶液としては、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと同様に、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド等と抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合を競合的に阻害し得る化合物の溶液であればよく、例えば、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ標準溶液として、該Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドからＮ末端のシステイン残基が欠損した未標識のポリペプチドの溶液であってもよい。
【００９８】
さらに、これらのキットは、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法に用いられる他の試薬等を適宜含んでいてもよい。該試薬として、例えば、生体試料の希釈や、抗原抗体反応の反応溶液の調製に用いられる緩衝液等が挙げられる。
【実施例】
【００９９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１００】
［参考例１］ Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを用いたＦＣＳ計測での結合反応測定
抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（ａｂｃａｍ社製、製品番号：ａｂ１１８７３）と、配列番号４のアミノ酸配列からなり、ＴＡＭＲＡをＮ末端のシステイン残基に結合させたＴＡＭＲＡ蛍光標識済みＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（シグマ社により合成；以下、蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を用いて、ＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。測定機としてはＭＦ２０（オリンパス社製）を用いた。
まず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の希釈系列（０、１、１０、１００ｎＭ）と、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解して混合し、５分間放置した後、各反応溶液をＦＣＳ計測にて５秒間５回の条件で測定し、拡散時間の平均値を算出した。
この結果、図１に示すように、拡散時間は、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の濃度依存的に増大し、１００ｎＭの場合に最大となった。拡散時間は分子の大きさと相関するため、蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドが抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と濃度依存的に結合していることが確認された。
【０１０１】
［参考例２］ 蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドと抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との結合に対するＣ３a−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の競合的結合阻害の測定
次に、１０ｎＭの抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体（ａｂｃａｍ社製）と、濃度既知のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の希釈系列（１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、７．８１２５ｎＭ）とを混合し、室温で５分間放置した後、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを加えてさらに室温１０分間インキュベーションし、参考例１と同様にしてＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。
この結果、図２に示すように、約１０ｎＭのヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を添加した場合に結合阻害反応が検出され、また、拡散時間は、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物の濃度依存的に減少し、競合的な抗原抗体反応の阻害がおきていることが確認された。
【０１０２】
［実施例１］
凝集系を用いた遅延型競合的抗原抗体反応において、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が測定可能であることを確認した。
まず、参考例１において用いた抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体を、ラテックスビーズに常法により結合させて、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズを作製した。
また、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（未標識品；以下、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を、シグマ社に依頼して合成した。合成されたポリペプチドは、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖を介したＳ−Ｓ結合により、２価のポリペプチドであった。
一方、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチド（未標識品；以下、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド）を、シグマ社に依頼して合成した。合成されたポリペプチドは配列内部に複数のシステインを含んでいる。
それぞれのペプチドをＤＴＴにてＳ−Ｓ結合を還元したのち、ＥＭＣＳ（同人化学社製）の架橋反応により、システインのＳＨ基とＮＨ２基を架橋させる反応を行った。
配列４のポリペプチドは、Ｎ末端のシステインがそれぞれ架橋した規則正しい構造となったが、配列５のポリペプチドは、Ｎ末端のシステインと配列内部のシステインがランダムにＮ末端のＮＨ２基と結合する複雑な構造となった。
抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド（０、２、４、８、１６ｎＭ）とを混合して室温で５分間放置した後、各溶液の６００ｎｍの波長の吸光度を測定した。各溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの濃度が０ｎＭである溶液（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを添加していない溶液）のＯＤ（６００ｎｍ）値を差し引いた値（△ＯＤ（６００ｎｍ）値）を図３に示す。
この結果、図３に示すように、ポリペプチドの濃度依存的にＯＤ（６００ｎｍ）値が上昇していた。これらの結果から、いずれのポリペプチドも、感作ビーズ中の抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合し、凝集体を形成するが、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの架橋物では、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドの架橋物を用いた場合よりも、より低濃度のポリペプチドで十分量の凝集体を形成できること、また、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドのほうが、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドよりも、溶液中に添加するポリペプチド濃度依存的なＯＤ（６００ｎｍ）値の上昇の割合が大きいことが確認された。これらの結果から、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドのような本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用ポリペプチドを用いることにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド濃度をより精度よく検出し得ることが明らかである。
【０１０３】
次に、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液の希釈系列を作製し、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体感作ビーズと混合させて５分間放置した後、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド又は配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを添加して、さらに５分間放置した。その後、これらの各反応溶液のＯＤ（６００ｎｍ）値を測定した。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約１５分間と非常に短時間であった。
この結果、いずれのポリペプチドを用いた場合であっても、添加したヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液の濃度依存的に、ＯＤ（６００ｎｍ）値の上昇が抑制されており、凝集体形成が阻害されていることが確認された。また、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物を添加した場合よりも、配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物を添加した場合のほうが、高濃度のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ溶液を添加しないと、凝集体形成阻害が生じないことも分かった。
【０１０４】
これらの結果から、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド等の本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ検出用多価ポリペプチドは、凝集系においても、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体に対して生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇと競合的に結合し、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定におけるトレーサーとして好適であることが明らかとなった。中でも、配列４のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドは、Ｎ末端以外の配列内部にシステインを含む配列５のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドよりも低濃度で感度よく機能することが分かった。これは、配列番号５のアミノ酸配列中には、複数のシステイン残基が含まれており、このため、それぞれのシステイン残基を介したＳ−ＮＨ２結合が形成され、得られるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチド架橋物は複雑な立体構造をとる結果、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が低下する可能性があるためと推察される。その他、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体のエピトープであるＣ末端領域が最も親水性が高い領域であるのに対して、配列番号５のアミノ酸配列中には、Ｎ末端から９〜２６番目のアミノ酸からなる領域が、エピトープであるＣ末端領域よりもはるかに親水性が高いため、Ｃ末端領域が包埋される結果、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体との親和性が低下している可能性もある。
【０１０５】
［実施例２］
抗原抗体反応時間を１５分間で行った場合に、生体試料中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度が上昇するか否かを、確認した。
まず、参考例１で用いた１０ｎＭの抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と、表１記載の物質とを、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解して混合して試料１〜６を調製し、これらの試料を５分間インキュベーションした後、２ｎＭの蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドを加えてさらに室温１０分間インキュベーションすることにより遅延競合抗原抗体反応阻害を起こし、参考例１と同様にしてＦＣＳ計測により、結合反応を測定した。同時に、検量線作成用に、参考例２から阻害反応に直線性のある領域として算出した３１．２５、１５．６２５、７．８１２５、及び０ｎＭのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ希釈系列を調整し、試料と同様に反応させて、ＦＣＳ計測を行った。得られた検量線の拡散時間とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の近似直線を算出し、試料１−１〜１−６の拡散時間をその近時直線式に代入して試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。なお、表１中、「−」とは、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体の他に何も加えなかったことを意味する。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約３０分間であり、アッセイコストは一試料あたり約１０円（１０円／ｗｅｌｌ）と非常に安価であった。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
この結果、図４に示すように、競合物のない試料１と比較して、試料２では抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドに対する抗原抗体反応の完全な阻害が起こっており、存在するＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は３０ｎＭ以上と算出された。これに対して、ヒトＣ３を添加した試料３では、全く抗原抗体反応の阻害が起こらず、ヒトＣ３は抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と結合しないことが確認された。一方、ヒト血清の希釈物を加えた試料４では弱い結合阻害が生じており、このことから、該ヒト血清には、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが存在していることが示唆された。ヒト血清の希釈物にさらにヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料５では、試料２と同様に強い抗原抗体反応阻害が起きていたが、ヒト血清の希釈物にさらにヒトＣ３抽出物を加えた試料６では、ヒト血清の希釈物のみを加えた試料４と同等の阻害活性であった。
【０１０８】
これらの結果から、抗原抗体反応阻害はＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的に生じていることから、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いることにより、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定できることが明らかとなった。
特に、Ｃ３ａ前駆体のＣ３では阻害が起こらなかったことから、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体がヒトＣ３ａと交差せず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体と蛍光Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇポリペプチドとの結合は極めてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇに特異的であると考えられた。
【０１０９】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇは、血液中に存在する前駆体のＣ３とＣ３切断セリンプロテアーゼの存在のため、採血後の血液サンプル中で時間経過とともに上昇し、それは、通常のＥＬＩＳＡアッセイの血液サンプルと抗体との反応時間（室温、１〜２時間）でも起こることがわかっている。これに対して、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いた本実施例においては、試料６と試料４との阻害活性が同等で試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度は検出限界以下と算出されたことから、全１５分間の抗原抗体反応においては、血清中のプロテアーゼにより、血清中のヒトＣ３が切断されて新たにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが生じることがなく、したがって、血清中のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を正確に測定することができることが明らかとなった。
【０１１０】
［比較例１］ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＳＩＡ法によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定
Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いて、実施例１の表１記載の添加物中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を測定した。
まず、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体が固相化されたプレートの各ウェルに、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解した表２記載の添加物及び検量線作成用のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を、それぞれ分注した後、室温で１時間インキュベーションし、抗原抗体反応を行った。
次に、洗浄工程を行った。具体的には、各ウェル中の添加物含有ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ溶液を吸引除去し、２００μＬの洗浄Ｂｕｆｆｅｒを注ぎ、１分間インキュベートした後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒを吸引除去した。さらに同じ洗浄工程を２回繰り返した。
次に、各ウェルに、１００μＬのＨＲＰ標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体溶液を分注し、室温で１時間インキュベーションして抗原抗体反応を行った後、前記と同様に洗浄工程を３回行った。さらに、ペーパータオル上でプレート内の水滴をたたき落とし、各ウェルに、１００μＬのＴＭＢ溶液を分注し、暗下で１５分間インキュベートした後、１００μＬのｓｔｏｐ溶液を分注して発色反応を停止させた。さらに、各ウェルの発色量を調べるため、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した。該アッセイ系では、各ウェルに添加した試料溶液中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが存在している場合には、ＯＤ（４５０ｎｍ）値が上昇する。いずれにおいても、試薬調製から測定までにかかる時間は約４時間であり、洗浄工程を含むため、操作も煩雑であった。さらに、アッセイコストは一試料あたり約３００円（３００円／ｗｅｌｌ）であり、実施例１の場合と比べて高額であった。
【０１１１】
【表２】
【０１１２】
検量線作成用のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物濃度とＯＤ値から近似直線を作成し、各試料のＯＤ値を近似直線（検量線）に代入して、試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。この結果、図５に示すように、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料２、ヒト血清を加えた試料４、及び、ヒト血清にヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ抽出物を加えた試料５では、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ溶液のみを添加した試料２−１と比べて、顕著にＯＤ（４５０ｎｍ）値が上昇しており、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の上昇がみられていたが、ヒトＣ３抽出物を加えた試料３では、ＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇は観察されなかった。これらの結果から、ＥＬＩＳＡ法においても、実施例１と同様に、試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが特異的に検出されていることが確認された。
一方、ヒト血清にヒトＣ３抽出物を加えた試料６では、ヒトＣ３抽出物のみを加えた試料３とは異なり、試料４よりも大きなＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇が観察され、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量がヒト血清よりも増大していることが確認された。これは、血清中のプロテアーゼにより、添加されたヒトＣ３が切断されて新たにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが生じたためと考えられる。また、試料４においても、測定中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が上昇している可能性が示唆された。これらの結果から抗原抗体反応が室温で１時間程度のＥＬＩＳＡ法では、測定中にＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が上昇し、生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を正確に測定できない可能性が高いことが明らかである。
【０１１３】
［比較例２］ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法によるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定２
Ｃ３ａ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｑｕｉｄｅｌ社製）を用いたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度の測定を、抗原抗体反応時間を、比較例１よりも短時間として行った。
具体的には、抗Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的抗体が固相化されたプレートの各ウェルに、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中に溶解した表２記載の添加物を、それぞれ分注した後、室温で１５分間インキュベーションし、抗原抗体反応を行った。比較例１と同様にして洗浄工程を行った後、各ウェルに、１００μＬのＨＲＰ標識された抗Ｃ３ａ／Ｃ３ポリクローナル抗体溶液を分注し、室温で１５分間インキュベーションして抗原抗体反応を行った。その後、さらに比較例１と同様にして洗浄工程及び発色反応を行い、各ウェルの４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した。
この結果、いずれの試料においても、測定されたＯＤ（４５０ｎｍ）値は比較例１の結果よりもはるかに小さく、このため、バックグランドとシグナルとの比が小さく反応を正確に検出することが難しかった。特に検量線は、３１．２５〜１５．６１５ｎＭの領域しか作成することができず、低濃度は測定できなかった。
この作成された検量線と測定されたＯＤ（４５０ｎｍ）値から、各試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を算出した。算出結果を図６に示す。この結果、試料６では、ＯＤ（４５０ｎｍ）値の上昇は確認されず、Ｃ３からのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの切り出しが生じていないようであったが、ウェル間のばらつきが大きく、正確には判定できなかった。
【０１１４】
以上の実施例及び比較例より、本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法により、血液試料等の生体試料中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度を、非常に短時間で正確に測定できること、及び、測定コストも、従来のｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩSＡ法の１／１０以下に抑えることが可能であり、経済的にも好ましいことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ濃度測定方法を用いることにより、生体試料、特に血液試料中の補体成分Ｃ３ａを、短時間で正確かつ簡便に測定することができるため、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する方法であって、
（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、
（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を算出する工程と、
を有し、
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであり、
前記競合用ポリペプチドが、ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドであることを特徴とするヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド。
（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド。
（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド。
（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド。
【請求項２】
前記工程（１ａ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であり、かつ、前記工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間と等しいことを特徴とする、請求項１記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項３】
前記（ｐ１）又は（ｐ３）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項４】
前記（ｐ２）又は（ｐ４）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項５】
前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）であり、前記工程（ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドとヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程。
（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程。
【請求項６】
前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項７】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ１）又は（ｐ２）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、吸光度法による濁度測定により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項８】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記いずれかのポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｐ’１）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ’２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応により結合させたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応。
（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応。
（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応。
【請求項１０】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１１】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、並びに、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチドであることを特徴とする請求項１０記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１２】
前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１０又は１１記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１３】
前記標識物質が蛍光物質であり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする請求項１２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１４】
前記一分子蛍光分析法が蛍光相関分光法（ＦＣＳ）であることを特徴とする請求項１３記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１５】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うものであり、
前記標識物質が酵素又は放射性同位体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１６】
前記標識物質がアルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、酵素反応によって生じる前記酵素の基質の変化による発色又は発光を検出することを特徴とする請求項１５記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１７】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項１９】
９〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はＮ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする請求項１７記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２０】
８〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする請求項１８記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２３】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種のポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチド同士の結合が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応によるものであることを特徴とする請求項２３記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応。
（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応。
（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応。
【請求項２５】
請求項１８又は２０に記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士の結合が、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応によるものであることを特徴とする請求項２５記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２７】
生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するためのキットであって、
請求項１７〜２６記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチド、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体、並びに、濃度既知のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット。
【請求項１】
競合阻害反応を用いて生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定する方法であって、
（１ａ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、生体試料と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｂ） 前記工程（１ａ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｃ） 反応溶液に、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程と、
（１ｄ） 前記工程（１ｃ）において得られた結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量を測定する工程と、
（１ｅ） 前記工程（１ｃ）において反応溶液に添加された競合用ポリペプチド量と、前記工程（１ｄ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量とを相関させる工程と、
（１ｆ） 前記工程（１ｅ）において得られた相関に基づき、工程（１ｂ）において測定されたＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量から、前記生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を算出する工程と、
を有し、
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記（ｐ１）〜（ｐ６）からなる群より選択されるポリペプチドであり、
前記競合用ポリペプチドが、ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドであることを特徴とするヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｐ１）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ２）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ３）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド。
（ｐ４）Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチド。
（ｐ５）前記（ｐ３）のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド。
（ｐ６）前記（ｐ４）のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチド。
【請求項２】
前記工程（１ａ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間が、３０分間以内であり、かつ、前記工程（１ｃ）における反応溶液中のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを結合させる反応時間と等しいことを特徴とする、請求項１記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項３】
前記（ｐ１）又は（ｐ３）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、９〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項４】
前記（ｐ２）又は（ｐ４）の、Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドとして、８〜２０アミノ酸からなるポリペプチドを用いることを特徴とする、請求項１又は２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項５】
前記工程（１ａ）が、下記工程（１ａ’−１）及び（１ａ’−２）であり、前記工程（ｃ）が、下記工程（１ｃ’−１）及び（１ｃ’−２）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（１ａ’−１） 反応溶液に、生体試料と抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ａ’−２） 前記工程（１ａ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドとヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程。
（１ｃ’−１） 反応溶液に、少なくとも１以上の濃度既知の競合用ポリペプチド溶液と、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体とを添加して、競合用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成する工程。
（１ｃ’−２） 前記工程（１ｃ’−１）の後、前記反応溶液に、さらに、所定量のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドを添加して、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと競合用ポリペプチドとを、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体に対して競合的に結合させることにより、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドと抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体との結合体を形成する工程。
【請求項６】
前記工程（１ｂ）が、前記工程（１ａ）における反応溶液自体を測定試料とし、かつ、前記工程（１ｄ）が、前記工程（１ｃ）における反応溶液自体を測定試料とすることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項７】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ１）又は（ｐ２）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、吸光度法による濁度測定により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項８】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、下記いずれかのポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｐ’１）配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたポリペプチド。
（ｐ’２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド同士を、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応により結合させたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応。
（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応。
（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応。
【請求項１０】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１１】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の側鎖に標識物質が結合したポリペプチド、並びに、配列番号１、３、及び４のアミノ酸配列からなる群より選択される１のポリペプチドのＮ末端のアミノ基に標識物質が結合したポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチドであることを特徴とする請求項１０記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１２】
前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１０又は１１記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１３】
前記標識物質が蛍光物質であり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナルを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする請求項１２記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１４】
前記一分子蛍光分析法が蛍光相関分光法（ＦＣＳ）であることを特徴とする請求項１３記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１５】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドが、前記（ｐ５）又は（ｐ６）のポリペプチドであり、前記結合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、前記標識物質から発されるシグナル又は前記標識物質により発されるシグナルを検出することにより行うものであり、
前記標識物質が酵素又は放射性同位体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１６】
前記標識物質がアルカリフォスファターゼ又はペルオキシダーゼであり、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド−抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体複合体を形成しているＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド量の測定を、酵素反応によって生じる前記酵素の基質の変化による発色又は発光を検出することを特徴とする請求項１５記載のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法。
【請求項１７】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項１８】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、リジン残基を有さない又はＮ末端に１個のみ有するポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項１９】
９〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のシステイン残基の側鎖又はＮ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする請求項１７記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２０】
８〜２０アミノ酸からなり、Ｎ末端のアミノ基に標識物質が結合していることを特徴とする請求項１８記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２２】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末側２０アミノ酸からなるアミノ酸配列の一部又は全部のアミノ酸配列を有し、９〜４１アミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２３】
Ｃ末端に配列番号１のアミノ酸配列を有しており、かつ、システイン残基をＮ末端に１個のみ有するポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる群より選択される１種のポリペプチド同士を、Ｎ末端のシステイン残基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチド同士の結合が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの反応によるものであることを特徴とする請求項２３記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
（ｉ）ＳＨ基同士の架橋反応。
（ｉｉ）アミノ基とＳＨ基との架橋反応。
（ｉｉｉ）２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のシステイン残基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応。
【請求項２５】
請求項１８又は２０に記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士を、Ｎ末端のアミノ基を介して結合させたことを特徴とするＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド同士の結合が、２以上のリガンドと特異的に結合する受容体と、Ｎ末端のアミノ基に前記リガンドを結合させたポリペプチドとの結合反応によるものであることを特徴とする請求項２５記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド。
【請求項２７】
生体試料中のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度を測定するためのキットであって、
請求項１７〜２６記載のＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチドからなる群より選択される１のポリペプチド、抗ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ特異的抗体、並びに、濃度既知のヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ又はそのＣ末端の８アミノ酸を含む部分ポリペプチドの標準溶液を含むヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２１０４０８（Ｐ２０１０−２１０４０８Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５６７４２（Ｐ２００９−５６７４２）
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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