プロテアーゼ活性が低下した細菌、及びそれを用いたタンパク質製造方法
【課題】 プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌、及び当該細菌を用いて、遺伝子工学的にタンパク質を製造する方法を提供すること。
【解決の手段】 バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで、プロテアーゼ活性が前記野生株よりも低下したバチルス属細菌変異株を得ることができた。また、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを前記変異株へ形質転換することで得られる、バチルス属細菌を用いて前記タンパク質を発現させると、野生株を宿主として用いたときよりも、組み換えタンパク質の発現量が増大した。
【解決の手段】 バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで、プロテアーゼ活性が前記野生株よりも低下したバチルス属細菌変異株を得ることができた。また、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを前記変異株へ形質転換することで得られる、バチルス属細菌を用いて前記タンパク質を発現させると、野生株を宿主として用いたときよりも、組み換えタンパク質の発現量が増大した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌、及びそれを用いた組み換えタンパク質、特にＦｃレセプターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９０のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、４５７（１９９１）
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、３１８（２００５）
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３８、１８１１（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、３７８（１９８９）
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３０、ｅ４３（２００２）
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以前、本出願人は、ＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子を導入したプラスミドベクターをバチルス属細菌に形質転換させることで、遺伝子工学的にＦｃγＲＩを発現させている（特願２００８−０４６４３８号）。しかしながら、バチルス属細菌は一般にプロテアーゼ活性が高く、生産されたＦｃγＲＩが分解されてしまう問題点があった。
【００１０】
そこで、本発明の課題はプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）活性が低下したバチルス属細菌、及び当該細菌を用いた遺伝子工学的なタンパク質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで得られる、プロテアーゼ活性が前記野生株よりも低下したバチルス属細菌変異株。
【００１２】
（２）バチルス属細菌野生株がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）であることを特徴とする、（１）に記載の変異株。
【００１３】
（３）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、（１）または（２）に記載の変異株へ形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なバチルス属細菌。
【００１４】
（４）タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、（３）に記載のバチルス属細菌。
【００１５】
（５）（４）に記載のバチルス属細菌を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１６】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】
一般的に変異株の取得方法としては、自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法の他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することにより変異を加速させた後生産性が向上した菌株を選別していく方法、前記方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法が例示できる。このうち、本発明の変異株は、バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することにより得ることができ、かつ当該変異株の有するプロテアーゼ活性が野生株と比較し低下していることを特徴としている。
【００１８】
本発明のバチルス属細菌変異株に用いる、バチルス属細菌野生株としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｈｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｄｄｅｒｉといった狭義のバチルス属細菌の他に、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒといったブレビバチルス属細菌、及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｉａｒｉｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｉｄｕｓといったパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌の類縁種も例示できる。特に本発明のバチルス属細菌変異株の作成に用いる野生株の好ましい一例として、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造で用いられるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）があげられる。
【００１９】
本発明のバチルス属細菌変異株の取得に用いる変異原物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチルといった化合物を例示できる。前記変異原物質を用いた変異株の選択方法としては、あらかじめ培養して得た細菌の菌体を前記変異原物質の水溶液に懸濁し、一定時間放置した後、遠心分離などの方法で菌体を回収することで変異原物質を除去した後、平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する方法を例示できる。前記選択方法における、コロニーを選択する方法についても特に制限はなく、カゼインを用いた固体培地上でのハローの形成度合いによる方法、及び任意の多数のコロニーを選択／分離した後液体培養を行ない、培養液中のプロテアーゼ活性をカゼインやアゾカゼインを用いて測定する方法が例示できる。後者の方法は、９６穴プレートや３８４穴プレートを用いて液体培養や抽出・比色定量することで、効率よく選択を行なうことができるため、好ましいコロニー選択方法といえる。前記コロニー選択方法により一次選抜を行ない、次いで培養液中のプロテアーゼ活性を測定することで、野生株よりプロテアーゼ活性が低下した変異株を取得することができる。また、当該操作により得られた変異株に対し、同様な操作を複数回繰り返すことにより、プロテアーゼ活性をより低下させ、また、生産性をさらに向上させることが可能である。
【００２０】
本発明のバチルス属細菌変異株の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存する方法、凍結法や凍結乾燥法により保存する方法が例示できる。継代培養による保存方法の場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。凍結による保存の場合は、培地にグリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられる凍結補助剤を添加した後に凍結すればよい。前記凍結補助剤の添加量は菌の生存に影響のない範囲であればよく、例えばグリセロールの場合では培養液容量全体の１／１０から１／３が好ましい。凍結の温度は、可能な限り低温であることが好ましく、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下である。凍結乾燥による保存の場合は、凍結補助剤を用いてあらかじめ可能な限り低温で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては上記のもののほかにスキムミルクなども用いられる。凍結乾燥後の菌体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存される。
【００２１】
本発明のバチルス属細菌変異株は、バチルス属細菌の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。また所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、さらに目的の温度まで冷却して固形化して用いればよい。バチルス属細菌増殖における培養温度は、約２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、約５から１０、好ましくは７．０である。
【００２２】
本発明のバチルス属細菌変異株は、野生株と比較しプロテアーゼ活性を低下していることを特徴としている。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを本発明の変異株へ形質転換することにより得られる、組み換えバチルス属細菌を用いて前記タンパク質を発現させると、前記細菌が有するプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が野生株よりも低減し、結果として得られる前記タンパク質の量が増大する。以降、本発明のバチルス属細菌変異株を用いたタンパク質製造の一例として、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のバチルス属細菌を用いて遺伝子工学的にヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造する際に使用する、ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドとしては、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子の全領域又は一部領域からなるポリヌクレオチドをそのまま用いてもよいが、前記ポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドがより好ましい。前記コドン変換したポリヌクレオチドの一態様として、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドがあげられる（特願２００８−０４６４３８号）。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能であり、塩基配列の変換はＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができるが、好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換してもよい。
【００２４】
さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
【００２５】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００２６】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターを本発明のバチルス属細菌変異株に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
【００２７】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、バチルス属細菌への外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法等をあげることができる。
【００２８】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩの製造で使用する培地の組成としては、本発明の変異株が増殖し、かつヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであればよく、前述した炭素源、無機塩、ビタミン類から適宜選択して用いればよい。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するバチルス属細菌の増殖を選択的に可能にするために、発現プラスミドベクターの構成を基とした選抜剤を培地に含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。発現プラスミドベクターに本発明の変異株の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養温度は１５から４０℃が好ましく、ｐＨは６から８が好ましい。また、培養時間はＦｃγＲＩが十分に生産される時間であればよく、通常は数時間から２００時間の間に設定されるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
【００２９】
培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等をあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
【００３０】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩの分析方法は、培養液から安定に効率的に定量できれば特に限定はないが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による定量が簡便性の点で好ましい。
【００３１】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等の様々な用途に用いられる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、培養液のまま使用することも可能であり、高度に精製して用いることもでき、またその中間の純度の様々な精製度合いで使用される。前記精製されたヒト型ＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等として利用される。精製ヒト型ＦｃγＲＩに要求される純度はその用途により異なり、それぞれの目的に要求される純度に調製されて利用される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の変異株は、バチルス属細菌野生株を変異原性物質で処理することで得られる。本発明の変異株は野生株と比較しプロテアーゼ活性が低下しているため、本発明の変異株を、遺伝子工学的にタンパク質を製造する際の宿主として用いることで、宿主の有するプロテアーゼに由来した発現タンパク質の分解が低減し、結果として前記タンパク質をより効率的に生産することができる。特に、本発明の変異株はＦｃレセプターＦｃγＲＩの遺伝子工学的生産の宿主として好ましく、得られたＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、分離剤のリガンドとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３５】
実施例１ 本発明のバチルス属細菌変異体の取得（その１）
以下に示す方法で、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌変異体を取得した。
【００３６】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブに細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なった。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００３７】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮ−メチル‐Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略記する）の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置して変異導入処理を行なった。
【００３８】
（３）遠心分離して菌体を回収後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。続いて、回収した菌体を３ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった後、ＬＢ培地に１．５重量％の寒天を加えて調製した平板培地に塗布して、３７℃で一晩静置培養した。
【００３９】
（４）生じたコロニーをプロテアーゼ選択プレートのカゼイン最小培地プレート（カゼイン １０ｇ／Ｌ、グルコース ５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １４ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ６ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．２ｇ／Ｌ、 酵母エキス ０．２ｇ／Ｌ、ビオチン ０．１ｍｇ／Ｌ、 寒天 １５ｇ／Ｌ）へレプリカし、３７℃で数日間静置培養した。カゼイン最小培地プレート上では、生じたコロニーの周辺に、菌が産出するプロテアーゼがカゼインを分解して出来るハローが観察できた。
【００４０】
（５）変異が導入されたコロニーのうち、プロテアーゼ活性が低いもの（すなわち、ハローが小さいもの）、また、カゼイン最小培地プレート上で生育の遅いもの（すなわちコロニー径がレプリカ元のプレートと比べて小さいもの）を候補株として選択した。
【００４１】
（６）生じたコロニーから選択した候補株のプロテアーゼ活性を、下記に示すカゼイン法により測定し、プロテアーゼ活性が低下した菌株の選定を行なった。
（６−１）１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．２ｍＬを３０℃で５分間加温した後、酵素濃度を適宜調整した酵素溶液（培養上清）０．２ｍＬを添加し、３０℃で１０分から半日程度反応を行なった。
（６−２）反応停止液（０．１Ｍトリクロロ酢酸、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ酢酸）０．４ｍＬを添加して反応を停止し、３０℃にて３０分間放置した後、酸変性タンパク質を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
（６−３）遠心分離した上清０．２ｍＬを分注し、アルカリ溶液（０．４Ｍ炭酸ナトリウム）１．０ｍＬとフェリン試薬（フェノール試薬を脱イオン水で５倍希釈したもの）０．２ｍＬを添加し、３０℃にて２０分間加温した。
（６−４）分光光度計を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、酸可溶性タンパク質分解物の生成量を求めた。菌の濁度あたりの吸光度を計算し、プロテアーゼ活性の比較を行った。なお、上記の酵素反応系に反応停止液を加えた後、酵素溶液を加えた系をブランクとする。
【００４２】
（７）（６）の結果、プロテアーゼ活性が最も低下した菌株としてＬ−Ｄ７株を取得した。前記菌株をＬＢ培地で培養し、得られた培養液１ｍＬに滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合し、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注して−８０℃にて凍結保存した。
【００４３】
（８）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｄ７株を植菌して３７℃で静置培養し、出現したコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで、凍結乾燥菌体を調製した。
【００４４】
実施例２ 本発明のバチルス属細菌変異体の取得（その２）
以下に示す方法で、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌変異体を取得した。
【００４５】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブに細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行った。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００４６】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮＴＧの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置することで変異導入処理を行なった。
【００４７】
（３）遠心分離して菌体を回収後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。
【００４８】
（４）回収した菌体を３ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった後、ＬＢ培地に１．５重量％の寒天を加えて調製した平板培地に塗布して、３７℃で一晩静置培養した。
【００４９】
（５）生じたコロニー全てを網羅的に選択し、９６穴ディープウェルプレート上の３ＹＣ培地（ポリペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、グルコース ３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・七水和物 ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）１ｍＬに植菌した後、３７℃で一晩振とう培養した。
【００５０】
（６）遠心分離した培養液の上清を用いて、下記に示すアゾカゼイン法によるプロテアーゼ活性を測定し、プロテアーゼ活性が低下した菌株の選定を行なった。
（６−１）培養液の遠心上清０．１５ｍＬを９６穴プレートに分注し、１（ｗ／ｖ）％アゾカゼイン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液０．１５ｍＬを添加して、３７℃１時間反応させた。
（６−２）反応停止液０．３ｍＬを加えた後、３７℃１５分間静置した。生じた酸変性タンパク質を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）することで除去し、上清０．１ｍＬを吸光度測定用９６穴プレートへ分注し、アルカリ溶液０．２ｍＬを加えて、４４０ｎｍの吸光度分光光度計を用いて測定した。
【００５１】
（７）（６）の結果、プロテアーゼ活性が最も大きく低下した菌株としてＬ−Ｇ９株を取得した。前記菌株をＬＢ培地で培養し、得られた培養液１ｍＬに滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合し、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注して−８０℃にて凍結保存した。
【００５２】
（８）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｇ９株を植菌して３７℃で静置培養後、出現したコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで、凍結乾燥菌体を調製した。
【００５３】
実施例３ 本発明のバチルス属細菌変異体のプロテアーゼ活性
実施例１及び２で取得したバチルス属細菌変異体、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）野生株とで、ＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質を用いてプロテアーゼ活性を比較した。
【００５４】
（１）培養液の遠心上清０．６７５ｍＬと適度に希釈した精製ＦｃγＲＩ溶液０．０７５ｍＬを混和後、４℃および３０℃にて静置し、一定時間経過ごとに０．１５ｍＬずつサンプリングを行なった。
【００５５】
（２）経時変化に対してＦｃγＲＩの残存率を下記に示すＥＬＩＳＡ法で測定し、培養上清中のＦｃγＲＩ分解活性を測定した。
（２−１）９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固定した。
（２−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（２−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、形質転換体の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体ガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（２−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５６】
結果を表１に示す。なお、かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７株及びＬ−Ｇ９株の相対値（％）を示す。Ｌ−Ｄ７株が有するプロテアーゼ活性は１５．９（濁度あたりのプロテアーゼ活性、以降同じ）、Ｌ−Ｇ９株のプロテアーゼ活性は１７．５であり、野生株が有する活性（２４．０）より、それぞれＬ−Ｄ７株で約３３％、Ｌ−Ｇ９株で約２７％それぞれ低下していた。また、ＦｃγＲＩ分解活性で比較すると、３０℃・２４時間後のＦｃγＲＩ残存率が野生株では１８％に対し、Ｌ−Ｄ７株では２３％、Ｌ−Ｇ９株では２２％と、いずれも野生株よりもプロテアーゼ活性抑制効果が見られた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
実施例４ 本発明のバチルス属細菌変異体を用いたＦｃγＲＩ生産
宿主として実施例１及び２で取得したバチルス属細菌変異体、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）野生株を用いたときにおける、組み換えＦｃγＲＩタンパク質の発現量を比較した。
（１）プラスミドベクターを用いた一般的な遺伝子工学的手法により、ＦｃγＲＩ遺伝子を、野生株、または実施例１及び２で取得した変異株（Ｌ−Ｄ７株、Ｌ−Ｇ９株）へ形質転換後、ＢＴＹｍ２培地（ポリペプトンペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ７．５ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）２００ｍＬに植菌し、３０℃にて２日間培養した。
（２）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ生産量を、実施例３（２）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、形質転換体でのＦｃγＲＩ生産性を測定した。
【００５９】
結果を表２に示す。かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７株及びＬ−Ｇ９株の相対値（％）を示す。宿主として野生株を用いたときのＦｃγＲＩ発現量が７７μｇ／Ｌであったのに対して、実施例１及び２で取得した株を用いたときのＦｃγＲＩ発現量は８３μｇ／Ｌ（Ｌ−Ｄ７株）、及び７９μｇ／Ｌ（Ｌ−Ｇ９株）といずれも野生株より向上した。以上より、バチルス属細菌を宿主として用いて組換タンパク質を発現させる際、バチルス属細菌としてプロテアーゼ活性が低下した変異株を用いることで、タンパク質発現量が向上していることがわかる。
【００６０】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌、及びそれを用いた組み換えタンパク質、特にＦｃレセプターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９０のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、４５７（１９９１）
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、３１８（２００５）
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３８、１８１１（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、３７８（１９８９）
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３０、ｅ４３（２００２）
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１−４４５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以前、本出願人は、ＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子を導入したプラスミドベクターをバチルス属細菌に形質転換させることで、遺伝子工学的にＦｃγＲＩを発現させている（特願２００８−０４６４３８号）。しかしながら、バチルス属細菌は一般にプロテアーゼ活性が高く、生産されたＦｃγＲＩが分解されてしまう問題点があった。
【００１０】
そこで、本発明の課題はプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）活性が低下したバチルス属細菌、及び当該細菌を用いた遺伝子工学的なタンパク質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで得られる、プロテアーゼ活性が前記野生株よりも低下したバチルス属細菌変異株。
【００１２】
（２）バチルス属細菌野生株がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）であることを特徴とする、（１）に記載の変異株。
【００１３】
（３）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、（１）または（２）に記載の変異株へ形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なバチルス属細菌。
【００１４】
（４）タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、（３）に記載のバチルス属細菌。
【００１５】
（５）（４）に記載のバチルス属細菌を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１６】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】
一般的に変異株の取得方法としては、自然突然変異により派生した優良菌株を選別していく方法の他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することにより変異を加速させた後生産性が向上した菌株を選別していく方法、前記方法で得られた性質の異なる菌株同士を細胞融合させる方法が例示できる。このうち、本発明の変異株は、バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することにより得ることができ、かつ当該変異株の有するプロテアーゼ活性が野生株と比較し低下していることを特徴としている。
【００１８】
本発明のバチルス属細菌変異株に用いる、バチルス属細菌野生株としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｈｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｄｄｅｒｉといった狭義のバチルス属細菌の他に、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｓｚｅｒｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒといったブレビバチルス属細菌、及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｈｉｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｉａｒｉｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｉｄｕｓといったパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌の類縁種も例示できる。特に本発明のバチルス属細菌変異株の作成に用いる野生株の好ましい一例として、遺伝子工学的手法によるタンパク質製造で用いられるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）があげられる。
【００１９】
本発明のバチルス属細菌変異株の取得に用いる変異原物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチルといった化合物を例示できる。前記変異原物質を用いた変異株の選択方法としては、あらかじめ培養して得た細菌の菌体を前記変異原物質の水溶液に懸濁し、一定時間放置した後、遠心分離などの方法で菌体を回収することで変異原物質を除去した後、平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する方法を例示できる。前記選択方法における、コロニーを選択する方法についても特に制限はなく、カゼインを用いた固体培地上でのハローの形成度合いによる方法、及び任意の多数のコロニーを選択／分離した後液体培養を行ない、培養液中のプロテアーゼ活性をカゼインやアゾカゼインを用いて測定する方法が例示できる。後者の方法は、９６穴プレートや３８４穴プレートを用いて液体培養や抽出・比色定量することで、効率よく選択を行なうことができるため、好ましいコロニー選択方法といえる。前記コロニー選択方法により一次選抜を行ない、次いで培養液中のプロテアーゼ活性を測定することで、野生株よりプロテアーゼ活性が低下した変異株を取得することができる。また、当該操作により得られた変異株に対し、同様な操作を複数回繰り返すことにより、プロテアーゼ活性をより低下させ、また、生産性をさらに向上させることが可能である。
【００２０】
本発明のバチルス属細菌変異株の保存方法については特に限定はなく、任意の培地に継代培養することで菌の活性を維持した状態で保存する方法、凍結法や凍結乾燥法により保存する方法が例示できる。継代培養による保存方法の場合は菌が活発に増殖している状態で新たな培地に継代するのが好ましい。凍結による保存の場合は、培地にグリセロール、マンニトール、ジメチルスルフォキシドといった通常の微生物の保存に用いられる凍結補助剤を添加した後に凍結すればよい。前記凍結補助剤の添加量は菌の生存に影響のない範囲であればよく、例えばグリセロールの場合では培養液容量全体の１／１０から１／３が好ましい。凍結の温度は、可能な限り低温であることが好ましく、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−８０℃以下である。凍結乾燥による保存の場合は、凍結補助剤を用いてあらかじめ可能な限り低温で凍結後、減圧乾燥すればよい。凍結乾燥の場合の凍結補助剤としては上記のもののほかにスキムミルクなども用いられる。凍結乾燥後の菌体は室温以下の温度で、好ましくは４℃以下で、さらに好ましくは−２０℃以下で保存される。
【００２１】
本発明のバチルス属細菌変異株は、バチルス属細菌の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。また所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。なお、固体培地を用いる場合には上記の組成の培地に寒天やジェランガムといった固形化剤を加熱溶解させた後に、培養に用いる試験管やシャーレに分注し、さらに目的の温度まで冷却して固形化して用いればよい。バチルス属細菌増殖における培養温度は、約２０から４０℃、好ましくは２５から３５℃であり、より好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、約５から１０、好ましくは７．０である。
【００２２】
本発明のバチルス属細菌変異株は、野生株と比較しプロテアーゼ活性を低下していることを特徴としている。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを本発明の変異株へ形質転換することにより得られる、組み換えバチルス属細菌を用いて前記タンパク質を発現させると、前記細菌が有するプロテアーゼに由来する発現タンパク質の分解が野生株よりも低減し、結果として得られる前記タンパク質の量が増大する。以降、本発明のバチルス属細菌変異株を用いたタンパク質製造の一例として、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造について詳細に説明する。
【００２３】
本発明のバチルス属細菌を用いて遺伝子工学的にヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造する際に使用する、ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドとしては、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子の全領域又は一部領域からなるポリヌクレオチドをそのまま用いてもよいが、前記ポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドがより好ましい。前記コドン変換したポリヌクレオチドの一態様として、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドがあげられる（特願２００８−０４６４３８号）。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能であり、塩基配列の変換はＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができるが、好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換してもよい。
【００２４】
さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
【００２５】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００２６】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターを本発明のバチルス属細菌変異株に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
【００２７】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、バチルス属細菌への外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法等をあげることができる。
【００２８】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いた遺伝子工学的なヒト型ＦｃγＲＩの製造において、ヒト型ＦｃγＲＩの製造で使用する培地の組成としては、本発明の変異株が増殖し、かつヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであればよく、前述した炭素源、無機塩、ビタミン類から適宜選択して用いればよい。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するバチルス属細菌の増殖を選択的に可能にするために、発現プラスミドベクターの構成を基とした選抜剤を培地に含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。発現プラスミドベクターに本発明の変異株の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養温度は１５から４０℃が好ましく、ｐＨは６から８が好ましい。また、培養時間はＦｃγＲＩが十分に生産される時間であればよく、通常は数時間から２００時間の間に設定されるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
【００２９】
培養液から、ヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等をあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
【００３０】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩの分析方法は、培養液から安定に効率的に定量できれば特に限定はないが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による定量が簡便性の点で好ましい。
【００３１】
本発明のバチルス属細菌変異株を用いて遺伝子工学的手法により得られたヒト型ＦｃγＲＩは、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等の様々な用途に用いられる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、培養液のまま使用することも可能であり、高度に精製して用いることもでき、またその中間の純度の様々な精製度合いで使用される。前記精製されたヒト型ＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、アフィニティーリガンド（分離剤）等として利用される。精製ヒト型ＦｃγＲＩに要求される純度はその用途により異なり、それぞれの目的に要求される純度に調製されて利用される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の変異株は、バチルス属細菌野生株を変異原性物質で処理することで得られる。本発明の変異株は野生株と比較しプロテアーゼ活性が低下しているため、本発明の変異株を、遺伝子工学的にタンパク質を製造する際の宿主として用いることで、宿主の有するプロテアーゼに由来した発現タンパク質の分解が低減し、結果として前記タンパク質をより効率的に生産することができる。特に、本発明の変異株はＦｃレセプターＦｃγＲＩの遺伝子工学的生産の宿主として好ましく、得られたＦｃγＲＩは医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、または、分離剤のリガンドとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３５】
実施例１ 本発明のバチルス属細菌変異体の取得（その１）
以下に示す方法で、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌変異体を取得した。
【００３６】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブに細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なった。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００３７】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮ−メチル‐Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略記する）の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置して変異導入処理を行なった。
【００３８】
（３）遠心分離して菌体を回収後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。続いて、回収した菌体を３ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった後、ＬＢ培地に１．５重量％の寒天を加えて調製した平板培地に塗布して、３７℃で一晩静置培養した。
【００３９】
（４）生じたコロニーをプロテアーゼ選択プレートのカゼイン最小培地プレート（カゼイン １０ｇ／Ｌ、グルコース ５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １４ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ６ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．２ｇ／Ｌ、 酵母エキス ０．２ｇ／Ｌ、ビオチン ０．１ｍｇ／Ｌ、 寒天 １５ｇ／Ｌ）へレプリカし、３７℃で数日間静置培養した。カゼイン最小培地プレート上では、生じたコロニーの周辺に、菌が産出するプロテアーゼがカゼインを分解して出来るハローが観察できた。
【００４０】
（５）変異が導入されたコロニーのうち、プロテアーゼ活性が低いもの（すなわち、ハローが小さいもの）、また、カゼイン最小培地プレート上で生育の遅いもの（すなわちコロニー径がレプリカ元のプレートと比べて小さいもの）を候補株として選択した。
【００４１】
（６）生じたコロニーから選択した候補株のプロテアーゼ活性を、下記に示すカゼイン法により測定し、プロテアーゼ活性が低下した菌株の選定を行なった。
（６−１）１％（ｗ／ｖ）カゼインを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．２ｍＬを３０℃で５分間加温した後、酵素濃度を適宜調整した酵素溶液（培養上清）０．２ｍＬを添加し、３０℃で１０分から半日程度反応を行なった。
（６−２）反応停止液（０．１Ｍトリクロロ酢酸、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ酢酸）０．４ｍＬを添加して反応を停止し、３０℃にて３０分間放置した後、酸変性タンパク質を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。
（６−３）遠心分離した上清０．２ｍＬを分注し、アルカリ溶液（０．４Ｍ炭酸ナトリウム）１．０ｍＬとフェリン試薬（フェノール試薬を脱イオン水で５倍希釈したもの）０．２ｍＬを添加し、３０℃にて２０分間加温した。
（６−４）分光光度計を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、酸可溶性タンパク質分解物の生成量を求めた。菌の濁度あたりの吸光度を計算し、プロテアーゼ活性の比較を行った。なお、上記の酵素反応系に反応停止液を加えた後、酵素溶液を加えた系をブランクとする。
【００４２】
（７）（６）の結果、プロテアーゼ活性が最も低下した菌株としてＬ−Ｄ７株を取得した。前記菌株をＬＢ培地で培養し、得られた培養液１ｍＬに滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合し、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注して−８０℃にて凍結保存した。
【００４３】
（８）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｄ７株を植菌して３７℃で静置培養し、出現したコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで、凍結乾燥菌体を調製した。
【００４４】
実施例２ 本発明のバチルス属細菌変異体の取得（その２）
以下に示す方法で、プロテアーゼ活性が低下したバチルス属細菌変異体を取得した。
【００４５】
（１）ＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／Ｌ、食塩 １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ）４ｍＬ入りの１４ｍＬ容チューブに細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行った。この培養液のうち１．０ｍＬを１．５ｍＬ容のチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００４６】
（２）（１）の菌体を１０μｇ／ｍＬのＮＴＧの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液１．０ｍＬに懸濁し、１０から６０分間室温で静置することで変異導入処理を行なった。
【００４７】
（３）遠心分離して菌体を回収後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。
【００４８】
（４）回収した菌体を３ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃で一晩振とう培養を行なった後、ＬＢ培地に１．５重量％の寒天を加えて調製した平板培地に塗布して、３７℃で一晩静置培養した。
【００４９】
（５）生じたコロニー全てを網羅的に選択し、９６穴ディープウェルプレート上の３ＹＣ培地（ポリペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、グルコース ３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・七水和物 ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）１ｍＬに植菌した後、３７℃で一晩振とう培養した。
【００５０】
（６）遠心分離した培養液の上清を用いて、下記に示すアゾカゼイン法によるプロテアーゼ活性を測定し、プロテアーゼ活性が低下した菌株の選定を行なった。
（６−１）培養液の遠心上清０．１５ｍＬを９６穴プレートに分注し、１（ｗ／ｖ）％アゾカゼイン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液０．１５ｍＬを添加して、３７℃１時間反応させた。
（６−２）反応停止液０．３ｍＬを加えた後、３７℃１５分間静置した。生じた酸変性タンパク質を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）することで除去し、上清０．１ｍＬを吸光度測定用９６穴プレートへ分注し、アルカリ溶液０．２ｍＬを加えて、４４０ｎｍの吸光度分光光度計を用いて測定した。
【００５１】
（７）（６）の結果、プロテアーゼ活性が最も大きく低下した菌株としてＬ−Ｇ９株を取得した。前記菌株をＬＢ培地で培養し、得られた培養液１ｍＬに滅菌した７０％グリセロ−ル水溶液０．４ｍＬを加えてよく混合し、あらかじめ滅菌したサンプル瓶（容量２ｍＬ）に分注して−８０℃にて凍結保存した。
【００５２】
（８）ＬＢ培地プレート上にＬ−Ｇ９株を植菌して３７℃で静置培養後、出現したコロニーを２０％スキムミルク水溶液で懸濁した。次いで、アンプル管に約０．１ｍＬずつ分注して、液体窒素中で凍結した後に凍結乾燥機で乾燥し、減圧を保ったまま封管することで、凍結乾燥菌体を調製した。
【００５３】
実施例３ 本発明のバチルス属細菌変異体のプロテアーゼ活性
実施例１及び２で取得したバチルス属細菌変異体、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）野生株とで、ＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質を用いてプロテアーゼ活性を比較した。
【００５４】
（１）培養液の遠心上清０．６７５ｍＬと適度に希釈した精製ＦｃγＲＩ溶液０．０７５ｍＬを混和後、４℃および３０℃にて静置し、一定時間経過ごとに０．１５ｍＬずつサンプリングを行なった。
【００５５】
（２）経時変化に対してＦｃγＲＩの残存率を下記に示すＥＬＩＳＡ法で測定し、培養上清中のＦｃγＲＩ分解活性を測定した。
（２−１）９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固定した。
（２−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（２−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、形質転換体の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体ガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（２−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５６】
結果を表１に示す。なお、かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７株及びＬ−Ｇ９株の相対値（％）を示す。Ｌ−Ｄ７株が有するプロテアーゼ活性は１５．９（濁度あたりのプロテアーゼ活性、以降同じ）、Ｌ−Ｇ９株のプロテアーゼ活性は１７．５であり、野生株が有する活性（２４．０）より、それぞれＬ−Ｄ７株で約３３％、Ｌ−Ｇ９株で約２７％それぞれ低下していた。また、ＦｃγＲＩ分解活性で比較すると、３０℃・２４時間後のＦｃγＲＩ残存率が野生株では１８％に対し、Ｌ−Ｄ７株では２３％、Ｌ−Ｇ９株では２２％と、いずれも野生株よりもプロテアーゼ活性抑制効果が見られた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
実施例４ 本発明のバチルス属細菌変異体を用いたＦｃγＲＩ生産
宿主として実施例１及び２で取得したバチルス属細菌変異体、及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）野生株を用いたときにおける、組み換えＦｃγＲＩタンパク質の発現量を比較した。
（１）プラスミドベクターを用いた一般的な遺伝子工学的手法により、ＦｃγＲＩ遺伝子を、野生株、または実施例１及び２で取得した変異株（Ｌ−Ｄ７株、Ｌ−Ｇ９株）へ形質転換後、ＢＴＹｍ２培地（ポリペプトンペプトン ３０ｇ／Ｌ、酵母エキス ７．５ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・七水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン・四水和物 ０．０１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・七水和物 ０．００１ｇ／Ｌ）２００ｍＬに植菌し、３０℃にて２日間培養した。
（２）遠心上清を回収した後、上清中のＦｃγＲＩ生産量を、実施例３（２）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、形質転換体でのＦｃγＲＩ生産性を測定した。
【００５９】
結果を表２に示す。かっこ内の数字は、それぞれ野生株の結果を１００％とした際のＬ−Ｄ７株及びＬ−Ｇ９株の相対値（％）を示す。宿主として野生株を用いたときのＦｃγＲＩ発現量が７７μｇ／Ｌであったのに対して、実施例１及び２で取得した株を用いたときのＦｃγＲＩ発現量は８３μｇ／Ｌ（Ｌ−Ｄ７株）、及び７９μｇ／Ｌ（Ｌ−Ｇ９株）といずれも野生株より向上した。以上より、バチルス属細菌を宿主として用いて組換タンパク質を発現させる際、バチルス属細菌としてプロテアーゼ活性が低下した変異株を用いることで、タンパク質発現量が向上していることがわかる。
【００６０】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで得られる、プロテアーゼ活性が前記野生株より低下したバチルス属細菌変異株。
【請求項２】
バチルス属細菌野生株がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）であることを特徴とする、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、請求項１または２に記載の変異株へ形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なバチルス属細菌。
【請求項４】
タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、請求項３に記載のバチルス属細菌。
【請求項５】
請求項４に記載のバチルス属細菌を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項１】
バチルス属細菌野生株を変異原物質で処理することで得られる、プロテアーゼ活性が前記野生株より低下したバチルス属細菌変異株。
【請求項２】
バチルス属細菌野生株がＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓｕｓ（ＮＢＲＣ１５７１６）であることを特徴とする、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、請求項１または２に記載の変異株へ形質転換することにより得られる、前記タンパク質を発現可能なバチルス属細菌。
【請求項４】
タンパク質がヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩである、請求項３に記載のバチルス属細菌。
【請求項５】
請求項４に記載のバチルス属細菌を用いたヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１６２００１（Ｐ２０１０−１６２００１Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６８０（Ｐ２００９−８６８０）
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１９日（２００９．１．１９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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