フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法
例えば、配列番号：２または配列番号７０に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を提供する。この４’ＣＧＴ遺伝子とＡＳ遺伝子を、本来オーロン類合成能のない植物において共発現することにより、オーロン類を蓄積することに成功し、花色が黄色味を帯びた色に変化した。さらに、両遺伝子の発現に加えて、宿主植物自身のフラボノイド色素合成系を制御することで、より鮮明な黄色の花を得ることができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はカルコン類に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および当該遺伝子を利用して花色が変換された植物に関するものである。更に詳しくは、カルコン類の４’位配糖体を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくはゴマノハグサ科由来の、より好ましくはキンギョソウあるいはリナリア由来のカルコン類の４’位配糖体を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びこれらの遺伝子とオーレウシジン合成酵素（以下、ＡＳという）遺伝子を単独または同時に発現させカルコン類またはオーロン類を蓄積させることにより花の色を改変する手法、好ましくは黄色く改変する手法に関するものである。
【背景技術】
花色は人が花卉を鑑賞あるいは購入する際に重要な形質であり、古くから様々な色の花が育種されてきた。単一の種ですべての色の花をもつ場合はむしろ稀であるが、これは花色として発現する色素の生合成が遺伝的に規定されていることによる。交配育種では利用できる遺伝子資源が交配可能な近縁種に限定されているため、交配によって目的の種においてすべての色の花を作ることは実質的に不可能であった。最近になって、遺伝子組換え技術を利用して、花色素を合成する遺伝子をある植物から取得し、当該遺伝子を別の種で発現することにより花の色を改変することが可能となった（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１））。
花の色のうち、橙、赤、紫、青は主にアントシアニンと総称されるフラボノイドに由来する。黄色は、カロチノイド、ベタレインといったフラボノイド以外の化合物に由来することが多いが、一部の植物種の黄色はフラボノイドに由来する。たとえば、黄色カーネーションには４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン（以下ＴＨＣ）の２’位配糖体が花弁中に存在することが知られている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１１１（１９９６））。また、キンギョソウ、リナリアにはＴＨＣの４’位配糖体が存在する。
カルコン類としては、ＴＨＣのほか、ブテイン、イソリクイチゲニン等及びこれらの誘導体の配糖体が知られており、カーネーション、アサガオ、ボタン、アスター、ムギワラギク、ニチニチソウ、シクラメン、ペチュニアはＴＨＣ、キンギョソウやスターチスは３，４，２’４’，６’）−ペンタヒドロキシカルコン（ＰＨＣ）、コスモス、キクイモはブテイン、ダリアはブテインおよびイソリクイチゲニンをアグリコンとする配糖体を含んでいる。また、キンギョソウ、リナリア、アサガオなどの限られた種にはオーレウシジン（以下ＡＵ）、ブラックテアチンなどのオーロン類と呼ばれる黄色の花色素が存在する。
オーロンの吸収極大は３９９ｎｍから４０３ｎｍであるのに対し、カルコンの吸収極大は３７２ｎｍから３８２ｎｍであるから、両者の色調は異なり、蛍光のためオーロンのほうが鮮やかな黄色を呈する（バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社）。一般にカルコン類、オーロン類、アントシアニンは植物細胞中では配糖体として液胞中に蓄積する。アントシアニンの生合成経路はよく研究されており、アントシアニンの合成に関与する酵素やそれらをコードする遺伝子が知られている（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９））。
フラボノイドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、また、種間で共通している。ＴＨＣは、３分子のマロニルＣｏＡと１分子のクマロイルＣｏＡからカルコン合成酵素の触媒作用により生合成される。ＴＨＣは薄い黄色を呈するが、植物細胞内では、通常カルコン異性化酵素（ＣＨＩ）により速やかに無色のナリンゲニンに変換される。また、ＴＨＣは中性付近のｐＨではきわめて不安定であり、自発的に閉環してナリンゲニンに変換する。ＴＨＣが植物細胞中で安定に存在、すなわち黄色を安定に呈するためには、ＴＨＣの２’位が糖により修飾され閉環できなくなることが必要である。この反応はＴＨＣの２’位にグルコースを転移する酵素（ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン２’位−糖転移酵素 以下２’ＣＧＴ）により触媒される。
ＴＨＣ２’位配糖体はカーネーション、シクラメンなどに存在することから、２’ＣＧＴもこれらの花に存在すると予測される。したがって、２’ＣＧＴ遺伝子を得る事ができれば、この酵素遺伝子を植物において発現し、ＴＨＣ２’位配糖体を蓄積させ、黄色の花を作成できると考えられていた（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ，ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７））。また、ＴＨＣ２’位配糖体を十分蓄積し黄色を発色させるためにはＣＨＩ遺伝子が欠損し、ＴＨＣからナリンゲニンへの酵素的変換が抑制されること、さらに明瞭な黄色の発色のためにはＣＨＩ遺伝子と他にフラバノン３−水酸化酵素（以下、Ｆ３Ｈという）遺伝子も欠損する必要があることが知られていた（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，５７８（２００２））。
これまでにカーネーションの２’ＣＧＴ遺伝子をクローニングしたという報告はある（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４，ｓ１５８（２００３））がその配列は開示されていない。また、カーネーションから２’ＣＧＴ活性をコードする遺伝子を取得し、ペチュニアで発現させ、ペチュニア花弁においてＴＨＣ２’位配糖体を蓄積した例もある（ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００）。しかしながら、２’ＣＧＴによって生成するＴＨＣ２’位配糖体は、その化学構造上、オーロン合成の前駆体となることが不可能となる。また、前述のようにＴＨＣ２’位配糖体の蓄積では、うすい黄色の花弁にしかならない。
ＴＨＣの２’位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も花弁は淡い黄色となることは知られているが、このメチル化を触媒する酵素やその遺伝子の実体は知られていない。ダリア、コスモスなどの黄色の品種には６’−デオキシカルコンが含まれる。マメ科植物においては、６’−デオキシカルコンは５−デオキシフラボノイドの前駆体であり、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とカルコンリダクターゼ（ＣＨＲ）の触媒作用により生合成される。ペチュニアにアルファルファのＣＨＲ遺伝子を導入したところ、ブテインなどの６’−デオキシカルコン類が生成したことが報告されているが、当該ＣＨＲ遺伝子を白い花をもつペチュニアに導入した場合、つぼみの段階ではごく薄い黄色が見られたが、開花時にはほとんど白であり、産業上有用な黄色の花を作出するに至らなかった（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８））。
前述のようにカルコン配糖体よりもオーロンのほうが鮮やかな黄色を呈するため、オーロンを蓄積させる方法を開発できれば産業上きわめて有用である。オーロンの生合成に関わる酵素の１つであるＡＳとその遺伝子については既に報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００））。この報告によればＡＳはＴＨＣ、ＰＨＣや、これらの配糖体を基質としてＡＵ、ブラクテアチンならびにこれらの配糖体を生成する。しかしながら、ＡＳ遺伝子を用いてＡＵやブラックテアチンなどのオーロンを生物において蓄積させた報告はない。
我々はＡＳ遺伝子を構成的プロモーターの制御下に結合したバイナリーベクターを構築し、アグロバクテリウム法によりペチュニアやトレニアにＡＳ遺伝子を導入したが、オーロンの蓄積は認められなかった。一方、アントシアニジンの３位の配糖化がアントシアニンの液胞への移行に必須であると報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３９７（１９９５））、これと同様にオーロンの配糖化が液胞への移行シグナルとして必須である可能性が考えられる。実際に黄色キンギョソウ花弁に蓄積している主要なオーロンはＡＵの６位の配糖体である。そこで、ＡＵの６位に配糖化活性を示すＧＴ（ＡＵ６ＧＴ）を取得し（ＷＯ ００／４９１５５）、このＡＵ６ＧＴ遺伝子とＡＳ遺伝子を共にペチュニアで構成的に発現させたが、オーロンの蓄積は見られなかった。
フラボノイドやアントシアニンの生合成に関与する酵素は細胞内では細胞質か小胞体に存在すると考えられている。これらの酵素の働きでフラボノイドやアントシアニンは液胞の外側、すなわち細胞質側で合成され、配糖化された後、液胞に輸送される（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３））。ところが、鋭意検討の結果、ＡＳは例外的に液胞内に存在することを本発明者らは明らかにした。このことから生体内では、配糖化されたカルコンが液胞に輸送され、これを基質として液胞内でオーロンが合成されるのではないかという着想を得た。
前述のように黄色キンギョソウ花弁の液胞に蓄積する主要なオーロンはＡＵ ６位配糖体である。ＡＵの６位はＴＨＣの４’位に対応し、黄色キンギョソウ花弁にはＴＨＣ４’配糖体も存在する。これらに基づき、細胞質で合成されたＴＨＣの４’位が配糖化された後、液胞に輸送され、それを基質としてＡＳによってＡＵ６位配糖体が合成されるという一連のオーロン合成経路を推測するにいたった。よってＡＵ６位配糖体などのオーロンを異種植物で合成させるためには、ＴＨＣ４’位配糖体を合成することが必須であると考えた。そのためには、ＴＨＣの４’位を配糖化するＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン４’位糖転移酵素、以下４’ＣＧＴ）が必要であり、４’ＣＧＴ遺伝子を取得する必要がある。しかしながら、４’ＣＧＴ遺伝子は今までにクローニングされた報告もなく、４’ＣＧＴが単離された報告もない。
フラボノイドをはじめ多様な化合物の配糖化反応を触媒して配糖体を生成する酵素は、一般に糖転移酵素（ＧＴ）と呼ばれ、植物は、基質及び転移する糖の種類に対応した多様な分子種のＧＴおよびそれらをコードする遺伝子を持っている。ＧＴは通常ＵＤＰ−グルコースをグルコース供与体として利用するので、そのアミノ酸配列中にＵＤＰ−グルコースに結合するモチーフを含んでいる（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１））。このモチーフを有するＧＴ遺伝子は、すでにゲノムの全構造が明らかになっているアラビドプシスには９９種あることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。
また他の植物からも、いくつかのＧＴのアミノ酸配列と機能が解明されている。フラボノイドあるいはアントシアニジンの３位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−糖転移酵素、以下３ＧＴ）の遺伝子は、シソ、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどから得られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。また、アントシアニンの５位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−糖転移酵素、以下５ＧＴ）の遺伝子は、シソ、バーベナなどから得られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，７４０５，（１９９９））。
３ＧＴや５ＧＴのアミノ酸配列の解析から、同一機能を有するＧＴは植物種が異なっていてもアミノ酸配列は類似していること、すなわちファミリーを形成することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。よって、既知のＧＴと同一機能を有する酵素（オルソログ）を他の植物種から得る事は、現在の技術水準からすれば困難ではない。たとえば、ペチュニアの５ＧＴ遺伝子は、シソの５ＧＴ遺伝子を用いてクローニングされた（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１（２００２）．）。しかしながら、同一の機能を有する酵素が全く得られていない新規ＧＴ遺伝子の取得には多大の試行錯誤と困難が伴う。
前述のように全ゲノム構造が明らかになっているアラビドプシスであるが、その花弁は白く、カルコン４’位配糖体の蓄積は報告されていない。したがって、アラビドプシスのＧＴ遺伝子の情報を利用して４’ＣＧＴ遺伝子のクローニングを行うことはできない。また、カーネーションから２’ＣＧＴが単離（ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００）されているが、４’ＣＧＴ遺伝子と２’ＣＧＴの相同性が高いことは必ずしも期待できない。なぜならば、基質が共通であっても糖を付加する位置が異なれば、それぞれのＧＴの生化学的および分子生物学的特性は大きく異なる可能性が考えられるからである。これは、３ＧＴと５ＧＴが別のＧＴファミリーに属することによっても支持される。また、ベタニジンの５ＧＴと６ＧＴは基質が共通にも関わらず、アミノ酸同一性は１９％しかないことが報告されている（Ｐｌａｎｔａ ２１４，４９２（２００２））。
事実、共通のアントシアニジン骨格の３位、５位または３’位に糖を転移する各ＧＴは、ＧＴスーパーファミリーの中の異なるファミリーに属し、これらのファミリー間のアミノ酸同一性は２０％程度に過ぎない（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，（２００３），Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３））。４’ＣＧＴ遺伝子のみならず、新規の遺伝子を取得するには一般にいくつかの方法が考えられる。たとえば花弁で発現しているバラの香り成分の合成に関与する酵素の遺伝子は、遺伝子を網羅的に配列決定し、それらの構造、発現様式、大腸菌での発現によって同定された（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１４，２３２５（２００２））。そこで４’ＣＧＴ遺伝子を同定するためにオーロンおよびカルコン４’配糖体を蓄積する黄色キンギョソウ（品種バタフライイエロー）花弁由来のｃＤＮＡライブラリーからランダムに５０００クローンを選び、これらの塩基配列を決定した。
公知のＤＮＡデータベースを用いたホモロジー検索の結果、３種のＧＴ遺伝子が得られた。そのうち２種は３ＧＴ遺伝子および前述の、ＡＵ６ＧＴをコードする遺伝子（ＷＯ００／４９１５５）、残る１種が新規ＧＴ（ｐＳＰＢ６６２と命名）であった（配列番号：１３）。しかし、ｐＳＰＢ６６２にコードされるＧＴはＴＨＣに対する配糖化活性を示さず、４’ＣＧＴではないことが明らかとなった。また、前述のように同遺伝子とＡＳ遺伝子とを共にペチュニアにおいて高発現させた結果、カルコン配糖体およびオーロンの生成は確認されず、花色についても変化は認められなかった。これらの結果から、５０００クローン程度のランダムスクリーニングによってはカルコン配糖化酵素遺伝子を単離できないことが示唆され、４’ＣＧＴ遺伝子を取得するのは、困難であった。
【特許文献１】 ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００
【特許文献２】 ＷＯ ００／４９１５５
【非特許文献１】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）
【非特許文献２】 Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１）
【非特許文献３】 Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１１１（１９９６）
【非特許文献４】 バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社
【非特許文献５】 Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９）
【非特許文献６】 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ，ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７）
【非特許文献７】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，５７８（２００２）
【非特許文献８】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４，ｓ１５８（２００３）
【非特許文献９】 Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８）
【非特許文献１０】 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００）
【非特許文献１１】 Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３９７（１９９５）
【非特許文献１２】 Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３）
【非特許文献１３】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１）
【非特許文献１４】 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１）
【非特許文献１５】 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９）
【非特許文献１６】 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１（２００２）
【非特許文献１７】 Ｐｌａｎｔａ ２１４，４９２（２００２）
【非特許文献１８】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，２００３（２００３）
【非特許文献１９】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１４，２３２５（２００２）
【発明の開示】
本発明は、カルコン類の４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質及びその遺伝子、好ましくはカルコン類の４’位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質及びその遺伝子を提供することにある。さらに当該ＧＴ遺伝子を用いて花色を改変、好ましくは黄色に変化させた植物体を提供することにある。
前述のように、４’ＣＧＴの生化学的あるいは分子生物学的な性質は知られておらず、酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。発明者らは、黄色キンギョソウ（バタフライイエロー）の花弁ｃＤＮＡライブラリーからＧＴファミリーの保存アミノ酸配列に対応した塩基配列を有するプローブを用いて、当該保存アミノ酸配列の塩基配列を有するＧＴ遺伝子を十種類取得した。さらに、当該ＧＴ遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、その中に、当該大腸菌の抽出液中にカルコンの４’位にグルコースを転移する活性、すなわち４’ＣＧＴ活性を確認し、クローン化した遺伝子が４’ＣＧＴをコードすることを確認した。この遺伝子を植物中で発現させ、花色を改変し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１）カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（３）配列番号１に記載する塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記（１）に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（５）配列番号１に記載する塩基配列の一部または全部からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（６）ゴマノハグサ科由来である前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（７）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、（８）前記（７）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、（９）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
本発明はまた、（１０）前記（７）に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法を提供する。
本発明はまた、（１１）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、またはそれら植物体の組織を提供する。
本発明はまた、（１２）前記（１１）に記載の植物体の切り花を提供する。
本発明はまた、（１３）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を用いてカルコン類の４’位に糖を転移する方法を提供する。
本発明はまた、（１４）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体に導入・発現して得られる、花色が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体を提供する。
本発明はまた、（１５）花色が黄色味を帯びていることを特徴とする前記（１４）に記載の植物体を提供する。
本発明はまた、（１６）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１７）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１８）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１９）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、植物における典型的なフラボノイド合成経路を示す。ここに記載された酵素遺伝子の有無により植物種ごとに代謝経路の末節は異なる。たとえば、黄色のキンギョソウ花弁においてはアントシアニン合成経路と共にオーロン合成に至る経路も存在するが、同じゴマノハグサ科の植物であるトレニアは、４’ＣＧＴ、ＡＳ遺伝子を有しないため、オーロン類を合成することは出来ない。図中の略称については以下参照。ＣＨＳ，カルコン合成酵素；ＣＨＩ，カルコン異性化酵素；Ｆ３Ｈ，フラバノン３−水酸化酵素；ＤＦＲ，ジヒドロフラボノール４−還元酵素；ＡＮＳ，アントシアニジン合成酵素；３ＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−配糖化酵素；ＦＬＳフラボノール合成酵素；ＦＮＳ，フラボン合成酵素；Ｆ３’Ｈ，フラボノイド３’−水酸化酵素；Ｆ３’，５’Ｈ，フラボノイド３’，５’−水酸化酵素；２’ＣＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン２’位糖転移酵素；４’ＣＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン４’位糖転移酵素；ＡＳ，オーレオシジン合成酵素
図２は、図１の続きである。
図３は、形質転換体トレニアのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。ｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７、ｐＳＦＬ３０８導入の形質転換体トレニア（品種サマーウェーブブルー）葉よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＫｐｎＩ切断後、４’ＣＧＴ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。各レーンの上の数字は導入遺伝子コンストラクトおよび形質転換体系統番号を記す。ＳＷＢは宿主として用いたサマーウェーブブルーである。Ｍ１、Ｍ２はＤＩＧラベルしたサイズマーカー（ロシュ）であり、各バンドのサイズを図の左右に記す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号２に記載したアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、もとのタンパク質と同等の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、４’ＣＧＴ活性を保持しているタンパク質である限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。なお、複数個とは、２〜３０個、好ましくは２〜９個をいう。
本発明はまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、５ｘＳＳＣ、５０℃といった比較的温和な条件下でハイブリダイズし、かつ４’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。さらに、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ４’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の技術的範囲に属する。ここでいうストリンジェントな条件とは、例えば２ｘＳＳＣ、６５℃があるが、ハイブリダイゼーションの条件はプローブに用いるＤＮＡの長さ及び塩基組成によって異なるから、この条件に限定されない。
上述ようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、好ましくはゴマノハグ科由来のもの、さらに好ましくはキンギョソウ、リナリア、ウンラン由来の遺伝子が挙げられるが、植物由来に限定されるものではない。すなわち、本発明の４’ＣＧＴ遺伝子は、キンギョソウ、リナリア、ウンラン由来の４’ＣＧＴ遺伝子に限定されるものではなく、カルコン類４’位配糖体を含む他の生物種に由来する４’ＣＧＴ遺伝子であれば、いずれでも黄色の花を育種するのに用いることができる。４’ＣＧＴ遺伝子を含む合成ＤＮＡも、植物由来の遺伝子と同様に用いることができる。
また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
ＧＴの保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すように、例えばキンギョソウやリナリア花弁から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有するＧＴをコードするＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えばアミノ酸配列を改変したいＤＮＡ断片をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望のアミノ酸配列の改変に対応したプライマーを用い、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望のアミノ酸配列の改変に対応したＤＮＡ断片を得ることができる。その後、この改変を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。このようなＤＮＡを化学的に合成することもできる。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
このようにして得られたＧＴ遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、当該大腸菌又は酵母の抽出液中の４’ＣＧＴの活性を測定することにより、得られたＧＴ遺伝子が４’ＣＧＴを示すタンパク質をコードすることを確認することができる。４’ＣＧＴの活性は、例えば実施例３に記載したように、逆相樹脂に４’ＣＧＴの基質となるカルコン類を吸着させ後、当該逆相樹脂をＧＴ遺伝子で形質転換した大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、生成したカルコン４’配糖体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析することにより測定できる。
さらに、得られた４’ＣＧＴ遺伝子を適切な宿主細胞で発現させることにより、当該遺伝子の産物である４’ＣＧＴタンパク質を得ることができる。あるいはまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を有するタンパク質又はペプチドに対する抗体を用いて他の生物の４’ＣＧＴ遺伝子を発現クローニングによって得ることもできる。
本発明はまた、４’ＣＧＴ遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス．スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。
真核細胞としては、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、ｔｒｐＣ等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
植物の発現ベクターの構築は、例えばアグロバクテリウムを用いる場合にはｐＢＩ１２１などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合にはｐＵＣ１９などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、４’ＣＧＴ遺伝子を導入した形質転換植物体を得ることができる。当該形質転換植物を栽培することにより、開花させ、花色が改変された植物体を得ることができる。
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を培養又は栽培し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする４’ＣＧＴタンパク質を回収、精製することができる。
本発明はキンギョソウやリナリアの４’ＣＧＴ遺伝子のみに限定されるものではなく、４’ＣＧＴあるいは４’ＣＧＴ遺伝子の起源としては、植物でも動物でも微生物でも合成したものであってもよく、４’ＣＧＴ活性を有していれば同様に花色改変へ利用できる。本発明はまた、４’ＣＧＴ遺伝子の利用に関するものであり、４’ＣＧＴ遺伝子を植物体に導入・発現することにより、花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体もしくはこれらの植物の栄養増殖体又はこれら植物体の組織も本発明の技術的範囲であり、組織の形態としては切り花であってもよい。また４’ＣＧＴ遺伝子のみでなく、４’ＣＧＴ遺伝子に加えＡＳ遺伝子も共に植物体へ導入、発現させたり、さらに加えて、宿主が本来有するフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体もしくはこれらの植物の栄養増殖体またはこれら植物体の組織も本発明の技術範囲であり組織の形態としては切花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、アサガオ、ベゴニア、インパチエンス、ゼラニウム、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、レンギョウ、ベゴニア、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワーなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
【実施例】
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、ＷＯ９６／２５５００あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
［実施例１］黄色キンギョソウ花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のキンギョソウである品種バタフライイエローの新鮮な花弁５ｇから論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０，１１６３（２０００））に記載のようにしてｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、１．６ｘ１０５ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔからなっていた。
［実施例２］４’ＣＧＴ遺伝子のスクリーニング１
すでに開示されているＧＴのアミノ酸配列を比較し、これらのアミノ酸配列の保存領域に相当する塩基配列を増幅し、これをプローブとして実施例１で述べたキンギョソウｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
プローブに用いたＧＴはアサガオ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−グルコシド糖転移酵素（３ＧＧＴ）（特開２００３−２８９８８４）、ペチュニア由来３ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４０１、（２００２））、バーベナ由来５ＧＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９））、コガネバナＧＴ（ＳＢＧＴ、Ｐｌａｎｔａ ２１０，１００６（２０００））、リンドウ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニン３’−糖転移酵素（３’ＧＴ）（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，（２００３））配列の５種である。それぞれＧＴについて、保存された領域の配列を増幅できるように１組のオリゴヌクレオチドを合成した。これらオリゴヌクレオチドの配列を配列番号：３〜１２に示す。
アサガオ３ＧＧＴ
ペチュニア３ＧＴ
バーベナ５ＧＴ
コガネバナＧＴ
リンドウ３’ＧＴ
プローブはノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型として１ｎｇのそれぞれのｃＤＮＡを含むプラスミドを用い、プライマーとして、上記の各遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド１００ｎｇを使用し、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分からなる反応を１サイクルとし、これを２５サイクル行った。各遺伝子のＰＣＲ増幅産物を等量混合したものをハイブリダイゼーションのプローブとして、実施例１に記載のキンギョソウ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションは、３０％ホルムアミド、１％ＳＤＳを含む５ＸＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は５ｘ ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間行った。スクリーニングによるポジティブシグナルの検出はノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。約３０万プラークをスクリーニングし、最終的に１０種類の完全長糖転移酵素遺伝子を含むクローンを得、これらをｐＳＰＢ２６４，１６２１，１６２０，１６２２，１６１０，１６０９，１６１７，１６１５，６６０，６５８とした。ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってこれらｃＤＮＡ配列を決定した。これらｃＤＮＡのアミノ酸コード領域の塩基配列を配列番号１４〜２３に示した。
［実施例３］大腸菌を用いたカルコンＧＴ活性の測定
３−１ 大腸菌発現ベクターの構築と大腸菌におけるＧＴの発現
実施例２で得られた１０種類のｃＤＮＡにコードされるＧＴ活性を大腸菌発現系を用いて解析した。まず、各ｃＤＮＡの大腸菌発現コンストラクトを作製した。ＰＣＲ法によって各ｃＤＮＡの開始コドンと考えられる塩基配列ＡＴＧに重なる様にＮｃｏＩサイトを導入し、開始メチオニンから終止コドンに至る領域を大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ、またはＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結した。
開始メチオニンに重なるＮｃｏＩサイト導入のためのＰＣＲ液（２５μｌ）は、各ＧＴｃＤＮＡを鋳型とし、開始メチオニン部位に重なるＮｃｏＩ認識配列を導入したプライマー、及びストップコドン付近の３’側から５’側に向けてのプライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ，１ｘ ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，，ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２８サイクル行い、最後に７２℃で５分間処理した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を解析し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認したのち、大腸菌発現ベクターｐ ＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）に導入した。
例えばｐ ＳＰＢ１６１７にコードされるｃＤＮＡ（配列番号：２０）については、配列表に示した１６１７ＢａｍＨＩＮｃｏＩ−ＦＷ（配列番号：２４）ならびに１６１７ＸｈｏＩＫｐｎＩ−ＲＶ（配列番号：２５）の二種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、開始メチオニン部位に重なるＮｃｏ１サイトと、終始コドンの３’側にＫｐｎＩ認識配列を導入した。増幅されたＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。塩基配列にＰＣＲによるエラーがないことを確認後、ＮｃｏＩとＫｐｎＩで切り出したＤＮＡ断片をｐ ＱＥ６１のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩサイトに連結し、ｐ ＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡの大腸菌発現ベクターであるｐＳＰＢ１６４２を得た。同様にして１０種類のＧＴ ｃＤＮＡの大腸菌発現ベクターを構築した。
１６１７ＢａｍＨＩＮｃｏＩ−ＦＷ
１６１７ＸｈｏＩＫｐｎＩ−ＲＷ
各発現ベクターを大腸菌株ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に導入し、３７℃で終濃度２０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩前培養した。前培養液の１ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ，カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地、５０ｍｌに加えＡ６００＝０．６−１．０に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．１ｍＭになるよう加え、さらに２７℃で一晩振とう培養し、３０００ｒｐｍ，１０分間、４℃で遠心し、集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社）での超音波処理により大腸菌を破砕した後、１５，０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とし、以下の活性測定に用いた。
３−２ 酵素活性の測定
Ｈ２Ｏで平衡化済みの逆相樹脂、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（ＴＯＳＯＨ）１ｍｌにＴＨＣ（５００μｇ／ｍｌエタノール溶液）をＨ２Ｏで希釈しながら負荷した後、水洗することにより、樹脂に固定された基質ＴＨＣを得た。この樹脂固定されたＴＨＣ １００μｌに３−１で得られた粗酵素液２００μｌおよび５ｍＭ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ １０μｌを加え、３０℃で１時間反応させた。遠心して上清を除去後、沈殿した樹脂を水洗し、０．１％ ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル３００μｌに懸濁し、超音波処理によりフラボノイドを樹脂より遊離した。１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ０．４５ｍｍ、４ｍｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ、ミリポア）を用いて不溶物を除去して、上清を液体高速クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）で分析した。カルコンおよびその配糖体の分析条件は以下の通りである。
カラムはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ−３０−ＵＧ−５（４．５ｍｍφｘｌ５０ｍｍ、野村化学）を用いて、移動相にはＡ液として０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルを用い、Ｂ液２０％からＢ液７０％の直線濃度勾配１０分間の溶出後、Ｂ液７０％で５分間維持した。流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所）による２５０−４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間１０．７分に溶出され、その２’位配糖体および４’位配糖体は８．５分に溶出されることをＴＨＣ及びＴＨＣの２’位および４’位配糖体の標品を用いて確認した。
ｐＳＰＢ１６４２を発現する大腸菌の抽出液を反応させたとところ、基質ＴＨＣに加え、８．５分に溶出される新たな生成物が検出された。これらはｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液およびｐＳＰＢ１６４２を発現する大腸菌の粗酵素液を煮沸した溶液を反応させたものでは検出されなかったことからｐＳＰＢ１６４２から発現されるＧＴによって生じた生成物と考えられる。さらに１Ｈ ＮＭＲ分析によって本生成物の構造を調べた。分析にはＪＮＭ−ＥＸ４００（ＪＥＯＬ）を用い、その他の分析条件は論文（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３２、１６５２（２００３））に記載のとおりである。この結果、ｐＳＰＢ１６４２の発現産物によって生じたＴＨＣ配糖体はＴＨＣ２’位配糖体であることが明らかとなった。よって、ｐ ＳＰＢ１６４２によって発現されるｃＤＮＡ、つまりｐＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡは２’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードしていると考えられた。
［実施例４］４’ＣＧＴ遺伝子のスクリーニング２
黄色キンギョソウ花弁のｃＤＮＡライブラリー約３０万クローンをｐＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡ全長をプローブとして再度スクリーニングした。ＰＣＲによるプローブラベリングには、１６１７−Ｆ（配列番号：２６）ならびに１６１７−Ｒ（配列番号：２７）プライマーを用い、実施例２記載の方法と同様に行った。スクリーニングと塩基配列の解析方法も実施例２と同様である。
１６１７−Ｆ
１６１７−Ｒ
その結果、新規ＧＴ遺伝子を５種、ｐＳＰＢ１７２１、１７２４、１７２３、１７１９、１７２５を得た。それぞれの配列を配列表に示した（配列番号：２８〜３１及び１）。
このうちｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡは、４５７アミノ酸からなる分子量５０．８ｋＤａ、等電点６．８２のタンパク質をコードする１３７４ｂｐ（ストップコドンを除く）の翻訳領域を含んでいた。ｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列（配列番号：２）を、すでに報告のあるＧＴのアミノ酸配列と比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９、５０９（１９９９））と１４％、シソ由来５ＧＴと１８％、シソ由来３ＧＴと１８％、リンドウの３’ＧＴと２３％、プローブとして用いたｐ ＳＰＢ１６１７にコードされるタンパク質のアミノ酸配列とは３１％の同一性しか示さなかった。なお、ホモロジー解析に使用したソフトフェアはＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．６．５．３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷで、条件は、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｌｏｓｕｍ ３０、ｋｅｔｕｐｌｅ：１、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：３、Ｔｏｐｄｉａｇｏｎａｌｓ：５、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｉｚｅ：５で行った。
［実施例５］得られたｃＤＮＡの大腸菌における発現
５−１．発現ベクターの構築
実施例４で得られた５種類のｃＤＮＡについて、大腸菌発現系を用い各ｃＤＮＡにコードされるタンパク質の酵素活性の測定を調べた。発現ベクターの構築ならびに発現方法、活性測定方法は実施例３と同様である。例えばｐＳＰＢ１７２５については、開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマー２種１７２５−ＮｃｏＩ（配列番号：３２）、１７２５−ＫｐｎＩ（配列番号：３３）を用いてＰＣＲ反応を行った。
１７２５−ＮｃｏＩ
１７２５−ＫｐｎＩ
ＰＣＲ液（２５μｌ）は、ｐ ＳＰ１７２５ ＤＮＡ １０ｎｇ，１ｘ ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１７２５−ＮｃｏＩ，１７２５−ＫｐｎＩプライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ，ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。
反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２８サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。増幅産物の塩基配列を確認したのち、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ処理によってｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒから切り出される約１．４ＫｂのフラグメントをｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩとＫｐｎＩサイトに連結し、大腸菌発現ベクターｐ ＳＰＢ１７６８を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株（ＴＯＹＯＢＯ）に導入した。他の４種類のｃＤＮＡについても同様にしてそれぞれｐＱＥ６１を用いた大腸菌発現ベクターを構築し、ＪＭ１０９に導入した。
５−２ 組換えタンパク質の大腸菌における発現とＧＴ活性測定
実施例５−１で得られた大腸菌形質転換株を、実施例３と同様の条件で培養し、それぞれのｃＤＮＡにコードされるタンパク質の活性測定を行った。その結果、ｐ ＳＰＢ１７６８を含む大腸菌の粗酵素液とＴＨＣの反応物中に、ＴＨＣ配糖体と思われるピークを検出した。このＴＨＣ配糖体をさらに詳しく同定するために、以下に記載のＴＨＣ２’位配糖体とＴＨＣ４’位配糖体を分離する条件にて再度ＨＰＬＣ分析を行った。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφｘ１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ，Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配１５分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配１０分間の溶出の後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所）による２５０−４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。
この条件で、ＴＨＣは保持時間２６．７分に溶出され、ＴＨＣ２’位配糖体は１９．８分、ＴＨＣ４’位配糖体は２０．６分に溶出される。ｐＳＰＢ１７６８を発現する大腸菌抽出液とＴＨＣの反応液中に見出されたＴＨＣ配糖体は本条件による分析で２０．６分に溶出されたのでＴＨＣ４’位配糖体であると考えられた。これはｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからｐ ＳＰＢ１７２５にコードされるＧＴによって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡにコードされるＧＴはＴＨＣの４’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有することが確認された。
また、本反応液中にはＴＨＣ４’位配糖体に加えて１５．５分に溶出される新たなピークが検出された。この物質はナリンゲニンの吸収スペクトルを示し、ナリンゲニン７位配糖体標品と保持時間が一致した。よってこの１５．５分に溶出された生成物はｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴによって生成したＴＨＣ４’位配糖体が、配糖化後に閉環して生じたナリンゲニン７位配糖体あるいはＴＨＣが閉環して生じたナリンゲニンに、４’ＣＧＴが作用して生じたナリンゲニン７位配糖体と考えられる。
［実施例６］キンギョソウ花弁における４’ＣＧＴ遺伝子の発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ法によってｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴ遺伝子の黄色キンギョソウ花弁における発現様式を解析した。オーロン類を蓄積する黄色キンギョソウ（バタフライイエロー品種）の花弁を成長段階に沿って５ステージに分離した。若い順に、ステージ１（蕾花弁長１ｃｍ以下），２（蕾か弁長１．０−１．５ｃｍ），３（蕾花弁長１．５−２．０ｃｍ），４（花弁長２．０−２．５ｃｍ、開花直前）および５（花弁長２．５ｃｍ以上、開花後の花弁）の５段階とし、ステージ５は成熟した花弁に対応する。
分離した花弁から１ｇからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ １μｇを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を利用し、合成条件は本システム製造業者が推奨する条件に従った。得られたステージ別のｃＤＮＡを鋳型に、実施例５に記載の１７２５−Ｎｃｏ１（配列番号：３２）および１７２５−Ｋｐｎ１プライマー（配列番号：３３）を用いてＰＣＲを行った。また、４’ＣＧＴ遺伝子発現量と内在遺伝子発現量とを比較するために、内部標準遺伝子としてキンギョソウのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子（配列番号：３４）を用い（Ｎａｔｕｒｅ ３３９，４６（１９８９））、本遺伝子増幅のためにＡｍＧＡＰＤＨ−Ｆ（配列番号：３５）、ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｒ（配列番号：３６）のプライマーを合成した。また、比較対象遺伝子としてキンギョソウのＡＳ遺伝子増幅のためにＡｍＡＳ−Ｆ（配列番号：３７）、ＡｍＡＳ−Ｒプライマー（配列番号：３８）を合成した。
ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｆ
ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｒ
ＡｍＡＳ−Ｆ
ＡｍＡＳ−Ｒ
ＰＣＲ条件は実施例３と同様の反応組成で、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分を１２サイクル行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離した後、常法によってＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンメンブレン（アマシャム）にブロッティングし、ハイブリダイゼーションによる増幅産物の検出を行った。ハイブリダイゼーション方法については前述のノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システムＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キットを用い、製造者の推奨する方法に従った。プローブには、キンギョソウのＡＳ、ＧＡＰＤＨおよびｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴのｃＤＮＡを用い、実施例２同様にして、上記の各遺伝子特異的プライマー（配列番号３２，３３，３５〜３８）を用いてＤＩＧラベリングを行った。
その結果、４’ＣＧＴ遺伝子及びＡＳ遺伝子はともにステージ４で発現がピークに達し、経時的に同様の発現パターンを示すことが分かった。さらに両遺伝子の発現パターンは黄色キンギョソウ花弁に含まれるカルコン４’位配糖体およびオーロン類の蓄積パターンに矛盾しないと考えられた（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６０，２２９（２００１））。
以上の結果からｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴ遺伝子は、キンギョソウ花弁内においてＡＳ遺伝子と同一の発現制御支配下に存在することが考えられ、両者は同一の生合成経路、すなわちオーロン類の生合成経路に関わっていると考えられる。
［実施例７］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現
７−１ ４’ＣＧＴ発現カセットの構築
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５（１９９６））をＳｎａＢＩで消化し、再連結することによりｏｍｅｇａ配列を除き、得られたプラスミドをｐＵＥ６とした。一方、ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）をＡｓｃＩで消化し、平滑末端化後、ＰａｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＰＰとした。ｐＵＥ６のＥｌ２３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでを有する断片を、ｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに挿入しｐＳＰＢ５４０を得た。ｐＳＰＢ５４０のＧＵＳ遺伝子部分をｐＳＰＢ１７２５から切り出される４’ＣＧＴ ｃＤＮＡ断片に置換し得られたプラスミドをｐＳＦＬ２０３とした。すなわち、ｐＳＦＬ２０３はｐＵＣＰＰをベクターとし、Ｅｌ２３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターで制御される４’ＣＧＴ発現カセットを有するものである。
７−２ ＡＳ発現カセットの構築
キンギョソウ由来のＡＳ ｃＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０，１１６３，（２０００））がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドをｐＳＰＢ２５１とした。ｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）にＭａｃＩプロモーター、ｐＳＰＢ２５１から切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片、ＭＡＳターミネーターを連結したＡＳ発現コンストラクトをｐＳＰＢ１６２４とした。
７−３ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現コンストラクトの作製
７−１に記載のｐＳＦＬ２０３をＰａｃＩで切断し、カルコン配糖化酵素遺伝子発現カセットを切り出し、これを７−２記載のｐＳＰＢ１６２４のＰａｃＩサイトに挿入した。得られたコンストラクトをｐＳＦＬ２０１とした。よってｐＳＦＬ２０１は植物細胞に導入された場合、４’ＣＧＴ遺伝子とＡＳ遺伝子が構成的に発現するように設計されている。
［実施例８］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＤＦＲの抑制
８−１トレニア由来のＤＦＲ遺伝子発現抑制カセットの構築
トレニアのジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）ｃＤＮＡについては論文（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３，３３，２０００）に記載のようにして取得した。トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡがベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−と連結したプラスミドをｐＴＤＦ１０とした。これを鋳型とし、ベクター配列に由来するＭ１３リバースプライマー（配列番号３９）とトレニアＤＦＲｃＤＮＡ配列に塩基置換でＮｃｏＩ認識部位を導入したプライマーＴｈＤＦＲ−ＮｃｏＩ（配列番号４０）を用いて、実施例３に記載のようにしてＰＣＲを行った。得られた約０．７５ｋｂのフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、塩基配列を確認したのち、ＳａｃＩとＮｃｏＩで０．７５ｋｂのトレニアＤＦＲ ｃＤＮＡ配列を切り出した。
またｐＴＤＦ１０をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断し、トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡの５’末端から１．１ｋｂを含むフラグメントを回収した。一方、７−１記載のｐＵＣＡＰをＰａｃＩで消化し、平滑末端化後、ＡｓｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＡＡとした。このｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに、ｐＵＥ６から切り出したＥｌ２３５Ｓプロモーター〜ＧＵＳ〜ＮＯＳターミネーターに至るフラグメントを挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ５４１とした。ｐＳＰＢ５４１をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子部分を除き、ここに、トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡ由来の０．７５ｋｂのフラグメントとおよび１．１ｋｂのフラグメントを、両フラグメントのＮｃｏＩ部位が連結する方向に挿入した。このようにして得られたプラスミドｐＳＦＬ３１４は、植物体内の導入された場合、Ｅｌ２３５Ｓプロモーターの制御下、トレニアのＤＦＲ ｃＤＮＡ配列に由来する二本鎖ＲＮＡを転写し、ＲＮＡｉ法によってトレニアのＤＦＲ遺伝子発現を抑制することができるものである。
Ｍ１３リバースプライマー
ＴｈＤＦＲ−ＮｃｏＩ
８−２ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＤＦＲ遺伝子発現の抑制のためのコンストラクトの構築
７−１記載のｐＵＥ６のＮＯＳターミネーター上流にＸｈｏＩリンカーを挿入した。このプラスミドをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られるＥｌ２３５Ｓプロモーター〜ベクター〜ＮＯＳターミネーターからなる断片と７−２記載のｐＳＰＢ２１５からＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ２１１を得た。ｐＳＰＢ２１１からＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩでＡＳ発現カセットを切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドのＰａｃＩサイトに、７−１記載のｐＳＦＬ２０３をＰａｃＩ切断して得られる４’ＣＧＴ発現カセットを挿入し、４’ＣＧＴとＡＳの発現カセットがタンデムに連結したｐＳＦＬ３０４を得た。さらに８−１記載のトレニアＤＦＲ二本鎖ＲＮＡ転写カセットをｐＳＦＬ３０４のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＦＬ３０７を得た。つまりｐＳＦＬ３０７は４’ＣＧＴとＡＳの発現ならびにトレニアのＤＦＲ遺伝子発現抑制のための３つのカセットを有する。
［実施例９］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現の抑制
９−１トレニア由来のＦ３ＨｃＤＮＡのクローニングと同遺伝子発現抑制カセットの構築
シソから得られたＦ３Ｈ ｃＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３５，９１５（１９９７））をプローブとして、トレニアの同酵素をコードするｃＤＮＡを取得した。すなわち、実施例２同様にして、トレニアｃＤＮＡライブラリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，６，２３９，２０００）約２０万のファージをスクリーニングした結果、配列番号４１に示すトレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡを得た。トレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡがベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−と連結したプラスミドをｐＳＰＢ２６６とした。これを鋳型とし、ベクター配列に由来するＭ１３リバースプライマー（配列番号３９）とトレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に塩基置換でＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマーＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−１（配列番号４２）を用いて、実施例３同様にしてＰＣＲを行った。
得られた約０．９ｋｂのフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、塩基配列を確認した。同様にして、トレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に塩基置換でＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマーＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−２（配列番号４３）とＭ１３リバースプライマーを用いて、約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を調整し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、塩基配列を確認した。実施例８−１に記載のｐＳＰＢ５４１をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子部分を除き、ここにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯからＢａｍＨＩとＳａｌＩ切断で切り出した０．９ｋｂのフラグメントと、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯからＳａｃＩとＳａｌＩ切断で切り出した０．７ｋｂのフラグメントを両フラグメントのＳａｌＩ部位が連結するように挿入した。このようにして得られたプラスミドｐＳＦＬ３１３は、植物体内に導入された場合、Ｅｌ２３５Ｓプロモーターの制御下、トレニアのＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に由来する二本鎖ＲＮＡを転写し、ＲＮＡｉ法によってトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現を抑制するものである。
ＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−１
ＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−２
９−２ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現の抑制のためのコンストラクトの構築
９−１記載のｐＳＦＬ３１３からＡｓｃＩ切断によりトレニアＦ３Ｈ ＲＮＡｉカセットを切り出し、実施例８−２記載のｐＳＦＬ３０４のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＦＬ３０８を得た。つまりｐＳＦＬ３０８は４’ＣＧＴとＡＳの発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現抑制のための３つのカセットを有する。
［実施例１０］植物における遺伝子発現と花色分析
実施例７−９で述べたｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７およびｐＳＦＬ３０８を公知の方法でトレニア（品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社））に導入した。形質転換の方法はＭｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．６，２３９，（２０００）に記載の方法にしたがった。選択マーカー耐性を示した個体を選抜し、それぞれの花色を観察した。ｐＳＦＬ２０１導入株では、得られた３５系統の形質転換体のうち、２２系統において宿主と比べて花色変化が見られ、黄色味を帯びた青、もしくは黄色味を帯びたグレーを示した。
しかし、完全に黄色になったものはなかった。ｐＳＦＬ３０７導入株では得られた３６系統の形質転換体のうち、１９系統において宿主と比べて花色変化が見られた。さらに、花色が変化した１９系統のうち６系統については宿主本来の青い色がほとんど混在せず、ほぼ完全な黄色花色を呈していた。またｐＳＦＬ３０８導入株では得られた３９系統の形質転換体のうち、２４系統において宿主と比べて花色変化が見られた。さらに、花色が変化した２４系統のうち１７系統については宿主本来の青い色がほとんど混在せず、ほぼ完全な黄色花色を呈していた。
花色変化が比較的顕著であったものについて色素分析を行った。
元株および各形質転換体の花弁を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりオーレウシジン６位配糖体およびアントシアニジンの分析を行った。アントシアニジン分析については花弁より抽出したフラボノイドを６Ｎ ＨＣｌに溶解し、沸騰水中に２０分間保持することにより加水分解後、アミルアルコールにてフラボノイドを再抽出したものを分析に供した。ＨＰＬＣ条件はそれぞれ以下のとおりである。
まずＡＵ６位配糖体の検出には、ＳＨＩＭ−ＰＡＣＫ ＦＣ−ＯＤＳカラム（５０×４．６ｍｍ、島津製作所）を用い、移動相にはＡ液として０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｂ液１０％から２３％の直線濃度勾配３分間の溶出後、Ｂ液２３％で１７分間維持し、さらにＢ液２３％から８０％の直線濃度勾配２分間の溶出後、Ｂ液８０％で３分間維持した。さらにＢ液８０％から１０％の直線濃度勾配２分間で溶出した。流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出は３６０、４００ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による２５０−５００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。本条件下で、ＴＨＣ ４’位配糖体、ＡＵ６位配糖体標品はそれぞれ保持時間１４．１７分および６．１９分に溶出される。
次にアントシアニジンはカラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ Ａ３１２（６×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いた。移動相には酢酸、メタノール、Ｈ２Ｏをそれぞれ６０：７０：２７０に混合したものを用い、１１分間維持した。検出は５２０ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による４００−６００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。本条件下で、マルビジンは保持時間９．１２分に溶出される。
その結果、ｐＳＦＬ２０１を導入した形質転換体ではＴＨＣ４’位配糖体ならびにＡＵ６位配糖体と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、それぞれ花弁中に０．０２％および０．０５％（花弁新鮮重量中のＷ／Ｗ）生成していることが確認された。また宿主が本来含有するアントシアニジン類も形質転換体に存在するため、これら形質転換体で観察された黄色がかった青またはグレーの花色は、ＴＨＣ４’位配糖体ならびＡＵ６位配糖体と、マルビジンなどのアントシアニジン類が共存したためと考えられる。
一方、ｐＳＦＬ３０７および３０８を導入した形質転換体ではオーロンの一種であるＡＵ６位配糖体のみと保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、ともに花弁中に０．０９％（花弁新鮮重量中のＷ／Ｗ）生成していることが確認された。ｐＳＦＬ３０７またはｐＳＦＬ３０８が導入された系統では、宿主が本来有するアントシアニジン類が宿主花弁に含まれる当該アントシアニジンの１０〜５０％と著しく減少していることが確認された。
［実施例１１］ゲノミックサザンハイブリダイゼーションによる４’ＣＧＴ遺伝子導入の確認
実施例１０で得られた形質転換体のうち、花弁の色素分析結果からＴＨＣ４’位配糖体ならびにＡＵ６位配糖体の蓄積量が比較的多かった系統を、各コンストラクト導入株から３系統ずつ選抜し、ゲノミックハイブリダイゼーションをおこなった。形質転換体の葉、約１ｇからＰｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、製造業者推奨の方法によってゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ各２０μｇを制限酵素ＫｐｎＩで切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動にて分離後、常法にしたがってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンに転写後、ノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システムを用い、ハイブリダイゼーションを行った。
４’ＣＧＴ遺伝子プローブのＤＩＧラベリング、ハイブリダイゼーションならびに検出方法は実施例６同様に製造業者推奨の方法に従った。ハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。ｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７、ｐＳＦＬ３０８の制限酵素地図を考慮するとゲノミックサザンで検出されたバンドの数から各形質転換体に導入された４’ＣＧＴ遺伝子コピー数を推定することができる。
ｐＳＦＬ２０１導入系統については、いずれの系統でも１本のバンドが見られることから１コピーの導入遺伝子を有することが推定される。ｐＳＦＬ３０７導入系統については、系統番号２および４の個体は１コピー、系統番号１３の個体では２本のバンドが見られることから２コピーの４’ＣＧＴ ｃＤＮＡが導入されたものと考えられる。ｐＳＦＬ３０８導入系統については、いずれの系統でも１本のバンドが見られることから１コピーの導入遺伝子を有することが推定される。
［実施例１２］定量ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現解析
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて元株および形質転換体各系統のつぼみからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡのうち１μｌをテンプレートとし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてトレニアＤＦＲとＦ３Ｈおよび外来性遺伝子であるＡＳと４’ＣＧＴの転写産物の発現定量を行った。製造者が推奨するソフトウェア’Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ’にて、各遺伝子を特異的に増幅するようなオリゴプライマーおよび特異的にハイブリダイズするような両末端を蛍光ラベルしたＴａｑ Ｍａｎプローブを設計し反応に供した。トレニアＤＦＲには、配列番号：５４と５５のオリゴプライマーおよび配列番号：５６のＴａｑ Ｍａｎプローブを、トレニアＦ３Ｈには、配列番号：５７と５８のオリゴプライマーおよび配列番号：５９のＴａｑＭａｎプローブを、ＡＳには配列番号：６０と６１のオリゴプライマーおよび配列番号：６２のＴａｑ Ｍａｎプローブを、４’ＣＧＴには配列番号：６３と６４のオリゴプライマーおよび配列番号：６５のＴａｑ Ｍａｎプローブを用いて発現定量を行った。
トレニアＤＦＲ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１１５８Ｆ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１２２３Ｒ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１１８０Ｔ
トレニアＦ３Ｈ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１０３５Ｆ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１１０１Ｒ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１０５５Ｔ
ＡＳ
ＡｍＡＳ−１５４５Ｆ
ＡｍＡＳ−１６３８Ｒ
ＡｍＡＳ−１５８２Ｔ
４’ ＣＧＴ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９０８Ｆ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９６６Ｒ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９２９Ｔ
また内在性コントロールとして、トレニアのグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。オリゴプライマーにはＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−７９４Ｆ（５’−ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＣＧ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’）（配列番号：６６）とＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−８５９Ｒ（５’−ＡＣＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＣＣＡ ＴＴＣ−３’）（配列番号：６７）を、Ｔａｑ ＭａｎプローブにはＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−８１６Ｔ（５’−ＡＧＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＣＧ−３’）（配列番号：６８）を用いた。
反応液は、元株または形質転換体各系統のｃＤＮＡ，１ｘ Ｔａｑ Ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），オリゴプライマー各１００ｎＭ，Ｔａｑ Ｍａｎプローブ１００ｎＭからなる総体積５０μｌに調整した。反応条件は、５０℃で２分、９５℃、１０分反応させた後、９５℃、１５秒、６０℃、１分の反応を４０サイクル行いＰＣＲでの増幅産物の生成過程をリアルタイムで検出した。その結果、ｐＳＦＬ２０１導入系統では導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに高発現していることを確認した。ｐＳＦＬ３０７導入系統では導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに発現し、内在性のＤＦＲｍＲＮＡが元株に比べて約１０％程度にまで抑制されていることが確認された。また、ｐＳＦＬ３０８導入系統においては導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに発現し、内在性のＦ３ＨｍＲＮＡが元株に比べて約５％程度にまで抑制されていることが確認された。
［実施例１３］４’ＣＧＴのＰＨＣに対する配糖化活性の測定
黄色キンギョソウ花弁内においてＰＨＣ４’位配糖体が確認されており（Ｓａｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６０，２２９−２３６（２００１））、ＡＳがこれらＰＨＣおよびＰＨＣ４’位配糖体を基質としてブラクテアチンおよびブラクテアチン６位配糖体を生成できることが知られている。４’ＣＧＴがＰＨＣの４’位の配糖化反応を触媒できるかどうかを明らかにするために、４’ＣＧＴのＰＨＣに対する配糖化活性を測定した。実施例５−２にしたがって、大腸菌で発現した組換え４’ＣＧＴを用いて実施例３−２と同様の方法で樹脂に固定したＰＨＣを基質として、酵素反応を行った。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφｘ１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ、Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配２２分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配で１４分間溶出後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／分で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＰ（島津製作所）による２２０−４００ｎｍの吸収スペクトルを測定することにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間３８．２分に溶出され、ＴＨＣ２’位配糖体は２７．７分、ＴＨＣ４’位配糖体は３０．０分、ＰＨＣは３２．４分、ＰＨＣ４’位配糖体は２４．３分に溶出される。ｐＳＰＢ１７６８を発現する大腸菌抽出液とＰＨＣの反応液中に見出されたＰＨＣ配糖体は、本条件による分析で２４．３分に溶出されたので、ＰＨＣ４’位配糖体であると同定した。ｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液とＰＨＣを反応させた場合には、ＰＨＣ配糖体は検出されなかった。したがって、ＰＨＣ４’位配糖体はｐＳＰＢ１７２５にコードされるＧＴによって生じた産物であると考えられる。以上の結果から、ｐＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡにコードされるＧＴはＰＨＣの４’位の水酸基にグルコースを配糖化する活性を有することが確認された。以上の結果から、４’ＣＧＴはＴＨＣの４’位の配糖化のみならずＰＨＣの４’位の配糖化反応を触媒することが示された。
［実施例１４］形質転換トレニアを用いた４’ＣＧＴおよびＡＳの機能解析
１４−１ コンストラクトの構築
実施例７に記載のｐＳＦＬ２０３からＰａｃＩで２．４ｋｂの４’ＣＧＴの発現カセット部分を切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩサイトに導入したものをｐＳＦＬ２０９とした。ｐＳＦＬ２０９は植物体内において４’ＣＧＴを単独で発現させるものである。
実施例９に記載のｐＳＦＬ３１３からＡｓｃＩで２．７ｋｂのＦ３Ｈ発現抑制用カセットを切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＡｓｃＩサイトに導入したものをｐＳＦＬ２１０とした。ｐＳＦＬ２１０は、トレニア植物体内においてトレニアのＦ３Ｈ遺伝子の２本鎖ＲＮＡを転写させることにより、Ｆ３Ｈの発現を抑制することを意図したものである。
一方、ＡＳについては、特許出願（Ｐ２００３−２９３１２１）にあるｐＳＰＢ１２０’のＢａｍＨＩとＸｈｏＩサイトに、実施例７に記載のｐＳＰＢ２５１からＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片を挿入することによって、植物体内でＡＳを発現するベクターｐＳＰＢ２１１を得た。
１４−２ ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現解析と花色分析
実施例１４−１で述べたｐＳＦＬ２０９、ｐＳＦＬ２１０およびｐＳＰＢ２１１を実施例１０に記載の方法でトレニア（品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社））に導入した。形質転換の方洙はＭｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．６，２３９，２０００に記載の方法にしたがった。選択マーカー耐性を示した個体を選抜した。得られた形質転換体および元株サマーウェブブルー各系統のつぼみからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。さらにＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて製造者の推奨する方法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ＡＳのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＡｍＡＳ−ＩＮＳＩＴＵ−ＦＷ（５’−ａａｔｔａｔｔｔｃｃｃａａｔｇｔｔｃａａａａａｔ−３’）（配列番号４４）とＡｍＡＳ−ＩＮＳＩＴＵ−ＲＶ（５’−ｔｇｇａｇｃｔｔｔａｇｇｔｔｔｇｔｇａａａ−３’）（配列番号４５）を、キンギョソウ４’ＣＧＴのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＫＩＲ−ＩＮＳＩＴＵ−ＦＷ（５’−ａｔｇｇｇａｇａａｇａａｔａｃａａｇａａａａｃ−３’）（配列番号４６）とＫＩＲ−ＩＮＳＩＴＵ−ＲＶ（５’−ｔｃｔｔａｃｇａｔａａａａｃａａａｃｔｃａ−３’）（配列番号４７）を、内在性Ｆ３ＨのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ．Ｆ３Ｈ−９２３Ｆ（５’−ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＧＡ Ａ−３’）（配列番号４８）とＴ．Ｆ３Ｈ−１３３９Ｒ（５’−ＴＧＧ ＣＣＧ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＡＴ−３’）（配列番号４９）を、さらに内部標準遺伝子としたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ．ＧＡＰＤＨ−Ｆ８７（５’−ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＧＣ Ｃ−３’）（配列番号５０）とＴ．ＧＡＰＤＨ−Ｒ６９２（５’−ＣＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＧＡ ＴＡＧ Ｃ−３’）（配列番号５１）を用いた。その結果、ｐＳＦＬ２０９導入系統では取得した形質転換体４１系統のうち、導入したキンギョソウ４’ＣＧＴ転写物が検出できたのは３７系統であったが、いずれの系統においても花色変化は認められなかった。ｐＳＦＬ２１０導入系統では取得した形質転換体４４系統のうち内在性Ｆ３’Ｈの転写物の量が有為に減少していることを検出できたのは３７系統であり、これらの系統は白色あるいは紫と白色の混色の花色を示した。さらに、ｐＳＰＢ２１１導入系統では取得した形質転換体４１系統のうち導入したＡＳが発現していることを確認できたのは３１系統であり、いずれの系統においても花色変化は認められなかった。
ｐＳＦＬ２０９導入系統およびｐＳＰＢ２１１導入系統は導入した遺伝子の転写産物が検出できた系統について、ｐＳＦＬ２１０導入系統は花色が白色を示した系統について色素分析を行った。サマーウェブブルーおよび各形質転換体の花弁を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＡＵ６位配糖体およびアントシアニジンの分析を行った。アントシアニジン分析は実施例１０に記載のように行った。ＨＰＬＣ条件はそれぞれ以下のとおりである。
まずＡＵ６位配糖体の検出には、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＦＣ−ＯＤＳカラム（５０×４．６ｍｍ、島津製作所）を用い、移動相にはＡ液として０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｂ液１０％から２３％の直線濃度勾配３分間の溶出後、Ｂ液２３％で１７分間維持し、さらにＢ液２３％から８０％の直線濃度勾配２分間の溶出後、Ｂ液８０％で３分間維持した。さらにＢ液８０％から１０％の直線濃度勾配２分間で溶出した。流速は０．８ｍｌ／分で行った。検出は、３６０及び４００ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による２５０−５００ｎｍの吸収スペクトルの測定により行った。本条件下で、ＴＨＣ ４位’配糖体、ＡＵ６位配糖体標品はそれぞれ保持時間１４．１７分および６．１９分に溶出される。次にアントシアニジンはカラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ Ａ３１２（６×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いた。移動相には酢酸、メタノール、Ｈ２Ｏをそれぞれ６０：７０：２７０に混合したものを用い、１１分間維持した。検出は５２０ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による４００−６００ｎｍの吸収スペクトルの測定により行った。本条件下で、マルビジンは保持時間９．１２分に溶出される。
その結果、ｐＳＦＬ２０９導入系統ではＴＨＣ４’位配糖体と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、新鮮花弁重量１ｇあたり０．０３６〜０．７６２ｍｇ生成していることが確認された。また宿主が本来含有するアントシアニジン類も存在した。
ｐＳＦＬ２１０導入系統ではアントシアニジン量は、宿主花弁に含アントシアニジン量の約１％程度に減少していることがわかった。
またｐＳＰＢ２１１導入系統では、宿主と比較してフラボノイド色素に変化は認められなかった。いずれの形質転換体においてもオーロン類と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物は検出されなかった。
したがって、Ｆ３Ｈの発現抑制ならびにＡＳの過剰発現だけではカルコン配糖体あるいはオーロンは植物体内で合成されないこと、４’ＣＧＴとＡＳの共発現によりオーロンが合成されることが示された。４’ＣＧＴ単独の過剰発現により、カルコン４’位配糖体を蓄積させることができ、花色の変化に役立つことがわかった。
［実施例１５］リナリアからの４’ＣＧＴｃＤＮＡのクローニング
実施例１と同様にして、リナリア（Ｌｉｎａｒｉａ ｂｉｐａｒｔｉｔａ）の蕾及び開花した花の花びらから抽出したＲＮＡを用い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。蕾由来のＲＮＡから８．０ｘ１０５ｐｆｕ／ｍｌのライブラリーが得られ、一方、開花花弁のｃＤＮＡを用いたものからは１．０ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌのｃＤＮＡライブラリーが得られた。
これら各ライブラリーの約３．０ｘ１０５ｐｆｕのファージ、実施例４に記載のキンギョソウのｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを行った。プローブの標識、ハイブリダイゼーションとその後のメンブレンの洗浄、検出方法は実施例２と同様に行った。その結果、最終的に１９個の陽性クローンが得られた。これらのうちカルコン糖転移酵素をコードするｃＤＮＡとして期待される長さ（約１．５ｋｂ）の８個のｃＤＮＡについて塩基配列を決定したところ、これら８クローンは全て同じ配列を有しており、最長のｃＤＮＡを有するクローンをｐＳＦＬ４０９とした。このｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：６９に示し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：７０に示す。ｐＳＦＬ４０９のｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列はキンギョソウのカルコン４’位糖転移酵素のものと高いホモロジーを有することが明らかとなった。しかし、キンギョソウのカルコン４’位糖転移酵素ｃＤＮＡと比較すると、ｐＳＦＬ４０９ｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列は開始メチオニンから１０ｂｐ程度を欠く不完全長ｃＤＮＡであった。そこで、Ｇｅｎｅ Ｒａｃｅｒ ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、５’ＲＡＣＥ法にて推定開始メチオニンを含む上流のｃＤＮＡフラグメントを増幅し、これをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたものをｐＳＦＬ４１７とした。この完全長を含むリナリアｃＤＮＡはキンギョソウ４’位糖転移酵素とアミノ酸レベルで６５％配列同一性を示した。
［実施例１６］リナリアのｃＤＮＡの大腸菌における発現と活性測定
大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１のＮｃｏＩサイトとＫｐｎＩサイトへ完全長のリナリアｃＤＮＡを導入し、大腸菌発現系によって本リナリアｃＤＮＡにコードされるタンパク質の活性について解析した。まず、大腸菌発現コンストラクト作製のため、ｐＳＦＬ４１７を鋳型とし、４１７−ＮｃｏＩプライマー（ＣＣＣＡＴＡＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧ）（配列番号５２）と４０９−ＥｃｏＲＩ（ＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧ）（配列番号５３）を用いＰＣＲを行った。これにより、ｐＳＦＬ４１７の開始メチオニンの位置にＮｃｏＩサイトが挿入され、３’側にＥｃｏＲＩサイトが挿入された。これをＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断したものとｐＳＦＬ４０９ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断したものを、大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングし、完全長リナリアｃＤＮＡを有する大腸菌発現用コンストラクト（ｐＳＦＬ４１８）が得られた。
これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、実施例１２と同様にして組換えタンパク質の活性測定を行った。基質にＴＨＣを用い、ｐＳＦＬ４１８を有する大腸菌抽出液を反応させた場合は保持時間３０．０分にＴＨＣの４’位配糖体が検出された。一方、対照実験として、ｐＱＥ６１ベクターを有する大腸菌抽出液をＴＨＣに反応させた場合は、ＴＨＣの４’位配糖体は全く検出されなかった。さらに実施例１２にしたがって、ＰＨＣに対する配糖化活性を測定した。その結果、ｐＳＦＬ４１８を有する大腸菌抽出液を反応させた場合には保持時間２４．３分にＰＨＣ４’位配糖体が検出された。一方対照実験ではＰＨＣ配糖体は検出されなかった。以上の結果から、ＳＦＬ４１８にクローニングされたリナリアのｃＤＮＡは４’ＣＧＴをコードするものと考えられる。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明はカルコン類に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および当該遺伝子を利用して花色が変換された植物に関するものである。更に詳しくは、カルコン類の４’位配糖体を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくはゴマノハグサ科由来の、より好ましくはキンギョソウあるいはリナリア由来のカルコン類の４’位配糖体を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びこれらの遺伝子とオーレウシジン合成酵素（以下、ＡＳという）遺伝子を単独または同時に発現させカルコン類またはオーロン類を蓄積させることにより花の色を改変する手法、好ましくは黄色く改変する手法に関するものである。
【背景技術】
花色は人が花卉を鑑賞あるいは購入する際に重要な形質であり、古くから様々な色の花が育種されてきた。単一の種ですべての色の花をもつ場合はむしろ稀であるが、これは花色として発現する色素の生合成が遺伝的に規定されていることによる。交配育種では利用できる遺伝子資源が交配可能な近縁種に限定されているため、交配によって目的の種においてすべての色の花を作ることは実質的に不可能であった。最近になって、遺伝子組換え技術を利用して、花色素を合成する遺伝子をある植物から取得し、当該遺伝子を別の種で発現することにより花の色を改変することが可能となった（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１））。
花の色のうち、橙、赤、紫、青は主にアントシアニンと総称されるフラボノイドに由来する。黄色は、カロチノイド、ベタレインといったフラボノイド以外の化合物に由来することが多いが、一部の植物種の黄色はフラボノイドに由来する。たとえば、黄色カーネーションには４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン（以下ＴＨＣ）の２’位配糖体が花弁中に存在することが知られている（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１１１（１９９６））。また、キンギョソウ、リナリアにはＴＨＣの４’位配糖体が存在する。
カルコン類としては、ＴＨＣのほか、ブテイン、イソリクイチゲニン等及びこれらの誘導体の配糖体が知られており、カーネーション、アサガオ、ボタン、アスター、ムギワラギク、ニチニチソウ、シクラメン、ペチュニアはＴＨＣ、キンギョソウやスターチスは３，４，２’４’，６’）−ペンタヒドロキシカルコン（ＰＨＣ）、コスモス、キクイモはブテイン、ダリアはブテインおよびイソリクイチゲニンをアグリコンとする配糖体を含んでいる。また、キンギョソウ、リナリア、アサガオなどの限られた種にはオーレウシジン（以下ＡＵ）、ブラックテアチンなどのオーロン類と呼ばれる黄色の花色素が存在する。
オーロンの吸収極大は３９９ｎｍから４０３ｎｍであるのに対し、カルコンの吸収極大は３７２ｎｍから３８２ｎｍであるから、両者の色調は異なり、蛍光のためオーロンのほうが鮮やかな黄色を呈する（バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社）。一般にカルコン類、オーロン類、アントシアニンは植物細胞中では配糖体として液胞中に蓄積する。アントシアニンの生合成経路はよく研究されており、アントシアニンの合成に関与する酵素やそれらをコードする遺伝子が知られている（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９））。
フラボノイドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、また、種間で共通している。ＴＨＣは、３分子のマロニルＣｏＡと１分子のクマロイルＣｏＡからカルコン合成酵素の触媒作用により生合成される。ＴＨＣは薄い黄色を呈するが、植物細胞内では、通常カルコン異性化酵素（ＣＨＩ）により速やかに無色のナリンゲニンに変換される。また、ＴＨＣは中性付近のｐＨではきわめて不安定であり、自発的に閉環してナリンゲニンに変換する。ＴＨＣが植物細胞中で安定に存在、すなわち黄色を安定に呈するためには、ＴＨＣの２’位が糖により修飾され閉環できなくなることが必要である。この反応はＴＨＣの２’位にグルコースを転移する酵素（ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン２’位−糖転移酵素 以下２’ＣＧＴ）により触媒される。
ＴＨＣ２’位配糖体はカーネーション、シクラメンなどに存在することから、２’ＣＧＴもこれらの花に存在すると予測される。したがって、２’ＣＧＴ遺伝子を得る事ができれば、この酵素遺伝子を植物において発現し、ＴＨＣ２’位配糖体を蓄積させ、黄色の花を作成できると考えられていた（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ，ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７））。また、ＴＨＣ２’位配糖体を十分蓄積し黄色を発色させるためにはＣＨＩ遺伝子が欠損し、ＴＨＣからナリンゲニンへの酵素的変換が抑制されること、さらに明瞭な黄色の発色のためにはＣＨＩ遺伝子と他にフラバノン３−水酸化酵素（以下、Ｆ３Ｈという）遺伝子も欠損する必要があることが知られていた（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，５７８（２００２））。
これまでにカーネーションの２’ＣＧＴ遺伝子をクローニングしたという報告はある（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４，ｓ１５８（２００３））がその配列は開示されていない。また、カーネーションから２’ＣＧＴ活性をコードする遺伝子を取得し、ペチュニアで発現させ、ペチュニア花弁においてＴＨＣ２’位配糖体を蓄積した例もある（ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００）。しかしながら、２’ＣＧＴによって生成するＴＨＣ２’位配糖体は、その化学構造上、オーロン合成の前駆体となることが不可能となる。また、前述のようにＴＨＣ２’位配糖体の蓄積では、うすい黄色の花弁にしかならない。
ＴＨＣの２’位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も花弁は淡い黄色となることは知られているが、このメチル化を触媒する酵素やその遺伝子の実体は知られていない。ダリア、コスモスなどの黄色の品種には６’−デオキシカルコンが含まれる。マメ科植物においては、６’−デオキシカルコンは５−デオキシフラボノイドの前駆体であり、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とカルコンリダクターゼ（ＣＨＲ）の触媒作用により生合成される。ペチュニアにアルファルファのＣＨＲ遺伝子を導入したところ、ブテインなどの６’−デオキシカルコン類が生成したことが報告されているが、当該ＣＨＲ遺伝子を白い花をもつペチュニアに導入した場合、つぼみの段階ではごく薄い黄色が見られたが、開花時にはほとんど白であり、産業上有用な黄色の花を作出するに至らなかった（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８））。
前述のようにカルコン配糖体よりもオーロンのほうが鮮やかな黄色を呈するため、オーロンを蓄積させる方法を開発できれば産業上きわめて有用である。オーロンの生合成に関わる酵素の１つであるＡＳとその遺伝子については既に報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００））。この報告によればＡＳはＴＨＣ、ＰＨＣや、これらの配糖体を基質としてＡＵ、ブラクテアチンならびにこれらの配糖体を生成する。しかしながら、ＡＳ遺伝子を用いてＡＵやブラックテアチンなどのオーロンを生物において蓄積させた報告はない。
我々はＡＳ遺伝子を構成的プロモーターの制御下に結合したバイナリーベクターを構築し、アグロバクテリウム法によりペチュニアやトレニアにＡＳ遺伝子を導入したが、オーロンの蓄積は認められなかった。一方、アントシアニジンの３位の配糖化がアントシアニンの液胞への移行に必須であると報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３９７（１９９５））、これと同様にオーロンの配糖化が液胞への移行シグナルとして必須である可能性が考えられる。実際に黄色キンギョソウ花弁に蓄積している主要なオーロンはＡＵの６位の配糖体である。そこで、ＡＵの６位に配糖化活性を示すＧＴ（ＡＵ６ＧＴ）を取得し（ＷＯ ００／４９１５５）、このＡＵ６ＧＴ遺伝子とＡＳ遺伝子を共にペチュニアで構成的に発現させたが、オーロンの蓄積は見られなかった。
フラボノイドやアントシアニンの生合成に関与する酵素は細胞内では細胞質か小胞体に存在すると考えられている。これらの酵素の働きでフラボノイドやアントシアニンは液胞の外側、すなわち細胞質側で合成され、配糖化された後、液胞に輸送される（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３））。ところが、鋭意検討の結果、ＡＳは例外的に液胞内に存在することを本発明者らは明らかにした。このことから生体内では、配糖化されたカルコンが液胞に輸送され、これを基質として液胞内でオーロンが合成されるのではないかという着想を得た。
前述のように黄色キンギョソウ花弁の液胞に蓄積する主要なオーロンはＡＵ ６位配糖体である。ＡＵの６位はＴＨＣの４’位に対応し、黄色キンギョソウ花弁にはＴＨＣ４’配糖体も存在する。これらに基づき、細胞質で合成されたＴＨＣの４’位が配糖化された後、液胞に輸送され、それを基質としてＡＳによってＡＵ６位配糖体が合成されるという一連のオーロン合成経路を推測するにいたった。よってＡＵ６位配糖体などのオーロンを異種植物で合成させるためには、ＴＨＣ４’位配糖体を合成することが必須であると考えた。そのためには、ＴＨＣの４’位を配糖化するＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン４’位糖転移酵素、以下４’ＣＧＴ）が必要であり、４’ＣＧＴ遺伝子を取得する必要がある。しかしながら、４’ＣＧＴ遺伝子は今までにクローニングされた報告もなく、４’ＣＧＴが単離された報告もない。
フラボノイドをはじめ多様な化合物の配糖化反応を触媒して配糖体を生成する酵素は、一般に糖転移酵素（ＧＴ）と呼ばれ、植物は、基質及び転移する糖の種類に対応した多様な分子種のＧＴおよびそれらをコードする遺伝子を持っている。ＧＴは通常ＵＤＰ−グルコースをグルコース供与体として利用するので、そのアミノ酸配列中にＵＤＰ−グルコースに結合するモチーフを含んでいる（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１））。このモチーフを有するＧＴ遺伝子は、すでにゲノムの全構造が明らかになっているアラビドプシスには９９種あることが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。
また他の植物からも、いくつかのＧＴのアミノ酸配列と機能が解明されている。フラボノイドあるいはアントシアニジンの３位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−糖転移酵素、以下３ＧＴ）の遺伝子は、シソ、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどから得られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。また、アントシアニンの５位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−糖転移酵素、以下５ＧＴ）の遺伝子は、シソ、バーベナなどから得られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，７４０５，（１９９９））。
３ＧＴや５ＧＴのアミノ酸配列の解析から、同一機能を有するＧＴは植物種が異なっていてもアミノ酸配列は類似していること、すなわちファミリーを形成することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１））。よって、既知のＧＴと同一機能を有する酵素（オルソログ）を他の植物種から得る事は、現在の技術水準からすれば困難ではない。たとえば、ペチュニアの５ＧＴ遺伝子は、シソの５ＧＴ遺伝子を用いてクローニングされた（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１（２００２）．）。しかしながら、同一の機能を有する酵素が全く得られていない新規ＧＴ遺伝子の取得には多大の試行錯誤と困難が伴う。
前述のように全ゲノム構造が明らかになっているアラビドプシスであるが、その花弁は白く、カルコン４’位配糖体の蓄積は報告されていない。したがって、アラビドプシスのＧＴ遺伝子の情報を利用して４’ＣＧＴ遺伝子のクローニングを行うことはできない。また、カーネーションから２’ＣＧＴが単離（ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００）されているが、４’ＣＧＴ遺伝子と２’ＣＧＴの相同性が高いことは必ずしも期待できない。なぜならば、基質が共通であっても糖を付加する位置が異なれば、それぞれのＧＴの生化学的および分子生物学的特性は大きく異なる可能性が考えられるからである。これは、３ＧＴと５ＧＴが別のＧＴファミリーに属することによっても支持される。また、ベタニジンの５ＧＴと６ＧＴは基質が共通にも関わらず、アミノ酸同一性は１９％しかないことが報告されている（Ｐｌａｎｔａ ２１４，４９２（２００２））。
事実、共通のアントシアニジン骨格の３位、５位または３’位に糖を転移する各ＧＴは、ＧＴスーパーファミリーの中の異なるファミリーに属し、これらのファミリー間のアミノ酸同一性は２０％程度に過ぎない（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，（２００３），Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３））。４’ＣＧＴ遺伝子のみならず、新規の遺伝子を取得するには一般にいくつかの方法が考えられる。たとえば花弁で発現しているバラの香り成分の合成に関与する酵素の遺伝子は、遺伝子を網羅的に配列決定し、それらの構造、発現様式、大腸菌での発現によって同定された（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１４，２３２５（２００２））。そこで４’ＣＧＴ遺伝子を同定するためにオーロンおよびカルコン４’配糖体を蓄積する黄色キンギョソウ（品種バタフライイエロー）花弁由来のｃＤＮＡライブラリーからランダムに５０００クローンを選び、これらの塩基配列を決定した。
公知のＤＮＡデータベースを用いたホモロジー検索の結果、３種のＧＴ遺伝子が得られた。そのうち２種は３ＧＴ遺伝子および前述の、ＡＵ６ＧＴをコードする遺伝子（ＷＯ００／４９１５５）、残る１種が新規ＧＴ（ｐＳＰＢ６６２と命名）であった（配列番号：１３）。しかし、ｐＳＰＢ６６２にコードされるＧＴはＴＨＣに対する配糖化活性を示さず、４’ＣＧＴではないことが明らかとなった。また、前述のように同遺伝子とＡＳ遺伝子とを共にペチュニアにおいて高発現させた結果、カルコン配糖体およびオーロンの生成は確認されず、花色についても変化は認められなかった。これらの結果から、５０００クローン程度のランダムスクリーニングによってはカルコン配糖化酵素遺伝子を単離できないことが示唆され、４’ＣＧＴ遺伝子を取得するのは、困難であった。
【特許文献１】 ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００
【特許文献２】 ＷＯ ００／４９１５５
【非特許文献１】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）
【非特許文献２】 Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１）
【非特許文献３】 Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５，１１１（１９９６）
【非特許文献４】 バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社
【非特許文献５】 Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９）
【非特許文献６】 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ，ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７）
【非特許文献７】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，５７８（２００２）
【非特許文献８】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４，ｓ１５８（２００３）
【非特許文献９】 Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８）
【非特許文献１０】 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００）
【非特許文献１１】 Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３９７（１９９５）
【非特許文献１２】 Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２８８，（２００３）
【非特許文献１３】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１）
【非特許文献１４】 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１）
【非特許文献１５】 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９）
【非特許文献１６】 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１（２００２）
【非特許文献１７】 Ｐｌａｎｔａ ２１４，４９２（２００２）
【非特許文献１８】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，２００３（２００３）
【非特許文献１９】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．１４，２３２５（２００２）
【発明の開示】
本発明は、カルコン類の４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質及びその遺伝子、好ましくはカルコン類の４’位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質及びその遺伝子を提供することにある。さらに当該ＧＴ遺伝子を用いて花色を改変、好ましくは黄色に変化させた植物体を提供することにある。
前述のように、４’ＣＧＴの生化学的あるいは分子生物学的な性質は知られておらず、酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。発明者らは、黄色キンギョソウ（バタフライイエロー）の花弁ｃＤＮＡライブラリーからＧＴファミリーの保存アミノ酸配列に対応した塩基配列を有するプローブを用いて、当該保存アミノ酸配列の塩基配列を有するＧＴ遺伝子を十種類取得した。さらに、当該ＧＴ遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、その中に、当該大腸菌の抽出液中にカルコンの４’位にグルコースを転移する活性、すなわち４’ＣＧＴ活性を確認し、クローン化した遺伝子が４’ＣＧＴをコードすることを確認した。この遺伝子を植物中で発現させ、花色を改変し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１）カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（３）配列番号１に記載する塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記（１）に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（５）配列番号１に記載する塩基配列の一部または全部からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記（１）記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（６）ゴマノハグサ科由来である前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、（７）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、（８）前記（７）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、（９）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
本発明はまた、（１０）前記（７）に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法を提供する。
本発明はまた、（１１）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、またはそれら植物体の組織を提供する。
本発明はまた、（１２）前記（１１）に記載の植物体の切り花を提供する。
本発明はまた、（１３）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を用いてカルコン類の４’位に糖を転移する方法を提供する。
本発明はまた、（１４）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体に導入・発現して得られる、花色が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体を提供する。
本発明はまた、（１５）花色が黄色味を帯びていることを特徴とする前記（１４）に記載の植物体を提供する。
本発明はまた、（１６）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１７）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１８）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、（１９）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、植物における典型的なフラボノイド合成経路を示す。ここに記載された酵素遺伝子の有無により植物種ごとに代謝経路の末節は異なる。たとえば、黄色のキンギョソウ花弁においてはアントシアニン合成経路と共にオーロン合成に至る経路も存在するが、同じゴマノハグサ科の植物であるトレニアは、４’ＣＧＴ、ＡＳ遺伝子を有しないため、オーロン類を合成することは出来ない。図中の略称については以下参照。ＣＨＳ，カルコン合成酵素；ＣＨＩ，カルコン異性化酵素；Ｆ３Ｈ，フラバノン３−水酸化酵素；ＤＦＲ，ジヒドロフラボノール４−還元酵素；ＡＮＳ，アントシアニジン合成酵素；３ＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−配糖化酵素；ＦＬＳフラボノール合成酵素；ＦＮＳ，フラボン合成酵素；Ｆ３’Ｈ，フラボノイド３’−水酸化酵素；Ｆ３’，５’Ｈ，フラボノイド３’，５’−水酸化酵素；２’ＣＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン２’位糖転移酵素；４’ＣＧＴ，ＵＤＰ−グルコース：４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン４’位糖転移酵素；ＡＳ，オーレオシジン合成酵素
図２は、図１の続きである。
図３は、形質転換体トレニアのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。ｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７、ｐＳＦＬ３０８導入の形質転換体トレニア（品種サマーウェーブブルー）葉よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＫｐｎＩ切断後、４’ＣＧＴ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションに供した。各レーンの上の数字は導入遺伝子コンストラクトおよび形質転換体系統番号を記す。ＳＷＢは宿主として用いたサマーウェーブブルーである。Ｍ１、Ｍ２はＤＩＧラベルしたサイズマーカー（ロシュ）であり、各バンドのサイズを図の左右に記す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号２に記載したアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、もとのタンパク質と同等の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、４’ＣＧＴ活性を保持しているタンパク質である限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。なお、複数個とは、２〜３０個、好ましくは２〜９個をいう。
本発明はまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、５ｘＳＳＣ、５０℃といった比較的温和な条件下でハイブリダイズし、かつ４’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。さらに、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ４’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の技術的範囲に属する。ここでいうストリンジェントな条件とは、例えば２ｘＳＳＣ、６５℃があるが、ハイブリダイゼーションの条件はプローブに用いるＤＮＡの長さ及び塩基組成によって異なるから、この条件に限定されない。
上述ようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、好ましくはゴマノハグ科由来のもの、さらに好ましくはキンギョソウ、リナリア、ウンラン由来の遺伝子が挙げられるが、植物由来に限定されるものではない。すなわち、本発明の４’ＣＧＴ遺伝子は、キンギョソウ、リナリア、ウンラン由来の４’ＣＧＴ遺伝子に限定されるものではなく、カルコン類４’位配糖体を含む他の生物種に由来する４’ＣＧＴ遺伝子であれば、いずれでも黄色の花を育種するのに用いることができる。４’ＣＧＴ遺伝子を含む合成ＤＮＡも、植物由来の遺伝子と同様に用いることができる。
また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
ＧＴの保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すように、例えばキンギョソウやリナリア花弁から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有するＧＴをコードするＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えばアミノ酸配列を改変したいＤＮＡ断片をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望のアミノ酸配列の改変に対応したプライマーを用い、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望のアミノ酸配列の改変に対応したＤＮＡ断片を得ることができる。その後、この改変を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。このようなＤＮＡを化学的に合成することもできる。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
このようにして得られたＧＴ遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、当該大腸菌又は酵母の抽出液中の４’ＣＧＴの活性を測定することにより、得られたＧＴ遺伝子が４’ＣＧＴを示すタンパク質をコードすることを確認することができる。４’ＣＧＴの活性は、例えば実施例３に記載したように、逆相樹脂に４’ＣＧＴの基質となるカルコン類を吸着させ後、当該逆相樹脂をＧＴ遺伝子で形質転換した大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、生成したカルコン４’配糖体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析することにより測定できる。
さらに、得られた４’ＣＧＴ遺伝子を適切な宿主細胞で発現させることにより、当該遺伝子の産物である４’ＣＧＴタンパク質を得ることができる。あるいはまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を有するタンパク質又はペプチドに対する抗体を用いて他の生物の４’ＣＧＴ遺伝子を発現クローニングによって得ることもできる。
本発明はまた、４’ＣＧＴ遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス．スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。
真核細胞としては、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、ｔｒｐＣ等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
植物の発現ベクターの構築は、例えばアグロバクテリウムを用いる場合にはｐＢＩ１２１などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合にはｐＵＣ１９などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、４’ＣＧＴ遺伝子を導入した形質転換植物体を得ることができる。当該形質転換植物を栽培することにより、開花させ、花色が改変された植物体を得ることができる。
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を培養又は栽培し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする４’ＣＧＴタンパク質を回収、精製することができる。
本発明はキンギョソウやリナリアの４’ＣＧＴ遺伝子のみに限定されるものではなく、４’ＣＧＴあるいは４’ＣＧＴ遺伝子の起源としては、植物でも動物でも微生物でも合成したものであってもよく、４’ＣＧＴ活性を有していれば同様に花色改変へ利用できる。本発明はまた、４’ＣＧＴ遺伝子の利用に関するものであり、４’ＣＧＴ遺伝子を植物体に導入・発現することにより、花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体もしくはこれらの植物の栄養増殖体又はこれら植物体の組織も本発明の技術的範囲であり、組織の形態としては切り花であってもよい。また４’ＣＧＴ遺伝子のみでなく、４’ＣＧＴ遺伝子に加えＡＳ遺伝子も共に植物体へ導入、発現させたり、さらに加えて、宿主が本来有するフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体もしくはこれらの植物の栄養増殖体またはこれら植物体の組織も本発明の技術範囲であり組織の形態としては切花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、アサガオ、ベゴニア、インパチエンス、ゼラニウム、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、レンギョウ、ベゴニア、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワーなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
【実施例】
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、ＷＯ９６／２５５００あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
［実施例１］黄色キンギョソウ花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のキンギョソウである品種バタフライイエローの新鮮な花弁５ｇから論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０，１１６３（２０００））に記載のようにしてｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、１．６ｘ１０５ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔからなっていた。
［実施例２］４’ＣＧＴ遺伝子のスクリーニング１
すでに開示されているＧＴのアミノ酸配列を比較し、これらのアミノ酸配列の保存領域に相当する塩基配列を増幅し、これをプローブとして実施例１で述べたキンギョソウｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
プローブに用いたＧＴはアサガオ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−グルコシド糖転移酵素（３ＧＧＴ）（特開２００３−２８９８８４）、ペチュニア由来３ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４０１、（２００２））、バーベナ由来５ＧＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５（１９９９））、コガネバナＧＴ（ＳＢＧＴ、Ｐｌａｎｔａ ２１０，１００６（２０００））、リンドウ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニン３’−糖転移酵素（３’ＧＴ）（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２，１６５２，（２００３））配列の５種である。それぞれＧＴについて、保存された領域の配列を増幅できるように１組のオリゴヌクレオチドを合成した。これらオリゴヌクレオチドの配列を配列番号：３〜１２に示す。
アサガオ３ＧＧＴ
ペチュニア３ＧＴ
バーベナ５ＧＴ
コガネバナＧＴ
リンドウ３’ＧＴ
プローブはノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型として１ｎｇのそれぞれのｃＤＮＡを含むプラスミドを用い、プライマーとして、上記の各遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド１００ｎｇを使用し、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分からなる反応を１サイクルとし、これを２５サイクル行った。各遺伝子のＰＣＲ増幅産物を等量混合したものをハイブリダイゼーションのプローブとして、実施例１に記載のキンギョソウ由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションは、３０％ホルムアミド、１％ＳＤＳを含む５ＸＳＳＣ中、３７℃で一晩行い、フィルターの洗浄は５ｘ ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間行った。スクリーニングによるポジティブシグナルの検出はノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、製造者の推奨する方法に従った。約３０万プラークをスクリーニングし、最終的に１０種類の完全長糖転移酵素遺伝子を含むクローンを得、これらをｐＳＰＢ２６４，１６２１，１６２０，１６２２，１６１０，１６０９，１６１７，１６１５，６６０，６５８とした。ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によってこれらｃＤＮＡ配列を決定した。これらｃＤＮＡのアミノ酸コード領域の塩基配列を配列番号１４〜２３に示した。
［実施例３］大腸菌を用いたカルコンＧＴ活性の測定
３−１ 大腸菌発現ベクターの構築と大腸菌におけるＧＴの発現
実施例２で得られた１０種類のｃＤＮＡにコードされるＧＴ活性を大腸菌発現系を用いて解析した。まず、各ｃＤＮＡの大腸菌発現コンストラクトを作製した。ＰＣＲ法によって各ｃＤＮＡの開始コドンと考えられる塩基配列ＡＴＧに重なる様にＮｃｏＩサイトを導入し、開始メチオニンから終止コドンに至る領域を大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ、またはＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶサイトに連結した。
開始メチオニンに重なるＮｃｏＩサイト導入のためのＰＣＲ液（２５μｌ）は、各ＧＴｃＤＮＡを鋳型とし、開始メチオニン部位に重なるＮｃｏＩ認識配列を導入したプライマー、及びストップコドン付近の３’側から５’側に向けてのプライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ，１ｘ ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，，ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２８サイクル行い、最後に７２℃で５分間処理した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。増幅されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を解析し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認したのち、大腸菌発現ベクターｐ ＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）に導入した。
例えばｐ ＳＰＢ１６１７にコードされるｃＤＮＡ（配列番号：２０）については、配列表に示した１６１７ＢａｍＨＩＮｃｏＩ−ＦＷ（配列番号：２４）ならびに１６１７ＸｈｏＩＫｐｎＩ−ＲＶ（配列番号：２５）の二種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、開始メチオニン部位に重なるＮｃｏ１サイトと、終始コドンの３’側にＫｐｎＩ認識配列を導入した。増幅されたＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングした。塩基配列にＰＣＲによるエラーがないことを確認後、ＮｃｏＩとＫｐｎＩで切り出したＤＮＡ断片をｐ ＱＥ６１のＮｃｏＩおよびＫｐｎＩサイトに連結し、ｐ ＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡの大腸菌発現ベクターであるｐＳＰＢ１６４２を得た。同様にして１０種類のＧＴ ｃＤＮＡの大腸菌発現ベクターを構築した。
１６１７ＢａｍＨＩＮｃｏＩ−ＦＷ
１６１７ＸｈｏＩＫｐｎＩ−ＲＷ
各発現ベクターを大腸菌株ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に導入し、３７℃で終濃度２０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩前培養した。前培養液の１ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ，カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地、５０ｍｌに加えＡ６００＝０．６−１．０に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．１ｍＭになるよう加え、さらに２７℃で一晩振とう培養し、３０００ｒｐｍ，１０分間、４℃で遠心し、集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０（ＢＲＡＮＳＯＮ社）での超音波処理により大腸菌を破砕した後、１５，０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とし、以下の活性測定に用いた。
３−２ 酵素活性の測定
Ｈ２Ｏで平衡化済みの逆相樹脂、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（ＴＯＳＯＨ）１ｍｌにＴＨＣ（５００μｇ／ｍｌエタノール溶液）をＨ２Ｏで希釈しながら負荷した後、水洗することにより、樹脂に固定された基質ＴＨＣを得た。この樹脂固定されたＴＨＣ １００μｌに３−１で得られた粗酵素液２００μｌおよび５ｍＭ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ １０μｌを加え、３０℃で１時間反応させた。遠心して上清を除去後、沈殿した樹脂を水洗し、０．１％ ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル３００μｌに懸濁し、超音波処理によりフラボノイドを樹脂より遊離した。１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ０．４５ｍｍ、４ｍｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ、ミリポア）を用いて不溶物を除去して、上清を液体高速クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）で分析した。カルコンおよびその配糖体の分析条件は以下の通りである。
カラムはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ−３０−ＵＧ−５（４．５ｍｍφｘｌ５０ｍｍ、野村化学）を用いて、移動相にはＡ液として０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルを用い、Ｂ液２０％からＢ液７０％の直線濃度勾配１０分間の溶出後、Ｂ液７０％で５分間維持した。流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所）による２５０−４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間１０．７分に溶出され、その２’位配糖体および４’位配糖体は８．５分に溶出されることをＴＨＣ及びＴＨＣの２’位および４’位配糖体の標品を用いて確認した。
ｐＳＰＢ１６４２を発現する大腸菌の抽出液を反応させたとところ、基質ＴＨＣに加え、８．５分に溶出される新たな生成物が検出された。これらはｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液およびｐＳＰＢ１６４２を発現する大腸菌の粗酵素液を煮沸した溶液を反応させたものでは検出されなかったことからｐＳＰＢ１６４２から発現されるＧＴによって生じた生成物と考えられる。さらに１Ｈ ＮＭＲ分析によって本生成物の構造を調べた。分析にはＪＮＭ−ＥＸ４００（ＪＥＯＬ）を用い、その他の分析条件は論文（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３２、１６５２（２００３））に記載のとおりである。この結果、ｐＳＰＢ１６４２の発現産物によって生じたＴＨＣ配糖体はＴＨＣ２’位配糖体であることが明らかとなった。よって、ｐ ＳＰＢ１６４２によって発現されるｃＤＮＡ、つまりｐＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡは２’ＣＧＴ活性を有するタンパク質をコードしていると考えられた。
［実施例４］４’ＣＧＴ遺伝子のスクリーニング２
黄色キンギョソウ花弁のｃＤＮＡライブラリー約３０万クローンをｐＳＰＢ１６１７ｃＤＮＡ全長をプローブとして再度スクリーニングした。ＰＣＲによるプローブラベリングには、１６１７−Ｆ（配列番号：２６）ならびに１６１７−Ｒ（配列番号：２７）プライマーを用い、実施例２記載の方法と同様に行った。スクリーニングと塩基配列の解析方法も実施例２と同様である。
１６１７−Ｆ
１６１７−Ｒ
その結果、新規ＧＴ遺伝子を５種、ｐＳＰＢ１７２１、１７２４、１７２３、１７１９、１７２５を得た。それぞれの配列を配列表に示した（配列番号：２８〜３１及び１）。
このうちｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡは、４５７アミノ酸からなる分子量５０．８ｋＤａ、等電点６．８２のタンパク質をコードする１３７４ｂｐ（ストップコドンを除く）の翻訳領域を含んでいた。ｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列（配列番号：２）を、すでに報告のあるＧＴのアミノ酸配列と比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９、５０９（１９９９））と１４％、シソ由来５ＧＴと１８％、シソ由来３ＧＴと１８％、リンドウの３’ＧＴと２３％、プローブとして用いたｐ ＳＰＢ１６１７にコードされるタンパク質のアミノ酸配列とは３１％の同一性しか示さなかった。なお、ホモロジー解析に使用したソフトフェアはＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．６．５．３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷで、条件は、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｌｏｓｕｍ ３０、ｋｅｔｕｐｌｅ：１、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：３、Ｔｏｐｄｉａｇｏｎａｌｓ：５、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｉｚｅ：５で行った。
［実施例５］得られたｃＤＮＡの大腸菌における発現
５−１．発現ベクターの構築
実施例４で得られた５種類のｃＤＮＡについて、大腸菌発現系を用い各ｃＤＮＡにコードされるタンパク質の酵素活性の測定を調べた。発現ベクターの構築ならびに発現方法、活性測定方法は実施例３と同様である。例えばｐＳＰＢ１７２５については、開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマー２種１７２５−ＮｃｏＩ（配列番号：３２）、１７２５−ＫｐｎＩ（配列番号：３３）を用いてＰＣＲ反応を行った。
１７２５−ＮｃｏＩ
１７２５−ＫｐｎＩ
ＰＣＲ液（２５μｌ）は、ｐ ＳＰ１７２５ ＤＮＡ １０ｎｇ，１ｘ ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１７２５−ＮｃｏＩ，１７２５−ＫｐｎＩプライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ，ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。
反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２８サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。増幅産物の塩基配列を確認したのち、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ処理によってｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒから切り出される約１．４ＫｂのフラグメントをｐＱＥ６１（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩとＫｐｎＩサイトに連結し、大腸菌発現ベクターｐ ＳＰＢ１７６８を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株（ＴＯＹＯＢＯ）に導入した。他の４種類のｃＤＮＡについても同様にしてそれぞれｐＱＥ６１を用いた大腸菌発現ベクターを構築し、ＪＭ１０９に導入した。
５−２ 組換えタンパク質の大腸菌における発現とＧＴ活性測定
実施例５−１で得られた大腸菌形質転換株を、実施例３と同様の条件で培養し、それぞれのｃＤＮＡにコードされるタンパク質の活性測定を行った。その結果、ｐ ＳＰＢ１７６８を含む大腸菌の粗酵素液とＴＨＣの反応物中に、ＴＨＣ配糖体と思われるピークを検出した。このＴＨＣ配糖体をさらに詳しく同定するために、以下に記載のＴＨＣ２’位配糖体とＴＨＣ４’位配糖体を分離する条件にて再度ＨＰＬＣ分析を行った。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφｘ１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ，Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配１５分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配１０分間の溶出の後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所）による２５０−４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。
この条件で、ＴＨＣは保持時間２６．７分に溶出され、ＴＨＣ２’位配糖体は１９．８分、ＴＨＣ４’位配糖体は２０．６分に溶出される。ｐＳＰＢ１７６８を発現する大腸菌抽出液とＴＨＣの反応液中に見出されたＴＨＣ配糖体は本条件による分析で２０．６分に溶出されたのでＴＨＣ４’位配糖体であると考えられた。これはｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからｐ ＳＰＢ１７２５にコードされるＧＴによって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ｐ ＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡにコードされるＧＴはＴＨＣの４’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有することが確認された。
また、本反応液中にはＴＨＣ４’位配糖体に加えて１５．５分に溶出される新たなピークが検出された。この物質はナリンゲニンの吸収スペクトルを示し、ナリンゲニン７位配糖体標品と保持時間が一致した。よってこの１５．５分に溶出された生成物はｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴによって生成したＴＨＣ４’位配糖体が、配糖化後に閉環して生じたナリンゲニン７位配糖体あるいはＴＨＣが閉環して生じたナリンゲニンに、４’ＣＧＴが作用して生じたナリンゲニン７位配糖体と考えられる。
［実施例６］キンギョソウ花弁における４’ＣＧＴ遺伝子の発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ法によってｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴ遺伝子の黄色キンギョソウ花弁における発現様式を解析した。オーロン類を蓄積する黄色キンギョソウ（バタフライイエロー品種）の花弁を成長段階に沿って５ステージに分離した。若い順に、ステージ１（蕾花弁長１ｃｍ以下），２（蕾か弁長１．０−１．５ｃｍ），３（蕾花弁長１．５−２．０ｃｍ），４（花弁長２．０−２．５ｃｍ、開花直前）および５（花弁長２．５ｃｍ以上、開花後の花弁）の５段階とし、ステージ５は成熟した花弁に対応する。
分離した花弁から１ｇからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ １μｇを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を利用し、合成条件は本システム製造業者が推奨する条件に従った。得られたステージ別のｃＤＮＡを鋳型に、実施例５に記載の１７２５−Ｎｃｏ１（配列番号：３２）および１７２５−Ｋｐｎ１プライマー（配列番号：３３）を用いてＰＣＲを行った。また、４’ＣＧＴ遺伝子発現量と内在遺伝子発現量とを比較するために、内部標準遺伝子としてキンギョソウのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子（配列番号：３４）を用い（Ｎａｔｕｒｅ ３３９，４６（１９８９））、本遺伝子増幅のためにＡｍＧＡＰＤＨ−Ｆ（配列番号：３５）、ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｒ（配列番号：３６）のプライマーを合成した。また、比較対象遺伝子としてキンギョソウのＡＳ遺伝子増幅のためにＡｍＡＳ−Ｆ（配列番号：３７）、ＡｍＡＳ−Ｒプライマー（配列番号：３８）を合成した。
ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｆ
ＡｍＧＡＰＤＨ−Ｒ
ＡｍＡＳ−Ｆ
ＡｍＡＳ−Ｒ
ＰＣＲ条件は実施例３と同様の反応組成で、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分を１２サイクル行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で分離した後、常法によってＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンメンブレン（アマシャム）にブロッティングし、ハイブリダイゼーションによる増幅産物の検出を行った。ハイブリダイゼーション方法については前述のノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システムＤＩＧ ＤＮＡ標識及び検出キットを用い、製造者の推奨する方法に従った。プローブには、キンギョソウのＡＳ、ＧＡＰＤＨおよびｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴのｃＤＮＡを用い、実施例２同様にして、上記の各遺伝子特異的プライマー（配列番号３２，３３，３５〜３８）を用いてＤＩＧラベリングを行った。
その結果、４’ＣＧＴ遺伝子及びＡＳ遺伝子はともにステージ４で発現がピークに達し、経時的に同様の発現パターンを示すことが分かった。さらに両遺伝子の発現パターンは黄色キンギョソウ花弁に含まれるカルコン４’位配糖体およびオーロン類の蓄積パターンに矛盾しないと考えられた（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６０，２２９（２００１））。
以上の結果からｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴ遺伝子は、キンギョソウ花弁内においてＡＳ遺伝子と同一の発現制御支配下に存在することが考えられ、両者は同一の生合成経路、すなわちオーロン類の生合成経路に関わっていると考えられる。
［実施例７］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現
７−１ ４’ＣＧＴ発現カセットの構築
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５（１９９６））をＳｎａＢＩで消化し、再連結することによりｏｍｅｇａ配列を除き、得られたプラスミドをｐＵＥ６とした。一方、ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）をＡｓｃＩで消化し、平滑末端化後、ＰａｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＰＰとした。ｐＵＥ６のＥｌ２３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでを有する断片を、ｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに挿入しｐＳＰＢ５４０を得た。ｐＳＰＢ５４０のＧＵＳ遺伝子部分をｐＳＰＢ１７２５から切り出される４’ＣＧＴ ｃＤＮＡ断片に置換し得られたプラスミドをｐＳＦＬ２０３とした。すなわち、ｐＳＦＬ２０３はｐＵＣＰＰをベクターとし、Ｅｌ２３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターで制御される４’ＣＧＴ発現カセットを有するものである。
７−２ ＡＳ発現カセットの構築
キンギョソウ由来のＡＳ ｃＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０，１１６３，（２０００））がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミドをｐＳＰＢ２５１とした。ｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）にＭａｃＩプロモーター、ｐＳＰＢ２５１から切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片、ＭＡＳターミネーターを連結したＡＳ発現コンストラクトをｐＳＰＢ１６２４とした。
７−３ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現コンストラクトの作製
７−１に記載のｐＳＦＬ２０３をＰａｃＩで切断し、カルコン配糖化酵素遺伝子発現カセットを切り出し、これを７−２記載のｐＳＰＢ１６２４のＰａｃＩサイトに挿入した。得られたコンストラクトをｐＳＦＬ２０１とした。よってｐＳＦＬ２０１は植物細胞に導入された場合、４’ＣＧＴ遺伝子とＡＳ遺伝子が構成的に発現するように設計されている。
［実施例８］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＤＦＲの抑制
８−１トレニア由来のＤＦＲ遺伝子発現抑制カセットの構築
トレニアのジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）ｃＤＮＡについては論文（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３，３３，２０００）に記載のようにして取得した。トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡがベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−と連結したプラスミドをｐＴＤＦ１０とした。これを鋳型とし、ベクター配列に由来するＭ１３リバースプライマー（配列番号３９）とトレニアＤＦＲｃＤＮＡ配列に塩基置換でＮｃｏＩ認識部位を導入したプライマーＴｈＤＦＲ−ＮｃｏＩ（配列番号４０）を用いて、実施例３に記載のようにしてＰＣＲを行った。得られた約０．７５ｋｂのフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、塩基配列を確認したのち、ＳａｃＩとＮｃｏＩで０．７５ｋｂのトレニアＤＦＲ ｃＤＮＡ配列を切り出した。
またｐＴＤＦ１０をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断し、トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡの５’末端から１．１ｋｂを含むフラグメントを回収した。一方、７−１記載のｐＵＣＡＰをＰａｃＩで消化し、平滑末端化後、ＡｓｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＡＡとした。このｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに、ｐＵＥ６から切り出したＥｌ２３５Ｓプロモーター〜ＧＵＳ〜ＮＯＳターミネーターに至るフラグメントを挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ５４１とした。ｐＳＰＢ５４１をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子部分を除き、ここに、トレニアＤＦＲ ｃＤＮＡ由来の０．７５ｋｂのフラグメントとおよび１．１ｋｂのフラグメントを、両フラグメントのＮｃｏＩ部位が連結する方向に挿入した。このようにして得られたプラスミドｐＳＦＬ３１４は、植物体内の導入された場合、Ｅｌ２３５Ｓプロモーターの制御下、トレニアのＤＦＲ ｃＤＮＡ配列に由来する二本鎖ＲＮＡを転写し、ＲＮＡｉ法によってトレニアのＤＦＲ遺伝子発現を抑制することができるものである。
Ｍ１３リバースプライマー
ＴｈＤＦＲ−ＮｃｏＩ
８−２ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＤＦＲ遺伝子発現の抑制のためのコンストラクトの構築
７−１記載のｐＵＥ６のＮＯＳターミネーター上流にＸｈｏＩリンカーを挿入した。このプラスミドをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られるＥｌ２３５Ｓプロモーター〜ベクター〜ＮＯＳターミネーターからなる断片と７−２記載のｐＳＰＢ２１５からＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ２１１を得た。ｐＳＰＢ２１１からＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩでＡＳ発現カセットを切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドのＰａｃＩサイトに、７−１記載のｐＳＦＬ２０３をＰａｃＩ切断して得られる４’ＣＧＴ発現カセットを挿入し、４’ＣＧＴとＡＳの発現カセットがタンデムに連結したｐＳＦＬ３０４を得た。さらに８−１記載のトレニアＤＦＲ二本鎖ＲＮＡ転写カセットをｐＳＦＬ３０４のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＦＬ３０７を得た。つまりｐＳＦＬ３０７は４’ＣＧＴとＡＳの発現ならびにトレニアのＤＦＲ遺伝子発現抑制のための３つのカセットを有する。
［実施例９］植物における４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現の抑制
９−１トレニア由来のＦ３ＨｃＤＮＡのクローニングと同遺伝子発現抑制カセットの構築
シソから得られたＦ３Ｈ ｃＤＮＡ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３５，９１５（１９９７））をプローブとして、トレニアの同酵素をコードするｃＤＮＡを取得した。すなわち、実施例２同様にして、トレニアｃＤＮＡライブラリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，６，２３９，２０００）約２０万のファージをスクリーニングした結果、配列番号４１に示すトレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡを得た。トレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡがベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−と連結したプラスミドをｐＳＰＢ２６６とした。これを鋳型とし、ベクター配列に由来するＭ１３リバースプライマー（配列番号３９）とトレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に塩基置換でＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマーＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−１（配列番号４２）を用いて、実施例３同様にしてＰＣＲを行った。
得られた約０．９ｋｂのフラグメントをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローニングし、塩基配列を確認した。同様にして、トレニアＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に塩基置換でＳａｌＩ認識部位を挿入したプライマーＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−２（配列番号４３）とＭ１３リバースプライマーを用いて、約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を調整し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、塩基配列を確認した。実施例８−１に記載のｐＳＰＢ５４１をＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳ遺伝子部分を除き、ここにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯからＢａｍＨＩとＳａｌＩ切断で切り出した０．９ｋｂのフラグメントと、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯからＳａｃＩとＳａｌＩ切断で切り出した０．７ｋｂのフラグメントを両フラグメントのＳａｌＩ部位が連結するように挿入した。このようにして得られたプラスミドｐＳＦＬ３１３は、植物体内に導入された場合、Ｅｌ２３５Ｓプロモーターの制御下、トレニアのＦ３Ｈ ｃＤＮＡ配列に由来する二本鎖ＲＮＡを転写し、ＲＮＡｉ法によってトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現を抑制するものである。
ＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−１
ＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ−２
９−２ ４’ＣＧＴとＡＳの共発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現の抑制のためのコンストラクトの構築
９−１記載のｐＳＦＬ３１３からＡｓｃＩ切断によりトレニアＦ３Ｈ ＲＮＡｉカセットを切り出し、実施例８−２記載のｐＳＦＬ３０４のＡｓｃＩサイトに挿入し、ｐＳＦＬ３０８を得た。つまりｐＳＦＬ３０８は４’ＣＧＴとＡＳの発現ならびにトレニアのＦ３Ｈ遺伝子発現抑制のための３つのカセットを有する。
［実施例１０］植物における遺伝子発現と花色分析
実施例７−９で述べたｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７およびｐＳＦＬ３０８を公知の方法でトレニア（品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社））に導入した。形質転換の方法はＭｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．６，２３９，（２０００）に記載の方法にしたがった。選択マーカー耐性を示した個体を選抜し、それぞれの花色を観察した。ｐＳＦＬ２０１導入株では、得られた３５系統の形質転換体のうち、２２系統において宿主と比べて花色変化が見られ、黄色味を帯びた青、もしくは黄色味を帯びたグレーを示した。
しかし、完全に黄色になったものはなかった。ｐＳＦＬ３０７導入株では得られた３６系統の形質転換体のうち、１９系統において宿主と比べて花色変化が見られた。さらに、花色が変化した１９系統のうち６系統については宿主本来の青い色がほとんど混在せず、ほぼ完全な黄色花色を呈していた。またｐＳＦＬ３０８導入株では得られた３９系統の形質転換体のうち、２４系統において宿主と比べて花色変化が見られた。さらに、花色が変化した２４系統のうち１７系統については宿主本来の青い色がほとんど混在せず、ほぼ完全な黄色花色を呈していた。
花色変化が比較的顕著であったものについて色素分析を行った。
元株および各形質転換体の花弁を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりオーレウシジン６位配糖体およびアントシアニジンの分析を行った。アントシアニジン分析については花弁より抽出したフラボノイドを６Ｎ ＨＣｌに溶解し、沸騰水中に２０分間保持することにより加水分解後、アミルアルコールにてフラボノイドを再抽出したものを分析に供した。ＨＰＬＣ条件はそれぞれ以下のとおりである。
まずＡＵ６位配糖体の検出には、ＳＨＩＭ−ＰＡＣＫ ＦＣ−ＯＤＳカラム（５０×４．６ｍｍ、島津製作所）を用い、移動相にはＡ液として０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｂ液１０％から２３％の直線濃度勾配３分間の溶出後、Ｂ液２３％で１７分間維持し、さらにＢ液２３％から８０％の直線濃度勾配２分間の溶出後、Ｂ液８０％で３分間維持した。さらにＢ液８０％から１０％の直線濃度勾配２分間で溶出した。流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出は３６０、４００ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による２５０−５００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。本条件下で、ＴＨＣ ４’位配糖体、ＡＵ６位配糖体標品はそれぞれ保持時間１４．１７分および６．１９分に溶出される。
次にアントシアニジンはカラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ Ａ３１２（６×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いた。移動相には酢酸、メタノール、Ｈ２Ｏをそれぞれ６０：７０：２７０に混合したものを用い、１１分間維持した。検出は５２０ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による４００−６００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。本条件下で、マルビジンは保持時間９．１２分に溶出される。
その結果、ｐＳＦＬ２０１を導入した形質転換体ではＴＨＣ４’位配糖体ならびにＡＵ６位配糖体と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、それぞれ花弁中に０．０２％および０．０５％（花弁新鮮重量中のＷ／Ｗ）生成していることが確認された。また宿主が本来含有するアントシアニジン類も形質転換体に存在するため、これら形質転換体で観察された黄色がかった青またはグレーの花色は、ＴＨＣ４’位配糖体ならびＡＵ６位配糖体と、マルビジンなどのアントシアニジン類が共存したためと考えられる。
一方、ｐＳＦＬ３０７および３０８を導入した形質転換体ではオーロンの一種であるＡＵ６位配糖体のみと保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、ともに花弁中に０．０９％（花弁新鮮重量中のＷ／Ｗ）生成していることが確認された。ｐＳＦＬ３０７またはｐＳＦＬ３０８が導入された系統では、宿主が本来有するアントシアニジン類が宿主花弁に含まれる当該アントシアニジンの１０〜５０％と著しく減少していることが確認された。
［実施例１１］ゲノミックサザンハイブリダイゼーションによる４’ＣＧＴ遺伝子導入の確認
実施例１０で得られた形質転換体のうち、花弁の色素分析結果からＴＨＣ４’位配糖体ならびにＡＵ６位配糖体の蓄積量が比較的多かった系統を、各コンストラクト導入株から３系統ずつ選抜し、ゲノミックハイブリダイゼーションをおこなった。形質転換体の葉、約１ｇからＰｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、製造業者推奨の方法によってゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ各２０μｇを制限酵素ＫｐｎＩで切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動にて分離後、常法にしたがってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンに転写後、ノンラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システムを用い、ハイブリダイゼーションを行った。
４’ＣＧＴ遺伝子プローブのＤＩＧラベリング、ハイブリダイゼーションならびに検出方法は実施例６同様に製造業者推奨の方法に従った。ハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。ｐＳＦＬ２０１、ｐＳＦＬ３０７、ｐＳＦＬ３０８の制限酵素地図を考慮するとゲノミックサザンで検出されたバンドの数から各形質転換体に導入された４’ＣＧＴ遺伝子コピー数を推定することができる。
ｐＳＦＬ２０１導入系統については、いずれの系統でも１本のバンドが見られることから１コピーの導入遺伝子を有することが推定される。ｐＳＦＬ３０７導入系統については、系統番号２および４の個体は１コピー、系統番号１３の個体では２本のバンドが見られることから２コピーの４’ＣＧＴ ｃＤＮＡが導入されたものと考えられる。ｐＳＦＬ３０８導入系統については、いずれの系統でも１本のバンドが見られることから１コピーの導入遺伝子を有することが推定される。
［実施例１２］定量ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現解析
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて元株および形質転換体各系統のつぼみからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡのうち１μｌをテンプレートとし、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてトレニアＤＦＲとＦ３Ｈおよび外来性遺伝子であるＡＳと４’ＣＧＴの転写産物の発現定量を行った。製造者が推奨するソフトウェア’Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ’にて、各遺伝子を特異的に増幅するようなオリゴプライマーおよび特異的にハイブリダイズするような両末端を蛍光ラベルしたＴａｑ Ｍａｎプローブを設計し反応に供した。トレニアＤＦＲには、配列番号：５４と５５のオリゴプライマーおよび配列番号：５６のＴａｑ Ｍａｎプローブを、トレニアＦ３Ｈには、配列番号：５７と５８のオリゴプライマーおよび配列番号：５９のＴａｑＭａｎプローブを、ＡＳには配列番号：６０と６１のオリゴプライマーおよび配列番号：６２のＴａｑ Ｍａｎプローブを、４’ＣＧＴには配列番号：６３と６４のオリゴプライマーおよび配列番号：６５のＴａｑ Ｍａｎプローブを用いて発現定量を行った。
トレニアＤＦＲ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１１５８Ｆ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１２２３Ｒ
ＳＷＢ ＤＦＲ−１１８０Ｔ
トレニアＦ３Ｈ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１０３５Ｆ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１１０１Ｒ
Ｔｏｒｅｎｉａ Ｆ３Ｈ−１０５５Ｔ
ＡＳ
ＡｍＡＳ−１５４５Ｆ
ＡｍＡＳ−１６３８Ｒ
ＡｍＡＳ−１５８２Ｔ
４’ ＣＧＴ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９０８Ｆ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９６６Ｒ
ＡｍＧＴｃｇ１２−９２９Ｔ
また内在性コントロールとして、トレニアのグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。オリゴプライマーにはＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−７９４Ｆ（５’−ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＣＧ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’）（配列番号：６６）とＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−８５９Ｒ（５’−ＡＣＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＣＣＡ ＴＴＣ−３’）（配列番号：６７）を、Ｔａｑ ＭａｎプローブにはＳＷＢ ＧＡＰＤＨ−８１６Ｔ（５’−ＡＧＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＣＧ−３’）（配列番号：６８）を用いた。
反応液は、元株または形質転換体各系統のｃＤＮＡ，１ｘ Ｔａｑ Ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），オリゴプライマー各１００ｎＭ，Ｔａｑ Ｍａｎプローブ１００ｎＭからなる総体積５０μｌに調整した。反応条件は、５０℃で２分、９５℃、１０分反応させた後、９５℃、１５秒、６０℃、１分の反応を４０サイクル行いＰＣＲでの増幅産物の生成過程をリアルタイムで検出した。その結果、ｐＳＦＬ２０１導入系統では導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに高発現していることを確認した。ｐＳＦＬ３０７導入系統では導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに発現し、内在性のＤＦＲｍＲＮＡが元株に比べて約１０％程度にまで抑制されていることが確認された。また、ｐＳＦＬ３０８導入系統においては導入したＡＳ，４’ＣＧＴがともに発現し、内在性のＦ３ＨｍＲＮＡが元株に比べて約５％程度にまで抑制されていることが確認された。
［実施例１３］４’ＣＧＴのＰＨＣに対する配糖化活性の測定
黄色キンギョソウ花弁内においてＰＨＣ４’位配糖体が確認されており（Ｓａｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６０，２２９−２３６（２００１））、ＡＳがこれらＰＨＣおよびＰＨＣ４’位配糖体を基質としてブラクテアチンおよびブラクテアチン６位配糖体を生成できることが知られている。４’ＣＧＴがＰＨＣの４’位の配糖化反応を触媒できるかどうかを明らかにするために、４’ＣＧＴのＰＨＣに対する配糖化活性を測定した。実施例５−２にしたがって、大腸菌で発現した組換え４’ＣＧＴを用いて実施例３−２と同様の方法で樹脂に固定したＰＨＣを基質として、酵素反応を行った。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφｘ１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ、Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配２２分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配で１４分間溶出後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／分で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＰ（島津製作所）による２２０−４００ｎｍの吸収スペクトルを測定することにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間３８．２分に溶出され、ＴＨＣ２’位配糖体は２７．７分、ＴＨＣ４’位配糖体は３０．０分、ＰＨＣは３２．４分、ＰＨＣ４’位配糖体は２４．３分に溶出される。ｐＳＰＢ１７６８を発現する大腸菌抽出液とＰＨＣの反応液中に見出されたＰＨＣ配糖体は、本条件による分析で２４．３分に溶出されたので、ＰＨＣ４’位配糖体であると同定した。ｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液とＰＨＣを反応させた場合には、ＰＨＣ配糖体は検出されなかった。したがって、ＰＨＣ４’位配糖体はｐＳＰＢ１７２５にコードされるＧＴによって生じた産物であると考えられる。以上の結果から、ｐＳＰＢ１７２５ｃＤＮＡにコードされるＧＴはＰＨＣの４’位の水酸基にグルコースを配糖化する活性を有することが確認された。以上の結果から、４’ＣＧＴはＴＨＣの４’位の配糖化のみならずＰＨＣの４’位の配糖化反応を触媒することが示された。
［実施例１４］形質転換トレニアを用いた４’ＣＧＴおよびＡＳの機能解析
１４−１ コンストラクトの構築
実施例７に記載のｐＳＦＬ２０３からＰａｃＩで２．４ｋｂの４’ＣＧＴの発現カセット部分を切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＰａｃＩサイトに導入したものをｐＳＦＬ２０９とした。ｐＳＦＬ２０９は植物体内において４’ＣＧＴを単独で発現させるものである。
実施例９に記載のｐＳＦＬ３１３からＡｓｃＩで２．７ｋｂのＦ３Ｈ発現抑制用カセットを切り出し、これをｐＢＩＮＰＬＵＳのＡｓｃＩサイトに導入したものをｐＳＦＬ２１０とした。ｐＳＦＬ２１０は、トレニア植物体内においてトレニアのＦ３Ｈ遺伝子の２本鎖ＲＮＡを転写させることにより、Ｆ３Ｈの発現を抑制することを意図したものである。
一方、ＡＳについては、特許出願（Ｐ２００３−２９３１２１）にあるｐＳＰＢ１２０’のＢａｍＨＩとＸｈｏＩサイトに、実施例７に記載のｐＳＰＢ２５１からＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切り出したＡＳ ｃＤＮＡ断片を挿入することによって、植物体内でＡＳを発現するベクターｐＳＰＢ２１１を得た。
１４−２ ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現解析と花色分析
実施例１４−１で述べたｐＳＦＬ２０９、ｐＳＦＬ２１０およびｐＳＰＢ２１１を実施例１０に記載の方法でトレニア（品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社））に導入した。形質転換の方洙はＭｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ．６，２３９，２０００に記載の方法にしたがった。選択マーカー耐性を示した個体を選抜した。得られた形質転換体および元株サマーウェブブルー各系統のつぼみからＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。さらにＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて製造者の推奨する方法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。ＡＳのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＡｍＡＳ−ＩＮＳＩＴＵ−ＦＷ（５’−ａａｔｔａｔｔｔｃｃｃａａｔｇｔｔｃａａａａａｔ−３’）（配列番号４４）とＡｍＡＳ−ＩＮＳＩＴＵ−ＲＶ（５’−ｔｇｇａｇｃｔｔｔａｇｇｔｔｔｇｔｇａａａ−３’）（配列番号４５）を、キンギョソウ４’ＣＧＴのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＫＩＲ−ＩＮＳＩＴＵ−ＦＷ（５’−ａｔｇｇｇａｇａａｇａａｔａｃａａｇａａａａｃ−３’）（配列番号４６）とＫＩＲ−ＩＮＳＩＴＵ−ＲＶ（５’−ｔｃｔｔａｃｇａｔａａａａｃａａａｃｔｃａ−３’）（配列番号４７）を、内在性Ｆ３ＨのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ．Ｆ３Ｈ−９２３Ｆ（５’−ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＧＡ Ａ−３’）（配列番号４８）とＴ．Ｆ３Ｈ−１３３９Ｒ（５’−ＴＧＧ ＣＣＧ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＡＴ−３’）（配列番号４９）を、さらに内部標準遺伝子としたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ．ＧＡＰＤＨ−Ｆ８７（５’−ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＧＣ Ｃ−３’）（配列番号５０）とＴ．ＧＡＰＤＨ−Ｒ６９２（５’−ＣＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＧＡ ＴＡＧ Ｃ−３’）（配列番号５１）を用いた。その結果、ｐＳＦＬ２０９導入系統では取得した形質転換体４１系統のうち、導入したキンギョソウ４’ＣＧＴ転写物が検出できたのは３７系統であったが、いずれの系統においても花色変化は認められなかった。ｐＳＦＬ２１０導入系統では取得した形質転換体４４系統のうち内在性Ｆ３’Ｈの転写物の量が有為に減少していることを検出できたのは３７系統であり、これらの系統は白色あるいは紫と白色の混色の花色を示した。さらに、ｐＳＰＢ２１１導入系統では取得した形質転換体４１系統のうち導入したＡＳが発現していることを確認できたのは３１系統であり、いずれの系統においても花色変化は認められなかった。
ｐＳＦＬ２０９導入系統およびｐＳＰＢ２１１導入系統は導入した遺伝子の転写産物が検出できた系統について、ｐＳＦＬ２１０導入系統は花色が白色を示した系統について色素分析を行った。サマーウェブブルーおよび各形質転換体の花弁を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＡＵ６位配糖体およびアントシアニジンの分析を行った。アントシアニジン分析は実施例１０に記載のように行った。ＨＰＬＣ条件はそれぞれ以下のとおりである。
まずＡＵ６位配糖体の検出には、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＦＣ−ＯＤＳカラム（５０×４．６ｍｍ、島津製作所）を用い、移動相にはＡ液として０．０５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ、Ｂ液として０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｂ液１０％から２３％の直線濃度勾配３分間の溶出後、Ｂ液２３％で１７分間維持し、さらにＢ液２３％から８０％の直線濃度勾配２分間の溶出後、Ｂ液８０％で３分間維持した。さらにＢ液８０％から１０％の直線濃度勾配２分間で溶出した。流速は０．８ｍｌ／分で行った。検出は、３６０及び４００ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による２５０−５００ｎｍの吸収スペクトルの測定により行った。本条件下で、ＴＨＣ ４位’配糖体、ＡＵ６位配糖体標品はそれぞれ保持時間１４．１７分および６．１９分に溶出される。次にアントシアニジンはカラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ Ａ３１２（６×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いた。移動相には酢酸、メタノール、Ｈ２Ｏをそれぞれ６０：７０：２７０に混合したものを用い、１１分間維持した。検出は５２０ｎｍにおける吸光度、およびＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所）による４００−６００ｎｍの吸収スペクトルの測定により行った。本条件下で、マルビジンは保持時間９．１２分に溶出される。
その結果、ｐＳＦＬ２０９導入系統ではＴＨＣ４’位配糖体と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物が、新鮮花弁重量１ｇあたり０．０３６〜０．７６２ｍｇ生成していることが確認された。また宿主が本来含有するアントシアニジン類も存在した。
ｐＳＦＬ２１０導入系統ではアントシアニジン量は、宿主花弁に含アントシアニジン量の約１％程度に減少していることがわかった。
またｐＳＰＢ２１１導入系統では、宿主と比較してフラボノイド色素に変化は認められなかった。いずれの形質転換体においてもオーロン類と保持時間および吸収スペクトルが一致する生成物は検出されなかった。
したがって、Ｆ３Ｈの発現抑制ならびにＡＳの過剰発現だけではカルコン配糖体あるいはオーロンは植物体内で合成されないこと、４’ＣＧＴとＡＳの共発現によりオーロンが合成されることが示された。４’ＣＧＴ単独の過剰発現により、カルコン４’位配糖体を蓄積させることができ、花色の変化に役立つことがわかった。
［実施例１５］リナリアからの４’ＣＧＴｃＤＮＡのクローニング
実施例１と同様にして、リナリア（Ｌｉｎａｒｉａ ｂｉｐａｒｔｉｔａ）の蕾及び開花した花の花びらから抽出したＲＮＡを用い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。蕾由来のＲＮＡから８．０ｘ１０５ｐｆｕ／ｍｌのライブラリーが得られ、一方、開花花弁のｃＤＮＡを用いたものからは１．０ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌのｃＤＮＡライブラリーが得られた。
これら各ライブラリーの約３．０ｘ１０５ｐｆｕのファージ、実施例４に記載のキンギョソウのｐＳＰＢ１７２５にコードされる４’ＣＧＴｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを行った。プローブの標識、ハイブリダイゼーションとその後のメンブレンの洗浄、検出方法は実施例２と同様に行った。その結果、最終的に１９個の陽性クローンが得られた。これらのうちカルコン糖転移酵素をコードするｃＤＮＡとして期待される長さ（約１．５ｋｂ）の８個のｃＤＮＡについて塩基配列を決定したところ、これら８クローンは全て同じ配列を有しており、最長のｃＤＮＡを有するクローンをｐＳＦＬ４０９とした。このｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：６９に示し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：７０に示す。ｐＳＦＬ４０９のｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列はキンギョソウのカルコン４’位糖転移酵素のものと高いホモロジーを有することが明らかとなった。しかし、キンギョソウのカルコン４’位糖転移酵素ｃＤＮＡと比較すると、ｐＳＦＬ４０９ｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列は開始メチオニンから１０ｂｐ程度を欠く不完全長ｃＤＮＡであった。そこで、Ｇｅｎｅ Ｒａｃｅｒ ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、５’ＲＡＣＥ法にて推定開始メチオニンを含む上流のｃＤＮＡフラグメントを増幅し、これをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたものをｐＳＦＬ４１７とした。この完全長を含むリナリアｃＤＮＡはキンギョソウ４’位糖転移酵素とアミノ酸レベルで６５％配列同一性を示した。
［実施例１６］リナリアのｃＤＮＡの大腸菌における発現と活性測定
大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１のＮｃｏＩサイトとＫｐｎＩサイトへ完全長のリナリアｃＤＮＡを導入し、大腸菌発現系によって本リナリアｃＤＮＡにコードされるタンパク質の活性について解析した。まず、大腸菌発現コンストラクト作製のため、ｐＳＦＬ４１７を鋳型とし、４１７−ＮｃｏＩプライマー（ＣＣＣＡＴＡＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧ）（配列番号５２）と４０９−ＥｃｏＲＩ（ＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧ）（配列番号５３）を用いＰＣＲを行った。これにより、ｐＳＦＬ４１７の開始メチオニンの位置にＮｃｏＩサイトが挿入され、３’側にＥｃｏＲＩサイトが挿入された。これをＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩで切断したものとｐＳＦＬ４０９ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断したものを、大腸菌発現ベクターｐＱＥ６１のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングし、完全長リナリアｃＤＮＡを有する大腸菌発現用コンストラクト（ｐＳＦＬ４１８）が得られた。
これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、実施例１２と同様にして組換えタンパク質の活性測定を行った。基質にＴＨＣを用い、ｐＳＦＬ４１８を有する大腸菌抽出液を反応させた場合は保持時間３０．０分にＴＨＣの４’位配糖体が検出された。一方、対照実験として、ｐＱＥ６１ベクターを有する大腸菌抽出液をＴＨＣに反応させた場合は、ＴＨＣの４’位配糖体は全く検出されなかった。さらに実施例１２にしたがって、ＰＨＣに対する配糖化活性を測定した。その結果、ｐＳＦＬ４１８を有する大腸菌抽出液を反応させた場合には保持時間２４．３分にＰＨＣ４’位配糖体が検出された。一方対照実験ではＰＨＣ配糖体は検出されなかった。以上の結果から、ＳＦＬ４１８にクローニングされたリナリアのｃＤＮＡは４’ＣＧＴをコードするものと考えられる。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号２又は７０に記載のアミノ酸配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１又は６９に記載する塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする請求項１記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号２又は７０に記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号１又は６９に記載する塩基配列の一部または全部からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項１記載の遺伝子。
【請求項６】
ゴマノハグサ科由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項７】
キンギョソウ又はリナリア由来である、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、栄養増殖した植物、またはそれら植物体の組織。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物体の切り花。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いてカルコン類の４’位に糖を転移する方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体に導入・発現して得られる、花色が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
【請求項１６】
花色が黄色味を帯びていることを特徴とする請求項１５に記載の植物体。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、花色を黄色く改変させる方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【請求項１】
カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号２又は７０に記載のアミノ酸配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１又は６９に記載する塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコードする請求項１記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号２又は７０に記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、カルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号１又は６９に記載する塩基配列の一部または全部からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項１記載の遺伝子。
【請求項６】
ゴマノハグサ科由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項７】
キンギョソウ又はリナリア由来である、請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の４’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、栄養増殖した植物、またはそれら植物体の組織。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物体の切り花。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いてカルコン類の４’位に糖を転移する方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体に導入・発現して得られる、花色が改変された当該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
【請求項１６】
花色が黄色味を帯びていることを特徴とする請求項１５に記載の植物体。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、花色を黄色く改変させる方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラボノイド合成系遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子と共にオーレウシジン合成酵素をコードする遺伝子を植物体に導入、発現させ、さらに宿主のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子の発現を抑制することによって花色を黄色く改変させる方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１４１
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６３９４（Ｐ２００５−５１６３９４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９４６１
【国際出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（５９９０９３７３１）インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド (5)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【発行日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９４６１
【国際出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（５９９０９３７３１）インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド (5)
【Ｆターム（参考）】
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