フルオリドまたはフッ化水素の検出方法およびその検出キット
本発明は、サンプル中のフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)の濃度を検出および/またはドーズする(dosing)ための方法に関し、前記方法は、測定溶液を得るために水溶液中でサンプルをシリル化有機化合物と接触させる段階であって、フルオリドまたはフッ化水素酸が存在する場合、前記有機シリル化合物は脱シリル化され、それによって、シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物を、識別される形で検出および/またはドーズすることができる段階と、サンプル中にフルオリドまたはフッ化水素が存在する場合に発生する、脱シリル化有機化合物の出現または有機性のシリル化化合物の消失を、前記測定溶液中で検出および/またはドーズする段階とを含む。本発明によって、フッ化水素またはフルオリドの存在を非常に実際的かつ容易な形で、10-2l HF/106l空気(10ppb)、また0.5〜1μg/mlのHFの溶液中濃度で検出することが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に存在するフルオリド(F-)(fluoride)またはフッ化水素(HF)の濃度を検出および/または測定するための方法、およびその方法を実施するための検出キットに関する。本発明によって、環境汚染物質を効率的にかつ高感度で測定することが可能になる。本発明は、完全に独創的であって容易に実施できる方法に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
フッ化水素は強い無機酸であり、無色で水に非常に溶解し易く、溶解してフッ化水素酸を形成する。HFは産業界で広く使用されているガスであり、特にポリマー、冷却液および消火用製品の製造、アルミニウム精製、核燃料製造およびエレクトロニクス部品の製造のために使用される。さらに、石炭、家庭廃棄物もしくは産業廃棄物およびプラスチックスの燃焼の際に放出される生成物である。
【０００３】
HFは3×10-2l HF/106l空気(30ppm)を超えるオーダーの濃度で有毒である。HFは皮膚/粘膜の曝露によってもたらされるやけど、ならびに上気道および下気道の炎症を引き起こす可能性のある強力な刺激物質である。さらにHFの吸収によって、代謝障害がもたらされる可能性がある。
【０００４】
さらにこの生成物は鉄、青銅およびガラスなどの多くの材料に対して非常に腐食性である。
【０００５】
したがって、危険な濃度のHFが検出された場合に適切な手段をとれるようにするために、特に工業排出物中および実験室ならびにこれらの周囲の環境において、人々や環境や工業的な装置を保護するのに、HFの濃度を監視するための手段を確立することが特に必要である。多くの国でHFの許容大気濃度基準が確立されている。これらの基準は一般に、(5×10-5〜5×10-4l)HF/106l空気(0.05〜0.5ppm)である。
【０００６】
以下の説明では、角括弧[]内の引用番号は本明細書に添付の文献一覧表の番号に対応する。
【０００７】
今日まで、HFまたはフッ化物イオンを測定するための多くの方法が開発され報告されている。一般にこれらの技術は、化学的、電気化学的、分光学的または光学的な検出法に基づくものである。HFの量を検出し測定することができる多くの装置が市販されている。
【０００８】
サンプル中のHFの量を検出し測定するのに使用できるいくつかの電気化学的方法、分光光度法およびクロマトグラフ法が、添付の参考文献一覧表の文献[1]に記載されている。
【０００９】
特定の電極を使用する、ID-110で表示された参照方法がOSHAウェブサイト上に記載されている。参考文献番号[2]である。この方法の感度は1.2×10-2l HF/106l空気(12ppb)であるが、この方法は現地で適用するのが難しい実験室試験用である。現地用の方法に関する限り、これらの感度はより劣り、0.2l HF/106l空気(200ppb)のオーダーである。
【００１０】
他の方法では、炭化ケイ素基板(「金属絶縁膜半導体(Metal Insulator Semiconductor)」:MIS)をベースにした検出器を用いる。この方法は、例えば参考文献番号[3]の文献に記載されている。HF測定用の種々の電子検出計器が様々な製造業者によって提案されている。その例としては、ウェブサイト上に記載されている文献番号[4]のBionics Instrument社のOEM Fluorine Sensor(登録商標)計器またはNORSK ELEKTRO OPTIKK A/S社のLaserGas(登録商標)計器がある。
【００１１】
これらの計器に付与されている検出限界は、ガス媒体の場合、100万分の1もしくは10億分の1の単位(ppmもしくはppb)で表され、水性媒体の場合、ミリリットル当たりのナノグラムもしくはマイクログラム(ng/mlもしくはμg/ml)で表される。一般に検出限界は、10-4l HF/106l空気(0.1ppm)のオーダーであり、溶液の場合、最も良好な装置の場合で(1〜1000ng)HF/mlである。
【００１２】
残念ながら、これらの方法および計器はスペースを要し、移動が困難であり、しばしば実施が難しく、また高価であることが多い。
【００１３】
HFを「検出するための理想的な手段」は以下の特徴を兼ね備えたものでなければならない。
- 感度:少なくとも10-4l HF/106l空気(0.1ppm)の測定である。
- コスト:必要な場合、容易に検出器の数を増やすことができるようにするために、コストは余り高くてはならない。
- 利用可能性:公開されている技術の多くについては市販品がない。その理由は、実施するのが特に難しいためである。
- 移動性:様々な場所で使用できるように、装置を容易に移動できなければならない。
- 迅速に実施できることおよび速やかに結果を使用できること。
【００１４】
従来技術のどの方法も装置もこれらの特性を兼ね備えていないようである。
【００１５】
したがって、「理想的な検出手段」の上記特徴をできる限り多く兼ね備えた新規の技術の真の必要性がある。
【非特許文献１】[1]International Society for Fluoride Research、Fluoride 31(2)、1998、74〜80頁- disponible sur le site Internet http://www.fluoride-journal.com/98-31-2/31274-80.htm
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【非特許文献４３】[43]ELLMAN G.L.ら、(1961)Biochem.Pharmacol.7,88
【特許文献１】[44]欧州特許第EP-A-0139552号
【特許文献２】[45]米国特許第5,047,300号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が達成しようとする目的は、具体的には、上記特徴をすべて有していて、さらに従来技術の方法および装置の上記欠点を有していない、HFを検出するための方法およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、測定溶液を得るために、水溶液中でサンプルをシリル化有機化合物と接触させるステップであって、フッ化水素酸またはフルオリド(F-)が存在する場合に前記シリル化有機化合物が脱シリル化され、シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物を互いに独立に検出および/または測定可能であるステップと、
前記サンプル中にフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)が存在している場合に起こる、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を、前記測定溶液中で検出および/または測定するステップと
を含む、サンプル中のフルオリドまたはフッ化水素の濃度を検出および/または測定する方法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下の説明において、「フッ素」または「フッ素およびその誘導体」という用語は、フルオリド(F-)、フッ化水素(HF)およびフッ化水素酸を暗黙のうちに表している。フルオリドはフッ素の塩の意味として理解されるものである。
【００１９】
フッ素は非常に求核的な原子であり、そのため、求核的な置換反応に介在することができる。より具体的には、以下の化学式で示されるような形で、フッ素はケイ素-酸素(Si-O)型の結合を特異的に攻撃することができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
この化学式において、R1、R2およびR3は、Siの置換基であり、後者と一緒になって、本発明の意味での有機化合物R4のシリル化基を形成する。
【００２２】
R1、R2およびR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択することができる。例えば、R1、R2およびR3はメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される。
【００２３】
したがってこの化学式では、-R4は、本発明の実施の際の、シリル化された有機化合物(左側)、または脱シリル化された有機化合物(右側)を表す。シリル化を可能にするために、この化合物は、シリル化のためにアクセス可能な少なくとも1個の水酸官能基を含有している。本発明の方法を実施する場合にその検出を容易にするために、この化合物は有利には有機化合物である。一般に、特に溶解性の問題、したがって感度ならびにフッ素検出および/または測定結果の再現性の問題から、この化合物は250〜200000gモル-1、例えば250〜1500gモル-1の分子量を有する。この化合物は、例えば、エストラジオール、3〜50個のアミノ酸残基を含有するペプチドなどのペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカインおよびアラキドン酸、またはこれらの化合物の誘導体から選択されるヒドロキシル化化合物であってよい。
【００２４】
本発明で使用できるペプチドは例えば文献番号[5]に記載されており、使用できるホモバニリン酸およびその誘導体は例えば文献番号[6]および[7]に、使用できるアンフォテリシンは例えば文献番号[8]〜[10]に、本発明で使用できるステロイドおよびステロイド誘導体は例えば文献番号[11]〜[17]に、本発明で使用できるサイトカインおよびサイトカイン誘導体は例えば文献番号[18]〜[20]に、使用できるアラキドン酸およびその誘導体は例えば文献番号[21]〜[24]に記載されている。
【００２５】
本質的なことは、測定溶液中において、これらの化合物の一方の消失および/または他方の出現の検出および/または測定を可能にするために、シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物を互いに別々に検出および/または測定できることである。したがって、本発明の方法は、シリル化有機化合物または脱シリル化有機化合物、あるいはこれら2つの化合物(ただし互いに独立に)を検出することに基づいている。
【００２６】
本発明によれば、シリル化有機化合物に対するフッ素またはその誘導体の単純な作用によって脱シリル化有機化合物またはこの有機化合物の未変性(native)の形態が、損なわれないまま回復され得るという条件付で、選択した有機化合物にシリル基を結合させる(シリル化)ために、任意の適切な試薬を使用することができる。使用できるシリル基もしくは官能基は化学式で上記されている。
【００２７】
本発明を実施するために、ヒドロキシル化された有機化合物をシリル化するのに使用できるものとして以下の試薬を挙げることができる。すなわち、N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(すなわちBTSFA)、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(すなわちMTBSTFA)、トリメチルシリル(すなわちTMS)、tert-ブチルジメチルシリル(すなわちt-BDMS)、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(すなわちBSA)、ヘキサメチルジシラザン(すなわちHMDS)、N-メチルトリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(すなわちMSTFA)、トリメチルクロロシラン(すなわちTMCS)、トリメチルシリルイミダゾール(すなわちTMSI)等である。
【００２８】
本発明の実施のために使用できるシリル化のための他の試薬および操作様式も、添付の参考文献一覧表の例えば文献番号[25]〜[30]に示されている。
【００２９】
一般にこれらの試薬は、使用が簡単であり、容易に入手でき、シリル官能基(ケイ素原子を含有する)を、選択した有機化合物に属している水酸官能基上に転移することを可能にする。
【００３０】
本発明において本発明者等はさらに、シリル基によって、本発明によるフッ素の検出および/または測定の感度および選択性にばらつきがあることを実証した事実を例示するために、具体的には以下の2つの試薬すなわち、
トリメチルシリル(-Si(CH3)3)官能基を、選択された有機化合物の-OH基に結合させるBTSFA、および
ジメチルtert-ブチルシリル(Si(CH3)2C(CH3)3官能基を、選択された有機化合物の-OH基に結合させるMTBSTFA
を挙げることができる。
【００３１】
BTSFAは、それほど疎水性でもないシリルをヒドロキシル化化合物に提供し、それによって、シリル化有機化合物が比較的良好な溶解性を持つことができるようにする利点を示す。しかし、本発明の方法を実施した場合、脱シリル化化合物への転換に関して、得られたシリル化化合物が、HFに対して常に特異性を示すとは限らない。これらのシリル化化合物は、サンプル中に存在する他の酸によって脱シリル化化合物に転換される可能性もある。したがって、この試薬は、フッ素についての特異性が必要とされない場合にフッ素を検出するため、あるいは、他の酸の濃度が、フッ素の検出または測定を妨害しない程度に十分低いサンプル中のフッ素を検出するために使用することが好ましい。
【００３２】
MTBSTFAは、より疎水性のシリル基をヒドロキシル化化合物に提供し、得られたシリル化化合物の水性媒体中での溶解性は、BTSFAによって得られるシリル化化合物の場合より劣る。他方、まったく予想していなかったことだが、実施例で実証するように、MTBSTFAでシリル化化合物の脱シリル化は、試験した他の酸に対してより、HFに対してより特異的である。したがって、この試薬は、フッ素に関して特異性を求められる場合、例えばサンプルが相当な濃度で他の酸を含有する場合に、サンプル中のフッ化水素を検出するために有利に用いることができる。
【００３３】
すなわち、本発明者等は、特にこれらの試薬を使用することによって、フッ素によるSi-O結合への攻撃の特異性も、ケイ素と酸素原子に結合している基に依存することを発見した。したがって、シリル化基を適切に選択すれば、本発明の方法を実施した場合、測定は、サンプル中の他の無機酸または有機酸および塩類によって妨害されない。-Si-(CH3)3を用いて本発明の方法を実施した場合、例えば、HFはHClと殆んど同じ脱シリル化活性を有している。-O-Si-(CH3)2-C(CH3)3を用いて本発明の方法を実施した場合、活性は(HClと比較したHFで)約1000倍の大きさである。
【００３４】
上記化学式に示すように、フッ素またはその誘導体による、シリル化有機化合物の脱シリル化有機化合物への転換率は、サンプル中に存在するHFの量に比例する。したがって、本発明の方法によって、一度にかつ同時にサンプル中に存在するフッ素およびその誘導体を検出し測定することができる。本発明の本質的な特徴とその発明の本質はまさに、シリル化有機化合物と非シリル化(脱シリル化)有機化合物との間の差を測定する検出手段を用い、それによって、フッ素の存在によって触媒作用を受けた脱シリル化を検出/定量化することによって、フルオリドおよび/またはフッ化水素を検出することにある。
【００３５】
接触させるステップは、水溶液中でサンプルとシリル化有機化合物を混合することによって実施することができる。混合は、溶液中でサンプルとフッ素を単に加えることによって、あるいは、例えば機械もしくは磁気攪拌機、または超音波処理等を用いた、溶液中でのサンプルとフッ素の積極的な攪拌によって実施することができる。その目的はもちろん、互いに確実に反応するように、フッ素(もし存在すれば)とシリル化有機化合物との間の相互作用を促進することである。
【００３６】
サンプルは液体、固体またはガス状のサンプルであってよい。サンプルが液体でない場合、サンプルと本発明のシリル化有機化合物を水溶液中で接触させるステップは、もちろん、サンプルを水溶液中に溶解させることを含む。例えば、サンプルがガスである場合バブリングによって、また、サンプルが固体である場合、攪拌しながら混合または可溶化によって溶解させる。この溶解の目的は、ガスもしくは固体サンプルのフッ素が、接触水溶液中にも存在するようにすることである。この溶解に使用される方法は当業者によく知られている。
【００３７】
本発明者等は、前記接触水溶液への水混和性有機溶媒の添加によって、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定の感度を大幅に増大させることができることを実証した。例としては、有機溶媒は、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノールまたはメタノール、あるいは当業者によく知られている同等の有機溶媒から選択することができる。すなわち、本発明者等は、そうした溶媒を使用した場合、100倍さらには500倍のフッ素検出感度の増大が測定された。例えばDMSOを用いた場合、検出の感度は0.001μg/mlまで向上する。
【００３８】
有機溶媒はいくつかの異なった効果をもたらす可能性がある。すなわち、シリル化有機化合物の溶解を容易にすること、脱シリル化を容易にすること、または検出中の妨害を少なくすることである(特にイムノテストの場合に注目される)。どれであれ、これらの効果のうちの1つだけでは、有機溶媒存在下での検出の感度のまさに驚異的で大幅な増大を説明するのには不十分である。有機溶媒は接触水溶液の1〜99容積%、有利には接触水溶液の50〜95容積%の範囲の量(残りは水)で存在することができる。
【００３９】
この溶媒の供給源(origin)は、有利には、シリル化有機化合物を調製した後、すなわち有機化合物がシリル化された後の回収溶媒とすることができる。次いで、フッ素の水性溶液とシリル化有機化合物の有機性溶液とを混合させることによって、接触させるステップを実施することができる。あるいは、有機溶媒を接触溶液に独立に加えることができる。
【００４０】
消失するシリル化有機化合物または出現する脱シリル化有機化合物の検出は、これらの化合物のうちの一方または他方の存在を別々に実証できるようにする、当業者によく知られた任意の手段を用いて実施することができる。例えば、その手段は、ガスクロマトグラフィーで実施する検出および/または測定、あるいは免疫学的試験で実施する検出および/または測定であってよい。
【００４１】
測定を実施するためには、既知量のフッ化水素酸またはフッ素を用いるか、既知量のシリル化有機化合物もしくは非シリル化有機化合物を用いて本発明の方法を適用することによって、一般的な方法で最初に標準シリーズを決定することができる。この標準シリーズによって、次に単純な外挿でサンプル中に存在するフッ素、フッ化水素またはフッ化水素酸の量を決定することが可能になる。
【００４２】
本発明の第1の実施形態では、検出および/または測定は、ガスクロマトグラフィーで実施することができる。その理由は、この技術が、本発明による有機化合物のシリル化された形態または脱シリル化された形態、したがって存在すればフッ素を、別々に検出および/または測定できるからである。用いられるクロマトグラフィーの技術は当業者に既知のものである。添付の参考文献一覧表の文献番号[31]〜[33]に記載されている技術が例として挙げられる。
【００４３】
第1の実施形態で使用できる有機化合物は上記のヒドロキシル化された有機化合物でよい。シリル化の試薬および技術も上記のものでよい。
【００４４】
本発明の第2の実施形態では、非シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定に免疫学的試験を用いる、すなわち非シリル化有機化合物かまたはシリル化有機化合物のどちらかに対する抗体を用いて実施するのが有利である。従来技術では、この種のアプローチは開示されていない。さらに本実施形態によって、従来の技術より高感度でフッ素を検出することが可能になる。
【００４５】
一般的な方法では、抗体は、検出可能な抗体/抗原複合体を形成させるために、非常に高い特異性で抗原と称される構造物を認識しそれに結合することができるタンパク質である。しかし、HFは非常にサイズの小さい分子なので、HFに対する抗体を作るのは不可能である。直接HFに対する抗体を作ることが不可能なので、本発明者等は、上記したフッ素の化学的特性、および、動物に注射した場合に抗体の発生をもたらす特徴を示す特定のシリル化有機化合物を用いることをもとにした独自の方策を取り入れた。
【００４６】
第2の実施形態で使用できる有機化合物は、1個または複数の水酸基を有する有機化合物である。これらの有機化合物は、本発明の意味の範囲内でシリル基が結合するのを可能にし、それを注射された動物中で、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物に対する抗体の特異的な生成を誘発する。これらの有機化合物は一般に250〜200000gモル-1、例えば250〜1500gモル-1の分子量を有している。これらの有機化合物は、例えば、上記のヒドロキシル化された有機化合物であってよく、例えばエストラジオール;ペプチド、例えば3〜50個のアミノ酸残基を含むペプチド、例えば文献番号[5]に記載のテトラペプチドアセチル化Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP);ホモバニリン酸;アンフォテリシン;ステロイド;サイトカイン;アラキドン酸またはこれらの化合物の誘導体から選択される。これらの有機化合物は、例えば文献番号[5]〜[24]に記載のものなどの化合物であってよい。
【００４７】
例示的なものとしては、エストラジオールまたはその誘導体を使用することができる。本発明によれば、これらが、抗体の生成をもたらすことができるという条件で、かつ、本発明の意味においてシリル化され得るという条件で、動物例えばマウスに注射した場合、「エストラジオール」は例えばエストラチエン-1,3,5-ジオール-3,17μまたは17μ-ジオールあるいはその誘導体、あるいは他の同等の化合物を意味するものと理解される。
【００４８】
本発明者等によって得られ、かつ本発明で使用することができるシリル化エストラジオールの例を以下に示す。エストラジオールは-OH官能基を有しており、以下に示すように、Si-O結合によって、この官能基にシリル基を結合させることができる(例えば、添付の図1に示す未変性エストラジオール(Es)と比較されたい)。
【００４９】
本発明の第2の実施形態を実施するのに選択した有機化合物をシリル化するために使用できる試薬は、上記したもの、例えばBTSFAまたはMTBSTFAであってよい。
【００５０】
本発明のこの実施形態で使用される抗体は、シリル化有機化合物と非シリル化有機化合物を別々に認識するという特徴を示す。これらの抗体はモノクローナルでよい。これらは、この種の抗体を調製するために慣用される技術、例えば、これらの化合物のうちの1つだけに特異的であるマウス抗体を得るために、シリル化有機化合物あるいは非シリル化有機化合物を、マウスに注射することによって調製することができる。本発明の方法を実施する目的で、2つの化合物(シリル化されたまたはシリル化されていない)のうちの1つだけに対して特異的である抗体を選択するために、異なるバッチの調製抗体で試験を実施することができる。抗体の調製のためのこれらの技術は、当業者によく知られているものである。
【００５１】
【化２】
【００５２】
例としては、本発明を実施するのに使用できる抗体を調製するために適した方法の概要が参考文献番号[34]〜[38]の文献に記載されている。
【００５３】
例としては、有機化合物が上記一覧表から選択されるシリル化可能な化合物である場合に、本発明を実施するのに使用できる抗体が、さらに文献番号[5]〜[24]および[39]〜[42]にも記載されている。
【００５４】
添付の図1に示した例では、エストラジオールに対しておりかつイムノアッセイで使用される抗体は、エストラジオールがシリル基で修飾された場合(以下「修飾エストラジオール」とも称する)、抗体が、エストラジオールをもはや認識しない、または、わずかにしか認識しない(すなわち、この認識の差が検出されるのには十分であるという形で)ように選択される。修飾エストラジオールへのフッ素の効果は、Si-O結合を攻撃する(脱シリル化反応)ということであり、それによって未変性エストラジオールは再び出現でき、次いで、以下「第1の抗体」と称するその特異的抗体が未変性エストラジオールを認識できるようになる。
【００５５】
本発明では、当業者に周知の抗原/抗体認識を検出するための任意の手段を、その抗体による脱シリル化有機化合物(「未変性有機化合物」)の認識か、その抗体によるシリル化有機化合物の認識かのどちらかを検出するために使用することができる。本明細書で、「第1の抗体と非シリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段」または「第1の抗体とシリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段」という用語を使用するのはそのためである。抗体を使用したこのような検出のための操作条件は当業者によく知られている。用いられるプロトコール、試薬、緩衝剤および操作条件は、例えば参考文献番号[5]〜[24]および[39]〜[42]の文献に記載されている。
【００５６】
この実施形態による検出は、例えば、免疫学的検出方法および/または免疫学的測定方法で通常用いられるものなどの、「競合」型のイムノアッセイまたは「非競合」型のイムノアッセイを実施することによって行う。
【００５７】
本発明のこの第2の実施形態の第1変更形態によれば、検出手段は例えば標識分子であってよい。これは、「トレーサー」と称され、前記第1の抗体に関して、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物、例えばシリル化エストラジオールまたは非シリル化エストラジオールと競合することになる。この標識分子としては、酵素例えばアセチルコリンエステラーゼ、蛍光標識、発光標識または放射性同位体を検出のために使用することができる。
【００５８】
したがって、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物のイムノアッセイ(すなわち免疫学的測定)は「競合」であると称される。このアッセイは、標準シリーズまたはサンプル中に存在するシリル化有機化合物または非シリル化有機化合物、例えばシリル化エストラジオールされたまたは非シリル化エストラジオールに対する抗体と、本発明による有機化合物例えばエストラジオールに化学的に類似していて、シグナル(標識)例えば酵素性、蛍光性、発光性もしくは放射性シグナルを運ぶトレーサーとを使用する。上記のエストラジオールの例では、トレーサーは例えば、エストラジオールを酵素例えばアセチルコリンエステラーゼに結合させることによって得ることができる。
【００５９】
本発明の方法を実施するために使用できる「競合」の検出を図解して図2および3に示す。この図では用いた有機化合物はエストラジオールである。標識化された分子もしくはトレーサーは「T」で表示され、シリル化されていない(修飾されていない)エストラジオールは「Es」で表示され、シリル化された(修飾された)エストラジオールは「Es-M」で表示されている。第1の抗体は例えばマウス抗体(sAb)である。図2は、修飾エストラジオール(Es-M)は、抗体(sAb)によって認識されないが(認識されないことは、×印で示されている)、HFが存在する場合、このストラジオールは、未変性エストラジオール(Es)に変換された後、第1の抗体(sAb)によって認識されることを示している。次いでこれはトレーサー(T)(標識エストラジオール)との競合に入る。したがって、HFの存在を検出することができる。この方法では、抗体と結合しているトレーサーの量は、サンプル中に存在するエストラジオールの量と反比例する。
【００６０】
この競合による検出方法では、第1の抗体(sAb)と非シリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段(または第1の抗体とシリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段)には、第2の抗体(gAb)を含むことができる。例えばこの第2の抗体は、上記マウス抗体(sAb)(第1の抗体)に対するヤギ抗体(gAb)またはウサギ抗体であってよい。第2の抗体を用いたこの検出の図解を添付の図2に加えた。この第2の抗体(gAb)はレセプタクル(R)、例えばマイクロタイトレーションプレートの底部に結合させることができる。
【００６１】
したがってこの例では、このアッセイは、限られた数の抗体分子に関して、トレーサーと測定されるエストラジオールとの間で競合させることにある。反応の最後で、抗体と結合していないトレーサーを除去した後、抗体-結合トレーサーによって運ばれるシグナルを測定することができる。
【００６２】
トレーサーが酵素例えばアセチルコリンエステラーゼを含む場合(図2の白い四角で図示されている)、検出手段にさらに酵素インジケータを含めることができる。アセチルコリンエステラーゼを用いる上記例では、酵素インジケータはアセチルチオコリンとジチオニトロフルオロベンゼンとの混合物からなる。このインジケータは、肉眼で見られるかまたは分光光度計で414nmで定量できる黄色の生成物に変換される。このインジケータは、実際に、本発明を実施するためのEllman比色分析検出および測定法を適用するために使用される。この方法は例えば文参考文献番号[43]の文献に記載されている。
【００６３】
本発明のこの第2の実施形態の第2の変更形態によれば、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定は、「非競合」型のイムノアッセイを用いて実施される。競合アッセイと較べて、非競合アプローチの難しさは選択される有機化合物に関係している。その化合物は、2つの化学的特性、すなわち固相に結合する可能性とシリル化される可能性とを有していなければならない。さらに、固相に結合した場合、液相の場合と同等に有利な条件下で、有機化合物の脱シリル化が可能でなければならない。この変更形態は、上記のヒドロキシル化された有機化合物に適用することができる。例えば、これを、上記のものなどのエストラジオール誘導体例えばエストラジオール3-カルボキシメチルエーテル、またはペプチド例えば上記のAcSDKPに適用することができる。
【００６４】
この変更形態では、シリル化化合物を、固相例えば支持体、例えば実験室で通常使用されているものなどのマイクロタイトレーションプレートに結合させる。サンプルを、シリル化化合物と接触させ、次いでプレート上に固定化させて、検出および/または測定をその場で実施することができる。
【００６５】
上記に定義したシリル化有機化合物のうちの1つを支持体に結合させ、同時に、シリル化化合物のフルオリドイオンとの反応性を保持するための当業者に知られた適当な技術によって、シリル化化合物を支持体に固定化させるかまたは結合させることができる。すべては、支持体と、本発明を実施するための選択したシリル化有機化合物の化学的性質によって決まる。この結合は、例えば共有結合によって行うことができる。支持体は、官能化された支持体、すなわちシリル化有機化合物の結合を容易にする化学基がそれにグラフトされた支持体であってよい。例えば、選択されたシリル化有機化合物が、上記のものなどのエストラジオール誘導体例えばエストラジオール-3-カルボキシメチルエーテル、またはペプチド例えばAcSDKPである場合、支持体は例えば、アミノ基例えばNunc-NH2プレートを含むプレート、またはポリリシンで活性化されたプレートであってよい。
【００６６】
サンプル中にフルオリドイオンが存在する場合、支持体と結合しているシリル化化合物は、フルオリドイオンとの反応に続いて非シリル化化合物に変換される。次いで、例えば非シリル化化合物を特異的に認識する第1の抗体の存在下で、イムノアッセイ技術によって検出および/または測定を実施することができる。
【００６７】
第1の抗体による非シリル化化合物の認識は、当業者に知られている任意の手段、例えば第1の抗体の標識化によっても、また標識を運ぶ第1の抗体を認識する第2の抗体(第2の抗体は次いでトレーサーとなる)によっても実証することができる。標識は、当業者が通常用いる、例えば酵素性シグナルのうちの1つであってよい。例えば、第2の抗体は、第1の抗体(マウス抗体(sAb)であってよい)に対するヤギ抗体またはウサギ抗体(gAb)であってよい。
【００６８】
「非競合」検出の1つの方法を図18に図解して示す。この図で用いられている有機化合物はエストラジオールカルボキシメチルエーテル(EstCME)である。抗体のうちの第2の抗体は、「sAb」(トレーサー)と表示されている抗エストラジオール抗体(例えばマウス抗体)である。シリル化されていない(修飾されていない)エストラジオールは「Es」で表示され、シリル化された(修飾された)エストラジオールは「Es-M」で表示されている。マウス抗体(sAb)に対する第2のヤギ抗体またはウサギ抗体(gAb)は、例えばマイクロタイトレーションプレート(R)の表面に付加される。トレーサー「T」を形成するために、gAb抗体は標識例えば酵素に結合される。この図は、抗体(sAb)が修飾エストラジオール(Es-M)を認識できないこと(認識できないことは×印で示されている)を示している。しかし、HFが存在する場合、Es-Mは、次に第1の抗体(sAb)によって認識され得る未変性エストラジオール(Es)に転換される。したがって、HFの存在を検出することができる。この場合、抗体(sAb)に結合しているトレーサーの量(gAb+標識)は、サンプル中に存在する脱シリル化エストラジオールの量に比例する。
【００６９】
本発明者等は、本発明のどの実施形態を用いたとしても、本発明を実施するのに有利な操作条件を決定した。もちろん必要なら、これらの条件は、用いる他のシリル基、他のシリル化有機化合物または他の検出手段のために、本発明の意味の範囲内で適合させるかまたは改変することができる。これらの条件は、本発明の第2の実施形態のために特に有利である。
【００７０】
したがって、本発明の方法において、接触させるステップは54〜64℃の温度で実施するのが有利である。これは、温度が高すぎると、シリル化有機化合物の自発的な脱シリル化を伴う現象が発生するからである。当業者は、選択した有機化合物および検出方法に応じて、本発明を実施する温度を容易に適合させることができよう。
【００７１】
本発明の方法での接触を、例えば50mMのリン酸塩緩衝液中で、または任意の適切な緩衝剤を用いてpH4.5〜6.5、好ましくはpH5.5で実施することも有利である。
【００７２】
その理由は、pH値が余り酸性サイドになり過ぎると、シリル化有機化合物の自発的な脱シリル化を伴う現象が発生する可能性があるからである。この場合も、当業者は、本発明を実施するpHを、選択した有機化合物および検出方法に応じて容易に適合させることができよう。
【００７３】
本発明によれば、シリル化有機化合物、例えばエストラジオールまたは同等の分子量の他の化合物などの測定溶液中の濃度を、有機化合物の分子量および用いる検出および/または測定手段に応じて適合させることができる。本発明の方法を実施する場合、一般に濃度は1〜2000ng/ml、例えば2〜500ng/mlであってよい。
【００７４】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットにも関し、前記キットは以下の試薬を含む。すなわち、フッ素またはフッ化水素酸が存在下で、脱シリル化されるシリル化有機化合物;水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出するための手段を含む。
【００７５】
フッ素またはフッ化水素酸の存在下で脱シリル化されるシリル化有機化合物は本明細書で定義の通りである。
【００７６】
水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出および/または測定するための手段は、もちろん本発明の方法を実施するための検出および/または測定方法に応じて変わる。使用できる方法は上記の定義の通りである。したがって、検出手段および/または測定手段は以下の成分のうちの1つもしくは複数を含むことができる。すなわち、着色インジケータ、上記したものなどのマーカー、酵素、上記したものなどの測定手段、シリル化有機化合物および/または非シリル化有機化合物等を検出および/または測定するのに必要な抗体等を含む。
【００７７】
例えば、キットは、競合のイムノアッセイを実施するために必要な試薬および抗体、または非競合のイムノアッセイを実施するために必要な試薬および抗体を含むことができる。キットは、非シリル化有機化合物または脱シリル化有機化合物に対する、あるいはシリル化有機化合物に対する1種または複数の抗体、例えばマウス抗体を含むことができる。キットはさらに、上記の抗体に対する1種または複数の抗体、例えばヤギ抗体もしくはウサギ抗体を含むことができる。キットは、実施された免疫学的反応を実証できるようにするトレーサーも含むことができる。
【００７８】
本発明によれば、キットは、1個または複数のウェルがその中に形成されている、試薬を受け入れるための支持体、例えばポリスチレンストリップをさらに含むことができる。このウェルは、本発明の方法の接触のステップ、ならびに/または検出および/または測定のためのレセプタクルとして用いられる。したがって、測定および/または検出を、マイクロタイトレーションプレートのウェル中で容易に実施することができる。そうした支持体、例えば上記のストリップ上に、マウス抗エストラジオール抗体に対する抗体例えばヤギ抗体またはウサギ抗体で、そのウェルをコーティングすることができる。シリル化エストラジオールをウェルの底部に結合させることもできる。
【００７９】
本発明の結果、本発明者等は、溶液中で0.001μg/mlのオーダーの濃度でHFを検出するための実際的で迅速な試験法を開発することに成功した。
【００８０】
有利なことに、本発明の感度は任意の工業的用途、特に、最も有用である大気中のフッ化水素酸の測定を想定することができる。この場合、1×10-2l HF/106l空気(10ppb)を容易に検出できる。したがって、本方法の性能は、HFを検出するのに数百ppbのオーダーの濃度に限られている従来技術の現地用アッセイの性能より優れている。
【００８１】
サンプルおよび用いる検出手段の性質によるが、一般に本発明によって、約1/2〜4時間で結果を得ることが可能になる。ある種の従来技術の方法のより長い時間を要する場合もあるが、本発明の方法は一般により高感度である。
【００８２】
本発明の方法は、フッ化水素酸またはフルオリドイオンを含有する任意のサンプルに有利に適用される。すなわち、大気サンプル、食品、植物、生物学的媒体に適用される。それぞれの場合、サンプリングおよびサンプル調製のための条件は、フッ化水素酸またはフルオリドイオンをアッセイするための任意の他の方法と同様である。
【００８３】
本発明の他の利点は実施するのが簡単なことである。例えば、その技術はイムノアッセイでの技術と同一であってよい。すなわち、簡易型の試薬の使用、分配のハンドリングが容易であること、コンパクトであること、輸送および再配置が容易であること、エネルギー供給なしで作業できる可能性があること、および肉眼またはポケット型簡易分光光度計を用いた比色計で読み取れることである。
【００８４】
添付の図面を参照して、非限定的な形で、例示で示されている以下の説明を読むことによって、本発明の他の用途および利点も明らかになるであろう。
【実施例】
【００８５】
本発明の方法の様々な態様を以下で検討した。すなわち、エストラジオールについての免疫学的アッセイの構築、シリル化によってエストラジオールを修飾するための条件の試験、質量分析によるシリル化有機化合物の立証、シリル化化合物のHFとの反応の試験、シリル化された誘導体の化学的性質の最適化、試薬の濃度および測定の感度の最適化、酸についての測定の特異性の最適化、ならびに測定の適用性(applicability)の試験である。これらの検討の主な結果を以下に示す。
【００８６】
試験は、大気中のフッ化水素酸のサンプル(実験室でのシミュレーション)と、フルオリドイオンを含有する水のサンプルとについて実施した。
【００８７】
本発明の方法の能力を判断するために、本発明者等はその感度パラメータを定義した。その感度は、HFの非存在下で得られるシグナルとは統計的に異なるシグナルを発生させるために必要なHFの量を表す。本発明の方法によれば、測定するサンプル中に存在する未変性(シリル化されていない)エストラジオールの量は、検出できないシリル化エストラジオールを、検出できる非シリル化エストラジオールに転換させるためのフッ素の量に応じて変わる。したがって、HFを測定するために、感度を、ジメチルtert-ブチルエストラジオールの存在下に置いた場合に、抗体と酵素トレーサーとの間の結合の著しい低下を誘発することができるフッ素の必要量として定義した。
【００８８】
(実施例1)
競合イムノアッセイによるフッ素の検出および測定への本発明の方法の適用
この実施例では、選択した有機化合物はβ17-エストラジオールの誘導体である化合物である。
【００８９】
1)抗エストラジオール抗体の調製
アッセイで使用した抗体は、具体的には、β17-エストラジオールから誘導され、マウス中で抗体を得る目的でウシアルブミンに結合させた化合物から作製した。
【００９０】
用いた技術は文献番号[39]に記載されているものである。
【００９１】
2)抗エストラジオール抗体からの抗体マウス抗体の調製
Immunotech company(Lumigny)から販売されているヤギ抗マウス抗体抗体を、96-ウェルのポリスチレンマイクロタイトレーションプレート(Nunc)をコーティングするために使用する(用いた希釈度は:5μg/ml)。コーティングした後、プレートを、0.5%アルブミンを含む緩衝液中に4℃で保存する。
【００９２】
プレートへの結合は簡単な吸収で行う。タンパク質が結合されるように、インキュベーションは十分に長くしなければならない。この調製は当業者の一般的な知見に属するものである。
【００９３】
3)酵素トレーサーの調製
酵素トレーサーは、エストラジオールをアセチルコリンエステラーゼ(AChE)に結合させて得た。N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテートを用いてチオール基をエストラジオールに導入する。修飾エストラジオールをAChEに結合させる。このAChEに、エストラジオールチオール基と反応するマレイミド基が導入されている。トレーサーはゲル濾過で精製し、次いで一定分量を-20℃で保存した。
【００９４】
この調製で使用し、かつ本発明で一般に使用できる技術および酵素トレーサーは、参考文献番号[44]および[45]の文献に記載されている。
【００９５】
4)製品と他の試薬
エストラジオールはSigma Aldrichから入手した。シリル化剤はPerbio companyから入手した。
【００９６】
フッ化水素酸はMerck-Eurolab companyから入手した。
【００９７】
すべての試薬、すなわちトレーサー、抗体、エストラジオールおよびサンプルは、アジド(0.01重量/容積%)(重量/容積%=重量gと容積100mlの比)(すなわち、この場合、0.01g/100ml)、ウシアルブミン(0.5重量/容積%)およびNaCl(0.9重量/容積%)を含有する0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7)中に希釈させて用いた。
【００９８】
5)用いたシリル化エストラジオール濃度の最適化
脱シリル化エストラジオール、したがって、フッ素を続いて検出できるようにするために、HFを含有するサンプルと接触させるシリル化エストラジオールの濃度を最適化した。
【００９９】
したがって、用いたシリル化エストラジオールの濃度が非常に低い場合、シリル化エストラジオールがすべてエストラジオールに変換されても、この低濃度によって、高精度での検出の実施が可能になるわけではない。
【０１００】
本発明の方法での脱シリル化のために使用される修飾エストラジオールの最適濃度を決定するために、複数の試験を実施した。この濃度はもちろん使用する試薬と操作条件によって変わる。
【０１０１】
ここで示す実施例では、濃度は好ましくは200ng/mlである。
【０１０２】
エストラジオールおよびその誘導体の場合、この濃度は一般に、1〜2000ng/ml、好ましくは2〜500ng/mlであると推定することができる。これらの範囲は、特に実施例の条件のための単なる目安としてだけ示したものである。
【０１０３】
6)エストラジオールのシリル化
1容積部のエストラジオール(2mg/ml)を4容積部のMTBSTFAと混合し、全体を室温で30分間〜1時間インキュベートする。
【０１０４】
用いたシリル化剤はBTSFAまたはMTBSTFAである。得られた生成物を上記に示す。
【０１０５】
液体クロマトグラフィーと質量分析による立証によって、エストラジオールはシリル化されていたことが分かった。
【０１０６】
シリル化した後、エストラジオールを、使用前に、100%ジメチルホルムアミド(DMF)、あるいは100%ジメチルスルホキシド(DMSO)で1000倍に希釈する。
【０１０７】
7)エストラジオールの脱シリル化
2.5μlの1Mリン酸塩緩衝液(pH=5.5)と、47.5μlのサンプルもしくは既知の濃度のHF溶液(標準シリーズ)を、50μlのシリル化エストラジオールに加える。
【０１０８】
混合物を振とうし、次いで水浴に55〜66℃で1時間置いて乾燥させる。
【０１０９】
脱シリル化反応は、アッセイ緩衝液中で混合物を希釈する(40倍希釈)ことによって停止させることができる。この緩衝液は、アジド(0.01重量/容積%)(重量/容積%=重量gと容積100mlの比)(すなわちこの場合、0.01g/100ml)、ウシアルブミン(0.5重量/容積%)およびNaCl(0.9重量/容積%)を含む0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7)である。
【０１１０】
8)酵素インジケータ:アセチルコリンエステラーゼ(Ellman反応)の酵素活性の測定
この方法は偽基質、すなわちアセチルチオコリン(AcTCh)を使用する。これは、アセチルコリンと同一速度で加水分解される。この加水分解は、ジチオニトロベンゼン(DTNB)を還元することができるチオコリン(TCh)の生成をもたらす。還元されたDTNBは、可視域(εm412nm=13600モル-1cm-1l)に強い吸収を有していて黄色に発色する。
【０１１１】
過剰な基質によるその阻害を考慮に入れて、AChEの活性が最大である濃度でAcTChを使用する。さらに、基質のすべてが変換され、比色測定されるのを回避するために、用いるDTNBの量はAcTChの量より少なくする。これに対して、AcTChの1分子の加水分解によって1分子だけの還元DTNBの生成が確実にもたらされるように、使用するDTNBは生成されるTChの量に対して過剰にする。
【０１１２】
Ellman反応の実施の仕方は当業者に知られており、ここで提供する情報を基に、当業者は本発明を実施するための最適の操作条件を容易に見出すことができる。
【０１１３】
9)未変性エストラジオールのイムノアッセイ:HFの定量化
先に得られたエストラジオール抽出物を1/40に希釈し、トレーサーと抗エストラジオール抗体を存在させてアッセイプレートに分配する。反応容積は200μlである。
【０１１４】
免疫学的反応を環境温度で1時間実施する。
【０１１５】
未結合トレーサーを除去するためにアッセイプレートを洗浄して、0.2ml容積部のインジケータ溶液を加える。
【０１１６】
約1時間後、黄色に発色する。分光光度計を用いて光学密度測定を実施する。
【０１１７】
10)結果の解釈
実施したアッセイにおいて、標準HFシリーズを用いて、サンプル中に含有されているフッ素の濃度を測定することが可能であった。したがって、本発明の方法の実現可能性が実証された。
【０１１８】
(実施例2)
MTBSTFA修飾エストラジオールとBTSFA修飾エストラジオールの場合のHF検出の特異性の差の検討
以下に述べるすべての操作において、脱シリル化の際のシリル化エストラジオールは、所与の実験ですべてのサンプルについて同一濃度で使用した。その濃度は200ng/mlであった。
【０１１９】
他の試薬の場合濃度は以下の通りである。
- マウス抗エストラジオール抗体:5μg/ml、
- アセチルチオコリン:7×10-4M、
- 5-5'-ジチオビスニトロベンゾエ-ト:7×10-4Mおよび
- アセチルチオコリンに結合されたエストラジオール:約1ng/ml
である。
【０１２０】
試験は、実施例1で説明した方法で、ポリスチレンストリップ上の300μlウェルで実施した。
【０１２１】
A)BTSFA(これはトリメチルシリル基を提供する)でシリル化されたエストラジオールをHFで開裂させ(脱シリル化反応)、それによってその未変性形態を回復する。このような開裂は他の酸、すなわち塩酸(HCl)、硝酸(HNO3)、硫酸(H2SO4)およびリン酸(H2PO4)を用いた場合にも認められる。結果を添付の図4に示す。
【０１２２】
したがって、このシリル基を用いた場合、脱シリル化反応は必ずしもフッ素に対して特異的ではない。したがって、このシリル化エストラジオールはむしろ、後者がそれのみである場合のHFの検出、あるいは他の酸が存在しない場合のHFの検出に適している。
【０１２３】
B)水性媒体中ではより低い溶解性を示すが、MTBSTFA(BTSFAによって提供されたものより疎水性であるシリル基を提供する)でシリル化されたエストラジオールは、HFによって特異的に開裂され(脱シリル化反応)、それによって未変性形態を回復する。したがって、同一条件下で作成した添付の図6に示すように、試験した他の酸は、この形で修飾されているエストラジオールを開裂させない (以下の実施例3を参照されたい)。
【０１２４】
したがって本発明者等は、エストラジオールをシリル化するために、以下の実施例ではMTBSTFAを選択した。
【０１２５】
(実施例3)
本発明の方法におけるフッ素脱シリル化反応に適した緩衝剤の探求
いくつかの酸物質も、MTBSTFAを用いて修飾エストラジオールの脱シリル化に対して効果があるので(実施例2参照)、本発明者等は、フッ素の脱シリル化反応に対する特異的な効果を高め、存在する可能性のある他の化合物の酸の性質に起因する非特異的効果を阻害する緩衝溶液を探求することにした。
【０１２６】
高濃度で存在する場合(高酸濃度物を緩衝するために必要)、水酸化ナトリウム(NaOH)や水酸化カリウム(KOH)などの塩基も酸不在下でのエストラジオールの脱シリル化を誘発する(データは示されていない)。したがって、これらは使用できない。
【０１２７】
リン酸塩イオンで50mMのリン酸塩緩衝(KH2PO4/K2HPO4)溶液も試験した。これらは良好な結果をもたらした。酸性であることが、シリル化エストラジオールが自発的に脱シリル化される結果をもたらさないことを確実にするために、これらの溶液のpHを検討した。
【０１２８】
したがって、例えばサンプルが、有機化合物の自発的な脱シリル化を誘発できる他の酸または塩基を含有し、それによって本発明の方法検出および/または測定感度が低下する場合、本発明の方法は緩衝媒体中で有利に実施することができる。
【０１２９】
さらに、本発明者等は、ある種の条件下では、脱シリル化温度が高すぎると、修飾エストラジオールが自発的に脱シリル化される(データは示していない)結果となることがあることを確認した。このため、種々の緩衝剤のそれぞれについて種々の温度を検討した。
【０１３０】
得られた結果を添付の図5に示す。この図では、「E2M」はジメチルシリルtert-ブチルエストラジオールを表し、「A.T.」は環境温度を表す。
【０１３１】
pH5.5または6のリン酸塩緩衝溶液の場合、シリル化エストラジオールの自発的な脱シリル化は94℃で起こるが、54℃ではそうした脱シリル化は起こらない。
【０１３２】
結論として、シリル化エストラジオールを脱シリル化するための好ましい条件を以下の通り示した。すなわち、pH5.5の50mMリン酸塩緩衝液中で、54〜64℃の温度である。これらの条件は、エストラジオールおよび上記のシリル基について、上記操作条件下で決定されたことを理解されよう。
【０１３３】
本明細書で提供した情報をもとに、当業者は、選択したシリル化有機化合物、サンプルおよび本発明の方法の実施条件に応じて、容易に他の条件を決定することができよう。
【０１３４】
(実施例4)
本発明の方法の実施に対する種々の酸の効果
脱シリル化に対する様々な他の酸の効果を上記実施例3の条件下で試験した。
【０１３５】
これらの試験結果を図6に示す。この図で、「F.ac」はギ酸を表し、「ac.ac」は酢酸を表し、「P.ac」はリン酸を表し、「OP.ac」はオリトリン酸を表し、「T.ac」はトリフルオロ酢酸を表す。
【０１３６】
これらの結果は、HF以外の酸が、MTBSTFAでシリル化されたエストラジオールに対してほとんど効果がないことを明らかに示している。
【０１３７】
したがって選択したシリル基はフッ素の検出の特異性に役割を果たしている。試験サンプル中にフッ素以外の化学成分が存在する場合、特にこれらの成分が用いられている有機化合物の脱シリル化を誘発できる場合、この事実を考慮すべきである。
【０１３８】
(実施例5)
他のハロゲンおよび求核物質と比較した場合のフッ素の特異性
フッ素はハロゲンであり、求核的な特徴も有している。エストラジオールの脱シリル化反応におけるフッ素の特異性を試験するために、Bu4NBr、Bu4NCl、Bu4NIおよびKIなどの他のハロゲン、ならびに4-ニトロフェノールおよび4-ニトロイミダゾールなどの求核物質の効果を、上記実施例の操作条件下で、MTBSTFAでシリル化されたエストラジオールを用いて検討した。
【０１３９】
添付の図7はこの実施例で得られた実験結果を示し、他の生成物と比較した場合のフッ素の特異的を実証している。
【０１４０】
試験した他の生成物と比較して、フッ素がエストラジオール脱シリル化反応において非常に特異的であることは明らかである。
【０１４１】
(実施例6)
HFおよびフッ素イオンによる開裂
この実施例では、先の実施例で用いた実験条件下で、様々なフッ素塩をMTBSTFAシリル化エストラジオールと接触させた。
【０１４２】
添付の図8は得られた結果を示している。この図では、試験した異なるフッ素塩を特定するためには、通常の化学記号を用いた。
【０１４３】
フッ素イオンはシリル化エストラジオールの開裂に関して、HFと同様の挙動をする。これはフッ素の反応の特異性を確認させるものである。
【０１４４】
(実施例7)
本発明の方法の分析能力と有機溶媒の添加の効果
図7および8に示すように、上記実施例で述べた条件下では、水性媒体で希釈されたHFの場合で、HF測定の感度は約5×10-5M(すなわち1μg/ml)である。
【０１４５】
本発明者等は、補足的な検討の過程で、水混和性有機溶媒を水性脱シリル化溶液に加えることによって、本発明の方法の感度をさらに増大させることができることを確認した。
【０１４６】
実験はジメチルホルムアミド(DMF)(エストラジオールのシリル化を参照されたい)とジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて実施した。
【０１４７】
本発明の方法による脱シリル化を行う溶媒としてジメチルスルホキシド(DMSO)を用いることによって、感度を500倍(約10-7M、すなわち0.001μg/ml)向上させることができる。
【０１４８】
図19は、接触水溶液の総容積ベースで95容積%の濃度のジメチルスルホキシドの存在下で実施した反応の場合での、フルオリドイオンについての分量応答曲線(dose-response curve)を示す。これらの結果は上記の実施例からの結果と比較されたい。
【０１４９】
したがって、前記接触水溶液への有機溶媒の添加によって、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定の感度が実質的に増大する。
【０１５０】
(実施例8)
本発明の化合物がエストラジオール誘導体である場合の本発明の方法の使用
この実施例では、本発明の方法を実施するために用いた有機化合物は、エストラジオール(E2OCH3)のO-メチル誘導体すなわち、次の式の17-βエストラジオール-3-メチルエーテルである。
【０１５１】
【化３】
【０１５２】
操作条件は上記実施例1および2で説明した条件である。
【０１５３】
得られた実験結果を添付の図17に示す。フッ素の存在下で確かにE2OCH3が脱シリル化されていることが分かる。
【０１５４】
したがって、本発明の方法でのエストラジオール誘導体の使用に対する説得力のある理由が認められる。
【０１５５】
(実施例9)
有機化合物が水酸官能基を有するペプチドである場合の本発明の方法の使用
この実施例では、有機化合物はペプチドである。ペプチドはテトラペプチド、すなわち以下の式のアセチル化Ser-Asp-LysPro(AcSDKP)である。
【０１５６】
【化４】
【０１５７】
AcSDKPは水酸基を有するペプチドであり、一度にかつ同時にシリル化し、そのカルボキシルまたはアミノ基によって固相に結合させるのが有利である。
【０１５８】
最初に、このペプチドのシリル化反応を検討し、続いて本発明の方法でのこのシリル化化合物の使用の検討を行った。
【０１５９】
未希釈のBSTFAまたはMTBSTFAを用いて、AcSDKP(1mg/ml)を22℃、37℃または60℃で、10、30または60分間シリル化した。反応後、文献[5]に記載の技術により、かつウサギポリクローナル抗体を用いて、シリル化されたAcSDKPをAcSDKP特異的競合アッセイで検出した。この場合、シグナルの増加は、免疫反応性がなくなり、したがってシリル化が効率的であったことを示している。
【０１６０】
得られた実験結果を報告する添付の図15が示すように、MTSBTFAは、AcSDKPの60℃での反応性を低下させる。これは化合物がシリル化されていることを示唆している。
【０１６１】
次いで本発明によって、HFの存在下で、このシリル化されたペプチドに対する脱シリル化試験を実施した。添付の図16は得られた結果を示す。HFはペプチドを脱シリル化することが分かる。したがって、シリル化された基を失ったことによって免疫反応性が増大し、それによってシグナルがより弱くなる結果となる。図に示すように、HFの存在下でシグナルは低下する。
【０１６２】
したがって、ヒドロキシル化されたペプチドを有機化合物として使用する場合、本発明の方法を実施することができる。
【０１６３】
(実施例10)
溶液中でのフッ素の検出および測定
本発明の方法の妥当性を立証するために、本発明等は、そのフッ素濃度が既知である種々の鉱水を試験した。
【０１６４】
用いたプロトコールは実施例1のプロトコールであり、選択した有機化合物はMTBSTFAでシリル化されたエストラジオール(ジメチルtert-ブチルエストラジオール)である。
【０１６５】
表Iはこの実施例で得られた結果を示す。いずれの場合も、この表はフッ素の存在が検出されたことを示している。
【０１６６】
濃縮した大部分の水サンプルの場合、理論濃度と判明した濃度との間の相関がありそうである。変動がほとんど観察されない原因は、サンプル中に存在するフッ素の性質によるということができる。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
(実施例11)
ガス媒体中のフッ素の検出および測定
測定されるHFはしばしばガスの形態であり、測定するために水溶液中にガスを通す必要がある。HFで汚染された空気がなかったので、本発明者等は、既知の濃度のHF溶液を密封容器中で蒸発させて、そうしたサンプルを人為的に作製した。HFを蒸発させた後、空気を収集用緩衝液(DMF)中にポンプで送り、そこでバブリングさせた。
【０１６９】
HF濃度が1.2×10-2l HF/106l空気(12ppb)である100リットルの空気を濾過できる装置を用いて、溶液中で、10-5MのHF濃度を得た(収率100%として)。
【０１７０】
フッ素の検出に使用するプロトコールは実施例1で述べたものである。選択した有機化合物はMTBSTFAでシリル化されたエストラジオールである(ジメチルtert-ブチルエストラジオール)。
【０１７１】
図9に示す結果は、いずれの場合にもフッ素が検出されたことを示している。フッ素の理論濃度と検出濃度間の相関はかなり良好である。
【０１７２】
したがって、本発明による空気中でHFを検出するための方法によって、10-2l HF/106l空気(10ppb)のオーダーの濃度でのHFの検出が容易に可能である。
【０１７３】
(実施例12)
本発明の方法の非競合イムノアッセイによるフッ素の検出および測定への適用
1)概略の方策
目的は、先に得られた結果を用いること、すなわちHFの作用によって、シリル化化合物の免疫学的認識を修飾する可能性についてである。
【０１７４】
先のアッセイフォーマット(競合)に対して、イムノメトリックアプローチは、シリル化化合物を、固体表面上に共有結合的に固定することにある。HFによるその変換は免疫活性形態をもたらし、それによって、シグナルが消失する競合アッセイと反対に、シグナルの発生がもたらされる。
【０１７５】
このフォーマットは優れた感度をもたらすことが多い。それは多分、過剰にある試薬と関連した熱力学的な好都合さと、シグナルの消失よりその出現の方が目視するまたは測定するのにより容易であるという事実に基づく読取の容易さとに起因している。
【０１７６】
2)試薬とプロトコール
用いた抗体は文献番号[39]に記載のものである。
【０１７７】
ウサギ抗体のビオチン化と、アセチルコリンエステラーゼによるストレプトアビジンまたは抗体の標識化とを当業者に周知の通常の技術を用いて実験室で実施した。
【０１７８】
化学薬品および製品はすべてSigmaまたはMerckから入手したものである。入手した化合物はSigmaまたはSteraloidsからのものである(エストラジオール誘導体の場合)。
【０１７９】
アッセイ緩衝液はアジド(0.01%)、ウシアルブミン(0.5%)およびNaCl(0.9%)を含有する0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7.4)である。
【０１８０】
酵素インジケータは、アセチルチオコリンとジニトリフルオロベンゼン(dinitrifluorobenzene)の混合物からなる。トレーサーとの反応に続いて、肉眼で視られるかまたは分光光度計で414nmで定量できる黄色が発生する。
【０１８１】
実験を実施するために、特にエストラジオール誘導体を結合させるために使用したプレートはNunc(Rochester、USA)から入手した。
【０１８２】
用いたシリル化剤はBSTFAとMTBSTFAである。
【０１８３】
使用したエストラジオールを以下に示す。この化合物の利点は、検出のために抗体を使用することと、競合アッセイ用に先に開発した基本原理を用いることが可能になることである。
【０１８４】
本発明者等は、得られた抗エストラジオール抗体は、シリル化化合物ではなく、非シリル化化合物を認識することをまず立証した(エストラジオールと比べて、抗体と53%交差反応)。立証は肯定された。
【０１８５】
【化５】
【０１８６】
次いで、本発明者等は、エストラジオールと、2種類のプレートすなわちアミノ基(Nunc-NH2プレート)を有するプレートとポリリシン(poly-Lys)で活性化したプレートの共有結合について試験した。
【０１８７】
3)エストラジオール誘導体の結合の試験
EstCMEを、プレート上でアミノ基を抗原のカルボキシル基に結合させる等モル濃度のN-ヒドロキシスクシニド(NHS)の存在下、22℃で3時間、Nuncプレートにインキュベートした。100ng/ml抗エストラジオール抗体を20℃で4時間用い、次いで、アセチルコリンエステラーゼ(2Ellman単位のgAb-AchE/ml)に結合させたヤギ抗ウサギ抗体抗体を22℃で2時間用いて可視化を実施した。Ellman試薬、AchEの基質を加えて酵素活性を可視化する。
【０１８８】
得られた結果を添付の図10に示す。エストラジオールが効果的に結合され、試験した最高濃度(100μl/ml)で最大値が得られていることを示している。
【０１８９】
ポリリシン(poly-Lys)(リン酸塩緩衝液中に1〜100μg/ml)をその上に予め吸収させたプレートを用いて、この最初の実験を繰り返した。
【０１９０】
得られた結果を添付の図11に示す。この場合、検討したポリリシンの濃度に関わらず同じオーダーの結果である。これはさらに、ポリリシンが担持するアミノ基は、選択されたエストラジオールを結合させるのに、よりアクセスし易いことを実証している。
【０１９１】
ポリリシンの濃度の影響についてより詳細に検討するために、より広い範囲のポリリシン濃度で試験を繰り返した。得られた結果を添付の図12のグラフに示す。ポリリシンの最適値が約1μg/mlであることが示されている。
【０１９２】
先の2つの図(図11と12)は、1μg/mlのポリリシン濃度と、10μg/mlのエストラジオールカルボキシメチルエーテル濃度で得られた水平域(plateau)で、エストラジオール誘導体のプレートへの結合が効果的であることを示している。
【０１９３】
4)エストラジオール誘導体のシリル化
さらに、本発明者等は、上記の化合物のシリル化のための最良条件の実証の検討を行った。エストラジオールカルボキシメチルエーテルとMTBSTFAを、種々の濃度(1/5、1/2および1/1)と2点の温度(22℃または37℃)で0〜60分間反応させた。シリル化エストラジオールの競合アッセイによってシリル化を測定する。このアッセイでは、シリル化エストラジオールの認識がされなくなる(またシグナルが増大することになる)。
【０１９４】
得られた結果を添付の図13に示す。この図は、高いMTBSFA濃度の条件下では、エストラジオールカルボキシメチルエーテルは、免疫反応性を喪失することを示している。この喪失は、認識の不在に起因するシグナルの増加によって示されている。MTBSFAが分量効果を有することが実証されている。
【０１９５】
これらの結果、すなわち固相への結合とシリル化の効果を合わせると、プレート上で行う以下の結合/脱シリル化試験が可能になる。
【０１９６】
5)結合/脱シリル化試験
エストラジオールカルボキシメチルエーテル(8.3mg/ml)を、同濃度のMTBSTFAの存在下、22℃で1時間反応させ、次いで水に1μg/mlまで希釈し、ポリリシン(1μg/ml)でコーティングしたプレート上で、NHSの存在下、22℃で1時間反応させた。
【０１９７】
HFの非存在下または1mM濃度のHFの存在下で22℃、37℃または64℃で1時間脱シリル化を実施した。
【０１９８】
結果を添付の図14に示す。この図から、HFの存在下でのシリル化エストラジオールカルボキシメチルエーテルの脱シリル化に対応する免疫反応性の増加が観察される。
【０１９９】
これによって、シリル化有機化合物を支持体に結合させた場合の、本発明の方法によるHFの検出が実証されている。
［参考文献］
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】その抗体(Ab)によって認識されるエストラジオール(Es)の部分を示す図であり、抗体によって認識されるエストラジオール分子の部分のSi原子と-OHとの結合が、抗体がこの分子を認識するのを阻止する。
【図２】競合によって検出を行う第1の実施形態による、本発明の方法によってHFを検出するための概略のスキームを示す図である。
【図３】競合イムノアッセイ(左側)と、そうしたアッセイを用いて得られるシグナルの測定(右側)とを示す図であり、この図では、S(%)は抗体(Ab)と結合しているトレーサー(T)によってもたらされるシグナルを表し、[Es](M)は未変性エストラジオールのモル濃度(モル/l)を表す。
【図４】BTSFAを用いて得られたトリメチルシリルエストラジオールの脱シリル化に対する種々の有機酸の効果を示すグラフであり(B/Boは、以下の実施例2のプロトコールによる免疫学的試験での、HFの存在下のシグナル(Bは結合を表す)と、HFの非存在下のシグナル(Boは非結合を表す)との比の形でのシグナルの尺度である)、[H+](M)はこのグラフで特定されている各酸の酸モル濃度を表す。
【図５】エストラジオールを脱シリル化するための条件、すなわち、温度、50mMリン酸塩(P)緩衝液のpHの検討を示すグラフである(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図６】50mMリン酸塩緩衝液(pH5.5)での、シリル化エストラジオールの脱シリル化に対する種々の酸の効果を示す図であり、[H+](M)はこのグラフで特定されている各酸の酸モル濃度を表す。データは塩酸、硝酸または硫酸でも同様である(B/Boシグナルシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図７】他の求核物質およびハロゲンと比較した場合の、本発明の方法によるHFの検出の特異性を示すグラフであり、[P](M)は、ハロゲンまたは他の求核物質のモル濃度を表し、各ハロゲンはこのグラフで特定されている(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図８】種々の塩の存在下での、本発明の方法によるHFの検出の特異性を示すグラフであり、[X+F-](M)はフッ素塩のモル濃度を表し、各塩はこのグラフで特定されている(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図９】本発明の方法によって検出された(d)フッ素[F]の濃度(μモル/lで)と、フッ素で汚染された大気のサンプル中の理論濃度([F]th)との間の相関を示すグラフである。
【図１０】図１０−１４は、非競合の免疫学的アッセイプロトコールにしたがった、特異的抗体による非シリル化エストラジオールの認識に関して得られた実験結果を表すグラフである。 図１０は、エストラジオールの濃度(μg/mlで)を変えて、アミノ基を有するマイクロタイトレーションプレート(アミノ化Nuncプレート)へのエストラジオールカルボキシメチルエーテル(EstCME)の結合について得られたシグナル(S)(mOD)を示す図である。
【図１１】ポリリシン(μg/mlで)を変えて、ポリリシン(poly-Lys)-活性化マイクロタイトレーションプレートへのエストラジオールカルボキシメチルエーテルの結合について得られたシグナル(S)(mOD)(吸光度414nmで測定)を示す図である。
【図１２】ポリリシン(μg/mlで)を変えて、ポリリシン(poly-Lys)-活性化マイクロタイトレーションプレートへのエストラジオールカルボキシメチルエーテルの結合について得られたシグナル(S)(mOD)(吸光度414nmで測定)を示す図である。
【図１３】MTSBTFAによるエストラジオールカルボキシメチルエーテルのシリル化の試験を示す図であり、シリル化効率は、MTSBTFA(1/5;1/2;1/1)の希釈度と温度(℃)を変えて、シグナル(S)(mOD)の増大で測定する。
【図１４】エストラジオールカルボキシメチルエーテルに続く、イムノメトリックフォーマット試験を示す図であり、シグナル(S)(mOD)は、HFが存在するまたはしない場合に応じて測定される。この図で、BoはHFの存在しない場合(対照)のシグナルを表す。
【図１５】テトラペプチドすなわちAcSDKPであるシリル化有機化合物を用いて、本発明の方法で実施して得られた実験結果をグラフの形で示す図であり、シグナル(S(mOD))は414nmで測定する。2つのシリーズのアッセイを実施した。一方のシリーズでは第1のシリル化剤(MTSBTFA)でシリル化されたテトラペプチドを用い、他方のシリーズでは第2のシリル化剤(BSTFA)でシリル化されたテトラペプチドを用いた。シリーズごとに22℃、37℃および70℃で3回のアッセイを行い、各ケースで10、30および60分に測定を行った。
【図１６】脱シリル化温度(T(℃))を変えて、本発明の方法によるフッ素の検出の効率の検討で得られた実験結果を示すグラフであり、シグナル(S(mOD))は414nmで測定。用いたシリル化化合物はMTBSTFAで得られた図15での化合物である。
【図１７】エストラジオールの誘導体であるシリル化有機化合物を用いて、本発明の方法を実施して得られた実験結果を示すグラフであり、シグナル(S(mOD))は、フッ素[F]の濃度(マイクロモル/l(μM))を変えて、414nmで測定する。
【図１８】本発明の方法の検出ステップで用いることができる、非競合の免疫学的検出の機構を図解的に示す図である。
【図１９】ジメチルスルホキシド(DMSO)の存在下で、本発明の方法によるフッ素の検出結果を示すグラフであり、B/Boは、HF(B)の存在下のシグナルと、HF(Bo)の非存在下のシグナルの比の形でのシグナルの尺度である。[F-](M)はフルオリドイオンのモル濃度である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に存在するフルオリド(F-)(fluoride)またはフッ化水素(HF)の濃度を検出および/または測定するための方法、およびその方法を実施するための検出キットに関する。本発明によって、環境汚染物質を効率的にかつ高感度で測定することが可能になる。本発明は、完全に独創的であって容易に実施できる方法に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
フッ化水素は強い無機酸であり、無色で水に非常に溶解し易く、溶解してフッ化水素酸を形成する。HFは産業界で広く使用されているガスであり、特にポリマー、冷却液および消火用製品の製造、アルミニウム精製、核燃料製造およびエレクトロニクス部品の製造のために使用される。さらに、石炭、家庭廃棄物もしくは産業廃棄物およびプラスチックスの燃焼の際に放出される生成物である。
【０００３】
HFは3×10-2l HF/106l空気(30ppm)を超えるオーダーの濃度で有毒である。HFは皮膚/粘膜の曝露によってもたらされるやけど、ならびに上気道および下気道の炎症を引き起こす可能性のある強力な刺激物質である。さらにHFの吸収によって、代謝障害がもたらされる可能性がある。
【０００４】
さらにこの生成物は鉄、青銅およびガラスなどの多くの材料に対して非常に腐食性である。
【０００５】
したがって、危険な濃度のHFが検出された場合に適切な手段をとれるようにするために、特に工業排出物中および実験室ならびにこれらの周囲の環境において、人々や環境や工業的な装置を保護するのに、HFの濃度を監視するための手段を確立することが特に必要である。多くの国でHFの許容大気濃度基準が確立されている。これらの基準は一般に、(5×10-5〜5×10-4l)HF/106l空気(0.05〜0.5ppm)である。
【０００６】
以下の説明では、角括弧[]内の引用番号は本明細書に添付の文献一覧表の番号に対応する。
【０００７】
今日まで、HFまたはフッ化物イオンを測定するための多くの方法が開発され報告されている。一般にこれらの技術は、化学的、電気化学的、分光学的または光学的な検出法に基づくものである。HFの量を検出し測定することができる多くの装置が市販されている。
【０００８】
サンプル中のHFの量を検出し測定するのに使用できるいくつかの電気化学的方法、分光光度法およびクロマトグラフ法が、添付の参考文献一覧表の文献[1]に記載されている。
【０００９】
特定の電極を使用する、ID-110で表示された参照方法がOSHAウェブサイト上に記載されている。参考文献番号[2]である。この方法の感度は1.2×10-2l HF/106l空気(12ppb)であるが、この方法は現地で適用するのが難しい実験室試験用である。現地用の方法に関する限り、これらの感度はより劣り、0.2l HF/106l空気(200ppb)のオーダーである。
【００１０】
他の方法では、炭化ケイ素基板(「金属絶縁膜半導体(Metal Insulator Semiconductor)」:MIS)をベースにした検出器を用いる。この方法は、例えば参考文献番号[3]の文献に記載されている。HF測定用の種々の電子検出計器が様々な製造業者によって提案されている。その例としては、ウェブサイト上に記載されている文献番号[4]のBionics Instrument社のOEM Fluorine Sensor(登録商標)計器またはNORSK ELEKTRO OPTIKK A/S社のLaserGas(登録商標)計器がある。
【００１１】
これらの計器に付与されている検出限界は、ガス媒体の場合、100万分の1もしくは10億分の1の単位(ppmもしくはppb)で表され、水性媒体の場合、ミリリットル当たりのナノグラムもしくはマイクログラム(ng/mlもしくはμg/ml)で表される。一般に検出限界は、10-4l HF/106l空気(0.1ppm)のオーダーであり、溶液の場合、最も良好な装置の場合で(1〜1000ng)HF/mlである。
【００１２】
残念ながら、これらの方法および計器はスペースを要し、移動が困難であり、しばしば実施が難しく、また高価であることが多い。
【００１３】
HFを「検出するための理想的な手段」は以下の特徴を兼ね備えたものでなければならない。
- 感度:少なくとも10-4l HF/106l空気(0.1ppm)の測定である。
- コスト:必要な場合、容易に検出器の数を増やすことができるようにするために、コストは余り高くてはならない。
- 利用可能性:公開されている技術の多くについては市販品がない。その理由は、実施するのが特に難しいためである。
- 移動性:様々な場所で使用できるように、装置を容易に移動できなければならない。
- 迅速に実施できることおよび速やかに結果を使用できること。
【００１４】
従来技術のどの方法も装置もこれらの特性を兼ね備えていないようである。
【００１５】
したがって、「理想的な検出手段」の上記特徴をできる限り多く兼ね備えた新規の技術の真の必要性がある。
【非特許文献１】[1]International Society for Fluoride Research、Fluoride 31(2)、1998、74〜80頁- disponible sur le site Internet http://www.fluoride-journal.com/98-31-2/31274-80.htm
【非特許文献２】[2]Occupational Safety and Health Administration"、http://www.osha dlc.gov/dts/sltc/methods/inorganic/id110/id110.html
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【特許文献１】[44]欧州特許第EP-A-0139552号
【特許文献２】[45]米国特許第5,047,300号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が達成しようとする目的は、具体的には、上記特徴をすべて有していて、さらに従来技術の方法および装置の上記欠点を有していない、HFを検出するための方法およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、測定溶液を得るために、水溶液中でサンプルをシリル化有機化合物と接触させるステップであって、フッ化水素酸またはフルオリド(F-)が存在する場合に前記シリル化有機化合物が脱シリル化され、シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物を互いに独立に検出および/または測定可能であるステップと、
前記サンプル中にフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)が存在している場合に起こる、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を、前記測定溶液中で検出および/または測定するステップと
を含む、サンプル中のフルオリドまたはフッ化水素の濃度を検出および/または測定する方法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下の説明において、「フッ素」または「フッ素およびその誘導体」という用語は、フルオリド(F-)、フッ化水素(HF)およびフッ化水素酸を暗黙のうちに表している。フルオリドはフッ素の塩の意味として理解されるものである。
【００１９】
フッ素は非常に求核的な原子であり、そのため、求核的な置換反応に介在することができる。より具体的には、以下の化学式で示されるような形で、フッ素はケイ素-酸素(Si-O)型の結合を特異的に攻撃することができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
この化学式において、R1、R2およびR3は、Siの置換基であり、後者と一緒になって、本発明の意味での有機化合物R4のシリル化基を形成する。
【００２２】
R1、R2およびR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択することができる。例えば、R1、R2およびR3はメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される。
【００２３】
したがってこの化学式では、-R4は、本発明の実施の際の、シリル化された有機化合物(左側)、または脱シリル化された有機化合物(右側)を表す。シリル化を可能にするために、この化合物は、シリル化のためにアクセス可能な少なくとも1個の水酸官能基を含有している。本発明の方法を実施する場合にその検出を容易にするために、この化合物は有利には有機化合物である。一般に、特に溶解性の問題、したがって感度ならびにフッ素検出および/または測定結果の再現性の問題から、この化合物は250〜200000gモル-1、例えば250〜1500gモル-1の分子量を有する。この化合物は、例えば、エストラジオール、3〜50個のアミノ酸残基を含有するペプチドなどのペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカインおよびアラキドン酸、またはこれらの化合物の誘導体から選択されるヒドロキシル化化合物であってよい。
【００２４】
本発明で使用できるペプチドは例えば文献番号[5]に記載されており、使用できるホモバニリン酸およびその誘導体は例えば文献番号[6]および[7]に、使用できるアンフォテリシンは例えば文献番号[8]〜[10]に、本発明で使用できるステロイドおよびステロイド誘導体は例えば文献番号[11]〜[17]に、本発明で使用できるサイトカインおよびサイトカイン誘導体は例えば文献番号[18]〜[20]に、使用できるアラキドン酸およびその誘導体は例えば文献番号[21]〜[24]に記載されている。
【００２５】
本質的なことは、測定溶液中において、これらの化合物の一方の消失および/または他方の出現の検出および/または測定を可能にするために、シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物を互いに別々に検出および/または測定できることである。したがって、本発明の方法は、シリル化有機化合物または脱シリル化有機化合物、あるいはこれら2つの化合物(ただし互いに独立に)を検出することに基づいている。
【００２６】
本発明によれば、シリル化有機化合物に対するフッ素またはその誘導体の単純な作用によって脱シリル化有機化合物またはこの有機化合物の未変性(native)の形態が、損なわれないまま回復され得るという条件付で、選択した有機化合物にシリル基を結合させる(シリル化)ために、任意の適切な試薬を使用することができる。使用できるシリル基もしくは官能基は化学式で上記されている。
【００２７】
本発明を実施するために、ヒドロキシル化された有機化合物をシリル化するのに使用できるものとして以下の試薬を挙げることができる。すなわち、N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(すなわちBTSFA)、N-メチル-N-(tert-ブチルジメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(すなわちMTBSTFA)、トリメチルシリル(すなわちTMS)、tert-ブチルジメチルシリル(すなわちt-BDMS)、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(すなわちBSA)、ヘキサメチルジシラザン(すなわちHMDS)、N-メチルトリメチルシリルトリフルオロアセトアミド(すなわちMSTFA)、トリメチルクロロシラン(すなわちTMCS)、トリメチルシリルイミダゾール(すなわちTMSI)等である。
【００２８】
本発明の実施のために使用できるシリル化のための他の試薬および操作様式も、添付の参考文献一覧表の例えば文献番号[25]〜[30]に示されている。
【００２９】
一般にこれらの試薬は、使用が簡単であり、容易に入手でき、シリル官能基(ケイ素原子を含有する)を、選択した有機化合物に属している水酸官能基上に転移することを可能にする。
【００３０】
本発明において本発明者等はさらに、シリル基によって、本発明によるフッ素の検出および/または測定の感度および選択性にばらつきがあることを実証した事実を例示するために、具体的には以下の2つの試薬すなわち、
トリメチルシリル(-Si(CH3)3)官能基を、選択された有機化合物の-OH基に結合させるBTSFA、および
ジメチルtert-ブチルシリル(Si(CH3)2C(CH3)3官能基を、選択された有機化合物の-OH基に結合させるMTBSTFA
を挙げることができる。
【００３１】
BTSFAは、それほど疎水性でもないシリルをヒドロキシル化化合物に提供し、それによって、シリル化有機化合物が比較的良好な溶解性を持つことができるようにする利点を示す。しかし、本発明の方法を実施した場合、脱シリル化化合物への転換に関して、得られたシリル化化合物が、HFに対して常に特異性を示すとは限らない。これらのシリル化化合物は、サンプル中に存在する他の酸によって脱シリル化化合物に転換される可能性もある。したがって、この試薬は、フッ素についての特異性が必要とされない場合にフッ素を検出するため、あるいは、他の酸の濃度が、フッ素の検出または測定を妨害しない程度に十分低いサンプル中のフッ素を検出するために使用することが好ましい。
【００３２】
MTBSTFAは、より疎水性のシリル基をヒドロキシル化化合物に提供し、得られたシリル化化合物の水性媒体中での溶解性は、BTSFAによって得られるシリル化化合物の場合より劣る。他方、まったく予想していなかったことだが、実施例で実証するように、MTBSTFAでシリル化化合物の脱シリル化は、試験した他の酸に対してより、HFに対してより特異的である。したがって、この試薬は、フッ素に関して特異性を求められる場合、例えばサンプルが相当な濃度で他の酸を含有する場合に、サンプル中のフッ化水素を検出するために有利に用いることができる。
【００３３】
すなわち、本発明者等は、特にこれらの試薬を使用することによって、フッ素によるSi-O結合への攻撃の特異性も、ケイ素と酸素原子に結合している基に依存することを発見した。したがって、シリル化基を適切に選択すれば、本発明の方法を実施した場合、測定は、サンプル中の他の無機酸または有機酸および塩類によって妨害されない。-Si-(CH3)3を用いて本発明の方法を実施した場合、例えば、HFはHClと殆んど同じ脱シリル化活性を有している。-O-Si-(CH3)2-C(CH3)3を用いて本発明の方法を実施した場合、活性は(HClと比較したHFで)約1000倍の大きさである。
【００３４】
上記化学式に示すように、フッ素またはその誘導体による、シリル化有機化合物の脱シリル化有機化合物への転換率は、サンプル中に存在するHFの量に比例する。したがって、本発明の方法によって、一度にかつ同時にサンプル中に存在するフッ素およびその誘導体を検出し測定することができる。本発明の本質的な特徴とその発明の本質はまさに、シリル化有機化合物と非シリル化(脱シリル化)有機化合物との間の差を測定する検出手段を用い、それによって、フッ素の存在によって触媒作用を受けた脱シリル化を検出/定量化することによって、フルオリドおよび/またはフッ化水素を検出することにある。
【００３５】
接触させるステップは、水溶液中でサンプルとシリル化有機化合物を混合することによって実施することができる。混合は、溶液中でサンプルとフッ素を単に加えることによって、あるいは、例えば機械もしくは磁気攪拌機、または超音波処理等を用いた、溶液中でのサンプルとフッ素の積極的な攪拌によって実施することができる。その目的はもちろん、互いに確実に反応するように、フッ素(もし存在すれば)とシリル化有機化合物との間の相互作用を促進することである。
【００３６】
サンプルは液体、固体またはガス状のサンプルであってよい。サンプルが液体でない場合、サンプルと本発明のシリル化有機化合物を水溶液中で接触させるステップは、もちろん、サンプルを水溶液中に溶解させることを含む。例えば、サンプルがガスである場合バブリングによって、また、サンプルが固体である場合、攪拌しながら混合または可溶化によって溶解させる。この溶解の目的は、ガスもしくは固体サンプルのフッ素が、接触水溶液中にも存在するようにすることである。この溶解に使用される方法は当業者によく知られている。
【００３７】
本発明者等は、前記接触水溶液への水混和性有機溶媒の添加によって、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定の感度を大幅に増大させることができることを実証した。例としては、有機溶媒は、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノールまたはメタノール、あるいは当業者によく知られている同等の有機溶媒から選択することができる。すなわち、本発明者等は、そうした溶媒を使用した場合、100倍さらには500倍のフッ素検出感度の増大が測定された。例えばDMSOを用いた場合、検出の感度は0.001μg/mlまで向上する。
【００３８】
有機溶媒はいくつかの異なった効果をもたらす可能性がある。すなわち、シリル化有機化合物の溶解を容易にすること、脱シリル化を容易にすること、または検出中の妨害を少なくすることである(特にイムノテストの場合に注目される)。どれであれ、これらの効果のうちの1つだけでは、有機溶媒存在下での検出の感度のまさに驚異的で大幅な増大を説明するのには不十分である。有機溶媒は接触水溶液の1〜99容積%、有利には接触水溶液の50〜95容積%の範囲の量(残りは水)で存在することができる。
【００３９】
この溶媒の供給源(origin)は、有利には、シリル化有機化合物を調製した後、すなわち有機化合物がシリル化された後の回収溶媒とすることができる。次いで、フッ素の水性溶液とシリル化有機化合物の有機性溶液とを混合させることによって、接触させるステップを実施することができる。あるいは、有機溶媒を接触溶液に独立に加えることができる。
【００４０】
消失するシリル化有機化合物または出現する脱シリル化有機化合物の検出は、これらの化合物のうちの一方または他方の存在を別々に実証できるようにする、当業者によく知られた任意の手段を用いて実施することができる。例えば、その手段は、ガスクロマトグラフィーで実施する検出および/または測定、あるいは免疫学的試験で実施する検出および/または測定であってよい。
【００４１】
測定を実施するためには、既知量のフッ化水素酸またはフッ素を用いるか、既知量のシリル化有機化合物もしくは非シリル化有機化合物を用いて本発明の方法を適用することによって、一般的な方法で最初に標準シリーズを決定することができる。この標準シリーズによって、次に単純な外挿でサンプル中に存在するフッ素、フッ化水素またはフッ化水素酸の量を決定することが可能になる。
【００４２】
本発明の第1の実施形態では、検出および/または測定は、ガスクロマトグラフィーで実施することができる。その理由は、この技術が、本発明による有機化合物のシリル化された形態または脱シリル化された形態、したがって存在すればフッ素を、別々に検出および/または測定できるからである。用いられるクロマトグラフィーの技術は当業者に既知のものである。添付の参考文献一覧表の文献番号[31]〜[33]に記載されている技術が例として挙げられる。
【００４３】
第1の実施形態で使用できる有機化合物は上記のヒドロキシル化された有機化合物でよい。シリル化の試薬および技術も上記のものでよい。
【００４４】
本発明の第2の実施形態では、非シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定に免疫学的試験を用いる、すなわち非シリル化有機化合物かまたはシリル化有機化合物のどちらかに対する抗体を用いて実施するのが有利である。従来技術では、この種のアプローチは開示されていない。さらに本実施形態によって、従来の技術より高感度でフッ素を検出することが可能になる。
【００４５】
一般的な方法では、抗体は、検出可能な抗体/抗原複合体を形成させるために、非常に高い特異性で抗原と称される構造物を認識しそれに結合することができるタンパク質である。しかし、HFは非常にサイズの小さい分子なので、HFに対する抗体を作るのは不可能である。直接HFに対する抗体を作ることが不可能なので、本発明者等は、上記したフッ素の化学的特性、および、動物に注射した場合に抗体の発生をもたらす特徴を示す特定のシリル化有機化合物を用いることをもとにした独自の方策を取り入れた。
【００４６】
第2の実施形態で使用できる有機化合物は、1個または複数の水酸基を有する有機化合物である。これらの有機化合物は、本発明の意味の範囲内でシリル基が結合するのを可能にし、それを注射された動物中で、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物に対する抗体の特異的な生成を誘発する。これらの有機化合物は一般に250〜200000gモル-1、例えば250〜1500gモル-1の分子量を有している。これらの有機化合物は、例えば、上記のヒドロキシル化された有機化合物であってよく、例えばエストラジオール;ペプチド、例えば3〜50個のアミノ酸残基を含むペプチド、例えば文献番号[5]に記載のテトラペプチドアセチル化Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP);ホモバニリン酸;アンフォテリシン;ステロイド;サイトカイン;アラキドン酸またはこれらの化合物の誘導体から選択される。これらの有機化合物は、例えば文献番号[5]〜[24]に記載のものなどの化合物であってよい。
【００４７】
例示的なものとしては、エストラジオールまたはその誘導体を使用することができる。本発明によれば、これらが、抗体の生成をもたらすことができるという条件で、かつ、本発明の意味においてシリル化され得るという条件で、動物例えばマウスに注射した場合、「エストラジオール」は例えばエストラチエン-1,3,5-ジオール-3,17μまたは17μ-ジオールあるいはその誘導体、あるいは他の同等の化合物を意味するものと理解される。
【００４８】
本発明者等によって得られ、かつ本発明で使用することができるシリル化エストラジオールの例を以下に示す。エストラジオールは-OH官能基を有しており、以下に示すように、Si-O結合によって、この官能基にシリル基を結合させることができる(例えば、添付の図1に示す未変性エストラジオール(Es)と比較されたい)。
【００４９】
本発明の第2の実施形態を実施するのに選択した有機化合物をシリル化するために使用できる試薬は、上記したもの、例えばBTSFAまたはMTBSTFAであってよい。
【００５０】
本発明のこの実施形態で使用される抗体は、シリル化有機化合物と非シリル化有機化合物を別々に認識するという特徴を示す。これらの抗体はモノクローナルでよい。これらは、この種の抗体を調製するために慣用される技術、例えば、これらの化合物のうちの1つだけに特異的であるマウス抗体を得るために、シリル化有機化合物あるいは非シリル化有機化合物を、マウスに注射することによって調製することができる。本発明の方法を実施する目的で、2つの化合物(シリル化されたまたはシリル化されていない)のうちの1つだけに対して特異的である抗体を選択するために、異なるバッチの調製抗体で試験を実施することができる。抗体の調製のためのこれらの技術は、当業者によく知られているものである。
【００５１】
【化２】
【００５２】
例としては、本発明を実施するのに使用できる抗体を調製するために適した方法の概要が参考文献番号[34]〜[38]の文献に記載されている。
【００５３】
例としては、有機化合物が上記一覧表から選択されるシリル化可能な化合物である場合に、本発明を実施するのに使用できる抗体が、さらに文献番号[5]〜[24]および[39]〜[42]にも記載されている。
【００５４】
添付の図1に示した例では、エストラジオールに対しておりかつイムノアッセイで使用される抗体は、エストラジオールがシリル基で修飾された場合(以下「修飾エストラジオール」とも称する)、抗体が、エストラジオールをもはや認識しない、または、わずかにしか認識しない(すなわち、この認識の差が検出されるのには十分であるという形で)ように選択される。修飾エストラジオールへのフッ素の効果は、Si-O結合を攻撃する(脱シリル化反応)ということであり、それによって未変性エストラジオールは再び出現でき、次いで、以下「第1の抗体」と称するその特異的抗体が未変性エストラジオールを認識できるようになる。
【００５５】
本発明では、当業者に周知の抗原/抗体認識を検出するための任意の手段を、その抗体による脱シリル化有機化合物(「未変性有機化合物」)の認識か、その抗体によるシリル化有機化合物の認識かのどちらかを検出するために使用することができる。本明細書で、「第1の抗体と非シリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段」または「第1の抗体とシリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段」という用語を使用するのはそのためである。抗体を使用したこのような検出のための操作条件は当業者によく知られている。用いられるプロトコール、試薬、緩衝剤および操作条件は、例えば参考文献番号[5]〜[24]および[39]〜[42]の文献に記載されている。
【００５６】
この実施形態による検出は、例えば、免疫学的検出方法および/または免疫学的測定方法で通常用いられるものなどの、「競合」型のイムノアッセイまたは「非競合」型のイムノアッセイを実施することによって行う。
【００５７】
本発明のこの第2の実施形態の第1変更形態によれば、検出手段は例えば標識分子であってよい。これは、「トレーサー」と称され、前記第1の抗体に関して、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物、例えばシリル化エストラジオールまたは非シリル化エストラジオールと競合することになる。この標識分子としては、酵素例えばアセチルコリンエステラーゼ、蛍光標識、発光標識または放射性同位体を検出のために使用することができる。
【００５８】
したがって、シリル化有機化合物または非シリル化有機化合物のイムノアッセイ(すなわち免疫学的測定)は「競合」であると称される。このアッセイは、標準シリーズまたはサンプル中に存在するシリル化有機化合物または非シリル化有機化合物、例えばシリル化エストラジオールされたまたは非シリル化エストラジオールに対する抗体と、本発明による有機化合物例えばエストラジオールに化学的に類似していて、シグナル(標識)例えば酵素性、蛍光性、発光性もしくは放射性シグナルを運ぶトレーサーとを使用する。上記のエストラジオールの例では、トレーサーは例えば、エストラジオールを酵素例えばアセチルコリンエステラーゼに結合させることによって得ることができる。
【００５９】
本発明の方法を実施するために使用できる「競合」の検出を図解して図2および3に示す。この図では用いた有機化合物はエストラジオールである。標識化された分子もしくはトレーサーは「T」で表示され、シリル化されていない(修飾されていない)エストラジオールは「Es」で表示され、シリル化された(修飾された)エストラジオールは「Es-M」で表示されている。第1の抗体は例えばマウス抗体(sAb)である。図2は、修飾エストラジオール(Es-M)は、抗体(sAb)によって認識されないが(認識されないことは、×印で示されている)、HFが存在する場合、このストラジオールは、未変性エストラジオール(Es)に変換された後、第1の抗体(sAb)によって認識されることを示している。次いでこれはトレーサー(T)(標識エストラジオール)との競合に入る。したがって、HFの存在を検出することができる。この方法では、抗体と結合しているトレーサーの量は、サンプル中に存在するエストラジオールの量と反比例する。
【００６０】
この競合による検出方法では、第1の抗体(sAb)と非シリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段(または第1の抗体とシリル化有機化合物との間の相互作用を検出するための手段)には、第2の抗体(gAb)を含むことができる。例えばこの第2の抗体は、上記マウス抗体(sAb)(第1の抗体)に対するヤギ抗体(gAb)またはウサギ抗体であってよい。第2の抗体を用いたこの検出の図解を添付の図2に加えた。この第2の抗体(gAb)はレセプタクル(R)、例えばマイクロタイトレーションプレートの底部に結合させることができる。
【００６１】
したがってこの例では、このアッセイは、限られた数の抗体分子に関して、トレーサーと測定されるエストラジオールとの間で競合させることにある。反応の最後で、抗体と結合していないトレーサーを除去した後、抗体-結合トレーサーによって運ばれるシグナルを測定することができる。
【００６２】
トレーサーが酵素例えばアセチルコリンエステラーゼを含む場合(図2の白い四角で図示されている)、検出手段にさらに酵素インジケータを含めることができる。アセチルコリンエステラーゼを用いる上記例では、酵素インジケータはアセチルチオコリンとジチオニトロフルオロベンゼンとの混合物からなる。このインジケータは、肉眼で見られるかまたは分光光度計で414nmで定量できる黄色の生成物に変換される。このインジケータは、実際に、本発明を実施するためのEllman比色分析検出および測定法を適用するために使用される。この方法は例えば文参考文献番号[43]の文献に記載されている。
【００６３】
本発明のこの第2の実施形態の第2の変更形態によれば、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定は、「非競合」型のイムノアッセイを用いて実施される。競合アッセイと較べて、非競合アプローチの難しさは選択される有機化合物に関係している。その化合物は、2つの化学的特性、すなわち固相に結合する可能性とシリル化される可能性とを有していなければならない。さらに、固相に結合した場合、液相の場合と同等に有利な条件下で、有機化合物の脱シリル化が可能でなければならない。この変更形態は、上記のヒドロキシル化された有機化合物に適用することができる。例えば、これを、上記のものなどのエストラジオール誘導体例えばエストラジオール3-カルボキシメチルエーテル、またはペプチド例えば上記のAcSDKPに適用することができる。
【００６４】
この変更形態では、シリル化化合物を、固相例えば支持体、例えば実験室で通常使用されているものなどのマイクロタイトレーションプレートに結合させる。サンプルを、シリル化化合物と接触させ、次いでプレート上に固定化させて、検出および/または測定をその場で実施することができる。
【００６５】
上記に定義したシリル化有機化合物のうちの1つを支持体に結合させ、同時に、シリル化化合物のフルオリドイオンとの反応性を保持するための当業者に知られた適当な技術によって、シリル化化合物を支持体に固定化させるかまたは結合させることができる。すべては、支持体と、本発明を実施するための選択したシリル化有機化合物の化学的性質によって決まる。この結合は、例えば共有結合によって行うことができる。支持体は、官能化された支持体、すなわちシリル化有機化合物の結合を容易にする化学基がそれにグラフトされた支持体であってよい。例えば、選択されたシリル化有機化合物が、上記のものなどのエストラジオール誘導体例えばエストラジオール-3-カルボキシメチルエーテル、またはペプチド例えばAcSDKPである場合、支持体は例えば、アミノ基例えばNunc-NH2プレートを含むプレート、またはポリリシンで活性化されたプレートであってよい。
【００６６】
サンプル中にフルオリドイオンが存在する場合、支持体と結合しているシリル化化合物は、フルオリドイオンとの反応に続いて非シリル化化合物に変換される。次いで、例えば非シリル化化合物を特異的に認識する第1の抗体の存在下で、イムノアッセイ技術によって検出および/または測定を実施することができる。
【００６７】
第1の抗体による非シリル化化合物の認識は、当業者に知られている任意の手段、例えば第1の抗体の標識化によっても、また標識を運ぶ第1の抗体を認識する第2の抗体(第2の抗体は次いでトレーサーとなる)によっても実証することができる。標識は、当業者が通常用いる、例えば酵素性シグナルのうちの1つであってよい。例えば、第2の抗体は、第1の抗体(マウス抗体(sAb)であってよい)に対するヤギ抗体またはウサギ抗体(gAb)であってよい。
【００６８】
「非競合」検出の1つの方法を図18に図解して示す。この図で用いられている有機化合物はエストラジオールカルボキシメチルエーテル(EstCME)である。抗体のうちの第2の抗体は、「sAb」(トレーサー)と表示されている抗エストラジオール抗体(例えばマウス抗体)である。シリル化されていない(修飾されていない)エストラジオールは「Es」で表示され、シリル化された(修飾された)エストラジオールは「Es-M」で表示されている。マウス抗体(sAb)に対する第2のヤギ抗体またはウサギ抗体(gAb)は、例えばマイクロタイトレーションプレート(R)の表面に付加される。トレーサー「T」を形成するために、gAb抗体は標識例えば酵素に結合される。この図は、抗体(sAb)が修飾エストラジオール(Es-M)を認識できないこと(認識できないことは×印で示されている)を示している。しかし、HFが存在する場合、Es-Mは、次に第1の抗体(sAb)によって認識され得る未変性エストラジオール(Es)に転換される。したがって、HFの存在を検出することができる。この場合、抗体(sAb)に結合しているトレーサーの量(gAb+標識)は、サンプル中に存在する脱シリル化エストラジオールの量に比例する。
【００６９】
本発明者等は、本発明のどの実施形態を用いたとしても、本発明を実施するのに有利な操作条件を決定した。もちろん必要なら、これらの条件は、用いる他のシリル基、他のシリル化有機化合物または他の検出手段のために、本発明の意味の範囲内で適合させるかまたは改変することができる。これらの条件は、本発明の第2の実施形態のために特に有利である。
【００７０】
したがって、本発明の方法において、接触させるステップは54〜64℃の温度で実施するのが有利である。これは、温度が高すぎると、シリル化有機化合物の自発的な脱シリル化を伴う現象が発生するからである。当業者は、選択した有機化合物および検出方法に応じて、本発明を実施する温度を容易に適合させることができよう。
【００７１】
本発明の方法での接触を、例えば50mMのリン酸塩緩衝液中で、または任意の適切な緩衝剤を用いてpH4.5〜6.5、好ましくはpH5.5で実施することも有利である。
【００７２】
その理由は、pH値が余り酸性サイドになり過ぎると、シリル化有機化合物の自発的な脱シリル化を伴う現象が発生する可能性があるからである。この場合も、当業者は、本発明を実施するpHを、選択した有機化合物および検出方法に応じて容易に適合させることができよう。
【００７３】
本発明によれば、シリル化有機化合物、例えばエストラジオールまたは同等の分子量の他の化合物などの測定溶液中の濃度を、有機化合物の分子量および用いる検出および/または測定手段に応じて適合させることができる。本発明の方法を実施する場合、一般に濃度は1〜2000ng/ml、例えば2〜500ng/mlであってよい。
【００７４】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットにも関し、前記キットは以下の試薬を含む。すなわち、フッ素またはフッ化水素酸が存在下で、脱シリル化されるシリル化有機化合物;水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出するための手段を含む。
【００７５】
フッ素またはフッ化水素酸の存在下で脱シリル化されるシリル化有機化合物は本明細書で定義の通りである。
【００７６】
水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出および/または測定するための手段は、もちろん本発明の方法を実施するための検出および/または測定方法に応じて変わる。使用できる方法は上記の定義の通りである。したがって、検出手段および/または測定手段は以下の成分のうちの1つもしくは複数を含むことができる。すなわち、着色インジケータ、上記したものなどのマーカー、酵素、上記したものなどの測定手段、シリル化有機化合物および/または非シリル化有機化合物等を検出および/または測定するのに必要な抗体等を含む。
【００７７】
例えば、キットは、競合のイムノアッセイを実施するために必要な試薬および抗体、または非競合のイムノアッセイを実施するために必要な試薬および抗体を含むことができる。キットは、非シリル化有機化合物または脱シリル化有機化合物に対する、あるいはシリル化有機化合物に対する1種または複数の抗体、例えばマウス抗体を含むことができる。キットはさらに、上記の抗体に対する1種または複数の抗体、例えばヤギ抗体もしくはウサギ抗体を含むことができる。キットは、実施された免疫学的反応を実証できるようにするトレーサーも含むことができる。
【００７８】
本発明によれば、キットは、1個または複数のウェルがその中に形成されている、試薬を受け入れるための支持体、例えばポリスチレンストリップをさらに含むことができる。このウェルは、本発明の方法の接触のステップ、ならびに/または検出および/または測定のためのレセプタクルとして用いられる。したがって、測定および/または検出を、マイクロタイトレーションプレートのウェル中で容易に実施することができる。そうした支持体、例えば上記のストリップ上に、マウス抗エストラジオール抗体に対する抗体例えばヤギ抗体またはウサギ抗体で、そのウェルをコーティングすることができる。シリル化エストラジオールをウェルの底部に結合させることもできる。
【００７９】
本発明の結果、本発明者等は、溶液中で0.001μg/mlのオーダーの濃度でHFを検出するための実際的で迅速な試験法を開発することに成功した。
【００８０】
有利なことに、本発明の感度は任意の工業的用途、特に、最も有用である大気中のフッ化水素酸の測定を想定することができる。この場合、1×10-2l HF/106l空気(10ppb)を容易に検出できる。したがって、本方法の性能は、HFを検出するのに数百ppbのオーダーの濃度に限られている従来技術の現地用アッセイの性能より優れている。
【００８１】
サンプルおよび用いる検出手段の性質によるが、一般に本発明によって、約1/2〜4時間で結果を得ることが可能になる。ある種の従来技術の方法のより長い時間を要する場合もあるが、本発明の方法は一般により高感度である。
【００８２】
本発明の方法は、フッ化水素酸またはフルオリドイオンを含有する任意のサンプルに有利に適用される。すなわち、大気サンプル、食品、植物、生物学的媒体に適用される。それぞれの場合、サンプリングおよびサンプル調製のための条件は、フッ化水素酸またはフルオリドイオンをアッセイするための任意の他の方法と同様である。
【００８３】
本発明の他の利点は実施するのが簡単なことである。例えば、その技術はイムノアッセイでの技術と同一であってよい。すなわち、簡易型の試薬の使用、分配のハンドリングが容易であること、コンパクトであること、輸送および再配置が容易であること、エネルギー供給なしで作業できる可能性があること、および肉眼またはポケット型簡易分光光度計を用いた比色計で読み取れることである。
【００８４】
添付の図面を参照して、非限定的な形で、例示で示されている以下の説明を読むことによって、本発明の他の用途および利点も明らかになるであろう。
【実施例】
【００８５】
本発明の方法の様々な態様を以下で検討した。すなわち、エストラジオールについての免疫学的アッセイの構築、シリル化によってエストラジオールを修飾するための条件の試験、質量分析によるシリル化有機化合物の立証、シリル化化合物のHFとの反応の試験、シリル化された誘導体の化学的性質の最適化、試薬の濃度および測定の感度の最適化、酸についての測定の特異性の最適化、ならびに測定の適用性(applicability)の試験である。これらの検討の主な結果を以下に示す。
【００８６】
試験は、大気中のフッ化水素酸のサンプル(実験室でのシミュレーション)と、フルオリドイオンを含有する水のサンプルとについて実施した。
【００８７】
本発明の方法の能力を判断するために、本発明者等はその感度パラメータを定義した。その感度は、HFの非存在下で得られるシグナルとは統計的に異なるシグナルを発生させるために必要なHFの量を表す。本発明の方法によれば、測定するサンプル中に存在する未変性(シリル化されていない)エストラジオールの量は、検出できないシリル化エストラジオールを、検出できる非シリル化エストラジオールに転換させるためのフッ素の量に応じて変わる。したがって、HFを測定するために、感度を、ジメチルtert-ブチルエストラジオールの存在下に置いた場合に、抗体と酵素トレーサーとの間の結合の著しい低下を誘発することができるフッ素の必要量として定義した。
【００８８】
(実施例1)
競合イムノアッセイによるフッ素の検出および測定への本発明の方法の適用
この実施例では、選択した有機化合物はβ17-エストラジオールの誘導体である化合物である。
【００８９】
1)抗エストラジオール抗体の調製
アッセイで使用した抗体は、具体的には、β17-エストラジオールから誘導され、マウス中で抗体を得る目的でウシアルブミンに結合させた化合物から作製した。
【００９０】
用いた技術は文献番号[39]に記載されているものである。
【００９１】
2)抗エストラジオール抗体からの抗体マウス抗体の調製
Immunotech company(Lumigny)から販売されているヤギ抗マウス抗体抗体を、96-ウェルのポリスチレンマイクロタイトレーションプレート(Nunc)をコーティングするために使用する(用いた希釈度は:5μg/ml)。コーティングした後、プレートを、0.5%アルブミンを含む緩衝液中に4℃で保存する。
【００９２】
プレートへの結合は簡単な吸収で行う。タンパク質が結合されるように、インキュベーションは十分に長くしなければならない。この調製は当業者の一般的な知見に属するものである。
【００９３】
3)酵素トレーサーの調製
酵素トレーサーは、エストラジオールをアセチルコリンエステラーゼ(AChE)に結合させて得た。N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテートを用いてチオール基をエストラジオールに導入する。修飾エストラジオールをAChEに結合させる。このAChEに、エストラジオールチオール基と反応するマレイミド基が導入されている。トレーサーはゲル濾過で精製し、次いで一定分量を-20℃で保存した。
【００９４】
この調製で使用し、かつ本発明で一般に使用できる技術および酵素トレーサーは、参考文献番号[44]および[45]の文献に記載されている。
【００９５】
4)製品と他の試薬
エストラジオールはSigma Aldrichから入手した。シリル化剤はPerbio companyから入手した。
【００９６】
フッ化水素酸はMerck-Eurolab companyから入手した。
【００９７】
すべての試薬、すなわちトレーサー、抗体、エストラジオールおよびサンプルは、アジド(0.01重量/容積%)(重量/容積%=重量gと容積100mlの比)(すなわち、この場合、0.01g/100ml)、ウシアルブミン(0.5重量/容積%)およびNaCl(0.9重量/容積%)を含有する0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7)中に希釈させて用いた。
【００９８】
5)用いたシリル化エストラジオール濃度の最適化
脱シリル化エストラジオール、したがって、フッ素を続いて検出できるようにするために、HFを含有するサンプルと接触させるシリル化エストラジオールの濃度を最適化した。
【００９９】
したがって、用いたシリル化エストラジオールの濃度が非常に低い場合、シリル化エストラジオールがすべてエストラジオールに変換されても、この低濃度によって、高精度での検出の実施が可能になるわけではない。
【０１００】
本発明の方法での脱シリル化のために使用される修飾エストラジオールの最適濃度を決定するために、複数の試験を実施した。この濃度はもちろん使用する試薬と操作条件によって変わる。
【０１０１】
ここで示す実施例では、濃度は好ましくは200ng/mlである。
【０１０２】
エストラジオールおよびその誘導体の場合、この濃度は一般に、1〜2000ng/ml、好ましくは2〜500ng/mlであると推定することができる。これらの範囲は、特に実施例の条件のための単なる目安としてだけ示したものである。
【０１０３】
6)エストラジオールのシリル化
1容積部のエストラジオール(2mg/ml)を4容積部のMTBSTFAと混合し、全体を室温で30分間〜1時間インキュベートする。
【０１０４】
用いたシリル化剤はBTSFAまたはMTBSTFAである。得られた生成物を上記に示す。
【０１０５】
液体クロマトグラフィーと質量分析による立証によって、エストラジオールはシリル化されていたことが分かった。
【０１０６】
シリル化した後、エストラジオールを、使用前に、100%ジメチルホルムアミド(DMF)、あるいは100%ジメチルスルホキシド(DMSO)で1000倍に希釈する。
【０１０７】
7)エストラジオールの脱シリル化
2.5μlの1Mリン酸塩緩衝液(pH=5.5)と、47.5μlのサンプルもしくは既知の濃度のHF溶液(標準シリーズ)を、50μlのシリル化エストラジオールに加える。
【０１０８】
混合物を振とうし、次いで水浴に55〜66℃で1時間置いて乾燥させる。
【０１０９】
脱シリル化反応は、アッセイ緩衝液中で混合物を希釈する(40倍希釈)ことによって停止させることができる。この緩衝液は、アジド(0.01重量/容積%)(重量/容積%=重量gと容積100mlの比)(すなわちこの場合、0.01g/100ml)、ウシアルブミン(0.5重量/容積%)およびNaCl(0.9重量/容積%)を含む0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7)である。
【０１１０】
8)酵素インジケータ:アセチルコリンエステラーゼ(Ellman反応)の酵素活性の測定
この方法は偽基質、すなわちアセチルチオコリン(AcTCh)を使用する。これは、アセチルコリンと同一速度で加水分解される。この加水分解は、ジチオニトロベンゼン(DTNB)を還元することができるチオコリン(TCh)の生成をもたらす。還元されたDTNBは、可視域(εm412nm=13600モル-1cm-1l)に強い吸収を有していて黄色に発色する。
【０１１１】
過剰な基質によるその阻害を考慮に入れて、AChEの活性が最大である濃度でAcTChを使用する。さらに、基質のすべてが変換され、比色測定されるのを回避するために、用いるDTNBの量はAcTChの量より少なくする。これに対して、AcTChの1分子の加水分解によって1分子だけの還元DTNBの生成が確実にもたらされるように、使用するDTNBは生成されるTChの量に対して過剰にする。
【０１１２】
Ellman反応の実施の仕方は当業者に知られており、ここで提供する情報を基に、当業者は本発明を実施するための最適の操作条件を容易に見出すことができる。
【０１１３】
9)未変性エストラジオールのイムノアッセイ:HFの定量化
先に得られたエストラジオール抽出物を1/40に希釈し、トレーサーと抗エストラジオール抗体を存在させてアッセイプレートに分配する。反応容積は200μlである。
【０１１４】
免疫学的反応を環境温度で1時間実施する。
【０１１５】
未結合トレーサーを除去するためにアッセイプレートを洗浄して、0.2ml容積部のインジケータ溶液を加える。
【０１１６】
約1時間後、黄色に発色する。分光光度計を用いて光学密度測定を実施する。
【０１１７】
10)結果の解釈
実施したアッセイにおいて、標準HFシリーズを用いて、サンプル中に含有されているフッ素の濃度を測定することが可能であった。したがって、本発明の方法の実現可能性が実証された。
【０１１８】
(実施例2)
MTBSTFA修飾エストラジオールとBTSFA修飾エストラジオールの場合のHF検出の特異性の差の検討
以下に述べるすべての操作において、脱シリル化の際のシリル化エストラジオールは、所与の実験ですべてのサンプルについて同一濃度で使用した。その濃度は200ng/mlであった。
【０１１９】
他の試薬の場合濃度は以下の通りである。
- マウス抗エストラジオール抗体:5μg/ml、
- アセチルチオコリン:7×10-4M、
- 5-5'-ジチオビスニトロベンゾエ-ト:7×10-4Mおよび
- アセチルチオコリンに結合されたエストラジオール:約1ng/ml
である。
【０１２０】
試験は、実施例1で説明した方法で、ポリスチレンストリップ上の300μlウェルで実施した。
【０１２１】
A)BTSFA(これはトリメチルシリル基を提供する)でシリル化されたエストラジオールをHFで開裂させ(脱シリル化反応)、それによってその未変性形態を回復する。このような開裂は他の酸、すなわち塩酸(HCl)、硝酸(HNO3)、硫酸(H2SO4)およびリン酸(H2PO4)を用いた場合にも認められる。結果を添付の図4に示す。
【０１２２】
したがって、このシリル基を用いた場合、脱シリル化反応は必ずしもフッ素に対して特異的ではない。したがって、このシリル化エストラジオールはむしろ、後者がそれのみである場合のHFの検出、あるいは他の酸が存在しない場合のHFの検出に適している。
【０１２３】
B)水性媒体中ではより低い溶解性を示すが、MTBSTFA(BTSFAによって提供されたものより疎水性であるシリル基を提供する)でシリル化されたエストラジオールは、HFによって特異的に開裂され(脱シリル化反応)、それによって未変性形態を回復する。したがって、同一条件下で作成した添付の図6に示すように、試験した他の酸は、この形で修飾されているエストラジオールを開裂させない (以下の実施例3を参照されたい)。
【０１２４】
したがって本発明者等は、エストラジオールをシリル化するために、以下の実施例ではMTBSTFAを選択した。
【０１２５】
(実施例3)
本発明の方法におけるフッ素脱シリル化反応に適した緩衝剤の探求
いくつかの酸物質も、MTBSTFAを用いて修飾エストラジオールの脱シリル化に対して効果があるので(実施例2参照)、本発明者等は、フッ素の脱シリル化反応に対する特異的な効果を高め、存在する可能性のある他の化合物の酸の性質に起因する非特異的効果を阻害する緩衝溶液を探求することにした。
【０１２６】
高濃度で存在する場合(高酸濃度物を緩衝するために必要)、水酸化ナトリウム(NaOH)や水酸化カリウム(KOH)などの塩基も酸不在下でのエストラジオールの脱シリル化を誘発する(データは示されていない)。したがって、これらは使用できない。
【０１２７】
リン酸塩イオンで50mMのリン酸塩緩衝(KH2PO4/K2HPO4)溶液も試験した。これらは良好な結果をもたらした。酸性であることが、シリル化エストラジオールが自発的に脱シリル化される結果をもたらさないことを確実にするために、これらの溶液のpHを検討した。
【０１２８】
したがって、例えばサンプルが、有機化合物の自発的な脱シリル化を誘発できる他の酸または塩基を含有し、それによって本発明の方法検出および/または測定感度が低下する場合、本発明の方法は緩衝媒体中で有利に実施することができる。
【０１２９】
さらに、本発明者等は、ある種の条件下では、脱シリル化温度が高すぎると、修飾エストラジオールが自発的に脱シリル化される(データは示していない)結果となることがあることを確認した。このため、種々の緩衝剤のそれぞれについて種々の温度を検討した。
【０１３０】
得られた結果を添付の図5に示す。この図では、「E2M」はジメチルシリルtert-ブチルエストラジオールを表し、「A.T.」は環境温度を表す。
【０１３１】
pH5.5または6のリン酸塩緩衝溶液の場合、シリル化エストラジオールの自発的な脱シリル化は94℃で起こるが、54℃ではそうした脱シリル化は起こらない。
【０１３２】
結論として、シリル化エストラジオールを脱シリル化するための好ましい条件を以下の通り示した。すなわち、pH5.5の50mMリン酸塩緩衝液中で、54〜64℃の温度である。これらの条件は、エストラジオールおよび上記のシリル基について、上記操作条件下で決定されたことを理解されよう。
【０１３３】
本明細書で提供した情報をもとに、当業者は、選択したシリル化有機化合物、サンプルおよび本発明の方法の実施条件に応じて、容易に他の条件を決定することができよう。
【０１３４】
(実施例4)
本発明の方法の実施に対する種々の酸の効果
脱シリル化に対する様々な他の酸の効果を上記実施例3の条件下で試験した。
【０１３５】
これらの試験結果を図6に示す。この図で、「F.ac」はギ酸を表し、「ac.ac」は酢酸を表し、「P.ac」はリン酸を表し、「OP.ac」はオリトリン酸を表し、「T.ac」はトリフルオロ酢酸を表す。
【０１３６】
これらの結果は、HF以外の酸が、MTBSTFAでシリル化されたエストラジオールに対してほとんど効果がないことを明らかに示している。
【０１３７】
したがって選択したシリル基はフッ素の検出の特異性に役割を果たしている。試験サンプル中にフッ素以外の化学成分が存在する場合、特にこれらの成分が用いられている有機化合物の脱シリル化を誘発できる場合、この事実を考慮すべきである。
【０１３８】
(実施例5)
他のハロゲンおよび求核物質と比較した場合のフッ素の特異性
フッ素はハロゲンであり、求核的な特徴も有している。エストラジオールの脱シリル化反応におけるフッ素の特異性を試験するために、Bu4NBr、Bu4NCl、Bu4NIおよびKIなどの他のハロゲン、ならびに4-ニトロフェノールおよび4-ニトロイミダゾールなどの求核物質の効果を、上記実施例の操作条件下で、MTBSTFAでシリル化されたエストラジオールを用いて検討した。
【０１３９】
添付の図7はこの実施例で得られた実験結果を示し、他の生成物と比較した場合のフッ素の特異的を実証している。
【０１４０】
試験した他の生成物と比較して、フッ素がエストラジオール脱シリル化反応において非常に特異的であることは明らかである。
【０１４１】
(実施例6)
HFおよびフッ素イオンによる開裂
この実施例では、先の実施例で用いた実験条件下で、様々なフッ素塩をMTBSTFAシリル化エストラジオールと接触させた。
【０１４２】
添付の図8は得られた結果を示している。この図では、試験した異なるフッ素塩を特定するためには、通常の化学記号を用いた。
【０１４３】
フッ素イオンはシリル化エストラジオールの開裂に関して、HFと同様の挙動をする。これはフッ素の反応の特異性を確認させるものである。
【０１４４】
(実施例7)
本発明の方法の分析能力と有機溶媒の添加の効果
図7および8に示すように、上記実施例で述べた条件下では、水性媒体で希釈されたHFの場合で、HF測定の感度は約5×10-5M(すなわち1μg/ml)である。
【０１４５】
本発明者等は、補足的な検討の過程で、水混和性有機溶媒を水性脱シリル化溶液に加えることによって、本発明の方法の感度をさらに増大させることができることを確認した。
【０１４６】
実験はジメチルホルムアミド(DMF)(エストラジオールのシリル化を参照されたい)とジメチルスルホキシド(DMSO)を用いて実施した。
【０１４７】
本発明の方法による脱シリル化を行う溶媒としてジメチルスルホキシド(DMSO)を用いることによって、感度を500倍(約10-7M、すなわち0.001μg/ml)向上させることができる。
【０１４８】
図19は、接触水溶液の総容積ベースで95容積%の濃度のジメチルスルホキシドの存在下で実施した反応の場合での、フルオリドイオンについての分量応答曲線(dose-response curve)を示す。これらの結果は上記の実施例からの結果と比較されたい。
【０１４９】
したがって、前記接触水溶液への有機溶媒の添加によって、本発明の方法によるフッ素の検出および/または測定の感度が実質的に増大する。
【０１５０】
(実施例8)
本発明の化合物がエストラジオール誘導体である場合の本発明の方法の使用
この実施例では、本発明の方法を実施するために用いた有機化合物は、エストラジオール(E2OCH3)のO-メチル誘導体すなわち、次の式の17-βエストラジオール-3-メチルエーテルである。
【０１５１】
【化３】
【０１５２】
操作条件は上記実施例1および2で説明した条件である。
【０１５３】
得られた実験結果を添付の図17に示す。フッ素の存在下で確かにE2OCH3が脱シリル化されていることが分かる。
【０１５４】
したがって、本発明の方法でのエストラジオール誘導体の使用に対する説得力のある理由が認められる。
【０１５５】
(実施例9)
有機化合物が水酸官能基を有するペプチドである場合の本発明の方法の使用
この実施例では、有機化合物はペプチドである。ペプチドはテトラペプチド、すなわち以下の式のアセチル化Ser-Asp-LysPro(AcSDKP)である。
【０１５６】
【化４】
【０１５７】
AcSDKPは水酸基を有するペプチドであり、一度にかつ同時にシリル化し、そのカルボキシルまたはアミノ基によって固相に結合させるのが有利である。
【０１５８】
最初に、このペプチドのシリル化反応を検討し、続いて本発明の方法でのこのシリル化化合物の使用の検討を行った。
【０１５９】
未希釈のBSTFAまたはMTBSTFAを用いて、AcSDKP(1mg/ml)を22℃、37℃または60℃で、10、30または60分間シリル化した。反応後、文献[5]に記載の技術により、かつウサギポリクローナル抗体を用いて、シリル化されたAcSDKPをAcSDKP特異的競合アッセイで検出した。この場合、シグナルの増加は、免疫反応性がなくなり、したがってシリル化が効率的であったことを示している。
【０１６０】
得られた実験結果を報告する添付の図15が示すように、MTSBTFAは、AcSDKPの60℃での反応性を低下させる。これは化合物がシリル化されていることを示唆している。
【０１６１】
次いで本発明によって、HFの存在下で、このシリル化されたペプチドに対する脱シリル化試験を実施した。添付の図16は得られた結果を示す。HFはペプチドを脱シリル化することが分かる。したがって、シリル化された基を失ったことによって免疫反応性が増大し、それによってシグナルがより弱くなる結果となる。図に示すように、HFの存在下でシグナルは低下する。
【０１６２】
したがって、ヒドロキシル化されたペプチドを有機化合物として使用する場合、本発明の方法を実施することができる。
【０１６３】
(実施例10)
溶液中でのフッ素の検出および測定
本発明の方法の妥当性を立証するために、本発明等は、そのフッ素濃度が既知である種々の鉱水を試験した。
【０１６４】
用いたプロトコールは実施例1のプロトコールであり、選択した有機化合物はMTBSTFAでシリル化されたエストラジオール(ジメチルtert-ブチルエストラジオール)である。
【０１６５】
表Iはこの実施例で得られた結果を示す。いずれの場合も、この表はフッ素の存在が検出されたことを示している。
【０１６６】
濃縮した大部分の水サンプルの場合、理論濃度と判明した濃度との間の相関がありそうである。変動がほとんど観察されない原因は、サンプル中に存在するフッ素の性質によるということができる。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
(実施例11)
ガス媒体中のフッ素の検出および測定
測定されるHFはしばしばガスの形態であり、測定するために水溶液中にガスを通す必要がある。HFで汚染された空気がなかったので、本発明者等は、既知の濃度のHF溶液を密封容器中で蒸発させて、そうしたサンプルを人為的に作製した。HFを蒸発させた後、空気を収集用緩衝液(DMF)中にポンプで送り、そこでバブリングさせた。
【０１６９】
HF濃度が1.2×10-2l HF/106l空気(12ppb)である100リットルの空気を濾過できる装置を用いて、溶液中で、10-5MのHF濃度を得た(収率100%として)。
【０１７０】
フッ素の検出に使用するプロトコールは実施例1で述べたものである。選択した有機化合物はMTBSTFAでシリル化されたエストラジオールである(ジメチルtert-ブチルエストラジオール)。
【０１７１】
図9に示す結果は、いずれの場合にもフッ素が検出されたことを示している。フッ素の理論濃度と検出濃度間の相関はかなり良好である。
【０１７２】
したがって、本発明による空気中でHFを検出するための方法によって、10-2l HF/106l空気(10ppb)のオーダーの濃度でのHFの検出が容易に可能である。
【０１７３】
(実施例12)
本発明の方法の非競合イムノアッセイによるフッ素の検出および測定への適用
1)概略の方策
目的は、先に得られた結果を用いること、すなわちHFの作用によって、シリル化化合物の免疫学的認識を修飾する可能性についてである。
【０１７４】
先のアッセイフォーマット(競合)に対して、イムノメトリックアプローチは、シリル化化合物を、固体表面上に共有結合的に固定することにある。HFによるその変換は免疫活性形態をもたらし、それによって、シグナルが消失する競合アッセイと反対に、シグナルの発生がもたらされる。
【０１７５】
このフォーマットは優れた感度をもたらすことが多い。それは多分、過剰にある試薬と関連した熱力学的な好都合さと、シグナルの消失よりその出現の方が目視するまたは測定するのにより容易であるという事実に基づく読取の容易さとに起因している。
【０１７６】
2)試薬とプロトコール
用いた抗体は文献番号[39]に記載のものである。
【０１７７】
ウサギ抗体のビオチン化と、アセチルコリンエステラーゼによるストレプトアビジンまたは抗体の標識化とを当業者に周知の通常の技術を用いて実験室で実施した。
【０１７８】
化学薬品および製品はすべてSigmaまたはMerckから入手したものである。入手した化合物はSigmaまたはSteraloidsからのものである(エストラジオール誘導体の場合)。
【０１７９】
アッセイ緩衝液はアジド(0.01%)、ウシアルブミン(0.5%)およびNaCl(0.9%)を含有する0.05Mリン酸塩緩衝液(pH7.4)である。
【０１８０】
酵素インジケータは、アセチルチオコリンとジニトリフルオロベンゼン(dinitrifluorobenzene)の混合物からなる。トレーサーとの反応に続いて、肉眼で視られるかまたは分光光度計で414nmで定量できる黄色が発生する。
【０１８１】
実験を実施するために、特にエストラジオール誘導体を結合させるために使用したプレートはNunc(Rochester、USA)から入手した。
【０１８２】
用いたシリル化剤はBSTFAとMTBSTFAである。
【０１８３】
使用したエストラジオールを以下に示す。この化合物の利点は、検出のために抗体を使用することと、競合アッセイ用に先に開発した基本原理を用いることが可能になることである。
【０１８４】
本発明者等は、得られた抗エストラジオール抗体は、シリル化化合物ではなく、非シリル化化合物を認識することをまず立証した(エストラジオールと比べて、抗体と53%交差反応)。立証は肯定された。
【０１８５】
【化５】
【０１８６】
次いで、本発明者等は、エストラジオールと、2種類のプレートすなわちアミノ基(Nunc-NH2プレート)を有するプレートとポリリシン(poly-Lys)で活性化したプレートの共有結合について試験した。
【０１８７】
3)エストラジオール誘導体の結合の試験
EstCMEを、プレート上でアミノ基を抗原のカルボキシル基に結合させる等モル濃度のN-ヒドロキシスクシニド(NHS)の存在下、22℃で3時間、Nuncプレートにインキュベートした。100ng/ml抗エストラジオール抗体を20℃で4時間用い、次いで、アセチルコリンエステラーゼ(2Ellman単位のgAb-AchE/ml)に結合させたヤギ抗ウサギ抗体抗体を22℃で2時間用いて可視化を実施した。Ellman試薬、AchEの基質を加えて酵素活性を可視化する。
【０１８８】
得られた結果を添付の図10に示す。エストラジオールが効果的に結合され、試験した最高濃度(100μl/ml)で最大値が得られていることを示している。
【０１８９】
ポリリシン(poly-Lys)(リン酸塩緩衝液中に1〜100μg/ml)をその上に予め吸収させたプレートを用いて、この最初の実験を繰り返した。
【０１９０】
得られた結果を添付の図11に示す。この場合、検討したポリリシンの濃度に関わらず同じオーダーの結果である。これはさらに、ポリリシンが担持するアミノ基は、選択されたエストラジオールを結合させるのに、よりアクセスし易いことを実証している。
【０１９１】
ポリリシンの濃度の影響についてより詳細に検討するために、より広い範囲のポリリシン濃度で試験を繰り返した。得られた結果を添付の図12のグラフに示す。ポリリシンの最適値が約1μg/mlであることが示されている。
【０１９２】
先の2つの図(図11と12)は、1μg/mlのポリリシン濃度と、10μg/mlのエストラジオールカルボキシメチルエーテル濃度で得られた水平域(plateau)で、エストラジオール誘導体のプレートへの結合が効果的であることを示している。
【０１９３】
4)エストラジオール誘導体のシリル化
さらに、本発明者等は、上記の化合物のシリル化のための最良条件の実証の検討を行った。エストラジオールカルボキシメチルエーテルとMTBSTFAを、種々の濃度(1/5、1/2および1/1)と2点の温度(22℃または37℃)で0〜60分間反応させた。シリル化エストラジオールの競合アッセイによってシリル化を測定する。このアッセイでは、シリル化エストラジオールの認識がされなくなる(またシグナルが増大することになる)。
【０１９４】
得られた結果を添付の図13に示す。この図は、高いMTBSFA濃度の条件下では、エストラジオールカルボキシメチルエーテルは、免疫反応性を喪失することを示している。この喪失は、認識の不在に起因するシグナルの増加によって示されている。MTBSFAが分量効果を有することが実証されている。
【０１９５】
これらの結果、すなわち固相への結合とシリル化の効果を合わせると、プレート上で行う以下の結合/脱シリル化試験が可能になる。
【０１９６】
5)結合/脱シリル化試験
エストラジオールカルボキシメチルエーテル(8.3mg/ml)を、同濃度のMTBSTFAの存在下、22℃で1時間反応させ、次いで水に1μg/mlまで希釈し、ポリリシン(1μg/ml)でコーティングしたプレート上で、NHSの存在下、22℃で1時間反応させた。
【０１９７】
HFの非存在下または1mM濃度のHFの存在下で22℃、37℃または64℃で1時間脱シリル化を実施した。
【０１９８】
結果を添付の図14に示す。この図から、HFの存在下でのシリル化エストラジオールカルボキシメチルエーテルの脱シリル化に対応する免疫反応性の増加が観察される。
【０１９９】
これによって、シリル化有機化合物を支持体に結合させた場合の、本発明の方法によるHFの検出が実証されている。
［参考文献］
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】その抗体(Ab)によって認識されるエストラジオール(Es)の部分を示す図であり、抗体によって認識されるエストラジオール分子の部分のSi原子と-OHとの結合が、抗体がこの分子を認識するのを阻止する。
【図２】競合によって検出を行う第1の実施形態による、本発明の方法によってHFを検出するための概略のスキームを示す図である。
【図３】競合イムノアッセイ(左側)と、そうしたアッセイを用いて得られるシグナルの測定(右側)とを示す図であり、この図では、S(%)は抗体(Ab)と結合しているトレーサー(T)によってもたらされるシグナルを表し、[Es](M)は未変性エストラジオールのモル濃度(モル/l)を表す。
【図４】BTSFAを用いて得られたトリメチルシリルエストラジオールの脱シリル化に対する種々の有機酸の効果を示すグラフであり(B/Boは、以下の実施例2のプロトコールによる免疫学的試験での、HFの存在下のシグナル(Bは結合を表す)と、HFの非存在下のシグナル(Boは非結合を表す)との比の形でのシグナルの尺度である)、[H+](M)はこのグラフで特定されている各酸の酸モル濃度を表す。
【図５】エストラジオールを脱シリル化するための条件、すなわち、温度、50mMリン酸塩(P)緩衝液のpHの検討を示すグラフである(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図６】50mMリン酸塩緩衝液(pH5.5)での、シリル化エストラジオールの脱シリル化に対する種々の酸の効果を示す図であり、[H+](M)はこのグラフで特定されている各酸の酸モル濃度を表す。データは塩酸、硝酸または硫酸でも同様である(B/Boシグナルシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図７】他の求核物質およびハロゲンと比較した場合の、本発明の方法によるHFの検出の特異性を示すグラフであり、[P](M)は、ハロゲンまたは他の求核物質のモル濃度を表し、各ハロゲンはこのグラフで特定されている(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図８】種々の塩の存在下での、本発明の方法によるHFの検出の特異性を示すグラフであり、[X+F-](M)はフッ素塩のモル濃度を表し、各塩はこのグラフで特定されている(B/Boシグナルは図4の場合と同様に測定)。
【図９】本発明の方法によって検出された(d)フッ素[F]の濃度(μモル/lで)と、フッ素で汚染された大気のサンプル中の理論濃度([F]th)との間の相関を示すグラフである。
【図１０】図１０−１４は、非競合の免疫学的アッセイプロトコールにしたがった、特異的抗体による非シリル化エストラジオールの認識に関して得られた実験結果を表すグラフである。 図１０は、エストラジオールの濃度(μg/mlで)を変えて、アミノ基を有するマイクロタイトレーションプレート(アミノ化Nuncプレート)へのエストラジオールカルボキシメチルエーテル(EstCME)の結合について得られたシグナル(S)(mOD)を示す図である。
【図１１】ポリリシン(μg/mlで)を変えて、ポリリシン(poly-Lys)-活性化マイクロタイトレーションプレートへのエストラジオールカルボキシメチルエーテルの結合について得られたシグナル(S)(mOD)(吸光度414nmで測定)を示す図である。
【図１２】ポリリシン(μg/mlで)を変えて、ポリリシン(poly-Lys)-活性化マイクロタイトレーションプレートへのエストラジオールカルボキシメチルエーテルの結合について得られたシグナル(S)(mOD)(吸光度414nmで測定)を示す図である。
【図１３】MTSBTFAによるエストラジオールカルボキシメチルエーテルのシリル化の試験を示す図であり、シリル化効率は、MTSBTFA(1/5;1/2;1/1)の希釈度と温度(℃)を変えて、シグナル(S)(mOD)の増大で測定する。
【図１４】エストラジオールカルボキシメチルエーテルに続く、イムノメトリックフォーマット試験を示す図であり、シグナル(S)(mOD)は、HFが存在するまたはしない場合に応じて測定される。この図で、BoはHFの存在しない場合(対照)のシグナルを表す。
【図１５】テトラペプチドすなわちAcSDKPであるシリル化有機化合物を用いて、本発明の方法で実施して得られた実験結果をグラフの形で示す図であり、シグナル(S(mOD))は414nmで測定する。2つのシリーズのアッセイを実施した。一方のシリーズでは第1のシリル化剤(MTSBTFA)でシリル化されたテトラペプチドを用い、他方のシリーズでは第2のシリル化剤(BSTFA)でシリル化されたテトラペプチドを用いた。シリーズごとに22℃、37℃および70℃で3回のアッセイを行い、各ケースで10、30および60分に測定を行った。
【図１６】脱シリル化温度(T(℃))を変えて、本発明の方法によるフッ素の検出の効率の検討で得られた実験結果を示すグラフであり、シグナル(S(mOD))は414nmで測定。用いたシリル化化合物はMTBSTFAで得られた図15での化合物である。
【図１７】エストラジオールの誘導体であるシリル化有機化合物を用いて、本発明の方法を実施して得られた実験結果を示すグラフであり、シグナル(S(mOD))は、フッ素[F]の濃度(マイクロモル/l(μM))を変えて、414nmで測定する。
【図１８】本発明の方法の検出ステップで用いることができる、非競合の免疫学的検出の機構を図解的に示す図である。
【図１９】ジメチルスルホキシド(DMSO)の存在下で、本発明の方法によるフッ素の検出結果を示すグラフであり、B/Boは、HF(B)の存在下のシグナルと、HF(Bo)の非存在下のシグナルの比の形でのシグナルの尺度である。[F-](M)はフルオリドイオンのモル濃度である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)を検出および／または濃度測定する方法であって、
測定溶液を得るために、水溶液中で前記サンプルをシリル化有機化合物と接触させるステップであって、ここで前記シリル化有機化合物は、フッ化水素酸またはフルオリドが存在する場合に脱シリル化され、前記シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物は互いに独立に検出および/または測定可能であるステップと、
前記サンプル中にフルオリドまたはフッ化水素が存在している場合に起こる、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を、前記測定溶液中で検出および/または測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記シリル化有機化合物の式が
【化１】
(式中、R1、R2およびR3はC1〜C6アルキルから独立に選択され、R4は前記有機化合物である)
である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
R1、R2およびR3がメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記有機化合物が250〜200000gモル-1の分子量を有するヒドロキシル化化合物である請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機化合物が、エストラジオール、ペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカイン、アラキドン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択されるヒドロキシル化化合物である請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記測定溶液中での、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定をガスクロマトグラフィーで実施する請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記非シリル化または脱シリル化有機化合物に対するか、シリル化有機化合物に対する1種または複数の抗体を用いた免疫学的試験によって、前記測定溶液中での、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定を実施する請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的試験が競合または非競合イムノアッセイである請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機化合物がエストラジオールまたはその誘導体の1つである請求項1または7に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機化合物が、エストラ-1,3,5-トリエン-3,17μまたは17μ-ジオール、あるいはそれらの誘導体からなる群から選択される請求項1または7に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触ステップにおいて、前記シリル化有機化合物を1〜2000ng/mlの濃度で使用する、請求項1ないし11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触水溶液のpHを緩衝材で処理してpH4.5〜5.5にする、請求項1ないし12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触ステップを54〜64℃の温度で実施する、請求項1ないし13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
以下の試薬、すなわち、フッ素またはフッ化水素酸が存在する場合に脱シリル化されるシリル化有機化合物と、水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出するための手段としての試薬とを含む、サンプル中のフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)の濃度を検出および/または測定するためのキット。
【請求項１６】
前記シリル化有機化合物の式が
【化２】
(式中、R1、R2およびR3はC1〜C6アルキルから独立に選択され、R4は前記有機化合物である)
である請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
R1、R2およびR3がメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される請求項16に記載のキット。
【請求項１８】
前記有機化合物が250〜200000gモル-1の分子量を有するヒドロキシル化化合物である請求項15、16または17のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記有機化合物がエストラジオール、ペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカインまたはアラキドン酸あるいはそれらの誘導体からなる群から選択されるヒドロキシル化化合物である請求項15または16に記載のキット。
【請求項２０】
前記有機化合物がエストラジオールまたはその誘導体の1つである請求項15または16に記載のキット。
【請求項２１】
前記有機化合物が、エストラ-1,3,5-トリエン-3,17μまたは17μ-ジオール、あるいはそれらの誘導体からなる群から選択される請求項15に記載のキット。
【請求項２２】
前記非シリル化または脱シリル化有機化合物に対するか、前記シリル化有機化合物に対する1つまたは複数の抗体をさらに含む請求項15から21のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
競合イムノアッセイの実施に必要な試薬および抗体、または非競合イムノアッセイの実施に必要な試薬および抗体をさらに含む請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
接触および/または検出および/または測定するステップのためのレセプタクルの働きをする1個または複数のウェルが中に形成されているポリスチレンストリップをさらに含む請求項15、22または23に記載のキット。
【請求項２５】
ウェルがマウス抗エストラジオール抗体に対する抗体でコーティングされている請求項14に記載のキット。
【請求項２６】
シリル化エストラジオールがウェルの底部に結合されている請求項24に記載のキット。
【請求項１】
サンプル中のフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)を検出および／または濃度測定する方法であって、
測定溶液を得るために、水溶液中で前記サンプルをシリル化有機化合物と接触させるステップであって、ここで前記シリル化有機化合物は、フッ化水素酸またはフルオリドが存在する場合に脱シリル化され、前記シリル化有機化合物と脱シリル化有機化合物は互いに独立に検出および/または測定可能であるステップと、
前記サンプル中にフルオリドまたはフッ化水素が存在している場合に起こる、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を、前記測定溶液中で検出および/または測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記シリル化有機化合物の式が
【化１】
(式中、R1、R2およびR3はC1〜C6アルキルから独立に選択され、R4は前記有機化合物である)
である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
R1、R2およびR3がメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記有機化合物が250〜200000gモル-1の分子量を有するヒドロキシル化化合物である請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機化合物が、エストラジオール、ペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカイン、アラキドン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択されるヒドロキシル化化合物である請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記測定溶液中での、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定をガスクロマトグラフィーで実施する請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記非シリル化または脱シリル化有機化合物に対するか、シリル化有機化合物に対する1種または複数の抗体を用いた免疫学的試験によって、前記測定溶液中での、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失の検出および/または測定を実施する請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的試験が競合または非競合イムノアッセイである請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機化合物がエストラジオールまたはその誘導体の1つである請求項1または7に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機化合物が、エストラ-1,3,5-トリエン-3,17μまたは17μ-ジオール、あるいはそれらの誘導体からなる群から選択される請求項1または7に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触ステップにおいて、前記シリル化有機化合物を1〜2000ng/mlの濃度で使用する、請求項1ないし11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触水溶液のpHを緩衝材で処理してpH4.5〜5.5にする、請求項1ないし12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触ステップを54〜64℃の温度で実施する、請求項1ないし13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
以下の試薬、すなわち、フッ素またはフッ化水素酸が存在する場合に脱シリル化されるシリル化有機化合物と、水溶液中で、脱シリル化有機化合物の出現またはシリル化有機化合物の消失を検出するための手段としての試薬とを含む、サンプル中のフルオリド(F-)またはフッ化水素(HF)の濃度を検出および/または測定するためのキット。
【請求項１６】
前記シリル化有機化合物の式が
【化２】
(式中、R1、R2およびR3はC1〜C6アルキルから独立に選択され、R4は前記有機化合物である)
である請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
R1、R2およびR3がメチル、エチル、プロピルおよびブチルからなる群から独立に選択される請求項16に記載のキット。
【請求項１８】
前記有機化合物が250〜200000gモル-1の分子量を有するヒドロキシル化化合物である請求項15、16または17のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記有機化合物がエストラジオール、ペプチド、ホモバニリン酸、アンフォテリシン、ステロイド、サイトカインまたはアラキドン酸あるいはそれらの誘導体からなる群から選択されるヒドロキシル化化合物である請求項15または16に記載のキット。
【請求項２０】
前記有機化合物がエストラジオールまたはその誘導体の1つである請求項15または16に記載のキット。
【請求項２１】
前記有機化合物が、エストラ-1,3,5-トリエン-3,17μまたは17μ-ジオール、あるいはそれらの誘導体からなる群から選択される請求項15に記載のキット。
【請求項２２】
前記非シリル化または脱シリル化有機化合物に対するか、前記シリル化有機化合物に対する1つまたは複数の抗体をさらに含む請求項15から21のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
競合イムノアッセイの実施に必要な試薬および抗体、または非競合イムノアッセイの実施に必要な試薬および抗体をさらに含む請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
接触および/または検出および/または測定するステップのためのレセプタクルの働きをする1個または複数のウェルが中に形成されているポリスチレンストリップをさらに含む請求項15、22または23に記載のキット。
【請求項２５】
ウェルがマウス抗エストラジオール抗体に対する抗体でコーティングされている請求項14に記載のキット。
【請求項２６】
シリル化エストラジオールがウェルの底部に結合されている請求項24に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
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【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００７−５０１４０６（Ｐ２００７−５０１４０６Ａ）
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３０４３８（Ｐ２００６−５３０４３８）
【出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０１９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５７９
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５９００００５１４）コミツサリア タ レネルジー アトミーク (429)
【公表日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０１９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５７９
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５９００００５１４）コミツサリア タ レネルジー アトミーク (429)
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