ファーミキューテス門に属する細菌による感染症の治療及び免疫学的診断のための、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つタンパク質に対するモノクローナル抗体
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ、エンテロコッカス属種などの病原菌から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質またはＰＢＰ２ａに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体に関する。また、本発明は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性を検出するための相補的な免疫学的診断における、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ、エンテロコッカス属種などの病原菌から産生されたＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
また、本発明は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性を検出するための相補的な免疫学的診断における、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）によって引き起こされた感染症は、臨床医にとって大きな関心事であり、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（1）によって引き起こされた感染症よりも高い罹患率及び死亡率を示す。さらに、ＭＲＳＡによる感染症は入院期間が長くなり抗菌剤の費用も嵩むので、ＭＲＳＡに感染した患者の治療コストは高くなる（1）。
【０００４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症の治療のために最初に選択された抗菌剤はバンコマイシンであった。しかし、米国及びオーストラリアの社会におけるＭＲＳＡ株の分離の増加は、日本、米国（5）及びブラジル（6）においてバンコマイシンに対して中程度の耐性を有するＭＲＳＡ株が確認されたことと共に、現在の状況をより厳しいものにしている。２００４年になされた、バンコマイシンに対して完全に耐性を有するＭＲＳＡ株についての報告（7）は、医療・化学の分野に深刻な懸念を引き起こした。ＭＲＳＡは、現在入手可能な全ての薬剤に対して耐性を有する病原菌である、恐ろしい「スーパーバグまたはスーパー細菌」となる強力な候補となっている。
【０００５】
通常、院内感染におけるＭＲＳＡ罹患率（ＭＲＳＡによって引き起こされた全ての感染症の割合）は、この１０年間では漸増傾向にある。Jarvis他によって行われた研究では、米国の３３７の病院の１２６８のＩＣＵ（集中治療室）におけるＩＣＵ内でのＭＲＳＡによる感染症の症例数は６６０から２１８４へ増加し、罹患率は３５％から６４．４５へ増加している（8）。日本では、ＭＲＳＡによって引き起こされた院内感染（ＨＩ）の罹患率は、６０〜９０％の深刻な値を示している（9）。米国で行われた研究では、ＭＲＳＡによる院内感染（ＨＩ）の罹患率は、１９７４年には２％だったのが１９９７年には５０％となり（10, 11）、米国の一部の病院では、ＨＩの８０％以上がＭＲＳＡによって引き起こされている（12）。英国では、ＭＲＳＡによる院内感染の罹患率は、１９８９年から１９９５年にかけて１．５５から１５．２％へ増加しており、現在（２００４）では４１．５％と推定される（13）。
【０００６】
高い罹患率に加えて、特に教育実習病院及び大型病院では、ＭＲＳＡは主要な病原菌起因の伝染病と見なされており、ブラジルの病院でアウトブレイクしている（14）。１９８６年には、サンパウロの大学病院で患者から分離された病院起源の黄色ブドウ球菌株の５０％以上がメチシリンに対して耐性を有しており、１９９３には、パウリスタ大学医学部（Paulista Medicine School）の小児科病院でのＭＲＳＡの発症率は７０％であった（15）。Resende他によってベロオリゾンテ（Belo Horizonte）の病院で行われた研究（16）では、ＭＲＳＡの罹患率が７１％であることが指摘されている。
【０００７】
ＭＲＳＡ株は、例えばＰＢＰ２ａなどのβラクタムクラスの抗菌剤に対する親和性が非常に低いペニシリン結合タンパク質を産出する（17）。遺伝子ｍｅｃＡによりコード化されたこの酵素の存在下では、βラクタム系抗菌薬が存在していても、細菌はペプチドグリカンを合成することができる。前記酵素は、イヌの正常フローラに存在する細菌であるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・シウリにも見ることができる。院内ＭＲＳＡ株は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性に加えて、第１の選択治療として依然としてグリコペプチド（バンコマイシン、テイコプラニン）が使用される他の利用可能な抗菌剤クラスの大部分に対して耐性を示す。
【０００８】
ＰＢＰ２ａに対してＤＮＡワクチン使用した２つの研究によれば、このタンパク質は免疫原性であり、得られた免疫応答は、マウスモデルで実施した分析では、ＭＲＳＡに対する防御能を与えることができることが報告されている（18, 19）。しかし、院内感染では、患者の大部分は、免疫抑制されていることが知られている（20）。この場合、細菌感染の制御時間に起因して、ワクチンは防御抗体を生成することができない。
【０００９】
ＰＢＰ２ａ免疫原性
【００１０】
GoffinとGhuysenの分類によれば、ＰＢＰ２ａはクラスＩＩマルチモジュラー酵素である（40）。７６キロダルトンのこの酵素は、膜結合領域と、非ペプチド転移酵素領域と、ペプチド転移酵素領域とから構成され、細菌性ペプチド転移反応に関与する４−アミノ酸活性コア（ＳＴＱＫ）を含んでいる（20 bis Ryfell, 1990）。
【００１１】
ＰＢＰ２ａに対するＤＮＡワクチンについての最新の研究では、Ohwada他の研究では３〜４回、Senna他の研究では１０００回全身感染させて免疫を与えた動物において細菌が減少することが報告されている（腎臓能の定量化）。上記の研究の著者は、遺伝子mecAの全配列（膜固定領域を除く）とペプチド転移酵素領域の内部フラグメントをそれぞれ使用した。
【００１２】
しかし、上述の方法では、ワクチンは、細菌感染の制御時間に起因して、防御抗体を生成することができない。従って、ＭＲＳＡによる感染の場合は、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の投与が、前記感染を治療するための最も適切な治療である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 1999/041285 A1号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の主な目的は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ、エンテロコッカス属種などの病原菌から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質（配列番号１）またはＰＢＰ２ａに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性を検出するための相補的な免疫学的診断における、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の使用である。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７の配列で表される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗ＰＢＰ２ａ抗体を産生するための免疫動物の血清の免疫酵素試験（ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図２】生サンプル及び精製後サンプルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示す。
【図３】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含む上清に対するＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ溶解物の免疫ブロッティング試験を示す。
【図４】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で培養し、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＭＲＳＡ（ＣＥＢ）及びＭＳＳＡ細菌のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図５】異なるＭＲＳＡ株の接種材料に対する、抗ＰＢＰ２ａ精製モノクローナル抗体及びバンコマイシンによって与えられたインビトロでの防御能試験（ＭＩＣ−最小阻止濃度）を示す。
【図６Ａ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡ ＣＥＢ株を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図６Ｂ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡイベリア型株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図６Ｃ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ株（ブラジル市中獲得型株）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図７Ａ】致死量の細菌（ＭＲＳＡ ＣＥＢ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図７Ｂ】致死量の細菌（イベリア型ＭＲＳＡ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図７Ｃ】致死量の細菌（ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図８Ａ】細菌（ＭＲＳＡ ＣＥＢ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体、バンコマイシン及び、抗体＋バンコマイシンの組合せで処理した動物及び非処理動物の腎臓における細菌の定量を示す。
【図８Ｂ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物の腎臓における細菌の定量を示す。
【図９Ａ】組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン３８との相互作用を示す。
【図９Ｂ】組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン１０との相互作用を示す。
【図１０】ＦＩＴＣで標識された抗ＰＢＰ２ａ抗体の存在下でのＭＲＳＡサンプルのフローサイトメトリーによる第２の解析のグラフである。
【図１１】ＶＲＥエンテロコッカス株に対する、抗体によって与えられたインビトロ防御能の結果を示す。
【図１２】腹腔内感染を決定するためのＬＤ５０及び致死量を示す。
【図１３】全身感染に対する、腸球菌由来の抗ＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５モノクローナル抗体のインビトロ防御能の有効性結果を示す。
【図１４】ＭＲＳＡイベリア型株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
抗菌剤に対する多耐性を有する細菌による感染症の発生は、驚くべき増加を示している。ＭＲＳＡによって引き起こされた院内感染の罹患率は世界中で増加しており、高い死亡率を示し、抗菌剤の集中的な使用及び患者の長期間の入院に起因して高いコストを生じさせている（24）。新規な有効な薬剤が市場にほとんど現れないことにより、化学療法に基づく治療はすでに限界に達している（25）。
【００１９】
これに関連して、有望な代替案と思われる受動免疫療法は、従来の化学療法と比較して様々な有利な特徴を有する：とりわけ、低い毒性、長い血漿半減期（このことにより投与量が減少するので治療が容易になり、最終的な治療コストも低くなる）、及び、特に本発明のモノクローナル抗体は、Paul Ehrlichにより推奨されている選択的毒性（薬物が関連する病原菌を選択的に除去する）という有利な特徴を有する（25a）。この最後の特徴は、多耐性細菌の出現をもたらす、広域スペクトル抗菌剤により果たされるいわゆる選択圧力を防止するのに大変役立つ（26）。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を開発するために、本願発明者は、マウスモデルにＤＮＡワクチンを用いた予備研究（18、19、20）及び免疫構造分子分析（immunostructural molecule analyses）に基づいて、標的としてＰＢＰ２ａを選択した。ＰＢＰ２ａの構造は２００２年に解明されており（29）、ＰＤＢ（タンパク質 Data Bank）にlwmrのコードで保存されている。
【００２１】
他のアプローチとは異なり、本願発明者は、ペプチド転移酵素ドメインにおいて酵素活性コア（ＳｘｘＫ）の側面に位置する、７６アミノ酸を有する分子の内部領域について研究した。エピトープ同定解析分析を前記分子及び別のクラスＩＩＣＨＭアレル（Tepitopeプログラム）に対するそれらの提示について行い、その後、前記分子でのそれらの位置を確認した（SPDB-Viewerプログラム）。このアプローチは、抗体が、天然分子の標的にアクセスする能力を評価することを可能にする。
【００２２】
このコンピュータ分析の結果は、酵素活性コアの近傍に位置し、クラスＩＩＣＨＭアレルによる優れた認識度を有し、かつＰＢＰ２ａの表面に位置するエピトープの存在を示す（データは示さない）。
【００２３】
これらのコンピュータによるシミュレーションは、標的認識試験（免疫ブロッティング、フローサイトメトリー）の実施により確認され、ＰＢＰ２ａ領域に対する抗体結合は、高い防御能を与えることが可能であることを示し、インビトロ及びインビボ試験の実施によって得られた結果により実証された。前記抗体は７６個のアミノ酸断片から作製されており、Ohwada及びSennaの研究によって前に示されたような、完全ＰＢＰ２ａによる免疫付与により作製された抗体よりも高い防御能を与えることが示され、本願発明者からの結果によって確認された。
【００２４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症の疫学は、全世界の病院におけるアウトブレイク及び流行に関与する優勢クローンタイプの存在を示す。そのようなクローンは、非流行性ＭＲＳＡ株よりも高いコロニー形成能力及び病原性を示す（30）。
【００２５】
得られた結果を実証するために、ＭＲＳＡにより引き起こされたほとんどの感染症（特に病院における感染症）の代表例である、様々なＭＡＳＡクローン（流行型クローン）について研究した。
【００２６】
ＣＥＢ株（ブラジル流行型クローン）は、ブラジルの病院においてＭＡＳＡによって引き起こされたほとんどの感染症に関与しており（31）、南アメリカの他の国々やポルトガル、チェコスロバキアでも確認されている（34）。ヨーロッパ流行型クローン（イベリア型ＭＡＳＡ）がヨーロッパの国々及び米国において発見されている（35）。
【００２７】
ＭＡＳＡによって引き起こされた市中感染症の症例が増加しているため、ブラジルで分離された株（WB79 CA-ＭＲＳＡ）が最近の試験に含められた。これらの試験は、院内ＭＲＳＡ株の特徴とは異なる高い病原性（パントン・バレンタイン・ロイコシジン（Panton-Valentine leukocidin）の存在）及び抗菌剤耐性を有するという、病院で発見されたものとは異なる特徴を示す（36）。近年、男性同性愛者の集団におけるＣＡ−ＭＲＳＡによる感染症のアウトブレイクが米国で確認されている（37）。この時点から、ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症は、ＳＴＤ（性感染症）としての面も持つと言える。
【００２８】
抗ＰＢＰ２ａ抗体の投与によって付与された防御能は、様々な被験クローンの全てに対して有効性を示し、あらゆるＭＲＳＡ型によって引き起こされた感染症（市中型または病院型）に対して適用性があることを信じさせる。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体のいくつかの重要な特徴について述べる。
【００３０】
（ｉ）インビトロでの防御結果は、関連する作用機序（分子活性コアに近い領域の遮断）が、細菌の成長及び増殖を阻害するのに十分であることを信じさせる。同様に、βラクラム系抗生物質については、この機序は時間依存性であり、細菌を増加段階にある最近を薬物作用の標的に曝す必要がある。
【００３１】
（ｉｉ）この特徴は、長い血中半減期を示す抗体の薬物速度論的特性によるものである（38）。抗生物質治療と比較して、このことは、より少ない投与回数で患者に対する治療効果を示し、結果として、最終コストがより低くなることを意味する。これらのアイデアは、バンコマイシンを用いた防御能比較分析の実施によって確認された（以下参照）。
【００３２】
（ｉｉｉ）インビトロでの細菌の成長の抑制もまた、本発明の抗体が、オプソニン作用及び補体活性化などの従来の補助的な抗原‐抗体反応機構を必要としないことを意味する。ほとんどの院内感染が免疫抑制状態の患者において発生することを考えると、本発明のモノクローナル抗体の特長は極めて重要である。
【００３３】
（ｉｖ）黄色ブドウ球菌の表面にプロテインＡが存在することが知られている。この分子は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して結合し、免疫システムのオプソニン作用を阻害するという特徴を有する（38）。本願発明者による試験から得られた結果により、投与された抗体集団は、ＰＢＰ２ａ阻害を妨げることなく、細菌表面に存在するプロテインＡを飽和させることができると考えられる。
【００３４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた全身感染症は、グリコペプチド、とりわけバンコマイシンを用いて治療されてきた。しかし、前記薬剤は、免疫毒性、聴器毒性、腎毒性及び一過性好中球減少症などの様々な副作用をもたらしたり、長期間の投与を必要としたり、高い最終治療コストをもたらしたりする。
【００３５】
マウス感染モデルを使用することにより、バンコマイシンによる治療、本発明のモノクローナル抗体による治療、及び、バンコマイシンと本発明のモノクローナル抗体の２つの薬剤による治療を互いに比較することが可能となる。得られた結果は、本発明のモノクローナル抗体の１回の投与は、バンコマイシンの５回の投与と同じかまたはそれよりも高い作用を示した。まや、バンコマイシンと本発明のモノクローナル抗体の同時投与は、別々に投与するよりも、殺菌においてより効果的であった。バンコマイシン及び本発明のモノクローナル抗体の投与により、本発明のモノクローナル抗体による治療コストがより低くなったり、または、深刻な状態の患者の回復がより効果的になることが判明したので、これらのデータは非常に重要である。
【００３６】
ＭＲＳＡによる感染症を治療するための抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の使用に加えて、本発明は以下の用途も考慮する。
【００３７】
（ｉ）本発明の抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体による、エンテロコッカス属種株のＰＢＰ５に近い分子量を有するタンパク質の認識結果は、本発明の抗体の投与によって前記病原菌に対する防御応答を得ることが可能であることを示す。ＰＢＰ５はＰＢＰ２ａと相同性を有しており、両方ともβラクタム系抗菌薬に対する親和性が低いクラスＢ多調節ＰＢＰとして分類される（40）。腸球菌は深刻な院内感染を引き起こす細菌であり、高程度の内因性を有し、抗菌剤に対する耐性を獲得する。バンコマイシン耐性株（ＶＲＥ）は、グリコペプチドに対する耐性を有する遺伝子の保有宿主の役割を果たし、他の病原菌へ移動することができる（41）。
【００３８】
（ｉｉ）本発明の抗体は、免疫診断試験によるＰＢＰ２ａ同定に用いることができる。例えば、本発明の抗体に結合したラテックス粒子の凝集に基づく免疫試験を行うことにより、数時間で、全てのβラクラム系抗生物質に対する耐性の予測結果を得ることができる。抗菌剤に対する感受性についての従来の試験（例えば、抗生物質感受性試験）では、結果が出るまでに１２〜２４時間かかった。
【００３９】
（ｉｉｉ）本発明のモノクローナル抗体が、慢性潰瘍に対しての標題の用途に成功的に使用されたら（インフリキシマブ、Streit他の文献及びWO 1999/041285 A1（特許文献１）を参照）、ＭＲＳＡによる鼻腔除菌を促進するために、及び、前記病原体によって引き起こされた皮膚病変を治療するために、本発明のモノクローナル抗体を局所的に投与してもよい。
【００４０】
最先端に見られる問題及び知識に基づいて、本願発明者は、実験動物に対して、遺伝子ｍｅｃＡ（配列番号２）に相当する構造を有するＤＮＡワクチンによる免疫付与を行った。前記免疫付与は、膜固定領域に対しては行わず、酵素活性コアを含んでいるペプチド転移酵素ドメイン（配列番号３）の７６個のアミノ酸を有する内部領域に対して行った。
【００４１】
前記免疫付与は、遺伝子ｍｅｃＡの全配列（膜固定領域を除く）及びペプチド転移酵素ドメインの内部断片を使用して、ＰＢＰ２ａに対するＤＮＡワクチンを開発したOhwada他及びSenna他の研究において示された条件と同一の条件で行われた。免疫付与は４回の投与によって行われ、免疫動物及び非免疫動物対照群をＭＲＳＡによって全身感染させ、２つの特定の時期において、被験動物の腎臓内に存在する細菌数を測定した。得られた結果は、ペプチド転移酵素断片で免疫付与した場合は、遺伝子ｍｅｃＡで免疫付与した場合よりも、被験動物の腎臓内に存在する細菌数が大幅に減少したことを示した。
【００４２】
従って、ペプチド転移酵素断片に対して生成された本発明の抗体は、上記の用いられた状態において（マウスモデルにおけるＤＮＡワクチン）、ＰＢＰ２ａに対する抗体を用いた場合よりも優れた防御能を提供する。前記ペプチド転移酵素断片は、酵素活性コアＳＴＱＫ（配列番号４）を含む。
【００４３】
従って、得られた結果に基づいて、本発明者は、ＰＢＰ２ａタンパク質またはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の作製方法と、前記酵素活性コアを含むペプチド転移酵素断片の使用を提供する。
【００４４】
以下、本発明を実施例を参照して説明するが、これらの実施例は限定的なものとして解釈されるべきではない。
【００４５】
材料及び方法
【００４６】
１．細菌：
【００４７】
次のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株を使用した。イベリア型ＭＲＳＡ、ＣＯＬ−ＭＲＳＡ（パスツール研究所の抗菌剤部門のDr. Patrice Courvalinから譲り受けた）、ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ及びＣＥＢ−ＭＲＳＡ（ＵＦＲＪの微生物学研究所のDr. Agnes Figueiredoから譲り受けた）；バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス株；及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株。大腸菌株、ＢＬ２１ ＤＥ３（Novagen）及びＴＯＰ１０（Invitrogen）を対照として使用した。
【００４８】
２．動物：
【００４９】
CECAL-FIOCRUZから入手してLAEAN-BioManguinhosに収容した４〜８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、免疫付与分析及びインビボ防御能分析に使用した。
【００５０】
３．免疫付与：
【００５１】
まず、マウス（４匹の被験動物）に１００ｍｇのｐＣＩ−ネオプラスミ：ＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子の断片（18）を投与し、その１４日後、ＭＲＳＡ ＰＢＰ２ａ（21）の内部領域に対応する、１０ｍｇの精製された組換えタンパク質を投与た。そして、完全フロイントアジュバント中で乳化させ、１４日後、不完全フロイントアジュバント内で乳化させた。その１４日後、免疫応答が最も高かった被験動物（酵素免疫分析‐ＥＬＩＳＡによって評価した）に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で希釈した１０ｍｇの精製タンパク質を静脈投与した。ＩＶ（静脈）注射の３日後、被験動物をＣＯ２で窒息させて安楽死させた後（CEUA L0009-07プロトコル−FIOCRUZ）、細胞融合のために脾臓を無菌的に取り出した。免疫応答が最も高かった被験動物の血清を、他の免疫学的試験のための免疫陽性対照として使用した。
【００５２】
４．モノクローナル抗体の作製：
【００５３】
脾臓から取り出したリンパ球を、融合用ポリエチレングリコールを用いてＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ATCC 1581）と融合させた後、「免疫学における最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」（22）のモノクローナル抗体作製プロトコルに従って、ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン培地中で３７℃、１０％ＣＯ２雰囲気下で培養した。その１４日後、精製された組換えタンパク質を抗原として使用して、後述する方法に従って、結果として得られたハイブリドーマをＥＬＩＳＡ試験によって評価した。評価が一番高かったハイブリドーマをクローニングした後、ＥＬＩＳＡによって最も良いクローンを選択して液体窒素中に保存した。
【００５４】
５．酵素免疫分析−ＥＬＩＳＡ：
【００５５】
炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中でマキシソープ（Maxisorp）９８ウエルプラスチックプレートを５００ｎｇ／ウエルの組換えタンパク質（ＰＢＰ２ａ断片）で感作させた後、４℃で一晩培養した。翌日、前記プレートを、Tween 20を０．０５％含有しているＰＢＳで３回洗浄し、脱脂粉乳５％含有ＰＢＳ及び中に３７℃で２時間保存した。サンプル（免疫動物の血清を１：１００で希釈したもの、または、培養細胞の上清）を分析した後、３７℃で２時間培養した。前記プレートを、再び、Tween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄し、抗Ｉｇ複合体を１：５０００の希釈率で加え、その後、３７℃で９０分間培養した。その後、前記プレートをTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ顕色剤（BioRad）を添加し、光を遮った状態で１５分間培養した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４を添加して反応を中断させた後、４５０ｎｍで測定した。１：２００で希釈した多クローン性高度免疫血清を陽性対照として用いた。
【００５６】
５．１．酵素免疫分析に基づく結合力分析：
【００５７】
５．１．１．尿素による結合力分析（Niederhouser他−５．１）：
【００５８】
プロトコルは、免疫分析（5）のプロトコルと類似しているが、次の点を変更した。サンプル（１００ｎｇのクローン１０精製モノクローナル抗体及び２．０ｎｇのクローン３８精製モノクローナル抗体）を３７℃で２時間培養した後、前記サンプルをTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳ中で８Ｍの尿素で３回洗浄した。その後、Tween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで４回洗浄した。通常に処理した（尿素で処理しなかった）同一のサンプルを対照として用いた。前記サンプルの光学密度を測定した後、尿素を用いて測定した値を尿素を用いないで測定した値で割り、それに１００掛けることによって結合率を計算した（パーセンタイル結果）。
【００５９】
５．１．２．チオシアン酸アンモニウムによる結合力分析（Goldblat他−５．２）：
【００６０】
プロトコルは、免疫分析（5）のプロトコルと類似しているが、次の点を変更した。サンプル（１００ｎｇのクローン１０精製モノクローナル抗体及び２．０ｎｇのクローン３８精製モノクローナル抗体）を３７℃で２時間培養した後、前記サンプルを次の濃度のチオシアン酸アンモニウムで３７℃で３０分間処理した。３Ｍ；１．５Ｍ；１．０Ｍ；０．７５Ｍ；０．５０Ｍ；０．２５Ｍ；及び０．１２５Ｍ。チオシアン酸アンモニウムで処理しなかったサンプルを各クローンの対照として用いた。
【００６１】
前記サンプルの光学密度を測定した後、次の式によって結合率を計算した。
ＡＲ（結合率）＝（（ｌｏｇ５０−ｌｏｇＡ）×（Ｂ−Ａ）／ｌｏｇＢ−ｌｏｇＡ）＋Ａ
ただし、ｌｏｇ５０＝１．７０とする。Ａは、５０％未満の吸光度減少が得られた、最も低いチオシアン酸アンモニウム濃度である。Ｂは、５０％を超える吸光度減少が得られた、最も高いチオシアン酸アンモニウム濃度である。
【００６２】
６．モノクローナル抗体の作製及び精製：
【００６３】
前もって選択したクローン１０及び３８のサンプルを、１０％のＣＯ２の雰囲気下のストーブ中の１００ｍＬの小瓶中で、１％のＢＳＡが添加された無血清培地（GIBCO VP-SFM）中で成長させた。上清を遠心分離した後、０．２２μｍのフィルタでろ過し、SelectSureプロテインＡ ＭＡＢ樹脂（ＧＥ）を用いた高性能クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。前記抗体を、ｐＨ１０．０の１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨ７．０に中性化した後、脱イオン水中で０．５倍のＰＢＳに対して透析させる。前記サンプルを凍結乾燥処理し、脱イオン水中で再懸濁させ、ローリー法で定量化し、ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動によって評価した。
【００６４】
７．標的認識：
【００６５】
７．１．インビトロでのＰＢＰ２ａ認識‐免疫ブロッティング：
【００６６】
ＭＲＳＡ（ＣＥＢ）株、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム株、及びＢＬ−２１ ＤＥ３大腸菌株を指数増殖期で成長させた。１ｍＬの各サンプルを遠心分離し、mini-Bead Beater device（Biospect Products）のガラスビーズ内で撹拌して溶解させた（３回、３０秒間）。各サンプルの１アリコートを１２％変性のポリアクリルアミドゲル内で電気泳動させ（SDS-PAGE）、その後、前記タンパク質をナイロン膜へ移動させた（Hybond N-BioRad）。前記膜を、脱脂粉乳１０％及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％を含有しているＰＢＳ緩衝液に入れて緩やかに撹拌した。前記膜をTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。その後、洗浄した膜を、ＰＢＳ中で１：１の割合で希釈した抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の上清と共に、２時間培養した。培養後、前記膜を上述した方法で洗浄し、１：１５，０００の割合でアルカリホスファターゼ複合体（マウス抗ＩｇＧ抗体‐Sigma A3688）と９０分間培養する。その後、ＰＢＳ中での洗浄を繰り返し、アルカリホスファターゼ用のWestern Blue基板（Promega）による成長を行った。
【００６７】
７．２．細菌表面でのＰＢＰ２ａ認識‐フローサイトメトリー：
【００６８】
ＭＲＳＡ（ＣＥＢ）株を静止期（ＯＮ）または指数増殖期で成長させた。前記サンプルを、１倍のＰＢＳ中で洗浄し、０．６のＤＯ６００（〜１０８細菌／ｍＬ）で再懸濁させた。そして、１ｍＬ（１０８細菌）中で遠心分離し、０．５％ＢＳＡ及び１：１０で希釈した正常血清（マウス：ヒト）中で再懸濁させた。そして、前記サンプルを４℃で３０分間培養した後、前記濃縮物（ペレット）をＰＢＳ中で２回洗浄し、０．５％ＢＳＡと１：１０，０００で希釈した抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含有している１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁させ、４℃で３０分間培養した。このステップの後、前記サンプルを前述した方法で再び洗浄し、０．５％ＢＳＡとＰＥ（フィコエリトリン）マウス抗Ｉｇ複合体の希釈物（１：１０００）を含有している１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁させ、その後、暗い状態で４℃で３０分間培養した。その後、前記サンプルを再び洗浄し、２％パラホルムアルデヒドを含有しているＰＢＳ中で４℃で１５分間静置した。この前処理の後、前記サンプルをフローサイトメータ（Becton and Dickinson社製のFACScalibur）で分析した。
【００６９】
８．インビトロ防御分析‐最少阻害濃度の測定：
【００７０】
ＭＳＲＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＣＯＬ及びＣＡ）を、６００ｎｍでの光学密度が０．５になるまで指数増殖期で成長させた。
【００７１】
適用される接種材料は、約１００，０００個の細菌を含むように調節した。ミュラーヒントン（Muller Hinton）培養液、細菌接種材料、及び、増殖中の精製抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を試験管または１４キャビティプレートに加えた。前記試験管またはプレートを３７℃で１２時間培養した。その後、サンプルにおける濁度を観察した。この最小抑制濃度は、より少ない量の抗体で最近接種材料（１００，０００個の細菌）の成長を抑制することができると考えられる。
【００７２】
９．インビボ防御能分析：
【００７３】
９．１．ＭＲＳＡ株についての致死量及びＬＤ５０の測定
【００７４】
リード・ミュンヒ（Reed-Muench）の方法（23）に従って、ＭＲＳＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ及びＣＯＬ）について致死量及びＬＤ５０の測定を行った。８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスのグループを、成長中の細菌を腹腔内経路で投与することにより接種し、７日間観察した。この期間を生き延びた被験動物を、動物保護法に従って安楽死させた。
【００７５】
９．２．全身感染及び細菌腎臓感染の定量分析
【００７６】
ＭＲＳＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ）を指数増殖期で成長させ（ＤＯ６００〜０．６）、約２×１０８の細菌に相当するＤＯ６００〜０．５で１倍の無菌ＰＢＳ中で洗浄し、再懸濁した。この濃度は、希釈率により計算し、オキサシリンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有しているＢＨＩ寒天プレート上に播種した。１日目に、８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに対して、４００ｍｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の腹腔内投与を１回行った。６日目に、被験動物を安楽死させ、腎臓を無菌的に取り出した。その後、腎臓を、１ｍＬの無菌ルリア培地中で均質化した後、１０倍に希釈した。１００μＬの各希釈液を、オキサシリンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有しているＢＨＩ寒天プレート上に播種した後、３７℃で２４時間培養した。そして、得られたコロニー数のカウントと総希釈率の計算を行った。
【００７７】
９．３．生存分析
【００７８】
ＭＲＳＡ株を、接種材料の調節を前に設定したＬＤ５０で行う以外は、前述した方法と同一の条件で成長させた。１日目に、８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに対して、精製された抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の服腔内投与を１回行った。翌日、被験動物と対照群に対して、腹腔内経路での投与を１回行うことによって、各株のＬＤ５０に従って、２．５〜６．０×１０８の細菌を感染させた。被験動物を１０日間観察した後、生き残ったものを安楽死させた。
【００７９】
１０．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体及びバンコマイシンのインビボ防御能の比較研究−腎臓感染の定量化
【００８０】
分析Ｉ
【００８１】
８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスの４つのグループ（１グループあたり４匹）に、６．０×１０７個の細菌（ＣＥＢ−ＭＲＳＡ）を腹腔内経路で投与して感染させた。被験動物のグループ１〜３に対しては、精製されたモノクローナル抗体（ＭＡＢ）、バンコマイシン、ＭＡＢ＋バンコマイシンをそれぞれ投与した。陰性対照としてのグループ（グループ４）には何も投与しなかった。
グループ１：ＭＡＢ（４００μｇ）（１日目）
グループ２：バンコマイシン（１５０μｇ、筋肉内投与経路、１２時間毎）
グループ３：バンコマイシン＋ＭＡＢ（３５０μｇ）（感染の１日後）
グループ４：対照
【００８２】
抗体及びバンコマイシンの最初の投与は、細菌投与の４時間後に行った。被験動物を４日目に安楽死させ、腎臓を無菌的に取り出し、前述した方法を用いて腎臓感染の定量化を行った。
【００８３】
分析ＩＩ
【００８４】
この分析は、細菌投与量を低くする（７．０×１０６個の細菌）こと以外は、分析Ｉと同じ方法で行った。グループ１は５００μｇの精製されたモノクローナル抗体で処理；グループ２はバンコマイシンで処理（１５０μｇ、筋肉内投与経路、１２時間毎：５回投与）；グループ３はバンコマイシン＋５００μｇのモノクローナル抗体；グループ４は対照とする（非処理動物）。
【００８５】
１１．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の決定
【００８６】
１１．１．ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡ抽出
【００８７】
ｍＲＮＡを抽出するために、RNeasy Minikitキット（Qiagen）を使用して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養細胞の１０ｍＬの遠心分離濃縮物（ペレット）を処理した。
【００８８】
１１．２．ｃＤＮＡ取得
【００８９】
逆転写反応：製造ガイドラインに従って、Ｍ−ＭＬＶ逆転写キット（Invitrogen）を使用して相補的ＤＮＡを得た。
【００９０】
１１．３．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＶＨ鎖及びＶＬ鎖の増幅
【００９１】
この反応は、下記の開始配列（プライマー）を使用して行った。
【００９２】
【表１】
【００９３】
１１．４．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のシークエンシング
【００９４】
シークエンシングのステップ：
【００９５】
Ｉ．増幅
【００９６】
増幅は、配列番号１〜３９によって定義された前述の開始配列を使用して行った。
【００９７】
ＩＩ．シークエンシング
【００９８】
装置BI Prism 3100 Genetic Analyser（Hitachi）を使用した。
【００９９】
１１．５．軽鎖及び重鎖のＣＤＲの配列分析及び同定
【０１００】
後でKabat's（24）及びChotia's（25）のアルゴリズムで解析して軽鎖及び重鎖のＣＤＲを同定するために、得られたＤＮＡ配列をDNASTAR社のプログラム（ExPASy部位翻訳プログラム）を用いて分析してアミノ酸配列に翻訳した。
【０１０１】
１２．モノクローナル抗体についての結合定数及び解離定数の決定（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore）方法によるクローン１０及び３８）
【０１０２】
Biacore X（登録商標）装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）のＣＭ−５センサを使用してＳＰＲ測定を行った。結合試薬及びＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｐ２０（Tween 20、ｐＨ７．４）はGE Healthcare社から入手した。
【０１０３】
例２
【０１０４】
１．マウス抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の獲得
【０１０５】
前述の免疫付与プロトコルを用いて動物群へ免疫を行った。ＥＬＩＳＡ試験による評価結果を図１に示す。
【０１０６】
融合手順（番号90-LATAの融合）を行った後、上清（ハイブリドーマ）を９６ウェルでＥＬＩＳＡ試験によって解析した。そのうち、上位５個のサンプルを選択して細胞を増やした（クローニング）。その後、再び、得られた上清をＥＬＩＳＡによって解析した。ＥＬＩＳＡによって得られた結果を検証するために精製組換えタンパク質（ＰＢＰ２ａ）に対する免疫ブロッティングによって陽性サンプルを検証した。最終結果を表１に示す。
【０１０７】
図１は、抗ＰＢＰ２ａ抗体産生のために免疫された動物の血清の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示している。横縞模様のグラフはそれぞれ、免疫された動物の１００倍希釈した血清に対応する。矩形波模様（一番右）のグラフは、陽性対照血清である。１つ目の横縞模様の棒グラフ：免疫前血清；２つ目の棒グラフ：４回目の免疫付与後の血清；３つ目の棒グラフ：５回目の免疫付与後の血清。
【０１０８】
表１．融合９０のクローニング：結論
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
選択されたクローンから、クローン７７〜３８に対して再クローニング手順を行い、分泌モノクローナル抗体の細胞安定性を検証した。解析した５０ウェルのうち、全てがＥＬＩＳＡ陽性であった。これらのクローンは増やされ、ＬＡＴＡＭ（Laboratorio de tecnologia de anticorpos monoclonais：モノクローナル抗体技術研究所）の液体窒素施設に貯蔵されている。
【０１１１】
２．モノクローナル抗体の成長、産生及び精製
【０１１２】
手順は、前述のように標準化した。産物は、上清１００ｍＬ当たり約４ｍｇのモノクローナル抗体であり、精製手順を実行した。結果を以下に示す。
【０１１３】
図２に、生サンプル及び精製後サンプルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示す。この図２は、精製前（カラム１）及び精製後（２）の上清サンプルを用い、MAb SelectSure樹脂を充填したＨＰＬＣカラムを通し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示している。カラム３〜９は、得られた精製サンプル分画に対応する。矢印は、約１５０ｋＤａの大きさを示している。
【０１１４】
３．モノクローナル抗体の機能的特性解析
【０１１５】
３．１．インビトロＰＢＰ２ａ認識−免疫ブロッティング
【０１１６】
標的病原体（ＰＢＰ２ａ及び類似配列）における抗体認識能力を調べるために、ＰＢＰ２ａを有する細菌（ＣＥＢ及びＣＯＬ ＭＲＳＡ）、ＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）株（ＰＢＰ２ａを有しない）、バンコマイシン耐性腸球菌属（ＰＢＰ５を有する）、βラクラム系抗生物質に対する親和性が低下したペプチド転移酵素（ＰＢＰ２ａに相同）、及び陰性対照として大腸菌株（組換えタンパク質を作製）に対して免疫ブロッティング試験を行った。その結果、それぞれＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５の大きさに相当するＭＲＳＡ及びエンテロコッカス属種株における分子量約７６ｋＤａのタンパク質を抗体が認識できたことが分かった。モノクローナル抗体は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌のタンパク質（ＰＢＰ２ａ陰性）とも大腸菌株とも反応性が示されなかった。結果を図３（ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡに対する免疫ブロッティング）に示す。
【０１１７】
抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含む上清に対するＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ溶解物の免疫ブロッティング試験の結果を図３に示す。
１．−分子量マーカー（カレイドスコープ）；
２．−指数増殖期において成長させたＭＳＳＡサンプル；
３及び４．−指数増殖期において成長させたＭＲＳＡサンプル；
５．−静止期において（一晩）成長させたＭＳＳＡサンプル；
６及び７．−静止期において成長させたＭＲＳＡサンプル。左の矢印は、ＰＢＰ２ａ分子量を示している。
【０１１８】
３．２．細菌表面上のＰＢＰ２ａ認識−フローサイトメトリー
【０１１９】
フローサイトメトリー試験の目的は、モノクローナル抗体による未変性状態の標的細菌認識の検証である。前の試験（免疫ブロッティング）では、変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によるタンパク質分離中に変性された標的タンパク質の認識が観察された。ここでも先と同様に、指数増殖期及び静止期において成長させた陰性対照株（ＭＳＳＡ，ＰＢＰ２ａ陰性）及びＭＲＳＡ株（ＣＥＢ）を解析した。その結果、両条件において抗体が細菌表面上の標的を認識できることが分かった。ブドウ球菌表面上のプロテインＡの存在は、抗体とＰＢＰ２ａとの結合を阻止することができなかった。結果を図４に示す。
【０１２０】
図４は、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体と培養し、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＭＲＳＡ（ＣＥＢ）及びＭＳＳＡ細菌のフローサイトメトリーの結果を示している。（１）にはＭＳＳＡ細菌、（２）には静止期において成長させたＭＲＳＡ、（３）には指数増殖期において成長させたＭＲＳＡを示す。ＭＲＳＡの集団は、蛍光複合体によって標識された細胞の増加に対応して右にずれている。
【０１２１】
４．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体によって与えられる防御の評価：
【０１２２】
４．１．インビトロ防御能試験
【０１２３】
最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
【０１２４】
これらの試験は、閉鎖系における標的への抗体の直接結合能の評価を目的とする。治療目的のモノクローナル抗体の場合、陽性結果が重要である。というのも、陽性結果は、宿主の自然免疫系及び獲得免疫系との組合せ作用によって生じる補体活性化及びオプソニン化機序などの宿主の免疫系の助けなしで、抗体が標的を認識しかつ細菌増殖を阻止できることを意味するからである。ＣＥＢ、ＣＯＬ及びイベリア型ＭＲＳＡ株を評価したところ、評価条件下で同じようなＭＩＣ値（約５００μｇ）が観察された。これらのデータは、ＭＲＳＡ株の遺伝的背景が異なるにもかかわらず、成長を阻止するために必要な抗体の用量が同じであることを示している。これらの結果を図５に示す。
【０１２５】
図５は、異なるＭＲＳＡ株由来の１０５個の細菌の接種材料に対して抗ＰＢＰ２ａ精製モノクローナル抗体及びバンコマイシンによって与えられるインビトロでの防御能試験（ＭＩＣ−最小阻止濃度）を示している。濁りがないことは、試験条件下で細菌増殖がなかったことを示している。
１Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ（ブラジル流行クローン）＋２５０μｇの抗体；
２Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ａ及び６Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋２５０μｇの抗体；
２Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ｂ及び６Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｃ：イベリア型ＭＲＳＡ（ヨーロッパ流行型クローン−ＥＥＣ）＋２５０μｇの抗体；
２Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ｃ及び６Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋１５０μｇのバンコマイシン；
２Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋３００μｇのバンコマイシン；
３Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋５００μｇのバンコマイシン；
４Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋７５０μｇのバンコマイシン；
５Ｄ及び６Ｄ：陰性対照。
【０１２６】
４．２．インビトロ防御能試験
【０１２７】
４．２．１．ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ及びＣＯＬ ＭＲＳＡ株に対する致死量及び亜致死量の決定：
【０１２８】
これらの分析は、用いた２つのモデル、すなわち、亜致死量による腎臓感染の定量化と、動物の約５０％を殺すことができる（ＬＤ５０）より大きな細菌接種材料を全身感染させた後の生存試験とにおいて、インビトロでの防御能を評価するために必要であった。投与が容易で目減りしないことから、腹腔内経路を選択した。リード−ミュンヒ（Reed-Muench）法を適用し、各条件（細菌濃度を増加させた感染用量）につき２匹の動物を用いて分析を行ってＬＤ５０及び亜致死量を決定し、黄色ブドウ球菌の平均致死量が分かった時点で３つの異なる用量を試験した。この病原体の試験には、ゲノムの配列を決定した最初のＭＲＳＡクローンであるＣＯＬ ＭＲＳＡ株を基準株として用いる。しかし、これは、他のＭＲＳＡクローンと比べて、病原性がほとんどなく、動物を感染させるためにより高用量を必要としたので、防御能分析には用いなかった。
【０１２９】
４．２．２．亜致死量で全身感染させた後の腎臓防御能分析
【０１３０】
これらの分析は、感染後の腎臓感染の定量化モデルを用いて、抗体が全身感染後に生命維持に必要な器官（腎臓）における細菌の存在を減少させる能力を評価する。病原性がありかつ異なる遺伝的背景を持つＭＲＳＡ株を用いて行った３つの独立した実験において、減少はｌｏｇ３（１０００倍）を超えた。これらの試験では、動物は以前に用量５００μｇの抗体を投与されていた。ＣＡ−ＭＲＳＡ株を用いた試験では、より低用量（２５０μｇ）の抗体によって与えられる防御能を評価した。細菌の減少が観察されたが、用量５００μｇで得られたものより少なかった。結果を図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃに示す。
【０１３１】
図６Ａは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡ ＣＥＢ株を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。横縞模様の棒グラフ：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。市松模様の棒グラフ：抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。細菌の定量：対照：Ｃ１：２０００個の細菌；Ｃ２：２９，０００個の細菌；Ｃ３：２２０，０００個の細菌；Ｃ４：５２，０００個の細菌（７５，７５０個の細菌の平均）。処理（感染防御）動物：Ｐ１：２０個の細菌；Ｐ２、Ｐ３及びＰ４：１０個の細菌（１２．５個の細菌の平均）。非処理動物と比較して処理動物から回収した細菌の量の減少：６０６０倍。
【０１３２】
図６Ｂは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のイベリア型ＭＲＳＡ株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。横縞模様の棒グラフ：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。大きな市松模様の棒グラフ：抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。小さな市松模様の棒グラフは、それぞれの得られた平均を示している。細菌の定量：対照：Ｃ１：２１０，０００個の細菌；Ｃ２：４４，０００個の細菌；Ｃ３：３００，０００個の細菌；Ｃ４：２９０，０００個の細菌（２１１，０００個の細菌の平均）。処理（感染防御）動物：Ｐ１：８０個の細菌；Ｐ２：２００個の細菌；Ｐ３：１０個の細菌；Ｐ４：６０個の細菌（８７．５個の細菌の平均）。非処理動物と比較して処理動物から回収した細菌の量の減少：２４２０倍。
【０１３３】
図６Ｃは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ株（ブラジル市中獲得型株）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。最初の５つの棒グラフ（ｘｘ模様、横縞模様及び大きな市松模様のグラフ）：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。最初の棒グラフ（ｘｘ模様）：安楽死前に死亡した動物に対する推定。棒グラフ６、７、８、９（横縞模様及び市松模様）：２５０μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。棒グラフ１０、１１、１２、１３（三角形模様）：５００μｇの抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。市松模様の棒グラフ（５、９、１３番目の棒グラフ）は、それぞれの得られた平均を示している。細菌の定量：対照：Ｃ１：６５０，０００個の細菌；Ｃ２：２６，０００個の細菌；Ｃ３：１７，０００個の細菌；Ｃ４：５００，０００個の細菌（死亡した動物に対する推定）（２３１，０００個の細菌の平均）。２５０μｇの抗体で処理した動物：Ｐ１：０；Ｐ２：５，４００個の細菌；Ｐ３：８３０個の細菌；Ｐ４：１０個の細菌（１，５６０個の細菌の平均）。５００μｇの抗体で処理した動物：Ｐ１：８０；Ｐ２：０；Ｐ３：２１０；Ｐ４：８０個の細菌（９２．５の平均），非処理動物と比較して２５０μｇの抗体で処理した動物から回収した細菌の量の減少：１４９倍。５００μｇの抗体で処理した場合：２４９７倍。
【０１３４】
４．２．３．生存試験
【０１３５】
この種の試験において、動物のうち５０％またはそれ以上を殺すことができる細菌負荷（ＬＤ５０）で感染させた後に抗体によって動物に与えられる防御を評価した。腎臓感染の定量化分析で用いた３つの株に対する防御を評価した。３つの独立した実験において、抗ＭＲＳＡモノクローナル抗体で処理した動物の（ｉ）生存時間及び（ｉｉ）生存率の著しい減少が観察された。
【０１３６】
ＣＥＢ ＭＲＳＡ株を用いた分析では、感染動物の生存率が対照群（非処理）で１０％しかなかったのに対して、処理動物で７０％であった。イベリア型ＭＲＳＡ株を用いた分析でも同様の結果が得られ、対照群が１００％死亡したのに対して、処理動物の防御は６０％であった。ＣＡ ＭＲＳＡ株を用いた分析では、対照動物で７０％であったのに対して、１００％の防御が見られた。これらの結果を図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示す。
【０１３７】
図７Ａは、２．３×１０８個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）（ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１３８】
図７Ｂは、４．２×１０８個の細菌（イベリア型ＭＲＳＡ）（〜ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１３９】
図７Ｃは、１．１×１０９個の細菌（ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ）（〜ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１４０】
４．２．４．モノクローナル抗体及びバンコマイシンによってそれぞれ与えられる防御能の比較試験
【０１４１】
バンコマイシンは、重度のＭＲＳＡ感染の治療のための第一選択抗菌薬であるので、前のものとは異なるモデルにおいて防御能の比較試験を行った。この試験では、動物を感染させ、感染のわずか４時間後に抗菌薬またはモノクローナル抗体の投与を開始した。３つの別個の群、すなわち、バンコマイシンで処理した群、モノクローナル抗体で処理した群及び抗菌薬＋抗体の同時投与群を用いて試験を行った。バンコマイシンの投与量を、ヒトに感染させた場合（１２時間毎に５００ｍｇ）と同じように調製した。
【０１４２】
その結果、感染から３日後に抗菌薬または抗体で処理した動物の腎臓に存在する細菌の量が約１５倍減少したことが分かった。しかし、抗菌薬及び抗体で処理した群においては、４，６１７倍の減少が見られた。
【０１４３】
これらの結果に基づき、本願出願人は、抗体１用量によって与えられる防御能がバンコマイシン５用量に相当し、感染動物の腎臓に観察される細菌負荷の減少にバンコマイシン及び抗体の同時投与が非常に効果的であったと結論することができる。単独及びバンコマイシンとの組合せによる抗ＭＲＳＡモノクローナル抗体の感染防御作用をより良好に観察するために、感染用量を減らしてこの試験を繰り返した（図８を参照）。
【０１４４】
より低い感染用量で第２の試験を行った後、その結果によって最初の結果を確認した。モノクローナル抗体処理によって与えられる防御能は８９倍の減少をもたらし、これは５用量バンコマイシン処理により得られる防御能（３５倍の減少）よりも高かった。しかし、最も顕著な減少の結果は、抗体＋バンコマイシンで処理した群で見られ、４５０倍の減少であった。
【０１４５】
図８Ａは、６．０×１０７個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体、バンコマイシン及び抗体＋バンコマイシンの組合せで処理した動物、並びに非処理動物の腎臓における細菌の定量を示している。感染から４時間後に処理を開始した。バンコマイシンを１２時間毎に投与した（５用量）。棒グラフ１、２、３、４、５（横縞模様）：非処理動物（対照）から回収した細菌の濃度の対数。Ｃ１：７，０００，０００；Ｃ２：２９５，０００；Ｃ３：３８０，０００；Ｃ４：３，２００，０００（平均：２，７１８，７５０個の細菌）。棒グラフ６、７、８、９、１０（市松模様）：４００μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。Ｐ１：４，２００；Ｐ２：３１０，０００；Ｐ３：３３０，０００；Ｐ４：９０，０００（１８３，５５０個の細菌の平均）。棒グラフ１１、１２、１３、１４、１５（水玉模様）：バンコマイシンで処理した動物。Ｐ１：１１０，０００；Ｐ２：５８，０００；Ｐ３：５００，０００；Ｐ４：２１，０００（１７２，２５０個の細菌の平均）。棒グラフ１６、１７、１８、１９、２９０（三角形模様）：抗体（３００μｇ）＋バンコマイシンで処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。Ｐ１：１，１００；Ｐ２：７００；Ｐ３：４５０；Ｐ４：９０（５８５個の細菌の平均）。
【０１４６】
図８Ｂは、７．０×１０６個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体（棒グラフ７〜１２）、バンコマイシン（棒グラフ１３〜１８）、抗体＋バンコマイシンの組合せ（１９〜２４）で処理した動物及び非処理動物（棒グラフ１〜６）の腎臓における細菌の定量を示している。感染から４時間後に処理を開始した。バンコマイシンを１２時間毎に投与した（５用量）。棒グラフ１〜６：非処理動物(対照）から回収した細菌の濃度の対数。Ｃ１：６，０００；Ｃ２：１，０００；Ｃ３：５００；Ｃ４：１１８，０００；Ｃ５：１，０００（平均：２５，２２０個の細菌）。棒グラフ７〜１２：５００μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。ＭＢ１：４５０；ＭＢ２：２００；ＭＢ３：１００；ＭＢ４：２０；ＭＢ５：０（２８４個の細菌の平均）。棒グラフ１３〜１８：バンコマイシンで処理した動物。ＶＣ１：１００；ＶＣ２：７００；ＶＣ３：０；ＶＣ４：０；ＶＣ５：２８００（７２０個の細菌の平均）。棒グラフ１９〜２４：抗体（５００μｇ）＋バンコマイシンで処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。ＭＢＶ１：１３０；ＭＢＶ２：２０；ＭＢＶ３：１０；ＭＢＶ４：８０；ＭＢＶ５：２０（５６個の細菌の平均）。
【０１４７】
５．結合分析
【０１４８】
モノクローナル抗体（クローン１０及び３８）の結合試験の結果：
【０１４９】
尿素プロトコル結合：
クローン１０：１．０３／１．４６（処理／非処理のＤＯの読み）＝７０．５％
クローン３８：１．００／１．２１＝８２．６％
チオシアン酸アンモニウムプロトコル結合：
クローン１０（ＤＯ）：
対照：１．１２
チオシアン酸塩で処理したサンプル：
２Ｍ＝０．０４６；１．５Ｍ＝０，０４７；１Ｍ＝０．１０７；０．７５Ｍ＝０．４８３；０．５Ｍ＝０．６０２；０．３７５Ｍ＝０．６８４
結合率：２．４７
クローン３８（ＤＯ）：
対照：１．２２
チオシアン酸塩で処理したサンプル：
２Ｍ＝０．０５６；１．５Ｍ＝０．０６２；１Ｍ＝０．１２９；０．７５Ｍ＝０．６４８；０．５Ｍ＝０．７５８；０．３７５Ｍ＝０．７９３
結合率：４．４０
【０１５０】
両実験において、クローン１０の結合率よりもクローン３８の結合率の方が高かったことが分かる。さらに、２つのプロトコルを用いて約１．０のＤＯに達するためには、抗体クローン３８の５０倍超のクローン１０が必要であることが分かった。
【０１５１】
６．表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるモノクローナル抗体（クローン１０及び３８）の結合定数及び解離定数の決定
【０１５２】
ＳＰＲ法によって得られた予備結果により抗体の結合が確認された。この場合もやはり、クローン１０よりもクローン３８の方が良好な結果を示した。表２のデータによれば、クローン３８は、クローン１０よりも４５０倍高い親和性を有することが分かる。
【０１５３】
この親和性は、主として、クローン１０よりも約１００倍高い結合率に起因する。クローン３８の親和性は非常に高いので、測定は器材の検知閾値に近いパラメータを示す。しかし、試験の計画及び実行を慎重にすることで、実験データはラングミュアのモデルによく合っていた。このことは、得られたデータが信頼できることを示している。
【０１５４】
図９は、組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン３８（図９Ａ）／クローン１０（図９Ｂ）との相互作用を示している。煙のような線の曲線は、その右側の凡例に従う濃度のＳＰＲデータを示している。全てのサンプルを２回解析した。各曲線に対するラングミュア１対１の理論モデルをで各曲線の下に黒で示す。縦軸は反応単位、横軸は時間を秒単位で示している。横軸に最も近い線は、各サンプルに対する基線（陰性対照）を表している。
【０１５５】
表２
【０１５６】
抗原（ＰＢＰ２ａ）とモノクローナル抗体（クローン１０及び３８）との間の解離定数及び相互作用定数。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
７．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の同定
【０１５９】
用いられる抗体を産生するクローン（クローン３８）のハイブリドーマ細胞においてｍＲＮＡ抽出手順を行った後、ｃＤＮＡを得て、この材料を用いて異なる軽鎖及び重鎖対立遺伝子についてＰＣＲ反応を行った。得られた材料を、ＰＣＲ反応で用いたのと同じプライマー配列（配列番号１８ないし配列番号３９によって画定される）を用いてシークエンシングを行った。３つの異なるシークエンシングにおいて軽鎖３９１及び重鎖３１０を同定した。カバット（Kabat）及びチョーティア（Chotia）のアルゴリズムを適用して、軽鎖及び重鎖のＣＤＲの同定に至った。これらは、添付の特許請求の範囲の対象である。
【０１６０】
軽鎖及び重鎖ＣＤＲの配列を以下に示す。
配列番号６−ＣＤＲ１軽鎖アミノ酸。
RSSQSIGHSNGNTYLE
配列番号７−ＣＤＲ２軽鎖アミノ酸。
KVSNRFS
配列番号８−ＣＤＲ３軽鎖アミノ酸。
FQGSYVPLT
配列番号９−ＣＤＲ１軽鎖ＤＮＡ。
cgcagcagccagagcattggccatagcaacggcaacacctatctggaa
配列番号１０−ＣＤＲ２軽鎖ＤＮＡ。
aaagtgagcaaccgctttagc
配列番号１１−ＣＤＲ３軽鎖ＤＮＡ。
tttcagggcagctatgtgccgctgacc
配列番号１２−ＣＤＲ１重鎖アミノ酸。
GFSITSSSSCWH
配列番号１３−ＣＤＲ２重鎖アミノ酸。
RICYEGSISYSPSLKS
配列番号１４−ＣＤＲ３重鎖アミノ酸。
ENHDWFFDV
配列番号１５−ＣＤＲ１重鎖ＤＮＡ。
ggctttagcattaccagcagcagcagctgctggcat
配列番号１６−ＣＤＲ２重鎖ＤＮＡ。
cgcatttgctatgaaggcagcattagctatagcccgagcctgaaaagc
配列番号１７−ＣＤＲ３重鎖ＤＮＡ。
gaaaaccatgattggttttttgatgtg
【０１６１】
補完的データ
【０１６２】
本発明をさらに発展させるために、他の分析を行った。そのほとんどを以下に実例を挙げて示す。
【０１６３】
例３
【０１６４】
ＣＥＢ ＭＲＳＡ株を用い、例１の７．２で説明したのと同じプロトコルに従い、さらには黄色ブドウ球菌凝集体を脱凝集させかつ抗体に曝露されるＰＢＰ２ａの量を増加させることを目標として各洗浄の間に渦撹拌の２つの１５秒のパルスを加えて、第２の試験を行った。
【０１６５】
標識物質ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及びＰＥ（フィコエリトリン）を試験し、対照サンプル（ｉ．モノクローナル抗体との接触のない純粋細菌及び、ｉｉ．純粋細菌＋標識物質ＦＩＴＣまたはＰＥ）と、モノクローナル抗体で処理しかつＰＥまたはＦＩＴＣで標識されたサンプルの解析を行った。FACScalibur装置の読みはリニアモードで行った。
【０１６６】
図１０は、ＦＩＴＣで標識された抗ＰＢＰ２ａ抗体の存在下でのＭＲＳＡサンプルのフローサイトメトリーによる解析のグラフである。曲線（ｘ）は標識されていないサンプルに対応し、曲線（ｙ）は標識されたサンプルに対応する。
【０１６７】
その結果、標識された集団の約２２％が装置によって検出されることが分かり、抗ＰＢＰ２ａ抗体は細菌表面上に存在する標的（ＰＢＰ２ａ）を認識することが確認された（図１０）。
【０１６８】
例４
【０１６９】
発明者はさらに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌由来の抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体によって与えられる、エンテロコッカスに対する防御を調べた。前述のように、この抗体は、エンテロコッカス属種株に存在するタンパク質（恐らく、ペプチド転移酵素であり、全てのエンテロコッカス株に存在し、βラクタム系抗菌薬に対する親和性が低く、分子量が約７６ｋＤａ（２３７アミノ酸）であるＰＢＰ５）を認識する。この酵素は、以下に示す配列比較（ClustalW）によれば、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する相同性を示す。
【０１７０】
【表４】
【０１７１】
配列比較は、ＰＢＰ５エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｆａｓ）及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｆａｍ）並びにＭＲＳＡのＰＢＰ２ａにそれぞれ対応する配列について行った。マーキングした配列（太字−ＰＢＰ５；下線−ＰＢＰ２ａ）は、モノクローナル抗体を作製するために用いたＰＢＰ２ａ領域に対応している。イタリック体で示しているのは、酵素活性コアに対応するアミノ酸である。
【０１７２】
このようにして、ＭＲＳＡに関して既に行ったように、マウスモデル（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）におけるインビトロ防御能試験、致死量及びＬＤ５０の決定、及びインビボ試験（亜致死量での腎臓感染の定量化及び致死量での生存試験）をエンテロコッカス株を用いて行った。これらの結果を対応する報告に示す。
【０１７３】
１．１．インビトロ防御能試験
【０１７４】
この試験の目的は、ＶＲＥエンテロコッカス株に対する抗体によって与えられるインビトロでの防御能の評価であった。
【０１７５】
リシェ研究所（laboratorio Richet）のエンテロコッカス・フェカリスの臨床株（ＶＲＥ）に対する精製モノクローナル抗体クローン３８（９０／ＤＡ５／ＣＢ５／ＡＡ３ ｈｉｂ７７）のインビトロ防御能試験（ＭＩＣ）。
【０１７６】
条件：
サンプル：SelecSure MAB樹脂を用いたＨＰＬＣにより上清から精製し、透析し、凍結乾燥させた。
抗体定量化（ローリー法）：３．５ｍｇ／ｍＬ
接種材料：ＶＲＥ株
前接種材料：バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬのＬＢ培地にＶＲＥ１コロニーを接種、静止期（ＯＮ）に３７℃で成長させ、１６０ｒｐｍで遠心分離
接種材料：２０ｍＬのＬＢ培地に４００ｍＬの前接種材料、２００ｍＬの三角フラスコ、３７℃、１６０ｒｐｍ
７時間後のＤＯ６００ｎｍの読み：０．７
定量化：５．５×１０８個の細菌／ｍＬ
試験条件：
接種材料：５．５×１０５個の細菌
抗体濃度：３００、４００、５００、６００及び７００ｍｇの抗体
培地：１ｍＬのルリア培地
細胞培養プレート，２４ウェル
陽性対照：ルリア培地＋細菌接種材料
陰性対照：ルリア培地
培養：１８時間、３７℃
【０１７７】
図１１は、抗体によって与えられた防御の評価の結果を示している。図１１では、
Ａ．３００ｍｇの抗体
Ｂ．４００ｍｇの抗体
Ｃ．５００ｍｇの抗体
Ｄ．６００ｍｇの抗体
Ｅ．陰性対照
Ｆ．陽性対照
Ｇ．７００ｍｇの抗体
を有する。
【０１７８】
１．２．腹腔内経路によるＬＤ５０及び致死量の決定−バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム
【０１７９】
プロトコル：
メスの７週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，平均体重２０ｇ
１日目−前接種材料：バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１０ｍＬのＬＢ培地にＶＲＥ株１コロニーを接種、５０ｍＬのファルコン（Falkow）チューブ、静止期（ＯＮ）に３７℃で成長させ、１６０ｒｐｍで遠心分離
２日目−接種材料：５０ｍＬのＬＢ培地／バンコマイシン（２５０ｍＬの三角フラスコ）に１ｍＬの前接種材料−４バイアル、３７℃、１６０ｒｐｍ、ＤＯ６００ｎｍ＝０．８０まで成長させ、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁、ＯＤ１．２
定量化：２．１×１０８個の細菌／ｍＬ
Ａ．６０μＬ（１．５×１０７）
Ｂ．３００μＬ（６．５×１０７）
Ｃ．９００μＬ（３００μＬ／用量まで減少）（１．５×１０８）
Ｄ．４．５ｍＬ（３００μＬ／用量まで減少）（６．５×１０８）
Ｅ．９．０ｍＬ（１．２×１０９個の細菌）（３００μＬ／用量まで減少）
Ｆ．４５．０ｍＬ（６．５×１０９個の細菌）（３００μＬ／用量まで減少）
【０１８０】
分析の２日目から１０日目に動物の観察を行った。
【０１８１】
結果を図１２に示す。致死量は１．２×１０９細菌であり、ＬＤ５０は６．５×１０８細菌であると結論される。
【０１８２】
７日目に生存している動物の腎臓感染の定量化：
Ａ（１．５×１０７）：細菌増殖なし
Ｂ（６．５×１０７）：細菌増殖なし
Ｃ（１．５×１０８）：３１００個の細菌
Ｄ（６．５×１０８）：２．８×１０４個の細菌
【０１８３】
１．３．インビトロ防御能試験−生存試験−マウスモデルにおける腹腔内経路による全身感染の致死量
【０１８４】
この試験の目的は、致死量のエンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）株の全身感染に対する抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体のインビトロでの防御能の有効性を評価することであった。
【０１８５】
１．抗体（血清入り培地で培養した細胞培養液の上清から精製したもの）
−サンプルを精製（HPLC SelecSure MAB）し、透析し、凍結乾燥させ、再懸濁し、使用前にろ過した。
−定量化（ローリー法）：１．０ｍｇ／ｍＬ
２．マウスモデル：メスの８週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，体重２３〜２５ｇ
３．プロトコル：
Ａ群（６匹の動物）：６５０ｍｇの抗体（３５０ｍｇ＋３００ｍｇ）
Ｂ群（６匹の動物）：対照（生理食塩水投与）
４．細菌接種材料の調製：
ＶＲＥ株：
前接種材料，１日目，バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１０ｍＬのＢＨＩ培地、静止期（ＯＮ）、３７℃、１６０ｒｐｍ
接種材料，３日目：バンコマイシンを添加した３０ｍＬのＢＨＩ培地に３００ｍＬの前接種材料を接種、ＤＯ６００は１．３１、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．５倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁し、ＯＤ＝１．１０に調整し、希釈し、プレーティングして定量化（２．０×１０８個の細菌／ｍＬ）；接種材料：１２ｍＬ，遠心して３００ｍＬ中で再懸濁，ＩＰ経路（〜２．２×１０９個の細菌）
タイムスケジュール：
１日目：抗体（３５０ｍｇ）のＩＰ接種
２日目：抗体（３００ｍｇ）のＩＰ接種、午後に全身感染（ＩＰ，２５０ｍＬの細菌溶液−２．２×１０９個の細菌）
２日目から１３日目：動物の観察。
【０１８６】
結果を図１３に示す。処理動物は２匹しか死亡しなかった（防御の６６．６％）。２日目に全ての対照動物が死亡した。
【０１８７】
１．４．インビトロでの防御能試験−マウスモデルにおける腹腔内経路によるバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウムの全身感染
【０１８８】
目的は、エンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）株の全身感染に対する腸球菌由来の抗ＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５モノクローナル抗体のインビトロでの防御能の有効性を評価することであった。
【０１８９】
試験：
１．抗体（血清入り培地で培養した細胞培養液の上清から精製したもの）
−サンプルを精製し（AffiPrep Protein A Biorad/HPLC SelecSure MAB）、透析し、凍結乾燥し、再懸濁した。
−定量化（ローリー法）：１．５ｍｇ／ｍＬ
２．マウスモデル：メスの８週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，体重１９〜２３ｇ
３．プロトコル：
Ａ群（４匹の動物）：５００μｇの抗体（２ヶ月間，ｄ０１，ｄ０２）
Ｂ群（４匹の動物）：非感染防御対照
４．細菌接種材料の調製：
イベリア型ＭＲＳＡ株：
前接種材料，１０ｍＬのＬＢ培地、静止期（ＯＮ）、３７℃、１２０ｒｐｍ
接種材料：２０ｍＬのＬＢ培地に２００μＬの前接種材料、ＤＯ６００は０．８０、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．５倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁し、ＯＤ＝０．５１に調整し、希釈し、プレーティングして定量化（２．４×１０８個の細菌／ｍＬ）；接種材料：５００μＬ，ＩＰ経路（２．４×１０８個の細菌）
タイムスケジュール：
１日目：腹腔内経路による２５０μｇの抗体の接種
２日目：腹腔内経路による２５０μｇの抗体の接種及び全身感染（腹腔内，５００μＬの細菌溶液）
６日目：安楽死、腎臓内の細菌の定量
【０１９０】
上記の結果に基づき、以下のことを強調することができる。
【０１９１】
インビトロ防御能試験−最小阻止濃度の決定：
合計７００μｇの抗体は、５５０，０００個の細菌の成長を阻止することができる。これらの値は、ＭＲＳＡ株に対して得られたＭＩＣ（約５００μｇであった）よりも高い。
【０１９２】
インビトロ防御能試験：
インビトロ防御能試験−マウスモデルにおける腹腔内経路による亜致死量のバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム全身感染
【０１９３】
動物に５００μｇのモノクローナル抗体を腹腔内経路（ＩＰ）により投与し、２．４×１０８個の細菌をＩＰ経路により全身感染させた。４日後、安楽死させて腎臓を切除し、細菌を定量した。処理動物は平均８７．５個の細菌／動物を示したが、対照（感染させたが処理していない動物）では平均２１１，０００個の細菌／動物であった。
【０１９４】
致死量投与後の生存試験
【０１９５】
動物に６５０μｇのモノクローナル抗体を投与し（ＩＰ経路）、全身感染させ（ＩＰ経路）、１０日間にわたって毎日観察した。対照（非処理）動物は感染後２日目までに死亡した；処理動物（６）のうち２匹が２日目に死亡し、残りは試験終了まで生存し続けた。生存率は６６．６％であった。
【０１９６】
従って、ここでもやはり、ＭＲＳＡ抗ＰＢＰａモノクローナル抗体が腸球菌に対する交叉防御能を与えることが示されることが確認された。しかし、防御能を与えるために必要な用量は、同様の条件下でＭＲＳＡに対して用いた用量よりも高かった。これはおそらく、抗体が、発現されたＰＢＰ２ａと同じ有効性をもってＰＢＰ５を認識する能力が低いためである。
【０１９７】
従って、本明細書で説明した発明、すなわちＰＢＰ２ａ及び相同配列と特異的に結合することができる抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体は、タンパク質または類似の物質（ＭＲＳＡ、ＭＲＳＥ及びエンテロコッカス属種、並びにＰＢＰ２ａに相同なタンパク質を有する任意の他の病原体）を有する細菌による感染に有用である。
【０１９８】
これらの感染が世界的な問題となり、既知の大規模流行ＭＲＳＡクローンに対する分析が行われたら、本発明の産物は、そのような病原体による感染が起きているあらゆる場所において適用可能である。
【０１９９】
発明者の最新の知識に照らして、本明細書で引用した文献を以下に示す。
【０２００】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ、エンテロコッカス属種などの病原菌から産生されたＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
また、本発明は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性を検出するための相補的な免疫学的診断における、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）によって引き起こされた感染症は、臨床医にとって大きな関心事であり、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（1）によって引き起こされた感染症よりも高い罹患率及び死亡率を示す。さらに、ＭＲＳＡによる感染症は入院期間が長くなり抗菌剤の費用も嵩むので、ＭＲＳＡに感染した患者の治療コストは高くなる（1）。
【０００４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症の治療のために最初に選択された抗菌剤はバンコマイシンであった。しかし、米国及びオーストラリアの社会におけるＭＲＳＡ株の分離の増加は、日本、米国（5）及びブラジル（6）においてバンコマイシンに対して中程度の耐性を有するＭＲＳＡ株が確認されたことと共に、現在の状況をより厳しいものにしている。２００４年になされた、バンコマイシンに対して完全に耐性を有するＭＲＳＡ株についての報告（7）は、医療・化学の分野に深刻な懸念を引き起こした。ＭＲＳＡは、現在入手可能な全ての薬剤に対して耐性を有する病原菌である、恐ろしい「スーパーバグまたはスーパー細菌」となる強力な候補となっている。
【０００５】
通常、院内感染におけるＭＲＳＡ罹患率（ＭＲＳＡによって引き起こされた全ての感染症の割合）は、この１０年間では漸増傾向にある。Jarvis他によって行われた研究では、米国の３３７の病院の１２６８のＩＣＵ（集中治療室）におけるＩＣＵ内でのＭＲＳＡによる感染症の症例数は６６０から２１８４へ増加し、罹患率は３５％から６４．４５へ増加している（8）。日本では、ＭＲＳＡによって引き起こされた院内感染（ＨＩ）の罹患率は、６０〜９０％の深刻な値を示している（9）。米国で行われた研究では、ＭＲＳＡによる院内感染（ＨＩ）の罹患率は、１９７４年には２％だったのが１９９７年には５０％となり（10, 11）、米国の一部の病院では、ＨＩの８０％以上がＭＲＳＡによって引き起こされている（12）。英国では、ＭＲＳＡによる院内感染の罹患率は、１９８９年から１９９５年にかけて１．５５から１５．２％へ増加しており、現在（２００４）では４１．５％と推定される（13）。
【０００６】
高い罹患率に加えて、特に教育実習病院及び大型病院では、ＭＲＳＡは主要な病原菌起因の伝染病と見なされており、ブラジルの病院でアウトブレイクしている（14）。１９８６年には、サンパウロの大学病院で患者から分離された病院起源の黄色ブドウ球菌株の５０％以上がメチシリンに対して耐性を有しており、１９９３には、パウリスタ大学医学部（Paulista Medicine School）の小児科病院でのＭＲＳＡの発症率は７０％であった（15）。Resende他によってベロオリゾンテ（Belo Horizonte）の病院で行われた研究（16）では、ＭＲＳＡの罹患率が７１％であることが指摘されている。
【０００７】
ＭＲＳＡ株は、例えばＰＢＰ２ａなどのβラクタムクラスの抗菌剤に対する親和性が非常に低いペニシリン結合タンパク質を産出する（17）。遺伝子ｍｅｃＡによりコード化されたこの酵素の存在下では、βラクタム系抗菌薬が存在していても、細菌はペプチドグリカンを合成することができる。前記酵素は、イヌの正常フローラに存在する細菌であるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・シウリにも見ることができる。院内ＭＲＳＡ株は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性に加えて、第１の選択治療として依然としてグリコペプチド（バンコマイシン、テイコプラニン）が使用される他の利用可能な抗菌剤クラスの大部分に対して耐性を示す。
【０００８】
ＰＢＰ２ａに対してＤＮＡワクチン使用した２つの研究によれば、このタンパク質は免疫原性であり、得られた免疫応答は、マウスモデルで実施した分析では、ＭＲＳＡに対する防御能を与えることができることが報告されている（18, 19）。しかし、院内感染では、患者の大部分は、免疫抑制されていることが知られている（20）。この場合、細菌感染の制御時間に起因して、ワクチンは防御抗体を生成することができない。
【０００９】
ＰＢＰ２ａ免疫原性
【００１０】
GoffinとGhuysenの分類によれば、ＰＢＰ２ａはクラスＩＩマルチモジュラー酵素である（40）。７６キロダルトンのこの酵素は、膜結合領域と、非ペプチド転移酵素領域と、ペプチド転移酵素領域とから構成され、細菌性ペプチド転移反応に関与する４−アミノ酸活性コア（ＳＴＱＫ）を含んでいる（20 bis Ryfell, 1990）。
【００１１】
ＰＢＰ２ａに対するＤＮＡワクチンについての最新の研究では、Ohwada他の研究では３〜４回、Senna他の研究では１０００回全身感染させて免疫を与えた動物において細菌が減少することが報告されている（腎臓能の定量化）。上記の研究の著者は、遺伝子mecAの全配列（膜固定領域を除く）とペプチド転移酵素領域の内部フラグメントをそれぞれ使用した。
【００１２】
しかし、上述の方法では、ワクチンは、細菌感染の制御時間に起因して、防御抗体を生成することができない。従って、ＭＲＳＡによる感染の場合は、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の投与が、前記感染を治療するための最も適切な治療である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 1999/041285 A1号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の主な目的は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・シウリ、エンテロコッカス属種などの病原菌から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質（配列番号１）またはＰＢＰ２ａに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、βラクタム系抗菌薬に対する耐性を検出するための相補的な免疫学的診断における、ＰＢＰ２ａまたはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の使用である。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７の配列で表される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗ＰＢＰ２ａ抗体を産生するための免疫動物の血清の免疫酵素試験（ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図２】生サンプル及び精製後サンプルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示す。
【図３】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含む上清に対するＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ溶解物の免疫ブロッティング試験を示す。
【図４】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で培養し、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＭＲＳＡ（ＣＥＢ）及びＭＳＳＡ細菌のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図５】異なるＭＲＳＡ株の接種材料に対する、抗ＰＢＰ２ａ精製モノクローナル抗体及びバンコマイシンによって与えられたインビトロでの防御能試験（ＭＩＣ−最小阻止濃度）を示す。
【図６Ａ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡ ＣＥＢ株を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図６Ｂ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡイベリア型株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図６Ｃ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ株（ブラジル市中獲得型株）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【図７Ａ】致死量の細菌（ＭＲＳＡ ＣＥＢ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図７Ｂ】致死量の細菌（イベリア型ＭＲＳＡ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図７Ｃ】致死量の細菌（ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ）に感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示す。
【図８Ａ】細菌（ＭＲＳＡ ＣＥＢ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体、バンコマイシン及び、抗体＋バンコマイシンの組合せで処理した動物及び非処理動物の腎臓における細菌の定量を示す。
【図８Ｂ】抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物の腎臓における細菌の定量を示す。
【図９Ａ】組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン３８との相互作用を示す。
【図９Ｂ】組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン１０との相互作用を示す。
【図１０】ＦＩＴＣで標識された抗ＰＢＰ２ａ抗体の存在下でのＭＲＳＡサンプルのフローサイトメトリーによる第２の解析のグラフである。
【図１１】ＶＲＥエンテロコッカス株に対する、抗体によって与えられたインビトロ防御能の結果を示す。
【図１２】腹腔内感染を決定するためのＬＤ５０及び致死量を示す。
【図１３】全身感染に対する、腸球菌由来の抗ＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５モノクローナル抗体のインビトロ防御能の有効性結果を示す。
【図１４】ＭＲＳＡイベリア型株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
抗菌剤に対する多耐性を有する細菌による感染症の発生は、驚くべき増加を示している。ＭＲＳＡによって引き起こされた院内感染の罹患率は世界中で増加しており、高い死亡率を示し、抗菌剤の集中的な使用及び患者の長期間の入院に起因して高いコストを生じさせている（24）。新規な有効な薬剤が市場にほとんど現れないことにより、化学療法に基づく治療はすでに限界に達している（25）。
【００１９】
これに関連して、有望な代替案と思われる受動免疫療法は、従来の化学療法と比較して様々な有利な特徴を有する：とりわけ、低い毒性、長い血漿半減期（このことにより投与量が減少するので治療が容易になり、最終的な治療コストも低くなる）、及び、特に本発明のモノクローナル抗体は、Paul Ehrlichにより推奨されている選択的毒性（薬物が関連する病原菌を選択的に除去する）という有利な特徴を有する（25a）。この最後の特徴は、多耐性細菌の出現をもたらす、広域スペクトル抗菌剤により果たされるいわゆる選択圧力を防止するのに大変役立つ（26）。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を開発するために、本願発明者は、マウスモデルにＤＮＡワクチンを用いた予備研究（18、19、20）及び免疫構造分子分析（immunostructural molecule analyses）に基づいて、標的としてＰＢＰ２ａを選択した。ＰＢＰ２ａの構造は２００２年に解明されており（29）、ＰＤＢ（タンパク質 Data Bank）にlwmrのコードで保存されている。
【００２１】
他のアプローチとは異なり、本願発明者は、ペプチド転移酵素ドメインにおいて酵素活性コア（ＳｘｘＫ）の側面に位置する、７６アミノ酸を有する分子の内部領域について研究した。エピトープ同定解析分析を前記分子及び別のクラスＩＩＣＨＭアレル（Tepitopeプログラム）に対するそれらの提示について行い、その後、前記分子でのそれらの位置を確認した（SPDB-Viewerプログラム）。このアプローチは、抗体が、天然分子の標的にアクセスする能力を評価することを可能にする。
【００２２】
このコンピュータ分析の結果は、酵素活性コアの近傍に位置し、クラスＩＩＣＨＭアレルによる優れた認識度を有し、かつＰＢＰ２ａの表面に位置するエピトープの存在を示す（データは示さない）。
【００２３】
これらのコンピュータによるシミュレーションは、標的認識試験（免疫ブロッティング、フローサイトメトリー）の実施により確認され、ＰＢＰ２ａ領域に対する抗体結合は、高い防御能を与えることが可能であることを示し、インビトロ及びインビボ試験の実施によって得られた結果により実証された。前記抗体は７６個のアミノ酸断片から作製されており、Ohwada及びSennaの研究によって前に示されたような、完全ＰＢＰ２ａによる免疫付与により作製された抗体よりも高い防御能を与えることが示され、本願発明者からの結果によって確認された。
【００２４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症の疫学は、全世界の病院におけるアウトブレイク及び流行に関与する優勢クローンタイプの存在を示す。そのようなクローンは、非流行性ＭＲＳＡ株よりも高いコロニー形成能力及び病原性を示す（30）。
【００２５】
得られた結果を実証するために、ＭＲＳＡにより引き起こされたほとんどの感染症（特に病院における感染症）の代表例である、様々なＭＡＳＡクローン（流行型クローン）について研究した。
【００２６】
ＣＥＢ株（ブラジル流行型クローン）は、ブラジルの病院においてＭＡＳＡによって引き起こされたほとんどの感染症に関与しており（31）、南アメリカの他の国々やポルトガル、チェコスロバキアでも確認されている（34）。ヨーロッパ流行型クローン（イベリア型ＭＡＳＡ）がヨーロッパの国々及び米国において発見されている（35）。
【００２７】
ＭＡＳＡによって引き起こされた市中感染症の症例が増加しているため、ブラジルで分離された株（WB79 CA-ＭＲＳＡ）が最近の試験に含められた。これらの試験は、院内ＭＲＳＡ株の特徴とは異なる高い病原性（パントン・バレンタイン・ロイコシジン（Panton-Valentine leukocidin）の存在）及び抗菌剤耐性を有するという、病院で発見されたものとは異なる特徴を示す（36）。近年、男性同性愛者の集団におけるＣＡ−ＭＲＳＡによる感染症のアウトブレイクが米国で確認されている（37）。この時点から、ＭＲＳＡによって引き起こされた感染症は、ＳＴＤ（性感染症）としての面も持つと言える。
【００２８】
抗ＰＢＰ２ａ抗体の投与によって付与された防御能は、様々な被験クローンの全てに対して有効性を示し、あらゆるＭＲＳＡ型によって引き起こされた感染症（市中型または病院型）に対して適用性があることを信じさせる。
【００２９】
本発明のモノクローナル抗体のいくつかの重要な特徴について述べる。
【００３０】
（ｉ）インビトロでの防御結果は、関連する作用機序（分子活性コアに近い領域の遮断）が、細菌の成長及び増殖を阻害するのに十分であることを信じさせる。同様に、βラクラム系抗生物質については、この機序は時間依存性であり、細菌を増加段階にある最近を薬物作用の標的に曝す必要がある。
【００３１】
（ｉｉ）この特徴は、長い血中半減期を示す抗体の薬物速度論的特性によるものである（38）。抗生物質治療と比較して、このことは、より少ない投与回数で患者に対する治療効果を示し、結果として、最終コストがより低くなることを意味する。これらのアイデアは、バンコマイシンを用いた防御能比較分析の実施によって確認された（以下参照）。
【００３２】
（ｉｉｉ）インビトロでの細菌の成長の抑制もまた、本発明の抗体が、オプソニン作用及び補体活性化などの従来の補助的な抗原‐抗体反応機構を必要としないことを意味する。ほとんどの院内感染が免疫抑制状態の患者において発生することを考えると、本発明のモノクローナル抗体の特長は極めて重要である。
【００３３】
（ｉｖ）黄色ブドウ球菌の表面にプロテインＡが存在することが知られている。この分子は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して結合し、免疫システムのオプソニン作用を阻害するという特徴を有する（38）。本願発明者による試験から得られた結果により、投与された抗体集団は、ＰＢＰ２ａ阻害を妨げることなく、細菌表面に存在するプロテインＡを飽和させることができると考えられる。
【００３４】
ＭＲＳＡによって引き起こされた全身感染症は、グリコペプチド、とりわけバンコマイシンを用いて治療されてきた。しかし、前記薬剤は、免疫毒性、聴器毒性、腎毒性及び一過性好中球減少症などの様々な副作用をもたらしたり、長期間の投与を必要としたり、高い最終治療コストをもたらしたりする。
【００３５】
マウス感染モデルを使用することにより、バンコマイシンによる治療、本発明のモノクローナル抗体による治療、及び、バンコマイシンと本発明のモノクローナル抗体の２つの薬剤による治療を互いに比較することが可能となる。得られた結果は、本発明のモノクローナル抗体の１回の投与は、バンコマイシンの５回の投与と同じかまたはそれよりも高い作用を示した。まや、バンコマイシンと本発明のモノクローナル抗体の同時投与は、別々に投与するよりも、殺菌においてより効果的であった。バンコマイシン及び本発明のモノクローナル抗体の投与により、本発明のモノクローナル抗体による治療コストがより低くなったり、または、深刻な状態の患者の回復がより効果的になることが判明したので、これらのデータは非常に重要である。
【００３６】
ＭＲＳＡによる感染症を治療するための抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の使用に加えて、本発明は以下の用途も考慮する。
【００３７】
（ｉ）本発明の抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体による、エンテロコッカス属種株のＰＢＰ５に近い分子量を有するタンパク質の認識結果は、本発明の抗体の投与によって前記病原菌に対する防御応答を得ることが可能であることを示す。ＰＢＰ５はＰＢＰ２ａと相同性を有しており、両方ともβラクタム系抗菌薬に対する親和性が低いクラスＢ多調節ＰＢＰとして分類される（40）。腸球菌は深刻な院内感染を引き起こす細菌であり、高程度の内因性を有し、抗菌剤に対する耐性を獲得する。バンコマイシン耐性株（ＶＲＥ）は、グリコペプチドに対する耐性を有する遺伝子の保有宿主の役割を果たし、他の病原菌へ移動することができる（41）。
【００３８】
（ｉｉ）本発明の抗体は、免疫診断試験によるＰＢＰ２ａ同定に用いることができる。例えば、本発明の抗体に結合したラテックス粒子の凝集に基づく免疫試験を行うことにより、数時間で、全てのβラクラム系抗生物質に対する耐性の予測結果を得ることができる。抗菌剤に対する感受性についての従来の試験（例えば、抗生物質感受性試験）では、結果が出るまでに１２〜２４時間かかった。
【００３９】
（ｉｉｉ）本発明のモノクローナル抗体が、慢性潰瘍に対しての標題の用途に成功的に使用されたら（インフリキシマブ、Streit他の文献及びWO 1999/041285 A1（特許文献１）を参照）、ＭＲＳＡによる鼻腔除菌を促進するために、及び、前記病原体によって引き起こされた皮膚病変を治療するために、本発明のモノクローナル抗体を局所的に投与してもよい。
【００４０】
最先端に見られる問題及び知識に基づいて、本願発明者は、実験動物に対して、遺伝子ｍｅｃＡ（配列番号２）に相当する構造を有するＤＮＡワクチンによる免疫付与を行った。前記免疫付与は、膜固定領域に対しては行わず、酵素活性コアを含んでいるペプチド転移酵素ドメイン（配列番号３）の７６個のアミノ酸を有する内部領域に対して行った。
【００４１】
前記免疫付与は、遺伝子ｍｅｃＡの全配列（膜固定領域を除く）及びペプチド転移酵素ドメインの内部断片を使用して、ＰＢＰ２ａに対するＤＮＡワクチンを開発したOhwada他及びSenna他の研究において示された条件と同一の条件で行われた。免疫付与は４回の投与によって行われ、免疫動物及び非免疫動物対照群をＭＲＳＡによって全身感染させ、２つの特定の時期において、被験動物の腎臓内に存在する細菌数を測定した。得られた結果は、ペプチド転移酵素断片で免疫付与した場合は、遺伝子ｍｅｃＡで免疫付与した場合よりも、被験動物の腎臓内に存在する細菌数が大幅に減少したことを示した。
【００４２】
従って、ペプチド転移酵素断片に対して生成された本発明の抗体は、上記の用いられた状態において（マウスモデルにおけるＤＮＡワクチン）、ＰＢＰ２ａに対する抗体を用いた場合よりも優れた防御能を提供する。前記ペプチド転移酵素断片は、酵素活性コアＳＴＱＫ（配列番号４）を含む。
【００４３】
従って、得られた結果に基づいて、本発明者は、ＰＢＰ２ａタンパク質またはそれに相同な配列を持つ他のタンパク質を認識してそれに結合することができるモノクローナル抗体の作製方法と、前記酵素活性コアを含むペプチド転移酵素断片の使用を提供する。
【００４４】
以下、本発明を実施例を参照して説明するが、これらの実施例は限定的なものとして解釈されるべきではない。
【００４５】
材料及び方法
【００４６】
１．細菌：
【００４７】
次のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株を使用した。イベリア型ＭＲＳＡ、ＣＯＬ−ＭＲＳＡ（パスツール研究所の抗菌剤部門のDr. Patrice Courvalinから譲り受けた）、ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ及びＣＥＢ−ＭＲＳＡ（ＵＦＲＪの微生物学研究所のDr. Agnes Figueiredoから譲り受けた）；バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス株；及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株。大腸菌株、ＢＬ２１ ＤＥ３（Novagen）及びＴＯＰ１０（Invitrogen）を対照として使用した。
【００４８】
２．動物：
【００４９】
CECAL-FIOCRUZから入手してLAEAN-BioManguinhosに収容した４〜８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、免疫付与分析及びインビボ防御能分析に使用した。
【００５０】
３．免疫付与：
【００５１】
まず、マウス（４匹の被験動物）に１００ｍｇのｐＣＩ−ネオプラスミ：ＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子の断片（18）を投与し、その１４日後、ＭＲＳＡ ＰＢＰ２ａ（21）の内部領域に対応する、１０ｍｇの精製された組換えタンパク質を投与た。そして、完全フロイントアジュバント中で乳化させ、１４日後、不完全フロイントアジュバント内で乳化させた。その１４日後、免疫応答が最も高かった被験動物（酵素免疫分析‐ＥＬＩＳＡによって評価した）に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で希釈した１０ｍｇの精製タンパク質を静脈投与した。ＩＶ（静脈）注射の３日後、被験動物をＣＯ２で窒息させて安楽死させた後（CEUA L0009-07プロトコル−FIOCRUZ）、細胞融合のために脾臓を無菌的に取り出した。免疫応答が最も高かった被験動物の血清を、他の免疫学的試験のための免疫陽性対照として使用した。
【００５２】
４．モノクローナル抗体の作製：
【００５３】
脾臓から取り出したリンパ球を、融合用ポリエチレングリコールを用いてＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ATCC 1581）と融合させた後、「免疫学における最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」（22）のモノクローナル抗体作製プロトコルに従って、ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン培地中で３７℃、１０％ＣＯ２雰囲気下で培養した。その１４日後、精製された組換えタンパク質を抗原として使用して、後述する方法に従って、結果として得られたハイブリドーマをＥＬＩＳＡ試験によって評価した。評価が一番高かったハイブリドーマをクローニングした後、ＥＬＩＳＡによって最も良いクローンを選択して液体窒素中に保存した。
【００５４】
５．酵素免疫分析−ＥＬＩＳＡ：
【００５５】
炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中でマキシソープ（Maxisorp）９８ウエルプラスチックプレートを５００ｎｇ／ウエルの組換えタンパク質（ＰＢＰ２ａ断片）で感作させた後、４℃で一晩培養した。翌日、前記プレートを、Tween 20を０．０５％含有しているＰＢＳで３回洗浄し、脱脂粉乳５％含有ＰＢＳ及び中に３７℃で２時間保存した。サンプル（免疫動物の血清を１：１００で希釈したもの、または、培養細胞の上清）を分析した後、３７℃で２時間培養した。前記プレートを、再び、Tween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄し、抗Ｉｇ複合体を１：５０００の希釈率で加え、その後、３７℃で９０分間培養した。その後、前記プレートをTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ顕色剤（BioRad）を添加し、光を遮った状態で１５分間培養した。０．５ＮのＨ２ＳＯ４を添加して反応を中断させた後、４５０ｎｍで測定した。１：２００で希釈した多クローン性高度免疫血清を陽性対照として用いた。
【００５６】
５．１．酵素免疫分析に基づく結合力分析：
【００５７】
５．１．１．尿素による結合力分析（Niederhouser他−５．１）：
【００５８】
プロトコルは、免疫分析（5）のプロトコルと類似しているが、次の点を変更した。サンプル（１００ｎｇのクローン１０精製モノクローナル抗体及び２．０ｎｇのクローン３８精製モノクローナル抗体）を３７℃で２時間培養した後、前記サンプルをTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳ中で８Ｍの尿素で３回洗浄した。その後、Tween 20（０．０５％）含有ＰＢＳで４回洗浄した。通常に処理した（尿素で処理しなかった）同一のサンプルを対照として用いた。前記サンプルの光学密度を測定した後、尿素を用いて測定した値を尿素を用いないで測定した値で割り、それに１００掛けることによって結合率を計算した（パーセンタイル結果）。
【００５９】
５．１．２．チオシアン酸アンモニウムによる結合力分析（Goldblat他−５．２）：
【００６０】
プロトコルは、免疫分析（5）のプロトコルと類似しているが、次の点を変更した。サンプル（１００ｎｇのクローン１０精製モノクローナル抗体及び２．０ｎｇのクローン３８精製モノクローナル抗体）を３７℃で２時間培養した後、前記サンプルを次の濃度のチオシアン酸アンモニウムで３７℃で３０分間処理した。３Ｍ；１．５Ｍ；１．０Ｍ；０．７５Ｍ；０．５０Ｍ；０．２５Ｍ；及び０．１２５Ｍ。チオシアン酸アンモニウムで処理しなかったサンプルを各クローンの対照として用いた。
【００６１】
前記サンプルの光学密度を測定した後、次の式によって結合率を計算した。
ＡＲ（結合率）＝（（ｌｏｇ５０−ｌｏｇＡ）×（Ｂ−Ａ）／ｌｏｇＢ−ｌｏｇＡ）＋Ａ
ただし、ｌｏｇ５０＝１．７０とする。Ａは、５０％未満の吸光度減少が得られた、最も低いチオシアン酸アンモニウム濃度である。Ｂは、５０％を超える吸光度減少が得られた、最も高いチオシアン酸アンモニウム濃度である。
【００６２】
６．モノクローナル抗体の作製及び精製：
【００６３】
前もって選択したクローン１０及び３８のサンプルを、１０％のＣＯ２の雰囲気下のストーブ中の１００ｍＬの小瓶中で、１％のＢＳＡが添加された無血清培地（GIBCO VP-SFM）中で成長させた。上清を遠心分離した後、０．２２μｍのフィルタでろ過し、SelectSureプロテインＡ ＭＡＢ樹脂（ＧＥ）を用いた高性能クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。前記抗体を、ｐＨ１０．０の１Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨ７．０に中性化した後、脱イオン水中で０．５倍のＰＢＳに対して透析させる。前記サンプルを凍結乾燥処理し、脱イオン水中で再懸濁させ、ローリー法で定量化し、ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動によって評価した。
【００６４】
７．標的認識：
【００６５】
７．１．インビトロでのＰＢＰ２ａ認識‐免疫ブロッティング：
【００６６】
ＭＲＳＡ（ＣＥＢ）株、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム株、及びＢＬ−２１ ＤＥ３大腸菌株を指数増殖期で成長させた。１ｍＬの各サンプルを遠心分離し、mini-Bead Beater device（Biospect Products）のガラスビーズ内で撹拌して溶解させた（３回、３０秒間）。各サンプルの１アリコートを１２％変性のポリアクリルアミドゲル内で電気泳動させ（SDS-PAGE）、その後、前記タンパク質をナイロン膜へ移動させた（Hybond N-BioRad）。前記膜を、脱脂粉乳１０％及びＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１％を含有しているＰＢＳ緩衝液に入れて緩やかに撹拌した。前記膜をTween 20（０．０５％）含有ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。その後、洗浄した膜を、ＰＢＳ中で１：１の割合で希釈した抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の上清と共に、２時間培養した。培養後、前記膜を上述した方法で洗浄し、１：１５，０００の割合でアルカリホスファターゼ複合体（マウス抗ＩｇＧ抗体‐Sigma A3688）と９０分間培養する。その後、ＰＢＳ中での洗浄を繰り返し、アルカリホスファターゼ用のWestern Blue基板（Promega）による成長を行った。
【００６７】
７．２．細菌表面でのＰＢＰ２ａ認識‐フローサイトメトリー：
【００６８】
ＭＲＳＡ（ＣＥＢ）株を静止期（ＯＮ）または指数増殖期で成長させた。前記サンプルを、１倍のＰＢＳ中で洗浄し、０．６のＤＯ６００（〜１０８細菌／ｍＬ）で再懸濁させた。そして、１ｍＬ（１０８細菌）中で遠心分離し、０．５％ＢＳＡ及び１：１０で希釈した正常血清（マウス：ヒト）中で再懸濁させた。そして、前記サンプルを４℃で３０分間培養した後、前記濃縮物（ペレット）をＰＢＳ中で２回洗浄し、０．５％ＢＳＡと１：１０，０００で希釈した抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含有している１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁させ、４℃で３０分間培養した。このステップの後、前記サンプルを前述した方法で再び洗浄し、０．５％ＢＳＡとＰＥ（フィコエリトリン）マウス抗Ｉｇ複合体の希釈物（１：１０００）を含有している１００μＬのＰＢＳ中で再懸濁させ、その後、暗い状態で４℃で３０分間培養した。その後、前記サンプルを再び洗浄し、２％パラホルムアルデヒドを含有しているＰＢＳ中で４℃で１５分間静置した。この前処理の後、前記サンプルをフローサイトメータ（Becton and Dickinson社製のFACScalibur）で分析した。
【００６９】
８．インビトロ防御分析‐最少阻害濃度の測定：
【００７０】
ＭＳＲＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＣＯＬ及びＣＡ）を、６００ｎｍでの光学密度が０．５になるまで指数増殖期で成長させた。
【００７１】
適用される接種材料は、約１００，０００個の細菌を含むように調節した。ミュラーヒントン（Muller Hinton）培養液、細菌接種材料、及び、増殖中の精製抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を試験管または１４キャビティプレートに加えた。前記試験管またはプレートを３７℃で１２時間培養した。その後、サンプルにおける濁度を観察した。この最小抑制濃度は、より少ない量の抗体で最近接種材料（１００，０００個の細菌）の成長を抑制することができると考えられる。
【００７２】
９．インビボ防御能分析：
【００７３】
９．１．ＭＲＳＡ株についての致死量及びＬＤ５０の測定
【００７４】
リード・ミュンヒ（Reed-Muench）の方法（23）に従って、ＭＲＳＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ及びＣＯＬ）について致死量及びＬＤ５０の測定を行った。８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスのグループを、成長中の細菌を腹腔内経路で投与することにより接種し、７日間観察した。この期間を生き延びた被験動物を、動物保護法に従って安楽死させた。
【００７５】
９．２．全身感染及び細菌腎臓感染の定量分析
【００７６】
ＭＲＳＡ株（ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ）を指数増殖期で成長させ（ＤＯ６００〜０．６）、約２×１０８の細菌に相当するＤＯ６００〜０．５で１倍の無菌ＰＢＳ中で洗浄し、再懸濁した。この濃度は、希釈率により計算し、オキサシリンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有しているＢＨＩ寒天プレート上に播種した。１日目に、８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに対して、４００ｍｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の腹腔内投与を１回行った。６日目に、被験動物を安楽死させ、腎臓を無菌的に取り出した。その後、腎臓を、１ｍＬの無菌ルリア培地中で均質化した後、１０倍に希釈した。１００μＬの各希釈液を、オキサシリンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有しているＢＨＩ寒天プレート上に播種した後、３７℃で２４時間培養した。そして、得られたコロニー数のカウントと総希釈率の計算を行った。
【００７７】
９．３．生存分析
【００７８】
ＭＲＳＡ株を、接種材料の調節を前に設定したＬＤ５０で行う以外は、前述した方法と同一の条件で成長させた。１日目に、８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに対して、精製された抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の服腔内投与を１回行った。翌日、被験動物と対照群に対して、腹腔内経路での投与を１回行うことによって、各株のＬＤ５０に従って、２．５〜６．０×１０８の細菌を感染させた。被験動物を１０日間観察した後、生き残ったものを安楽死させた。
【００７９】
１０．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体及びバンコマイシンのインビボ防御能の比較研究−腎臓感染の定量化
【００８０】
分析Ｉ
【００８１】
８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスの４つのグループ（１グループあたり４匹）に、６．０×１０７個の細菌（ＣＥＢ−ＭＲＳＡ）を腹腔内経路で投与して感染させた。被験動物のグループ１〜３に対しては、精製されたモノクローナル抗体（ＭＡＢ）、バンコマイシン、ＭＡＢ＋バンコマイシンをそれぞれ投与した。陰性対照としてのグループ（グループ４）には何も投与しなかった。
グループ１：ＭＡＢ（４００μｇ）（１日目）
グループ２：バンコマイシン（１５０μｇ、筋肉内投与経路、１２時間毎）
グループ３：バンコマイシン＋ＭＡＢ（３５０μｇ）（感染の１日後）
グループ４：対照
【００８２】
抗体及びバンコマイシンの最初の投与は、細菌投与の４時間後に行った。被験動物を４日目に安楽死させ、腎臓を無菌的に取り出し、前述した方法を用いて腎臓感染の定量化を行った。
【００８３】
分析ＩＩ
【００８４】
この分析は、細菌投与量を低くする（７．０×１０６個の細菌）こと以外は、分析Ｉと同じ方法で行った。グループ１は５００μｇの精製されたモノクローナル抗体で処理；グループ２はバンコマイシンで処理（１５０μｇ、筋肉内投与経路、１２時間毎：５回投与）；グループ３はバンコマイシン＋５００μｇのモノクローナル抗体；グループ４は対照とする（非処理動物）。
【００８５】
１１．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の決定
【００８６】
１１．１．ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡ抽出
【００８７】
ｍＲＮＡを抽出するために、RNeasy Minikitキット（Qiagen）を使用して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養細胞の１０ｍＬの遠心分離濃縮物（ペレット）を処理した。
【００８８】
１１．２．ｃＤＮＡ取得
【００８９】
逆転写反応：製造ガイドラインに従って、Ｍ−ＭＬＶ逆転写キット（Invitrogen）を使用して相補的ＤＮＡを得た。
【００９０】
１１．３．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＶＨ鎖及びＶＬ鎖の増幅
【００９１】
この反応は、下記の開始配列（プライマー）を使用して行った。
【００９２】
【表１】
【００９３】
１１．４．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のシークエンシング
【００９４】
シークエンシングのステップ：
【００９５】
Ｉ．増幅
【００９６】
増幅は、配列番号１〜３９によって定義された前述の開始配列を使用して行った。
【００９７】
ＩＩ．シークエンシング
【００９８】
装置BI Prism 3100 Genetic Analyser（Hitachi）を使用した。
【００９９】
１１．５．軽鎖及び重鎖のＣＤＲの配列分析及び同定
【０１００】
後でKabat's（24）及びChotia's（25）のアルゴリズムで解析して軽鎖及び重鎖のＣＤＲを同定するために、得られたＤＮＡ配列をDNASTAR社のプログラム（ExPASy部位翻訳プログラム）を用いて分析してアミノ酸配列に翻訳した。
【０１０１】
１２．モノクローナル抗体についての結合定数及び解離定数の決定（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore）方法によるクローン１０及び３８）
【０１０２】
Biacore X（登録商標）装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）のＣＭ−５センサを使用してＳＰＲ測定を行った。結合試薬及びＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｐ２０（Tween 20、ｐＨ７．４）はGE Healthcare社から入手した。
【０１０３】
例２
【０１０４】
１．マウス抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の獲得
【０１０５】
前述の免疫付与プロトコルを用いて動物群へ免疫を行った。ＥＬＩＳＡ試験による評価結果を図１に示す。
【０１０６】
融合手順（番号90-LATAの融合）を行った後、上清（ハイブリドーマ）を９６ウェルでＥＬＩＳＡ試験によって解析した。そのうち、上位５個のサンプルを選択して細胞を増やした（クローニング）。その後、再び、得られた上清をＥＬＩＳＡによって解析した。ＥＬＩＳＡによって得られた結果を検証するために精製組換えタンパク質（ＰＢＰ２ａ）に対する免疫ブロッティングによって陽性サンプルを検証した。最終結果を表１に示す。
【０１０７】
図１は、抗ＰＢＰ２ａ抗体産生のために免疫された動物の血清の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示している。横縞模様のグラフはそれぞれ、免疫された動物の１００倍希釈した血清に対応する。矩形波模様（一番右）のグラフは、陽性対照血清である。１つ目の横縞模様の棒グラフ：免疫前血清；２つ目の棒グラフ：４回目の免疫付与後の血清；３つ目の棒グラフ：５回目の免疫付与後の血清。
【０１０８】
表１．融合９０のクローニング：結論
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
選択されたクローンから、クローン７７〜３８に対して再クローニング手順を行い、分泌モノクローナル抗体の細胞安定性を検証した。解析した５０ウェルのうち、全てがＥＬＩＳＡ陽性であった。これらのクローンは増やされ、ＬＡＴＡＭ（Laboratorio de tecnologia de anticorpos monoclonais：モノクローナル抗体技術研究所）の液体窒素施設に貯蔵されている。
【０１１１】
２．モノクローナル抗体の成長、産生及び精製
【０１１２】
手順は、前述のように標準化した。産物は、上清１００ｍＬ当たり約４ｍｇのモノクローナル抗体であり、精製手順を実行した。結果を以下に示す。
【０１１３】
図２に、生サンプル及び精製後サンプルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示す。この図２は、精製前（カラム１）及び精製後（２）の上清サンプルを用い、MAb SelectSure樹脂を充填したＨＰＬＣカラムを通し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した結果を示している。カラム３〜９は、得られた精製サンプル分画に対応する。矢印は、約１５０ｋＤａの大きさを示している。
【０１１４】
３．モノクローナル抗体の機能的特性解析
【０１１５】
３．１．インビトロＰＢＰ２ａ認識−免疫ブロッティング
【０１１６】
標的病原体（ＰＢＰ２ａ及び類似配列）における抗体認識能力を調べるために、ＰＢＰ２ａを有する細菌（ＣＥＢ及びＣＯＬ ＭＲＳＡ）、ＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）株（ＰＢＰ２ａを有しない）、バンコマイシン耐性腸球菌属（ＰＢＰ５を有する）、βラクラム系抗生物質に対する親和性が低下したペプチド転移酵素（ＰＢＰ２ａに相同）、及び陰性対照として大腸菌株（組換えタンパク質を作製）に対して免疫ブロッティング試験を行った。その結果、それぞれＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５の大きさに相当するＭＲＳＡ及びエンテロコッカス属種株における分子量約７６ｋＤａのタンパク質を抗体が認識できたことが分かった。モノクローナル抗体は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌のタンパク質（ＰＢＰ２ａ陰性）とも大腸菌株とも反応性が示されなかった。結果を図３（ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡに対する免疫ブロッティング）に示す。
【０１１７】
抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体を含む上清に対するＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ溶解物の免疫ブロッティング試験の結果を図３に示す。
１．−分子量マーカー（カレイドスコープ）；
２．−指数増殖期において成長させたＭＳＳＡサンプル；
３及び４．−指数増殖期において成長させたＭＲＳＡサンプル；
５．−静止期において（一晩）成長させたＭＳＳＡサンプル；
６及び７．−静止期において成長させたＭＲＳＡサンプル。左の矢印は、ＰＢＰ２ａ分子量を示している。
【０１１８】
３．２．細菌表面上のＰＢＰ２ａ認識−フローサイトメトリー
【０１１９】
フローサイトメトリー試験の目的は、モノクローナル抗体による未変性状態の標的細菌認識の検証である。前の試験（免疫ブロッティング）では、変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によるタンパク質分離中に変性された標的タンパク質の認識が観察された。ここでも先と同様に、指数増殖期及び静止期において成長させた陰性対照株（ＭＳＳＡ，ＰＢＰ２ａ陰性）及びＭＲＳＡ株（ＣＥＢ）を解析した。その結果、両条件において抗体が細菌表面上の標的を認識できることが分かった。ブドウ球菌表面上のプロテインＡの存在は、抗体とＰＢＰ２ａとの結合を阻止することができなかった。結果を図４に示す。
【０１２０】
図４は、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体と培養し、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＭＲＳＡ（ＣＥＢ）及びＭＳＳＡ細菌のフローサイトメトリーの結果を示している。（１）にはＭＳＳＡ細菌、（２）には静止期において成長させたＭＲＳＡ、（３）には指数増殖期において成長させたＭＲＳＡを示す。ＭＲＳＡの集団は、蛍光複合体によって標識された細胞の増加に対応して右にずれている。
【０１２１】
４．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体によって与えられる防御の評価：
【０１２２】
４．１．インビトロ防御能試験
【０１２３】
最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
【０１２４】
これらの試験は、閉鎖系における標的への抗体の直接結合能の評価を目的とする。治療目的のモノクローナル抗体の場合、陽性結果が重要である。というのも、陽性結果は、宿主の自然免疫系及び獲得免疫系との組合せ作用によって生じる補体活性化及びオプソニン化機序などの宿主の免疫系の助けなしで、抗体が標的を認識しかつ細菌増殖を阻止できることを意味するからである。ＣＥＢ、ＣＯＬ及びイベリア型ＭＲＳＡ株を評価したところ、評価条件下で同じようなＭＩＣ値（約５００μｇ）が観察された。これらのデータは、ＭＲＳＡ株の遺伝的背景が異なるにもかかわらず、成長を阻止するために必要な抗体の用量が同じであることを示している。これらの結果を図５に示す。
【０１２５】
図５は、異なるＭＲＳＡ株由来の１０５個の細菌の接種材料に対して抗ＰＢＰ２ａ精製モノクローナル抗体及びバンコマイシンによって与えられるインビトロでの防御能試験（ＭＩＣ−最小阻止濃度）を示している。濁りがないことは、試験条件下で細菌増殖がなかったことを示している。
１Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ（ブラジル流行クローン）＋２５０μｇの抗体；
２Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ａ及び６Ａ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋２５０μｇの抗体；
２Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ｂ及び６Ｂ：ＣＯＬ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｃ：イベリア型ＭＲＳＡ（ヨーロッパ流行型クローン−ＥＥＣ）＋２５０μｇの抗体；
２Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ＋５００μｇの抗体；
３Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ＋７５０μｇの抗体；
４Ｃ及び６Ｃ：ＥＥＣ ＭＲＳＡ株の陰性対照。
１Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋１５０μｇのバンコマイシン；
２Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋３００μｇのバンコマイシン；
３Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋５００μｇのバンコマイシン；
４Ｄ：ＣＥＢ ＭＲＳＡ＋７５０μｇのバンコマイシン；
５Ｄ及び６Ｄ：陰性対照。
【０１２６】
４．２．インビトロ防御能試験
【０１２７】
４．２．１．ＣＥＢ、イベリア型、ＷＢ７９ ＣＡ及びＣＯＬ ＭＲＳＡ株に対する致死量及び亜致死量の決定：
【０１２８】
これらの分析は、用いた２つのモデル、すなわち、亜致死量による腎臓感染の定量化と、動物の約５０％を殺すことができる（ＬＤ５０）より大きな細菌接種材料を全身感染させた後の生存試験とにおいて、インビトロでの防御能を評価するために必要であった。投与が容易で目減りしないことから、腹腔内経路を選択した。リード−ミュンヒ（Reed-Muench）法を適用し、各条件（細菌濃度を増加させた感染用量）につき２匹の動物を用いて分析を行ってＬＤ５０及び亜致死量を決定し、黄色ブドウ球菌の平均致死量が分かった時点で３つの異なる用量を試験した。この病原体の試験には、ゲノムの配列を決定した最初のＭＲＳＡクローンであるＣＯＬ ＭＲＳＡ株を基準株として用いる。しかし、これは、他のＭＲＳＡクローンと比べて、病原性がほとんどなく、動物を感染させるためにより高用量を必要としたので、防御能分析には用いなかった。
【０１２９】
４．２．２．亜致死量で全身感染させた後の腎臓防御能分析
【０１３０】
これらの分析は、感染後の腎臓感染の定量化モデルを用いて、抗体が全身感染後に生命維持に必要な器官（腎臓）における細菌の存在を減少させる能力を評価する。病原性がありかつ異なる遺伝的背景を持つＭＲＳＡ株を用いて行った３つの独立した実験において、減少はｌｏｇ３（１０００倍）を超えた。これらの試験では、動物は以前に用量５００μｇの抗体を投与されていた。ＣＡ−ＭＲＳＡ株を用いた試験では、より低用量（２５０μｇ）の抗体によって与えられる防御能を評価した。細菌の減少が観察されたが、用量５００μｇで得られたものより少なかった。結果を図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃに示す。
【０１３１】
図６Ａは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＭＲＳＡ ＣＥＢ株を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。横縞模様の棒グラフ：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。市松模様の棒グラフ：抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。細菌の定量：対照：Ｃ１：２０００個の細菌；Ｃ２：２９，０００個の細菌；Ｃ３：２２０，０００個の細菌；Ｃ４：５２，０００個の細菌（７５，７５０個の細菌の平均）。処理（感染防御）動物：Ｐ１：２０個の細菌；Ｐ２、Ｐ３及びＰ４：１０個の細菌（１２．５個の細菌の平均）。非処理動物と比較して処理動物から回収した細菌の量の減少：６０６０倍。
【０１３２】
図６Ｂは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のイベリア型ＭＲＳＡ株（ヨーロッパ流行型クローン）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。横縞模様の棒グラフ：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。大きな市松模様の棒グラフ：抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。小さな市松模様の棒グラフは、それぞれの得られた平均を示している。細菌の定量：対照：Ｃ１：２１０，０００個の細菌；Ｃ２：４４，０００個の細菌；Ｃ３：３００，０００個の細菌；Ｃ４：２９０，０００個の細菌（２１１，０００個の細菌の平均）。処理（感染防御）動物：Ｐ１：８０個の細菌；Ｐ２：２００個の細菌；Ｐ３：１０個の細菌；Ｐ４：６０個の細菌（８７．５個の細菌の平均）。非処理動物と比較して処理動物から回収した細菌の量の減少：２４２０倍。
【０１３３】
図６Ｃは、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物及び非処理動物に亜致死量のＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ株（ブラジル市中獲得型株）を全身感染させ、それぞれの動物の腎臓感染を定量化した結果を示している。最初の５つの棒グラフ（ｘｘ模様、横縞模様及び大きな市松模様のグラフ）：各非処理動物の腎臓から単離した細菌の濃度の対数。最初の棒グラフ（ｘｘ模様）：安楽死前に死亡した動物に対する推定。棒グラフ６、７、８、９（横縞模様及び市松模様）：２５０μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。棒グラフ１０、１１、１２、１３（三角形模様）：５００μｇの抗体で処理した各動物の腎臓から単離した細菌の量の対数。市松模様の棒グラフ（５、９、１３番目の棒グラフ）は、それぞれの得られた平均を示している。細菌の定量：対照：Ｃ１：６５０，０００個の細菌；Ｃ２：２６，０００個の細菌；Ｃ３：１７，０００個の細菌；Ｃ４：５００，０００個の細菌（死亡した動物に対する推定）（２３１，０００個の細菌の平均）。２５０μｇの抗体で処理した動物：Ｐ１：０；Ｐ２：５，４００個の細菌；Ｐ３：８３０個の細菌；Ｐ４：１０個の細菌（１，５６０個の細菌の平均）。５００μｇの抗体で処理した動物：Ｐ１：８０；Ｐ２：０；Ｐ３：２１０；Ｐ４：８０個の細菌（９２．５の平均），非処理動物と比較して２５０μｇの抗体で処理した動物から回収した細菌の量の減少：１４９倍。５００μｇの抗体で処理した場合：２４９７倍。
【０１３４】
４．２．３．生存試験
【０１３５】
この種の試験において、動物のうち５０％またはそれ以上を殺すことができる細菌負荷（ＬＤ５０）で感染させた後に抗体によって動物に与えられる防御を評価した。腎臓感染の定量化分析で用いた３つの株に対する防御を評価した。３つの独立した実験において、抗ＭＲＳＡモノクローナル抗体で処理した動物の（ｉ）生存時間及び（ｉｉ）生存率の著しい減少が観察された。
【０１３６】
ＣＥＢ ＭＲＳＡ株を用いた分析では、感染動物の生存率が対照群（非処理）で１０％しかなかったのに対して、処理動物で７０％であった。イベリア型ＭＲＳＡ株を用いた分析でも同様の結果が得られ、対照群が１００％死亡したのに対して、処理動物の防御は６０％であった。ＣＡ ＭＲＳＡ株を用いた分析では、対照動物で７０％であったのに対して、１００％の防御が見られた。これらの結果を図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示す。
【０１３７】
図７Ａは、２．３×１０８個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）（ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１３８】
図７Ｂは、４．２×１０８個の細菌（イベリア型ＭＲＳＡ）（〜ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１３９】
図７Ｃは、１．１×１０９個の細菌（ＷＢ７９ ＣＡ−ＭＲＳＡ）（〜ＬＤ５０）を腹腔内投与して感染させた後の処理（感染防御）動物及び非処理（対照）動物の生存曲線を示している。
【０１４０】
４．２．４．モノクローナル抗体及びバンコマイシンによってそれぞれ与えられる防御能の比較試験
【０１４１】
バンコマイシンは、重度のＭＲＳＡ感染の治療のための第一選択抗菌薬であるので、前のものとは異なるモデルにおいて防御能の比較試験を行った。この試験では、動物を感染させ、感染のわずか４時間後に抗菌薬またはモノクローナル抗体の投与を開始した。３つの別個の群、すなわち、バンコマイシンで処理した群、モノクローナル抗体で処理した群及び抗菌薬＋抗体の同時投与群を用いて試験を行った。バンコマイシンの投与量を、ヒトに感染させた場合（１２時間毎に５００ｍｇ）と同じように調製した。
【０１４２】
その結果、感染から３日後に抗菌薬または抗体で処理した動物の腎臓に存在する細菌の量が約１５倍減少したことが分かった。しかし、抗菌薬及び抗体で処理した群においては、４，６１７倍の減少が見られた。
【０１４３】
これらの結果に基づき、本願出願人は、抗体１用量によって与えられる防御能がバンコマイシン５用量に相当し、感染動物の腎臓に観察される細菌負荷の減少にバンコマイシン及び抗体の同時投与が非常に効果的であったと結論することができる。単独及びバンコマイシンとの組合せによる抗ＭＲＳＡモノクローナル抗体の感染防御作用をより良好に観察するために、感染用量を減らしてこの試験を繰り返した（図８を参照）。
【０１４４】
より低い感染用量で第２の試験を行った後、その結果によって最初の結果を確認した。モノクローナル抗体処理によって与えられる防御能は８９倍の減少をもたらし、これは５用量バンコマイシン処理により得られる防御能（３５倍の減少）よりも高かった。しかし、最も顕著な減少の結果は、抗体＋バンコマイシンで処理した群で見られ、４５０倍の減少であった。
【０１４５】
図８Ａは、６．０×１０７個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体、バンコマイシン及び抗体＋バンコマイシンの組合せで処理した動物、並びに非処理動物の腎臓における細菌の定量を示している。感染から４時間後に処理を開始した。バンコマイシンを１２時間毎に投与した（５用量）。棒グラフ１、２、３、４、５（横縞模様）：非処理動物（対照）から回収した細菌の濃度の対数。Ｃ１：７，０００，０００；Ｃ２：２９５，０００；Ｃ３：３８０，０００；Ｃ４：３，２００，０００（平均：２，７１８，７５０個の細菌）。棒グラフ６、７、８、９、１０（市松模様）：４００μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。Ｐ１：４，２００；Ｐ２：３１０，０００；Ｐ３：３３０，０００；Ｐ４：９０，０００（１８３，５５０個の細菌の平均）。棒グラフ１１、１２、１３、１４、１５（水玉模様）：バンコマイシンで処理した動物。Ｐ１：１１０，０００；Ｐ２：５８，０００；Ｐ３：５００，０００；Ｐ４：２１，０００（１７２，２５０個の細菌の平均）。棒グラフ１６、１７、１８、１９、２９０（三角形模様）：抗体（３００μｇ）＋バンコマイシンで処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。Ｐ１：１，１００；Ｐ２：７００；Ｐ３：４５０；Ｐ４：９０（５８５個の細菌の平均）。
【０１４６】
図８Ｂは、７．０×１０６個の細菌（ＣＥＢ ＭＲＳＡ）に感染させた後の、抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体（棒グラフ７〜１２）、バンコマイシン（棒グラフ１３〜１８）、抗体＋バンコマイシンの組合せ（１９〜２４）で処理した動物及び非処理動物（棒グラフ１〜６）の腎臓における細菌の定量を示している。感染から４時間後に処理を開始した。バンコマイシンを１２時間毎に投与した（５用量）。棒グラフ１〜６：非処理動物(対照）から回収した細菌の濃度の対数。Ｃ１：６，０００；Ｃ２：１，０００；Ｃ３：５００；Ｃ４：１１８，０００；Ｃ５：１，０００（平均：２５，２２０個の細菌）。棒グラフ７〜１２：５００μｇの抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体で処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。ＭＢ１：４５０；ＭＢ２：２００；ＭＢ３：１００；ＭＢ４：２０；ＭＢ５：０（２８４個の細菌の平均）。棒グラフ１３〜１８：バンコマイシンで処理した動物。ＶＣ１：１００；ＶＣ２：７００；ＶＣ３：０；ＶＣ４：０；ＶＣ５：２８００（７２０個の細菌の平均）。棒グラフ１９〜２４：抗体（５００μｇ）＋バンコマイシンで処理した動物から回収した細菌の濃度の対数。ＭＢＶ１：１３０；ＭＢＶ２：２０；ＭＢＶ３：１０；ＭＢＶ４：８０；ＭＢＶ５：２０（５６個の細菌の平均）。
【０１４７】
５．結合分析
【０１４８】
モノクローナル抗体（クローン１０及び３８）の結合試験の結果：
【０１４９】
尿素プロトコル結合：
クローン１０：１．０３／１．４６（処理／非処理のＤＯの読み）＝７０．５％
クローン３８：１．００／１．２１＝８２．６％
チオシアン酸アンモニウムプロトコル結合：
クローン１０（ＤＯ）：
対照：１．１２
チオシアン酸塩で処理したサンプル：
２Ｍ＝０．０４６；１．５Ｍ＝０，０４７；１Ｍ＝０．１０７；０．７５Ｍ＝０．４８３；０．５Ｍ＝０．６０２；０．３７５Ｍ＝０．６８４
結合率：２．４７
クローン３８（ＤＯ）：
対照：１．２２
チオシアン酸塩で処理したサンプル：
２Ｍ＝０．０５６；１．５Ｍ＝０．０６２；１Ｍ＝０．１２９；０．７５Ｍ＝０．６４８；０．５Ｍ＝０．７５８；０．３７５Ｍ＝０．７９３
結合率：４．４０
【０１５０】
両実験において、クローン１０の結合率よりもクローン３８の結合率の方が高かったことが分かる。さらに、２つのプロトコルを用いて約１．０のＤＯに達するためには、抗体クローン３８の５０倍超のクローン１０が必要であることが分かった。
【０１５１】
６．表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるモノクローナル抗体（クローン１０及び３８）の結合定数及び解離定数の決定
【０１５２】
ＳＰＲ法によって得られた予備結果により抗体の結合が確認された。この場合もやはり、クローン１０よりもクローン３８の方が良好な結果を示した。表２のデータによれば、クローン３８は、クローン１０よりも４５０倍高い親和性を有することが分かる。
【０１５３】
この親和性は、主として、クローン１０よりも約１００倍高い結合率に起因する。クローン３８の親和性は非常に高いので、測定は器材の検知閾値に近いパラメータを示す。しかし、試験の計画及び実行を慎重にすることで、実験データはラングミュアのモデルによく合っていた。このことは、得られたデータが信頼できることを示している。
【０１５４】
図９は、組換えＰＢＰ２ａ（抗原）とモノクローナル抗体クローン３８（図９Ａ）／クローン１０（図９Ｂ）との相互作用を示している。煙のような線の曲線は、その右側の凡例に従う濃度のＳＰＲデータを示している。全てのサンプルを２回解析した。各曲線に対するラングミュア１対１の理論モデルをで各曲線の下に黒で示す。縦軸は反応単位、横軸は時間を秒単位で示している。横軸に最も近い線は、各サンプルに対する基線（陰性対照）を表している。
【０１５５】
表２
【０１５６】
抗原（ＰＢＰ２ａ）とモノクローナル抗体（クローン１０及び３８）との間の解離定数及び相互作用定数。
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
７．抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の同定
【０１５９】
用いられる抗体を産生するクローン（クローン３８）のハイブリドーマ細胞においてｍＲＮＡ抽出手順を行った後、ｃＤＮＡを得て、この材料を用いて異なる軽鎖及び重鎖対立遺伝子についてＰＣＲ反応を行った。得られた材料を、ＰＣＲ反応で用いたのと同じプライマー配列（配列番号１８ないし配列番号３９によって画定される）を用いてシークエンシングを行った。３つの異なるシークエンシングにおいて軽鎖３９１及び重鎖３１０を同定した。カバット（Kabat）及びチョーティア（Chotia）のアルゴリズムを適用して、軽鎖及び重鎖のＣＤＲの同定に至った。これらは、添付の特許請求の範囲の対象である。
【０１６０】
軽鎖及び重鎖ＣＤＲの配列を以下に示す。
配列番号６−ＣＤＲ１軽鎖アミノ酸。
RSSQSIGHSNGNTYLE
配列番号７−ＣＤＲ２軽鎖アミノ酸。
KVSNRFS
配列番号８−ＣＤＲ３軽鎖アミノ酸。
FQGSYVPLT
配列番号９−ＣＤＲ１軽鎖ＤＮＡ。
cgcagcagccagagcattggccatagcaacggcaacacctatctggaa
配列番号１０−ＣＤＲ２軽鎖ＤＮＡ。
aaagtgagcaaccgctttagc
配列番号１１−ＣＤＲ３軽鎖ＤＮＡ。
tttcagggcagctatgtgccgctgacc
配列番号１２−ＣＤＲ１重鎖アミノ酸。
GFSITSSSSCWH
配列番号１３−ＣＤＲ２重鎖アミノ酸。
RICYEGSISYSPSLKS
配列番号１４−ＣＤＲ３重鎖アミノ酸。
ENHDWFFDV
配列番号１５−ＣＤＲ１重鎖ＤＮＡ。
ggctttagcattaccagcagcagcagctgctggcat
配列番号１６−ＣＤＲ２重鎖ＤＮＡ。
cgcatttgctatgaaggcagcattagctatagcccgagcctgaaaagc
配列番号１７−ＣＤＲ３重鎖ＤＮＡ。
gaaaaccatgattggttttttgatgtg
【０１６１】
補完的データ
【０１６２】
本発明をさらに発展させるために、他の分析を行った。そのほとんどを以下に実例を挙げて示す。
【０１６３】
例３
【０１６４】
ＣＥＢ ＭＲＳＡ株を用い、例１の７．２で説明したのと同じプロトコルに従い、さらには黄色ブドウ球菌凝集体を脱凝集させかつ抗体に曝露されるＰＢＰ２ａの量を増加させることを目標として各洗浄の間に渦撹拌の２つの１５秒のパルスを加えて、第２の試験を行った。
【０１６５】
標識物質ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及びＰＥ（フィコエリトリン）を試験し、対照サンプル（ｉ．モノクローナル抗体との接触のない純粋細菌及び、ｉｉ．純粋細菌＋標識物質ＦＩＴＣまたはＰＥ）と、モノクローナル抗体で処理しかつＰＥまたはＦＩＴＣで標識されたサンプルの解析を行った。FACScalibur装置の読みはリニアモードで行った。
【０１６６】
図１０は、ＦＩＴＣで標識された抗ＰＢＰ２ａ抗体の存在下でのＭＲＳＡサンプルのフローサイトメトリーによる解析のグラフである。曲線（ｘ）は標識されていないサンプルに対応し、曲線（ｙ）は標識されたサンプルに対応する。
【０１６７】
その結果、標識された集団の約２２％が装置によって検出されることが分かり、抗ＰＢＰ２ａ抗体は細菌表面上に存在する標的（ＰＢＰ２ａ）を認識することが確認された（図１０）。
【０１６８】
例４
【０１６９】
発明者はさらに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌由来の抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体によって与えられる、エンテロコッカスに対する防御を調べた。前述のように、この抗体は、エンテロコッカス属種株に存在するタンパク質（恐らく、ペプチド転移酵素であり、全てのエンテロコッカス株に存在し、βラクタム系抗菌薬に対する親和性が低く、分子量が約７６ｋＤａ（２３７アミノ酸）であるＰＢＰ５）を認識する。この酵素は、以下に示す配列比較（ClustalW）によれば、ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａに対する相同性を示す。
【０１７０】
【表４】
【０１７１】
配列比較は、ＰＢＰ５エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｆａｓ）及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｆａｍ）並びにＭＲＳＡのＰＢＰ２ａにそれぞれ対応する配列について行った。マーキングした配列（太字−ＰＢＰ５；下線−ＰＢＰ２ａ）は、モノクローナル抗体を作製するために用いたＰＢＰ２ａ領域に対応している。イタリック体で示しているのは、酵素活性コアに対応するアミノ酸である。
【０１７２】
このようにして、ＭＲＳＡに関して既に行ったように、マウスモデル（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）におけるインビトロ防御能試験、致死量及びＬＤ５０の決定、及びインビボ試験（亜致死量での腎臓感染の定量化及び致死量での生存試験）をエンテロコッカス株を用いて行った。これらの結果を対応する報告に示す。
【０１７３】
１．１．インビトロ防御能試験
【０１７４】
この試験の目的は、ＶＲＥエンテロコッカス株に対する抗体によって与えられるインビトロでの防御能の評価であった。
【０１７５】
リシェ研究所（laboratorio Richet）のエンテロコッカス・フェカリスの臨床株（ＶＲＥ）に対する精製モノクローナル抗体クローン３８（９０／ＤＡ５／ＣＢ５／ＡＡ３ ｈｉｂ７７）のインビトロ防御能試験（ＭＩＣ）。
【０１７６】
条件：
サンプル：SelecSure MAB樹脂を用いたＨＰＬＣにより上清から精製し、透析し、凍結乾燥させた。
抗体定量化（ローリー法）：３．５ｍｇ／ｍＬ
接種材料：ＶＲＥ株
前接種材料：バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬのＬＢ培地にＶＲＥ１コロニーを接種、静止期（ＯＮ）に３７℃で成長させ、１６０ｒｐｍで遠心分離
接種材料：２０ｍＬのＬＢ培地に４００ｍＬの前接種材料、２００ｍＬの三角フラスコ、３７℃、１６０ｒｐｍ
７時間後のＤＯ６００ｎｍの読み：０．７
定量化：５．５×１０８個の細菌／ｍＬ
試験条件：
接種材料：５．５×１０５個の細菌
抗体濃度：３００、４００、５００、６００及び７００ｍｇの抗体
培地：１ｍＬのルリア培地
細胞培養プレート，２４ウェル
陽性対照：ルリア培地＋細菌接種材料
陰性対照：ルリア培地
培養：１８時間、３７℃
【０１７７】
図１１は、抗体によって与えられた防御の評価の結果を示している。図１１では、
Ａ．３００ｍｇの抗体
Ｂ．４００ｍｇの抗体
Ｃ．５００ｍｇの抗体
Ｄ．６００ｍｇの抗体
Ｅ．陰性対照
Ｆ．陽性対照
Ｇ．７００ｍｇの抗体
を有する。
【０１７８】
１．２．腹腔内経路によるＬＤ５０及び致死量の決定−バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム
【０１７９】
プロトコル：
メスの７週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，平均体重２０ｇ
１日目−前接種材料：バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１０ｍＬのＬＢ培地にＶＲＥ株１コロニーを接種、５０ｍＬのファルコン（Falkow）チューブ、静止期（ＯＮ）に３７℃で成長させ、１６０ｒｐｍで遠心分離
２日目−接種材料：５０ｍＬのＬＢ培地／バンコマイシン（２５０ｍＬの三角フラスコ）に１ｍＬの前接種材料−４バイアル、３７℃、１６０ｒｐｍ、ＤＯ６００ｎｍ＝０．８０まで成長させ、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁、ＯＤ１．２
定量化：２．１×１０８個の細菌／ｍＬ
Ａ．６０μＬ（１．５×１０７）
Ｂ．３００μＬ（６．５×１０７）
Ｃ．９００μＬ（３００μＬ／用量まで減少）（１．５×１０８）
Ｄ．４．５ｍＬ（３００μＬ／用量まで減少）（６．５×１０８）
Ｅ．９．０ｍＬ（１．２×１０９個の細菌）（３００μＬ／用量まで減少）
Ｆ．４５．０ｍＬ（６．５×１０９個の細菌）（３００μＬ／用量まで減少）
【０１８０】
分析の２日目から１０日目に動物の観察を行った。
【０１８１】
結果を図１２に示す。致死量は１．２×１０９細菌であり、ＬＤ５０は６．５×１０８細菌であると結論される。
【０１８２】
７日目に生存している動物の腎臓感染の定量化：
Ａ（１．５×１０７）：細菌増殖なし
Ｂ（６．５×１０７）：細菌増殖なし
Ｃ（１．５×１０８）：３１００個の細菌
Ｄ（６．５×１０８）：２．８×１０４個の細菌
【０１８３】
１．３．インビトロ防御能試験−生存試験−マウスモデルにおける腹腔内経路による全身感染の致死量
【０１８４】
この試験の目的は、致死量のエンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）株の全身感染に対する抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体のインビトロでの防御能の有効性を評価することであった。
【０１８５】
１．抗体（血清入り培地で培養した細胞培養液の上清から精製したもの）
−サンプルを精製（HPLC SelecSure MAB）し、透析し、凍結乾燥させ、再懸濁し、使用前にろ過した。
−定量化（ローリー法）：１．０ｍｇ／ｍＬ
２．マウスモデル：メスの８週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，体重２３〜２５ｇ
３．プロトコル：
Ａ群（６匹の動物）：６５０ｍｇの抗体（３５０ｍｇ＋３００ｍｇ）
Ｂ群（６匹の動物）：対照（生理食塩水投与）
４．細菌接種材料の調製：
ＶＲＥ株：
前接種材料，１日目，バンコマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した１０ｍＬのＢＨＩ培地、静止期（ＯＮ）、３７℃、１６０ｒｐｍ
接種材料，３日目：バンコマイシンを添加した３０ｍＬのＢＨＩ培地に３００ｍＬの前接種材料を接種、ＤＯ６００は１．３１、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．５倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁し、ＯＤ＝１．１０に調整し、希釈し、プレーティングして定量化（２．０×１０８個の細菌／ｍＬ）；接種材料：１２ｍＬ，遠心して３００ｍＬ中で再懸濁，ＩＰ経路（〜２．２×１０９個の細菌）
タイムスケジュール：
１日目：抗体（３５０ｍｇ）のＩＰ接種
２日目：抗体（３００ｍｇ）のＩＰ接種、午後に全身感染（ＩＰ，２５０ｍＬの細菌溶液−２．２×１０９個の細菌）
２日目から１３日目：動物の観察。
【０１８６】
結果を図１３に示す。処理動物は２匹しか死亡しなかった（防御の６６．６％）。２日目に全ての対照動物が死亡した。
【０１８７】
１．４．インビトロでの防御能試験−マウスモデルにおける腹腔内経路によるバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウムの全身感染
【０１８８】
目的は、エンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）株の全身感染に対する腸球菌由来の抗ＰＢＰ２ａ及びＰＢＰ５モノクローナル抗体のインビトロでの防御能の有効性を評価することであった。
【０１８９】
試験：
１．抗体（血清入り培地で培養した細胞培養液の上清から精製したもの）
−サンプルを精製し（AffiPrep Protein A Biorad/HPLC SelecSure MAB）、透析し、凍結乾燥し、再懸濁した。
−定量化（ローリー法）：１．５ｍｇ／ｍＬ
２．マウスモデル：メスの８週齢のＢａｌｂ／Ｃ動物，体重１９〜２３ｇ
３．プロトコル：
Ａ群（４匹の動物）：５００μｇの抗体（２ヶ月間，ｄ０１，ｄ０２）
Ｂ群（４匹の動物）：非感染防御対照
４．細菌接種材料の調製：
イベリア型ＭＲＳＡ株：
前接種材料，１０ｍＬのＬＢ培地、静止期（ＯＮ）、３７℃、１２０ｒｐｍ
接種材料：２０ｍＬのＬＢ培地に２００μＬの前接種材料、ＤＯ６００は０．８０、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．５倍の無菌ＰＢＳ中で再懸濁し、ＯＤ＝０．５１に調整し、希釈し、プレーティングして定量化（２．４×１０８個の細菌／ｍＬ）；接種材料：５００μＬ，ＩＰ経路（２．４×１０８個の細菌）
タイムスケジュール：
１日目：腹腔内経路による２５０μｇの抗体の接種
２日目：腹腔内経路による２５０μｇの抗体の接種及び全身感染（腹腔内，５００μＬの細菌溶液）
６日目：安楽死、腎臓内の細菌の定量
【０１９０】
上記の結果に基づき、以下のことを強調することができる。
【０１９１】
インビトロ防御能試験−最小阻止濃度の決定：
合計７００μｇの抗体は、５５０，０００個の細菌の成長を阻止することができる。これらの値は、ＭＲＳＡ株に対して得られたＭＩＣ（約５００μｇであった）よりも高い。
【０１９２】
インビトロ防御能試験：
インビトロ防御能試験−マウスモデルにおける腹腔内経路による亜致死量のバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム全身感染
【０１９３】
動物に５００μｇのモノクローナル抗体を腹腔内経路（ＩＰ）により投与し、２．４×１０８個の細菌をＩＰ経路により全身感染させた。４日後、安楽死させて腎臓を切除し、細菌を定量した。処理動物は平均８７．５個の細菌／動物を示したが、対照（感染させたが処理していない動物）では平均２１１，０００個の細菌／動物であった。
【０１９４】
致死量投与後の生存試験
【０１９５】
動物に６５０μｇのモノクローナル抗体を投与し（ＩＰ経路）、全身感染させ（ＩＰ経路）、１０日間にわたって毎日観察した。対照（非処理）動物は感染後２日目までに死亡した；処理動物（６）のうち２匹が２日目に死亡し、残りは試験終了まで生存し続けた。生存率は６６．６％であった。
【０１９６】
従って、ここでもやはり、ＭＲＳＡ抗ＰＢＰａモノクローナル抗体が腸球菌に対する交叉防御能を与えることが示されることが確認された。しかし、防御能を与えるために必要な用量は、同様の条件下でＭＲＳＡに対して用いた用量よりも高かった。これはおそらく、抗体が、発現されたＰＢＰ２ａと同じ有効性をもってＰＢＰ５を認識する能力が低いためである。
【０１９７】
従って、本明細書で説明した発明、すなわちＰＢＰ２ａ及び相同配列と特異的に結合することができる抗ＰＢＰ２ａモノクローナル抗体は、タンパク質または類似の物質（ＭＲＳＡ、ＭＲＳＥ及びエンテロコッカス属種、並びにＰＢＰ２ａに相同なタンパク質を有する任意の他の病原体）を有する細菌による感染に有用である。
【０１９８】
これらの感染が世界的な問題となり、既知の大規模流行ＭＲＳＡクローンに対する分析が行われたら、本発明の産物は、そのような病原体による感染が起きているあらゆる場所において適用可能である。
【０１９９】
発明者の最新の知識に照らして、本明細書で引用した文献を以下に示す。
【０２００】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号６、７、８、１２、１３及び１４からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号９、１０、１１、１５、１６及び１７からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
エンテロコッカス属種から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号６、７、８、１２、１３及び１４からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
エンテロコッカス属種から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号９、１０、１１、１５、１６及び１７からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
βラクタム系抗菌薬に対する耐性を診断するための方法であって、
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を含んでいる疑いのある細菌サンプルに対して、請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体を単独でまたは他の物質と共に加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を持っている細菌による感染症を治療または予防するための医薬組成物であって、
所定量の請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体と、薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を含んでいる細菌による感染症を治療または予防するための方法であって、
所定量の請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体を、ヒトまたは動物の対象に対して投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＧＦＳＩＴＳＳＳＳＣＷＨ（配列番号１２）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ１ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＲＩＣＹＥＧＳＩＳＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１３）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ２ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＥＮＨＤＷＦＦＤＶ（配列番号１４）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ３ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＲＳＳＱＳＩＧＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号６）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ１ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号７）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ２ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号８）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ３ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号９に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１５】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１０に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１１に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１５に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１８】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１６に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１９】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１７に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号６、７、８、１２、１３及び１４からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号９、１０、１１、１５、１６及び１７からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
エンテロコッカス属種から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号６、７、８、１２、１３及び１４からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
エンテロコッカス属種から産生されたＰＢＰ２ａタンパク質に対して結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号９、１０、１１、１５、１６及び１７からなる群から選択されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する対応するアミノ酸配列を含んでなる可変鎖領域を含むことを特徴とする単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
βラクタム系抗菌薬に対する耐性を診断するための方法であって、
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を含んでいる疑いのある細菌サンプルに対して、請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体を単独でまたは他の物質と共に加えるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を持っている細菌による感染症を治療または予防するための医薬組成物であって、
所定量の請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体と、薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
ＰＢＰ２ａまたはそれに相同なタンパク質を含んでいる細菌による感染症を治療または予防するための方法であって、
所定量の請求項１または２のいずれかに定義された単離されたモノクローナル抗体を、ヒトまたは動物の対象に対して投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＧＦＳＩＴＳＳＳＳＣＷＨ（配列番号１２）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ１ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＲＩＣＹＥＧＳＩＳＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１３）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ２ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＥＮＨＤＷＦＦＤＶ（配列番号１４）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変重鎖（ＣＤＲ３ ＶＨ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＲＳＳＱＳＩＧＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号６）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ１ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号７）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ２ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体であって、
配列ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号８）または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変軽鎖（ＣＤＲ３ ＶＬ）を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号９に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１５】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１０に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１１に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１７】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１５に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ１領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１８】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１６に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ２領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【請求項１９】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１７に記載の配列または該配列に対応する変性の可能性のある核酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する可変重鎖を含むことを特徴とする抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５０１７３２（Ｐ２０１３−５０１７３２Ａ）
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２４０６４（Ｐ２０１２−５２４０６４）
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＲ２０１０／０００２６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７７９１
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（５１１２１９５３７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１０日（２０１０．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＲ２０１０／０００２６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７７９１
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（５１１２１９５３７）
【Ｆターム（参考）】
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