フラクトオリゴ糖蓄積トランスジェニック植物及びその作出方法
スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物で植物を形質転換する工程を含む、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法、及び前記方法により作出されたトランスジェニック植物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、フラクトオリゴ糖を高純度かつ高含量で蓄積するトランスジェニック植物及びその作出方法に関する。より具体的には、例えば、カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を植物で発現させ、１−ケストース、ニストース、又は１−フルクトフラノシルニストースの少なくとも１つの成分を蓄積するトランスジェニック植物の作出方法に関する。
【背景技術】
フラクトオリゴ糖は、スクロースにフルクトースがβ２→１結合で結合したオリゴ糖類であり、その還元末端はグルコースである。フラクトオリゴ糖は、難う蝕性や、ビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質代謝改善作用、免疫調節作用など様々な生理機能を有することが明らかになっており、機能性食品素材として産業上極めて有用である。フラクトオリゴ糖は、自然界では広く植物に分布しており、例えば、アスパラガス、タマネギ、キクイモ、又は蜂蜜などに含まれていることが知られているが、その含有量は低く、タマネギで２．８ｇ／１００ｇ程度といわれている。
近年、微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼの転移反応を利用して、スクロースからフラクトオリゴ糖を大量に製造する技術が確立され、工業的に生産されている。工業的に使用されているカビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、転移活性が高いことや異性体がほとんど生成しないことが特徴であり、スクロースを基質とした酵素反応を行うことにより、重合度３〜６のフラクトオリゴ糖を効率よく生成する。更に、カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼを改変することにより、親β−フルクトフラノシダーゼにより生成するフラクトオリゴ糖の組成と異なる組成のフラクトオリゴ糖を生成するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体が得られている［国際公開第９７／３４００４号パンフレット（特許文献１）］。
一方、植物に特定の遺伝子を導入して形質転換させる技術は、アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いてタバコに遺伝子が導入されて以来、多くの有用形質を付与した作物が作出されてきた。また、植物に有用成分を蓄積させる試みも行われ、フラクトオリゴ糖を植物に蓄積させた例も公知となっている［国際公開第９６／０１９０４号パンフレット（特許文献２）、国際公開第０３／００８５４号パンフレット（特許文献３）、“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”１６巻，１９９８年，ｐ．８４３−８４６（非特許文献１）］。
しかしながら、前記の先行例におけるフラクトオリゴ糖の生成量は微量であり、また、フラクトオリゴ糖の異性体、例えば、１−ケストースの異性体であるネオケストースや６−ケストースが生成されている［特許文献２，ｐ．５６−５９，図１７Ａ・図１７Ｂ、特許文献３］。また、貯蔵糖がスクロースであるビートの形質転換体の根及び葉における蓄積量は、それぞれ、１−ケストースが７３．８μｍｏｌ／ｇ ＦＷ（３．７％）及び０．１μｍｏｌ／ｇ ＦＷ程度である［非特許文献１］。
【特許文献１】国際公開第９７／３４００４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／０１９０４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００８５４号パンフレット
【非特許文献１】“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”１６巻，１９９８年，ｐ．８４３−８４６
【発明の開示】
微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて発酵生産を行う従来のフラクトオリゴ糖製造法は、製造コストが高いばかりでなく、単糖（グルコース）が副生産物として生成されるため、オリゴ糖の特長である整腸作用・難う蝕性・低カロリー等の生理的機能を損なう問題があった。そのため、クロマト分画等により単糖類を除去する工程が必要となり、更に製造コストを増大することも問題であった。これらの問題点を解決するために、効率よく、より高純度のフラクトオリゴ糖を生成させる方法が望まれている。
植物にフラクトオリゴ糖を蓄積させる方法も試みられているが、高純度のフラクトオリゴ糖、特に、その構成成分である１−ケストース、ニストース、及び／又は１−フルクトフラノシルニストースを高含量でかつ高純度に蓄積するトランスジェニック植物はいまだに報告されていない。
本発明者らは、これまでに植物における発現の報告がされていなかったアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を用いて、種々の検討を重ね、植物の形質転換が可能な遺伝子構築物を調製した。更に、この遺伝子構築物を用いて植物を形質転換し、植物体として再生させることにより、フラクトオリゴ糖を蓄積できるトランスジェニック植物を作出した。通常、タバコはフラクトオリゴ糖を生成しないが、本発明のトランスジェニック植物の一例であるタバコは、約３〜４μｍｏｌ／ｇもの１−ケストースを生産、蓄積し、更に、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースが検出されないという、これまでにない特性を有する。また、本発明のトランスジェニック植物の別の一例であるビートは、その葉中に約０．１５μｍｏｌ／ｇの１−ケストースを生産、蓄積し、更に、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースが検出されないという、これまでにない特性を有する。
従って、本発明は、スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼを含む遺伝子構築物で植物を形質転換し、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法、並びに前記方法で作出されたトランスジェニック植物、その子孫植物、及びそれらの種子を提供するものである。更に、本発明のトランスジェニック植物、その子孫植物、及びそれらの種子を用いたフラクトオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物で植物を形質転換する工程を含む、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法。
（２）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来である、（１）に記載の方法。
（３）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来である、（２）に記載の方法。
（４）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、下記からなる群より選択される、（１）に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
（５）遺伝子構築物が、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター又は生育ステージ特異的プロモーターに機能し得るように連結されたβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含んでなる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）プロモーターが、下記からなる群より選択される、（５）に記載の方法：
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
（７）トランスジェニック植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）トランスジェニック植物が、ナス科、アカザ科又はイネ科に属する植物である、（７）に記載の方法。
（９）トランスジェニック植物が、タバコ属、フダンソウ属、又はサトウキビ属に属する植物である、（８）に記載の方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法により作出されたトランスジェニック植物又はその子孫植物。
（１１）（１０）に記載のトランスジェニック植物又はその子孫植物の種子。
（１２）（１０）に記載の植物若しくは子孫植物又は（１１）に記載の種子を栽培する工程、及び植物体内に蓄積されたフラクトオリゴ糖を採取する工程を含んでなる、フラクトオリゴ糖の製造法。
【発明を実施するための最良の形態】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子
β−フルクトフラノシダーゼは、ＩＵＢＭＢ（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）による分類でＥＣ３．２．１．２６に分類されている加水分解酵素の１つである。本発明で用いることのできるβ−フルクトフラノシダーゼは、スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼである限り、特に限定されるものではない。
本発明におけるフラクトオリゴ糖とは、スクロースにフルクトースがβ２→１結合で重合した重合度３以上のフルクタンであり、還元末端にはグルコースが結合している。重合度３のフルクタンが１−ケストース、重合度４のフルクタンがニストース、重合度５のフルクタンが１−フルクトフラノシルニストースである。本発明では、特に重合度３〜５のフラクトオリゴ糖を効率よく生産することを目的としている。
そこで、本発明では、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の選定が重要となる。カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、植物や細菌由来のフラクトオリゴ糖生成酵素と比較して、比活性が高く、広いｐＨ領域と温度領域で作用するために効率よくフラクトオリゴ糖を生成し、異性体の生成がほとんど見られないという好ましい特徴を有する。
本発明における好適なβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子として、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。より好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来の遺伝子が挙げられる。具体的な例として、国際公開第９７／３４００４号パンフレットに記載のアスペルギルス・ニガー ＡＣＥ−２−１（ＡＴＣＣ２０６１１）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号２）、ペニシリウム・ロッケフォルチ（ＩＡＭ７２５４）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号１２）、及びスコプラリオプシス・ブレビカウリス（ＩＦＯ４８４３）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号１４）、並びに国際公開第９９／１３０５９号パンフレットに記載のペニシリウム・ロッケフォルチ（ＩＡＭ７２５４）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号２）、及びスコプラリオプシス・ブレビカウリス（ＩＦＯ４８４３）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号４）が挙げられる。
また、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、下記からなる群より選択することができる：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
前記遺伝子（ｂ）は、配列番号１で表わされる塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子である限り、特に限定されるものではない。前記遺伝子（ｂ）としては、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に、適当なマーカー配列及び／又は融合用パートナーをコードする塩基配列が付加された塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
前記遺伝子（ｃ）において、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数は、具体的には１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個である。
より具体的には、国際公開第９７／３４００４号パンフレットの実施例Ｄ１〜Ｄ１１に記載されている方法で得られる変異体をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼの各種変異体である、Ｆ１７０Ｗ変異体、Ｇ３００Ｗ変異体、Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｅ３８６Ｋ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｒ変異体、Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｅ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｄ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、又はＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体を挙げることができる。なお、前記変異体の名称は、
原アミノ酸：位置：置換アミノ酸
を意味しており、例えば、１７０番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）に置換したものは「Ｆ１７０Ｗ」として示される。また、多数の変異は、記号「＋」によって表わされ、例えば、「Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ」は、１７０、３００、及び３１３番目のアミノ酸であるフェニルアラニン、グリシン（Ｇ）、及びヒスチジン（Ｈ）が、それぞれトリプトファン、バリン（Ｖ）、及びリジン（Ｋ）に置換されていることを示す。
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、好ましくは国際公開第９７／３４００４号パンフレット又は国際公開第９９／１３０５９号パンフレットに記載の方法に従って調製することができる。より具体的には、国際公開第９７／３４００４号パンフレット実施例Ａ、実施例Ｄ１を参照してプラスミドｐＡＮ１２０（同パンフレット図６）を調製した後、ＢａｍＨＩで消化することにより、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＦＦａｓｅ）ｃＤＮＡを得ることができる。
前記遺伝子（ｄ）において、配列番号１で表される塩基配列との相同性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ法（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）を用いて算出される数値である。
遺伝子構築物
上記のようにして得られるβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、又はそれを含有するプラスミドを基に、更に植物体で発現可能な遺伝子構築物（植物プラスミド又はバイナリーベクター）を調製することができる。
本発明に使用される遺伝子構築物は、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び植物体内で機能する適切なプロモーターの他に、適切なターミネーター（例えば、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、又はＣＭＶ３５Ｓターミネーター等）、発現制御に有用なエレメント、及び／又は形質転換体を選抜するための適切なマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はＧ４１８耐性などの薬剤耐性遺伝子）を含むことができる。
植物体内で機能する適切なプロモーターとは、例えば、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター、又は生育ステージ特異的プロモーター等が挙げられる。構成的プロモーターとは、植物の器官や生育条件等に関係なく、常に一定量発現させるプロモーターであり、例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス・３５Ｓ・プロモーター等が挙げられる。器官特異的プロモーターとは、特定の器官（例えば、根、葉、又は茎など）で特異的に発現させるプロモーターであり、例えば、スポラミンＡプロモーター又はスポラミンＢプロモーター等が挙げられる。生育ステージ特異的プロモーターとは、特定の生育段階（例えば、発芽期又は結実期など）で特異的に発現させるプロモーターである。これらプロモーターは、例えば、使用する宿主、発現させるべき器官・組織、及び／又は生育ステージ等に応じて適切に選択することができる。また、本発明に使用されるプロモーターは、植物内に導入した場合に、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してその下流方向に転写をはじめることができるプロモーターを意味する。好ましくは以下の群から選択される：
（ｉ）カリフラワー・モザイク・ウイルス・３５Ｓ・プロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
例えば、塊根中でβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を発現させるには、サツマイモのスポラミンプロモーターが好ましい。サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ）は貯蔵タンパク質としてスポラミンを産生し、これはサツマイモ塊根の全可溶性タンパク質の６０〜８０％を占めている。このスポラミンをコードする遺伝子は多重遺伝子族を形成しており、その相同性からスポラミンＡ遺伝子とスポラミンＢ遺伝子に分類されている。いずれの遺伝子も塊根で特異的に発現するプロモーターを持つ。また、スポラミンプロモーターは、糖類、特にスクロースで誘導される特徴を有する。
本発明に使用される遺伝子構築物の構築手順は特に限定されるものではないが、例えば、以下のようにして調製することができる。すなわち、アスペルギルス・ニガー由来のβ−フルクトフラノシダーゼｃＤＮＡをｐＢＩ１２１（クローンテック社製）のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に存在するＢａｍＨＩ部位に挿入し、必要に応じてβ−グルクロニダーゼ遺伝子を除去してバイナリーベクターを得ることができる。前記ベクターは、β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子上流にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが、下流にはＴｉプラスミドのヘパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが連結されているので、前記ベクターのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子は植物での発現が可能となる。また、前記ベクターにはカナマイシン耐性遺伝子が存在し、大腸菌等の微生物や植物においてカナマイシン耐性を付与することができる。
β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の植物体への導入、発現
本発明で使用される植物体への遺伝子導入法は特に限定されず、植物細胞又は植物体への遺伝子導入法として当業者に公知のいずれの方法を使用してもよい。例えば、本発明の好適な実施態様の一つとして、遺伝子構築物を植物に導入するためにアグロバクテリムが用いられる。植物を形質転換するためにアグロバクテリウムを用いる場合、導入すべき塩基配列に隣接する位置にＴ−ＤＮＡ領域のボーダー配列を連結させることができる。このようなＴ−ＤＮＡを用いる形質転換ベクターの適切な構築は当業者に公知である。
別の実施態様として、カルシウム及び／若しくはポリエチレングリコールを使用した導入法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法等が挙げられる。
また、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を導入する植物は、特に限定されないが、奸ましくは双子葉植物又は単子葉植物である。より好ましくは、双子葉植物ではナス科又はアカザ科、単子葉植物ではイネ科が挙げられる。更に好ましくは、ナス科タバコ属、アカザ科フダンソウ属、又はイネ科サトウキビ属が挙げられる。特により好ましくは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ビート（サトウダイコン：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｒａｐａ，テーブルビート：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｒｕｂｒａ，フダンソウ：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ，又はベタ・ウルガリス・アルバ：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ａｌｂａ）、若しくはサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、又はこれらのプロトプラストが挙げられる。ビートやサトウキビは、スクロースを貯蔵する植物であり、それらのスクロース貯蔵器官又は組織においてβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子を発現させることにより、フラクトオリゴ糖の生産において特に有利な効果が得られる。
本発明におけるβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物の植物の染色体へ導入する方法は、例えば、以下のようなリーフディスク法（Ｈｏｒｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２２９−１２３２，１９８５）で行うのが好ましい。アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＹＥＰ液体培地において、例えば、２８℃で８〜９時間振盪培養した菌体を、常法に従い、プロトプラスト（コンピテントセル）を調製する。β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を前述のコンピテントセルに加え、緩やかに混ぜた後に氷上に静置する。続いて、２ｍｍ電極幅キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｌｕｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｕｌｓｅｒＴＭ Ｃｕｖｅｔｔｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、エレクトロポレーション装置［例えば、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（Ｒ）ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］で取扱説明書に従ってエレクトロポレーションを行う。処理後の試料にＹＥＰ液体培地を加えて２８℃で２〜４時間静置培養後、抗生物質（例えば、カナマイシン）を含有するＬＢ培地で培養して形質転換体を得ることができる。
この形質転換体をＹＥＰ液体培地で培養し、この培養液を無菌培養した植物の葉から採取したリーフディスクに漬けた後に、茎葉分化培地で培養してカルスを形成、増殖させる。植物用の茎葉分化培地としては、例えば、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｎｇｅとＳｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３−４９７，１９６２）等、公知の培地を使用することができる。その後に選択用の茎葉分化培地を用いて、カルスの選択を行えばよい。例えば、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌを加えたものを使用すればよい。
更に、植物体を再分化させるには、ＭＳ培地等の公知の培地にカナマイシン等を加えた根分化培地を用いて培養すればよい。発根した幼植物体を移植して栽培することにより植物体（トランスジェニック植物）を得ることができる。その種子を栽培し、その子孫植物及びその種子を得ることができる。
なお、本明細書におけるトランスジェニック植物又は子孫植物における用語「植物」には、生物個体の全体としての植物体だけでなく、その一部である器官（例えば、葉、茎、根、花、又は果実等）、組織、及び細胞などが含まれる。
トランスジェニック植物体中のフラクトオリゴ糖の採取・分析
本発明のトランスジェニック植物体内のフラクトオリゴ糖を採取・分析する方法として、例えば、以下のように行うことができる。植物体の各器官（根、茎、又は葉等）を液体窒素中で粉砕して一定量を秤量し、蒸留水を所定量加えて充分に攪拌する。遠心分離により上清を回収し、薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィー等公知の方法で分析することにより、植物体におけるフラクトオリゴ糖の生成・蓄積を確認することができる。
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：タバコへのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の導入
（１）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むバイナリーベクターの調製
国際公開第９７／３４００４号パンフレット実施例Ａ、実施例Ｄ１を参照して調製したプラスミドｐＡＮ１２０（同パンフレット図６）をＢａｍＨＩで消化し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＦＦａｓｅ）ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む約１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）をＢａｍＨＩで消化し、前記のＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結し、ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（２）サツマイモのスポラミンＡプロモーターを含むバイナリーベクターの調製
サツマイモのスポラミンＡプロモーターをＨａｔｔｏｒｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ，“Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，１１巻，１９８８年，ｐ．４１７−４２６に記載の方法に従って調製した。得られたスポラミンＡプロモーターを更にＨｉｎｄＩＩＩで消化し、スポラミンＡプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１ｋｂｐ）を得た。
ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）をＳｍａＩ、ＳａｃＩで消化し、平滑化して自己連結させることにより、β−グルクロニダーゼ遺伝子を除去したプラスミドｐＢＩ１０１−ＧＵＳを得た。
ｐＢＩ１０１−ＧＵＳをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前記のスポラミンＡプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。続けて、連結したプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、実施例１の（１）と同様に調製したＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結し、ｐＢＩ１０１−ＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ部位にスポラミンＡプロモーターが、その下流にあるＢａｍＨＩ部位にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（３）サツマイモのスポラミンＢプロモーターを含むベクターの調製
サツマイモのスポラミンＢプロモーターをＨａｔｔｏｒｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ，“Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，”，１１巻，１９８８年，ｐ．４１７−４２６に記載の方法に従って調製した。得られたスポラミンＢプロモーターを更にＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、スポラミンＢプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（約０．７５ｋｂｐ）を得た。得られた断片を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）のマルチクローニングサイトに挿入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、実施例１の（１）と同様に調製したＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化し、スポラミンＢプロモーターとその下流にＦＦａｓｅ遺伝子を含む約２．７ｋｂｐの断片を得た。続いて、実施例１の（２）に記載の方法に従って調製したプラスミドｐＢＩ１０１−ＧＵＳをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、前記の約２．７ｋｂｐの断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結し、ｐＢＩ１０１−ＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に、スポラミンＢプロモーターとその下流にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（４）タバコへの遺伝子導入と植物体再生
アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（プラスミド，７巻，１９８２年，ｐ．１５）をＹＥＰ液体培地（ストレプトマイシン添加）２５０ｍＬにおいて２８℃で８〜９時間振盪培養した（Ｏ．Ｄ．６００＝０．５まで）。
遠心分離した菌体に氷冷１０％グリセロール溶液［９．３１％（Ｗ／Ｖ）スクロース、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム］２００ｍＬを加えて懸濁する操作を３回繰り返した。更に、氷冷１０％グリセロール溶液２０〜３０ｍＬを加え懸濁して遠心分離し、得られた菌体に氷冷１０％グリセロール溶液４００〜６００μＬを加えて懸濁し、液体窒素で瞬間凍結してコンピテントセルとした。
実施例１の（１）、（２）、及び（３）で調製した３種のバイナリーベクターＤＮＡ各１μＬを、それぞれ前記コンピテントセル５０μＬに加え、緩やかに混ぜた後３０秒以上氷上に静置後、２ｍｍ電極幅キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｌｕｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｕｌｓｅｒＴＭ Ｃｕｖｅｔｔｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、エレクトロポレーション装置［ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（Ｒ）ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］で取扱説明書に従ってエレクトロポレーションを行った。処理後の各試料にＹＥＰ液体培地１ｍＬを加えて２８℃で２〜４時間静置培養した後、カナマイシンを含有するＬＢ培地で培養して、３種のバイナリーベクターＤＮＡの各々で形質転換された形質転換体を得た。
得られた各形質転換体をＹＥＰ液体培地において２８℃で振盪培養して培養液を得た（Ｏ．Ｄ．５５０＝１．０まで培養）。無菌培養したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ株）の無菌葉から切り出したリーフディスク（５〜７ｍｍ四方）をＭＳ液体培地に浸し、前記培養液を加え、３０分間静置した。
前記リーフディスクから、余分な培養液を滅菌済みの濾紙で除去し、ＭＳシュート分化培地Ａに葉の裏面を上にして植え、２５℃暗所にて３〜４日間培養した。リーフディスクをＭＳシュート分化培地Ｂに植え替え、２５℃で１６時間明所／８時間暗所で培養した。３〜４週間で新しいＭＳシュート分化培地Ｂに植え替え、シュートが１ｃｍくらいまで伸びた後、シュートのみをＭＳシュート分化培地Ｃに植え替え、完全な植物体を得た。その後は、ＭＳ寒天培地に植え継いだ。なお、前記ＭＳシュート分化培地Ａ〜Ｃは、ＭＳ培地に、それぞれ以下に示す化合物を添加した培地である。
（５）タバコ植物体へのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子導入の確認
（５ａ）タバコ植物体からの全ＤＮＡ単離
実施例１の（１）、（２）、及び（３）のバイナリーベクターを用いて各々得られたタバコ植物体の葉組織５０〜１００ｍｇを採取し、−８０℃で冷凍した後、１００μＬの抽出用緩衝液を加えて解凍した。
超音波破砕機で葉組織を１〜２分間磨砕した後、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の取扱説明書に記載の方法に従ってタバコ植物体の全ＤＮＡを得た。
（５ｂ）ＰＣＲ法による導入遺伝子の検出
β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子を導入した領域の上流・下流となる領域の配列をもとにプライマーを設計した。
実施例１の（１）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域３‘側、及びｎｏｓ−Ｔｅｒ．領域５’側の配列をもとに、以下のプライマーを設計した。
実施例１の（２）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、上流側にサツマイモ由来スポラミンＡプロモーターを調製する際に用いたプライマー（ＳＰＯＡ１Ｓ）、下流側にβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子配列の下流領域をもとに設計したプライマー（ＦＦａｓｅＲｅｖ）を使用した。
実施例１の（３）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、上流側にサツマイモ由来スポラミンＢプロモーターを調製する際に用いたプライマー（ＳＰＯＢ１Ｓ２）、下流側にβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子配列の下流領域をもとに設計したプライマー（前記のＦＦａｓｅＲｅｖ：配列番号５）を使用した。
実施例１の（５ａ）で調製した、各植物体の全ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応を行い、増幅された遺伝子断片を観察した。実施例１の（１）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の全ＤＮＡからは、β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子（約１．９ｋｂｐ）＋ＧＵＳ遺伝子（約２ｋｂｐ）の合計約４ｋｂｐの断片が確認された。また、実施例１の（２）又は（３）のバイナリーベクターを用いて得られた各植物体の全ＤＮＡからは、スポラミンプロモーター（約１ｋｂｐ）＋β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子（約１．９ｋｂｐ）の合計約３ｋｂｐの断片がそれぞれ確認された。
実施例２：タバコ植物体内のフラクトオリゴ糖の分析
実施例１の（３）のバイナリーベクター（サツマイモのスポラミンＢプロモーターを含有する）を用いて、実施例１の（４）に記載の方法で得られたタバコ形質転換体の茎中のフラクトオリゴ糖を以下のように分析した。同様の方法で、形質転換を行っていないタバコ親株についても分析を行った。
３０ｃｍ以上に成長したタバコ植物体の茎下部約１．５ｇ生重量を液体窒素存在下で磨砕し、純水１．５ｍＬを加えて撹拌した。８０℃〜８５℃で１．５時間保温後、遠心分離した上清を分析に供した。高速液体クロマトグラフィー分析は、検出器：示差屈折計４１０（Ｗａｔｅｒｓ社製）、カラム：ハイバーリクロカート２５０−４リクロスフェア１００ＮＨ２ ４ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（関東化学社製）を用いて行い、分析条件は、移動相：アセトニトリル：水＝７２：２８、流速：毎分１．０ｍＬ、温度：４０℃で行った。その結果を表１に示した。
フラクトオリゴ糖を全く生産しないタバコの茎中において、本発明の方法で形質転換されたタバコ（トランスジェニック植物）はフラクトオリゴ糖の成分である１−ケストース（ＧＦ２）及びニストース（ＧＦ３）を顕著に生成・蓄積していることが確認された。また、表１には示していないが、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースは検出されなかった。
実施例３：ビートへのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の導入及びビート植物体内のフラクトオリゴ糖の分析
実施例１（４）と同様にアグロバクテリウム法によりフルクトフラノシダーゼ遺伝子をビートに導入した。なお、導入するβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子としては、実施例１（１）で調製したバイナリーベクターを使用した。
遺伝子導入後の植物個体再生までの操作は、以下に示すとおり、使用した培地を若干変更したこと以外は、実施例１（４）と同様に実施した。すなわち、ビート葉から切り出したリーフディスクに遺伝子を導入した後、ＭＳシュート分化培地Ｄで培養し、ＭＳシュート分化培地Ｅに植え替え、シュートが充分に１ｃｍ以上に生育してから、ＭＳシュート分化培地Ｃに植え替え、植物個体の再生を行った。なお、前記ＭＳシュート分化培地Ｄ及びＥは、ＭＳ培地に、それぞれ以下に示す化合物を添加した培地である。
ビート植物体の葉０．３ｇＦＷ（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）を液体窒素存在下で磨砕し、純水１ｍＬを加えて撹拌した。８０〜８５℃で１．５時間保温後、遠心分離した上清を実施例２と同じＨＰＬＣ分析に供した。その結果、０．１５μｍｏｌ／ｇＦＷの１−ケストースが検出された。また、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースは検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、フラクトオリゴ糖を植物体内に高含量かつ高純度で蓄積させたトランスジェニック植物が得られ、フラクトオリゴ糖を効率よく産生することができる。
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２〜６の配列で表される各塩基配列は、それぞれ、プライマーＣＡＭＶ３５Ｓ、プライマーｎｏｓ−Ｔｅｒ、プライマーＳＰＯＡ１Ｓ、プライマーＦＦａｓｅＲｅｖ、及びプライマーＳＰＯＢ１Ｓ２である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【技術分野】
本発明は、フラクトオリゴ糖を高純度かつ高含量で蓄積するトランスジェニック植物及びその作出方法に関する。より具体的には、例えば、カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を植物で発現させ、１−ケストース、ニストース、又は１−フルクトフラノシルニストースの少なくとも１つの成分を蓄積するトランスジェニック植物の作出方法に関する。
【背景技術】
フラクトオリゴ糖は、スクロースにフルクトースがβ２→１結合で結合したオリゴ糖類であり、その還元末端はグルコースである。フラクトオリゴ糖は、難う蝕性や、ビフィズス菌増殖促進作用、コレステロールなどの脂質代謝改善作用、免疫調節作用など様々な生理機能を有することが明らかになっており、機能性食品素材として産業上極めて有用である。フラクトオリゴ糖は、自然界では広く植物に分布しており、例えば、アスパラガス、タマネギ、キクイモ、又は蜂蜜などに含まれていることが知られているが、その含有量は低く、タマネギで２．８ｇ／１００ｇ程度といわれている。
近年、微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼの転移反応を利用して、スクロースからフラクトオリゴ糖を大量に製造する技術が確立され、工業的に生産されている。工業的に使用されているカビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、転移活性が高いことや異性体がほとんど生成しないことが特徴であり、スクロースを基質とした酵素反応を行うことにより、重合度３〜６のフラクトオリゴ糖を効率よく生成する。更に、カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼを改変することにより、親β−フルクトフラノシダーゼにより生成するフラクトオリゴ糖の組成と異なる組成のフラクトオリゴ糖を生成するβ−フルクトフラノシダーゼ変異体が得られている［国際公開第９７／３４００４号パンフレット（特許文献１）］。
一方、植物に特定の遺伝子を導入して形質転換させる技術は、アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いてタバコに遺伝子が導入されて以来、多くの有用形質を付与した作物が作出されてきた。また、植物に有用成分を蓄積させる試みも行われ、フラクトオリゴ糖を植物に蓄積させた例も公知となっている［国際公開第９６／０１９０４号パンフレット（特許文献２）、国際公開第０３／００８５４号パンフレット（特許文献３）、“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”１６巻，１９９８年，ｐ．８４３−８４６（非特許文献１）］。
しかしながら、前記の先行例におけるフラクトオリゴ糖の生成量は微量であり、また、フラクトオリゴ糖の異性体、例えば、１−ケストースの異性体であるネオケストースや６−ケストースが生成されている［特許文献２，ｐ．５６−５９，図１７Ａ・図１７Ｂ、特許文献３］。また、貯蔵糖がスクロースであるビートの形質転換体の根及び葉における蓄積量は、それぞれ、１−ケストースが７３．８μｍｏｌ／ｇ ＦＷ（３．７％）及び０．１μｍｏｌ／ｇ ＦＷ程度である［非特許文献１］。
【特許文献１】国際公開第９７／３４００４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／０１９０４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００８５４号パンフレット
【非特許文献１】“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”１６巻，１９９８年，ｐ．８４３−８４６
【発明の開示】
微生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて発酵生産を行う従来のフラクトオリゴ糖製造法は、製造コストが高いばかりでなく、単糖（グルコース）が副生産物として生成されるため、オリゴ糖の特長である整腸作用・難う蝕性・低カロリー等の生理的機能を損なう問題があった。そのため、クロマト分画等により単糖類を除去する工程が必要となり、更に製造コストを増大することも問題であった。これらの問題点を解決するために、効率よく、より高純度のフラクトオリゴ糖を生成させる方法が望まれている。
植物にフラクトオリゴ糖を蓄積させる方法も試みられているが、高純度のフラクトオリゴ糖、特に、その構成成分である１−ケストース、ニストース、及び／又は１−フルクトフラノシルニストースを高含量でかつ高純度に蓄積するトランスジェニック植物はいまだに報告されていない。
本発明者らは、これまでに植物における発現の報告がされていなかったアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を用いて、種々の検討を重ね、植物の形質転換が可能な遺伝子構築物を調製した。更に、この遺伝子構築物を用いて植物を形質転換し、植物体として再生させることにより、フラクトオリゴ糖を蓄積できるトランスジェニック植物を作出した。通常、タバコはフラクトオリゴ糖を生成しないが、本発明のトランスジェニック植物の一例であるタバコは、約３〜４μｍｏｌ／ｇもの１−ケストースを生産、蓄積し、更に、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースが検出されないという、これまでにない特性を有する。また、本発明のトランスジェニック植物の別の一例であるビートは、その葉中に約０．１５μｍｏｌ／ｇの１−ケストースを生産、蓄積し、更に、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースが検出されないという、これまでにない特性を有する。
従って、本発明は、スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼを含む遺伝子構築物で植物を形質転換し、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法、並びに前記方法で作出されたトランスジェニック植物、その子孫植物、及びそれらの種子を提供するものである。更に、本発明のトランスジェニック植物、その子孫植物、及びそれらの種子を用いたフラクトオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物で植物を形質転換する工程を含む、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法。
（２）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来である、（１）に記載の方法。
（３）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来である、（２）に記載の方法。
（４）β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、下記からなる群より選択される、（１）に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
（５）遺伝子構築物が、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター又は生育ステージ特異的プロモーターに機能し得るように連結されたβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含んでなる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）プロモーターが、下記からなる群より選択される、（５）に記載の方法：
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
（７）トランスジェニック植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）トランスジェニック植物が、ナス科、アカザ科又はイネ科に属する植物である、（７）に記載の方法。
（９）トランスジェニック植物が、タバコ属、フダンソウ属、又はサトウキビ属に属する植物である、（８）に記載の方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法により作出されたトランスジェニック植物又はその子孫植物。
（１１）（１０）に記載のトランスジェニック植物又はその子孫植物の種子。
（１２）（１０）に記載の植物若しくは子孫植物又は（１１）に記載の種子を栽培する工程、及び植物体内に蓄積されたフラクトオリゴ糖を採取する工程を含んでなる、フラクトオリゴ糖の製造法。
【発明を実施するための最良の形態】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子
β−フルクトフラノシダーゼは、ＩＵＢＭＢ（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）による分類でＥＣ３．２．１．２６に分類されている加水分解酵素の１つである。本発明で用いることのできるβ−フルクトフラノシダーゼは、スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼである限り、特に限定されるものではない。
本発明におけるフラクトオリゴ糖とは、スクロースにフルクトースがβ２→１結合で重合した重合度３以上のフルクタンであり、還元末端にはグルコースが結合している。重合度３のフルクタンが１−ケストース、重合度４のフルクタンがニストース、重合度５のフルクタンが１−フルクトフラノシルニストースである。本発明では、特に重合度３〜５のフラクトオリゴ糖を効率よく生産することを目的としている。
そこで、本発明では、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の選定が重要となる。カビ由来のβ−フルクトフラノシダーゼは、植物や細菌由来のフラクトオリゴ糖生成酵素と比較して、比活性が高く、広いｐＨ領域と温度領域で作用するために効率よくフラクトオリゴ糖を生成し、異性体の生成がほとんど見られないという好ましい特徴を有する。
本発明における好適なβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子として、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。より好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来の遺伝子が挙げられる。具体的な例として、国際公開第９７／３４００４号パンフレットに記載のアスペルギルス・ニガー ＡＣＥ−２−１（ＡＴＣＣ２０６１１）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号２）、ペニシリウム・ロッケフォルチ（ＩＡＭ７２５４）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号１２）、及びスコプラリオプシス・ブレビカウリス（ＩＦＯ４８４３）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号１４）、並びに国際公開第９９／１３０５９号パンフレットに記載のペニシリウム・ロッケフォルチ（ＩＡＭ７２５４）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号２）、及びスコプラリオプシス・ブレビカウリス（ＩＦＯ４８４３）由来の酵素をコードする遺伝子（同パンフレット配列番号４）が挙げられる。
また、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、下記からなる群より選択することができる：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
前記遺伝子（ｂ）は、配列番号１で表わされる塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子である限り、特に限定されるものではない。前記遺伝子（ｂ）としては、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に、適当なマーカー配列及び／又は融合用パートナーをコードする塩基配列が付加された塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
前記遺伝子（ｃ）において、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数は、具体的には１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個である。
より具体的には、国際公開第９７／３４００４号パンフレットの実施例Ｄ１〜Ｄ１１に記載されている方法で得られる変異体をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼの各種変異体である、Ｆ１７０Ｗ変異体、Ｇ３００Ｗ変異体、Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｅ３８６Ｋ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｒ変異体、Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｅ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｇ３００Ｄ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｗ＋Ｈ３１３Ｋ変異体、又はＦ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ変異体を挙げることができる。なお、前記変異体の名称は、
原アミノ酸：位置：置換アミノ酸
を意味しており、例えば、１７０番目のフェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）に置換したものは「Ｆ１７０Ｗ」として示される。また、多数の変異は、記号「＋」によって表わされ、例えば、「Ｆ１７０Ｗ＋Ｇ３００Ｖ＋Ｈ３１３Ｋ」は、１７０、３００、及び３１３番目のアミノ酸であるフェニルアラニン、グリシン（Ｇ）、及びヒスチジン（Ｈ）が、それぞれトリプトファン、バリン（Ｖ）、及びリジン（Ｋ）に置換されていることを示す。
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子は、好ましくは国際公開第９７／３４００４号パンフレット又は国際公開第９９／１３０５９号パンフレットに記載の方法に従って調製することができる。より具体的には、国際公開第９７／３４００４号パンフレット実施例Ａ、実施例Ｄ１を参照してプラスミドｐＡＮ１２０（同パンフレット図６）を調製した後、ＢａｍＨＩで消化することにより、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＦＦａｓｅ）ｃＤＮＡを得ることができる。
前記遺伝子（ｄ）において、配列番号１で表される塩基配列との相同性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ法（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）を用いて算出される数値である。
遺伝子構築物
上記のようにして得られるβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、又はそれを含有するプラスミドを基に、更に植物体で発現可能な遺伝子構築物（植物プラスミド又はバイナリーベクター）を調製することができる。
本発明に使用される遺伝子構築物は、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び植物体内で機能する適切なプロモーターの他に、適切なターミネーター（例えば、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、又はＣＭＶ３５Ｓターミネーター等）、発現制御に有用なエレメント、及び／又は形質転換体を選抜するための適切なマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はＧ４１８耐性などの薬剤耐性遺伝子）を含むことができる。
植物体内で機能する適切なプロモーターとは、例えば、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター、又は生育ステージ特異的プロモーター等が挙げられる。構成的プロモーターとは、植物の器官や生育条件等に関係なく、常に一定量発現させるプロモーターであり、例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス・３５Ｓ・プロモーター等が挙げられる。器官特異的プロモーターとは、特定の器官（例えば、根、葉、又は茎など）で特異的に発現させるプロモーターであり、例えば、スポラミンＡプロモーター又はスポラミンＢプロモーター等が挙げられる。生育ステージ特異的プロモーターとは、特定の生育段階（例えば、発芽期又は結実期など）で特異的に発現させるプロモーターである。これらプロモーターは、例えば、使用する宿主、発現させるべき器官・組織、及び／又は生育ステージ等に応じて適切に選択することができる。また、本発明に使用されるプロモーターは、植物内に導入した場合に、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してその下流方向に転写をはじめることができるプロモーターを意味する。好ましくは以下の群から選択される：
（ｉ）カリフラワー・モザイク・ウイルス・３５Ｓ・プロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
例えば、塊根中でβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を発現させるには、サツマイモのスポラミンプロモーターが好ましい。サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ）は貯蔵タンパク質としてスポラミンを産生し、これはサツマイモ塊根の全可溶性タンパク質の６０〜８０％を占めている。このスポラミンをコードする遺伝子は多重遺伝子族を形成しており、その相同性からスポラミンＡ遺伝子とスポラミンＢ遺伝子に分類されている。いずれの遺伝子も塊根で特異的に発現するプロモーターを持つ。また、スポラミンプロモーターは、糖類、特にスクロースで誘導される特徴を有する。
本発明に使用される遺伝子構築物の構築手順は特に限定されるものではないが、例えば、以下のようにして調製することができる。すなわち、アスペルギルス・ニガー由来のβ−フルクトフラノシダーゼｃＤＮＡをｐＢＩ１２１（クローンテック社製）のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に存在するＢａｍＨＩ部位に挿入し、必要に応じてβ−グルクロニダーゼ遺伝子を除去してバイナリーベクターを得ることができる。前記ベクターは、β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子上流にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが、下流にはＴｉプラスミドのヘパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが連結されているので、前記ベクターのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子は植物での発現が可能となる。また、前記ベクターにはカナマイシン耐性遺伝子が存在し、大腸菌等の微生物や植物においてカナマイシン耐性を付与することができる。
β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の植物体への導入、発現
本発明で使用される植物体への遺伝子導入法は特に限定されず、植物細胞又は植物体への遺伝子導入法として当業者に公知のいずれの方法を使用してもよい。例えば、本発明の好適な実施態様の一つとして、遺伝子構築物を植物に導入するためにアグロバクテリムが用いられる。植物を形質転換するためにアグロバクテリウムを用いる場合、導入すべき塩基配列に隣接する位置にＴ−ＤＮＡ領域のボーダー配列を連結させることができる。このようなＴ−ＤＮＡを用いる形質転換ベクターの適切な構築は当業者に公知である。
別の実施態様として、カルシウム及び／若しくはポリエチレングリコールを使用した導入法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法等が挙げられる。
また、β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を導入する植物は、特に限定されないが、奸ましくは双子葉植物又は単子葉植物である。より好ましくは、双子葉植物ではナス科又はアカザ科、単子葉植物ではイネ科が挙げられる。更に好ましくは、ナス科タバコ属、アカザ科フダンソウ属、又はイネ科サトウキビ属が挙げられる。特により好ましくは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ビート（サトウダイコン：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｒａｐａ，テーブルビート：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｒｕｂｒａ，フダンソウ：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ，又はベタ・ウルガリス・アルバ：Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ．ａｌｂａ）、若しくはサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、又はこれらのプロトプラストが挙げられる。ビートやサトウキビは、スクロースを貯蔵する植物であり、それらのスクロース貯蔵器官又は組織においてβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子を発現させることにより、フラクトオリゴ糖の生産において特に有利な効果が得られる。
本発明におけるβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物の植物の染色体へ導入する方法は、例えば、以下のようなリーフディスク法（Ｈｏｒｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２２９−１２３２，１９８５）で行うのが好ましい。アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＹＥＰ液体培地において、例えば、２８℃で８〜９時間振盪培養した菌体を、常法に従い、プロトプラスト（コンピテントセル）を調製する。β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を前述のコンピテントセルに加え、緩やかに混ぜた後に氷上に静置する。続いて、２ｍｍ電極幅キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｌｕｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｕｌｓｅｒＴＭ Ｃｕｖｅｔｔｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、エレクトロポレーション装置［例えば、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（Ｒ）ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］で取扱説明書に従ってエレクトロポレーションを行う。処理後の試料にＹＥＰ液体培地を加えて２８℃で２〜４時間静置培養後、抗生物質（例えば、カナマイシン）を含有するＬＢ培地で培養して形質転換体を得ることができる。
この形質転換体をＹＥＰ液体培地で培養し、この培養液を無菌培養した植物の葉から採取したリーフディスクに漬けた後に、茎葉分化培地で培養してカルスを形成、増殖させる。植物用の茎葉分化培地としては、例えば、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｎｇｅとＳｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３−４９７，１９６２）等、公知の培地を使用することができる。その後に選択用の茎葉分化培地を用いて、カルスの選択を行えばよい。例えば、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌを加えたものを使用すればよい。
更に、植物体を再分化させるには、ＭＳ培地等の公知の培地にカナマイシン等を加えた根分化培地を用いて培養すればよい。発根した幼植物体を移植して栽培することにより植物体（トランスジェニック植物）を得ることができる。その種子を栽培し、その子孫植物及びその種子を得ることができる。
なお、本明細書におけるトランスジェニック植物又は子孫植物における用語「植物」には、生物個体の全体としての植物体だけでなく、その一部である器官（例えば、葉、茎、根、花、又は果実等）、組織、及び細胞などが含まれる。
トランスジェニック植物体中のフラクトオリゴ糖の採取・分析
本発明のトランスジェニック植物体内のフラクトオリゴ糖を採取・分析する方法として、例えば、以下のように行うことができる。植物体の各器官（根、茎、又は葉等）を液体窒素中で粉砕して一定量を秤量し、蒸留水を所定量加えて充分に攪拌する。遠心分離により上清を回収し、薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィー等公知の方法で分析することにより、植物体におけるフラクトオリゴ糖の生成・蓄積を確認することができる。
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：タバコへのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の導入
（１）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むバイナリーベクターの調製
国際公開第９７／３４００４号パンフレット実施例Ａ、実施例Ｄ１を参照して調製したプラスミドｐＡＮ１２０（同パンフレット図６）をＢａｍＨＩで消化し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ２０６１１株由来のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＦＦａｓｅ）ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む約１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）をＢａｍＨＩで消化し、前記のＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結し、ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（２）サツマイモのスポラミンＡプロモーターを含むバイナリーベクターの調製
サツマイモのスポラミンＡプロモーターをＨａｔｔｏｒｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ，“Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，１１巻，１９８８年，ｐ．４１７−４２６に記載の方法に従って調製した。得られたスポラミンＡプロモーターを更にＨｉｎｄＩＩＩで消化し、スポラミンＡプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１ｋｂｐ）を得た。
ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）をＳｍａＩ、ＳａｃＩで消化し、平滑化して自己連結させることにより、β−グルクロニダーゼ遺伝子を除去したプラスミドｐＢＩ１０１−ＧＵＳを得た。
ｐＢＩ１０１−ＧＵＳをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前記のスポラミンＡプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。続けて、連結したプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、実施例１の（１）と同様に調製したＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結し、ｐＢＩ１０１−ＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ部位にスポラミンＡプロモーターが、その下流にあるＢａｍＨＩ部位にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（３）サツマイモのスポラミンＢプロモーターを含むベクターの調製
サツマイモのスポラミンＢプロモーターをＨａｔｔｏｒｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ，“Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，”，１１巻，１９８８年，ｐ．４１７−４２６に記載の方法に従って調製した。得られたスポラミンＢプロモーターを更にＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、スポラミンＢプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（約０．７５ｋｂｐ）を得た。得られた断片を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）のマルチクローニングサイトに挿入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、実施例１の（１）と同様に調製したＦＦａｓｅ ｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結した。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化し、スポラミンＢプロモーターとその下流にＦＦａｓｅ遺伝子を含む約２．７ｋｂｐの断片を得た。続いて、実施例１の（２）に記載の方法に従って調製したプラスミドｐＢＩ１０１−ＧＵＳをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、前記の約２．７ｋｂｐの断片とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて連結し、ｐＢＩ１０１−ＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に、スポラミンＢプロモーターとその下流にＦＦａｓｅ遺伝子が挿入されたバイナリーベクターを作製した。
（４）タバコへの遺伝子導入と植物体再生
アグロバクテリウム・テュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（プラスミド，７巻，１９８２年，ｐ．１５）をＹＥＰ液体培地（ストレプトマイシン添加）２５０ｍＬにおいて２８℃で８〜９時間振盪培養した（Ｏ．Ｄ．６００＝０．５まで）。
遠心分離した菌体に氷冷１０％グリセロール溶液［９．３１％（Ｗ／Ｖ）スクロース、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム］２００ｍＬを加えて懸濁する操作を３回繰り返した。更に、氷冷１０％グリセロール溶液２０〜３０ｍＬを加え懸濁して遠心分離し、得られた菌体に氷冷１０％グリセロール溶液４００〜６００μＬを加えて懸濁し、液体窒素で瞬間凍結してコンピテントセルとした。
実施例１の（１）、（２）、及び（３）で調製した３種のバイナリーベクターＤＮＡ各１μＬを、それぞれ前記コンピテントセル５０μＬに加え、緩やかに混ぜた後３０秒以上氷上に静置後、２ｍｍ電極幅キュベット（Ｇｅｎｅ Ｐｌｕｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｕｌｓｅｒＴＭ Ｃｕｖｅｔｔｅ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に移し、エレクトロポレーション装置［ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（Ｒ）ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ，ＢＩＯ−ＲＡＤ社製］で取扱説明書に従ってエレクトロポレーションを行った。処理後の各試料にＹＥＰ液体培地１ｍＬを加えて２８℃で２〜４時間静置培養した後、カナマイシンを含有するＬＢ培地で培養して、３種のバイナリーベクターＤＮＡの各々で形質転換された形質転換体を得た。
得られた各形質転換体をＹＥＰ液体培地において２８℃で振盪培養して培養液を得た（Ｏ．Ｄ．５５０＝１．０まで培養）。無菌培養したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ株）の無菌葉から切り出したリーフディスク（５〜７ｍｍ四方）をＭＳ液体培地に浸し、前記培養液を加え、３０分間静置した。
前記リーフディスクから、余分な培養液を滅菌済みの濾紙で除去し、ＭＳシュート分化培地Ａに葉の裏面を上にして植え、２５℃暗所にて３〜４日間培養した。リーフディスクをＭＳシュート分化培地Ｂに植え替え、２５℃で１６時間明所／８時間暗所で培養した。３〜４週間で新しいＭＳシュート分化培地Ｂに植え替え、シュートが１ｃｍくらいまで伸びた後、シュートのみをＭＳシュート分化培地Ｃに植え替え、完全な植物体を得た。その後は、ＭＳ寒天培地に植え継いだ。なお、前記ＭＳシュート分化培地Ａ〜Ｃは、ＭＳ培地に、それぞれ以下に示す化合物を添加した培地である。
（５）タバコ植物体へのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子導入の確認
（５ａ）タバコ植物体からの全ＤＮＡ単離
実施例１の（１）、（２）、及び（３）のバイナリーベクターを用いて各々得られたタバコ植物体の葉組織５０〜１００ｍｇを採取し、−８０℃で冷凍した後、１００μＬの抽出用緩衝液を加えて解凍した。
超音波破砕機で葉組織を１〜２分間磨砕した後、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の取扱説明書に記載の方法に従ってタバコ植物体の全ＤＮＡを得た。
（５ｂ）ＰＣＲ法による導入遺伝子の検出
β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子を導入した領域の上流・下流となる領域の配列をもとにプライマーを設計した。
実施例１の（１）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域３‘側、及びｎｏｓ−Ｔｅｒ．領域５’側の配列をもとに、以下のプライマーを設計した。
実施例１の（２）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、上流側にサツマイモ由来スポラミンＡプロモーターを調製する際に用いたプライマー（ＳＰＯＡ１Ｓ）、下流側にβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子配列の下流領域をもとに設計したプライマー（ＦＦａｓｅＲｅｖ）を使用した。
実施例１の（３）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の検出用プライマーとして、上流側にサツマイモ由来スポラミンＢプロモーターを調製する際に用いたプライマー（ＳＰＯＢ１Ｓ２）、下流側にβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子配列の下流領域をもとに設計したプライマー（前記のＦＦａｓｅＲｅｖ：配列番号５）を使用した。
実施例１の（５ａ）で調製した、各植物体の全ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ反応を行い、増幅された遺伝子断片を観察した。実施例１の（１）のバイナリーベクターを用いて得られた植物体の全ＤＮＡからは、β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子（約１．９ｋｂｐ）＋ＧＵＳ遺伝子（約２ｋｂｐ）の合計約４ｋｂｐの断片が確認された。また、実施例１の（２）又は（３）のバイナリーベクターを用いて得られた各植物体の全ＤＮＡからは、スポラミンプロモーター（約１ｋｂｐ）＋β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子（約１．９ｋｂｐ）の合計約３ｋｂｐの断片がそれぞれ確認された。
実施例２：タバコ植物体内のフラクトオリゴ糖の分析
実施例１の（３）のバイナリーベクター（サツマイモのスポラミンＢプロモーターを含有する）を用いて、実施例１の（４）に記載の方法で得られたタバコ形質転換体の茎中のフラクトオリゴ糖を以下のように分析した。同様の方法で、形質転換を行っていないタバコ親株についても分析を行った。
３０ｃｍ以上に成長したタバコ植物体の茎下部約１．５ｇ生重量を液体窒素存在下で磨砕し、純水１．５ｍＬを加えて撹拌した。８０℃〜８５℃で１．５時間保温後、遠心分離した上清を分析に供した。高速液体クロマトグラフィー分析は、検出器：示差屈折計４１０（Ｗａｔｅｒｓ社製）、カラム：ハイバーリクロカート２５０−４リクロスフェア１００ＮＨ２ ４ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ（関東化学社製）を用いて行い、分析条件は、移動相：アセトニトリル：水＝７２：２８、流速：毎分１．０ｍＬ、温度：４０℃で行った。その結果を表１に示した。
フラクトオリゴ糖を全く生産しないタバコの茎中において、本発明の方法で形質転換されたタバコ（トランスジェニック植物）はフラクトオリゴ糖の成分である１−ケストース（ＧＦ２）及びニストース（ＧＦ３）を顕著に生成・蓄積していることが確認された。また、表１には示していないが、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースは検出されなかった。
実施例３：ビートへのβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の導入及びビート植物体内のフラクトオリゴ糖の分析
実施例１（４）と同様にアグロバクテリウム法によりフルクトフラノシダーゼ遺伝子をビートに導入した。なお、導入するβ−フルクトフラノシダーゼ遺伝子としては、実施例１（１）で調製したバイナリーベクターを使用した。
遺伝子導入後の植物個体再生までの操作は、以下に示すとおり、使用した培地を若干変更したこと以外は、実施例１（４）と同様に実施した。すなわち、ビート葉から切り出したリーフディスクに遺伝子を導入した後、ＭＳシュート分化培地Ｄで培養し、ＭＳシュート分化培地Ｅに植え替え、シュートが充分に１ｃｍ以上に生育してから、ＭＳシュート分化培地Ｃに植え替え、植物個体の再生を行った。なお、前記ＭＳシュート分化培地Ｄ及びＥは、ＭＳ培地に、それぞれ以下に示す化合物を添加した培地である。
ビート植物体の葉０．３ｇＦＷ（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）を液体窒素存在下で磨砕し、純水１ｍＬを加えて撹拌した。８０〜８５℃で１．５時間保温後、遠心分離した上清を実施例２と同じＨＰＬＣ分析に供した。その結果、０．１５μｍｏｌ／ｇＦＷの１−ケストースが検出された。また、１−ケストースの異性体、すなわち、６−ケストース及びネオケストースは検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、フラクトオリゴ糖を植物体内に高含量かつ高純度で蓄積させたトランスジェニック植物が得られ、フラクトオリゴ糖を効率よく産生することができる。
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２〜６の配列で表される各塩基配列は、それぞれ、プライマーＣＡＭＶ３５Ｓ、プライマーｎｏｓ−Ｔｅｒ、プライマーＳＰＯＡ１Ｓ、プライマーＦＦａｓｅＲｅｖ、及びプライマーＳＰＯＢ１Ｓ２である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物で植物を形質転換する工程を含む、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法。
【請求項２】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、下記からなる群より選択される、請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
遺伝子構築物が、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター、又は生育ステージ特異的プロモーターに機能し得るように連結されたβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーターが、下記からなる群より選択される、請求項５に記載の方法：
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
【請求項７】
トランスジェニック植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
トランスジェニック植物が、ナス科、アカザ科、又はイネ科に属する植物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トランスジェニック植物が、タバコ属、フダンソウ属、又はサトウキビ属に属する植物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により作出されたトランスジェニック植物又はその子孫植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物又はその子孫植物の種子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の植物若しくは子孫植物又は請求項１１に記載の種子を栽培する工程、及び植物体内に蓄積されたフラクトオリゴ糖を採取する工程を含む、フラクトオリゴ糖の製造法。
【請求項１】
スクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子構築物で植物を形質転換する工程を含む、フラクトオリゴ糖を蓄積するトランスジェニック植物を作出する方法。
【請求項２】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物由来、又はスコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属に属する微生物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
β−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子が、下記からなる群より選択される、請求項１に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子、及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と８５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつスクロースをフラクトオリゴ糖に変換する作用を有するβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
遺伝子構築物が、構成的プロモーター、器官特異的プロモーター、又は生育ステージ特異的プロモーターに機能し得るように連結されたβ−フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーターが、下記からなる群より選択される、請求項５に記載の方法：
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、
（ｉｉ）サツマイモのスポラミンＡプロモーター、及び
（ｉｉｉ）サツマイモのスポラミンＢプロモーター。
【請求項７】
トランスジェニック植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
トランスジェニック植物が、ナス科、アカザ科、又はイネ科に属する植物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トランスジェニック植物が、タバコ属、フダンソウ属、又はサトウキビ属に属する植物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により作出されたトランスジェニック植物又はその子孫植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物又はその子孫植物の種子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の植物若しくは子孫植物又は請求項１１に記載の種子を栽培する工程、及び植物体内に蓄積されたフラクトオリゴ糖を採取する工程を含む、フラクトオリゴ糖の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９６６
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３０４２（Ｐ２００５−５０３０４２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２５６４
【国際出願日】平成１６年３月２日（２００４．３．２）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２５６４
【国際出願日】平成１６年３月２日（２００４．３．２）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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