ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤
【課題】本発明は、新規抗炎症剤を提供することを課題とする。さらには新規抗炎症剤に有効成分として含まれるビタミンＫ３の作用を解明し、有効性が高く、安全性に優れた薬剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤を用いる治療方法を提供することを課題とする。
【解決手段】培養細胞を用いた実験や動物実験において、ビタミンＫ３が抗炎症作用を発揮しうる。ビタミンＫ３の作用はビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認された。
【解決手段】培養細胞を用いた実験や動物実験において、ビタミンＫ３が抗炎症作用を発揮しうる。ビタミンＫ３の作用はビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤に関する。より詳しくは、ビタミンＫ３を有効成分として含む、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息の起因となる炎症症状、あるいはこれらの疾患の結果生じる炎症症状に有効に作用する抗炎症剤に関する。さらには、本発明はこれらの症状に対する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンのひとつであり、天然に存在するものと人工に合成されたものがある。その生理機能としては骨へのカルシウム定着作用や血液凝固作用などが報告されている。より具体的にはビタミンＫ依存性タンパク質のＮ末端に存在するグルタミン酸残基を、生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）に変換する酵素であるγ−グルタミルカルボキシラーゼの補酵素として作用する。また、ビタミンＫは血液凝固ＩＩ（プロトロンビン）、ＶＩＩ、ＩＸやＸ因子等のビタミンＫ依存性タンパク質の生合成に不可欠なビタミンである。
【０００３】
天然に存在するビタミンＫには、緑黄色野菜・海藻類・緑茶・植物油などに含まれるビタミンＫ１（フィロキノン）と、腸内細菌によって合成されるビタミンＫ２（メナキノン）の２種類がある。さらにビタミンＫ２には１１種類の同族体があり、この中で食品に多く含まれるのは、動物性食品に広く分布するメナキノン-4と、納豆菌によって産生されるメナキノン-7が挙げられる。通常、フィロキノン・メナキノン-4・メナキノン-7を総称してビタミンＫという。また、人工合成型のビタミンＫとしてビタミンＫ３（メナジオン）やビタミンＫ４（メナジオール）などが挙げられる。
【０００４】
ビタミンＫ類の作用については、多く報告されており、各種ビタミンＫや、それらと化学構造の類似するＣｏＱなどについて例えばカラゲニン浮腫動物モデルにこれらの物質を投与したときの抗炎症効果を確認したものがある。ここでは、ビタミンＫ１、２、ＣｏＱは難溶性のため水素添加ヒマシ油に溶かし、ビタミンＫ３及びＫ４は水溶性のものを用い、水で溶解したりアラビアゴム乳剤としたものを用いて検討がなされている。その結果、抗炎症作用が認められる場合と認められない場合があり、認められる場合もその効力は弱く、一貫した抗炎症作用は証明できなかった、と報告されている（非特許文献１）。したがって、ビタミンＫの抗炎症作用を積極的に支持する成績は得られず、いわゆる抗炎症薬といわれる薬物と比較すれば、Ｋの抗炎症作用は疑わしいものと思われるとも示されている。
【０００５】
ビタミンＫ２又はその水和物が、ＮＦ−κＢ（Nuclear factor kappa B）活性化阻害作用を有することについて開示がある（特許文献１）。特許文献１では、ビタミンＫ２又はその水和物は癌細胞増殖抑制、癌治療において有用であり、さらに抗腫瘍剤と組み合わせることにより、抗腫瘍作用が増強されることが示されている。
【０００６】
ビタミンＫ３については、ＤＮＡポリメラーゼγを選択的に阻害し、ビタミンＫ１、Ｋ２に比べてより強い抗腫瘍効果があることが報告されている（非特許文献２）。また、ビタミンＫ３は、膵腺房細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献３−５）。しかしながら、各種炎症性疾患に対するビタミンＫ３の作用、効果については殆ど検討がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO2005/107731号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vitamine (Japan), 43:282-298 (1971)
【非特許文献２】Cancer Sci, 99:1040-1048 (2008)
【非特許文献３】J Physiol Gastro Liver Physiol, 286: 189-196 (2004)
【非特許文献４】J Cell Sci, 115:485-497 (2002)
【非特許文献５】J Biol Chem, 281:40485-40492 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規抗炎症剤を提供することを課題とする。さらには新規抗炎症剤に有効成分として含まれるビタミンＫ３（以下、「ＶｉｔＫ３」という場合もある。）の作用を解明し、有効性が高く、安全性に優れた薬剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤を用いる治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、in vitroやin vivoの実験系において、ビタミンＫ３が抗炎症作用を発揮しうることを確認し、その作用はビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認され、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤。
２．炎症が、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息より選択されるいずれかの疾患により生じる症状である前項１に記載の抗炎症剤。
３．炎症が、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状である前項１又は２に記載の抗炎症剤。
４．炎症性疾患が、オートファジーの異常亢進を伴う症状である前項１又は２に記載の抗炎症剤。
５．ビタミンＫ３を有効成分として含むＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
６．ビタミンＫ３を有効成分として含むオートファジーの異常亢進抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、肺炎モデルや膵炎モデルなどの各種炎症性疾患モデル動物にビタミンＫ３を投与した場合には、組織学的な観察結果より炎症症状が改善することが観察され、ビタミンＫ３が炎症症状に有効に作用しうることが認められた。このビタミンＫ３の抗炎症作用は、ビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認された。また、ビタミンＫ３の作用機序を確認した結果、in vitroにおいてＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導を抑制したり、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢを抑制することが確認された。さらには、オートファジーを軽減化させることも確認された。すなわち本発明により、ビタミンＫ３は、ＮＦ−κＢ活性阻害作用やオートファジーの亢進抑制作用を有し、ＮＦ−κＢ活性化やオートファジーの亢進を伴う各種疾患や症状に対して有効に作用しうることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＮＦ−κＢの不活性化状態及び活性化状態の存在様式を示す模式図である。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞でのＴＮＦ−αによる転写因子ＮＦ−κＢ活性化に対するビタミンＫ３の作用を、ウエスタンブロッティングによるｐ６５の検出にて確認した写真図である。（実施例１）
【図３】ＲＡＷ２６４．７細胞でのＬＰＳによる転写因子ＮＦ−κＢ活性化に対するビタミンＫ３の作用を、ウエスタンブロッティングによるｐ６５の検出にて確認した写真図である。（実施例２）
【図４】ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用を、ＲＡＷ２６４．７細胞でのｐ６５の発現にて確認した写真図である。（実施例３）
【図５】ＲＡＷ２６４．７細胞でのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例４）
【図６】マウスマクロファージ細胞でのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例５）
【図７】マウスでのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例６）
【図８】ＡＲＤＳモデルマウスでのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例７）
【図９】ＡＲＤＳモデルマウスでの肺組織を示す写真図である。（実施例８）
【図１０】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、組織の形状にて確認した写真図である。（実施例９）
【図１１】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、ＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞の発現率にて確認した図である。（実施例９）
【図１２】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比にて確認した写真図である。（実施例９）
【図１３】マウス膵炎モデルの膵臓組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１０）
【図１４】マウス膵炎モデルの膵臓組織でのオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を確認した写真図である。（実施例１１）
【図１５】マウス膵炎モデルでの膵臓組織でのビタミンＫ３によるアポトーシス誘導作用を確認した写真図である。（実施例１２）
【図１６】マウス腸炎モデルの腸でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した図である。（実施例１３）
【図１７】マウス腸炎モデルの腸でのビタミンＫ３の抗炎症作用を腸の長さで確認した写真図である。（実施例１３）
【図１８】マウス腸炎モデルの腸組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１３）
【図１９】マウス皮膚炎モデルの皮膚肥厚の程度を示す図である。（実施例１４）
【図２０】マウス皮膚炎モデルでの皮膚組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１４）
【図２１】マウス喘息モデルでの肺胞洗浄液（ＢＡＬ）でのビタミンＫ３による総細胞数及び白血球細胞分画を確認した図である。（実施例１５）
【図２２】マウス喘息モデルの気道粘膜でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１５）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤に関する。背景技術の欄でも説明したように、ビタミンＫにはいくつかの種類があり、ビタミンＫ１及びＫ２は天然に存在するが、ビタミンＫ３は人工合成型である。以下に、ビタミンＫ１（式I）、Ｋ２（式II）及びＫ３（式III）の構造式を参考に示す。
【００１５】
【化１】
【００１６】
【化２】
【００１７】
【化３】
【００１８】
本発明の抗炎症剤に有効成分として含まれるビタミンＫ３は、水和物であっても良い。炎症反応とは、身体組織の傷害に反応して、異物を排除しようとする防御反応であり、細胞からさまざまな伝達物質が放出され、腫れや痛み、発熱などを伴う反応をいう。炎症性疾患とは炎症反応による伝達物質によっておこる病気の総称であり、代表的なものに肺炎、膵炎、炎症性腸炎、皮膚炎、関節炎、筋炎、血管炎などが挙げられる。本発明において炎症とは、いわゆる炎症性疾患により発生する症状のみならず、腫瘍やアレルギー性疾患などのいわゆる炎症性疾患には含まれない疾患などであっても、それらに起因して身体組織に障害を生じた結果、炎症反応がおこり、腫れや痛み、発熱などを伴う症状が起こる場合も包含される。したがって、本発明の抗炎症剤は、いわゆる炎症性疾患に対してのみならず、あらゆる炎症症状を伴う場合に使用することができる。本発明は、これらの症状に対する治療方法にも及ぶ。
【００１９】
本発明において、炎症は上記広義の範囲で解釈されるが、好適にはＮＦ−κＢの活性化を伴うものが挙げられる。ＮＦ−κＢは転写因子の一種であり、免疫応答に関与するともいわれている。不活性なＮＦ−κＢは、ヘテロ二量体を形成して細胞質に存在し、ＩκＢ（InhibitorκＢ）と結合することによりその活性は抑制されている。しかし、ＴＮＦ−αなどの刺激によりＩκＢのセリン残基がリン酸化する酵素複合体であるＩκＢキナーゼが活性化すると、ＩκＢはプロテアソームにより分解を受ける。その結果ＮＦ−κＢの核内移行シグナルが露出し、核内に移行できるようになる（図１参照）。
【００２０】
生体内では、通常厳密にＮＦ−κＢの発現は制御されているものの、炎症性サイトカイン、細菌やウイルス（発ガン性ウイルスを含む）の感染、紫外線、ディーゼル粉末粒子など、ストレスを伴う外部刺激を受けると活性化されて核内に移行し、その制御下にある遺伝子の発現を誘導し、その結果、免疫応答や細胞死が回避されるといった生体防御機構が働く。具体的には、ＮＦ−κＢが活性化されると、さまざまなタンパク質の転写を活性化し、ＴＮＦ−αなどのサイトカインや、ケモカイン、接着分子、サイクリンなどの発現量が増加し、これらによって生体防御機構が作用する。これらの反応は、通常一過性のものであるが、ウイルスや紫外線、アレルゲンなどの化学物質による一部の特殊な刺激はＮＦ−κＢの恒常的又は過剰な活性化を引き起こし、アレルギー疾患や炎症性疾患、悪性腫瘍などを誘発する原因のひとつとなっている。本発明においては、炎症は、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息等の疾患の起因となる炎症症状、あるいはこれらの疾患の結果生じる炎症症状が好適に例示される。例えば、気管支炎、気管支喘息は、気道の炎症又は慢性炎症に起因する疾患である。
【００２１】
本発明において、炎症はオートファジー（autophagy）の異常亢進を伴うものも含まれる。オートファジーは細胞の飢餓状態や細胞死に起因して生じるともいわれており、オートファゴソーム（リソソームと融合したファゴソーム:自己の細胞成分を取り込んだリソソーム加水分解酵素を含む細胞質内隔離膜構造体）に取り込んだ自己の細胞内成分物をリソソーム酵素で分解する細胞現象である。オートファジーは、細胞の飢餓状態や細胞死以外にも様々な細胞活動に関連していることが知られている。例えば、細胞質内に感染した細菌やウイルスの排除に関連することが報告されている。
【００２２】
本発明において、ビタミンＫ３はＮＦ−κＢ活性化阻害剤の有効成分として作用する。ＮＦ−κＢ活性化阻害のメカニズムは明らかではないが、例えばあるタンパク質のプロモーターの転写因子であるＩκＢのリン酸化が阻害されることで、ＮＦ−κＢの活性化が阻害されるとも考えられる。すなわち、ビタミンＫ３は、ＩκＢのリン酸化を阻害することで、ＮＦ−κＢの活性化を阻害すると考えられる。本発明は、ビタミンＫ３を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化阻害剤にも及ぶ。本発明において「ＮＦ−κＢ活性化阻害剤」とは、転写因子ＮＦ−κＢの機能を阻害する作用を有する薬剤を意味する。例えば、生体又は生体の一部において、ＮＦ−κＢがＩκＢとの複合体から解放されるのを阻害する薬剤、ＮＦ−κＢの核への移行を阻害する薬剤、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を阻害する薬剤、ＮＦ−κＢの転写活性を阻害する薬剤などが含まれる。
【００２３】
また、本発明において、ビタミンＫ３はオートファジーの異常亢進抑制剤の有効成分としても作用する。白血球の細胞死や末梢血細胞数の制御は、炎症や生体防御と深い関わりをもっていることから、オートファジーの異常亢進を抑制することで、抗炎症作用も発揮しうる。
【００２４】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分とする薬剤に関し、その投与量は適宜決定することができる。例えばヒトに投与する場合、投与量や投与方法は適宜決定することができる。好ましい投与量は、ビタミンＫ３として、成人（体重６０ｋｇ）あたり、通常、１０〜２００ｍｇ／日であり、好ましくは１５〜１３５ｍｇ／日であり、さらに好ましくは３０〜６０ｍｇ／日（例えば４５ｍｇ／日）である。投与期間は、特に限定されるものではなく、例えば、１〜１０００日、好ましくは３〜３００日である。投与量及び投与期間は、炎症の治療効果と患者の状態を勘案しながら、適宜設定することができる。
【００２５】
本発明に使用するビタミンＫ３又はその水和物は、公知の方法又は今後開発される方法により合成することができる。例えば、メナジオン（シグマ製）のような市販のビタミンＫ３を使用することもできる。
【００２６】
本発明のビタミンＫ３を有効成分として含む薬剤は、薬学的に許容しうる添加剤を混和し製剤化して使用することができる。上記添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
以下に上記添加剤の例を挙げる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウムが挙げられる。
【００２８】
結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカが挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウムが挙げられる。着色剤としては三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものが挙げられる。
【００２９】
矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミドが挙げられる。懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子が挙げられる。
【００３０】
等張化剤としては、ブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトールが挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。防腐剤としてはメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。抗酸化剤としては硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールが挙げられる。安定化剤としては一般に医薬に使用されるものが挙げられる。吸収促進剤としては一般に医薬に使用されるものが挙げられる。また、必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸等の成分を配合してもよい。
【００３１】
また、上記製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤等の経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤又は注射剤を挙げることができる。上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。なお、必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。上記注射剤は、上記添加剤のうち、特に乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。
【実施例】
【００３２】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００３３】
（実施例１）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用（１）
本実施例ではヒト腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３細胞を用いて、ビタミンＫ３の転写因子ＮＦ−κＢの活性化に及ぼす作用を確認した。不活性なＮＦ−κＢ及び活性化されたＮＦ−κＢの存在様式については、図１を参照されたい。
【００３４】
本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、３０分間インキュベーションし、その後ＮＦ−κＢを構成するサブユニットであるｐ６５（６５ｋＤａ）の存在を確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を確認した。ｐ６５はｐ６５に対する抗体（SantaCruz Biotechnology製）を用いてウエスタンブロット法にて確認した。比較例として、ビタミンＫ３の代わりにビタミンＫ１又はＫ２で処理した場合についても確認した。また陰性コントロールは各種ビタミンＫもＴＮＦ−αでも処理しない系とし、陽性コントロールは各種ビタミンＫでは処理を行わなかったが、ＴＮＦ−αで処理を行った系とした。
【００３５】
上記の結果、ビタミンＫ３で処理した系については、陰性コントロールとほぼ同様に６５ｋＤａのバンドは殆ど認められなかった。これにより、ビタミンＫ３はＴＮＦ−αによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうる作用があることが確認された。一方、ビタミンＫ１、Ｋ２で処理した系についてはいずれも陽性コントロールと同様に６５ｋＤａでバンドが認められ、ＮＦ−κＢの活性化の抑制作用は認められなかった（図２）。
【００３６】
（実施例２）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用（２）
本実施例では、ＴＮＦ−αを含む培地で処理する代わりに、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ(lipopolysaccharide)を含む培地で処理したほかは、実施例１と同手法により検討を行なった。ＬＰＳにより細胞が刺激されるとＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８や血小板活性化因子（ＰＡＦ）などのサイトカイン誘導放出を促進する。その結果、ＬＰＳで処理することによりＮＦ−κＢが活性化される。
【００３７】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系については、ＬＰＳもビタミンＫ３も用いない陰性コントロールとほぼ同様に６５ｋＤａのバンドは殆ど認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは６５ｋＤａでバンドが認められ、ＮＦ−κＢの活性化が確認された（図３）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうることが確認された。
【００３８】
（実施例３）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢの核内移行に及ぼす作用
本実施例ではマクロファージ様細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を用いて、転写因子ＮＦ−κＢの核内移行を確認した。
【００３９】
本実施例では、Ｒａｗ２６４．７細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、３０分間インキュベーションし、その後ＮＦ−κＢを構成するサブユニットであるｐ６５（６５ｋＤａ）の存在を確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を確認した。ｐ６５はｐ６５に対する抗体（SantaCruz Biotechnology製）を用いて免疫染色法にて確認した。また陰性コントロールは各種ビタミンＫもＬＰＳでも処理しない系とし、陽性コントロールは各種ビタミンＫ３では処理を行わなかったが、ＬＰＳで処理を行った系とした。また、ビタミンＫ３とＬＰＳを処理した各Ｒａｗ２６４．７細胞の核を、核染色色素であるTOPRO-3（インビトロジェン社製）を用いて染色し、蛍光顕微鏡により核の位置を確認した。ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系については、ＬＰＳもビタミンＫ３も用いない陰性コントロールとほぼ同様に、核内にはＮＦκＢのサブユニットｐ６５は殆ど認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは核内にＮＦκＢのサブユニットｐ６５の存在が認められ、ＮＦ−κＢの活性化が確認された（図４）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうることが免疫染色法によっても確認された。
【００４０】
（実施例４）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（１）
本実施例では、マクロファージ様細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を用いて、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４１】
本実施例では、Ｒａｗ２６４．７細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、１２時間インキュベーションした。その後、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡの系で市販のキット（Bioscience製）を用いて測定した。
【００４２】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系では、ＴＮＦ−αの産生は認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図５）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制しうることが確認された。
【００４３】
（実施例５）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（２）
本実施例では、マウスより採取したマロファージ様細胞を用いて、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４４】
まず、C57BL/6マウス（雄、８週齢）に３％チオグリコール酸０．１ｍｌを腹腔内(ip)投与して１週間おき、腹膜炎モデルマウスを作製した。得られたモデルマウスの腹膜腔よりマクロファージ様細胞を採取し、ＤＭＥＭ培地中で３７℃、１日間培養した。培地を５、１０又は５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃、３０分間インキュベーションした。次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含む培地に交換し、３７℃、１２時間インキュベーションした。その後、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００４５】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系では、ビタミンＫ３の濃度依存的にＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールや、ビタミンＫ３が５μＭの系では高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図６）。これにより、ビタミンＫ３の濃度依存的に、ＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制しうることが確認された。
【００４６】
（実施例６）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（３）
本実施例では、マウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４７】
まず、C57BL/6マウス（雄、７週齢）に１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＫ３を腹腔内(ip)投与して３０分後、２５０μｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内(ip)投与し、さらに１時間おいた。その後心臓採血を行い、血中のＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００４８】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３を投与した系では、陰性コントロールと同様に、ＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳ投与を行い、ビタミンＫ３投与しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図７）。これにより、ビタミンＫ３がＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制することが確認された。
【００４９】
（実施例７）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（４）
本実施例では、ＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群,Acute Respiratory Distress Syndrome）モデルマウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００５０】
まず、C57BL/6マウス（雄、８週齢）に１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＫ３を腹腔内(ip)投与して３０分後、１５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内(ip)投与し、ＡＲＤＳモデルを作製した。その後心臓採血を行い、血中のＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００５１】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３を投与した系では、ＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳ投与を行い、ビタミンＫ３投与しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図８）。これにより、高濃度のＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理したＡＲＤＳモデルにおいても、ビタミンＫ３がＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制することが確認された。
【００５２】
（実施例８）ビタミンＫ３によるＬＰＳの肺組織に及ぼす作用
本実施例では、ＡＲＤＳモデルマウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳの肺組織に及ぼす作用を確認した。
実施例７の各条件で処理したマウスから肺組織を得、確認した。肺組織を用いて、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った結果、ＬＰＳ処理において、肺組織の崩壊が確認された。ＬＰＳとビタミンＫ３とを処理した結果、ＬＰＳによる肺組織の崩壊は見られず、肺組織の状態は陰性コントロールと同じ程度であった（図９）。
【００５３】
（実施例９）ビタミンＫ３によるオートファジーに及ぼす作用
マウス膵炎モデルでは、膵腺房細胞でオートファジー(autophagy)が誘導されることは公知であり（膵臓, 23: 20-24 (2008)）、膵臓特異的にオートファジーを欠損させると、膵炎が抑制されることも公知である（J Biol Chem, 181:1065-1072 (2008)）。本実施例ではイヌ腎臓由来細胞株であるＭＤＣＫ細胞を用いて、in vitroの系でオートファジーを作製し、ビタミンＫ３のオートファジーに及ぼす作用を確認した。
【００５４】
オートファジーは飢餓状態に対する適応機構の１つであり、広く真核生物に保存されている機構である。生物は外界の栄養源の飢餓状態を感知すると、オートファジーにより自己細胞の細胞質の構成成分やオルガネラをリソソーム／液胞内で分解し、リサイクルする。オートファジーは細胞内のタンパク質分解系のひとつである。オートファジーでは、オートファゴソーム(autophagosome)と呼ばれる脂質二重膜構造体が形成され、分解すべき細胞質成分を膜で隔離する。この脂質二重膜成分に、ＡＴＧ５とＬＣ３−Ｉ，ＩＩが発現する。ＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの発現の割合からオートファジーを確認することができる。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞は、通常１０v/v％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養されるが、ＦＣＳを欠く培地で培養したときは、細胞は飢餓状態になる。１０v/v％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した系、ＦＣＳを欠くＤＭＥＭ培地で培養した系、及びＦＣＳを欠くが、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で培養した系について細胞の形態を確認した。飢餓状態は２時間とし、ビタミンＫ３は飢餓状態の３０分前より前投与した。飢餓状態後に細胞を固定し、核染色したのちに共焦点顕微鏡で観察した。
【００５６】
飢餓状態で２時間培養した系では、オートファゴソームを示すＧＦＰシグナルを多数観察した。ＧＦＰシグナルを発現している細胞をＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞という。一方、ビタミンＫ３を投与した系ではＧＦＰシグナルはほとんど見られなかった（図１０）。
【００５７】
また、全細胞中のＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞量を確認したところ、ビタミンＫ３を投与した系では、ほとんど確認できなかった。以上より細胞の飢餓状態に起因するオートファジーが、ビタミンＫ３により抑制されることが確認された（図１１）。
【００５８】
上記各培養条件でＭＤＣＫ細胞を培養したときのＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの発現をウエスタンブロット法にて確認した。各抗体は、Anti-LC3 (Medical ＆ Biological Laboratories社製)を使用した。飢餓状態の系で発現していたＬＣ３−ＩＩがビタミンＫ３投与で、減弱していた。のＬＣ３−Ｉ／ＬＣ３−ＩＩ比の計測でもビタミンＫ３投与でのＬＣ３−ＩＩの低下が示されており、図１０−１１と同様の結論を示唆する結果となった（図１２）。
【００５９】
（実施例１０）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（１）
マウス急性膵炎モデルにおけるビタミンＫ３投与の効果について検討した。C57BL/6マウス（雄、８週齢）にセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を１時間ごとに６回腹腔投与して、急性膵炎を惹起した。ビタミンＫ３（１００ｍｇ／ｋｇ）単回投与、または２回投与した系で膵の炎症程度を比較した。セルレインのみ投与した系の膵組織では、浮腫や炎症細胞浸潤といった著明な炎症所見が観察された。ビタミンＫ３投与で炎症は著明に減少し、２回投与でさらに低下していた。この結果よりマウス膵炎モデルにおいてビタミンＫ３投与で炎症が軽減されることが確認された（図１３）。
【００６０】
（実施例１１）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（２）
図１３と同様の実験をＧＦＰ−ＬＣ３トランスジェニックマウス（雄、８週齢）で行い、膵炎時のオートファジーとビタミンＫ３の関連を確認した。膵組織の共焦点顕微鏡での観察では、セルレインのみ投与した系では著明なＧＦＰシグナルを認めたのに対し、ビタミンＫ３も投与することによってシグナルの低下が見られた。ウエスタンブロット法での解析でも同様の結果となり、マウス膵炎モデルでのオートファジーが、ビタミンＫ３投与により抑制されることが確認された（図１４）。
【００６１】
（実施例１２）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（３）
図１３と同様の実験系で得た膵組織標本を用いて、ビタミンＫ３とアポトーシスの関連を検討した。膵組織をAnti-activated caspase3抗体(Promega社)で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。ビタミンＫ３を投与した系でアポトーシスの誘導がみられた。この結果により、マウス膵炎モデルでビタミンＫ３投与により、膵組織においてアポトーシスが誘導されることが確認された（図１５）。
【００６２】
（実施例１３）マウス腸炎におけるビタミンＫ３の作用
Ａ）ＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウス作製時にビタミンＫ３を投与したときの作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに蒸留水で３％に溶かしたデキストラン硫酸ナトリウム(Dextran sodium sulfate (DSS))を５日間飲水させＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウスを作製した。
ＤＳＳ投与開始より５日間、ビタミンＫ３を１００ｍｇ／ｋｇ（コーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ経口投与した。また、コントロールとしてコーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ５日間経口投与した。５日目の体重の変化を測定し、５日目に解剖し、腸の長さの測定とＨＥ染色による組織学的評価を行った。
【００６３】
Ｂ）ＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウス作製後にビタミンＫ３を投与したときの作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに蒸留水で３％に溶かしたＤＳＳを５日間飲水させＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウスを作製した。６日目以降は通常の飲水を行なった。
ＤＳＳ投与開始より８日目から５日間、ビタミンＫ３を１００ｍｇ／ｋｇ（コーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ経口投与した。また、コントロールとしてコーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ５日間経口投与した。ＤＳＳ開始時から体重の変化を測定し、１２日目に解剖し、腸の長さの測定とＨＥ染色による組織学的評価を行った。
【００６４】
腸の長さは、ビタミンＫ投与群は、コントロール群に比べてやや長かった。また、ＨＥ染色による組織学的評価の結果、ビタミンＫ投与群の腸では炎症が抑制され、正常な組織所見が観察された。
【００６５】
（実施例１４）マウス皮膚炎におけるビタミンＫ３の作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに、０．５％2,4‐ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を感作させ、ＤＮＦＢ誘発接触皮膚炎モデルを作製した。感作後６日目に、マウスの両側の耳の厚みを測定し、その後右耳にコーン油（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で溶解したビタミンＫ３を１０マイクロリットルを、コントロールとして左耳にコーンオイルをそれぞれ塗布後、０．２％ＤＮＦＢを両耳に塗布し、アレルギー反応を惹起させた。
【００６６】
惹起翌日に両側の耳の厚みを測定し、右耳と左耳の肥厚率を比較・検定し、ビタミンＫ３の抗炎症効果を評価した。その結果、ビタミンＫ３投与群のアレルギー反応惹起前後の厚みの差は、コントロール群に比べて薄く、ビタミンＫ３は皮膚炎において、抗炎症作用を発揮していることが確認された（図１９）。
【００６７】
ＤＮＦＢ感作後６日目に、モデルの耳を切除し病理標本を作製した。その結果、コントロール群では、皮下組織に著明な炎症細胞の浸潤を認めたが、ビタミンＫ３投与群では炎症細胞の浸潤は抑制されていた（図２０）。
【００６８】
（実施例１５）マウス喘息におけるビタミンＫ３の作用
生後６週のＣ５７ＢＬ／６マウス（♀）を用い、コーン油で溶解したビタミンＫ３を２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ及びコントロールとしてコーン油を投与した４群で比較を行なった。
喘息モデルとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いた気道炎症モデルがある。これは、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫後、ＯＶＡを吸入させて気道炎症を起こすものである。
０日目及び７日目にマウスにＯＶＡ／Ａｌｕｍを１０μｇ／１ｍｇを腹腔内投与することで感作を行い、次に１４−１６日目に１％ＯＶＡの吸入を３０分行ない、マウス喘息モデルを作製した。１３日目に各濃度のビタミンＫ３又はコーンオイルをモデルの腹腔内に各々２００μＬ／匹投与し、喘息に対する治療効果を検討した。１７日目に気管挿管を行い、ＰＢＳ０．８ｍｌで２回肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、ＢＡＬ中の総細胞数と白血球細胞分画で気道炎症の程度を評価した。具体的にはＢＡＬ液の細胞数を、血算板を用いてカウントした後、３０００ｒｐｍ、３分間でサイトスピンを行い、Diff-Quick染色を用いて分画を評価した。その結果、ビタミンＫ３の投与により、細胞数や好酸球すうが抑制され、炎症症状が改善されることが確認された（図２１）。
【００６９】
また、マウス喘息モデルを作製２４時間後に、解剖して気道粘膜組織の病理標本を作製した。その結果、コントロール群では、気道粘膜組織に著明な炎症細胞の浸潤を認めたが、ビタミンＫ３投与群では炎症細胞の浸潤は抑制されていた（図２２）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上詳述したように、本発明により、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎又は喘息モデルなどの各種炎症性疾患モデル動物にビタミンＫ３を投与した場合には、組織学的な観察結果より炎症症状が改善することが観察された。これらにより、ビタミンＫ３が炎症症状に有効に作用し、このビタミンＫ３の抗炎症効果は、ビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いと考えられる。また、ビタミンＫ３の作用機序を確認した結果、in vitroにおいてＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導を抑制したり、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢを抑制することが確認され、さらには、オートファジーを軽減化させることも確認された。本発明によりビタミンＫ３は、ＮＦ−κＢ活性阻害作用やオートファジーの亢進抑制作用を有し、ＮＦ−κＢ活性化やオートファジーの異常亢進を伴う各種疾患や症状に対して有効に作用しうることが判明したため、ビタミンＫ３は優れた抗炎症剤として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤に関する。より詳しくは、ビタミンＫ３を有効成分として含む、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息の起因となる炎症症状、あるいはこれらの疾患の結果生じる炎症症状に有効に作用する抗炎症剤に関する。さらには、本発明はこれらの症状に対する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンのひとつであり、天然に存在するものと人工に合成されたものがある。その生理機能としては骨へのカルシウム定着作用や血液凝固作用などが報告されている。より具体的にはビタミンＫ依存性タンパク質のＮ末端に存在するグルタミン酸残基を、生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）に変換する酵素であるγ−グルタミルカルボキシラーゼの補酵素として作用する。また、ビタミンＫは血液凝固ＩＩ（プロトロンビン）、ＶＩＩ、ＩＸやＸ因子等のビタミンＫ依存性タンパク質の生合成に不可欠なビタミンである。
【０００３】
天然に存在するビタミンＫには、緑黄色野菜・海藻類・緑茶・植物油などに含まれるビタミンＫ１（フィロキノン）と、腸内細菌によって合成されるビタミンＫ２（メナキノン）の２種類がある。さらにビタミンＫ２には１１種類の同族体があり、この中で食品に多く含まれるのは、動物性食品に広く分布するメナキノン-4と、納豆菌によって産生されるメナキノン-7が挙げられる。通常、フィロキノン・メナキノン-4・メナキノン-7を総称してビタミンＫという。また、人工合成型のビタミンＫとしてビタミンＫ３（メナジオン）やビタミンＫ４（メナジオール）などが挙げられる。
【０００４】
ビタミンＫ類の作用については、多く報告されており、各種ビタミンＫや、それらと化学構造の類似するＣｏＱなどについて例えばカラゲニン浮腫動物モデルにこれらの物質を投与したときの抗炎症効果を確認したものがある。ここでは、ビタミンＫ１、２、ＣｏＱは難溶性のため水素添加ヒマシ油に溶かし、ビタミンＫ３及びＫ４は水溶性のものを用い、水で溶解したりアラビアゴム乳剤としたものを用いて検討がなされている。その結果、抗炎症作用が認められる場合と認められない場合があり、認められる場合もその効力は弱く、一貫した抗炎症作用は証明できなかった、と報告されている（非特許文献１）。したがって、ビタミンＫの抗炎症作用を積極的に支持する成績は得られず、いわゆる抗炎症薬といわれる薬物と比較すれば、Ｋの抗炎症作用は疑わしいものと思われるとも示されている。
【０００５】
ビタミンＫ２又はその水和物が、ＮＦ−κＢ（Nuclear factor kappa B）活性化阻害作用を有することについて開示がある（特許文献１）。特許文献１では、ビタミンＫ２又はその水和物は癌細胞増殖抑制、癌治療において有用であり、さらに抗腫瘍剤と組み合わせることにより、抗腫瘍作用が増強されることが示されている。
【０００６】
ビタミンＫ３については、ＤＮＡポリメラーゼγを選択的に阻害し、ビタミンＫ１、Ｋ２に比べてより強い抗腫瘍効果があることが報告されている（非特許文献２）。また、ビタミンＫ３は、膵腺房細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献３−５）。しかしながら、各種炎症性疾患に対するビタミンＫ３の作用、効果については殆ど検討がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO2005/107731号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vitamine (Japan), 43:282-298 (1971)
【非特許文献２】Cancer Sci, 99:1040-1048 (2008)
【非特許文献３】J Physiol Gastro Liver Physiol, 286: 189-196 (2004)
【非特許文献４】J Cell Sci, 115:485-497 (2002)
【非特許文献５】J Biol Chem, 281:40485-40492 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規抗炎症剤を提供することを課題とする。さらには新規抗炎症剤に有効成分として含まれるビタミンＫ３（以下、「ＶｉｔＫ３」という場合もある。）の作用を解明し、有効性が高く、安全性に優れた薬剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤を用いる治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、in vitroやin vivoの実験系において、ビタミンＫ３が抗炎症作用を発揮しうることを確認し、その作用はビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認され、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤。
２．炎症が、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息より選択されるいずれかの疾患により生じる症状である前項１に記載の抗炎症剤。
３．炎症が、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状である前項１又は２に記載の抗炎症剤。
４．炎症性疾患が、オートファジーの異常亢進を伴う症状である前項１又は２に記載の抗炎症剤。
５．ビタミンＫ３を有効成分として含むＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
６．ビタミンＫ３を有効成分として含むオートファジーの異常亢進抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、肺炎モデルや膵炎モデルなどの各種炎症性疾患モデル動物にビタミンＫ３を投与した場合には、組織学的な観察結果より炎症症状が改善することが観察され、ビタミンＫ３が炎症症状に有効に作用しうることが認められた。このビタミンＫ３の抗炎症作用は、ビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いことが確認された。また、ビタミンＫ３の作用機序を確認した結果、in vitroにおいてＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導を抑制したり、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢを抑制することが確認された。さらには、オートファジーを軽減化させることも確認された。すなわち本発明により、ビタミンＫ３は、ＮＦ−κＢ活性阻害作用やオートファジーの亢進抑制作用を有し、ＮＦ−κＢ活性化やオートファジーの亢進を伴う各種疾患や症状に対して有効に作用しうることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＮＦ−κＢの不活性化状態及び活性化状態の存在様式を示す模式図である。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞でのＴＮＦ−αによる転写因子ＮＦ−κＢ活性化に対するビタミンＫ３の作用を、ウエスタンブロッティングによるｐ６５の検出にて確認した写真図である。（実施例１）
【図３】ＲＡＷ２６４．７細胞でのＬＰＳによる転写因子ＮＦ−κＢ活性化に対するビタミンＫ３の作用を、ウエスタンブロッティングによるｐ６５の検出にて確認した写真図である。（実施例２）
【図４】ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用を、ＲＡＷ２６４．７細胞でのｐ６５の発現にて確認した写真図である。（実施例３）
【図５】ＲＡＷ２６４．７細胞でのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例４）
【図６】マウスマクロファージ細胞でのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例５）
【図７】マウスでのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例６）
【図８】ＡＲＤＳモデルマウスでのＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導に対するビタミンＫ３の作用を示す図である。（実施例７）
【図９】ＡＲＤＳモデルマウスでの肺組織を示す写真図である。（実施例８）
【図１０】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、組織の形状にて確認した写真図である。（実施例９）
【図１１】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、ＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞の発現率にて確認した図である。（実施例９）
【図１２】ＭＤＣＫ細胞での飢餓状態によるオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比にて確認した写真図である。（実施例９）
【図１３】マウス膵炎モデルの膵臓組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１０）
【図１４】マウス膵炎モデルの膵臓組織でのオートファジーに対するビタミンＫ３の作用を確認した写真図である。（実施例１１）
【図１５】マウス膵炎モデルでの膵臓組織でのビタミンＫ３によるアポトーシス誘導作用を確認した写真図である。（実施例１２）
【図１６】マウス腸炎モデルの腸でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した図である。（実施例１３）
【図１７】マウス腸炎モデルの腸でのビタミンＫ３の抗炎症作用を腸の長さで確認した写真図である。（実施例１３）
【図１８】マウス腸炎モデルの腸組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１３）
【図１９】マウス皮膚炎モデルの皮膚肥厚の程度を示す図である。（実施例１４）
【図２０】マウス皮膚炎モデルでの皮膚組織でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１４）
【図２１】マウス喘息モデルでの肺胞洗浄液（ＢＡＬ）でのビタミンＫ３による総細胞数及び白血球細胞分画を確認した図である。（実施例１５）
【図２２】マウス喘息モデルの気道粘膜でのビタミンＫ３の抗炎症作用を確認した写真図である。（実施例１５）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤に関する。背景技術の欄でも説明したように、ビタミンＫにはいくつかの種類があり、ビタミンＫ１及びＫ２は天然に存在するが、ビタミンＫ３は人工合成型である。以下に、ビタミンＫ１（式I）、Ｋ２（式II）及びＫ３（式III）の構造式を参考に示す。
【００１５】
【化１】
【００１６】
【化２】
【００１７】
【化３】
【００１８】
本発明の抗炎症剤に有効成分として含まれるビタミンＫ３は、水和物であっても良い。炎症反応とは、身体組織の傷害に反応して、異物を排除しようとする防御反応であり、細胞からさまざまな伝達物質が放出され、腫れや痛み、発熱などを伴う反応をいう。炎症性疾患とは炎症反応による伝達物質によっておこる病気の総称であり、代表的なものに肺炎、膵炎、炎症性腸炎、皮膚炎、関節炎、筋炎、血管炎などが挙げられる。本発明において炎症とは、いわゆる炎症性疾患により発生する症状のみならず、腫瘍やアレルギー性疾患などのいわゆる炎症性疾患には含まれない疾患などであっても、それらに起因して身体組織に障害を生じた結果、炎症反応がおこり、腫れや痛み、発熱などを伴う症状が起こる場合も包含される。したがって、本発明の抗炎症剤は、いわゆる炎症性疾患に対してのみならず、あらゆる炎症症状を伴う場合に使用することができる。本発明は、これらの症状に対する治療方法にも及ぶ。
【００１９】
本発明において、炎症は上記広義の範囲で解釈されるが、好適にはＮＦ−κＢの活性化を伴うものが挙げられる。ＮＦ−κＢは転写因子の一種であり、免疫応答に関与するともいわれている。不活性なＮＦ−κＢは、ヘテロ二量体を形成して細胞質に存在し、ＩκＢ（InhibitorκＢ）と結合することによりその活性は抑制されている。しかし、ＴＮＦ−αなどの刺激によりＩκＢのセリン残基がリン酸化する酵素複合体であるＩκＢキナーゼが活性化すると、ＩκＢはプロテアソームにより分解を受ける。その結果ＮＦ−κＢの核内移行シグナルが露出し、核内に移行できるようになる（図１参照）。
【００２０】
生体内では、通常厳密にＮＦ−κＢの発現は制御されているものの、炎症性サイトカイン、細菌やウイルス（発ガン性ウイルスを含む）の感染、紫外線、ディーゼル粉末粒子など、ストレスを伴う外部刺激を受けると活性化されて核内に移行し、その制御下にある遺伝子の発現を誘導し、その結果、免疫応答や細胞死が回避されるといった生体防御機構が働く。具体的には、ＮＦ−κＢが活性化されると、さまざまなタンパク質の転写を活性化し、ＴＮＦ−αなどのサイトカインや、ケモカイン、接着分子、サイクリンなどの発現量が増加し、これらによって生体防御機構が作用する。これらの反応は、通常一過性のものであるが、ウイルスや紫外線、アレルゲンなどの化学物質による一部の特殊な刺激はＮＦ−κＢの恒常的又は過剰な活性化を引き起こし、アレルギー疾患や炎症性疾患、悪性腫瘍などを誘発する原因のひとつとなっている。本発明においては、炎症は、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息等の疾患の起因となる炎症症状、あるいはこれらの疾患の結果生じる炎症症状が好適に例示される。例えば、気管支炎、気管支喘息は、気道の炎症又は慢性炎症に起因する疾患である。
【００２１】
本発明において、炎症はオートファジー（autophagy）の異常亢進を伴うものも含まれる。オートファジーは細胞の飢餓状態や細胞死に起因して生じるともいわれており、オートファゴソーム（リソソームと融合したファゴソーム:自己の細胞成分を取り込んだリソソーム加水分解酵素を含む細胞質内隔離膜構造体）に取り込んだ自己の細胞内成分物をリソソーム酵素で分解する細胞現象である。オートファジーは、細胞の飢餓状態や細胞死以外にも様々な細胞活動に関連していることが知られている。例えば、細胞質内に感染した細菌やウイルスの排除に関連することが報告されている。
【００２２】
本発明において、ビタミンＫ３はＮＦ−κＢ活性化阻害剤の有効成分として作用する。ＮＦ−κＢ活性化阻害のメカニズムは明らかではないが、例えばあるタンパク質のプロモーターの転写因子であるＩκＢのリン酸化が阻害されることで、ＮＦ−κＢの活性化が阻害されるとも考えられる。すなわち、ビタミンＫ３は、ＩκＢのリン酸化を阻害することで、ＮＦ−κＢの活性化を阻害すると考えられる。本発明は、ビタミンＫ３を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化阻害剤にも及ぶ。本発明において「ＮＦ−κＢ活性化阻害剤」とは、転写因子ＮＦ−κＢの機能を阻害する作用を有する薬剤を意味する。例えば、生体又は生体の一部において、ＮＦ−κＢがＩκＢとの複合体から解放されるのを阻害する薬剤、ＮＦ−κＢの核への移行を阻害する薬剤、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を阻害する薬剤、ＮＦ−κＢの転写活性を阻害する薬剤などが含まれる。
【００２３】
また、本発明において、ビタミンＫ３はオートファジーの異常亢進抑制剤の有効成分としても作用する。白血球の細胞死や末梢血細胞数の制御は、炎症や生体防御と深い関わりをもっていることから、オートファジーの異常亢進を抑制することで、抗炎症作用も発揮しうる。
【００２４】
本発明は、ビタミンＫ３を有効成分とする薬剤に関し、その投与量は適宜決定することができる。例えばヒトに投与する場合、投与量や投与方法は適宜決定することができる。好ましい投与量は、ビタミンＫ３として、成人（体重６０ｋｇ）あたり、通常、１０〜２００ｍｇ／日であり、好ましくは１５〜１３５ｍｇ／日であり、さらに好ましくは３０〜６０ｍｇ／日（例えば４５ｍｇ／日）である。投与期間は、特に限定されるものではなく、例えば、１〜１０００日、好ましくは３〜３００日である。投与量及び投与期間は、炎症の治療効果と患者の状態を勘案しながら、適宜設定することができる。
【００２５】
本発明に使用するビタミンＫ３又はその水和物は、公知の方法又は今後開発される方法により合成することができる。例えば、メナジオン（シグマ製）のような市販のビタミンＫ３を使用することもできる。
【００２６】
本発明のビタミンＫ３を有効成分として含む薬剤は、薬学的に許容しうる添加剤を混和し製剤化して使用することができる。上記添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
以下に上記添加剤の例を挙げる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウムが挙げられる。
【００２８】
結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカが挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウムが挙げられる。着色剤としては三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものが挙げられる。
【００２９】
矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミドが挙げられる。懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子が挙げられる。
【００３０】
等張化剤としては、ブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトールが挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。防腐剤としてはメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。抗酸化剤としては硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールが挙げられる。安定化剤としては一般に医薬に使用されるものが挙げられる。吸収促進剤としては一般に医薬に使用されるものが挙げられる。また、必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸等の成分を配合してもよい。
【００３１】
また、上記製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤等の経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤又は注射剤を挙げることができる。上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。なお、必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。上記注射剤は、上記添加剤のうち、特に乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。
【実施例】
【００３２】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００３３】
（実施例１）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用（１）
本実施例ではヒト腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３細胞を用いて、ビタミンＫ３の転写因子ＮＦ−κＢの活性化に及ぼす作用を確認した。不活性なＮＦ−κＢ及び活性化されたＮＦ−κＢの存在様式については、図１を参照されたい。
【００３４】
本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、３０分間インキュベーションし、その後ＮＦ−κＢを構成するサブユニットであるｐ６５（６５ｋＤａ）の存在を確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を確認した。ｐ６５はｐ６５に対する抗体（SantaCruz Biotechnology製）を用いてウエスタンブロット法にて確認した。比較例として、ビタミンＫ３の代わりにビタミンＫ１又はＫ２で処理した場合についても確認した。また陰性コントロールは各種ビタミンＫもＴＮＦ−αでも処理しない系とし、陽性コントロールは各種ビタミンＫでは処理を行わなかったが、ＴＮＦ−αで処理を行った系とした。
【００３５】
上記の結果、ビタミンＫ３で処理した系については、陰性コントロールとほぼ同様に６５ｋＤａのバンドは殆ど認められなかった。これにより、ビタミンＫ３はＴＮＦ−αによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうる作用があることが確認された。一方、ビタミンＫ１、Ｋ２で処理した系についてはいずれも陽性コントロールと同様に６５ｋＤａでバンドが認められ、ＮＦ−κＢの活性化の抑制作用は認められなかった（図２）。
【００３６】
（実施例２）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢ活性化に及ぼす作用（２）
本実施例では、ＴＮＦ−αを含む培地で処理する代わりに、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ(lipopolysaccharide)を含む培地で処理したほかは、実施例１と同手法により検討を行なった。ＬＰＳにより細胞が刺激されるとＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８や血小板活性化因子（ＰＡＦ）などのサイトカイン誘導放出を促進する。その結果、ＬＰＳで処理することによりＮＦ−κＢが活性化される。
【００３７】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系については、ＬＰＳもビタミンＫ３も用いない陰性コントロールとほぼ同様に６５ｋＤａのバンドは殆ど認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは６５ｋＤａでバンドが認められ、ＮＦ−κＢの活性化が確認された（図３）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうることが確認された。
【００３８】
（実施例３）ビタミンＫ３による転写因子ＮＦ−κＢの核内移行に及ぼす作用
本実施例ではマクロファージ様細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を用いて、転写因子ＮＦ−κＢの核内移行を確認した。
【００３９】
本実施例では、Ｒａｗ２６４．７細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、３０分間インキュベーションし、その後ＮＦ−κＢを構成するサブユニットであるｐ６５（６５ｋＤａ）の存在を確認することで、ＮＦ−κＢの活性化を確認した。ｐ６５はｐ６５に対する抗体（SantaCruz Biotechnology製）を用いて免疫染色法にて確認した。また陰性コントロールは各種ビタミンＫもＬＰＳでも処理しない系とし、陽性コントロールは各種ビタミンＫ３では処理を行わなかったが、ＬＰＳで処理を行った系とした。また、ビタミンＫ３とＬＰＳを処理した各Ｒａｗ２６４．７細胞の核を、核染色色素であるTOPRO-3（インビトロジェン社製）を用いて染色し、蛍光顕微鏡により核の位置を確認した。ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系については、ＬＰＳもビタミンＫ３も用いない陰性コントロールとほぼ同様に、核内にはＮＦκＢのサブユニットｐ６５は殆ど認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは核内にＮＦκＢのサブユニットｐ６５の存在が認められ、ＮＦ−κＢの活性化が確認された（図４）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＮＦ−κＢの活性化を抑制しうることが免疫染色法によっても確認された。
【００４０】
（実施例４）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（１）
本実施例では、マクロファージ様細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を用いて、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４１】
本実施例では、Ｒａｗ２６４．７細胞を、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、３０分間インキュベーションし、次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含むＤＭＥＭ培地に交換してさらに３７℃、１２時間インキュベーションした。その後、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡの系で市販のキット（Bioscience製）を用いて測定した。
【００４２】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系では、ＴＮＦ−αの産生は認められなかった。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図５）。これにより、ビタミンＫ３は、ＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制しうることが確認された。
【００４３】
（実施例５）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（２）
本実施例では、マウスより採取したマロファージ様細胞を用いて、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４４】
まず、C57BL/6マウス（雄、８週齢）に３％チオグリコール酸０．１ｍｌを腹腔内(ip)投与して１週間おき、腹膜炎モデルマウスを作製した。得られたモデルマウスの腹膜腔よりマクロファージ様細胞を採取し、ＤＭＥＭ培地中で３７℃、１日間培養した。培地を５、１０又は５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃、３０分間インキュベーションした。次に１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含む培地に交換し、３７℃、１２時間インキュベーションした。その後、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００４５】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３で処理した系では、ビタミンＫ３の濃度依存的にＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳで処理し、ビタミンＫ３で処理しない陽性コントロールや、ビタミンＫ３が５μＭの系では高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図６）。これにより、ビタミンＫ３の濃度依存的に、ＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制しうることが確認された。
【００４６】
（実施例６）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（３）
本実施例では、マウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００４７】
まず、C57BL/6マウス（雄、７週齢）に１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＫ３を腹腔内(ip)投与して３０分後、２５０μｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内(ip)投与し、さらに１時間おいた。その後心臓採血を行い、血中のＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００４８】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３を投与した系では、陰性コントロールと同様に、ＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳ投与を行い、ビタミンＫ３投与しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図７）。これにより、ビタミンＫ３がＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制することが確認された。
【００４９】
（実施例７）ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用（４）
本実施例では、ＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群,Acute Respiratory Distress Syndrome）モデルマウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳのＴＮＦ−α誘導に及ぼす作用を確認した。
【００５０】
まず、C57BL/6マウス（雄、８週齢）に１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＫ３を腹腔内(ip)投与して３０分後、１５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを腹腔内(ip)投与し、ＡＲＤＳモデルを作製した。その後心臓採血を行い、血中のＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡの系で測定した。測定は、実施例４と同手法により行なった。
【００５１】
上記の結果、ＬＰＳ及びビタミンＫ３を投与した系では、ＴＮＦ−αの産生が抑制されることが確認された。一方、ＬＰＳ投与を行い、ビタミンＫ３投与しない陽性コントロールでは高いＴＮＦ−αの産生が確認された（図８）。これにより、高濃度のＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理したＡＲＤＳモデルにおいても、ビタミンＫ３がＬＰＳによるＴＮＦ−αの産生誘導を抑制することが確認された。
【００５２】
（実施例８）ビタミンＫ３によるＬＰＳの肺組織に及ぼす作用
本実施例では、ＡＲＤＳモデルマウスにビタミンＫ３を投与したときの、ビタミンＫ３によるＬＰＳの肺組織に及ぼす作用を確認した。
実施例７の各条件で処理したマウスから肺組織を得、確認した。肺組織を用いて、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った結果、ＬＰＳ処理において、肺組織の崩壊が確認された。ＬＰＳとビタミンＫ３とを処理した結果、ＬＰＳによる肺組織の崩壊は見られず、肺組織の状態は陰性コントロールと同じ程度であった（図９）。
【００５３】
（実施例９）ビタミンＫ３によるオートファジーに及ぼす作用
マウス膵炎モデルでは、膵腺房細胞でオートファジー(autophagy)が誘導されることは公知であり（膵臓, 23: 20-24 (2008)）、膵臓特異的にオートファジーを欠損させると、膵炎が抑制されることも公知である（J Biol Chem, 181:1065-1072 (2008)）。本実施例ではイヌ腎臓由来細胞株であるＭＤＣＫ細胞を用いて、in vitroの系でオートファジーを作製し、ビタミンＫ３のオートファジーに及ぼす作用を確認した。
【００５４】
オートファジーは飢餓状態に対する適応機構の１つであり、広く真核生物に保存されている機構である。生物は外界の栄養源の飢餓状態を感知すると、オートファジーにより自己細胞の細胞質の構成成分やオルガネラをリソソーム／液胞内で分解し、リサイクルする。オートファジーは細胞内のタンパク質分解系のひとつである。オートファジーでは、オートファゴソーム(autophagosome)と呼ばれる脂質二重膜構造体が形成され、分解すべき細胞質成分を膜で隔離する。この脂質二重膜成分に、ＡＴＧ５とＬＣ３−Ｉ，ＩＩが発現する。ＬＣ３−Ｉに対するＬＣ３−ＩＩの発現の割合からオートファジーを確認することができる。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞は、通常１０v/v％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養されるが、ＦＣＳを欠く培地で培養したときは、細胞は飢餓状態になる。１０v/v％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した系、ＦＣＳを欠くＤＭＥＭ培地で培養した系、及びＦＣＳを欠くが、５０μＭのビタミンＫ３を含むＤＭＥＭ培地で培養した系について細胞の形態を確認した。飢餓状態は２時間とし、ビタミンＫ３は飢餓状態の３０分前より前投与した。飢餓状態後に細胞を固定し、核染色したのちに共焦点顕微鏡で観察した。
【００５６】
飢餓状態で２時間培養した系では、オートファゴソームを示すＧＦＰシグナルを多数観察した。ＧＦＰシグナルを発現している細胞をＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞という。一方、ビタミンＫ３を投与した系ではＧＦＰシグナルはほとんど見られなかった（図１０）。
【００５７】
また、全細胞中のＧＦＰ−ＬＣ３陽性細胞量を確認したところ、ビタミンＫ３を投与した系では、ほとんど確認できなかった。以上より細胞の飢餓状態に起因するオートファジーが、ビタミンＫ３により抑制されることが確認された（図１１）。
【００５８】
上記各培養条件でＭＤＣＫ細胞を培養したときのＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの発現をウエスタンブロット法にて確認した。各抗体は、Anti-LC3 (Medical ＆ Biological Laboratories社製)を使用した。飢餓状態の系で発現していたＬＣ３−ＩＩがビタミンＫ３投与で、減弱していた。のＬＣ３−Ｉ／ＬＣ３−ＩＩ比の計測でもビタミンＫ３投与でのＬＣ３−ＩＩの低下が示されており、図１０−１１と同様の結論を示唆する結果となった（図１２）。
【００５９】
（実施例１０）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（１）
マウス急性膵炎モデルにおけるビタミンＫ３投与の効果について検討した。C57BL/6マウス（雄、８週齢）にセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を１時間ごとに６回腹腔投与して、急性膵炎を惹起した。ビタミンＫ３（１００ｍｇ／ｋｇ）単回投与、または２回投与した系で膵の炎症程度を比較した。セルレインのみ投与した系の膵組織では、浮腫や炎症細胞浸潤といった著明な炎症所見が観察された。ビタミンＫ３投与で炎症は著明に減少し、２回投与でさらに低下していた。この結果よりマウス膵炎モデルにおいてビタミンＫ３投与で炎症が軽減されることが確認された（図１３）。
【００６０】
（実施例１１）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（２）
図１３と同様の実験をＧＦＰ−ＬＣ３トランスジェニックマウス（雄、８週齢）で行い、膵炎時のオートファジーとビタミンＫ３の関連を確認した。膵組織の共焦点顕微鏡での観察では、セルレインのみ投与した系では著明なＧＦＰシグナルを認めたのに対し、ビタミンＫ３も投与することによってシグナルの低下が見られた。ウエスタンブロット法での解析でも同様の結果となり、マウス膵炎モデルでのオートファジーが、ビタミンＫ３投与により抑制されることが確認された（図１４）。
【００６１】
（実施例１２）マウス膵炎におけるビタミンＫ３の作用（３）
図１３と同様の実験系で得た膵組織標本を用いて、ビタミンＫ３とアポトーシスの関連を検討した。膵組織をAnti-activated caspase3抗体(Promega社)で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。ビタミンＫ３を投与した系でアポトーシスの誘導がみられた。この結果により、マウス膵炎モデルでビタミンＫ３投与により、膵組織においてアポトーシスが誘導されることが確認された（図１５）。
【００６２】
（実施例１３）マウス腸炎におけるビタミンＫ３の作用
Ａ）ＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウス作製時にビタミンＫ３を投与したときの作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに蒸留水で３％に溶かしたデキストラン硫酸ナトリウム(Dextran sodium sulfate (DSS))を５日間飲水させＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウスを作製した。
ＤＳＳ投与開始より５日間、ビタミンＫ３を１００ｍｇ／ｋｇ（コーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ経口投与した。また、コントロールとしてコーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ５日間経口投与した。５日目の体重の変化を測定し、５日目に解剖し、腸の長さの測定とＨＥ染色による組織学的評価を行った。
【００６３】
Ｂ）ＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウス作製後にビタミンＫ３を投与したときの作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに蒸留水で３％に溶かしたＤＳＳを５日間飲水させＤＳＳ誘起大腸炎モデルマウスを作製した。６日目以降は通常の飲水を行なった。
ＤＳＳ投与開始より８日目から５日間、ビタミンＫ３を１００ｍｇ／ｋｇ（コーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ経口投与した。また、コントロールとしてコーン油で希釈）を、２００μ／ｌずつ５日間経口投与した。ＤＳＳ開始時から体重の変化を測定し、１２日目に解剖し、腸の長さの測定とＨＥ染色による組織学的評価を行った。
【００６４】
腸の長さは、ビタミンＫ投与群は、コントロール群に比べてやや長かった。また、ＨＥ染色による組織学的評価の結果、ビタミンＫ投与群の腸では炎症が抑制され、正常な組織所見が観察された。
【００６５】
（実施例１４）マウス皮膚炎におけるビタミンＫ３の作用
８週齢の♀Ｂ６マウスに、０．５％2,4‐ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を感作させ、ＤＮＦＢ誘発接触皮膚炎モデルを作製した。感作後６日目に、マウスの両側の耳の厚みを測定し、その後右耳にコーン油（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）で溶解したビタミンＫ３を１０マイクロリットルを、コントロールとして左耳にコーンオイルをそれぞれ塗布後、０．２％ＤＮＦＢを両耳に塗布し、アレルギー反応を惹起させた。
【００６６】
惹起翌日に両側の耳の厚みを測定し、右耳と左耳の肥厚率を比較・検定し、ビタミンＫ３の抗炎症効果を評価した。その結果、ビタミンＫ３投与群のアレルギー反応惹起前後の厚みの差は、コントロール群に比べて薄く、ビタミンＫ３は皮膚炎において、抗炎症作用を発揮していることが確認された（図１９）。
【００６７】
ＤＮＦＢ感作後６日目に、モデルの耳を切除し病理標本を作製した。その結果、コントロール群では、皮下組織に著明な炎症細胞の浸潤を認めたが、ビタミンＫ３投与群では炎症細胞の浸潤は抑制されていた（図２０）。
【００６８】
（実施例１５）マウス喘息におけるビタミンＫ３の作用
生後６週のＣ５７ＢＬ／６マウス（♀）を用い、コーン油で溶解したビタミンＫ３を２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ及びコントロールとしてコーン油を投与した４群で比較を行なった。
喘息モデルとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いた気道炎症モデルがある。これは、ＯＶＡ／Ａｌｕｍで免疫後、ＯＶＡを吸入させて気道炎症を起こすものである。
０日目及び７日目にマウスにＯＶＡ／Ａｌｕｍを１０μｇ／１ｍｇを腹腔内投与することで感作を行い、次に１４−１６日目に１％ＯＶＡの吸入を３０分行ない、マウス喘息モデルを作製した。１３日目に各濃度のビタミンＫ３又はコーンオイルをモデルの腹腔内に各々２００μＬ／匹投与し、喘息に対する治療効果を検討した。１７日目に気管挿管を行い、ＰＢＳ０．８ｍｌで２回肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、ＢＡＬ中の総細胞数と白血球細胞分画で気道炎症の程度を評価した。具体的にはＢＡＬ液の細胞数を、血算板を用いてカウントした後、３０００ｒｐｍ、３分間でサイトスピンを行い、Diff-Quick染色を用いて分画を評価した。その結果、ビタミンＫ３の投与により、細胞数や好酸球すうが抑制され、炎症症状が改善されることが確認された（図２１）。
【００６９】
また、マウス喘息モデルを作製２４時間後に、解剖して気道粘膜組織の病理標本を作製した。その結果、コントロール群では、気道粘膜組織に著明な炎症細胞の浸潤を認めたが、ビタミンＫ３投与群では炎症細胞の浸潤は抑制されていた（図２２）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上詳述したように、本発明により、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎又は喘息モデルなどの各種炎症性疾患モデル動物にビタミンＫ３を投与した場合には、組織学的な観察結果より炎症症状が改善することが観察された。これらにより、ビタミンＫ３が炎症症状に有効に作用し、このビタミンＫ３の抗炎症効果は、ビタミンＫ１やビタミンＫ２と比べて非常に強いと考えられる。また、ビタミンＫ３の作用機序を確認した結果、in vitroにおいてＬＰＳによるＴＮＦ−αの誘導を抑制したり、ＴＮＦ−αにより活性化されたＮＦ−κＢを抑制することが確認され、さらには、オートファジーを軽減化させることも確認された。本発明によりビタミンＫ３は、ＮＦ−κＢ活性阻害作用やオートファジーの亢進抑制作用を有し、ＮＦ−κＢ活性化やオートファジーの異常亢進を伴う各種疾患や症状に対して有効に作用しうることが判明したため、ビタミンＫ３は優れた抗炎症剤として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤。
【請求項２】
炎症が、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息より選択されるいずれかの疾患により生じる症状である請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
炎症が、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状である請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
炎症性疾患が、オートファジーの異常亢進を伴う症状である請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
ビタミンＫ３を有効成分として含むＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項６】
ビタミンＫ３を有効成分として含むオートファジーの異常亢進抑制剤。
【請求項１】
ビタミンＫ３を有効成分として含む抗炎症剤。
【請求項２】
炎症が、肺炎、膵炎、腸炎、皮膚炎、気管支炎及び気管支喘息より選択されるいずれかの疾患により生じる症状である請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
炎症が、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状である請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
炎症性疾患が、オートファジーの異常亢進を伴う症状である請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
ビタミンＫ３を有効成分として含むＮＦ−κＢ活性化阻害剤。
【請求項６】
ビタミンＫ３を有効成分として含むオートファジーの異常亢進抑制剤。
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１６】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１６】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１８】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１１−６３７８（Ｐ２０１１−６３７８Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７５９８５（Ｐ２００９−１７５９８５）
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年６月３０日 日本膵臓学会 発行の、「膵臓 第２４巻第３号」にて発表
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年６月３０日 日本膵臓学会 発行の、「膵臓 第２４巻第３号」にて発表
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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