プレニルキノン生合成能の高い形質転換植物
【課題】プレニルキノン類の量の増加は、植物に、酸化的ストレス、特に、冷気、乾燥または強度の光に対する、より優れた抵抗性を付与する。植物および植物細胞を形質転換することによりこれらの性質を付与する。
【解決手段】形質転換植物、特に、プラストキノン類、トコトリエノール類およびトコフェロール類を、形質転換されていない同じ植物よりも多量に産生する形質転換植物を得た。該植物を産生するための方法および前記植物を培養するための方法も示す。該植物は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素阻害剤に耐性となる特性も獲得していた。
【解決手段】形質転換植物、特に、プラストキノン類、トコトリエノール類およびトコフェロール類を、形質転換されていない同じ植物よりも多量に産生する形質転換植物を得た。該植物を産生するための方法および前記植物を培養するための方法も示す。該植物は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素阻害剤に耐性となる特性も獲得していた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物、特に、プラストキノン類、トコトリエノール類およびトコフェロール類を、形質転換されていない同じ植物よりも多量に産生する形質転換植物に関する。本発明は、これらの植物を産生するための方法およびこれらの植物を培養するための方法にも関する。本発明の植物は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素（以下、ＨＰＰＤと呼ぶ）の阻害剤である除草剤に耐性となる特性も有する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルキノン類は、特にプラストキノン類、トコフェロール類およびトコトリエノール類を含む、脂質親和性を有する化合物の大きな群である。植物中で、プレニルキノン類は、ホモゲンチサート経路を介して合成される。
【０００３】
最も良く知られているプレニルキノンはビタミンＥ、すなわちα−トコフェロールであり、ヒトまたは動物の食事の必須成分であり、特に、ビタミンＥを天然には生成しないが栄養的に必要としている哺乳動物に必須である。ビタミンＥの最も理解されている効果は、細胞膜脂質へのその抗酸化作用である（Ｅｐｓｔｅｉｎら著、１９６６年、Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻：３２２〜３３５頁；Ｋａｍｅｌ−ＥｌｄｉｎおよびＡｐｐｅｌｑｖｉｓｔ著、１９９６年、Ｌｉｐｉｄｓ第３１巻：６７１〜７０１頁）。
【０００４】
ビタミンＥ以外に、ヒトおよび動物の食事において必須ではないがトコトリエノール類が、ビタミンＥよりも著しい特に有利な抗酸化特性を有する（Ｋａｍａｔら著、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７０巻、１３１〜１３７頁）。これらの化合物は、特に、細胞をフリーラジカルから保護すること、および心臓血管疾患または癌の発生を防ぐことも知られている（Ｐａｃｋｅｒら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１（２）巻：３６９８〜３７３８頁）。さらに、トコトリエノール類は、エストロゲン受容体の増殖の阻害による抗癌活性、すなわち、トコフェロール類が持っていない活性を示す（Ｇｕｔｈｒｉｅら著、１９９７頁、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２７巻：５４４〜５４８頁）。これらは、トコフェロール類よりもかなり優れた低コレステロール血症活性も示し（Ｐｅａｒｃｅら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３５巻、３５９５〜３６０６頁；Ｑｕｒｅｓｈｉら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１巻：２６０６〜２６１８頁）、これにより、動脈硬化を抑えることがより可能になっている。
【０００５】
プラストキノン類は、ヒトまたは動物の健康における役割が知られていないが、植物においては必須の役割を果たす。これらの分子は、葉緑素膜中に存在し、それらの機能は、光合成反応中の電子移動である（Ｇｒｕｍｂａｃｈ著、１９８４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｉｐｉｄｓ、ＳｉｅｇｅｎｔｈａｌｅｒおよびＥｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ編）。
【０００６】
さらに、プレニルキノン類の量の増加が、植物に、酸化的ストレス、特に、冷気、乾燥または強度の光に対する、より優れた抵抗性を付与する。
【０００７】
植物および光合成性生物において、通常、ホモゲンチサートがプレニルキノン類の芳香族前駆体を構成する。ホモゲンチサートは、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素（以下、ＨＰＰＤと称する）の産物である。大部分の生物において、ＨＰＰＤは、芳香族アミノ酸チロシンの異化分解経路に関連する酵素である（Ｇｏｏｄｗｉｎ著、１９７２年、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ、Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｂ．Ｌ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、１〜９４）。ＨＰＰＤは、チロシン分解産物であるｐ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）のホモゲンチサートへの転化反応を触媒する。
【０００８】
大部分の植物は、アロゲナートを介してチロシンを合成する（ＡｂｏｕＺｅｉｄら著、１９９５年、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂ第４１巻：１２９８〜１３０２頁；Ｂｏｎｎｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第３６巻、１０１３〜１０２２頁；Ｂｙｎｇら著、１９８１年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第６巻：１２８９〜１２９２頁；ＣｏｎｎｅｌｙおよびＣｏｎｎ著、１９８６年、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ第４１ｃ：６９〜７８頁；Ｇａｉｎｅｓら著、１９８２年、Ｐｌａｎｔｓ第１５６巻：２３３〜２４０頁）。これらの植物において、ＨＰＰは、チロシンの分解からのみ誘導される。一方、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のような生物において、ＨＰＰはチロシン前駆体であり、プレフェナートをＨＰＰに転化するプレフェナート脱水素酵素（以下、ＰＤＨと呼ぶ）の作用により合成される（Ｌｉｎｇｅｎｓら著、１９６７年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ第１巻：３６３〜３７４頁；ＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｏｎ著、１９８２年、Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ第７０１巻：２０４〜２１１頁）。従って、これらの生物において、ＨＰＰの産生は芳香族アミノ酸生合成経路（シキマート経路）に直接結びつき、チロシン分解経路には結びつかない（図１参照）。
【０００９】
植物によるプレニルキノン類の生合成を増加させるために、本特許出願の発明者は、前記前駆体の生合成をＰＤＨ酵素の過発現による「シキマート」経路に結びつけることにより、これらの植物の細胞内へのＨＰＰ前駆体の流入を増加させようとした。予想される効果は、ＨＰＰ前駆体のより大きな流れであり、全体としてプレニルキノン生合成を増加させるはずである。
【００１０】
ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、前記植物によるプレニルキノン類の産生の増加を可能にすることが実際上注目された。この増加は、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物が、ＨＰＰＤ酵素も過発現する植物である場合、非常に著しい。
【００１１】
ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、ＨＰＰＤ阻害剤への前記植物の耐性の増加を可能にすることも注目された。この耐性の増加は、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物が、ＨＰＰＤ酵素も過発現する植物である場合、非常に著しい。
【００１２】
この数年間において、この酵素が新規科の「脱色性」除草剤の標的であることが示された後、ＨＰＰＤへの興味が著しく増加した。その標的がＨＰＰＤであるそのような除草剤は、特にイソオキサゾール（欧州特許第４１８ １７５号、欧州特許第４７０ ８５６号、欧州特許４８７ ３５２号、欧州特許第５２７ ０３６号、欧州特許５６０ ４８２号、欧州特許６８２ ６５９号、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、イソキサフルトール、トウモロコシ用の選択的除草剤、ジケトニトリル（欧州特許第４９６ ６３０号、欧州特許第４９６ ６３１号）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５ ５０５号、欧州特許第６２５ ５０８号、米国特許第５，５０６，１９５号）、特にスルコトリオンまたはメソトリオン、あるいはピラゾリネートである。
【００１３】
その標的が植物の生命を維持する代謝経路に含まれる酵素である除草剤の利点の一つは、離れた系統発生的由来の植物に対する広い活性範囲である。しかしながら、そのような除草剤は、不必要な植物すなわち「雑草」を除去するために作物に適用されたときに、栽培植物にも作用するという大きな欠点も有する。この欠点は、前記除草剤に耐性のある栽培植物を用いることにより克服することができる。そのような植物は、通常、それらの組織中で酵素を過発現するように前記除草剤への抵抗性のための酵素をコードする遺伝子をそのゲノム中に導入することによる遺伝子工学により得られる。
【００１４】
今までに、除草剤に耐性の植物を作るために、遺伝子工学を用いる３つの主要な手法が用いられてきた。第１の手法は、解毒性酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにより除草剤を解毒することにある。この酵素は、除草剤またはその活性代謝産物を、非毒性分解産物、例えば、ブロモキシニルまたはベースト（ｂａｓｔｅ）への耐性用の酵素に転化する（欧州特許第２４２ ２３６号、欧州特許第３３７ ８９９号）。第２の手法は、除草剤またはその活性代謝産物への感受性が低くなるように突然変異された標的酵素、例えば、グリホサート耐性酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにある（欧州特許第２９３ ３５６号；Ｐａｄｇｅｔｔｅら著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻：３３頁）。第３の手法は、植物中で、大量の、可能なら植物に入る除草剤の量よりもかなり多い量の標的酵素を産生するように、感受性標的酵素を過発現することにある。この手法は、その阻害剤の存在にも拘わらず、機能性酵素の充分な水準を維持することを可能にする。
【００１５】
この第３の手法を実行し、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性の植物を得ることを可能にした（ＷＯ９６／３８５６７）。さらに、感受性（非突然変異）標的酵素を過発現させるこの単純な手法を初めてうまく用いて、除草剤への作物学的水準での耐性を植物に付与した。
【００１６】
大部分のＨＰＰＤ阻害除草剤が、ゆっくりかつ実質的に不可逆的に結合する基質に関して競合的阻害剤であることも知られている（Ｅｌｌｉｓら著、１９９６年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻：２４〜２７頁；Ｖｉｖｉａｎｉら著、１９９８年、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第６２巻：１２５〜１３４頁）。従って、それらの作用形式は、その結合部位に選択的に結合することによりＨＰＰと競合することにある。この結合の結果は、ホモゲンチサート合成を細胞が停止することである。
【００１７】
ＰＤＨ酵素の過発現によるＨＰＰＤ基質ＨＰＰの流入の増加を利用する本発明は、除草剤耐性植物、特に、ＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である植物を得るための第４の可能な手法を構成するようである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許第４１８１７５号明細書
【特許文献２】欧州特許第４７０８５６号明細書
【特許文献３】欧州特許４８７３５２号明細書
【特許文献４】欧州特許第５２７０３６号明細書
【特許文献５】欧州特許５６０４８２号明細書
【特許文献６】欧州特許６８２６５９号明細書
【特許文献７】米国特許第５４２４２７６号明細書
【特許文献８】欧州特許第４９６６３０号明細書
【特許文献９】欧州特許第４９６６３１号明細書
【特許文献１０】欧州特許第６２５５０５号明細書
【特許文献１１】欧州特許第６２５５０８号明細書
【特許文献１２】米国特許第５５０６１９５号明細書
【特許文献１３】欧州特許第２４２２３６号明細書
【特許文献１４】欧州特許第３３７８９９号明細書
【特許文献１５】欧州特許第２９３３５６号明細書
【特許文献１６】国際公開第９６／３８５６７号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｅｐｓｔｅｉｎら著、１９６６年、Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻：３２２〜３３５頁
【非特許文献２】Ｋａｍｅｌ−ＥｌｄｉｎおよびＡｐｐｅｌｑｖｉｓｔ著、１９９６年、Ｌｉｐｉｄｓ第３１巻：６７１〜７０１頁
【非特許文献３】Ｋａｍａｔら著、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７０巻、１３１〜１３７頁
【非特許文献４】Ｐａｃｋｅｒら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１（２）巻：３６９８〜３７３８頁）
【非特許文献５】Ｇｕｔｈｒｉｅら著、１９９７頁、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２７巻：５４４〜５４８頁
【非特許文献６】Ｐｅａｒｃｅら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３５巻、３５９５〜３６０６頁
【非特許文献７】Ｑｕｒｅｓｈｉら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１巻：２６０６〜２６１８頁）
【非特許文献８】Ｇｒｕｍｂａｃｈ著、１９８４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｉｐｉｄｓ、ＳｉｅｇｅｎｔｈａｌｅｒおよびＥｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ編
【非特許文献９】Ｇｏｏｄｗｉｎ著、１９７２年、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ、Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｂ．Ｌ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、１〜９４）
【非特許文献１０】ＡｂｏｕＺｅｉｄら著、１９９５年、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂ第４１巻：１２９８〜１３０２頁
【非特許文献１１】Ｂｏｎｎｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第３６巻、１０１３〜１０２２頁
【非特許文献１２】Ｂｙｎｇら著、１９８１年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第６巻：１２８９〜１２９２頁
【非特許文献１３】ＣｏｎｎｅｌｙおよびＣｏｎｎ著、１９８６年、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ第４１ｃ：６９〜７８頁
【非特許文献１４】Ｇａｉｎｅｓら著、１９８２年、Ｐｌａｎｔｓ第１５６巻：２３３〜２４０頁
【非特許文献１５】Ｌｉｎｇｅｎｓら著、１９６７年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ第１巻：３６３〜３７４頁
【非特許文献１６】ＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｏｎ著、１９８２年、Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ第７０１巻：２０４〜２１１頁
【非特許文献１７】Ｐａｄｇｅｔｔｅら著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻：３３頁
【非特許文献１８】Ｅｌｌｉｓら著、１９９６年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻：２４〜２７頁
【非特許文献１９】Ｖｉｖｉａｎｉら著、１９９８年、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第６２巻：１２５〜１３４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従って、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２１】
特定の実施態様によれば、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含み、植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子は除くことを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２２】
もう一つの特定の実施態様によれば、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、および
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換された植物からなることを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２３】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の形質転換植物は形質転換植物細胞により代表され得る。
【００２４】
「形質転換植物」または「形質転換植物細胞」という用語は、本発明によれば、形質転換植物または任意の他の生物に由来し得る少なくとも一つの導入遺伝子をそのゲノム中に安定して取り込んだ植物または植物細胞を意味することを関心のある。好ましくは、本発明による導入遺伝子は、形質転換植物以外の少なくとも一つの生物に由来する要素を含むキメラ遺伝子により代表される。特に、本発明による導入遺伝子は、他の要素のうち、異なる生物に由来する少なくとも一つのプロモーター、コード配列、およびターミネーターを含んでよく、前記生物も形質転換植物と異なる。
【００２５】
「植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「ＰＤＨ」という用語は、プレフェナートをＨＰＰに転化するＰＤＨ活性を示す任意の天然または突然変異したＰＤＨ酵素を意味するものと解釈されるべきである。特に、前記ＰＤＨ酵素は、任意の型の生物に由来し得る。ＰＤＨ活性を有する酵素は、プレフェナート基質の量の減少の測定または、酵素的反応から誘導される産物、すなわちＨＰＰまたは補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの一方の蓄積の測定を可能にする任意の方法により確認することができる。特に、ＰＤＨ活性は、実施例２に記載の方法により測定することができる。
【００２６】
ＰＤＨ酵素をコードしている多くの遺伝子が文献に記載されており、その配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／上で確認することができる。Ｍａｎｎｈａｕｐｔらが記載（１９８９年、Ｇｅｎｅ第８５巻、３０３〜３１１頁）のような酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（受入番号Ｓ４６０３７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、特に、Ｈｅｎｎｅｒらが記載（１９８６年、Ｇｅｎｅ第４９（１）巻、１４７〜１５２頁）のような種Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（受入番号Ｐ２０６９２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、特に、Ｈｕｄｓｏｎらが記載（１９８４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８０（４）巻、１０２３〜１０５１頁）のような種Ｅ．ｃｏｌｉ（受入番号ＫＭＥＣＴＤ）、またはＥｒｗｉｎｉａ属の細菌、特に、Ｘｉａらが記載（１９９２年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第１３８（７）巻、１３０９〜１３１６頁）のような種Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（受入番号Ｓ２９９３４）のＰＤＨ酵素をコードする遺伝子が特に知られている。
【００２７】
「植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「ＨＰＰＤ」という用語は、ＨＰＰをホモゲンチサートに転化するＨＰＰＤ活性を示す任意の天然、突然変異またはキメラＨＰＰＤ酵素を意味するものと解釈されるべきである。ＨＰＰＤの酵素活性は、ＨＰＰ基質の量の減少の測定または、酵素反応から誘導される産物、すなわちホモゲンチサートの蓄積の測定を可能にする任意の方法により測定することができる。特に、実施例１およびＧａｒｃｉａｌらの文献（１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３２５巻、７６１〜７６９頁）またはＧａｒｃｉａｌらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載の方法によりＨＰＰＤ活性を測定することができる。
【００２８】
特に、前記ＨＰＰＤ酵素は、任意の型の生物に由来し得る。ＨＰＰＤ酵素をコードする多くの遺伝子、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｒｕｅｔｓｃｈｉら著、１９９２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２０５巻、４５９〜４６６頁、ＷＯ９６／３８５６７）のような細菌の、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＷＯ９６／３８５６７、遺伝子バンク ＡＦ０４７８３４）またはニンジン（ＷＯ９６／３８５６７、遺伝子バンク ８７２５７）のような植物の、Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ（遺伝子バンク ＣＯＩＴＲＰ）の、またはマウスもしくはブタのような哺乳動物の遺伝子が文献に記載されている。
【００２９】
本発明によれば、「突然変異したＨＰＰＤ」という用語は、天然ＨＰＰＤに関して少なくとも一つの突然変異を有すると共に、対応する天然ＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害性除草剤への耐性がより大きな特性を有するＨＰＰＤを意味することを意図している。この突然変異したＨＰＰＤは、特許出願ＷＯ９９／２４５８５に記載のように、そのＣ末端部分において突然変異したＨＰＰＤであることが有利である。好ましくは、突然変異したＨＰＰＤは、特許出願ＷＯ９９／２４５８５に記載のように、突然変異Ｗ３３６を含む。
【００３０】
「キメラＨＰＰＤ」という用語は、種々のＨＰＰＤに由来する要素を含むＨＰＰＤを意味することを意図している。そのようなキメラＨＰＰＤは、特に、特許出願ＷＯ９９／２４５８６に記載されている。
【００３１】
このＨＰＰＤは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｅｓｃｅｎｓ（ＷＯ９６／３８５６７）またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＷＯ９６／３８５６７）からのＨＰＰＤであるのが有利である。
【００３２】
「植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「フィチル／プレニルトランスフェラーゼ」という用語は、特許出願ＷＯ０２／０８９５６１に記載のようなフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を意味すると解されるべきである。特に、前記「植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子」は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｌｒ１７３６遺伝子（ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏｂａｓｅ上のＣｙａｎｏｂａｓｅに記載の配列）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡＴＰＴ２遺伝子（Ｓｍｉｔｈら著、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第１１巻、８３〜９２頁）から選択される遺伝子からなる。
【００３３】
本発明による形質転換された植物または植物細胞は、非形質転換植物よりも多くの量のプレニルキノン類を産生する。好ましくは、本発明による形質転換された植物または植物細胞は、植物中で機能的でありＰＤＨまたはＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子の一つのみで形質転換された植物よりも多くの量のプレニルキノン類を産生する。好ましくは、本発明による形質転換された植物または植物細胞により産生されるプレニルキノン類は、トコフェロール類および／またはトコトリエノール類および／またはプラストキノン類である。トコフェロール類、トコトリエノール類およびプラストキノン類の量を測定するための多くの方法が知られており、当業者が利用できる。例えば、トコフェロール類、トコトリエノール類およびプラストキノン類は、Ｆｒａｚｅｒらの方法（２０００年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第２４巻：５５１〜５５８頁）により測定することができる。本発明によれば、「より多くの量」という用語は、好ましくは少なくとも２倍多い、好ましくは少なくとも５倍多い、好ましくは少なくとも１０倍多い、好ましくは少なくとも５０倍多い、好ましくは少なくとも１００倍多い、好ましくは少なくとも５００倍多い、および好ましくは少なくとも１０００倍多い量を意味すると解される。
【００３４】
本発明による形質転換された植物は、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性である効果も有する。
【００３５】
「ＨＰＰＤ阻害剤に耐性の形質転換された植物」という用語は、形質転換されていない同じ植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量（ｄｏｓｅ）に関して耐性である特徴を少なくとも示す前述のような形質転換植物を意味すると意図される。形質転換されていない植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量は、使用するＨＰＰＤ阻害剤に、および前記阻害剤を適用する植物に、および前記植物に適用する段階にも依存する。しかしながら、当業者は、ＨＰＰＤ阻害剤について通常そうであるように、植物への「脱色」効果により先行される可能性のある、前記阻害剤の適用からある日数後に死ぬことになる前記阻害剤の致死効果に、または、植物の成長低下という効果に、前記阻害剤の毒性が対応し得るという知識においてそのような投与量を決めることができる。好ましくは、本発明によるＨＰＰＤ阻害剤に耐性の形質転換された植物は、植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子のみで形質転換された同じ植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量に関して耐性である。
【００３６】
「ＨＰＰＤ阻害剤」という用語は、ＨＰＰをホモゲンチサートに転化させるその天然の酵素的活性を一時的にまたは永続的に阻害するように植物ＨＰＰＤ酵素に結合することができる天然または人工由来の任意の化合物を意味すると意図される。この特性故に、本発明のＨＰＰＤ阻害剤は、それが適用される植物の死または成長阻害を誘発し、前記死は、通常、前記植物の「脱色」の後に生じる。
【００３７】
ＨＰＰＤ阻害剤の例として、イソオキサゾール（欧州特許第４１８ １７５号、欧州特許第４７０ ８５６号、欧州特許第４８７ ３５２号、欧州特許第５２７ ０３６号、欧州特許第５６０ ４８２号、欧州特許第６８２ ６５９号、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、イソキサフルトール、トウモロコシ用の選択的除草剤、ジケトニトリル類（以下、ＤＫＮｓと呼び、欧州特許第４９６ ６３０号、欧州特許第４９６ ６３１号に記載）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン類（欧州特許第６２５ ５０５号、欧州特許第６２５ ５０８号、米国特許第５，５０６，１９５号）、特にスルコトリオンまたはメソトリオン、あるいはピラゾリネートを挙げることができる。
【００３８】
本発明によれば、「植物中で機能的である遺伝子」という表現は、植物中で機能することができる遺伝子を意味すると意図される。植物中で機能することができる遺伝子は、前記植物の少なくとも一つの組織中でその遺伝子がコードする蛋白を発現することができる遺伝子である。特に、本発明による植物中で機能的である遺伝子は、ＰＤＨおよびＨＰＰＤ酵素を過発現させ得る。蛋白の過発現は、形質転換されていない同じ植物中におけるよりも高い水準での形質転換植物の組織中でのこの蛋白の過発現を意味し、この水準は、前記植物の同一の発育段階において測定される。好ましくは、本発明による植物中で機能的な遺伝子は、それが導入される植物以外の生物に由来する要素を含み得るキメラ遺伝子である。
【００３９】
本発明による植物中で機能的である遺伝子は、好ましくは、少なくとも、互いに機能的に結合している、植物中で機能的であるプロモーター、ＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする配列、およびこの同じ植物中で機能的であるターミネーター要素を含むキメラ遺伝子である。キメラ遺伝子が含み得る種々の要素は、第１に、蛋白の転写、翻訳および成熟用の制御要素、例えば、プロモーター、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列、またはポリアデニル化シグナルを構成するターミネーター要素であり、第２に、蛋白をコードする配列である。「互いに機能的に結合」という発現は、その機能が調整されてコード配列を発現させるように、キメラ遺伝子の前記要素が互いに結合していることを意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を提供することができる場合、コード配列に機能的に結合される。本発明によるキメラ遺伝子およびその種々の要素のアセンブリの構築は、当業者によく知られている技術、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の技術を用いて行うことができる。キメラ遺伝子を構成する制御要素の選択は、それらがその中で機能すべき植物に本質的に依存し、当業者は、所定の植物中で機能的である制御要素を選択することができる。
【００４０】
本発明によるキメラ遺伝子が含み得るプロモーターは、構成的に、誘発的に、空間的にまたは時間的に制御することができる。
【００４１】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる構成的プロモーターのうち、例えば、オクトピンシンターゼ遺伝子またはノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｓａｎｄｅｒｓら著、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１５巻、１５４３〜１５４８頁）のような細菌プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの１９Ｓまたは３５Ｓ ＲＮＡの転写を制御する遺伝子のプロモーター（ＣａＭＶ；Ｌａｗｔｏｎら著、１９８７年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第９巻、３１５〜３２４頁；Ｏｄｅｌｌら著、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ第３１３頁、８１０〜８１２頁）のようなウイルスプロモーター、カッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター（ＣｓＶＭＶ；特許出願ＷＯ９７／４８８１９に記載）を挙げることができる。植物由来のプロモーターのうち、リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子のプロモーター、欧州特許第０ ５０７ ６９８号に記載のようなヒストン遺伝子のプロモーター、またはイネアクチン遺伝子のプロモーター（Ｗａｎｇら著、１９９２年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１２（８）巻：３３９９〜３４０６頁；米国特許第５，６４１，８７６号）が挙げられる。
【００４２】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる誘発性プロモーターのうち、例えば、オーキシン結合蛋白をコードする遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｗｏｂら著、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第４（３）巻：４２３〜４３２頁）、ＵＤＰ−グルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーター（Ｒａｌｓｔｏｎら著、１９８８年、Ｇｅｎｅｔ．第１１９（１）巻：１８５〜１９７頁）、ＭＩＰ蛋白分解酵素阻害剤をコードする遺伝子のプロモーター（Ｃｏｒｄｅｒｏら著、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第６（２）巻、１４１〜１５０頁）、またはグリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素をコードする遺伝子のプロモーター（Ｍａｒｔｉｎｅｚら著、１９８９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２０８（４）巻、５５１〜５６５頁；Ｑｕｉｇｌｅｙら著、１９８９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第２９（５）巻、４１２〜４２１頁；Ｋｏｈｌｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２９（６）巻、１２９３〜１２９８年）を挙げることができる。
【００４３】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる組織特異的プロモーターのうち、例えば特許出願ＷＯ００／２９５９４に記載のような根特異的プロモーター、特許出願ＷＯ９８／２２５９３、ＷＯ９９／１５６７９またはＷＯ９９／４３８１８に記載のような花特異的プロモーター、果実特異的プロモーター、特に、特許出願ＷＯ９１／１３９９３、ＷＯ９２／１７５８０、ＷＯ９８／４５４６０、ＷＯ９８／４５４６１またはＷＯ９９／１６８９０に記載のような種子特異的プロモーターを挙げることができる。
【００４４】
本発明のキメラ遺伝子で用いることができるターミネーター要素のうち、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のノパリンシンターゼをコードする遺伝子のｎｏｓターミネーター要素（Ｂｅｖａｎら著、１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）または欧州特許出願第０ ６３３ ３１７号に記載のようなヒストン遺伝子のターミネーター要素を挙げることができる。
【００４５】
キメラ遺伝子は、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）標的配列も含むことができる。そのような、ＨＰＰＤ酵素またはＰＤＨ酵素をコードする配列の上流または下流に位置する配列は、前記ＨＰＰＤまたはＰＤＨ酵素を、特異的に、宿主生物の細胞区画内に導くことを可能にする。例えば、キメラ遺伝子は、ミトコンドリア、プラスト、小胞体または小胞のような細胞質の特定の区画にＨＰＰＤおよび／またはＰＤＨ酵素を導くために、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列を含むことができる。
【００４６】
そのような配列の役割が、特に、大部分が植物細胞の種々の区画中での蛋白の輸送に関連するレビューＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８年）の３８版に記載されている（植物細胞中の小胞への蛋白の選別；１２７〜１４４頁、核孔複合体；１４５〜１６２頁、葉緑体外皮膜中へのおよびそれを通過する蛋白移動；９１〜２０７頁；葉緑体中のチラコイド蛋白の標的用の複数経路；２０９〜２２１頁；植物内へのミトコンドリア蛋白輸送；３１１〜３３８頁）。
【００４７】
一つの実施態様によれば、トランジットペプチドは、葉緑体標的またはミトコンドリア標的シグナルであり得、続いて、葉緑体またはミトコンドリア内で開裂する。好ましくは、本発明のキメラ遺伝子は、ＨＰＰＤおよび／またはＰＤＨ酵素を葉緑体中に導くトランジットペプチドをコードする細胞下標的配列を含む。
【００４８】
トランジットペプチドは、一重または二重であってよい。二重トランジットペプチドは、中間配列により任意に分離される。例えば、本発明による好ましいトランジットペプチドは、転写の方向において、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ−末端部の配列の一部、および、続いて、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子の第２のトランジットペプチドをコードする配列を含む。そのような二重トランジットペプチドが、例えば、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載されている。
【００４９】
本発明によれば、キメラ遺伝子は、転写活性化因子（エンハンサー）、例えば、特許出願ＷＯ８７／０７６４４に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄ（１９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４（４）巻：１５９０〜７頁）に記載されているタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の、またはゴマノハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ、米国特許第５，９９４，５２１号）の転写活性化因子のような、プロモーターとコード配列との間に位置する、他の制御配列も含むことができる。本発明によるキメラ遺伝子は、イントロン、特に、単子葉植物中での遺伝子の発現を促進するイントロン、例えば、特許出願ＷＯ９９／３４００５に記載のイネアクチン遺伝子のイントロン１またはトウモロコシイントロンａｄｈ１も含むことができる。
【００５０】
本発明による植物および植物細胞は、形質転換された植物および植物細胞である。本発明による形質転換された植物および植物細胞を得るために、当業者は、植物を形質転換する多くの既知の方法の一つを用いることができる。
【００５１】
好ましくは、本発明による植物および植物細胞は、本発明による植物中で機能的でありＨＰＰＤまたはＰＤＨを過発現させる遺伝子を含むクローニング、発現および／または形質転換ベクターで形質転換される。
【００５２】
本発明の実施に有用であり得るベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスである。好ましくは、本発明による植物細胞または植物を形質転換するためのベクターはプラスミドである。通常、ベクターの主な性質は、それ自体を維持する性能および、特に複製開始点の存在故に植物細胞中で自己複製する性能であるはずである。宿主生物の安定な形質転換を得ることを目的として、ベクターをゲノム中に取り込むこともできる。そのようなベクターの選択および、本発明による遺伝子を前記ベクター中に挿入するための技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に広く記載されており、当業者の通常の知識の一部である。本発明で用いられるベクターは、本発明による遺伝子に加えて、選択マーカーをコードする別の遺伝子も含むのが有利である。選択マーカーは、効果的に形質転換された宿主生物、すなわち、ベクターを取り込んだ生物の選択を可能にする。用いることができる選択マーカーのうち、抗生物質に抵抗性を得るための遺伝子を含むマーカー、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｒｉｔｚら著、１９８３年、Ｇｅｎｅ第２５巻：１７９〜１８８頁）のマーカーを挙げることができるが、除草剤耐性遺伝子、例えば、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）への抵抗性を得るためのｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら著、１９９０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第１８（４）巻：１０６２頁）、グリホサートへの抵抗性を得るためのＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第５，１８８，６４２号）、あるいはイソオキサゾールへの抵抗性を得るためのＨＰＰＤ遺伝子（ＷＯ９６／３８５６７）を含むマーカーも挙げられる。ＧＵＳ酵素のような容易に確認できる酵素をコードする遺伝子、または形質転換細胞中での顔料の産生を制御する酵素または顔料をコードする遺伝子も挙げられる。そのような選択マーカー遺伝子が、特に、特許出願ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８、ＷＯ９６／３８５６７およびＷＯ９７／０４１０３に記載されている。
【００５３】
本発明による形質転換植物を得るために用いることができる形質転換方法のうち一つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および前述のベクターの存在下に形質転換させるべき植物の細胞または組織を配置することである（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎら著、１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第１６８（１）巻、１１１〜１１５頁；ＭｅｒｃｅｎｉｅｒおよびＣｈａｓｓｙ著、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ第７０（４）巻、５０３〜５１７頁）。電気穿孔は、形質転換させるべき細胞または組織とベクターを電場に付することからなるもう一つの方法である（ＡｎｄｒｅａｓｏｎおよびＥｖａｎｓ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６（７）巻、６５０〜６６０頁；ＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒ著、１９８９年、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３（１）巻、５６〜６２頁）。もう一つの方法は、ベクターを、マイクロインジェクションにより細胞または組織に直接注入することからなる（ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ著、１９８５年、Ｇｅｎｅ第３３（２）巻、１２１〜１３６頁）。「バイオリスティック」法を有利に用いることができる。これは、ベクターがその上に吸着された粒子を、細胞または組織に衝突させることからなる（Ｂｒｕｃｅら著、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６（２４）巻、９６９２〜９６９６頁；Ｋｌｅｉｎら著、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０（３）巻、２８６〜２９１頁；米国特許第４，９４５，０５０号）。好ましくは、植物細胞または組織の形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌を用いて、好ましくは、前記植物の細胞または組織にＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｋｎｏｐｆ、１９７９年、Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６巻、１４３〜１７３頁；Ｓｈａｗら著、１９８３年、Ｇｅｎｅ、第２３（３）巻：３１５〜３３０頁）またはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＢｅｖａｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ著、１９８２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻：３５７〜３８４頁；ＴｅｐｆｅｒおよびＣａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ著、１９８７年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、第４（１）巻、２４〜２８頁）を注入することにより行うことができる。好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの植物細胞または組織の形質転換は、Ｉｓｈｉｄａらが記載のプロトコール（１９９６年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１４（６）巻、７４５〜７５０頁）に従って行われる。当業者は、形質転換すべき植物の性質に従った適切な方法を選択する。
【００５４】
本発明の主題は、本発明による植物を産生する方法でもある。この方法は、前述のように形質転換された植物細胞から形質転換植物を再生することにある。再生は、植物の性質に依存する任意の適切な方法により得られる。
【００５５】
本発明は、これらの形質転換された植物の一部および、これらの植物の子孫も含む。「これらの植物の一部」という用語は、地面の上であっても下であっても、これらの植物の任意の器官を意味すると意図される。地面の上の器官は、茎、葉、および雄および雌の生殖器官を含む花である。地面の下の器官は、主に根であるが、塊茎でもあり得る。「子孫」という用語は、主に、これらの植物の互いの生殖により生じる胚芽を含む種子である。拡大解釈では、「子孫」という用語は、親の少なくとも一つが本発明による形質転換植物である交雑から誘導される各新しい世代において形成される全ての種子に適用される。子孫は、前記形質転換植物の植物性増殖により得ることもできる。本発明による種子は、殺真菌性、除草性、殺虫性、殺線虫性、殺菌性または殺ウイルス性から選択される活性を有する少なくとも一つの活性産物を含む農薬組成物で被覆することができる。
【００５６】
本発明による形質転換植物は、関心のある蛋白をコードする少なくとも一つの他の遺伝子を含むことができ、この他の遺伝子も、植物中で機能的でありＰＤＨおよび／またはＨＰＰＤを過発現させる遺伝子と同時、その前または後に植物のゲノム中に人工的に導入される。関心のある蛋白をコードする遺伝子のうち、除草剤への耐性を得るためのもう一つの酵素をコードする遺伝子、例えば、ビアラホスへの耐性を得るためのｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら著、ＮＡＲ、第１８巻：１０６２頁、１９９０年）をコードする遺伝子、またはグリホサートへの耐性を得るためのＥＰＳＰＳ酵素（米国特許第５，１８８，６４２号、ＷＯ９７／０４１０３）をコードする遺伝子を挙げることができる。殺虫性毒素をコードする遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細菌のδ−内毒素をコードする遺伝子も挙げることができる（例えば、国際特許出願ＷＯ９８／４０４９０）。疾患への抵抗性を得るための他の遺伝子、例えば、欧州特許出願第０ ５３１ ４９８号または米国特許第５，８６６，７７８号に記載のようなオキサラートオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子もこれらの植物中に含まれてよく、特許出願ＷＯ９７／３００８２、ＷＯ９９／２４５９４、ＷＯ９９／０２７１７、ＷＯ９９／５３０５３およびＷＯ９９／９１０８９に記載のような別の抗菌および／または抗真菌性ペプチドをコードする遺伝子も挙げられる。植物の栽培学的特徴をコードする遺伝子、特に、米国特許第５，５５２，３０６号、５，６１４，３１３および特許出願ＷＯ９８／４６７６３およびＷＯ９８／４６７６４に記載のようなδ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子または、特許出願ＷＯ００／０１８３３およびＷＯ００／３６１２７に記載のようなセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）酵素をコードする遺伝子も挙げることができる。
【００５７】
関心のある蛋白をコードするさらなる遺伝子を、ベクターにより取り込むことができる。この場合、ベクターは、ＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする本発明の遺伝子、およびもう一つのペプチドまたは関心のある蛋白をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む。
【００５８】
これらは、前述の通常の技術に従って、前記さらなる遺伝子を含む少なくとも一つの他のベクターにより取り込むこともできる。
【００５９】
本発明による植物は、一方が、本発明によるＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子を有し、他方が、少なくとも一つの他の関心のあるペプチドまたは蛋白をコードするもう一つの遺伝子を有する、植物の交雑により得ることもできる。
【００６０】
本発明により形質転換された植物は、単子葉植物または双子葉植物であってよい。好ましくは、これらの植物は、栽培学的に重要な植物である。単子葉植物は小麦、トウモロコシまたはイネであるのが良い。双子葉植物はナタネ、ダイズ、タバコまたは綿花であるのが良い。
【００６１】
本発明は、本発明の形質転換植物を栽培する方法であって、前記植物の栽培に適した耕地（ｆｉｅｌｄ）の領域に前記形質転換植物の種子を播くこと、前記種子または前記形質転換植物に実質的に影響を与えることなく前記耕地の領域にＨＰＰＤ阻害剤を含む少なくとも一種の除草剤組成物を適用すること、次に、所望の成熟度に達したときに栽培植物を採取すること、および任意に、採取した植物から種子を分離することから構成されることを特徴とする方法にも関する。
【００６２】
本発明は、ＨＰＰＤ阻害剤への耐性を植物に与えるための方法であって、前記植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする方法にも関する。
【００６３】
本発明は、プレニルキノン類、特にトコフェロール類、トコトリエノール類および／またはプラストキノン類の産生のための、本発明による植物または植物細胞の使用にも関する。
【００６４】
本発明は、植物中のプレニルキノン類の量を増加させる方法であって、前記植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする方法にも関する。
【００６５】
本発明は、プレニルキノン類を産生する方法であって、本発明による形質転換植物細胞または植物を、前記植物細胞または前記植物の成長および増殖に適した培養培地中で培養する工程を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００６６】
前記方法の特定の実施態様によれば、産生されたプレニルキノン類が好ましくは、ビタミンＥに代表されるトコフェロール類である。
【００６７】
前記方法の特定の実施態様によれば、産生されたプレニルキノン類は好ましくはトコトリエノール類である。
【００６８】
本発明の特定の実施態様によれば、プレニルキノン類を産生するための前記方法は、前記形質転換植物細胞によりまたは第１の工程で培養された前記形質転換植物により産生された前記プレニルキノン類を抽出するその後の工程を含む。
【００６９】
プレニルキノン類を産生するための前記方法を、本発明による形質転換植物細胞を用いて行う場合、前記植物細胞は、その生存および成長を促進する培養培地中で培養される。当業者は、前記植物細胞を最適に成長させるように前記培養培地の組成を決めることができる。例えば、植物細胞を培養するための方法および培地が、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの文献（１９６２年、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．第１５巻：４７３〜４９７頁）およびＧａｍｂｏｒｇらの文献（１９６８年、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５０巻：１５１〜１５９頁）に記載されている。
【００７０】
さらに、本発明による形質転換植物細胞を用いて前記方法を行う場合、産生された前記プレニルキノン類は、培養培地中に分泌されてよいしまたは分泌されなくてもよい。前記プレニルキノン類が培養培地中に分泌される場合、前記方法の抽出工程の前に、前記植物細胞の除去により培養培地を回収する工程を行うことができる。前記植物細胞の除去により培養培地を回収するそのような工程は、液体画分に含まれている固形分を分離する任意の手段により行うことができる。特に、濾過および遠心分離は、この工程を行うための適切な手段である。
【００７１】
プレニルキノン類が培養培地中に分泌されない場合、抽出工程は、培養された植物細胞の濃縮、単離された植物細胞の破壊、破壊された細胞抽出物の遠心分離および、その後の、前記プレニルキノン類を含む上澄みの回収からなる一連の工程により行うことができる。細胞破壊工程は、機械的粉砕（圧力差、超音波の作用、摩砕による）、酵素的溶解または浸透圧衝撃のような当業者に知られた技術を用いて行うことができ、前記技術は個々にまたは組み合わせて用いることができる。
【００７２】
プレニルキノン類を産生するための前記方法を本発明による形質転換植物を用いて行う場合、前記植物は、その生存およびその成長に適した基質上で培養され、前記基質は天然または人工的であり得る。天然基質は、例えば、土または土の混合物であってよく、前記植物は、例えば培養チャンバー中のような制御条件下、例えば温室中のような半制御条件下、または例えば露出地面のような天然条件下で培養することができる。人工基質は、例えば、液体基質または寒天基質であってよく、その組成物は、本発明による植物の生存および成長を促進する。当業者は、前記植物を最適に成長させるように前記人工基質の組成を決めることができる。植物を培養するための基質の例として、栄養要素Ｎ（窒素）、Ｐ（リン）およびＫ（カリウム）を含む栄養溶液、またはこれらの媒体上に植物を成長させる任意の他の市販または調節栄養溶液を注いだ岩綿または蛭石のような培地を挙げることができる。本発明による植物を人工基質上で培養する場合、これらは、通常、培養チャンバー中で制御条件下に培養される。
【００７３】
さらに、本発明による形質転換植物を用いて前記方法を行う場合、産生された前記プレニルキノン類は、通常、前記形質転換植物中に固定される。
【００７４】
本発明による形質転換植物または前記植物の一部は、ヒトまたは動物の食事を意図した食物組成物中に直接用いて取り込む、または、それらが含むプレニルキノン類の抽出を行うことができる。前述のように、「植物の一部」という用語は、地面の上であっても地面の下であっても、これらの植物の任意の器官を意味すると意図される。地面の上の器官は、茎、葉、および雄および雌の生殖器官を含む花、ならびに種子でもある。地面の下の器官は、主に根であるが、塊茎でもあり得る。本発明の好ましい実施態様によれば、種子は、食用を意図した形質転換植物の一部である。
【００７５】
本発明は、本発明による形質転換植物の種子も含み、この種子は、非形質転換植物の種子と比較してプレニルキノン類に富んでいる。さらに、本発明は、種子または本発明による形質転換植物の他の部分を含む食物組成物も含む。植物のこれらの部分、特に種子から産生された油も、本発明の主題である。
【００７６】
形質転換植物中で産生されたプレニルキノン類を回収するために、培養された植物の粉砕、粉砕植物材料の濾過および／または遠心分離、および、その後の、前記プレニルキノン類を含む上澄みの回収からなる一連の工程により抽出工程を行うことができ、前記回収は、脂質化合物の抽出からなることができる。好ましくは、粉砕工程は、機械的粉砕（圧力差、超音波の作用、摩砕による）からなり、その後、酵素的溶解または浸透圧衝撃を行うことができる。
【００７７】
本方法は、得られた植物細胞または植物の抽出物中に含まれるプレニルキノン類を精製する最終的工程を行うこともできる。前記プレニルキノン類の精製は、化合物を濃縮または分離する技術、特に、当業者に良く知られている微小濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーの技術により行うことができる。精製されたプレニルキノン類を得るために、当業者は、前記プレニルキノン類を含む精製画分を確認するために前記プレニルキノン類を測定する方法を用いることができる。この方法によれば、産生された前記プレニルキノン類は、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または有利には１００％の純度を有する。
【００７８】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明による形質転換植物は、植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子および植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子に加えて、植物中で機能的でありゲラニル−ゲラニルリダクターゼ（以下、ＧＧＲと呼ぶ）酵素を過発現させる遺伝子を含む。産生されたプレニルキノン類のうち、そのような植物は、トコトリエノール類およびプラストキノン類に比して、優先的に、トコフェロール類、特にビタミンＥを産生する。
【００７９】
ＧＧＲ酵素は、ゲラニル−ゲラニルピロホスフェートからフィチルピロホスフェートへの転化を触媒する酵素である。特定の実施態様によれば、植物中で機能的でありＧＧＲを過発現させる遺伝子は、植物ＧＧＲをコードする遺伝子のコード配列を含む。例えば、Ｋｅｌｌｅｒらの文献（１９９８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２５１（１−２）巻：４１３〜４１７頁）に公開されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＧＧＲをコードする配列、または、受入番号ＡＪ００７７８９（タバコ）、ＡＦ０６９３１８（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｎｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ）、Ｙ１４００４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびＱ５５０８７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３）により記載された配列を用いることができる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
以下の実施例により、本発明を説明することができるが、その範囲を制限するものではない。
【００８２】
これらの実施例で以下に記載の方法または工程の全てが、例示的なものであり、同じ結果を達成するために利用できる種々の方法のうちから選択される。この選択は、結果の質に影響を与えず、その結果、同じ結果を得るために当業者が適切な方法を用いることができる。特に、および実施例で別段の断りがない限り、用いられる全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌの文献（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）、Ａｕｓｕｂｅｌらの文献（１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、米国、第１巻および２巻）、およびＢｒｏｗｎの文献（１９９８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、英国）に記載の標準的プロトコールに従って行われる。植物分子生物学用の標準的材料および方法が、Ｒ．Ｄ．Ｄ．Ｃｒｏｙ（１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（英国）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（英国））に記載されている。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用の標準的材料および方法も、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒの文献（１９９５年、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州）およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎらの文献（２０００、ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｎｃｈ，第１版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、独国）に記載されている。
【実施例１】
【００８３】
ＨＰＰＤ活性の測定
Ｇａｒｃｉａらの文献（１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３２５巻、７６１〜７６９頁）またはＧａｒｃｉａらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載の方法によりＨＰＰＤ活性を測定することができる。
【実施例２】
【００８４】
プレフェナート脱水素酵素活性の測定
プレフェナート脱水素酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、３００μＭのプレフェナートおよび１ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰを含み合計体積が２００μｌである溶液中でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの形成を２５℃で、３４０ｎｍでの分光光度モニターにより測定する。
【実施例３】
【００８５】
ＨＰＰＤ過発現キメラ遺伝子の構築
ＨＰＰＤ阻害性除草剤への抵抗性を植物に付与するためにＨＰＰＤを過発現させるキメラ遺伝子を構築した。
【００８６】
これは、転写の方向において、欧州特許出願第０ ５０７ ６９８号に記載のような「二重ヒストン」プロモーター（ＰｄＨ４）、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄの文献（１９９０年；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻：１５９０〜１５９７頁）に記載のタバコエッチウイルス翻訳エンハンサー（ＴＥＶ）配列、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載のような最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）をコードする配列、特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤ遺伝子のコード部分、次いで、Ｂｅｖａｎらの文献（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）に記載のノパリンシンターゼ遺伝子のｎｏｓターミネーターを組み立てることから構成される。次に、アセンブリを、バイナリーベクターにクローニングし、以下の構造を有する。
【００８７】
【化１】
【実施例４】
【００８８】
ＰＤＨ過発現キメラ遺伝子の構築
キメラ遺伝子過発現ＰＤＨの構築は、翻訳の方向において、欧州特許出願第０ ５０７ ６９８号に記載のような「二重ヒストン」プロモーター（ＰｄＨ４）、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄの文献（１９９０年；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻：１５９０〜１５９７頁）に記載のタバコエッチウイルス翻訳エンハンサー（ＴＥＶ）配列、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載のような最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）をコードする配列、Ｍａｎｎｈａｕｐｔらの文献（１９８９年、Ｇｅｎｅ第８５巻、３０３〜３１１頁）に記載の酵母ＰＤＨ遺伝子のコード部分、およびＢｅｖａｎらの文献（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）に記載のノパリンシンターゼ遺伝子のｎｏｓターミネーターを組み立てることからなる。次に、アセンブリを、カナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含むバイナリーベクターｐＲＤ２２４にクローニングしてベクターｐＲＤ２２４−ＰＤＨを得る。このベクターは以下の構造を有する。
【００８９】
【化２】
【００９０】
次に、このバイナリーベクターを用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＥＨＡ１０５を形質転換し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＥＨＡ１０５−ｐＲＤ ２２４−ＰＤＨを得た。このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を用いて、タバコＰＢＤ６およびタバコＰＢＤ６−ＡＲＡ９を形質転換した（タバコは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現させるキメラ遺伝子で形質転換）。
【００９１】
形質転換された植物を、カナマイシン上で選択する。
【実施例５】
【００９２】
ＰＤＨを過発現している発現カセットでのタバコＰＢＤ６−ＡＲＡ９の形質転換
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物は、実施例３に記載のようなキメラ遺伝子で形質転換したタバコ植物であり、特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現している。ＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物を得るための方法が、Ｇａｒｃｉａらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載されている。実施例４に記載のようなＰＤＨを過発現しているキメラ遺伝子で形質転換されたＰＢＤ６−ＡＲＡ９系を、ＡＲＡ９−ＰＤＨ系と呼ぶ。
【００９３】
５．１：形質転換
ｆｏｌｉａｒ ｄｉｓｋ技術（Ｈｏｒｓｃｈら著、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２７巻：１２２９〜１２３１頁）に従って、非発癌遺伝子であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ１０５−ｐＲＤ２２４−ＰＤＨを用いて形質転換を行う。
【００９４】
５．２：再生
３０ｇ／ｌのスクロースおよび３５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）基礎培地上で、外植葉からＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物を再生する。外植葉は、温室中の植物から得、ｆｏｌｉａｒ ｄｉｓｋ技術（Ｈｏｒｓｃｈら著、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２７巻：１２２９〜１２３１頁）に従って３つの連続工程で再生する：
・第１の工程は、３０ｇ／ｌのスクロースと０．０５ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＡＮＡ）および２ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）も含むＭＳ基礎培地上で１５日間、そして２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンで若枝を誘導することを含む。
【００９５】
・この工程中に形成された緑若枝を、次に、３０ｇ／ｌのスクロースおよび２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンが加えられているが、ホルモンを含まないＭＳ培地上で１０日間培養することにより成長させる。
【００９６】
・続いて成長した若枝を除去し、次に、塩、ビタミンおよび糖の半分の量、２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含み、ホルモンを含まないＭＳ発根媒体上で培養する。約１５日後、発根した若枝を温室内に移す。
【００９７】
形質転換された植物の耐性を、ジケトニトリル（ＤＫＮ）で処理した土の上に播種することにより調べる。
【実施例６】
【００９８】
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物のＨＰＰＤ阻害剤への耐性
６．１．ジケトニトリル（ＤＫＮ）への耐性
１３個のＡＲＡ９−ＰＤＨ系および、形質転換用の出発材料として用いたＰＢＤ６−ＡＲＡ９系を、ＤＫＮの濃度が５、１０および３２ｐｐｍと増加するように蒔いた。
【００９９】
ＤＫＮが５ｐｐｍの場合、全てのＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨ系は、特にそれら全てがＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現するので、抵抗性である。ＤＫＮが１０ｐｐｍの場合、親系ＰＢＤ６−ＡＲＡ９が完全に阻害される。一方、全てのＡＲＡ９−ＰＤＨ系は、阻害される一つ（ＡＲＡ９−ＰＤＨ４）のみを除いて、優れた抵抗性である。ＤＫＮが３２ｐｐｍの場合、１０ｐｐｍのＤＫＮに抵抗性であったＡＲＡ９−ＰＤＨ系の全てが、抵抗性であり正常に成長する植物を与えるが、組換えＨＰＰＤのみを発現する親系ＰＢＤ６−ＡＲＡ９は完全に阻害される。最良の耐性を示す系は、ＡＲＡ９−ＰＤＨ１４、ＡＲＡ９−ＰＤＨ１８およびＡＲＡ９−ＰＤＨ２４系である。
【０１００】
６．２．スルコトリオンおよびメソトリオンへの耐性
ＨＰＰＤ阻害剤スルコトリオンおよびメソトリオンを用いて同じ実験を行った。ＡＲＡ９−ＰＤＨ１８系は、３μＭのメソトリオンおよび６μＭのスルコトリオンに耐性であるが、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ型の野生型タバコ系は、０．３７５μＭのこれら二つの化合物に感受性であることが分かった。
【実施例７】
【０１０１】
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物中でのトコフェロールおよびトコトリエノール水準の測定
分析した植物の各々の中間葉および幼若葉のサンプルから、Ｆｏｌｃｈの方法（Ｆｏｌｃｈら著、１９５７頁、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２６〜４９７頁）により脂質抽出物を得る。次に、それらのトコフェロールおよびトコトリエノール含量の分析を、Ｆｒａｚｅｒらの方法（２０００年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第２４巻：５５１〜５５８頁）に従ったＨＰＬＣにより行う。次に、これらの含量を、対照産物に関して定量し、次に、固形分１ｇ当たりのμｇで表す。結果を表１に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
これらの結果は、ＰＤＨおよびＨＰＰＤ酵素を過発現させるキメラ遺伝子で組み合わせて形質転換したＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物は、ＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子で単独形質転換したＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物と比べて、プレニルキノン類、特に、トコフェロール類およびトコトリエノール類を多量に与えることを明らかに示している。トコトリエノール類について最高の効果が得られる。この効果は、分裂組織に富む幼若葉においていっそう顕著である。この組織特異性の原因は、ＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物を作るために用いられるプロモーターであって、植物の迅速成長組織、特に分裂組織（ＰｄＨ４）において優先的に発現されるプロモーターに関係する。他の型のプロモーターの使用により、植物の他の組織において同様の効果を得ることが可能となるはずである。
【０１０４】
さらに、種々のＡＲＡ９−ＰＤＨ系の間で観察される相違は、異なる形質転換事象が含まれるという事実に由来する。ホモ接合性系の成長を意図した最適系の間での交雑は、プレニルキノン類の産生、およびＨＰＰＤ阻害剤への耐性に関して同等である系を得ることを可能にするはずである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物、特に、プラストキノン類、トコトリエノール類およびトコフェロール類を、形質転換されていない同じ植物よりも多量に産生する形質転換植物に関する。本発明は、これらの植物を産生するための方法およびこれらの植物を培養するための方法にも関する。本発明の植物は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素（以下、ＨＰＰＤと呼ぶ）の阻害剤である除草剤に耐性となる特性も有する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルキノン類は、特にプラストキノン類、トコフェロール類およびトコトリエノール類を含む、脂質親和性を有する化合物の大きな群である。植物中で、プレニルキノン類は、ホモゲンチサート経路を介して合成される。
【０００３】
最も良く知られているプレニルキノンはビタミンＥ、すなわちα−トコフェロールであり、ヒトまたは動物の食事の必須成分であり、特に、ビタミンＥを天然には生成しないが栄養的に必要としている哺乳動物に必須である。ビタミンＥの最も理解されている効果は、細胞膜脂質へのその抗酸化作用である（Ｅｐｓｔｅｉｎら著、１９６６年、Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻：３２２〜３３５頁；Ｋａｍｅｌ−ＥｌｄｉｎおよびＡｐｐｅｌｑｖｉｓｔ著、１９９６年、Ｌｉｐｉｄｓ第３１巻：６７１〜７０１頁）。
【０００４】
ビタミンＥ以外に、ヒトおよび動物の食事において必須ではないがトコトリエノール類が、ビタミンＥよりも著しい特に有利な抗酸化特性を有する（Ｋａｍａｔら著、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７０巻、１３１〜１３７頁）。これらの化合物は、特に、細胞をフリーラジカルから保護すること、および心臓血管疾患または癌の発生を防ぐことも知られている（Ｐａｃｋｅｒら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１（２）巻：３６９８〜３７３８頁）。さらに、トコトリエノール類は、エストロゲン受容体の増殖の阻害による抗癌活性、すなわち、トコフェロール類が持っていない活性を示す（Ｇｕｔｈｒｉｅら著、１９９７頁、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２７巻：５４４〜５４８頁）。これらは、トコフェロール類よりもかなり優れた低コレステロール血症活性も示し（Ｐｅａｒｃｅら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３５巻、３５９５〜３６０６頁；Ｑｕｒｅｓｈｉら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１巻：２６０６〜２６１８頁）、これにより、動脈硬化を抑えることがより可能になっている。
【０００５】
プラストキノン類は、ヒトまたは動物の健康における役割が知られていないが、植物においては必須の役割を果たす。これらの分子は、葉緑素膜中に存在し、それらの機能は、光合成反応中の電子移動である（Ｇｒｕｍｂａｃｈ著、１９８４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｉｐｉｄｓ、ＳｉｅｇｅｎｔｈａｌｅｒおよびＥｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ編）。
【０００６】
さらに、プレニルキノン類の量の増加が、植物に、酸化的ストレス、特に、冷気、乾燥または強度の光に対する、より優れた抵抗性を付与する。
【０００７】
植物および光合成性生物において、通常、ホモゲンチサートがプレニルキノン類の芳香族前駆体を構成する。ホモゲンチサートは、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ酵素（以下、ＨＰＰＤと称する）の産物である。大部分の生物において、ＨＰＰＤは、芳香族アミノ酸チロシンの異化分解経路に関連する酵素である（Ｇｏｏｄｗｉｎ著、１９７２年、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ、Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｂ．Ｌ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、１〜９４）。ＨＰＰＤは、チロシン分解産物であるｐ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）のホモゲンチサートへの転化反応を触媒する。
【０００８】
大部分の植物は、アロゲナートを介してチロシンを合成する（ＡｂｏｕＺｅｉｄら著、１９９５年、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂ第４１巻：１２９８〜１３０２頁；Ｂｏｎｎｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第３６巻、１０１３〜１０２２頁；Ｂｙｎｇら著、１９８１年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第６巻：１２８９〜１２９２頁；ＣｏｎｎｅｌｙおよびＣｏｎｎ著、１９８６年、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ第４１ｃ：６９〜７８頁；Ｇａｉｎｅｓら著、１９８２年、Ｐｌａｎｔｓ第１５６巻：２３３〜２４０頁）。これらの植物において、ＨＰＰは、チロシンの分解からのみ誘導される。一方、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）のような生物において、ＨＰＰはチロシン前駆体であり、プレフェナートをＨＰＰに転化するプレフェナート脱水素酵素（以下、ＰＤＨと呼ぶ）の作用により合成される（Ｌｉｎｇｅｎｓら著、１９６７年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ第１巻：３６３〜３７４頁；ＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｏｎ著、１９８２年、Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ第７０１巻：２０４〜２１１頁）。従って、これらの生物において、ＨＰＰの産生は芳香族アミノ酸生合成経路（シキマート経路）に直接結びつき、チロシン分解経路には結びつかない（図１参照）。
【０００９】
植物によるプレニルキノン類の生合成を増加させるために、本特許出願の発明者は、前記前駆体の生合成をＰＤＨ酵素の過発現による「シキマート」経路に結びつけることにより、これらの植物の細胞内へのＨＰＰ前駆体の流入を増加させようとした。予想される効果は、ＨＰＰ前駆体のより大きな流れであり、全体としてプレニルキノン生合成を増加させるはずである。
【００１０】
ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、前記植物によるプレニルキノン類の産生の増加を可能にすることが実際上注目された。この増加は、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物が、ＨＰＰＤ酵素も過発現する植物である場合、非常に著しい。
【００１１】
ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子による植物の形質転換が、ＨＰＰＤ阻害剤への前記植物の耐性の増加を可能にすることも注目された。この耐性の増加は、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物が、ＨＰＰＤ酵素も過発現する植物である場合、非常に著しい。
【００１２】
この数年間において、この酵素が新規科の「脱色性」除草剤の標的であることが示された後、ＨＰＰＤへの興味が著しく増加した。その標的がＨＰＰＤであるそのような除草剤は、特にイソオキサゾール（欧州特許第４１８ １７５号、欧州特許第４７０ ８５６号、欧州特許４８７ ３５２号、欧州特許第５２７ ０３６号、欧州特許５６０ ４８２号、欧州特許６８２ ６５９号、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、イソキサフルトール、トウモロコシ用の選択的除草剤、ジケトニトリル（欧州特許第４９６ ６３０号、欧州特許第４９６ ６３１号）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５ ５０５号、欧州特許第６２５ ５０８号、米国特許第５，５０６，１９５号）、特にスルコトリオンまたはメソトリオン、あるいはピラゾリネートである。
【００１３】
その標的が植物の生命を維持する代謝経路に含まれる酵素である除草剤の利点の一つは、離れた系統発生的由来の植物に対する広い活性範囲である。しかしながら、そのような除草剤は、不必要な植物すなわち「雑草」を除去するために作物に適用されたときに、栽培植物にも作用するという大きな欠点も有する。この欠点は、前記除草剤に耐性のある栽培植物を用いることにより克服することができる。そのような植物は、通常、それらの組織中で酵素を過発現するように前記除草剤への抵抗性のための酵素をコードする遺伝子をそのゲノム中に導入することによる遺伝子工学により得られる。
【００１４】
今までに、除草剤に耐性の植物を作るために、遺伝子工学を用いる３つの主要な手法が用いられてきた。第１の手法は、解毒性酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにより除草剤を解毒することにある。この酵素は、除草剤またはその活性代謝産物を、非毒性分解産物、例えば、ブロモキシニルまたはベースト（ｂａｓｔｅ）への耐性用の酵素に転化する（欧州特許第２４２ ２３６号、欧州特許第３３７ ８９９号）。第２の手法は、除草剤またはその活性代謝産物への感受性が低くなるように突然変異された標的酵素、例えば、グリホサート耐性酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにある（欧州特許第２９３ ３５６号；Ｐａｄｇｅｔｔｅら著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻：３３頁）。第３の手法は、植物中で、大量の、可能なら植物に入る除草剤の量よりもかなり多い量の標的酵素を産生するように、感受性標的酵素を過発現することにある。この手法は、その阻害剤の存在にも拘わらず、機能性酵素の充分な水準を維持することを可能にする。
【００１５】
この第３の手法を実行し、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性の植物を得ることを可能にした（ＷＯ９６／３８５６７）。さらに、感受性（非突然変異）標的酵素を過発現させるこの単純な手法を初めてうまく用いて、除草剤への作物学的水準での耐性を植物に付与した。
【００１６】
大部分のＨＰＰＤ阻害除草剤が、ゆっくりかつ実質的に不可逆的に結合する基質に関して競合的阻害剤であることも知られている（Ｅｌｌｉｓら著、１９９６年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻：２４〜２７頁；Ｖｉｖｉａｎｉら著、１９９８年、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第６２巻：１２５〜１３４頁）。従って、それらの作用形式は、その結合部位に選択的に結合することによりＨＰＰと競合することにある。この結合の結果は、ホモゲンチサート合成を細胞が停止することである。
【００１７】
ＰＤＨ酵素の過発現によるＨＰＰＤ基質ＨＰＰの流入の増加を利用する本発明は、除草剤耐性植物、特に、ＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である植物を得るための第４の可能な手法を構成するようである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許第４１８１７５号明細書
【特許文献２】欧州特許第４７０８５６号明細書
【特許文献３】欧州特許４８７３５２号明細書
【特許文献４】欧州特許第５２７０３６号明細書
【特許文献５】欧州特許５６０４８２号明細書
【特許文献６】欧州特許６８２６５９号明細書
【特許文献７】米国特許第５４２４２７６号明細書
【特許文献８】欧州特許第４９６６３０号明細書
【特許文献９】欧州特許第４９６６３１号明細書
【特許文献１０】欧州特許第６２５５０５号明細書
【特許文献１１】欧州特許第６２５５０８号明細書
【特許文献１２】米国特許第５５０６１９５号明細書
【特許文献１３】欧州特許第２４２２３６号明細書
【特許文献１４】欧州特許第３３７８９９号明細書
【特許文献１５】欧州特許第２９３３５６号明細書
【特許文献１６】国際公開第９６／３８５６７号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｅｐｓｔｅｉｎら著、１９６６年、Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻：３２２〜３３５頁
【非特許文献２】Ｋａｍｅｌ−ＥｌｄｉｎおよびＡｐｐｅｌｑｖｉｓｔ著、１９９６年、Ｌｉｐｉｄｓ第３１巻：６７１〜７０１頁
【非特許文献３】Ｋａｍａｔら著、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７０巻、１３１〜１３７頁
【非特許文献４】Ｐａｃｋｅｒら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１（２）巻：３６９８〜３７３８頁）
【非特許文献５】Ｇｕｔｈｒｉｅら著、１９９７頁、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２７巻：５４４〜５４８頁
【非特許文献６】Ｐｅａｒｃｅら著、１９９２年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３５巻、３５９５〜３６０６頁
【非特許文献７】Ｑｕｒｅｓｈｉら著、２００１年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１３１巻：２６０６〜２６１８頁）
【非特許文献８】Ｇｒｕｍｂａｃｈ著、１９８４年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｉｐｉｄｓ、ＳｉｅｇｅｎｔｈａｌｅｒおよびＥｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ編
【非特許文献９】Ｇｏｏｄｗｉｎ著、１９７２年、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ、Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｂ．Ｌ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、１〜９４）
【非特許文献１０】ＡｂｏｕＺｅｉｄら著、１９９５年、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂ第４１巻：１２９８〜１３０２頁
【非特許文献１１】Ｂｏｎｎｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第３６巻、１０１３〜１０２２頁
【非特許文献１２】Ｂｙｎｇら著、１９８１年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第６巻：１２８９〜１２９２頁
【非特許文献１３】ＣｏｎｎｅｌｙおよびＣｏｎｎ著、１９８６年、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ第４１ｃ：６９〜７８頁
【非特許文献１４】Ｇａｉｎｅｓら著、１９８２年、Ｐｌａｎｔｓ第１５６巻：２３３〜２４０頁
【非特許文献１５】Ｌｉｎｇｅｎｓら著、１９６７年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ第１巻：３６３〜３７４頁
【非特許文献１６】ＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒおよびＭｏｒｒｉｓｓｏｎ著、１９８２年、Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ第７０１巻：２０４〜２１１頁
【非特許文献１７】Ｐａｄｇｅｔｔｅら著、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻：３３頁
【非特許文献１８】Ｅｌｌｉｓら著、１９９６年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻：２４〜２７頁
【非特許文献１９】Ｖｉｖｉａｎｉら著、１９９８年、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第６２巻：１２５〜１３４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従って、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２１】
特定の実施態様によれば、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含み、植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子は除くことを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２２】
もう一つの特定の実施態様によれば、本発明は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、および
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換された植物からなることを特徴とする形質転換植物に関する。
【００２３】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の形質転換植物は形質転換植物細胞により代表され得る。
【００２４】
「形質転換植物」または「形質転換植物細胞」という用語は、本発明によれば、形質転換植物または任意の他の生物に由来し得る少なくとも一つの導入遺伝子をそのゲノム中に安定して取り込んだ植物または植物細胞を意味することを関心のある。好ましくは、本発明による導入遺伝子は、形質転換植物以外の少なくとも一つの生物に由来する要素を含むキメラ遺伝子により代表される。特に、本発明による導入遺伝子は、他の要素のうち、異なる生物に由来する少なくとも一つのプロモーター、コード配列、およびターミネーターを含んでよく、前記生物も形質転換植物と異なる。
【００２５】
「植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「ＰＤＨ」という用語は、プレフェナートをＨＰＰに転化するＰＤＨ活性を示す任意の天然または突然変異したＰＤＨ酵素を意味するものと解釈されるべきである。特に、前記ＰＤＨ酵素は、任意の型の生物に由来し得る。ＰＤＨ活性を有する酵素は、プレフェナート基質の量の減少の測定または、酵素的反応から誘導される産物、すなわちＨＰＰまたは補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの一方の蓄積の測定を可能にする任意の方法により確認することができる。特に、ＰＤＨ活性は、実施例２に記載の方法により測定することができる。
【００２６】
ＰＤＨ酵素をコードしている多くの遺伝子が文献に記載されており、その配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／上で確認することができる。Ｍａｎｎｈａｕｐｔらが記載（１９８９年、Ｇｅｎｅ第８５巻、３０３〜３１１頁）のような酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（受入番号Ｓ４６０３７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、特に、Ｈｅｎｎｅｒらが記載（１９８６年、Ｇｅｎｅ第４９（１）巻、１４７〜１５２頁）のような種Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（受入番号Ｐ２０６９２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、特に、Ｈｕｄｓｏｎらが記載（１９８４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８０（４）巻、１０２３〜１０５１頁）のような種Ｅ．ｃｏｌｉ（受入番号ＫＭＥＣＴＤ）、またはＥｒｗｉｎｉａ属の細菌、特に、Ｘｉａらが記載（１９９２年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第１３８（７）巻、１３０９〜１３１６頁）のような種Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ（受入番号Ｓ２９９３４）のＰＤＨ酵素をコードする遺伝子が特に知られている。
【００２７】
「植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「ＨＰＰＤ」という用語は、ＨＰＰをホモゲンチサートに転化するＨＰＰＤ活性を示す任意の天然、突然変異またはキメラＨＰＰＤ酵素を意味するものと解釈されるべきである。ＨＰＰＤの酵素活性は、ＨＰＰ基質の量の減少の測定または、酵素反応から誘導される産物、すなわちホモゲンチサートの蓄積の測定を可能にする任意の方法により測定することができる。特に、実施例１およびＧａｒｃｉａｌらの文献（１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３２５巻、７６１〜７６９頁）またはＧａｒｃｉａｌらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載の方法によりＨＰＰＤ活性を測定することができる。
【００２８】
特に、前記ＨＰＰＤ酵素は、任意の型の生物に由来し得る。ＨＰＰＤ酵素をコードする多くの遺伝子、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｒｕｅｔｓｃｈｉら著、１９９２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２０５巻、４５９〜４６６頁、ＷＯ９６／３８５６７）のような細菌の、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＷＯ９６／３８５６７、遺伝子バンク ＡＦ０４７８３４）またはニンジン（ＷＯ９６／３８５６７、遺伝子バンク ８７２５７）のような植物の、Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ（遺伝子バンク ＣＯＩＴＲＰ）の、またはマウスもしくはブタのような哺乳動物の遺伝子が文献に記載されている。
【００２９】
本発明によれば、「突然変異したＨＰＰＤ」という用語は、天然ＨＰＰＤに関して少なくとも一つの突然変異を有すると共に、対応する天然ＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害性除草剤への耐性がより大きな特性を有するＨＰＰＤを意味することを意図している。この突然変異したＨＰＰＤは、特許出願ＷＯ９９／２４５８５に記載のように、そのＣ末端部分において突然変異したＨＰＰＤであることが有利である。好ましくは、突然変異したＨＰＰＤは、特許出願ＷＯ９９／２４５８５に記載のように、突然変異Ｗ３３６を含む。
【００３０】
「キメラＨＰＰＤ」という用語は、種々のＨＰＰＤに由来する要素を含むＨＰＰＤを意味することを意図している。そのようなキメラＨＰＰＤは、特に、特許出願ＷＯ９９／２４５８６に記載されている。
【００３１】
このＨＰＰＤは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｅｓｃｅｎｓ（ＷＯ９６／３８５６７）またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＷＯ９６／３８５６７）からのＨＰＰＤであるのが有利である。
【００３２】
「植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子」という表現において、「フィチル／プレニルトランスフェラーゼ」という用語は、特許出願ＷＯ０２／０８９５６１に記載のようなフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を意味すると解されるべきである。特に、前記「植物中で機能的でありフィチル／プレニルトランスフェラーゼ酵素を過発現させる遺伝子」は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｌｒ１７３６遺伝子（ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏｂａｓｅ上のＣｙａｎｏｂａｓｅに記載の配列）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡＴＰＴ２遺伝子（Ｓｍｉｔｈら著、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第１１巻、８３〜９２頁）から選択される遺伝子からなる。
【００３３】
本発明による形質転換された植物または植物細胞は、非形質転換植物よりも多くの量のプレニルキノン類を産生する。好ましくは、本発明による形質転換された植物または植物細胞は、植物中で機能的でありＰＤＨまたはＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子の一つのみで形質転換された植物よりも多くの量のプレニルキノン類を産生する。好ましくは、本発明による形質転換された植物または植物細胞により産生されるプレニルキノン類は、トコフェロール類および／またはトコトリエノール類および／またはプラストキノン類である。トコフェロール類、トコトリエノール類およびプラストキノン類の量を測定するための多くの方法が知られており、当業者が利用できる。例えば、トコフェロール類、トコトリエノール類およびプラストキノン類は、Ｆｒａｚｅｒらの方法（２０００年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第２４巻：５５１〜５５８頁）により測定することができる。本発明によれば、「より多くの量」という用語は、好ましくは少なくとも２倍多い、好ましくは少なくとも５倍多い、好ましくは少なくとも１０倍多い、好ましくは少なくとも５０倍多い、好ましくは少なくとも１００倍多い、好ましくは少なくとも５００倍多い、および好ましくは少なくとも１０００倍多い量を意味すると解される。
【００３４】
本発明による形質転換された植物は、ＨＰＰＤ阻害剤に耐性である効果も有する。
【００３５】
「ＨＰＰＤ阻害剤に耐性の形質転換された植物」という用語は、形質転換されていない同じ植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量（ｄｏｓｅ）に関して耐性である特徴を少なくとも示す前述のような形質転換植物を意味すると意図される。形質転換されていない植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量は、使用するＨＰＰＤ阻害剤に、および前記阻害剤を適用する植物に、および前記植物に適用する段階にも依存する。しかしながら、当業者は、ＨＰＰＤ阻害剤について通常そうであるように、植物への「脱色」効果により先行される可能性のある、前記阻害剤の適用からある日数後に死ぬことになる前記阻害剤の致死効果に、または、植物の成長低下という効果に、前記阻害剤の毒性が対応し得るという知識においてそのような投与量を決めることができる。好ましくは、本発明によるＨＰＰＤ阻害剤に耐性の形質転換された植物は、植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子のみで形質転換された同じ植物に通常毒性であるＨＰＰＤ阻害剤の投与量に関して耐性である。
【００３６】
「ＨＰＰＤ阻害剤」という用語は、ＨＰＰをホモゲンチサートに転化させるその天然の酵素的活性を一時的にまたは永続的に阻害するように植物ＨＰＰＤ酵素に結合することができる天然または人工由来の任意の化合物を意味すると意図される。この特性故に、本発明のＨＰＰＤ阻害剤は、それが適用される植物の死または成長阻害を誘発し、前記死は、通常、前記植物の「脱色」の後に生じる。
【００３７】
ＨＰＰＤ阻害剤の例として、イソオキサゾール（欧州特許第４１８ １７５号、欧州特許第４７０ ８５６号、欧州特許第４８７ ３５２号、欧州特許第５２７ ０３６号、欧州特許第５６０ ４８２号、欧州特許第６８２ ６５９号、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、イソキサフルトール、トウモロコシ用の選択的除草剤、ジケトニトリル類（以下、ＤＫＮｓと呼び、欧州特許第４９６ ６３０号、欧州特許第４９６ ６３１号に記載）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン類（欧州特許第６２５ ５０５号、欧州特許第６２５ ５０８号、米国特許第５，５０６，１９５号）、特にスルコトリオンまたはメソトリオン、あるいはピラゾリネートを挙げることができる。
【００３８】
本発明によれば、「植物中で機能的である遺伝子」という表現は、植物中で機能することができる遺伝子を意味すると意図される。植物中で機能することができる遺伝子は、前記植物の少なくとも一つの組織中でその遺伝子がコードする蛋白を発現することができる遺伝子である。特に、本発明による植物中で機能的である遺伝子は、ＰＤＨおよびＨＰＰＤ酵素を過発現させ得る。蛋白の過発現は、形質転換されていない同じ植物中におけるよりも高い水準での形質転換植物の組織中でのこの蛋白の過発現を意味し、この水準は、前記植物の同一の発育段階において測定される。好ましくは、本発明による植物中で機能的な遺伝子は、それが導入される植物以外の生物に由来する要素を含み得るキメラ遺伝子である。
【００３９】
本発明による植物中で機能的である遺伝子は、好ましくは、少なくとも、互いに機能的に結合している、植物中で機能的であるプロモーター、ＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする配列、およびこの同じ植物中で機能的であるターミネーター要素を含むキメラ遺伝子である。キメラ遺伝子が含み得る種々の要素は、第１に、蛋白の転写、翻訳および成熟用の制御要素、例えば、プロモーター、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列、またはポリアデニル化シグナルを構成するターミネーター要素であり、第２に、蛋白をコードする配列である。「互いに機能的に結合」という発現は、その機能が調整されてコード配列を発現させるように、キメラ遺伝子の前記要素が互いに結合していることを意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を提供することができる場合、コード配列に機能的に結合される。本発明によるキメラ遺伝子およびその種々の要素のアセンブリの構築は、当業者によく知られている技術、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の技術を用いて行うことができる。キメラ遺伝子を構成する制御要素の選択は、それらがその中で機能すべき植物に本質的に依存し、当業者は、所定の植物中で機能的である制御要素を選択することができる。
【００４０】
本発明によるキメラ遺伝子が含み得るプロモーターは、構成的に、誘発的に、空間的にまたは時間的に制御することができる。
【００４１】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる構成的プロモーターのうち、例えば、オクトピンシンターゼ遺伝子またはノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｓａｎｄｅｒｓら著、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１５巻、１５４３〜１５４８頁）のような細菌プロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの１９Ｓまたは３５Ｓ ＲＮＡの転写を制御する遺伝子のプロモーター（ＣａＭＶ；Ｌａｗｔｏｎら著、１９８７年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第９巻、３１５〜３２４頁；Ｏｄｅｌｌら著、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ第３１３頁、８１０〜８１２頁）のようなウイルスプロモーター、カッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター（ＣｓＶＭＶ；特許出願ＷＯ９７／４８８１９に記載）を挙げることができる。植物由来のプロモーターのうち、リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子のプロモーター、欧州特許第０ ５０７ ６９８号に記載のようなヒストン遺伝子のプロモーター、またはイネアクチン遺伝子のプロモーター（Ｗａｎｇら著、１９９２年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１２（８）巻：３３９９〜３４０６頁；米国特許第５，６４１，８７６号）が挙げられる。
【００４２】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる誘発性プロモーターのうち、例えば、オーキシン結合蛋白をコードする遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｗｏｂら著、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第４（３）巻：４２３〜４３２頁）、ＵＤＰ−グルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のプロモーター（Ｒａｌｓｔｏｎら著、１９８８年、Ｇｅｎｅｔ．第１１９（１）巻：１８５〜１９７頁）、ＭＩＰ蛋白分解酵素阻害剤をコードする遺伝子のプロモーター（Ｃｏｒｄｅｒｏら著、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第６（２）巻、１４１〜１５０頁）、またはグリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素をコードする遺伝子のプロモーター（Ｍａｒｔｉｎｅｚら著、１９８９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２０８（４）巻、５５１〜５６５頁；Ｑｕｉｇｌｅｙら著、１９８９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第２９（５）巻、４１２〜４２１頁；Ｋｏｈｌｅｒら著、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２９（６）巻、１２９３〜１２９８年）を挙げることができる。
【００４３】
本発明のキメラ遺伝子において用いることができる組織特異的プロモーターのうち、例えば特許出願ＷＯ００／２９５９４に記載のような根特異的プロモーター、特許出願ＷＯ９８／２２５９３、ＷＯ９９／１５６７９またはＷＯ９９／４３８１８に記載のような花特異的プロモーター、果実特異的プロモーター、特に、特許出願ＷＯ９１／１３９９３、ＷＯ９２／１７５８０、ＷＯ９８／４５４６０、ＷＯ９８／４５４６１またはＷＯ９９／１６８９０に記載のような種子特異的プロモーターを挙げることができる。
【００４４】
本発明のキメラ遺伝子で用いることができるターミネーター要素のうち、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のノパリンシンターゼをコードする遺伝子のｎｏｓターミネーター要素（Ｂｅｖａｎら著、１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）または欧州特許出願第０ ６３３ ３１７号に記載のようなヒストン遺伝子のターミネーター要素を挙げることができる。
【００４５】
キメラ遺伝子は、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）標的配列も含むことができる。そのような、ＨＰＰＤ酵素またはＰＤＨ酵素をコードする配列の上流または下流に位置する配列は、前記ＨＰＰＤまたはＰＤＨ酵素を、特異的に、宿主生物の細胞区画内に導くことを可能にする。例えば、キメラ遺伝子は、ミトコンドリア、プラスト、小胞体または小胞のような細胞質の特定の区画にＨＰＰＤおよび／またはＰＤＨ酵素を導くために、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドをコードする配列を含むことができる。
【００４６】
そのような配列の役割が、特に、大部分が植物細胞の種々の区画中での蛋白の輸送に関連するレビューＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８年）の３８版に記載されている（植物細胞中の小胞への蛋白の選別；１２７〜１４４頁、核孔複合体；１４５〜１６２頁、葉緑体外皮膜中へのおよびそれを通過する蛋白移動；９１〜２０７頁；葉緑体中のチラコイド蛋白の標的用の複数経路；２０９〜２２１頁；植物内へのミトコンドリア蛋白輸送；３１１〜３３８頁）。
【００４７】
一つの実施態様によれば、トランジットペプチドは、葉緑体標的またはミトコンドリア標的シグナルであり得、続いて、葉緑体またはミトコンドリア内で開裂する。好ましくは、本発明のキメラ遺伝子は、ＨＰＰＤおよび／またはＰＤＨ酵素を葉緑体中に導くトランジットペプチドをコードする細胞下標的配列を含む。
【００４８】
トランジットペプチドは、一重または二重であってよい。二重トランジットペプチドは、中間配列により任意に分離される。例えば、本発明による好ましいトランジットペプチドは、転写の方向において、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ−末端部の配列の一部、および、続いて、色素体中に位置する酵素をコードする植物遺伝子の第２のトランジットペプチドをコードする配列を含む。そのような二重トランジットペプチドが、例えば、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載されている。
【００４９】
本発明によれば、キメラ遺伝子は、転写活性化因子（エンハンサー）、例えば、特許出願ＷＯ８７／０７６４４に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄ（１９９０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４（４）巻：１５９０〜７頁）に記載されているタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の、またはゴマノハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ、米国特許第５，９９４，５２１号）の転写活性化因子のような、プロモーターとコード配列との間に位置する、他の制御配列も含むことができる。本発明によるキメラ遺伝子は、イントロン、特に、単子葉植物中での遺伝子の発現を促進するイントロン、例えば、特許出願ＷＯ９９／３４００５に記載のイネアクチン遺伝子のイントロン１またはトウモロコシイントロンａｄｈ１も含むことができる。
【００５０】
本発明による植物および植物細胞は、形質転換された植物および植物細胞である。本発明による形質転換された植物および植物細胞を得るために、当業者は、植物を形質転換する多くの既知の方法の一つを用いることができる。
【００５１】
好ましくは、本発明による植物および植物細胞は、本発明による植物中で機能的でありＨＰＰＤまたはＰＤＨを過発現させる遺伝子を含むクローニング、発現および／または形質転換ベクターで形質転換される。
【００５２】
本発明の実施に有用であり得るベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスである。好ましくは、本発明による植物細胞または植物を形質転換するためのベクターはプラスミドである。通常、ベクターの主な性質は、それ自体を維持する性能および、特に複製開始点の存在故に植物細胞中で自己複製する性能であるはずである。宿主生物の安定な形質転換を得ることを目的として、ベクターをゲノム中に取り込むこともできる。そのようなベクターの選択および、本発明による遺伝子を前記ベクター中に挿入するための技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に広く記載されており、当業者の通常の知識の一部である。本発明で用いられるベクターは、本発明による遺伝子に加えて、選択マーカーをコードする別の遺伝子も含むのが有利である。選択マーカーは、効果的に形質転換された宿主生物、すなわち、ベクターを取り込んだ生物の選択を可能にする。用いることができる選択マーカーのうち、抗生物質に抵抗性を得るための遺伝子を含むマーカー、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｒｉｔｚら著、１９８３年、Ｇｅｎｅ第２５巻：１７９〜１８８頁）のマーカーを挙げることができるが、除草剤耐性遺伝子、例えば、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）への抵抗性を得るためのｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら著、１９９０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第１８（４）巻：１０６２頁）、グリホサートへの抵抗性を得るためのＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第５，１８８，６４２号）、あるいはイソオキサゾールへの抵抗性を得るためのＨＰＰＤ遺伝子（ＷＯ９６／３８５６７）を含むマーカーも挙げられる。ＧＵＳ酵素のような容易に確認できる酵素をコードする遺伝子、または形質転換細胞中での顔料の産生を制御する酵素または顔料をコードする遺伝子も挙げられる。そのような選択マーカー遺伝子が、特に、特許出願ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８、ＷＯ９６／３８５６７およびＷＯ９７／０４１０３に記載されている。
【００５３】
本発明による形質転換植物を得るために用いることができる形質転換方法のうち一つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および前述のベクターの存在下に形質転換させるべき植物の細胞または組織を配置することである（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎら著、１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第１６８（１）巻、１１１〜１１５頁；ＭｅｒｃｅｎｉｅｒおよびＣｈａｓｓｙ著、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ第７０（４）巻、５０３〜５１７頁）。電気穿孔は、形質転換させるべき細胞または組織とベクターを電場に付することからなるもう一つの方法である（ＡｎｄｒｅａｓｏｎおよびＥｖａｎｓ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６（７）巻、６５０〜６６０頁；ＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒ著、１９８９年、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３（１）巻、５６〜６２頁）。もう一つの方法は、ベクターを、マイクロインジェクションにより細胞または組織に直接注入することからなる（ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ著、１９８５年、Ｇｅｎｅ第３３（２）巻、１２１〜１３６頁）。「バイオリスティック」法を有利に用いることができる。これは、ベクターがその上に吸着された粒子を、細胞または組織に衝突させることからなる（Ｂｒｕｃｅら著、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６（２４）巻、９６９２〜９６９６頁；Ｋｌｅｉｎら著、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０（３）巻、２８６〜２９１頁；米国特許第４，９４５，０５０号）。好ましくは、植物細胞または組織の形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌を用いて、好ましくは、前記植物の細胞または組織にＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｋｎｏｐｆ、１９７９年、Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６巻、１４３〜１７３頁；Ｓｈａｗら著、１９８３年、Ｇｅｎｅ、第２３（３）巻：３１５〜３３０頁）またはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＢｅｖａｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ著、１９８２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻：３５７〜３８４頁；ＴｅｐｆｅｒおよびＣａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ著、１９８７年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、第４（１）巻、２４〜２８頁）を注入することにより行うことができる。好ましくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの植物細胞または組織の形質転換は、Ｉｓｈｉｄａらが記載のプロトコール（１９９６年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１４（６）巻、７４５〜７５０頁）に従って行われる。当業者は、形質転換すべき植物の性質に従った適切な方法を選択する。
【００５４】
本発明の主題は、本発明による植物を産生する方法でもある。この方法は、前述のように形質転換された植物細胞から形質転換植物を再生することにある。再生は、植物の性質に依存する任意の適切な方法により得られる。
【００５５】
本発明は、これらの形質転換された植物の一部および、これらの植物の子孫も含む。「これらの植物の一部」という用語は、地面の上であっても下であっても、これらの植物の任意の器官を意味すると意図される。地面の上の器官は、茎、葉、および雄および雌の生殖器官を含む花である。地面の下の器官は、主に根であるが、塊茎でもあり得る。「子孫」という用語は、主に、これらの植物の互いの生殖により生じる胚芽を含む種子である。拡大解釈では、「子孫」という用語は、親の少なくとも一つが本発明による形質転換植物である交雑から誘導される各新しい世代において形成される全ての種子に適用される。子孫は、前記形質転換植物の植物性増殖により得ることもできる。本発明による種子は、殺真菌性、除草性、殺虫性、殺線虫性、殺菌性または殺ウイルス性から選択される活性を有する少なくとも一つの活性産物を含む農薬組成物で被覆することができる。
【００５６】
本発明による形質転換植物は、関心のある蛋白をコードする少なくとも一つの他の遺伝子を含むことができ、この他の遺伝子も、植物中で機能的でありＰＤＨおよび／またはＨＰＰＤを過発現させる遺伝子と同時、その前または後に植物のゲノム中に人工的に導入される。関心のある蛋白をコードする遺伝子のうち、除草剤への耐性を得るためのもう一つの酵素をコードする遺伝子、例えば、ビアラホスへの耐性を得るためのｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら著、ＮＡＲ、第１８巻：１０６２頁、１９９０年）をコードする遺伝子、またはグリホサートへの耐性を得るためのＥＰＳＰＳ酵素（米国特許第５，１８８，６４２号、ＷＯ９７／０４１０３）をコードする遺伝子を挙げることができる。殺虫性毒素をコードする遺伝子、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細菌のδ−内毒素をコードする遺伝子も挙げることができる（例えば、国際特許出願ＷＯ９８／４０４９０）。疾患への抵抗性を得るための他の遺伝子、例えば、欧州特許出願第０ ５３１ ４９８号または米国特許第５，８６６，７７８号に記載のようなオキサラートオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子もこれらの植物中に含まれてよく、特許出願ＷＯ９７／３００８２、ＷＯ９９／２４５９４、ＷＯ９９／０２７１７、ＷＯ９９／５３０５３およびＷＯ９９／９１０８９に記載のような別の抗菌および／または抗真菌性ペプチドをコードする遺伝子も挙げられる。植物の栽培学的特徴をコードする遺伝子、特に、米国特許第５，５５２，３０６号、５，６１４，３１３および特許出願ＷＯ９８／４６７６３およびＷＯ９８／４６７６４に記載のようなδ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子または、特許出願ＷＯ００／０１８３３およびＷＯ００／３６１２７に記載のようなセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）酵素をコードする遺伝子も挙げることができる。
【００５７】
関心のある蛋白をコードするさらなる遺伝子を、ベクターにより取り込むことができる。この場合、ベクターは、ＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする本発明の遺伝子、およびもう一つのペプチドまたは関心のある蛋白をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む。
【００５８】
これらは、前述の通常の技術に従って、前記さらなる遺伝子を含む少なくとも一つの他のベクターにより取り込むこともできる。
【００５９】
本発明による植物は、一方が、本発明によるＰＤＨ酵素および／またはＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子を有し、他方が、少なくとも一つの他の関心のあるペプチドまたは蛋白をコードするもう一つの遺伝子を有する、植物の交雑により得ることもできる。
【００６０】
本発明により形質転換された植物は、単子葉植物または双子葉植物であってよい。好ましくは、これらの植物は、栽培学的に重要な植物である。単子葉植物は小麦、トウモロコシまたはイネであるのが良い。双子葉植物はナタネ、ダイズ、タバコまたは綿花であるのが良い。
【００６１】
本発明は、本発明の形質転換植物を栽培する方法であって、前記植物の栽培に適した耕地（ｆｉｅｌｄ）の領域に前記形質転換植物の種子を播くこと、前記種子または前記形質転換植物に実質的に影響を与えることなく前記耕地の領域にＨＰＰＤ阻害剤を含む少なくとも一種の除草剤組成物を適用すること、次に、所望の成熟度に達したときに栽培植物を採取すること、および任意に、採取した植物から種子を分離することから構成されることを特徴とする方法にも関する。
【００６２】
本発明は、ＨＰＰＤ阻害剤への耐性を植物に与えるための方法であって、前記植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする方法にも関する。
【００６３】
本発明は、プレニルキノン類、特にトコフェロール類、トコトリエノール類および／またはプラストキノン類の産生のための、本発明による植物または植物細胞の使用にも関する。
【００６４】
本発明は、植物中のプレニルキノン類の量を増加させる方法であって、前記植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする方法にも関する。
【００６５】
本発明は、プレニルキノン類を産生する方法であって、本発明による形質転換植物細胞または植物を、前記植物細胞または前記植物の成長および増殖に適した培養培地中で培養する工程を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００６６】
前記方法の特定の実施態様によれば、産生されたプレニルキノン類が好ましくは、ビタミンＥに代表されるトコフェロール類である。
【００６７】
前記方法の特定の実施態様によれば、産生されたプレニルキノン類は好ましくはトコトリエノール類である。
【００６８】
本発明の特定の実施態様によれば、プレニルキノン類を産生するための前記方法は、前記形質転換植物細胞によりまたは第１の工程で培養された前記形質転換植物により産生された前記プレニルキノン類を抽出するその後の工程を含む。
【００６９】
プレニルキノン類を産生するための前記方法を、本発明による形質転換植物細胞を用いて行う場合、前記植物細胞は、その生存および成長を促進する培養培地中で培養される。当業者は、前記植物細胞を最適に成長させるように前記培養培地の組成を決めることができる。例えば、植物細胞を培養するための方法および培地が、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの文献（１９６２年、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．第１５巻：４７３〜４９７頁）およびＧａｍｂｏｒｇらの文献（１９６８年、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５０巻：１５１〜１５９頁）に記載されている。
【００７０】
さらに、本発明による形質転換植物細胞を用いて前記方法を行う場合、産生された前記プレニルキノン類は、培養培地中に分泌されてよいしまたは分泌されなくてもよい。前記プレニルキノン類が培養培地中に分泌される場合、前記方法の抽出工程の前に、前記植物細胞の除去により培養培地を回収する工程を行うことができる。前記植物細胞の除去により培養培地を回収するそのような工程は、液体画分に含まれている固形分を分離する任意の手段により行うことができる。特に、濾過および遠心分離は、この工程を行うための適切な手段である。
【００７１】
プレニルキノン類が培養培地中に分泌されない場合、抽出工程は、培養された植物細胞の濃縮、単離された植物細胞の破壊、破壊された細胞抽出物の遠心分離および、その後の、前記プレニルキノン類を含む上澄みの回収からなる一連の工程により行うことができる。細胞破壊工程は、機械的粉砕（圧力差、超音波の作用、摩砕による）、酵素的溶解または浸透圧衝撃のような当業者に知られた技術を用いて行うことができ、前記技術は個々にまたは組み合わせて用いることができる。
【００７２】
プレニルキノン類を産生するための前記方法を本発明による形質転換植物を用いて行う場合、前記植物は、その生存およびその成長に適した基質上で培養され、前記基質は天然または人工的であり得る。天然基質は、例えば、土または土の混合物であってよく、前記植物は、例えば培養チャンバー中のような制御条件下、例えば温室中のような半制御条件下、または例えば露出地面のような天然条件下で培養することができる。人工基質は、例えば、液体基質または寒天基質であってよく、その組成物は、本発明による植物の生存および成長を促進する。当業者は、前記植物を最適に成長させるように前記人工基質の組成を決めることができる。植物を培養するための基質の例として、栄養要素Ｎ（窒素）、Ｐ（リン）およびＫ（カリウム）を含む栄養溶液、またはこれらの媒体上に植物を成長させる任意の他の市販または調節栄養溶液を注いだ岩綿または蛭石のような培地を挙げることができる。本発明による植物を人工基質上で培養する場合、これらは、通常、培養チャンバー中で制御条件下に培養される。
【００７３】
さらに、本発明による形質転換植物を用いて前記方法を行う場合、産生された前記プレニルキノン類は、通常、前記形質転換植物中に固定される。
【００７４】
本発明による形質転換植物または前記植物の一部は、ヒトまたは動物の食事を意図した食物組成物中に直接用いて取り込む、または、それらが含むプレニルキノン類の抽出を行うことができる。前述のように、「植物の一部」という用語は、地面の上であっても地面の下であっても、これらの植物の任意の器官を意味すると意図される。地面の上の器官は、茎、葉、および雄および雌の生殖器官を含む花、ならびに種子でもある。地面の下の器官は、主に根であるが、塊茎でもあり得る。本発明の好ましい実施態様によれば、種子は、食用を意図した形質転換植物の一部である。
【００７５】
本発明は、本発明による形質転換植物の種子も含み、この種子は、非形質転換植物の種子と比較してプレニルキノン類に富んでいる。さらに、本発明は、種子または本発明による形質転換植物の他の部分を含む食物組成物も含む。植物のこれらの部分、特に種子から産生された油も、本発明の主題である。
【００７６】
形質転換植物中で産生されたプレニルキノン類を回収するために、培養された植物の粉砕、粉砕植物材料の濾過および／または遠心分離、および、その後の、前記プレニルキノン類を含む上澄みの回収からなる一連の工程により抽出工程を行うことができ、前記回収は、脂質化合物の抽出からなることができる。好ましくは、粉砕工程は、機械的粉砕（圧力差、超音波の作用、摩砕による）からなり、その後、酵素的溶解または浸透圧衝撃を行うことができる。
【００７７】
本方法は、得られた植物細胞または植物の抽出物中に含まれるプレニルキノン類を精製する最終的工程を行うこともできる。前記プレニルキノン類の精製は、化合物を濃縮または分離する技術、特に、当業者に良く知られている微小濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーの技術により行うことができる。精製されたプレニルキノン類を得るために、当業者は、前記プレニルキノン類を含む精製画分を確認するために前記プレニルキノン類を測定する方法を用いることができる。この方法によれば、産生された前記プレニルキノン類は、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または有利には１００％の純度を有する。
【００７８】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明による形質転換植物は、植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子および植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子に加えて、植物中で機能的でありゲラニル−ゲラニルリダクターゼ（以下、ＧＧＲと呼ぶ）酵素を過発現させる遺伝子を含む。産生されたプレニルキノン類のうち、そのような植物は、トコトリエノール類およびプラストキノン類に比して、優先的に、トコフェロール類、特にビタミンＥを産生する。
【００７９】
ＧＧＲ酵素は、ゲラニル−ゲラニルピロホスフェートからフィチルピロホスフェートへの転化を触媒する酵素である。特定の実施態様によれば、植物中で機能的でありＧＧＲを過発現させる遺伝子は、植物ＧＧＲをコードする遺伝子のコード配列を含む。例えば、Ｋｅｌｌｅｒらの文献（１９９８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２５１（１−２）巻：４１３〜４１７頁）に公開されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＧＧＲをコードする配列、または、受入番号ＡＪ００７７８９（タバコ）、ＡＦ０６９３１８（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｎｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ）、Ｙ１４００４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびＱ５５０８７（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３）により記載された配列を用いることができる。
【００８０】
【表１】
【００８１】
以下の実施例により、本発明を説明することができるが、その範囲を制限するものではない。
【００８２】
これらの実施例で以下に記載の方法または工程の全てが、例示的なものであり、同じ結果を達成するために利用できる種々の方法のうちから選択される。この選択は、結果の質に影響を与えず、その結果、同じ結果を得るために当業者が適切な方法を用いることができる。特に、および実施例で別段の断りがない限り、用いられる全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｎｏｌａｎ Ｃ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌの文献（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州）、Ａｕｓｕｂｅｌらの文献（１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、米国、第１巻および２巻）、およびＢｒｏｗｎの文献（１９９８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、英国）に記載の標準的プロトコールに従って行われる。植物分子生物学用の標準的材料および方法が、Ｒ．Ｄ．Ｄ．Ｃｒｏｙ（１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（英国）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（英国））に記載されている。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用の標準的材料および方法も、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒの文献（１９９５年、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州）およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎらの文献（２０００、ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｎｃｈ，第１版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、独国）に記載されている。
【実施例１】
【００８３】
ＨＰＰＤ活性の測定
Ｇａｒｃｉａらの文献（１９９７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３２５巻、７６１〜７６９頁）またはＧａｒｃｉａらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載の方法によりＨＰＰＤ活性を測定することができる。
【実施例２】
【００８４】
プレフェナート脱水素酵素活性の測定
プレフェナート脱水素酵素活性は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、３００μＭのプレフェナートおよび１ｍＭのＮＡＤまたはＮＡＤＰを含み合計体積が２００μｌである溶液中でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの形成を２５℃で、３４０ｎｍでの分光光度モニターにより測定する。
【実施例３】
【００８５】
ＨＰＰＤ過発現キメラ遺伝子の構築
ＨＰＰＤ阻害性除草剤への抵抗性を植物に付与するためにＨＰＰＤを過発現させるキメラ遺伝子を構築した。
【００８６】
これは、転写の方向において、欧州特許出願第０ ５０７ ６９８号に記載のような「二重ヒストン」プロモーター（ＰｄＨ４）、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄの文献（１９９０年；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻：１５９０〜１５９７頁）に記載のタバコエッチウイルス翻訳エンハンサー（ＴＥＶ）配列、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載のような最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）をコードする配列、特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤ遺伝子のコード部分、次いで、Ｂｅｖａｎらの文献（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）に記載のノパリンシンターゼ遺伝子のｎｏｓターミネーターを組み立てることから構成される。次に、アセンブリを、バイナリーベクターにクローニングし、以下の構造を有する。
【００８７】
【化１】
【実施例４】
【００８８】
ＰＤＨ過発現キメラ遺伝子の構築
キメラ遺伝子過発現ＰＤＨの構築は、翻訳の方向において、欧州特許出願第０ ５０７ ６９８号に記載のような「二重ヒストン」プロモーター（ＰｄＨ４）、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＦｒｅｅｄの文献（１９９０年；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６４巻：１５９０〜１５９７頁）に記載のタバコエッチウイルス翻訳エンハンサー（ＴＥＶ）配列、欧州特許出願第０ ５０８ ９０９号に記載のような最適化トランジットペプチド（ＯＴＰ）をコードする配列、Ｍａｎｎｈａｕｐｔらの文献（１９８９年、Ｇｅｎｅ第８５巻、３０３〜３１１頁）に記載の酵母ＰＤＨ遺伝子のコード部分、およびＢｅｖａｎらの文献（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１（２）巻、３６９〜３８５頁）に記載のノパリンシンターゼ遺伝子のｎｏｓターミネーターを組み立てることからなる。次に、アセンブリを、カナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含むバイナリーベクターｐＲＤ２２４にクローニングしてベクターｐＲＤ２２４−ＰＤＨを得る。このベクターは以下の構造を有する。
【００８９】
【化２】
【００９０】
次に、このバイナリーベクターを用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＥＨＡ１０５を形質転換し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＥＨＡ１０５−ｐＲＤ ２２４−ＰＤＨを得た。このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を用いて、タバコＰＢＤ６およびタバコＰＢＤ６−ＡＲＡ９を形質転換した（タバコは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現させるキメラ遺伝子で形質転換）。
【００９１】
形質転換された植物を、カナマイシン上で選択する。
【実施例５】
【００９２】
ＰＤＨを過発現している発現カセットでのタバコＰＢＤ６−ＡＲＡ９の形質転換
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物は、実施例３に記載のようなキメラ遺伝子で形質転換したタバコ植物であり、特許出願ＷＯ９６／３８５６７に記載のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現している。ＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物を得るための方法が、Ｇａｒｃｉａらの文献（１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１１９巻、１５０７〜１５１６頁）に記載されている。実施例４に記載のようなＰＤＨを過発現しているキメラ遺伝子で形質転換されたＰＢＤ６−ＡＲＡ９系を、ＡＲＡ９−ＰＤＨ系と呼ぶ。
【００９３】
５．１：形質転換
ｆｏｌｉａｒ ｄｉｓｋ技術（Ｈｏｒｓｃｈら著、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２７巻：１２２９〜１２３１頁）に従って、非発癌遺伝子であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ１０５−ｐＲＤ２２４−ＰＤＨを用いて形質転換を行う。
【００９４】
５．２：再生
３０ｇ／ｌのスクロースおよび３５０ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）基礎培地上で、外植葉からＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物を再生する。外植葉は、温室中の植物から得、ｆｏｌｉａｒ ｄｉｓｋ技術（Ｈｏｒｓｃｈら著、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２７巻：１２２９〜１２３１頁）に従って３つの連続工程で再生する：
・第１の工程は、３０ｇ／ｌのスクロースと０．０５ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＡＮＡ）および２ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）も含むＭＳ基礎培地上で１５日間、そして２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンで若枝を誘導することを含む。
【００９５】
・この工程中に形成された緑若枝を、次に、３０ｇ／ｌのスクロースおよび２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンが加えられているが、ホルモンを含まないＭＳ培地上で１０日間培養することにより成長させる。
【００９６】
・続いて成長した若枝を除去し、次に、塩、ビタミンおよび糖の半分の量、２００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含み、ホルモンを含まないＭＳ発根媒体上で培養する。約１５日後、発根した若枝を温室内に移す。
【００９７】
形質転換された植物の耐性を、ジケトニトリル（ＤＫＮ）で処理した土の上に播種することにより調べる。
【実施例６】
【００９８】
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物のＨＰＰＤ阻害剤への耐性
６．１．ジケトニトリル（ＤＫＮ）への耐性
１３個のＡＲＡ９−ＰＤＨ系および、形質転換用の出発材料として用いたＰＢＤ６−ＡＲＡ９系を、ＤＫＮの濃度が５、１０および３２ｐｐｍと増加するように蒔いた。
【００９９】
ＤＫＮが５ｐｐｍの場合、全てのＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨ系は、特にそれら全てがＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＨＰＰＤを過発現するので、抵抗性である。ＤＫＮが１０ｐｐｍの場合、親系ＰＢＤ６−ＡＲＡ９が完全に阻害される。一方、全てのＡＲＡ９−ＰＤＨ系は、阻害される一つ（ＡＲＡ９−ＰＤＨ４）のみを除いて、優れた抵抗性である。ＤＫＮが３２ｐｐｍの場合、１０ｐｐｍのＤＫＮに抵抗性であったＡＲＡ９−ＰＤＨ系の全てが、抵抗性であり正常に成長する植物を与えるが、組換えＨＰＰＤのみを発現する親系ＰＢＤ６−ＡＲＡ９は完全に阻害される。最良の耐性を示す系は、ＡＲＡ９−ＰＤＨ１４、ＡＲＡ９−ＰＤＨ１８およびＡＲＡ９−ＰＤＨ２４系である。
【０１００】
６．２．スルコトリオンおよびメソトリオンへの耐性
ＨＰＰＤ阻害剤スルコトリオンおよびメソトリオンを用いて同じ実験を行った。ＡＲＡ９−ＰＤＨ１８系は、３μＭのメソトリオンおよび６μＭのスルコトリオンに耐性であるが、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ型の野生型タバコ系は、０．３７５μＭのこれら二つの化合物に感受性であることが分かった。
【実施例７】
【０１０１】
ＰＢＤ６−ＡＲＡ９およびＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物中でのトコフェロールおよびトコトリエノール水準の測定
分析した植物の各々の中間葉および幼若葉のサンプルから、Ｆｏｌｃｈの方法（Ｆｏｌｃｈら著、１９５７頁、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２６〜４９７頁）により脂質抽出物を得る。次に、それらのトコフェロールおよびトコトリエノール含量の分析を、Ｆｒａｚｅｒらの方法（２０００年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．第２４巻：５５１〜５５８頁）に従ったＨＰＬＣにより行う。次に、これらの含量を、対照産物に関して定量し、次に、固形分１ｇ当たりのμｇで表す。結果を表１に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
これらの結果は、ＰＤＨおよびＨＰＰＤ酵素を過発現させるキメラ遺伝子で組み合わせて形質転換したＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物は、ＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子で単独形質転換したＰＢＤ６−ＡＲＡ９タバコ植物と比べて、プレニルキノン類、特に、トコフェロール類およびトコトリエノール類を多量に与えることを明らかに示している。トコトリエノール類について最高の効果が得られる。この効果は、分裂組織に富む幼若葉においていっそう顕著である。この組織特異性の原因は、ＡＲＡ９−ＰＤＨタバコ植物を作るために用いられるプロモーターであって、植物の迅速成長組織、特に分裂組織（ＰｄＨ４）において優先的に発現されるプロモーターに関係する。他の型のプロモーターの使用により、植物の他の組織において同様の効果を得ることが可能となるはずである。
【０１０４】
さらに、種々のＡＲＡ９−ＰＤＨ系の間で観察される相違は、異なる形質転換事象が含まれるという事実に由来する。ホモ接合性系の成長を意図した最適系の間での交雑は、プレニルキノン類の産生、およびＨＰＰＤ阻害剤への耐性に関して同等である系を得ることを可能にするはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする、植物中のプレニルキノン類の量を増加させる方法であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記方法。
【請求項２】
形質転換植物細胞または植物を、前記植物細胞または前記植物の成長および増殖に適した培養培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、プレニルキノン類を産生する方法であって、
形質転換植物は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物であって、
形質転換植物細胞は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物細胞であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物細胞である、前記方法。
【請求項３】
植物中で機能的でありＰＤＨを過発現させる遺伝子が、酵母ＰＤＨをコードする遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵母ＰＤＨをコードする遺伝子のコード配列が、サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）遺伝子のコード配列であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
植物中で機能的でありＨＰＰＤを過発現させる遺伝子が、植物ＨＰＰＤをコードする遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
植物ＨＰＰＤをコードする遺伝子のコード配列が、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）遺伝子のコード配列であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プレニルキノン類がトコトリエノール類であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プレニルキノン類がビタミンＥに代表されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物を、同時または順次に、さらに、植物中で機能的でありＧＧＲ酵素を過発現させる遺伝子で形質転換することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
プレニルキノン類を産生するための、形質転換植物または形質転換植物細胞の使用であって、
形質転換植物は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物であって、
形質転換植物細胞は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物細胞であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物細胞である、前記使用。
【請求項１】
植物を、同時又は順次に、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
で形質転換することを特徴とする、植物中のプレニルキノン類の量を増加させる方法であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記方法。
【請求項２】
形質転換植物細胞または植物を、前記植物細胞または前記植物の成長および増殖に適した培養培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、プレニルキノン類を産生する方法であって、
形質転換植物は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物であって、
形質転換植物細胞は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物細胞であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物細胞である、前記方法。
【請求項３】
植物中で機能的でありＰＤＨを過発現させる遺伝子が、酵母ＰＤＨをコードする遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵母ＰＤＨをコードする遺伝子のコード配列が、サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）遺伝子のコード配列であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
植物中で機能的でありＨＰＰＤを過発現させる遺伝子が、植物ＨＰＰＤをコードする遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
植物ＨＰＰＤをコードする遺伝子のコード配列が、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）遺伝子のコード配列であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プレニルキノン類がトコトリエノール類であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プレニルキノン類がビタミンＥに代表されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物を、同時または順次に、さらに、植物中で機能的でありＧＧＲ酵素を過発現させる遺伝子で形質転換することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
プレニルキノン類を産生するための、形質転換植物または形質転換植物細胞の使用であって、
形質転換植物は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物であって、
形質転換植物細胞は、
（１）植物中で機能的でありＰＤＨ酵素を過発現させる遺伝子、
（２）植物中で機能的でありＨＰＰＤ酵素を過発現させる遺伝子
を含むことを特徴とする形質転換植物細胞であって、但し、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子は、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのＴｙｒＡ遺伝子ではない前記形質転換植物細胞である、前記使用。
【公開番号】特開２０１０−２４６５５２（Ｐ２０１０−２４６５５２Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２６７８４（Ｐ２０１０−１２６７８４）
【出願日】平成２２年６月２日（２０１０．６．２）
【分割の表示】特願２００４−５３５５９２（Ｐ２００４−５３５５９２）の分割
【原出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（５０３３２５５３８）バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー (73)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２日（２０１０．６．２）
【分割の表示】特願２００４−５３５５９２（Ｐ２００４−５３５５９２）の分割
【原出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（５０３３２５５３８）バイエル・クロツプサイエンス・エス・アー (73)
【Ｆターム（参考）】
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