ヒトＩＬ１７に対する抗体およびその使用
モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合し、そしてＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる、ＩＬ−１７に結合する抗体は、炎症疾病の処置のための有利な特性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩＬ１７Ａに対する抗体（ＩＬ１７抗体）、その産生のための方法、前記抗体を含む薬学的組成物、およびその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトＩＬ−１７Ａ（ＣＴＬＡ−８、Swiss Prot Q16552、ＩＬ−１７とさらに名付けられる）は、多発性硬化症の病態形成に関与する記憶Ｔ細胞のサブセット（Ｔｈ１７と呼ばれる）によって産生される炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−１７Ａは、他の炎症性サイトカイン、ケモカインおよび接着分子の誘導に役割を果たしている。ＩＬ−１７Ａ中和抗体を用いての動物の処置は、自己免疫性脳脊髄炎の疾病の発症率および重症度を減少させる(Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573)。ＩＬ−１７Ａは、多発性硬化症患者の脳脊髄液において過剰発現されている(Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50; Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis 5 (1999) 101-104; WO 2005/051422)。さらに、ＩＬ−１７Ａ中和抗体は、コラーゲン誘発関節炎のマウスＲＡモデルの重症度および発症率を減少させ、そして高レベルのＩＬ−１７Ａを、ＲＡ患者の炎症が起きている関節の滑液において検出することができる(Ziolkowska, M. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838; Kotake, S. et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352; Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50)。
【０００３】
WO 96/17939, US 5,716,623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276およびWO 00/69436 WO 95/18826 US 6,274,711, US 6,274,711, WO 97/15320, US 6,063,372, WO 2006/013107およびWO200802115は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ａに対する抗体に関する。
【０００４】
発明の要約
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２または９のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含むこと、および軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ＩＬ−１７に結合する抗体を含む。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含むことを特徴とする。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする。好ましくは、ＩＬ−１７に結合し、そして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸配列フラグメントによって特徴付けられる抗体は、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む。突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む好ましい重鎖定常領域が、配列番号１１に示されている。
【０００５】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞株である＜ｈＩＬ−１７＞１Ａ１．３Ｃ１（抗体３Ｃ１）が、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０００６】
【表１】
【０００７】
前記細胞株から得ることのできる抗体（抗体３Ｃ１）が、本発明の好ましい態様である。本発明のさらなる態様は、抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）のキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＴ細胞エピトープの欠失した抗体変異体である。前記抗体は、１nM以下のＩＣ５０値でＩＬ１７に特異的に結合する。３Ｃ１の好ましいヒト化バージョンは、Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７である。
【０００８】
本発明はさらに、ＩＬ−１７に結合し、そしてモノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体にも関する。前記抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【０００９】
好ましくは、前記抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましくは、本発明による抗体は、カニクイザル皮膚線維芽細胞を使用するサイトカイン放出アッセイにおいて、１００ng/mlの濃度で、カニクイザルのＩＬ−１７Ａにより誘発されるＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を１．５nM以下のＩＣ５０値で阻害する。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、薬学的組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物の製造のための方法である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、およびＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、ＩＬ−１７に結合する抗体の重鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、本発明による軽鎖ＣＤＲ３領域、および好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、ＩＬ−１７に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号７または１０の重鎖可変ドメイン並びに配列番号８の可変軽鎖ドメイン、並びに好ましくは重鎖ＩｇＧ１定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、本発明による抗体をコードする核酸である。
【００１４】
本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準において周知であり、そして例えば、Kabat (例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。前記抗体がマウス起源であり、そしてKabat (例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。
【００１５】
本発明による抗体は、ＣＣＤ２５−ＳＫ細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を阻害することによって特に特徴付けられる。本発明による抗体は、０．５nM（１６ng/ml）以下のＩＣ５０値で、ＩＬ−１７により媒介される細胞活性化を特異的に中和する。本発明による抗体は、１nM以下のＩＣ５０値でＩＬ１７に特異的に結合する。
【００１６】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１である。好ましいγ１重鎖定常領域が、配列番号１１、並びにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの突然変異を含まない配列番号１１に示される。
【００１７】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒト補因子Ｃ１ｑに結合しないことによって特徴付けられ、それ故、ＣＤＣエフェクター機能を回避する。
【００１８】
本発明による抗体は、好ましくは、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。本発明による抗体は、Ｌ２３４（アミノ酸２３４位におけるロイシン）、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ＥＵインデックスによる番号付け）において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって好ましくは特徴付けられる。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１９】
本発明はさらに、原核宿主細胞または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現することのできる前記核酸を含む発現ベクター、およびこのような抗体の組換え産生のためのこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明によるベクターを含む、原核宿主細胞または真核宿主細胞を含む。本発明はさらに、原核宿主細胞または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、本発明による組換えヒト抗体またはヒト化抗体の産生のための方法を含む。本発明はさらに、このような組換え法によって得ることのできる抗体も含む。
【００２０】
本発明による抗体は、ＩＬ−１７ターゲッティング療法の必要な患者のための利点を示す。本発明による抗体は、このような免疫学的疾病を患う、特に多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者のための利点をもたらす、新たなそして発明的な特性を有する。本発明による抗体は、処置患者のブドウ球菌性および腸内細菌性の感染に対する感受性を引き起こさない。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者を処置するための方法を提供し、前記方法は、このような疾病を有すると診断された（それ故、このような療法の必要とされる）患者に、本発明によるＩＬ−１７に結合する抗体の有効量を投与することを含む。前記抗体は、好ましくは薬学的組成物で投与される。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を患者に投与することによって特徴付けられる、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者の処置のための方法である。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者の処置のための、および本発明による薬学的組成物の製造のための、本発明による抗体の使用も含む。さらに、本発明は、本発明による薬学的組成物の製造のための方法も含む。
【００２１】
本発明はさらに、本発明による抗体を、場合により、薬学的目的のために抗体の製剤化に有用である緩衝剤および／またはアジュバントと一緒に含む、薬学的組成物も含む。本発明はさらに、薬学的に許容される担体中に本発明による抗体を含む、薬学的組成物も提供する。１つの態様において、薬学的組成物は、製品またはキットに含まれていてもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、完全な抗体および抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない、抗体構造の様々な形態を包含する。本発明による抗体は、好ましくは、本発明による特徴的な特性が保持されている限り、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子工学操作された抗体である。「抗体フラグメント」は、完全長の抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、ダイアボディ、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-52において記載されている。さらに、抗体フラグメントは、ＶＨドメインの特徴を有し、すなわちＶＬドメインと一緒に会合することができ、またはＩＬ−１７に結合するＶＬドメインの特徴を有し、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位に会合することができ、これにより、本発明による抗体の特性を与える、単鎖ポリペプチドを含む。本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物をいう。「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含む、抗体をいう。好ましい態様において、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。
【００２３】
本明細書において使用する「ＩＬ−１７に結合する」という用語は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいての、ヒトＩＬ−１７への前記抗体の結合を意味する。前記抗体が１μg/mlの抗体濃度において７：１以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を引き起こすならば、結合が見られる。本発明による抗体は、１nM（０．１５μg/ml）以下のＩＣ５０値でヒトＩＬ−１７Ａに特異的に結合する。前記抗体は、ＩＬ−１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦには結合せず（７：１未満のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比）、それ故、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する。ＩＬ−１７Ａおよび変異体への結合は、固定化したＩＬ−１７または変異体を使用するＥＬＩＳＡによって行なわれる。
【００２４】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常、エピトープは、特異的な３次元構造特徴、並びに特異的な荷電特徴を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下において前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないことで区別される。好ましくは、本発明による抗体は、ネイティブなＩＬ−１７には特異的に結合するが、変性したＩＬ−１７には特異的に結合しない。本発明のＩＬ−１７抗体は、抗体Ｍａｂ３１７が結合するのと同じ、ＩＬ−１７上のエピトープに結合する。本発明のＩＬ−１７抗体のエピトープ結合特性を、当技術分野において公知の技法を使用して決定し得る。ＩＬ−１７抗体を、in vitroにおけるクロスブロッキング（crossblocking）結合アッセイによって試験し、ＩＬ−１７への抗体Ｍａｂ３１７の結合を妨害する試験抗体の能力を決定する。試験抗体が抗体Ｍａｂ３１７によって少なくとも１５％置換されると、エピトープは近似している。
【００２５】
本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接的に関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの各対を意味する。可変軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインは同じ一般的な構造を有し、そして各々のドメインが、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲはβ−シート構造を接続するループを形成し得る。各々の鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によってその３次元構造が保たれ、そして他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００２６】
本明細書において使用する場合の「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、そして抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義および／または「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００２７】
本出願内において使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の基を意味する。
【００２８】
本明細書において使用する「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖ＤＮＡでもまたは二本鎖ＤＮＡでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸と機能的関係にあるように配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現されるならば、それは前記ポリペプチドのためのＤＮＡと作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼすならば、それはコード配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように位置しているならば、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が同鎖上にあり、そして分泌リーダーの場合には、連続的およびリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣行に従って使用する。本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は同義語として使用され、そして全てのこのような名称は子孫も含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、対象の初代細胞、および継代数に関係なくそれらから誘導された培養物も含む。全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異に因り、ＤＮＡ内容物が正確に同一ではない場合があることを理解されたい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングしたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。
【００２９】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者には周知の用語であり、そして抗体のパパインによる切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、そしてこれらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域により異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑへの結合およびＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞障害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害作用）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において規定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野の水準において公知であり、そして例えばBoakle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434によって記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（KabatのＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照されたい）である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの抗体は通常、補体活性化およびＣ１ｑへの結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑに結合しない。
【００３０】
本発明による抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのヒト抗体のＦｃ部分である、ヒト起源のＦｃ部分を含む。本発明による抗体のＦｃ部分については、好ましくは、以下に定義するＣ１ｑへの結合は全く検出することができない。
【００３１】
本発明は、それ故、本発明による抗体がＩＬ−１７に結合し、ヒト起源のＦｃ部分を含み、そしてヒト補因子Ｃ１ｑに結合せず、それ故、ＣＤＣエフェクター機能を回避する、前記抗体を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明による抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５における突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスのＦｃγレセプターの結合に関し、そして／またはＰＶＡ２３６突然変異を含む。好ましいのは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である（ＰＶＡ２３６は、ＩｇＧ１のアミノ酸２３３位〜２３６位のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（１文字アミノ酸コードで示される）またはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡによって置換されていることを意味する）。従って、本発明は、本発明による抗体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体であることを特徴とする、本発明による抗体を提供する。１つの態様において、前記抗体はヒト抗体である。別の態様において、前記抗体はヒト化抗体である。１つの態様において、本発明は、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含み、そして前記抗体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体であることを特徴とする、本発明による抗体を提供し、前記抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＩＬ−１７に結合する。別の態様において、ＫＤの範囲は１０−１１〜１０−９Ｍである。
【００３３】
Ｃ１ｑへの結合を、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に従って測定することができる。本発明においてＣ１ｑへの結合が無いことは、ＥＬＩＳＡプレートが、種々の濃度の抗体でコーティングされている様なアッセイにおいて、ヒトＣ１ｑが加えられる場合に、特徴づけられる。Ｃ１ｑへの結合は、ヒトＣ１ｑに対して作られた抗体によって検出され、その後、ペルオキシダーゼで標識したコンジュゲートを、ペルオキシダーゼ基質のＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）を用いて検出する。試験抗体についての４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、１０μg/mlの抗体濃度において０．０５未満である場合に、本発明においてＣ１ｑへの結合が無いことが、見つけられる。
【００３４】
本発明による抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準において周知であり、そして例えばKabat (例えばJohnson, G.およびWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号２３を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸である。
【００３６】
本発明は、本発明による抗体の治療有効量を患者に投与することによって特徴付けられる、療法の必要な患者の処置のための方法を含む。本発明は、療法のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、炎症性疾患および血栓性疾患の予防および処置のための医薬品の調製のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、炎症性疾病の処置のための、好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症および関節リウマチの処置のための、本発明による抗体の使用を含む。
【００３７】
本発明による抗体は、さらに、本発明による抗体の前記の特徴に影響を及ぼさないかまたは変化させない、「保存的な配列の改変」（変異抗体）、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変を有する、このような抗体を含む。改変を、当技術分野において公知の標準的な技法、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的なアミノ酸の置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、ヒト抗ＩＬ−１７抗体において予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することができる。それ故、「変異体」抗ＩＬ−１７抗体は、本明細書において、親抗体の１つ以上の可変領域における１０個まで、好ましくは約２個から約５個までの付加、欠失および／または置換によって、「親」抗ＩＬ−１７抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子をいう。アミノ酸置換を、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって行なうことができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１７に結合するヒトＩｇＧ１タイプの抗体の重鎖をコードする核酸の配列が、前記の改変される抗体がＣ１ｑおよび／またはＦｃγレセプターに結合しないような様式で改変されており、前記の改変された核酸および前記抗体の軽鎖をコードする核酸が発現ベクターに挿入され、前記ベクターが真核宿主細胞に挿入され、前記のコードタンパク質が発現されそして宿主細胞または上清から回収されることを特徴とする、Ｆｃγレセプターおよび／またはＣ１ｑに結合しない、ＩＬ−１７に対する抗体の産生のための方法である。
【００３９】
配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大の配列同一率を達成した後、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端または内部における伸長、欠失または挿入のいずれも、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されないものとする。変異体は、ヒトＩＬ−１７に結合する能力を保持し、そして好ましくは親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、変異体は、処置中に低減した副作用を有し得る。
【００４０】
「親」抗体は抗体３Ｃ１のＣＤＲ領域を含み、そして好ましくは変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有し、そして存在する場合、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。
【００４１】
本発明による抗体は、好ましくは、組換え手段によって産生される。このような方法は当技術分野の水準において広く公知であり、そして、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離および通常は薬学的に許容される純度までの精製を含む。タンパク質の発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはE.coli細胞などの適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞において行なわれ、そして前記抗体が細胞から（上清からまたは細胞溶解後に）回収される。抗体の組換え産生は当技術分野の水準において周知であり、そして、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の概説記事において記載されている。抗体は、全細胞中、細胞溶解液中、または部分精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、カラムクロマトグラフィーおよび当技術分野において周知のその他の技法を含む、標準的な技法によって、他の細胞性成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を排除するために行なわれる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83によって、およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離およびシークエンスされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ源およびＲＮＡ源として作用し得る。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し得、その後、これを別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【００４２】
ヒトＩＬ−１７抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を、抗体をコードする核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば前記したように非常に制限された範囲でしか実施することができない。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプおよびエピトープの結合などの前記の抗体の特徴を変化させることはないが、組換え産生の収率、タンパク質の安定性を向上させ得るか、または精製を促進し得る。また、抗ＩＬ−１７抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、分子の酸化的安定性を向上させ、そして異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合（群）を抗体に加えて、その安定性を向上させることもできる（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを変化させる。「変化させる」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を除去すること、および／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、前記抗体が（Ｎ結合グリコシル化部位のための）前記のトリペプチド配列の１つ以上を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に行なわれる。
【００４３】
抗ＩＬ−１７抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、またはヒト化抗ＩＬ−１７抗体のより以前に調製された変異体または非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４４】
抗体の別のタイプの共有結合による改変は、US Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337において示される様式で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの多種多様な非タンパク質性ポリマーの１つに前記抗体を連結させることを含む。
【００４５】
本発明による重鎖および軽鎖の可変ドメインを、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列および転写終結配列と組み合わせて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖の発現構築物を単一ベクター中に組合せても、宿主細胞中に同時トランスフェクションしても、連続的にトランスフェクションしても、または別々にトランスフェクションしてもよく、これをその後、融合して、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。
【００４６】
別の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体の１つもしくは組合せまたはその抗原結合部分を含む、例えば薬学的組成物などの組成物を提供する。本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」としては、生理的に適合する、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収／再吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、注射または注入のために適している。本発明の組成物を、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。当業者によって理解されているように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に依存して変更されるだろう。薬学的に許容される担体としては、無菌で水性の液剤または分散剤、および無菌注射用液剤もしくは分散剤の調製のための無菌の散剤が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝食塩水溶液であり得る。選択した投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者には公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形へと製剤化される。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量（有効量）が得られるように変更され得る。選択した用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、使用する特定の化合物の排泄速度、使用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態および病歴、並びに医学分野において周知である同様な因子を含む、多種多様な薬物動態因子に依存する。
【００４７】
本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息、および移植片拒絶を患う、患者の処置のための本発明による抗体の使用を含む。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、関節リウマチを患う患者の処置のための、抗ＩＬ−１７抗体、好ましくは本発明による抗体の使用であり、前記患者は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度応答するか、または応答しない。本発明のさらなる態様は、関節リウマチを患う患者の処置のための医薬品の製造のための、抗ＩＬ−１７抗体、好ましくは本発明による抗体の使用であり、前記患者は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度応答するか、または応答しない。ＲＡ処置のためのＴＮＦアンタゴニストは、例えば、インフリキシマブ（ＩＦＸ、レミケード（登録商標））、エタネルセプト（ＥＴＡ、エンブレル（登録商標））、およびアダリムマブ（ＡＤＡ、ヒュミラ（登録商標））である。抗ＩＬ−１７抗体は、好ましくは、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度に応答するかまたは応答しない患者に、少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間投与される。
【００４９】
本発明はさらに、薬学的に許容される担体と共に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造のための方法、およびこのような方法のための本発明による前記抗体の使用を提供する。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、薬学的物質の製造のための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。本発明はまた、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、薬学的物質の製造のための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。
【００５０】
配列の説明
配列番号１ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ３
配列番号２ Ｍａｂ１０６の重鎖ＣＤＲ２
配列番号３ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号４ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号６ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号７ Ｍａｂ１０６の重鎖可変ドメイン
配列番号８ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖可変ドメイン
配列番号９ Ｍａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ２
配列番号１０ Ｍａｂ１０６の重鎖可変ドメイン
配列番号１１ γ１重鎖定常領域
配列番号１２ κ軽鎖定常領域
【００５１】
実施例
実施例１
免疫化の説明
免疫化を、２０週間以内に、５匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス１匹あたりPeprotech (http://www.peprotech.com;製造番号: 200-17、１％アルブミンを含む１％ＰＢＳ中)からの２５０（１×）および１００μg（３×）の組換えヒトＩＬ１７を使用して行なった。
【００５２】
実施例２
ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ−１７への結合
NUNC（登録商標）Maxisorpプレート（９６ウェル）を、ＰＢＳ中０．５μg/mlの濃度の組換えヒトＩＬ−１７（Peprotech 200-17番、www.peprotech.com）でコーティングする（１００ml/ウェル）。プレートをオービタルシェーカーで撹拌しながら２時間３７℃でインキュベーションする。その後、コーティング溶液を除去し、そして１００μl/ウェルのＰＢＳＴＣ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Tween（登録商標）２０、２％ニワトリ血清）を加える。プレートを室温で１時間インキュベーションする。ブロッキング溶液を除去し、そして試料（ブランク：ＰＢＳＴＣ試料（ＰＢＳ中１０μg/ml）：本発明による抗ヒトＩＬ−１７抗体３Ｃ１およびＭａｂ１０６；eBioscience (www.ebioscience.com)のＭａｂ１６−７１７８−８５；R&D Systems (www.rndsystems.com)のＭＡＢ３１７、NVP-AIN-497 (WO 2006013107)；をプレートに加える（１００μg/ml）。プレートを撹拌しながら室温でインキュベーションする。試料を除去し、プレートを、２００μl/ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて３回洗浄し、そして、マウス抗体の検出のための二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ、ＨＲＰコンジュゲート；Chemicon AP127P、www.millipore.com)、またはヒト化抗体の検出のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ、ＨＲＰコンジュゲート(Chemicon AP113P)を加える。二次抗体をＰＢＳＴＣ中で１：１００００に希釈し、そしてプレートを撹拌しながら室温で１時間インキュベーションする。二次抗体を除去し、プレートを２００μl/ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて３回洗浄し、そして１００μl/ウェルのＡＢＴＳ（登録商標）(Roche Diagnostics GmbH)を加える。ＩＬ−１７Ａへの結合（１００％と設定）と比較した吸光度を、４０５/４９２nmにおいて測定する。他のヒトＩＬ−１７サブタイプ（ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥおよびＩＬ−１７Ｆ）への結合も、同じアッセイフォーマットを用いて行った。結果を表１に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
実施例３
ＩｇＧ１クラスの免疫グロブリンのための発現プラスミドの調製
プラスミド６４５４（以下においてｐ６４５４として示す）は、真核細胞における抗ＩＬ−１７抗体の発現のための発現プラスミドである（エキソン−イントロン構成を保持したゲノム的に構成された発現カセット）。それは、以下の機能的エレメントを含む：
−ベクターｐＵＣ１８由来の複製起点（ｐＵＣ起点）
−E.coliにおいてアンピシリン耐性（Amp）を付与するβ（ベータ）ラクタマーゼ遺伝子、
−以下のエレメントを含むγ１−重鎖の発現のための発現カセット：
−ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター）、
−コザック配列を含む合成５’ＵＴＲ、
−シグナル配列イントロン（Ｌ１＿イントロン＿Ｌ２）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−３’末端にスプライスドナー部位が配置された重鎖可変領域（ＶＨ）のためのｃＤＮＡ、
−マウス免疫グロブリンμ−エンハンサー領域、
−エキソンＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、介在イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を有する３’ＵＴＲを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖γ１−遺伝子（ＩＧＨＧ１）、
−以下のエレメントを含むκ軽鎖の発現のための発現カセット：
−ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター）、
−コザック配列を含む合成５’ＵＴＲ、
−シグナル配列イントロン（Ｌ１＿イントロンＬ２＿)を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−３’末端にスプライスドナー部位が配置された軽鎖可変領域のためのｃＤＮＡ（ＶＬ）、
−イントロン性のマウスＩｇ−κエンハンサー領域、
−ＩＧＫＣエキソン、およびポリアデニル化シグナル配列を有するＩＧＫ ３’ＵＴＲを含む、ヒト免疫グロブリンκ遺伝子（ＩＧＫ）、
−以下を含む、真核細胞における栄養要求選択に適したマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現のための発現カセット、
−短縮バージョンのＳＶ４０初期プロモーターおよび起点、
−マウスＤＨＦＲのコード配列、
−ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル。
【００５５】
ｐ６４５４をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、そしてメトトレキセート（ＭＴＸ）を用いての選択後に安定な細胞株を単離し、そしてＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧに関するヒト抗体の産生についてスクリーニングした。
【００５６】
実施例４
補体系の活性化の検討（Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ）
本発明による抗体のＣ１ｑへの結合を調べるために、ＥＬＩＳＡアプローチを使用する。Ｃ１ｑは適応免疫系の一部であり、そして免疫複合体への結合時に、いくつかのチモーゲンの連続的な活性化を引き起こす。続いて、酵素は、Ｃ３分子の切断を引き起こし、これは、炎症反応の開始、外来または異常な粒子のオプソニン化、および細胞膜の溶解をもたらし得る。
【００５７】
１０μg/mLから０．１５６μg/mLまでの７つの濃度の、ＰＢＳ−緩衝液中の試験しようとする抗体を１００μl/ウェルで用いて、ＭＴＰ（Nunc）を一晩４℃でコーティングする。フリーの結合部位のブロッキングは、ＰＢＳ中３％ＢＰＬＡ（Roche）を２００μl/ウェルで用いて１時間かけて室温で行なう。ＭＴＰを、３％ＢＰＬＡのＰＢＳ溶液中２μg/mLのＣ１ｑ(Quiddel)と共にインキュベーションする（１００μg/mL）。ＭＴＰを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて室温で３回洗浄する。ＰＢＳ中３％ＢＰＬＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の０．２５μg/mLのポリクローナルウサギ抗Ｃ１ｑ抗体（DAKO）を１００μl/ウェルで添加することによって１時間かけて室温で結合を検出した。ＭＴＰを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて室温で３回洗浄する。ＰＢＳ中３％Ｔｗｅｅｎ２０中の０．１μg/mLの二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＰＯＤ(Jackson Immuno Research)を１００μl/ウェルで１時間かけて室温で加える。室温でＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてＭＴＰを３回洗浄した後、ＭＴＰを、ＡＢＴＳ溶液（Roche）と共にインキュベーションし、そして４０５nmの波長における吸光を、４９０nmの参照波長を用いて測定する。抗体でコーティングされていないが、同一の検出手順によって処理されたウェルにおけるバックグラウンドシグナルを決定する。試験抗体についての４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、１０μg/mlの抗体濃度において０．０５未満であるならば、Ｃ１ｑへの結合は全く見られない。
【００５８】
実施例５
ＢＩＡｃｏｒｅクロスブロッキング実験を介したエピトープ領域のマッピング
全ての測定を、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器を使用して行なった。システムおよび試料緩衝液はＨＢＳ−ＥＰであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、３．４mM ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ/ｖ））。ＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５センサーチップをプレコンディショニング手順にかけた。連続的に０．１％ＳＤＳ、５０mM ＮａＯＨ、１０mM ＨＣｌおよび１００mM Ｈ３ＰＯ４を３０秒間かけてフローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４の上に注入した。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ｗｉｚａｒｄ ｖ．４．１を使用して製造業者の指示に従ってアミンカップリング手順を行なった。
【００５９】
キメラ抗体またはヒト化抗体を用いてのクロスブロッキング実験を実施するために、ＥＤＣ／ＮＨＳによるセンサー表面の活性化後、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Jackson)を、全てのセンサーフローセル（ＦＣ）上に固定した。１０mM ＮａＡｃ ｐＨ５．０中の３０μg/mlのポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、１０μl/分で７分間使用して、１０，０００ＲＵの抗体捕捉システムを固定した。表面を、エタノールアミンを用いた飽和によって不活性化した。ヒト捕捉システムセンサーを、１０μl/分で２分間のｈｕＩｇＧ分析物（Bayer）の結合を５サイクル、および３０μl/分で３分間の１０mMグリシンｐＨ１．７を用いての再生を用いて調整した。
【００６０】
１０μl/分の流速で、一次ｍＡｂをＦＣ１〜ＦＣ４に３分間かけて注入した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の５０μg/mlのｈｕＩｇＧ（Bayer）からの混液を、ＦＣ１〜ＦＣ４に、１０μl/分で３分間注入することを使用して、センサー捕捉システムのフリーの結合能をブロッキングした。続いて、抗原ｒｈｕＩＬ１７−Ａを、ＦＣ１〜ＦＣ４に１０μl/分で３分間注入して、一次抗体結合能を飽和した。３０μl/分で３分間のＦＣ１〜ＦＣ４への２回目の注入を行ない、その後、二次抗体を別々に３０μl/分で３分間かけて、フローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４に注入した。センサーを、１０mMグリシン（ｐＨ１．７５）を３０μl/分で３分間使用して再生した。
【００６１】
最初に、０nMの分析物の注入を全てのセンサーグラムから差し引き、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉システムからの一次抗体の解離を修正した。二次抗体および一次抗体の応答シグナルによって商が形成された。商はモル比（ＭＲ）の名称を有し、これはエピトープ領域の到達容易性を示す。
【００６２】
モル比の数値は行列で列挙した。相同的ｍＡｂ組合せは、ブロッキング手順が成功裏に実施されたかどうかの対照として作用した。カットオフは、相同的ｍＡｂ組合せによって定義された。
【００６３】
クロスブロッキング実験におけるカットオフは、Ｍａｂ１０６相同的アッセイフォーマットに設定された（９％）。ＭＲ＝１５％を越えるモル比の数値は、独立したエピトープへの到達に関する。
【００６４】
エピトープマッピングからの結果（表２参照）は、Ｍａｂ Ｋ１０６およびその誘導体のＭａｂ１０７が、ＮＶＰ−ＡＩＮ−４９７とは異なるエピトープ領域に結合することを示す。さらに、Ｍａｂ Ｋ１０６は、ｅＢｉｏ６４ＣＡＰ１７とは異なるエピトープを覆い、そしてＭａｂ３１７と同じエピトープ領域を覆う。
【００６５】
【表３】
【００６６】
分析のカットオフは、相同的アッセイ組合せによって定義される。（１０６、９％）；（ＡＩＮ−４５７、６％）；（ｅＢｉｏ６４ＣＡＰ１７、７％）；（Ｍａｂ３１７、０％）。ここでカットオフは、相同的Ｍａｂ１０６アッセイに設定された。
【００６７】
実施例６
サイトカイン放出アッセイ、ＩＬ−１７Ａにより誘発されるｈＩＬ−８の放出の阻害
アッセイは、抗ＩＬ−１７抗体のプレインキュベーションを伴う、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦ−αを用いての刺激後の、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のｈＩＬ−８の産生の検出として行なわれる。ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞はＩＬ−１７レセプターを有する。可溶性ＩＬ−１７Ａは、これらのＩＬ−１７レセプターに結合する。ＩＬ−１７Ａに対する抗体はＩＬ−１７Ａに結合する。機序はＴＮＦαの存在下においてのみ働く。ＩＬ−１７レセプターへのＩＬ−１７Ａの結合を通して、細胞はｈＩＬ−８を産生し、これを、ＥＬＩＳＡによって解読値として検出することができる。測定されたｈＩＬ−８は、どの濃度で抗ＩＬ−１７抗体が、ＩＬ−１７によるＣＣＤ−２５ＳＫ細胞の刺激を阻害するかの情報を与える。
【００６８】
ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞を、４８ウェルプレート中で２．５×１０４個の細胞/ウェルの細胞密度で播種し（容量、０．４５ml/ウェル）、そして２４時間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩インキュベーションした後、細胞を、９０００；３０００；１０００；３３３．３；１１１．１；３７．０３；１２．３４；および４．１１ng/mlの最終濃度の抗ＩＬ−１７抗体を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズは、５０μl/ウェルの培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１０ng/mlのＩＬ−１７Ａおよび５０pg/mlのＴＮＦ−αの混合物（５０μl/ウェル、１０倍濃縮）を用いて刺激し、そして２４時間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩インキュベーションした後、上清を９６ウェルプレートに移し、そしてｈＩＬ−８ＥＬＩＳＡのための中間体として−２０℃で凍結した。
【００６９】
ｈＩＬ−８ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして２時間室温でインキュベーションした。標準的な希釈シリーズ：４００pg/ml；２００pg/ml；１００pg/ml；５０pg/ml；２５pg/ml；１２．５pg/ml；６．３pg/mlおよび陰性対照としてのアッセイ希釈液。試料の希釈は１：２００であった。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで４回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで６回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして１２分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応を５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止した。解読は、４５０nmで３０分以内に５７０nmでのλ修正と共に行なった。結果を表３に示す（８０％の最大阻害と比較して測定したＩＣ５０値）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
実施例７
滑膜細胞によるサイトカインの放出アッセイ、ＩＬ−１７Ａにより誘発されるｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８の阻害
初代ヒト線維芽細胞様の滑膜細胞（ＨＦＬＳ）の細胞は、ＩＬ−１７Ａによる刺激に応答してｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８を産生する。アッセイを、刺激前に抗ＩＬ−１７抗体と共に細胞をプレインキュベーションした後に、ＨＦＬＳ細胞によるこのＩＬ−１７Ａの刺激するｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８の産生の阻害を測定することによって行う。
【００７２】
ＨＦＬＳ細胞を、４８ウェルプレート中０．５mlの容量で４×１０５個の細胞/mlの細胞密度で播種し、そして３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションして接着させた。一晩インキュベーションした後、培地を４００μlの新たな培地と交換し、そして細胞を、一連の抗体濃度（１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、０ng/ml）の抗ＩＬ−１７を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズを、５０μl/ウェルを使用して培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１００ng/mlのＩＬ−１７Ａ（５０μlの１０００ng/ml（１０倍濃縮））を用いて刺激し、そして一晩３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーション（１８時間）した。インキュベーション期間後、上清を新たなチューブに移し、そして直ちに分析するか、またはＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃に保存するかのいずれかを行なった。ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８のＥＬＩＳＡのために、１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして２時間室温で製造業者の指示に従ってインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで少なくとも３回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで少なくとも３回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして解読に十分な色が発生するまでインキュベーションした。インキュベーション後、反応を、５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、そして４５０nmの波長で３０分以内にプレート解読機で解読した。結果を表４に示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
実施例８
カニクイザルＩＬ−１７Ａとの交差反応性（結合アッセイ）
結合アッセイを、実施例２に従って行なった。結果を表５に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
実施例９
カニクイザル（Maccaca Fasicularis）サイトカイン放出アッセイ、カニクイザルのＩＬ−１７Ａにより誘発されたＩＬ−６およびＩＬ−８の産生の阻害
カニクイザル皮膚線維芽（ＣＤＦ）細胞は、ヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１７Ａの刺激に応答してカニクイザルのＩＬ−６およびＩＬ−８を産生する。アッセイを、刺激前にヒトＩＬ−１７に対して生じた抗ＩＬ−１７抗体と共に細胞をプレインキュベーションした後、ＣＤＦ細胞による、このカニクイザルＩＬ−１７Ａの刺激によるＩＬ６およびＩＬ−８の産生の阻害を測定することによって行う。
【００７７】
ＣＤＦ細胞を、４８ウェルプレート中０．５mlの容量で２×１０５個の細胞/mlの細胞密度で播種し、そして３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションして接着させた。一晩インキュベーションした後、培地を４００μlの新たな培地と交換し、そして細胞を、一連の抗体濃度（１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、０ng/ml）の抗ＩＬ−１７抗体を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズを、５０μl/ウェルを使用して培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１００ng/mlのＩＬ−１７Ａ（５０μlの１０００ng/ml（１０倍濃縮））を用いて刺激し、そして３７℃および５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベーションした。インキュベーション期間後、上清を新たなチューブに移し、そして直ちに分析するか、またはＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で保存するかのいずれかを行なった。ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８ ＥＬＩＳＡは、そのそれぞれのカニクイザルサイトカインと交差反応性であることが示され、そしてこれを使用して定量的サイトカインレベルを定量した。ＥＬＩＳＡのために、１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして製造業者の指示に従って２時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルを用いて少なくとも３回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルを用いて少なくとも３回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして解読に十分な色が発生するまでインキュベーションした。インキュベーション後、反応を、５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、そして３０分以内に４５０nmの波長でプレート解読機で解読した。結果を表６に示す。
【００７８】
【表７】
【００７９】
実施例１０
ユーロピウムに基づいたＡＤＣＣアッセイ
ＰＢＬを、フィコール・パックと勾配遠心分離によって単離する：ヘパリン処理した血液試料をＰＢＳを用いて１：１に希釈した。８mlの希釈した血液をフィコール上に重層し、そして８００ｇで３０分間遠心分離にかけた。細胞（ＰＢＬ）を回収し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳを用いて洗浄し、そして細胞培養培地中に再懸濁した。細胞を、２．５×１０６個の細胞/mlまで希釈した。（これは、１ウェルあたり５×１０３個のターゲット細胞を使用する場合、２５：１のエフェクター／ターゲット比がもたらされる）。
【００８０】
ターゲット細胞を、ＢＡＤＴＡ（２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカルボン酸アセトキシメチルエステル）を用いて標識する：細胞を、アキュターゼ（商標）(Millipore)の添加によって収集し、１回洗浄し、そして１×１０６個の細胞/mlまで希釈した。１×１０６個の細胞あたり２．５μlのＢＡＤＴＡを加え、そして３５分間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションした。標識期間後、細胞を、１０mlの培養培地を用いて希釈し、２００ｇで１０分間遠心分離にかけ、そして上清を吸引した。この工程を、培養培地／２mMプロベネシドを用いて３回繰り返し、そして試料を１×１０５個の細胞/mlまで希釈し、３００ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を取り出し、そして５０μlをピペットで、バックグラウンド対照のためのウェルに入れた。
【００８１】
バックグラウンド：５０μlのアリコートを、１００μlの培地を用いて希釈。自発的溶解：５０μlの標識されたターゲット細胞懸濁液；１００μlの培養培地を加え、そして残りの試料のように２時間／３７℃でインキュベーションする。最大溶解：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；１００μlのTriton（登録商標）Ｘ−１００（０．５％ＰＢＳ溶液）を加え、そして２時間／３７℃でインキュベーションする。抗体を含まない溶解対照：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；５０μlの培養培地を加え；５０μlのエフェクター細胞を加え、２時間で３７℃。エフェクター細胞を含まない溶解対照：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；５０μlの培養培地を加え、使用される最も高い濃度の５０mlの抗体溶液を加え、そして２時間／３７℃でインキュベーションする。
【００８２】
インキュベーション期間終了時に、９６ウェルプレートを１００rpmで遠心分離にかけた。２０μlの各上清を、OptiPlate（登録商標）ＨＴＲＦ−９６（Packard）に移し、そして２００mlのユーロピウム溶液を加え、そして振とう機で１５分間インキュベーションした。時間分解蛍光に関する蛍光を測定し、そして自発的放出および特異的放出を、以下の式に従って算出した：
【００８３】
特異的放出％＝特異的溶解（計数）−自発的溶解（計数）×１００
最大溶解（計数）−自発的溶解（計数）
【００８４】
抗体１０６の添加後に有意な特異的放出（ＡＤＣＣ）は全く測定されなかった。
【００８５】
実施例１１
ＣＤＣアッセイ
細胞をトリプシンの添加により収集し、洗浄し、１×１０５個の細胞/mlとなるまで希釈し、そして１００μl/ウェルを９６ウェル平底マイクロタイタープレートに加えた。抗体を培地中２５μlの容量で６倍の最終濃度で加えた（それぞれ抗体−リガンド複合体）。３０分間のインキュベーション時間後、２５μlの新たに溶解した幼齢ウサギ補体(Cedarlane CL3441、１mlの凍結乾燥物、４mlの再蒸留水中に新たに希釈)を、１：２４の補体最終濃度となるまで加えた。２０時間のインキュベーション期間後、５０μlの上清を取り出し、そして１００μlのCell Titer Glo（登録商標）試薬(Promega Corp.)を残りの１００μlの上清に加えた。プレートを２分間オービタルシェーカーで振とうし、１００μl/ウェルを黒ルミネセンスマイクロタイタープレート（Costar）に移し、そして発光を測定した。
【００８６】
対照：培地対照（ターゲット細胞＋５０μlの培地）；最大溶解（ターゲット細胞＋５０μl ０．５％Triton X-100）、補体対照（ターゲット細胞＋２５μlの培地＋２５μlの補体）。
【００８７】
結果：抗ＩＬ１７抗体１０６を用いて、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を全く検出できなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩＬ１７Ａに対する抗体（ＩＬ１７抗体）、その産生のための方法、前記抗体を含む薬学的組成物、およびその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトＩＬ−１７Ａ（ＣＴＬＡ−８、Swiss Prot Q16552、ＩＬ−１７とさらに名付けられる）は、多発性硬化症の病態形成に関与する記憶Ｔ細胞のサブセット（Ｔｈ１７と呼ばれる）によって産生される炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−１７Ａは、他の炎症性サイトカイン、ケモカインおよび接着分子の誘導に役割を果たしている。ＩＬ−１７Ａ中和抗体を用いての動物の処置は、自己免疫性脳脊髄炎の疾病の発症率および重症度を減少させる(Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573)。ＩＬ−１７Ａは、多発性硬化症患者の脳脊髄液において過剰発現されている(Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50; Matusevicius, D. et al., Multiple Sclerosis 5 (1999) 101-104; WO 2005/051422)。さらに、ＩＬ−１７Ａ中和抗体は、コラーゲン誘発関節炎のマウスＲＡモデルの重症度および発症率を減少させ、そして高レベルのＩＬ−１７Ａを、ＲＡ患者の炎症が起きている関節の滑液において検出することができる(Ziolkowska, M. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838; Kotake, S. et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352; Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50)。
【０００３】
WO 96/17939, US 5,716,623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276およびWO 00/69436 WO 95/18826 US 6,274,711, US 6,274,711, WO 97/15320, US 6,063,372, WO 2006/013107およびWO200802115は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ａに対する抗体に関する。
【０００４】
発明の要約
本発明は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２または９のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含むこと、および軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ＩＬ−１７に結合する抗体を含む。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含むことを特徴とする。好ましくは、前記抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする。好ましくは、ＩＬ−１７に結合し、そして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸配列フラグメントによって特徴付けられる抗体は、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む。突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む好ましい重鎖定常領域が、配列番号１１に示されている。
【０００５】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞株である＜ｈＩＬ−１７＞１Ａ１．３Ｃ１（抗体３Ｃ１）が、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０００６】
【表１】
【０００７】
前記細胞株から得ることのできる抗体（抗体３Ｃ１）が、本発明の好ましい態様である。本発明のさらなる態様は、抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）のキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＴ細胞エピトープの欠失した抗体変異体である。前記抗体は、１nM以下のＩＣ５０値でＩＬ１７に特異的に結合する。３Ｃ１の好ましいヒト化バージョンは、Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７である。
【０００８】
本発明はさらに、ＩＬ−１７に結合し、そしてモノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体にも関する。前記抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【０００９】
好ましくは、前記抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましくは、本発明による抗体は、カニクイザル皮膚線維芽細胞を使用するサイトカイン放出アッセイにおいて、１００ng/mlの濃度で、カニクイザルのＩＬ−１７Ａにより誘発されるＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を１．５nM以下のＩＣ５０値で阻害する。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、薬学的組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物の製造のための方法である。好ましくは、薬学的組成物は、モノクローナル抗体３Ｃ１が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる抗体を含む。好ましくは、薬学的組成物の抗体は、少なくとも１０−８Ｍ−１から１０−１２Ｍ−１の親和性でＩＬ−１７に結合し、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、およびＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、ＩＬ−１７に結合する抗体の重鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、本発明による軽鎖ＣＤＲ３領域、および好ましくはＩｇＧ１重鎖定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、ＩＬ−１７に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸である。好ましくは、前記抗体はさらに、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含む。本発明のさらなる態様は、配列番号７または１０の重鎖可変ドメイン並びに配列番号８の可変軽鎖ドメイン、並びに好ましくは重鎖ＩｇＧ１定常ドメインにおける突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、本発明による抗体をコードする核酸である。
【００１４】
本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準において周知であり、そして例えば、Kabat (例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。前記抗体がマウス起源であり、そしてKabat (例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。
【００１５】
本発明による抗体は、ＣＣＤ２５−ＳＫ細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を阻害することによって特に特徴付けられる。本発明による抗体は、０．５nM（１６ng/ml）以下のＩＣ５０値で、ＩＬ−１７により媒介される細胞活性化を特異的に中和する。本発明による抗体は、１nM以下のＩＣ５０値でＩＬ１７に特異的に結合する。
【００１６】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１である。好ましいγ１重鎖定常領域が、配列番号１１、並びにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの突然変異を含まない配列番号１１に示される。
【００１７】
本発明による抗体は、好ましくは、ヒト補因子Ｃ１ｑに結合しないことによって特徴付けられ、それ故、ＣＤＣエフェクター機能を回避する。
【００１８】
本発明による抗体は、好ましくは、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位、好ましくはアミノ酸２２０位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において、改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプである。本発明による抗体は、Ｌ２３４（アミノ酸２３４位におけるロイシン）、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ＥＵインデックスによる番号付け）において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって好ましくは特徴付けられる。好ましくは、前記抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００１９】
本発明はさらに、原核宿主細胞または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現することのできる前記核酸を含む発現ベクター、およびこのような抗体の組換え産生のためのこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明によるベクターを含む、原核宿主細胞または真核宿主細胞を含む。本発明はさらに、原核宿主細胞または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、本発明による組換えヒト抗体またはヒト化抗体の産生のための方法を含む。本発明はさらに、このような組換え法によって得ることのできる抗体も含む。
【００２０】
本発明による抗体は、ＩＬ−１７ターゲッティング療法の必要な患者のための利点を示す。本発明による抗体は、このような免疫学的疾病を患う、特に多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者のための利点をもたらす、新たなそして発明的な特性を有する。本発明による抗体は、処置患者のブドウ球菌性および腸内細菌性の感染に対する感受性を引き起こさない。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者を処置するための方法を提供し、前記方法は、このような疾病を有すると診断された（それ故、このような療法の必要とされる）患者に、本発明によるＩＬ−１７に結合する抗体の有効量を投与することを含む。前記抗体は、好ましくは薬学的組成物で投与される。本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を患者に投与することによって特徴付けられる、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者の処置のための方法である。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息または移植片拒絶を患う患者の処置のための、および本発明による薬学的組成物の製造のための、本発明による抗体の使用も含む。さらに、本発明は、本発明による薬学的組成物の製造のための方法も含む。
【００２１】
本発明はさらに、本発明による抗体を、場合により、薬学的目的のために抗体の製剤化に有用である緩衝剤および／またはアジュバントと一緒に含む、薬学的組成物も含む。本発明はさらに、薬学的に許容される担体中に本発明による抗体を含む、薬学的組成物も提供する。１つの態様において、薬学的組成物は、製品またはキットに含まれていてもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、完全な抗体および抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない、抗体構造の様々な形態を包含する。本発明による抗体は、好ましくは、本発明による特徴的な特性が保持されている限り、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子工学操作された抗体である。「抗体フラグメント」は、完全長の抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、ダイアボディ、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-52において記載されている。さらに、抗体フラグメントは、ＶＨドメインの特徴を有し、すなわちＶＬドメインと一緒に会合することができ、またはＩＬ−１７に結合するＶＬドメインの特徴を有し、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位に会合することができ、これにより、本発明による抗体の特性を与える、単鎖ポリペプチドを含む。本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物をいう。「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含む、抗体をいう。好ましい態様において、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。
【００２３】
本明細書において使用する「ＩＬ−１７に結合する」という用語は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいての、ヒトＩＬ−１７への前記抗体の結合を意味する。前記抗体が１μg/mlの抗体濃度において７：１以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を引き起こすならば、結合が見られる。本発明による抗体は、１nM（０．１５μg/ml）以下のＩＣ５０値でヒトＩＬ−１７Ａに特異的に結合する。前記抗体は、ＩＬ−１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦには結合せず（７：１未満のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比）、それ故、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する。ＩＬ−１７Ａおよび変異体への結合は、固定化したＩＬ−１７または変異体を使用するＥＬＩＳＡによって行なわれる。
【００２４】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常、エピトープは、特異的な３次元構造特徴、並びに特異的な荷電特徴を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下において前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないことで区別される。好ましくは、本発明による抗体は、ネイティブなＩＬ−１７には特異的に結合するが、変性したＩＬ−１７には特異的に結合しない。本発明のＩＬ−１７抗体は、抗体Ｍａｂ３１７が結合するのと同じ、ＩＬ−１７上のエピトープに結合する。本発明のＩＬ−１７抗体のエピトープ結合特性を、当技術分野において公知の技法を使用して決定し得る。ＩＬ−１７抗体を、in vitroにおけるクロスブロッキング（crossblocking）結合アッセイによって試験し、ＩＬ−１７への抗体Ｍａｂ３１７の結合を妨害する試験抗体の能力を決定する。試験抗体が抗体Ｍａｂ３１７によって少なくとも１５％置換されると、エピトープは近似している。
【００２５】
本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接的に関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの各対を意味する。可変軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインは同じ一般的な構造を有し、そして各々のドメインが、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲはβ−シート構造を接続するループを形成し得る。各々の鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によってその３次元構造が保たれ、そして他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００２６】
本明細書において使用する場合の「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、そして抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義および／または「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００２７】
本出願内において使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の基を意味する。
【００２８】
本明細書において使用する「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖ＤＮＡでもまたは二本鎖ＤＮＡでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸と機能的関係にあるように配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現されるならば、それは前記ポリペプチドのためのＤＮＡと作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼすならば、それはコード配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように位置しているならば、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が同鎖上にあり、そして分泌リーダーの場合には、連続的およびリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣行に従って使用する。本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は同義語として使用され、そして全てのこのような名称は子孫も含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、対象の初代細胞、および継代数に関係なくそれらから誘導された培養物も含む。全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異に因り、ＤＮＡ内容物が正確に同一ではない場合があることを理解されたい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングしたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。
【００２９】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者には周知の用語であり、そして抗体のパパインによる切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、そしてこれらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域により異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑへの結合およびＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞障害作用）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害作用）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において規定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野の水準において公知であり、そして例えばBoakle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434によって記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（KabatのＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照されたい）である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの抗体は通常、補体活性化およびＣ１ｑへの結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑに結合しない。
【００３０】
本発明による抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのヒト抗体のＦｃ部分である、ヒト起源のＦｃ部分を含む。本発明による抗体のＦｃ部分については、好ましくは、以下に定義するＣ１ｑへの結合は全く検出することができない。
【００３１】
本発明は、それ故、本発明による抗体がＩＬ−１７に結合し、ヒト起源のＦｃ部分を含み、そしてヒト補因子Ｃ１ｑに結合せず、それ故、ＣＤＣエフェクター機能を回避する、前記抗体を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明による抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５および／またはＤ２６５における突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスのＦｃγレセプターの結合に関し、そして／またはＰＶＡ２３６突然変異を含む。好ましいのは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＰＶＡ２３６である（ＰＶＡ２３６は、ＩｇＧ１のアミノ酸２３３位〜２３６位のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（１文字アミノ酸コードで示される）またはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡによって置換されていることを意味する）。従って、本発明は、本発明による抗体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１および／またはＰ３２９において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体であることを特徴とする、本発明による抗体を提供する。１つの態様において、前記抗体はヒト抗体である。別の態様において、前記抗体はヒト化抗体である。１つの態様において、本発明は、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含み、そして前記抗体が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１において少なくとも１つの突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体であることを特徴とする、本発明による抗体を提供し、前記抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＩＬ−１７に結合する。別の態様において、ＫＤの範囲は１０−１１〜１０−９Ｍである。
【００３３】
Ｃ１ｑへの結合を、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に従って測定することができる。本発明においてＣ１ｑへの結合が無いことは、ＥＬＩＳＡプレートが、種々の濃度の抗体でコーティングされている様なアッセイにおいて、ヒトＣ１ｑが加えられる場合に、特徴づけられる。Ｃ１ｑへの結合は、ヒトＣ１ｑに対して作られた抗体によって検出され、その後、ペルオキシダーゼで標識したコンジュゲートを、ペルオキシダーゼ基質のＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）を用いて検出する。試験抗体についての４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、１０μg/mlの抗体濃度において０．０５未満である場合に、本発明においてＣ１ｑへの結合が無いことが、見つけられる。
【００３４】
本発明による抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野の水準において周知であり、そして例えばKabat (例えばJohnson, G.およびWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号２３を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、本発明による抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸である。
【００３６】
本発明は、本発明による抗体の治療有効量を患者に投与することによって特徴付けられる、療法の必要な患者の処置のための方法を含む。本発明は、療法のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、炎症性疾患および血栓性疾患の予防および処置のための医薬品の調製のための本発明による抗体の使用を含む。本発明は、炎症性疾病の処置のための、好ましくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症および関節リウマチの処置のための、本発明による抗体の使用を含む。
【００３７】
本発明による抗体は、さらに、本発明による抗体の前記の特徴に影響を及ぼさないかまたは変化させない、「保存的な配列の改変」（変異抗体）、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変を有する、このような抗体を含む。改変を、当技術分野において公知の標準的な技法、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的なアミノ酸の置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、ヒト抗ＩＬ−１７抗体において予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することができる。それ故、「変異体」抗ＩＬ−１７抗体は、本明細書において、親抗体の１つ以上の可変領域における１０個まで、好ましくは約２個から約５個までの付加、欠失および／または置換によって、「親」抗ＩＬ−１７抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子をいう。アミノ酸置換を、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載されたような分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって行なうことができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１７に結合するヒトＩｇＧ１タイプの抗体の重鎖をコードする核酸の配列が、前記の改変される抗体がＣ１ｑおよび／またはＦｃγレセプターに結合しないような様式で改変されており、前記の改変された核酸および前記抗体の軽鎖をコードする核酸が発現ベクターに挿入され、前記ベクターが真核宿主細胞に挿入され、前記のコードタンパク質が発現されそして宿主細胞または上清から回収されることを特徴とする、Ｆｃγレセプターおよび／またはＣ１ｑに結合しない、ＩＬ−１７に対する抗体の産生のための方法である。
【００３９】
配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して、最大の配列同一率を達成した後、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義される。抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端または内部における伸長、欠失または挿入のいずれも、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されないものとする。変異体は、ヒトＩＬ−１７に結合する能力を保持し、そして好ましくは親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、変異体は、処置中に低減した副作用を有し得る。
【００４０】
「親」抗体は抗体３Ｃ１のＣＤＲ領域を含み、そして好ましくは変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有し、そして存在する場合、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。
【００４１】
本発明による抗体は、好ましくは、組換え手段によって産生される。このような方法は当技術分野の水準において広く公知であり、そして、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離および通常は薬学的に許容される純度までの精製を含む。タンパク質の発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはE.coli細胞などの適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞において行なわれ、そして前記抗体が細胞から（上清からまたは細胞溶解後に）回収される。抗体の組換え産生は当技術分野の水準において周知であり、そして、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の概説記事において記載されている。抗体は、全細胞中、細胞溶解液中、または部分精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。精製は、カラムクロマトグラフィーおよび当技術分野において周知のその他の技法を含む、標準的な技法によって、他の細胞性成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を排除するために行なわれる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83によって、およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離およびシークエンスされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ源およびＲＮＡ源として作用し得る。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し得、その後、これを別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【００４２】
ヒトＩＬ−１７抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を、抗体をコードする核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。しかしながら、このような改変は、例えば前記したように非常に制限された範囲でしか実施することができない。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプおよびエピトープの結合などの前記の抗体の特徴を変化させることはないが、組換え産生の収率、タンパク質の安定性を向上させ得るか、または精製を促進し得る。また、抗ＩＬ−１７抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、分子の酸化的安定性を向上させ、そして異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合（群）を抗体に加えて、その安定性を向上させることもできる（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを変化させる。「変化させる」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を除去すること、および／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、前記抗体が（Ｎ結合グリコシル化部位のための）前記のトリペプチド配列の１つ以上を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に行なわれる。
【００４３】
抗ＩＬ−１７抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、またはヒト化抗ＩＬ−１７抗体のより以前に調製された変異体または非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４４】
抗体の別のタイプの共有結合による改変は、US Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337において示される様式で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの多種多様な非タンパク質性ポリマーの１つに前記抗体を連結させることを含む。
【００４５】
本発明による重鎖および軽鎖の可変ドメインを、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列および転写終結配列と組み合わせて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖の発現構築物を単一ベクター中に組合せても、宿主細胞中に同時トランスフェクションしても、連続的にトランスフェクションしても、または別々にトランスフェクションしてもよく、これをその後、融合して、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。
【００４６】
別の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体の１つもしくは組合せまたはその抗原結合部分を含む、例えば薬学的組成物などの組成物を提供する。本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」としては、生理的に適合する、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収／再吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、注射または注入のために適している。本発明の組成物を、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。当業者によって理解されているように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に依存して変更されるだろう。薬学的に許容される担体としては、無菌で水性の液剤または分散剤、および無菌注射用液剤もしくは分散剤の調製のための無菌の散剤が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝食塩水溶液であり得る。選択した投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者には公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形へと製剤化される。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量（有効量）が得られるように変更され得る。選択した用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、使用する特定の化合物の排泄速度、使用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、容態、全般的な健康状態および病歴、並びに医学分野において周知である同様な因子を含む、多種多様な薬物動態因子に依存する。
【００４７】
本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息、および移植片拒絶を患う、患者の処置のための本発明による抗体の使用を含む。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、関節リウマチを患う患者の処置のための、抗ＩＬ−１７抗体、好ましくは本発明による抗体の使用であり、前記患者は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度応答するか、または応答しない。本発明のさらなる態様は、関節リウマチを患う患者の処置のための医薬品の製造のための、抗ＩＬ−１７抗体、好ましくは本発明による抗体の使用であり、前記患者は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度応答するか、または応答しない。ＲＡ処置のためのＴＮＦアンタゴニストは、例えば、インフリキシマブ（ＩＦＸ、レミケード（登録商標））、エタネルセプト（ＥＴＡ、エンブレル（登録商標））、およびアダリムマブ（ＡＤＡ、ヒュミラ（登録商標））である。抗ＩＬ−１７抗体は、好ましくは、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＣＤ２０抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＩＬ６抗体を用いての処置に中程度に応答するかまたは応答しない患者に、少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間投与される。
【００４９】
本発明はさらに、薬学的に許容される担体と共に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造のための方法、およびこのような方法のための本発明による前記抗体の使用を提供する。本発明はさらに、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、薬学的物質の製造のための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。本発明はまた、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、薬学的物質の製造のための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。
【００５０】
配列の説明
配列番号１ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ３
配列番号２ Ｍａｂ１０６の重鎖ＣＤＲ２
配列番号３ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ１
配列番号４ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号６ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号７ Ｍａｂ１０６の重鎖可変ドメイン
配列番号８ Ｍａｂ１０６およびＭａｂ１０７の軽鎖可変ドメイン
配列番号９ Ｍａｂ１０７の重鎖ＣＤＲ２
配列番号１０ Ｍａｂ１０６の重鎖可変ドメイン
配列番号１１ γ１重鎖定常領域
配列番号１２ κ軽鎖定常領域
【００５１】
実施例
実施例１
免疫化の説明
免疫化を、２０週間以内に、５匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス１匹あたりPeprotech (http://www.peprotech.com;製造番号: 200-17、１％アルブミンを含む１％ＰＢＳ中)からの２５０（１×）および１００μg（３×）の組換えヒトＩＬ１７を使用して行なった。
【００５２】
実施例２
ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ−１７への結合
NUNC（登録商標）Maxisorpプレート（９６ウェル）を、ＰＢＳ中０．５μg/mlの濃度の組換えヒトＩＬ−１７（Peprotech 200-17番、www.peprotech.com）でコーティングする（１００ml/ウェル）。プレートをオービタルシェーカーで撹拌しながら２時間３７℃でインキュベーションする。その後、コーティング溶液を除去し、そして１００μl/ウェルのＰＢＳＴＣ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Tween（登録商標）２０、２％ニワトリ血清）を加える。プレートを室温で１時間インキュベーションする。ブロッキング溶液を除去し、そして試料（ブランク：ＰＢＳＴＣ試料（ＰＢＳ中１０μg/ml）：本発明による抗ヒトＩＬ−１７抗体３Ｃ１およびＭａｂ１０６；eBioscience (www.ebioscience.com)のＭａｂ１６−７１７８−８５；R&D Systems (www.rndsystems.com)のＭＡＢ３１７、NVP-AIN-497 (WO 2006013107)；をプレートに加える（１００μg/ml）。プレートを撹拌しながら室温でインキュベーションする。試料を除去し、プレートを、２００μl/ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて３回洗浄し、そして、マウス抗体の検出のための二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ、ＨＲＰコンジュゲート；Chemicon AP127P、www.millipore.com)、またはヒト化抗体の検出のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ、ＨＲＰコンジュゲート(Chemicon AP113P)を加える。二次抗体をＰＢＳＴＣ中で１：１００００に希釈し、そしてプレートを撹拌しながら室温で１時間インキュベーションする。二次抗体を除去し、プレートを２００μl/ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて３回洗浄し、そして１００μl/ウェルのＡＢＴＳ（登録商標）(Roche Diagnostics GmbH)を加える。ＩＬ−１７Ａへの結合（１００％と設定）と比較した吸光度を、４０５/４９２nmにおいて測定する。他のヒトＩＬ−１７サブタイプ（ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥおよびＩＬ−１７Ｆ）への結合も、同じアッセイフォーマットを用いて行った。結果を表１に示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
実施例３
ＩｇＧ１クラスの免疫グロブリンのための発現プラスミドの調製
プラスミド６４５４（以下においてｐ６４５４として示す）は、真核細胞における抗ＩＬ−１７抗体の発現のための発現プラスミドである（エキソン−イントロン構成を保持したゲノム的に構成された発現カセット）。それは、以下の機能的エレメントを含む：
−ベクターｐＵＣ１８由来の複製起点（ｐＵＣ起点）
−E.coliにおいてアンピシリン耐性（Amp）を付与するβ（ベータ）ラクタマーゼ遺伝子、
−以下のエレメントを含むγ１−重鎖の発現のための発現カセット：
−ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター）、
−コザック配列を含む合成５’ＵＴＲ、
−シグナル配列イントロン（Ｌ１＿イントロン＿Ｌ２）を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−３’末端にスプライスドナー部位が配置された重鎖可変領域（ＶＨ）のためのｃＤＮＡ、
−マウス免疫グロブリンμ−エンハンサー領域、
−エキソンＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、介在イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を有する３’ＵＴＲを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖γ１−遺伝子（ＩＧＨＧ１）、
−以下のエレメントを含むκ軽鎖の発現のための発現カセット：
−ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモーター）、
−コザック配列を含む合成５’ＵＴＲ、
−シグナル配列イントロン（Ｌ１＿イントロンＬ２＿)を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−３’末端にスプライスドナー部位が配置された軽鎖可変領域のためのｃＤＮＡ（ＶＬ）、
−イントロン性のマウスＩｇ−κエンハンサー領域、
−ＩＧＫＣエキソン、およびポリアデニル化シグナル配列を有するＩＧＫ ３’ＵＴＲを含む、ヒト免疫グロブリンκ遺伝子（ＩＧＫ）、
−以下を含む、真核細胞における栄養要求選択に適したマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現のための発現カセット、
−短縮バージョンのＳＶ４０初期プロモーターおよび起点、
−マウスＤＨＦＲのコード配列、
−ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル。
【００５５】
ｐ６４５４をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、そしてメトトレキセート（ＭＴＸ）を用いての選択後に安定な細胞株を単離し、そしてＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧに関するヒト抗体の産生についてスクリーニングした。
【００５６】
実施例４
補体系の活性化の検討（Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ）
本発明による抗体のＣ１ｑへの結合を調べるために、ＥＬＩＳＡアプローチを使用する。Ｃ１ｑは適応免疫系の一部であり、そして免疫複合体への結合時に、いくつかのチモーゲンの連続的な活性化を引き起こす。続いて、酵素は、Ｃ３分子の切断を引き起こし、これは、炎症反応の開始、外来または異常な粒子のオプソニン化、および細胞膜の溶解をもたらし得る。
【００５７】
１０μg/mLから０．１５６μg/mLまでの７つの濃度の、ＰＢＳ−緩衝液中の試験しようとする抗体を１００μl/ウェルで用いて、ＭＴＰ（Nunc）を一晩４℃でコーティングする。フリーの結合部位のブロッキングは、ＰＢＳ中３％ＢＰＬＡ（Roche）を２００μl/ウェルで用いて１時間かけて室温で行なう。ＭＴＰを、３％ＢＰＬＡのＰＢＳ溶液中２μg/mLのＣ１ｑ(Quiddel)と共にインキュベーションする（１００μg/mL）。ＭＴＰを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて室温で３回洗浄する。ＰＢＳ中３％ＢＰＬＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の０．２５μg/mLのポリクローナルウサギ抗Ｃ１ｑ抗体（DAKO）を１００μl/ウェルで添加することによって１時間かけて室温で結合を検出した。ＭＴＰを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて室温で３回洗浄する。ＰＢＳ中３％Ｔｗｅｅｎ２０中の０．１μg/mLの二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＰＯＤ(Jackson Immuno Research)を１００μl/ウェルで１時間かけて室温で加える。室温でＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてＭＴＰを３回洗浄した後、ＭＴＰを、ＡＢＴＳ溶液（Roche）と共にインキュベーションし、そして４０５nmの波長における吸光を、４９０nmの参照波長を用いて測定する。抗体でコーティングされていないが、同一の検出手順によって処理されたウェルにおけるバックグラウンドシグナルを決定する。試験抗体についての４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、１０μg/mlの抗体濃度において０．０５未満であるならば、Ｃ１ｑへの結合は全く見られない。
【００５８】
実施例５
ＢＩＡｃｏｒｅクロスブロッキング実験を介したエピトープ領域のマッピング
全ての測定を、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器を使用して行なった。システムおよび試料緩衝液はＨＢＳ−ＥＰであった（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、３．４mM ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ/ｖ））。ＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５センサーチップをプレコンディショニング手順にかけた。連続的に０．１％ＳＤＳ、５０mM ＮａＯＨ、１０mM ＨＣｌおよび１００mM Ｈ３ＰＯ４を３０秒間かけてフローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４の上に注入した。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００ｗｉｚａｒｄ ｖ．４．１を使用して製造業者の指示に従ってアミンカップリング手順を行なった。
【００５９】
キメラ抗体またはヒト化抗体を用いてのクロスブロッキング実験を実施するために、ＥＤＣ／ＮＨＳによるセンサー表面の活性化後、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Jackson)を、全てのセンサーフローセル（ＦＣ）上に固定した。１０mM ＮａＡｃ ｐＨ５．０中の３０μg/mlのポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、１０μl/分で７分間使用して、１０，０００ＲＵの抗体捕捉システムを固定した。表面を、エタノールアミンを用いた飽和によって不活性化した。ヒト捕捉システムセンサーを、１０μl/分で２分間のｈｕＩｇＧ分析物（Bayer）の結合を５サイクル、および３０μl/分で３分間の１０mMグリシンｐＨ１．７を用いての再生を用いて調整した。
【００６０】
１０μl/分の流速で、一次ｍＡｂをＦＣ１〜ＦＣ４に３分間かけて注入した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の５０μg/mlのｈｕＩｇＧ（Bayer）からの混液を、ＦＣ１〜ＦＣ４に、１０μl/分で３分間注入することを使用して、センサー捕捉システムのフリーの結合能をブロッキングした。続いて、抗原ｒｈｕＩＬ１７−Ａを、ＦＣ１〜ＦＣ４に１０μl/分で３分間注入して、一次抗体結合能を飽和した。３０μl/分で３分間のＦＣ１〜ＦＣ４への２回目の注入を行ない、その後、二次抗体を別々に３０μl/分で３分間かけて、フローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４に注入した。センサーを、１０mMグリシン（ｐＨ１．７５）を３０μl/分で３分間使用して再生した。
【００６１】
最初に、０nMの分析物の注入を全てのセンサーグラムから差し引き、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉システムからの一次抗体の解離を修正した。二次抗体および一次抗体の応答シグナルによって商が形成された。商はモル比（ＭＲ）の名称を有し、これはエピトープ領域の到達容易性を示す。
【００６２】
モル比の数値は行列で列挙した。相同的ｍＡｂ組合せは、ブロッキング手順が成功裏に実施されたかどうかの対照として作用した。カットオフは、相同的ｍＡｂ組合せによって定義された。
【００６３】
クロスブロッキング実験におけるカットオフは、Ｍａｂ１０６相同的アッセイフォーマットに設定された（９％）。ＭＲ＝１５％を越えるモル比の数値は、独立したエピトープへの到達に関する。
【００６４】
エピトープマッピングからの結果（表２参照）は、Ｍａｂ Ｋ１０６およびその誘導体のＭａｂ１０７が、ＮＶＰ−ＡＩＮ−４９７とは異なるエピトープ領域に結合することを示す。さらに、Ｍａｂ Ｋ１０６は、ｅＢｉｏ６４ＣＡＰ１７とは異なるエピトープを覆い、そしてＭａｂ３１７と同じエピトープ領域を覆う。
【００６５】
【表３】
【００６６】
分析のカットオフは、相同的アッセイ組合せによって定義される。（１０６、９％）；（ＡＩＮ−４５７、６％）；（ｅＢｉｏ６４ＣＡＰ１７、７％）；（Ｍａｂ３１７、０％）。ここでカットオフは、相同的Ｍａｂ１０６アッセイに設定された。
【００６７】
実施例６
サイトカイン放出アッセイ、ＩＬ−１７Ａにより誘発されるｈＩＬ−８の放出の阻害
アッセイは、抗ＩＬ−１７抗体のプレインキュベーションを伴う、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦ−αを用いての刺激後の、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のｈＩＬ−８の産生の検出として行なわれる。ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞はＩＬ−１７レセプターを有する。可溶性ＩＬ−１７Ａは、これらのＩＬ−１７レセプターに結合する。ＩＬ−１７Ａに対する抗体はＩＬ−１７Ａに結合する。機序はＴＮＦαの存在下においてのみ働く。ＩＬ−１７レセプターへのＩＬ−１７Ａの結合を通して、細胞はｈＩＬ−８を産生し、これを、ＥＬＩＳＡによって解読値として検出することができる。測定されたｈＩＬ−８は、どの濃度で抗ＩＬ−１７抗体が、ＩＬ−１７によるＣＣＤ−２５ＳＫ細胞の刺激を阻害するかの情報を与える。
【００６８】
ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞を、４８ウェルプレート中で２．５×１０４個の細胞/ウェルの細胞密度で播種し（容量、０．４５ml/ウェル）、そして２４時間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩インキュベーションした後、細胞を、９０００；３０００；１０００；３３３．３；１１１．１；３７．０３；１２．３４；および４．１１ng/mlの最終濃度の抗ＩＬ−１７抗体を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズは、５０μl/ウェルの培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１０ng/mlのＩＬ−１７Ａおよび５０pg/mlのＴＮＦ−αの混合物（５０μl/ウェル、１０倍濃縮）を用いて刺激し、そして２４時間３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩インキュベーションした後、上清を９６ウェルプレートに移し、そしてｈＩＬ−８ＥＬＩＳＡのための中間体として−２０℃で凍結した。
【００６９】
ｈＩＬ−８ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして２時間室温でインキュベーションした。標準的な希釈シリーズ：４００pg/ml；２００pg/ml；１００pg/ml；５０pg/ml；２５pg/ml；１２．５pg/ml；６．３pg/mlおよび陰性対照としてのアッセイ希釈液。試料の希釈は１：２００であった。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで４回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで６回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして１２分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応を５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止した。解読は、４５０nmで３０分以内に５７０nmでのλ修正と共に行なった。結果を表３に示す（８０％の最大阻害と比較して測定したＩＣ５０値）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
実施例７
滑膜細胞によるサイトカインの放出アッセイ、ＩＬ−１７Ａにより誘発されるｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８の阻害
初代ヒト線維芽細胞様の滑膜細胞（ＨＦＬＳ）の細胞は、ＩＬ−１７Ａによる刺激に応答してｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８を産生する。アッセイを、刺激前に抗ＩＬ−１７抗体と共に細胞をプレインキュベーションした後に、ＨＦＬＳ細胞によるこのＩＬ−１７Ａの刺激するｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８の産生の阻害を測定することによって行う。
【００７２】
ＨＦＬＳ細胞を、４８ウェルプレート中０．５mlの容量で４×１０５個の細胞/mlの細胞密度で播種し、そして３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベーションして接着させた。一晩インキュベーションした後、培地を４００μlの新たな培地と交換し、そして細胞を、一連の抗体濃度（１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、０ng/ml）の抗ＩＬ−１７を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズを、５０μl/ウェルを使用して培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１００ng/mlのＩＬ−１７Ａ（５０μlの１０００ng/ml（１０倍濃縮））を用いて刺激し、そして一晩３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーション（１８時間）した。インキュベーション期間後、上清を新たなチューブに移し、そして直ちに分析するか、またはＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃に保存するかのいずれかを行なった。ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８のＥＬＩＳＡのために、１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして２時間室温で製造業者の指示に従ってインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで少なくとも３回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルで少なくとも３回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして解読に十分な色が発生するまでインキュベーションした。インキュベーション後、反応を、５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、そして４５０nmの波長で３０分以内にプレート解読機で解読した。結果を表４に示す。
【００７３】
【表５】
【００７４】
実施例８
カニクイザルＩＬ−１７Ａとの交差反応性（結合アッセイ）
結合アッセイを、実施例２に従って行なった。結果を表５に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
実施例９
カニクイザル（Maccaca Fasicularis）サイトカイン放出アッセイ、カニクイザルのＩＬ−１７Ａにより誘発されたＩＬ−６およびＩＬ−８の産生の阻害
カニクイザル皮膚線維芽（ＣＤＦ）細胞は、ヒトまたはカニクイザルのＩＬ−１７Ａの刺激に応答してカニクイザルのＩＬ−６およびＩＬ−８を産生する。アッセイを、刺激前にヒトＩＬ−１７に対して生じた抗ＩＬ−１７抗体と共に細胞をプレインキュベーションした後、ＣＤＦ細胞による、このカニクイザルＩＬ−１７Ａの刺激によるＩＬ６およびＩＬ−８の産生の阻害を測定することによって行う。
【００７７】
ＣＤＦ細胞を、４８ウェルプレート中０．５mlの容量で２×１０５個の細胞/mlの細胞密度で播種し、そして３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションして接着させた。一晩インキュベーションした後、培地を４００μlの新たな培地と交換し、そして細胞を、一連の抗体濃度（１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、０ng/ml）の抗ＩＬ−１７抗体を用いて３０分間処理した。各抗体希釈シリーズを、５０μl/ウェルを使用して培地（１０倍濃縮）を用いて作製した。３０分後、細胞を、１００ng/mlのＩＬ−１７Ａ（５０μlの１０００ng/ml（１０倍濃縮））を用いて刺激し、そして３７℃および５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベーションした。インキュベーション期間後、上清を新たなチューブに移し、そして直ちに分析するか、またはＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で保存するかのいずれかを行なった。ｈＩＬ−６およびｈＩＬ−８ ＥＬＩＳＡは、そのそれぞれのカニクイザルサイトカインと交差反応性であることが示され、そしてこれを使用して定量的サイトカインレベルを定量した。ＥＬＩＳＡのために、１００μlの希釈した捕捉抗体を各ウェルに加え、そして４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液を用いて希釈液を作製した。プレートを吸引し、２００μl/ウェルで３回洗浄し、２００μl/ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、そして１時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２００μl/ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準および試料を加え、そして製造業者の指示に従って２時間室温でインキュベーションした。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルを用いて少なくとも３回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに加えた。コンジュゲートを、アッセイ希釈液で１：２５０に希釈した検出抗体および酵素試薬を用いて調製した。プレートを吸引し、そして２５０μl/ウェルを用いて少なくとも３回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに加え、そして解読に十分な色が発生するまでインキュベーションした。インキュベーション後、反応を、５０μl/ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、そして３０分以内に４５０nmの波長でプレート解読機で解読した。結果を表６に示す。
【００７８】
【表７】
【００７９】
実施例１０
ユーロピウムに基づいたＡＤＣＣアッセイ
ＰＢＬを、フィコール・パックと勾配遠心分離によって単離する：ヘパリン処理した血液試料をＰＢＳを用いて１：１に希釈した。８mlの希釈した血液をフィコール上に重層し、そして８００ｇで３０分間遠心分離にかけた。細胞（ＰＢＬ）を回収し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳを用いて洗浄し、そして細胞培養培地中に再懸濁した。細胞を、２．５×１０６個の細胞/mlまで希釈した。（これは、１ウェルあたり５×１０３個のターゲット細胞を使用する場合、２５：１のエフェクター／ターゲット比がもたらされる）。
【００８０】
ターゲット細胞を、ＢＡＤＴＡ（２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジカルボン酸アセトキシメチルエステル）を用いて標識する：細胞を、アキュターゼ（商標）(Millipore)の添加によって収集し、１回洗浄し、そして１×１０６個の細胞/mlまで希釈した。１×１０６個の細胞あたり２．５μlのＢＡＤＴＡを加え、そして３５分間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションした。標識期間後、細胞を、１０mlの培養培地を用いて希釈し、２００ｇで１０分間遠心分離にかけ、そして上清を吸引した。この工程を、培養培地／２mMプロベネシドを用いて３回繰り返し、そして試料を１×１０５個の細胞/mlまで希釈し、３００ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を取り出し、そして５０μlをピペットで、バックグラウンド対照のためのウェルに入れた。
【００８１】
バックグラウンド：５０μlのアリコートを、１００μlの培地を用いて希釈。自発的溶解：５０μlの標識されたターゲット細胞懸濁液；１００μlの培養培地を加え、そして残りの試料のように２時間／３７℃でインキュベーションする。最大溶解：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；１００μlのTriton（登録商標）Ｘ−１００（０．５％ＰＢＳ溶液）を加え、そして２時間／３７℃でインキュベーションする。抗体を含まない溶解対照：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；５０μlの培養培地を加え；５０μlのエフェクター細胞を加え、２時間で３７℃。エフェクター細胞を含まない溶解対照：５０μl/ウェルの標識されたターゲット細胞懸濁液；５０μlの培養培地を加え、使用される最も高い濃度の５０mlの抗体溶液を加え、そして２時間／３７℃でインキュベーションする。
【００８２】
インキュベーション期間終了時に、９６ウェルプレートを１００rpmで遠心分離にかけた。２０μlの各上清を、OptiPlate（登録商標）ＨＴＲＦ−９６（Packard）に移し、そして２００mlのユーロピウム溶液を加え、そして振とう機で１５分間インキュベーションした。時間分解蛍光に関する蛍光を測定し、そして自発的放出および特異的放出を、以下の式に従って算出した：
【００８３】
特異的放出％＝特異的溶解（計数）−自発的溶解（計数）×１００
最大溶解（計数）−自発的溶解（計数）
【００８４】
抗体１０６の添加後に有意な特異的放出（ＡＤＣＣ）は全く測定されなかった。
【００８５】
実施例１１
ＣＤＣアッセイ
細胞をトリプシンの添加により収集し、洗浄し、１×１０５個の細胞/mlとなるまで希釈し、そして１００μl/ウェルを９６ウェル平底マイクロタイタープレートに加えた。抗体を培地中２５μlの容量で６倍の最終濃度で加えた（それぞれ抗体−リガンド複合体）。３０分間のインキュベーション時間後、２５μlの新たに溶解した幼齢ウサギ補体(Cedarlane CL3441、１mlの凍結乾燥物、４mlの再蒸留水中に新たに希釈)を、１：２４の補体最終濃度となるまで加えた。２０時間のインキュベーション期間後、５０μlの上清を取り出し、そして１００μlのCell Titer Glo（登録商標）試薬(Promega Corp.)を残りの１００μlの上清に加えた。プレートを２分間オービタルシェーカーで振とうし、１００μl/ウェルを黒ルミネセンスマイクロタイタープレート（Costar）に移し、そして発光を測定した。
【００８６】
対照：培地対照（ターゲット細胞＋５０μlの培地）；最大溶解（ターゲット細胞＋５０μl ０．５％Triton X-100）、補体対照（ターゲット細胞＋２５μlの培地＋２５μlの補体）。
【００８７】
結果：抗ＩＬ１７抗体１０６を用いて、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を全く検出できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２または９のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含むこと、そして、軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが、配列番号７または１０を含むことを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１から得ることができることを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項５】
抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）のキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＴ細胞エピトープの欠失した抗体変異体であることを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項６】
ヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる、請求項１〜５記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合し、ヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項８】
突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、請求項６または７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８記載の抗体を含むことによって特徴付けられる、薬学的組成物。
【請求項１０】
モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合する抗体を含むことによって特徴付けられる、薬学的組成物。
【請求項１１】
薬学的組成物の製造のための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１２】
薬学的組成物の製造のための、モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体の使用。
【請求項１３】
多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１４】
多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体の使用。
【請求項１５】
ＩＬ−１７に結合する抗体の重鎖をコードする核酸であって、前記抗体が、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ３領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記核酸。
【請求項１６】
原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるＩＬ−１７に結合する抗体の発現のための、請求項１５記載の核酸を含むことによって特徴付けられる、発現ベクター。
【請求項１７】
原核宿主細胞または真核宿主細胞において請求項１５記載の核酸を発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、ＩＬ−１７に結合する組換え抗体の産生のための方法。
【請求項１８】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１。
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号１のＣＤＲ３領域、配列番号２または９のＣＤＲ２領域および配列番号３のＣＤＲ１領域を含むこと、そして、軽鎖可変ドメインが、配列番号４のＣＤＲ３領域、配列番号５のＣＤＲ２領域および配列番号６のＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが、配列番号７または１０を含むことを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが配列番号７または１０を含み、そして軽鎖可変ドメインが配列番号８を含むことを特徴とする、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１から得ることができることを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項５】
抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）のキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＴ細胞エピトープの欠失した抗体変異体であることを特徴とする、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項６】
ヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる、請求項１〜５記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合し、ヒンジ領域のアミノ酸２１６位〜２４０位において、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸３２７位〜３３１位において改変されたヒトＩｇＧ１アイソタイプであることによって特徴付けられる、ヒトＩＬ−１７に結合する抗体。
【請求項８】
突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位におけるロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むことによって特徴付けられる、請求項６または７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８記載の抗体を含むことによって特徴付けられる、薬学的組成物。
【請求項１０】
モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合する抗体を含むことによって特徴付けられる、薬学的組成物。
【請求項１１】
薬学的組成物の製造のための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１２】
薬学的組成物の製造のための、モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体の使用。
【請求項１３】
多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１４】
多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、喘息および移植片拒絶の処置のための、モノクローナル抗体３Ｃ１（ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１）が結合するのと同じＩＬ−１７エピトープに結合することによって特徴付けられる、抗体の使用。
【請求項１５】
ＩＬ−１７に結合する抗体の重鎖をコードする核酸であって、前記抗体が、配列番号１の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２または９の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ３領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１領域を含むことを特徴とする、前記核酸。
【請求項１６】
原核宿主細胞または真核宿主細胞におけるＩＬ−１７に結合する抗体の発現のための、請求項１５記載の核酸を含むことによって特徴付けられる、発現ベクター。
【請求項１７】
原核宿主細胞または真核宿主細胞において請求項１５記載の核酸を発現させ、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、ＩＬ−１７に結合する組換え抗体の産生のための方法。
【請求項１８】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２９４１。
【公表番号】特表２０１２−５０３９７７（Ｐ２０１２−５０３９７７Ａ）
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２８２２３（Ｐ２０１１−５２８２２３）
【出願日】平成２１年９月２１日（２００９．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６７８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３４４４３
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５０６１５３８１５）ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２１日（２００９．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００６７８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３４４４３
【国際公開日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【出願人】（５０６１５３８１５）ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト (25)
【Ｆターム（参考）】
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