プロテインキナーゼ活性の解析方法
【課題】基質ペプチドのリン酸化検出で、プロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングする方法を提供。
【解決手段】プロテインキナーゼの基質ペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されたアレイ上の該ペプチドのリン酸化検出で、ビオチン修飾の例えば式（Ｉ）のポリアミン亜鉛錯体を作用させ、その後アビジンを作用させてプロテインキナーゼ活性の解析。
【解決手段】プロテインキナーゼの基質ペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されたアレイ上の該ペプチドのリン酸化検出で、ビオチン修飾の例えば式（Ｉ）のポリアミン亜鉛錯体を作用させ、その後アビジンを作用させてプロテインキナーゼ活性の解析。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドが１もしくは複数種固定化されてなるアレイを用いたプロテインキナーゼ活性の解析方法であって、アレイ上でリン酸化反応を行った後、ビオチン修飾されたキレート化合物を作用させることによりリン酸化を検出する方法に関する。特に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと示すこともある。）による分析技術を用いることにより、迅速で効率的であり、しかも簡便なプロテインキナーゼ活性の解析を実現することができるものである。より具体的には、ＳＰＲにより解析された物質間の相互作用の様子をモニターした表面プラズモン共鳴イメージング法（以下、ＳＰＲイメージング法と示すこともある。）を応用した新規なプロテインキナーゼ活性の解析方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、増殖因子やサイトカインにより活性化した細胞表面の受容体からどのように核へシグナルが伝達されるかはもとより、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生死などを制御する様々なシグナル伝達経路の実態が明らかになってきた。これらのシグナル伝達経路は独立して機能しているのではなく、互いにクロストークしあい、システムとして機能している。そして、癌をはじめ色々な疾病の原因が、これらのシグナル伝達経路の異常として説明されるようになってきた。
【０００３】
上述したシグナル伝達経路においては、様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析して、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待される。しかしながら、これまでには簡便で効率よく種々のプロテインキナーゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術は、未だ確立されていないのが現状である。
【０００４】
既に報告されている関連する技術としては、例えばペプチドアレイを用いてチロシンキナーゼの一種であるｃＳｒｃキナーゼの活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ｐ６０チロシンキナーゼやプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡとも示す。）などに関して、おのおのの基質ペプチドをガラススライドに固定化したアレイを用いて、蛍光標識された抗体を用いたリン酸化反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献２及び３参照）や、あるいは放射性物質（［γ32Ｐ］ＡＴＰ）を用いたアレイ上でのキナーゼ反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献４，５及び６参照）がある。しかしながら、いずれの先行技術においても種々のプロテインキナーゼの動態を同時に効率的にプロファイリングための方法としては、十分な技術が開示されているものではない。また上記いずれの方法においても、蛍光性物質や放射性物質を用いる必要があり、解析に手間を要する点や、取り扱いの困難性、特殊な技術や施設の必要性などの点で大きな問題がある。
【０００５】
抗体を用いた検出系は広く適用されているものの、特にリン酸化セリン、リン酸化スレオニンを認識する抗体に関しては、その結合特異性や親和性の点で十分な特性を有するものも見出されておらず、精度のよい測定の実現には大きな問題がある。また抗体の場合は、リン酸化アミノ酸の種類に応じて別々なものを作用させる必要があることや、リン酸化アミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列への結合依存性が高い場合が多く、ユニバーサルな検出系手段として利用するにはあまり有利ではない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２０巻、第２７０〜２７４頁（２００２年３月発行）
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０８５〜２０８８頁（２００２年発行）
【非特許文献３】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０７９〜２０８３頁（２００２年発行）
【非特許文献４】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第１３巻、第３１５〜３２０頁（２００２年発行）
【非特許文献５】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７７巻、第２７８３９〜２７８４９頁（２００２年発行）
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８９巻、第１７６０〜１７６３頁（２０００年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安価な物質を用いて迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により基質ペプチドのリン酸化を検出することにより、特に種々のプロテインキナーゼにおける動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドが固定化されてなるアレイを用いてプロテインキナーゼによるリン酸化を行った後、特定の分子量を有するビオチン修飾キレート化合物を作用させ、好適には更にストレプトアビジンもしくはアビジンを作用させた際に、特に該アレイ上における物質間の相互作用をＳＰＲイメージング法により検出することが、様々なプロテインキナーゼ動態を迅速に特に網羅的な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明は以下のような構成からなる。
１．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際してリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
２．リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする１のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
３．レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする１または２のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
４．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リガンドにより修飾されたキレート化合物とレセプターとの複合体を形成させ、該複合体を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
５．複合体を作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする４のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
６．リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００である１〜５のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
７．リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が６００〜９００である６のプロテインキナーゼ活性の解析方法
８．リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする１〜７のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
９．キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする１〜８のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１０．キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる１〜９のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１１．キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いる１〜１０のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【化１】
１２．前記ペプチドがｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質である１〜１１のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１３．各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも２種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる１〜１２のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１４．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする１〜１３のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１５．リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする１〜１４のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における基板上のリン酸化ペプチドの検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことが可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。ＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能である点でより好ましい。
【００１２】
ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰを本発明のアレイ上に適用して行うことができる。最適なリン酸化反応条件はプロテインキナーゼの種類に応じて変動するが、例えば、バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ2+，Ｃａ2+リン脂質などのリン酸化を補助する物質を共存させるのがよい。
【００１３】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できる。
【００１４】
本発明において、ペプチドはプロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類のペプチドは１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。プロテインキナーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテインキナーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで全てのプロテインキナーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテインキナーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテインキナーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１５】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１６】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω1 と周波数ω2）が媒質中で混合され、ω1＋ω2、あるいはω1−ω2の光が発生する現象である。特にω1として可視光を用い、ω2として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１７】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲは蛍光物質、放射性物質などによるラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１８】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００１９】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２０】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２１】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２２】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ2に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２３】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２４】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２５】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２６】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【００２７】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２８】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のキナーゼを含有する溶液を作用させ、さらにキレート化合物を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテインキナーゼの基質となるペプチドとは、該プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドをいうものである。
【００２９】
ペプチドの長さは特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のものが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産されたペプチドを用いてもよい。また基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させたものを用いるのも有用である。
【００３０】
上記ペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。
【００３１】
その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００３２】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるためには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。
【００３３】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加したペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００３４】
本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするためにキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が、亜鉛、鉄、コバルト、パラジウムのような金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３５】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３６】
【化２】
【００３７】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ2Ｌ）は、市販の１，３−ビス[ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ2Ｌ−ＣＨ3ＣＯＯ-・２ＣｌＯ4-・Ｈ2Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００３８】
本発明に用いられるリガンドとレセプターは、お互いを特異的に認識し結合できる関係にあるものが選択されるのがよい。リガンドとレセプターの例としては、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ステロイドホルモンとステロイドホルモンレセプター、核酸と転写因子、一本鎖核酸配列とその一本鎖核酸配列に相補的な配列を有する一本鎖核酸配列などがあげられる。なかでも、リガンドとしてビオチン、レセプターとしてアビジンもしくはストレプトアビジンを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明においては、上述のようなポリアミン亜鉛錯体が例えばビオチンのようなリガンドにより修飾されたものを用いることを特徴とする。なお、リガンドとはビオチンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンや核酸などであってもよい。直鎖状のリンカー構造を介してビオチン修飾されていることが好ましい。そして、その分子量としては５００〜１０００の範囲であり、より好ましくは６００〜９００、更に好ましくは７００〜９００である。具体的には、式（ＩＩ）に示されるような構造のものが例示されるが、特に限定されるものではない。ビオチン修飾されたポリアミン亜鉛錯体の分子量が１０００を超えると、安定性も悪くなり、リン酸への結合効率の点からも好ましくない。
【００４０】
【化３】
【００４１】
なお、本発明において作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。
【００４２】
本発明においては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させるだけでもリン酸化を検出することは可能な場合もあるが、特にビオチンが修飾されたものを用いることにより、その後更に、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンのようなレセプターを作用させることにより、その検出感度がより高まるという効果を期待することができる。なお、レセプターとは、アビジンもしくはストレプトアビジンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンレセプターや転写因子や核酸などであってもよい。ストレプトアビジンを作用させる方がより好ましい。作用させるアビジンもしくはストレプトアビジンの濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の場合と同様である。
【００４３】
更に好ましい態様として、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後に、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体いずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。アレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンの場合と同様である。
【００４４】
また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。
【００４５】
こうしたキレート性化合物の適用は、上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。
【００４６】
また、上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００４９】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００５０】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５１】
上記のようにして得られた表面に、５種類のプロテインキナーゼ基質（リン酸化基質及び非リン酸化基質）を固定化させた。各基質ペプチドのアミノ酸配列並びにその固定化に関する配置を図１下部に示した。ｂｌａｎｋはペプチドを固定化しないブランクスポットを示す。それぞれの基質ペプチドをリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTMスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００５２】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、ＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、３００μｌをチップ上に注出し、室温で３０分反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００５３】
（アレイ上のリン酸基検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（ＩＩ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所より購入）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４は２５μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。作用は室温で１時間行った。
【００５４】
【化４】
【００５５】
上記作用させたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、上記と同じ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ストレプトアビジン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製）を同緩衝液に溶解して、１，５，１０，５０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製し、順次プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。得られたセンサーグラムを図１上部に示した。リン酸化基質の種類によりその強度に差異はあるものの、いずれのリン酸化基質においても非リン酸化基質と比べると有意なシグナル上昇を確認することができている。
【００５６】
また、ＳＰＲイメージングを行った結果を図１中段に示した。これはＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、ストレプトアビジン（以下、ＳＡと示すこともある。）反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。リン酸化基質の固定化された箇所にのみスポットが認められており、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４が特異的に結合していることが確認されている。
【００５７】
［実施例２］
実施例１と同じアレイを用いて未反応マレイミド基のブロッキングまでは同様に行い、アレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４をランニングバッファーに溶解して１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製し、順次プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。その後ランニングバッファーを送液させながら洗浄を行った後、ストレプトアビジン溶液を１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度順に送液して作用させた。得られたセンサーグラムを図２上部に示した。この場合においてもリン酸化基質の種類によりその強度に差異はあるものの、いずれのリン酸化基質においても非リン酸化基質と比べると有意なシグナル上昇を確認することができている。また実施例１と同様にしてＳＰＲイメージングを行った結果を図２中段に示した。これについても同様の傾向が確認される。
【００５８】
［実施例３］
（ペプチド固定化）
金基板への４ａｒｍＰＥＧチオールの結合は、実施例１と同様に行った。その後のＵＶ照射に際しては、フォトマスクとして５００μｍ四方の正方形の穴が１６個（４個×４個のパターンからなる。）有するものを用いた点以外は、実施例１と同様にしてパターン化を行った。その後のアレイ表面へのアミノ基の導入、架橋剤を用いたマレイミド基表面の形成も、実施例１と同様に行った。基質ペプチドのスポッティングはマニュアル操作により０．１μｌずつで行った。基質としては、ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）基質（図１のＰＫＡ（Ｓｅｒ）と同じ）、セリン残基が予めリン酸化されたポジティブコントロール（ｐＰＫＡ）、セリン残基がアラニン残基に置換されているネガティブコントロール（ｎＰＫＡ）を用いて、図３下部に示したような配置で固定化させた。スポット後の反応も実施例１と同様に行った。
【００５９】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
実施例１と全く同様にして行った。
【００６０】
（アレイ上のリン酸基検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、３０分間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）４μｌとした。
【００６１】
ＰＫＡ反応を行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４を実施例１と同じ条件により作用させた。そのアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。実施例１と同様にストレプトアビジン溶液を１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度の順に送液しながら作用させた。その結果得られたセンサーグラム及びＳＰＲイメージングを行った結果を図３に示した。ポジティブコントロールにおいては最も強い結合シグナルが確認されており、さらにＰＫＡ基質においてもある程度の割合で結合シグナルが確認できている。ネガティブコントロール、ブランクにおいてはほとんどシグナル変化が認められていない。この結果より、アレイ上におけるＰＫＡ基質のリン酸化を検出できていることが示される。
【００６２】
［実施例４］
実施例３と同じＰＫＡ基質及びそのポジティブコントロール、ネガティブコントロール並びにｃＳｒｃ基質及びそのポジティブコントロールを９６点に固定化したアレイを実施例１と同様にして作製した。基質の配置は図４下部に示す通りである。ブロッキング、ＰＫＡ反応、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４の作用を実施例３と同様にして行い、アレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。ストレプトアビジン溶液（１０μｇ／ｍｌ）を送液により作用させた。シグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２．５μｇ／ｍｌ濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラム及びＳＰＲイメージングを行った結果を図４に示した。ＰＫＡ及びｃＳｒｃ基質のポジティブコントロールにおいては、いずれも強いシグナル上昇が確認され、ＰＫＡ基質においてもある程度のシグナル上昇が確認できる。ネガティブコントロール、ブランクにおいいてはほとんどシグナル変化は見られていない。シグナル上昇はストレプトアビジン抗体の作用させるとより顕著になっており、その特異性の面でも優れていることから、優れた増感効果を奏していることが示される。
【００６３】
［実施例５］
図１に示したＰＫＡ基質（スレオニン型）、ＰＫＣ基質（セリン型）、ｃＳｒｃ基質（Ｙａｏ；チロシン型）についてリン酸化、非リン酸化基質を固定化したアレイを実施例１と同様にして作製した。その後のブロッキングも実施例１と同様にして行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングした。一方、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４溶液（５０μｇ／ｍｌ）とストレプトアビジン溶液（７５μｇ／ｍｌ）を等量ずつ混合させて室温で３０分反応させて、複合体を形成させた。この複合体溶液を実施例１と同じランニングバッファーで１０倍、５倍希釈したものを送液しながら作用させた。更にシグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２．５μｇ／ｍｌ濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラムを図５に示した。この場合もリン酸化基質においてのみ特異的にシグナル上昇を認めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待され、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図３】実施例３において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図４】実施例４において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図５】実施例５におけるＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドが１もしくは複数種固定化されてなるアレイを用いたプロテインキナーゼ活性の解析方法であって、アレイ上でリン酸化反応を行った後、ビオチン修飾されたキレート化合物を作用させることによりリン酸化を検出する方法に関する。特に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと示すこともある。）による分析技術を用いることにより、迅速で効率的であり、しかも簡便なプロテインキナーゼ活性の解析を実現することができるものである。より具体的には、ＳＰＲにより解析された物質間の相互作用の様子をモニターした表面プラズモン共鳴イメージング法（以下、ＳＰＲイメージング法と示すこともある。）を応用した新規なプロテインキナーゼ活性の解析方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、増殖因子やサイトカインにより活性化した細胞表面の受容体からどのように核へシグナルが伝達されるかはもとより、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生死などを制御する様々なシグナル伝達経路の実態が明らかになってきた。これらのシグナル伝達経路は独立して機能しているのではなく、互いにクロストークしあい、システムとして機能している。そして、癌をはじめ色々な疾病の原因が、これらのシグナル伝達経路の異常として説明されるようになってきた。
【０００３】
上述したシグナル伝達経路においては、様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析して、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待される。しかしながら、これまでには簡便で効率よく種々のプロテインキナーゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術は、未だ確立されていないのが現状である。
【０００４】
既に報告されている関連する技術としては、例えばペプチドアレイを用いてチロシンキナーゼの一種であるｃＳｒｃキナーゼの活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ｐ６０チロシンキナーゼやプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡとも示す。）などに関して、おのおのの基質ペプチドをガラススライドに固定化したアレイを用いて、蛍光標識された抗体を用いたリン酸化反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献２及び３参照）や、あるいは放射性物質（［γ32Ｐ］ＡＴＰ）を用いたアレイ上でのキナーゼ反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献４，５及び６参照）がある。しかしながら、いずれの先行技術においても種々のプロテインキナーゼの動態を同時に効率的にプロファイリングための方法としては、十分な技術が開示されているものではない。また上記いずれの方法においても、蛍光性物質や放射性物質を用いる必要があり、解析に手間を要する点や、取り扱いの困難性、特殊な技術や施設の必要性などの点で大きな問題がある。
【０００５】
抗体を用いた検出系は広く適用されているものの、特にリン酸化セリン、リン酸化スレオニンを認識する抗体に関しては、その結合特異性や親和性の点で十分な特性を有するものも見出されておらず、精度のよい測定の実現には大きな問題がある。また抗体の場合は、リン酸化アミノ酸の種類に応じて別々なものを作用させる必要があることや、リン酸化アミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列への結合依存性が高い場合が多く、ユニバーサルな検出系手段として利用するにはあまり有利ではない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２０巻、第２７０〜２７４頁（２００２年３月発行）
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０８５〜２０８８頁（２００２年発行）
【非特許文献３】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０７９〜２０８３頁（２００２年発行）
【非特許文献４】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第１３巻、第３１５〜３２０頁（２００２年発行）
【非特許文献５】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７７巻、第２７８３９〜２７８４９頁（２００２年発行）
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８９巻、第１７６０〜１７６３頁（２０００年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安価な物質を用いて迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により基質ペプチドのリン酸化を検出することにより、特に種々のプロテインキナーゼにおける動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドが固定化されてなるアレイを用いてプロテインキナーゼによるリン酸化を行った後、特定の分子量を有するビオチン修飾キレート化合物を作用させ、好適には更にストレプトアビジンもしくはアビジンを作用させた際に、特に該アレイ上における物質間の相互作用をＳＰＲイメージング法により検出することが、様々なプロテインキナーゼ動態を迅速に特に網羅的な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明は以下のような構成からなる。
１．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際してリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
２．リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする１のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
３．レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする１または２のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
４．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リガンドにより修飾されたキレート化合物とレセプターとの複合体を形成させ、該複合体を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
５．複合体を作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする４のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
６．リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００である１〜５のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
７．リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が６００〜９００である６のプロテインキナーゼ活性の解析方法
８．リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする１〜７のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
９．キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする１〜８のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１０．キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる１〜９のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１１．キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いる１〜１０のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【化１】
１２．前記ペプチドがｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質である１〜１１のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１３．各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも２種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる１〜１２のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１４．少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする１〜１３のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
１５．リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする１〜１４のいずれかのプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における基板上のリン酸化ペプチドの検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことが可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。ＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能である点でより好ましい。
【００１２】
ペプチドのリン酸化は、プロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸、例えばＡＴＰを本発明のアレイ上に適用して行うことができる。最適なリン酸化反応条件はプロテインキナーゼの種類に応じて変動するが、例えば、バッファー中にプロテインキナーゼを有し得る供試試料とヌクレオシド三リン酸を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜４０℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜１時間程度反応させることで、ペプチドをリン酸化することができる。必要に応じて、リン酸化の反応溶液には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ2+，Ｃａ2+リン脂質などのリン酸化を補助する物質を共存させるのがよい。
【００１３】
動態のプロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン、ヒスチジンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーなどが例示できる。
【００１４】
本発明において、ペプチドはプロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類のペプチドは１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。プロテインキナーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテインキナーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで全てのプロテインキナーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテインキナーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテインキナーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１５】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１６】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω1 と周波数ω2）が媒質中で混合され、ω1＋ω2、あるいはω1−ω2の光が発生する現象である。特にω1として可視光を用い、ω2として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１７】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲは蛍光物質、放射性物質などによるラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１８】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００１９】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２０】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２１】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２２】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ2に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２３】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２４】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２５】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２６】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【００２７】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２８】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種のペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のキナーゼを含有する溶液を作用させ、さらにキレート化合物を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテインキナーゼの基質となるペプチドとは、該プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドをいうものである。
【００２９】
ペプチドの長さは特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のものが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産されたペプチドを用いてもよい。また基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させたものを用いるのも有用である。
【００３０】
上記ペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。
【００３１】
その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００３２】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるためには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。
【００３３】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加したペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００３４】
本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするためにキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が、亜鉛、鉄、コバルト、パラジウムのような金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましく、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。
【００３５】
このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。
【００３６】
【化２】
【００３７】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ2Ｌ）は、市販の１，３−ビス[ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ2Ｌ−ＣＨ3ＣＯＯ-・２ＣｌＯ4-・Ｈ2Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００３８】
本発明に用いられるリガンドとレセプターは、お互いを特異的に認識し結合できる関係にあるものが選択されるのがよい。リガンドとレセプターの例としては、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ステロイドホルモンとステロイドホルモンレセプター、核酸と転写因子、一本鎖核酸配列とその一本鎖核酸配列に相補的な配列を有する一本鎖核酸配列などがあげられる。なかでも、リガンドとしてビオチン、レセプターとしてアビジンもしくはストレプトアビジンを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明においては、上述のようなポリアミン亜鉛錯体が例えばビオチンのようなリガンドにより修飾されたものを用いることを特徴とする。なお、リガンドとはビオチンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンや核酸などであってもよい。直鎖状のリンカー構造を介してビオチン修飾されていることが好ましい。そして、その分子量としては５００〜１０００の範囲であり、より好ましくは６００〜９００、更に好ましくは７００〜９００である。具体的には、式（ＩＩ）に示されるような構造のものが例示されるが、特に限定されるものではない。ビオチン修飾されたポリアミン亜鉛錯体の分子量が１０００を超えると、安定性も悪くなり、リン酸への結合効率の点からも好ましくない。
【００４０】
【化３】
【００４１】
なお、本発明において作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。
【００４２】
本発明においては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させるだけでもリン酸化を検出することは可能な場合もあるが、特にビオチンが修飾されたものを用いることにより、その後更に、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンのようなレセプターを作用させることにより、その検出感度がより高まるという効果を期待することができる。なお、レセプターとは、アビジンもしくはストレプトアビジンに限定されるものではなく、ステロイドホルモンレセプターや転写因子や核酸などであってもよい。ストレプトアビジンを作用させる方がより好ましい。作用させるアビジンもしくはストレプトアビジンの濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の場合と同様である。
【００４３】
更に好ましい態様として、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後に、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体いずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。アレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンの場合と同様である。
【００４４】
また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。
【００４５】
こうしたキレート性化合物の適用は、上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。
【００４６】
また、上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００４９】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００５０】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５１】
上記のようにして得られた表面に、５種類のプロテインキナーゼ基質（リン酸化基質及び非リン酸化基質）を固定化させた。各基質ペプチドのアミノ酸配列並びにその固定化に関する配置を図１下部に示した。ｂｌａｎｋはペプチドを固定化しないブランクスポットを示す。それぞれの基質ペプチドをリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTMスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００５２】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、ＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、３００μｌをチップ上に注出し、室温で３０分反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
【００５３】
（アレイ上のリン酸基検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（ＩＩ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所より購入）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４は２５μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。作用は室温で１時間行った。
【００５４】
【化４】
【００５５】
上記作用させたアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、上記と同じ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。ストレプトアビジン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ製）を同緩衝液に溶解して、１，５，１０，５０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製し、順次プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。得られたセンサーグラムを図１上部に示した。リン酸化基質の種類によりその強度に差異はあるものの、いずれのリン酸化基質においても非リン酸化基質と比べると有意なシグナル上昇を確認することができている。
【００５６】
また、ＳＰＲイメージングを行った結果を図１中段に示した。これはＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、ストレプトアビジン（以下、ＳＡと示すこともある。）反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。リン酸化基質の固定化された箇所にのみスポットが認められており、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４が特異的に結合していることが確認されている。
【００５７】
［実施例２］
実施例１と同じアレイを用いて未反応マレイミド基のブロッキングまでは同様に行い、アレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４をランニングバッファーに溶解して１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度の溶液を調製し、順次プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いて送液させながらアレイ表面に作用させた。温度は３０℃に設定して行った。その後ランニングバッファーを送液させながら洗浄を行った後、ストレプトアビジン溶液を１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度順に送液して作用させた。得られたセンサーグラムを図２上部に示した。この場合においてもリン酸化基質の種類によりその強度に差異はあるものの、いずれのリン酸化基質においても非リン酸化基質と比べると有意なシグナル上昇を確認することができている。また実施例１と同様にしてＳＰＲイメージングを行った結果を図２中段に示した。これについても同様の傾向が確認される。
【００５８】
［実施例３］
（ペプチド固定化）
金基板への４ａｒｍＰＥＧチオールの結合は、実施例１と同様に行った。その後のＵＶ照射に際しては、フォトマスクとして５００μｍ四方の正方形の穴が１６個（４個×４個のパターンからなる。）有するものを用いた点以外は、実施例１と同様にしてパターン化を行った。その後のアレイ表面へのアミノ基の導入、架橋剤を用いたマレイミド基表面の形成も、実施例１と同様に行った。基質ペプチドのスポッティングはマニュアル操作により０．１μｌずつで行った。基質としては、ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）基質（図１のＰＫＡ（Ｓｅｒ）と同じ）、セリン残基が予めリン酸化されたポジティブコントロール（ｐＰＫＡ）、セリン残基がアラニン残基に置換されているネガティブコントロール（ｎＰＫＡ）を用いて、図３下部に示したような配置で固定化させた。スポット後の反応も実施例１と同様に行った。
【００５９】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
実施例１と全く同様にして行った。
【００６０】
（アレイ上のリン酸基検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、３０分間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス製）４μｌとした。
【００６１】
ＰＫＡ反応を行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４を実施例１と同じ条件により作用させた。そのアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。実施例１と同様にストレプトアビジン溶液を１，５，１０μｇ／ｍｌ濃度の順に送液しながら作用させた。その結果得られたセンサーグラム及びＳＰＲイメージングを行った結果を図３に示した。ポジティブコントロールにおいては最も強い結合シグナルが確認されており、さらにＰＫＡ基質においてもある程度の割合で結合シグナルが確認できている。ネガティブコントロール、ブランクにおいてはほとんどシグナル変化が認められていない。この結果より、アレイ上におけるＰＫＡ基質のリン酸化を検出できていることが示される。
【００６２】
［実施例４］
実施例３と同じＰＫＡ基質及びそのポジティブコントロール、ネガティブコントロール並びにｃＳｒｃ基質及びそのポジティブコントロールを９６点に固定化したアレイを実施例１と同様にして作製した。基質の配置は図４下部に示す通りである。ブロッキング、ＰＫＡ反応、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４の作用を実施例３と同様にして行い、アレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーは実施例１と同じものを用いた。ストレプトアビジン溶液（１０μｇ／ｍｌ）を送液により作用させた。シグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２．５μｇ／ｍｌ濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラム及びＳＰＲイメージングを行った結果を図４に示した。ＰＫＡ及びｃＳｒｃ基質のポジティブコントロールにおいては、いずれも強いシグナル上昇が確認され、ＰＫＡ基質においてもある程度のシグナル上昇が確認できる。ネガティブコントロール、ブランクにおいいてはほとんどシグナル変化は見られていない。シグナル上昇はストレプトアビジン抗体の作用させるとより顕著になっており、その特異性の面でも優れていることから、優れた増感効果を奏していることが示される。
【００６３】
［実施例５］
図１に示したＰＫＡ基質（スレオニン型）、ＰＫＣ基質（セリン型）、ｃＳｒｃ基質（Ｙａｏ；チロシン型）についてリン酸化、非リン酸化基質を固定化したアレイを実施例１と同様にして作製した。その後のブロッキングも実施例１と同様にして行い、ＳＰＲ装置（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒTM）にセッティングした。一方、Ｐｈｏｓ−ｔａｇTMＢＴＬ−１０４溶液（５０μｇ／ｍｌ）とストレプトアビジン溶液（７５μｇ／ｍｌ）を等量ずつ混合させて室温で３０分反応させて、複合体を形成させた。この複合体溶液を実施例１と同じランニングバッファーで１０倍、５倍希釈したものを送液しながら作用させた。更にシグナル上昇がプラトーになるのを確認後、ランニングバッファーの送液により洗浄して、ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２．５μｇ／ｍｌ濃度にして送液により作用させた。得られたセンサーグラムを図５に示した。この場合もリン酸化基質においてのみ特異的にシグナル上昇を認めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待され、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図２】実施例２におけるＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図３】実施例３において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図４】実施例４において、アレイ上に基質ペプチドを固定化したパターン並びにＳＰＲ解析及びＳＰＲイメージングを行った結果を示す図である。
【図５】実施例５におけるＳＰＲ解析を行った結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際してリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項２】
リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする請求項１に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項３】
レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項１または２に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項４】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リガンドにより修飾されたキレート化合物とレセプターとの複合体を形成させ、該複合体を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項５】
複合体を作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項４に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項６】
リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００である請求項１〜５のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項７】
リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が６００〜９００である請求項６記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法
【請求項８】
リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項９】
キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１０】
キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる請求項１〜９のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１１】
キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いる請求項１〜１０のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【化１】
【請求項１２】
前記ペプチドがｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質である請求項１〜１１のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１３】
各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも２種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる請求項１〜１２のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１５】
リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リン酸化の検出に際してリガンドにより修飾されているキレート化合物を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項２】
リガンドにより修飾されたキレート化合物を作用させた後、更にレセプターを作用させることを特徴とする請求項１に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項３】
レセプターを作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項１または２に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項４】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板上に固定化されてなるアレイ上における該ペプチドのリン酸化を検出する方法であって、リガンドにより修飾されたキレート化合物とレセプターとの複合体を形成させ、該複合体を作用させ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して検出することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項５】
複合体を作用させた後、更にレセプターを認識する抗体を作用させることを特徴とする請求項４に記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項６】
リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が５００〜１０００である請求項１〜５のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項７】
リガンドにより修飾されたキレート化合物の分子量が６００〜９００である請求項６記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法
【請求項８】
リガンドがビオチンであり、リガンドに特異的なレセプターがアビジンもしくはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項９】
キレート化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１０】
キレート化合物として、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる請求項１〜９のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１１】
キレート化合物として、式（Ｉ）に記載される化合物を用いる請求項１〜１０のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【化１】
【請求項１２】
前記ペプチドがｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー、 ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）ファミリー、ミオシン軽鎖キナーゼファミリー、プロテインキナーゼC（ＰＫＣ）ファミリー、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ）ファミリー、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードに属するプロテインキナーゼファミリー、Ｓｒｃチロシンキナーゼファミリー、及び受容体型チロシンキナーゼファミリーからなる群から選ばれる少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質である請求項１〜１１のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１３】
各々が別々のプロテインキナーゼの基質である、少なくとも２種のペプチドが金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いる請求項１〜１２のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１４】
少なくとも１種のプロテインキナーゼの基質となる対応する少なくとも１種のペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ上のペプチドにプロテインキナーゼを含み得る供試材料及びヌクレオシド三リン酸を作用させ、リン酸化された前記ペプチドを検出することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【請求項１５】
リン酸化されたペプチドを、表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のプロテインキナーゼ活性の解析方法。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２４４３８６（Ｐ２００７−２４４３８６Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７５９４３（Ｐ２００７−７５９４３）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【分割の表示】特願２００４−３２３５３１（Ｐ２００４−３２３５３１）の分割
【原出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【分割の表示】特願２００４−３２３５３１（Ｐ２００４−３２３５３１）の分割
【原出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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