ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法
【課題】効率よく、かつ高収率でコハク酸等の有機酸を製造する方法を提供する。
【解決手段】ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強された好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、コハク酸を生成させることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【解決手段】ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強された好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、コハク酸を生成させることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌またはその調製物を用いた有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下これを「ＰＣ」と略称することがある）は、解糖系の代謝中間化合物であるピルビン酸に二酸化炭素（重炭酸イオン）を固定することによりオキザロ酢酸を生成し、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに４炭素（Ｃ4）化合物を補充する生理的役割を果たすとされている。
【０００３】
ピルビン酸カルボキシラーゼは微生物、動植物においてひろくその存在が確認されている。該酵素をコードする遺伝子に関しては、ほ乳類に関し多数研究されているものの、微生物に関しては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来の遺伝子［GENE, 191, 47-50, (1997)参照］、Rhizobium etli由来の遺伝子［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）由来の遺伝子[Mol.Gen.Genet.,229, 307-315, (1991)]、が単離され、その塩基配列が決定されているのみである。
【０００４】
ＴＣＡサイクルは、アミノ酸等各種有用物質生合成系において重要な代謝経路である。該遺伝子を利用することにより、ＴＣＡサイクルへの物質供給が強化され、オキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン等）の生産能の増強が期待されている。
【０００５】
本発明者らが知る限り工業的観点からの利用については、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた菌体を用いたオキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン等）製造法［特公平７−８３７１４，特開平９−１２１８７２］の報告はあるが、ＰＣ組み換え菌株の利用については殆ど検討されていない。
【０００６】
すなわち、ＰＣ遺伝子を増強した好気性コリネ型細菌を用いて、オキザロ酢酸からＴＣＡサイクルを逆行してリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等を生成させる効率のよい製造方法は全く知られていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】GENE, 191, 47-50, (1997)
【非特許文献２】J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)
【非特許文献３】Mol.Gen.Genet.,229, 307-315, (1991)
【特許文献１】特公平７−８３７１４
【特許文献２】特開平９−１２１８７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、本発明の目的は、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用いてリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者等は、好気性コリネ型細菌を用いてこれらの有機酸を生産する方法について検討したところ、好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させることにより、これら有機酸を効率よく生産可能であることを見いだし、さらに好気性コリネ型細菌をＰＣ遺伝子で組み換えることにより、ＰＣ活性を増強し、ＣＯ２をピルビン酸に取り込ませる能力を増強した菌体を用いることによりこれら有機酸の生産性が著しく向上することを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、有機酸を生成させることを特徴とする有機酸の製造方法に関する。
【００１１】
上記方法において、反応液に炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させる方法としては、炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を反応液に添加する方法、または反応液に二酸化炭素ガスを供給する方法が挙げられる。
【００１２】
上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、微生物または動植物由来の遺伝子が挙げられる。上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。
【００１３】
上記好気性コリネ型細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) が挙げられる。また、ブレビバクテリウム・フラバムとしては、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用いた培養法あるいは酵素法により、効率よく、かつ 高収率でコハク酸等の有機酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子を、もしくは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
【００１６】
本発明のＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知である、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のものを一例として述べれば次のとおりである。
【００１７】
ＰＣ遺伝子は、上記サッカロマイセス・セレビシエの染色体上に少なくとも２種類存在し、それらの配列が既知であるため[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得することができる。
【００１８】
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５６ｋｂからなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を増幅させることができる。
【００１９】
また、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５４ｋｂからなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を増幅させることができる。
【００２０】
このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５'末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
【００２１】
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列より、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとに、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
【００２２】
本明細書における「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００２３】
上記ＰＣ遺伝子を包含する本発明に用いるＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。
【００２４】
また、前記の如く酵母（Saccharomyces serevisiae）染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。
【００２５】
また、サッカロマイセス・セレビシエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。得られた遺伝子は、後記実施例２（Ｂ）作製のベクターのｔａｃプロモーター下流に挿入することができる。挿入したプラスミドを実施例２（Ｄ）の方法に従って好気性コリネ型細菌を形質転換し、有機酸の製造に使用することができる。
【００２６】
ヒト［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
【００２７】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出し、Fisher & Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。
【００２８】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
【００２９】
ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。
【００３０】
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
【００３１】
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００３２】
ＰＣ遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、本発明で用いるＰＣ遺伝子で組み換えられた好気性コリネ型細菌が得られる。
【００３３】
本発明に用いられるＰＣ遺伝子で組み換えられた好気性コリネ型細菌又はその調製物とは、通常の好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌またはその調製物であれば特に限定されるものではないが、例えば、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属等のコリネ型細菌またはその調製物が挙げられる。これらのうち、特にブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３(ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７), 同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス （Brevibacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９等のコリネ型細菌またはその調製物が好適に用いられる。
【００３４】
好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養したのち用いることができる。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いる事ができる。
【００３５】
培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収し、菌体をそのまま又は調製物として次に示す反応に用いられる。ここでいう調製物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製したＰＣ活性を有する画分等を指す。
【００３６】
反応液には、水、緩衝液、培地等が用いられるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。反応液には、例えばグルコース、エタノール等の有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることが特徴である。この場合の、有機原料としては、特に限定されることなく、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノールが好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌが好ましく、エタノールの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌが好ましい。
【００３７】
炭酸イオン、重炭酸イオンは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
【００３８】
また、嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。
【００３９】
反応の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２０時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定されないが、１ｇ／ｌ〜７００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌさらに好ましくは２０ｇ／ｌ〜４００ｇ／ｌが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。
【００４０】
上記でいう調製物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を指す。
【００４１】
以上の様な方法で製造した有機酸は、必要に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、カラム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事により、結晶として採取する方法等が挙げられる。
【００４２】
本発明で、製造の対象となる有機酸としては、特に限定されるものではないが、本発明の効果からは、酸素含有雰囲気で、好気性コリネ細菌又はその調製物で効率的に製造できない化合物が特に好ましい。
【００４３】
具体的には、有機カルボン酸が挙げられ、より具体的にはコハク酸、リンゴ酸、フマル酸等が挙げられる。
【００４４】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００４５】
〔実施例１〕
酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの全ＤＮＡの抽出：
酵母用増殖培地（ＹＰＡＤ）１Ｌ［組成：１０ｇ Yeast Extract，２０ｇ ペプトン，２０ｇ グルコース，１００ｍｇ アデニン及び蒸留水：１０００ｍｌ］にサッカロマイセス・セレビシエ Ｗ３０３−１Ａ株（Yeast, Vol.2, 163-167 (1986)）を白金耳を用いて植菌し、対数増殖期後期まで３０℃で培養し、菌体を集めた。
【００４６】
得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００４７】
（Ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化及び組換え体の創製：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
（ａ−１）5'-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG -3'（配列番号１）
（ｂ−１）5'-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT ACT TT -3'（配列番号２）
【００４８】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００４９】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００５０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００５１】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．５６ｋｐのＤＮＡ断片が検出できた。
【００５２】
〔実施例２〕ＰＣ遺伝子によるコリネ型細菌組み換え体の作製
（Ａ）シャトルベクターの構築
特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５３】
（ａ−２）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA CTG-3'（配列番号３）
（ｂ−２）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-3'（配列番号４）
【００５４】
上記プラスミドｐＣＲＹ３０は、次のようにして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ） ＩＦＯ１２１４４（工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５の受託番号で寄託されている）からプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。
【００５５】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００５６】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００５７】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００５８】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
【００５９】
上記で増幅産物を確認できた反応液 １０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ １μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００６０】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００６１】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００６２】
米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００６３】
（ａ−３）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-3'（配列番号５）
（ｂ−３）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'（配列番号６）
【００６４】
上記プラスミドｐＣＲＹ３１は、次のようにして構築されたプラスミドである。前記ｐＢＹ５０３由来の複製領域とプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）とを連結したプラスミドｐＣＲＹ３（このプラスミドを保持するブレビバクテリウム・フラバム MJ233 GE102は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている）をＫｐｎＩで部分分解してＤＮＡ断片を得る。一方、ｐＢＹ５０３をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）から調製し、ＫｐｎＩで完全分解し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。これらのＤＮＡ断片を連結し、各種制限酵素で切断したときに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択することによって、ｐＣＲＹ３１が得られる。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００６７】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００６８】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００６９】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
【００７０】
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７１】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７２】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００７３】
上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７４】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００７６】
（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入
ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００７７】
（ａ−４）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3'（配列番号７）
（ｂ−４）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８）
【００７８】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００７９】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００８０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００８１】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
【００８２】
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００８３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００８４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
【００８５】
（Ｃ）ＰＣ遺伝子のシャトルベクターへの挿入
実施例１（Ｂ）で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃ ５μｌを各々制限酵素ＢｇｌII、ＳｓｅＩまたはＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩで各々切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００８６】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００８７】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＳｓｅＩ，ＮｄｅＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．５６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＰＣ−ＰＹＣ２と命名した。
【００８８】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41株の形質転換
本プラスミドを米国特許第５，１８５，２６２号明細書記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入した。
【００８９】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１は、１９７６年１１月１７日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、郵便番号305)に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３８１２として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８が付与されている。
【００９０】
〔実施例３〕有機酸の製造（Ｉ）
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、上記ｐＰＣプラスミドを導入し形質転換させたブレビバクテリウム フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
【００９１】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／Ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が２８．５ｇ／Ｌ、酢酸が３．５ｇ／Ｌ、コハク酸が１６ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．２ｇ／Ｌ生成していた。
【００９２】
〔実施例４〕有機酸の製造（II）
実施例３と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試した。
【００９３】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、ここに１０％二酸化炭素ガス(９０％窒素ガス）を0.1vvmの速度で供給しながら３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が２７ｇ／Ｌ、酢酸が２．５ｇ／Ｌ、コハク酸が１７ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．５ｇ／Ｌ生成していた。
【００９４】
〔比較例１〕
形質転換してないブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株を用いた以外は、実施例４と同様に行った。
【００９５】
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
【００９６】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が３３．４ｇ／Ｌ、酢酸が５ｇ／Ｌ、コハク酸が１０ｇ／Ｌ、リンゴ酸が０．５ｇ／Ｌ生成していた。
【００９７】
〔比較例２〕
炭酸イオンを添加しない以外は、実施例４と同様に行った。
【００９８】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、実施例４と同様に培養した菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、３０℃で２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が１４ｇ／Ｌ、酢酸が３．６ｇ／Ｌ、コハク酸が２．４ｇ／Ｌ生成していた。
【００９９】
〔実施例５〕
酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来ＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を用いた有機酸製造
酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＰＣ遺伝子の一つであるＰＹＣ１はその配列が既知（Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−４，ｂ−４）により、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、酵母（Saccharomycescerevisiae）由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１００】
（ａ−４）5'-TTT CAT ATG TCG CAA AGA AAA TTC GCC -3'（配列番号９）
（ｂ−４）5'-TTT CCT GCA GGT CAT GCC TTA GTT TCA ACA GGA AC -3'（配列番号１０）
【０１０１】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１５．５ｇ／Ｌ生成していた。
【０１０２】
〔実施例６〕リゾビウム・エトリ由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造
リゾビウム・エトリ由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知（J.Bacteriol., 178,5960-5970, (1996)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−５，ｂ−５）を用いて、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Rhizobium etli由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１０３】
（ａ−５）5'-TTT CAT ATG CCC ATA TCC AAG ATA CTC -3'（配列番号１１）
（ｂ−５）5'-TTT CCT GCA GGT CAT CCG CCG TAA ACC TCC AGC AG -3'（配列番号１２）
【０１０４】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１４．５ｇ／Ｌ生成していた。
【０１０５】
〔実施例７〕バチルス・ステアロサーモフィルス由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造
バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知（GENE, 191, 47-50, (1997)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例２（Ｄ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−６，ｂ−６）を用いて、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Bacillus atearothermophilus由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１０６】
（ａ−６）5'-TTT CAT ATG AAG ACA AGA CGA ATT CGC -3'（配列番号１３）
（ｂ−６）5'-TTT CCT GCA GGT TAT TTG GAC AAC TCC ATG AGC AA -3'（配列番号１４）
【０１０７】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１４．０ｇ／Ｌ生成していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌またはその調製物を用いた有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下これを「ＰＣ」と略称することがある）は、解糖系の代謝中間化合物であるピルビン酸に二酸化炭素（重炭酸イオン）を固定することによりオキザロ酢酸を生成し、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに４炭素（Ｃ4）化合物を補充する生理的役割を果たすとされている。
【０００３】
ピルビン酸カルボキシラーゼは微生物、動植物においてひろくその存在が確認されている。該酵素をコードする遺伝子に関しては、ほ乳類に関し多数研究されているものの、微生物に関しては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来の遺伝子［GENE, 191, 47-50, (1997)参照］、Rhizobium etli由来の遺伝子［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）由来の遺伝子[Mol.Gen.Genet.,229, 307-315, (1991)]、が単離され、その塩基配列が決定されているのみである。
【０００４】
ＴＣＡサイクルは、アミノ酸等各種有用物質生合成系において重要な代謝経路である。該遺伝子を利用することにより、ＴＣＡサイクルへの物質供給が強化され、オキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン等）の生産能の増強が期待されている。
【０００５】
本発明者らが知る限り工業的観点からの利用については、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた菌体を用いたオキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン等）製造法［特公平７−８３７１４，特開平９−１２１８７２］の報告はあるが、ＰＣ組み換え菌株の利用については殆ど検討されていない。
【０００６】
すなわち、ＰＣ遺伝子を増強した好気性コリネ型細菌を用いて、オキザロ酢酸からＴＣＡサイクルを逆行してリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等を生成させる効率のよい製造方法は全く知られていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】GENE, 191, 47-50, (1997)
【非特許文献２】J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)
【非特許文献３】Mol.Gen.Genet.,229, 307-315, (1991)
【特許文献１】特公平７−８３７１４
【特許文献２】特開平９−１２１８７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、本発明の目的は、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用いてリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者等は、好気性コリネ型細菌を用いてこれらの有機酸を生産する方法について検討したところ、好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させることにより、これら有機酸を効率よく生産可能であることを見いだし、さらに好気性コリネ型細菌をＰＣ遺伝子で組み換えることにより、ＰＣ活性を増強し、ＣＯ２をピルビン酸に取り込ませる能力を増強した菌体を用いることによりこれら有機酸の生産性が著しく向上することを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、有機酸を生成させることを特徴とする有機酸の製造方法に関する。
【００１１】
上記方法において、反応液に炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させる方法としては、炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を反応液に添加する方法、または反応液に二酸化炭素ガスを供給する方法が挙げられる。
【００１２】
上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、微生物または動植物由来の遺伝子が挙げられる。上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。
【００１３】
上記好気性コリネ型細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) が挙げられる。また、ブレビバクテリウム・フラバムとしては、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用いた培養法あるいは酵素法により、効率よく、かつ 高収率でコハク酸等の有機酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子を、もしくは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
【００１６】
本発明のＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知である、酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のものを一例として述べれば次のとおりである。
【００１７】
ＰＣ遺伝子は、上記サッカロマイセス・セレビシエの染色体上に少なくとも２種類存在し、それらの配列が既知であるため[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得することができる。
【００１８】
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５６ｋｂからなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を増幅させることができる。
【００１９】
また、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５４ｋｂからなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を増幅させることができる。
【００２０】
このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５'末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
【００２１】
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列より、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとに、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
【００２２】
本明細書における「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００２３】
上記ＰＣ遺伝子を包含する本発明に用いるＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエ染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。
【００２４】
また、前記の如く酵母（Saccharomyces serevisiae）染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。
【００２５】
また、サッカロマイセス・セレビシエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。得られた遺伝子は、後記実施例２（Ｂ）作製のベクターのｔａｃプロモーター下流に挿入することができる。挿入したプラスミドを実施例２（Ｄ）の方法に従って好気性コリネ型細菌を形質転換し、有機酸の製造に使用することができる。
【００２６】
ヒト［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
【００２７】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出し、Fisher & Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。
【００２８】
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
【００２９】
ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。
【００３０】
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
【００３１】
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００３２】
ＰＣ遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、本発明で用いるＰＣ遺伝子で組み換えられた好気性コリネ型細菌が得られる。
【００３３】
本発明に用いられるＰＣ遺伝子で組み換えられた好気性コリネ型細菌又はその調製物とは、通常の好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌またはその調製物であれば特に限定されるものではないが、例えば、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属等のコリネ型細菌またはその調製物が挙げられる。これらのうち、特にブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３(ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７), 同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス （Brevibacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９等のコリネ型細菌またはその調製物が好適に用いられる。
【００３４】
好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養したのち用いることができる。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いる事ができる。
【００３５】
培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収し、菌体をそのまま又は調製物として次に示す反応に用いられる。ここでいう調製物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製したＰＣ活性を有する画分等を指す。
【００３６】
反応液には、水、緩衝液、培地等が用いられるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。反応液には、例えばグルコース、エタノール等の有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることが特徴である。この場合の、有機原料としては、特に限定されることなく、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノールが好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌが好ましく、エタノールの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌが好ましい。
【００３７】
炭酸イオン、重炭酸イオンは、１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
【００３８】
また、嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。
【００３９】
反応の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２０時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定されないが、１ｇ／ｌ〜７００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌさらに好ましくは２０ｇ／ｌ〜４００ｇ／ｌが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。
【００４０】
上記でいう調製物とは、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を指す。
【００４１】
以上の様な方法で製造した有機酸は、必要に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、カラム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事により、結晶として採取する方法等が挙げられる。
【００４２】
本発明で、製造の対象となる有機酸としては、特に限定されるものではないが、本発明の効果からは、酸素含有雰囲気で、好気性コリネ細菌又はその調製物で効率的に製造できない化合物が特に好ましい。
【００４３】
具体的には、有機カルボン酸が挙げられ、より具体的にはコハク酸、リンゴ酸、フマル酸等が挙げられる。
【００４４】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００４５】
〔実施例１〕
酵母サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの全ＤＮＡの抽出：
酵母用増殖培地（ＹＰＡＤ）１Ｌ［組成：１０ｇ Yeast Extract，２０ｇ ペプトン，２０ｇ グルコース，１００ｍｇ アデニン及び蒸留水：１０００ｍｌ］にサッカロマイセス・セレビシエ Ｗ３０３−１Ａ株（Yeast, Vol.2, 163-167 (1986)）を白金耳を用いて植菌し、対数増殖期後期まで３０℃で培養し、菌体を集めた。
【００４６】
得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００４７】
（Ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン化及び組換え体の創製：
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
（ａ−１）5'-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG -3'（配列番号１）
（ｂ−１）5'-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT ACT TT -3'（配列番号２）
【００４８】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００４９】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００５０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００５１】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．５６ｋｐのＤＮＡ断片が検出できた。
【００５２】
〔実施例２〕ＰＣ遺伝子によるコリネ型細菌組み換え体の作製
（Ａ）シャトルベクターの構築
特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５３】
（ａ−２）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA CTG-3'（配列番号３）
（ｂ−２）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-3'（配列番号４）
【００５４】
上記プラスミドｐＣＲＹ３０は、次のようにして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ） ＩＦＯ１２１４４（工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５の受託番号で寄託されている）からプラスミドｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができる。
【００５５】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００５６】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００５７】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００５８】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
【００５９】
上記で増幅産物を確認できた反応液 １０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ １μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００６０】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００６１】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００６２】
米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００６３】
（ａ−３）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-3'（配列番号５）
（ｂ−３）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3'（配列番号６）
【００６４】
上記プラスミドｐＣＲＹ３１は、次のようにして構築されたプラスミドである。前記ｐＢＹ５０３由来の複製領域とプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）とを連結したプラスミドｐＣＲＹ３（このプラスミドを保持するブレビバクテリウム・フラバム MJ233 GE102は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている）をＫｐｎＩで部分分解してＤＮＡ断片を得る。一方、ｐＢＹ５０３をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）から調製し、ＫｐｎＩで完全分解し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。これらのＤＮＡ断片を連結し、各種制限酵素で切断したときに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択することによって、ｐＣＲＹ３１が得られる。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００６７】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００６８】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００６９】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
【００７０】
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７１】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７２】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００７３】
上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７４】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００７６】
（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入
ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００７７】
（ａ−４）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3'（配列番号７）
（ｂ−４）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８）
【００７８】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００７９】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ
１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ
鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下）
上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ
滅菌蒸留水 ６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
【００８０】
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒
エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００８１】
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
【００８２】
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００８３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００８４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
【００８５】
（Ｃ）ＰＣ遺伝子のシャトルベクターへの挿入
実施例１（Ｂ）で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃ ５μｌを各々制限酵素ＢｇｌII、ＳｓｅＩまたはＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩで各々切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００８６】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔トリプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００８７】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＳｓｅＩ，ＮｄｅＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製のプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．５６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＰＣ−ＰＹＣ２と命名した。
【００８８】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41株の形質転換
本プラスミドを米国特許第５，１８５，２６２号明細書記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入した。
【００８９】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１は、１９７６年１１月１７日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、郵便番号305)に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３８１２として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８が付与されている。
【００９０】
〔実施例３〕有機酸の製造（Ｉ）
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、上記ｐＰＣプラスミドを導入し形質転換させたブレビバクテリウム フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
【００９１】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／Ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が２８．５ｇ／Ｌ、酢酸が３．５ｇ／Ｌ、コハク酸が１６ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．２ｇ／Ｌ生成していた。
【００９２】
〔実施例４〕有機酸の製造（II）
実施例３と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試した。
【００９３】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、ここに１０％二酸化炭素ガス(９０％窒素ガス）を0.1vvmの速度で供給しながら３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が２７ｇ／Ｌ、酢酸が２．５ｇ／Ｌ、コハク酸が１７ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．５ｇ／Ｌ生成していた。
【００９４】
〔比較例１〕
形質転換してないブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株を用いた以外は、実施例４と同様に行った。
【００９５】
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
【００９６】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が３３．４ｇ／Ｌ、酢酸が５ｇ／Ｌ、コハク酸が１０ｇ／Ｌ、リンゴ酸が０．５ｇ／Ｌ生成していた。
【００９７】
〔比較例２〕
炭酸イオンを添加しない以外は、実施例４と同様に行った。
【００９８】
（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、実施例４と同様に培養した菌体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ）、３０℃で２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳酸が１４ｇ／Ｌ、酢酸が３．６ｇ／Ｌ、コハク酸が２．４ｇ／Ｌ生成していた。
【００９９】
〔実施例５〕
酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来ＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を用いた有機酸製造
酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＰＣ遺伝子の一つであるＰＹＣ１はその配列が既知（Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−４，ｂ−４）により、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、酵母（Saccharomycescerevisiae）由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１００】
（ａ−４）5'-TTT CAT ATG TCG CAA AGA AAA TTC GCC -3'（配列番号９）
（ｂ−４）5'-TTT CCT GCA GGT CAT GCC TTA GTT TCA ACA GGA AC -3'（配列番号１０）
【０１０１】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１５．５ｇ／Ｌ生成していた。
【０１０２】
〔実施例６〕リゾビウム・エトリ由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造
リゾビウム・エトリ由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知（J.Bacteriol., 178,5960-5970, (1996)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−５，ｂ−５）を用いて、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Rhizobium etli由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１０３】
（ａ−５）5'-TTT CAT ATG CCC ATA TCC AAG ATA CTC -3'（配列番号１１）
（ｂ−５）5'-TTT CCT GCA GGT CAT CCG CCG TAA ACC TCC AGC AG -3'（配列番号１２）
【０１０４】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１４．５ｇ／Ｌ生成していた。
【０１０５】
〔実施例７〕バチルス・ステアロサーモフィルス由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造
バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知（GENE, 191, 47-50, (1997)）であるため、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例２（Ｄ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプライマー（ａ−６，ｂ−６）を用いて、ＰＣをコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Bacillus atearothermophilus由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
【０１０６】
（ａ−６）5'-TTT CAT ATG AAG ACA AGA CGA ATT CGC -3'（配列番号１３）
（ｂ−６）5'-TTT CCT GCA GGT TAT TTG GAC AAC TCC ATG AGC AA -3'（配列番号１４）
【０１０７】
得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に従って培養したところ、コハク酸が１４．０ｇ／Ｌ生成していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強された好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、コハク酸を生成させることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項２】
炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を反応液に添加すること、または反応液に二酸化炭素ガスを供給することにより、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを反応液に含有させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、微生物あるいは動植物由来である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属に属する微生物由来である請求項３記載の方法。
【請求項５】
好気性コリネ型細菌が、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強された好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、コハク酸を生成させることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項２】
炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を反応液に添加すること、または反応液に二酸化炭素ガスを供給することにより、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを反応液に含有させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、微生物あるいは動植物由来である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属に属する微生物由来である請求項３記載の方法。
【請求項５】
好気性コリネ型細菌が、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【公開番号】特開２００７−１２５０３０（Ｐ２００７−１２５０３０Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４７２０９（Ｐ２００６−３４７２０９）
【出願日】平成１８年１２月２５日（２００６．１２．２５）
【分割の表示】特願平１０−２０３６１の分割
【原出願日】平成１０年１月１６日（１９９８．１．１６）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２５日（２００６．１２．２５）
【分割の表示】特願平１０−２０３６１の分割
【原出願日】平成１０年１月１６日（１９９８．１．１６）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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