プロトン濃度トポグラフィーならびにその生成方法および生成デバイス
等電点フォーカシングのためのデバイス。デバイスは、長さ軸を有し、かつ、電解質溶液を含有するために構成されるフォーカシング容器と、前記長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含み、それぞれの前記電気分解ユニットが、イオン流を前記フォーカシング容器の中に注入して、その結果、前記長さ軸に沿った前記電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を作るようにするために構成され、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、前記ｐＨ勾配が、前記複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行）の内容は、本明細書中に完全に述べられているかのように組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、等電点フォーカシングのための方法およびシステムに関連する。
【背景技術】
【０００３】
等電点フォーカシングは、分析物サンプルにおける分子を、分子の異なるイオン的性質を利用することによって分離するための分析技術である。
【０００４】
等電点フォーカシングは通常、固定化されたプロトン濃度勾配、一般には、所与の方向でより高いｐＨからより低いｐＨにまで変化するプロトン濃度勾配を有する電解質溶液（場合によっては、例えば、ポリアクリルアミド、デンプンおよび／またはアガロースに基づくゲル形態での電解質溶液）において行われる。一部の実施では、溶液は、電場のもとでｐＨ勾配を生じさせる両性電解質を含有する。等電点フォーカシングでは、分離が、分離距離全体を占め、かつ、勾配におけるｐＨが陽極から陰極に向かって増大するｐＨ勾配において生じる。使用時において、分析物が電解質溶液におけるある場所に負荷される。それぞれの異なる分子の電荷が、分子の様々な官能基の酸性度（ｐＫａ）に従って周囲のプロトン濃度に応答して変化する。
【０００５】
電位が、等電点フォーカシング陽極と、等電点フォーカシング陰極との間でプロトン濃度勾配と平行に加えられる。正味の正電荷を有する分子が電解質溶液を通って陰極に向かって移動し、一方、正味の負電荷を有する分子が電解質溶液を通って陽極に向かって移動する。
【０００６】
これらの分子が移動するにつれ、周囲のｐＨが変化して、分子における正味の電荷を減少させ、ついには、分子が、周囲のｐＨのためではあるが、分子における正味の電荷がゼロとなる等電点（ｐＩ）に達する。この地点で、移動中の分子は、ゼロの電荷を有するので停止する。そのような様式において、等電点フォーカシングは、特定のｐＩを有する分子を電解質溶液の比較的狭い体積に集中させる。等電点フォーカシングは、タンパク質をその酸性度に従って特徴づけることによってタンパク質の分析のために有用である。より重要なことであるが、等電点フォーカシングは、タンパク質の混合物を分離するために有用である。
【０００７】
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、プロトンの局所的濃度、プロトン濃度勾配および所望されるプロトン濃度トポグラフィーを、電解質を含む環境（例えば、電解質溶液またはゲルなど）において生じさせる際に有用な方法およびデバイスを記載する。この特許出願はまた、等電点フォーカシングおよびデータ表示のための方法およびデバイスを開示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、長さ軸を有し、かつ、電解質溶液を含有するために構成されるフォーカシング容器と、長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含む。それぞれの電気分解ユニットが、イオン流をフォーカシング容器の中に注入して、その結果、長さ軸に沿った電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配をもたらすようにするために構成される。それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、ｐＨ勾配が、複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される。
【０００９】
場合によっては、ｐＨ傾斜部は少なくとも０．１のｐＨである。
【００１０】
場合によっては、それぞれの段差が少なくとも３ｍｍの長さである。
【００１１】
場合によっては、少なくとも１つの電気分解ユニットは複数の電気分解ユニットを含み、この場合、それぞれの電気分解ユニットを別個に制御するためのコントローラーをさらに含む。
【００１２】
場合によっては、電解質溶液は複数の生体分子を含み、これらの複数の生体分子がｐＨ勾配に沿った少なくとも１つのｐＨ傾斜部にのみ濃縮する。
【００１３】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの１０未満を含む。
【００１４】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの５未満を含む。
【００１５】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの２つを含む。
【００１６】
場合によっては、少なくとも１つの電気分解ユニットの１つが、複数のヒドロキシルイオンを注入するために構成され、かつ、少なくとも１つの電気分解ユニットの別の１つが、複数の水素イオンを注入するために構成される。
【００１７】
場合によっては、フォーカシング容器は複数の狭くなったセグメントを有する。それぞれの電気分解ユニットが、イオン流をそれぞれの狭いセグメントに注入するために構成される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液を含有するために構成され、かつ、第１および第２の末端部ならびに長さ軸を有するフォーカシング容器であって、少なくとも１つのスリットを第１および第２の末端部までの途中に有するフォーカシング容器と、第１の末端部および第２の末端部にそれぞれ取り付けられ、かつ、第１の電流を、電解質溶液を介してそれらの間に通すために構成される陽極および陰極とを含む。本デバイスはさらに、少なくとも１つのスリットに近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランと、それぞれの少なくとも１つの二極性メンブランの前方にそれぞれが取り付けられ、かつ、第２の電流を少なくとも１つのそれぞれの二極性メンブランに付与し、その結果、少なくとも１つのスリットを介するイオン流を促進するようにするために構成される少なくとも１つの制御可能な電極とを含む。
【００１９】
場合によっては、本デバイスは、第１および第２の電流を、陽極および陰極に対して、また、少なくとも１つの制御可能な電極に対してそれぞれ供給する電流源を含む。
【００２０】
さらに場合によっては、本デバイスはさらに、発生器電流源を経由して上記制御可能な電極に物理的に接続されるホイートストンブリッジを含む。
【００２１】
場合によっては、第１および第２の電流は高電圧の電流である。
【００２２】
場合によっては、少なくとも１つの二極性メンブランは少なくとも１つの無気泡性の二極性メンブランである。
【００２３】
場合によっては、本デバイスは、第１および第２の末端部にそれぞれ接続される第１および第２の受器を含み、ただし、この場合、陽極および陰極が第１および第２の受器にそれぞれ少なくとも部分的に取り付けられる。
【００２４】
場合によっては、本デバイスは、フォーカシング容器を支持するための適所の前方において複数のソケットを有する支持構造物を含む。それぞれのソケットが、少なくとも１つの二極性メンブランの１つと、少なくとも１つの制御可能な電極の１つとを含有する。
【００２５】
場合によっては、本デバイスは、ｐＨレベルを少なくとも１つの二極性メンブランのそれぞれの近くで測定するために構成される少なくとも１つのｐＨプローブを含む。
【００２６】
場合によっては、少なくとも１つのスリットの幅が３ｍｍ未満である。
【００２７】
場合によっては、少なくとも１つの制御可能な電極と、二極性メンブランとの間の距離が３ｍｍ未満である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、長さ軸を有するフォーカシング容器を提供すること、複数の生体分子を有する電解質溶液を前記容器に加えること、電場を長さ軸に沿って電解質溶液において加えること、および、イオン流を長さ軸に沿った少なくとも１つの地点に注入して、電解質溶液における複数の段差によって定義されるｐＨ勾配を確立し、その結果、複数の生体分子が少なくとも１つの地点の近くで少なくとも１つの濃縮において蓄積することを含み、ただし、それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、ｐＨ勾配が、複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される。
【００２９】
場合によっては、本方法はさらに、ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤を加えることを含む。
【００３０】
場合によっては、ｐＨ勾配が上記複数の段差の中の複数の傾斜部によって定義され、この場合、ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤の混合物を加えることをさらに含む。
【００３１】
場合によっては、複数の生体分子が上記少なくとも１つの濃縮にだけ蓄積する。
【００３２】
場合によっては、注入することは、電流を、それぞれの上記少なくとも１つの地点で電解質溶液に近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランにおいて加えることを含む。
【００３３】
場合によっては、本方法はさらに、上記複数の生体分子を少なくとも１つの濃縮に従って診断することを含む。
【００３４】
場合によっては、本方法はさらに、少なくとも１つの濃縮の少なくとも１つを別々に集めることを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、電解質溶液を有する容器に少なくとも１つの生体分子を提供すること、少なくとも１つのｐＨ指示薬を電解質溶液に加えること、および、ｐＨ勾配を電解質溶液においてもたらすことを含む。本方法はさらに、電解質溶液の少なくとも１つの画像を取り込むこと、電解質溶液の少なくとも１つのセグメントの少なくとも１つの色特性を少なくとも１つの画像に従ってコンピューター計算すること、および、セグメントにおける少なくとも１つのｐＨレベルを少なくとも１つの色特性に従って計算することを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをその長さ軸の途中で、取り外し可能に保持するために構成されるフォーカシング容器と、第１の電流を、多孔性ブロックにおいて電解質溶液を介して通すために構成される複数の電極と、イオン流をフォーカシング容器の中に注入して、その結果、ｐＨ勾配を多孔性ブロックにおける電解質溶液において変化させるようにするためにそれぞれが構成される、長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含む。生体分子の混合物がｐＨ勾配に従って多孔性ブロックにおいて配置される。
【００３７】
場合によっては、フォーカシング容器は、多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、および、多孔性ブロックをフォーカシング容器から取り出すことの少なくとも一方のための開口部を有する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、ｐＨ勾配を、多孔性ブロックにおける生体分子の複数の濃縮を促進するように電解質溶液においてもたらすこと、および、多孔性ブロックを、複数の濃縮のうちの１つをそれぞれが別々に含有する複数のセグメントにセグメント化することを含む。
【００３９】
場合によっては、セグメント化することが、多孔性ブロックを複数の濃縮のうちのそれぞれ２つの間で切り取って、複数のセグメントを作製することによって行われる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための着脱可能な溶液カートリッジが提供される。着脱可能な溶液カートリッジは、等電点フォーカシングシステムのフォーカシング流路にはまるようなサイズおよび形状を有し、かつ、複数の生体分子を有する電解質溶液により湿潤化されて、その結果、複数の生体分子の移動を電解質溶液において形成されるｐＨ勾配に従って可能にするようにするために構成される多孔性ブロックを含む。
【００４１】
場合によっては、多孔性ブロックは、複数の生体分子濃縮のうちのただ１つの濃縮をそれぞれが含む複数のセグメントを作製するために切り取ることができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質の混合物を分離するためのデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液および混合物を含有するために構成される電気泳動容器であって、長さ軸と、長さ軸と平行する第１および第２の向き合う側面とを有する電気泳動容器と、第１および第２の側面にそれぞれ取り付けられる第１および第２の二極性メンブランと、電場を電解質溶液において加えて、その結果、タンパク質を長さ軸に沿って動かすようにするための少なくとも１つ電極とを含む。第１および第２の二極性メンブランのうちの１つが、イオン流を電気泳動容器の中に注入して、その結果、電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を長さ軸と直交してもたらすようにするために構成される。それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有する。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４５】
【図１】図１は、生体分子の分離、および／または、１つもしくは複数の生体分子を有する分析物の診断を行うための、本発明のいくつかの実施形態による例示的な等電点フォーカシングデバイスの側面図の概略図である。
【００４６】
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示されるｐＨ発生器の拡大図である。
【００４７】
【図３】図３は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示されるデバイスの構成要素のいくつかを支持するための例示的な構造物の概略図である。
【００４８】
【図４】図４は、本発明のいくつかの実施形態による、等電点フォーカシングのための方法のフローチャートである。
【００４９】
【図５】図５は、本発明のいくつかの実施形態による、電場をイオンスリットの近くで増大させるための狭くなったセグメントを有するフォーカシング流路の概略図である。
【００５０】
【図６】図６は、本発明のいくつかの実施形態による、ｐＨ発生器の近くに配置されるフォーカシング流路のセグメント、ならびに、Ｎａ２ＳＯ４電解質溶液およびリン酸塩緩衝剤系（ＨＰＯ４−２／Ｈ２ＰＯ４−）を使用するときの段差形状の勾配である。
【００５１】
【図７】図７は、本発明のいくつかの実施形態に従ってもたらされる段階化ｐＨプロフィルを有する例示的な勾配、および、タンパク質の濃縮である。
【００５２】
【図８】図８は、本発明のいくつかの実施形態による、通過する電流に対する無気泡性ＢＰＭの応答の概略図である。
【００５３】
【図９】図９は、本発明のいくつかの実施形態による、幅広いスリットを有するｐＨ発生器である。
【００５４】
【図１０】図１０は、図１に示されるデバイスに類似するデバイスで、電解質溶液および生体分子により湿らされる多孔性ブロックを有する、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの概略図である。
【００５５】
【図１１】図１１は、本発明のいくつかの実施形態による、生体分子濃縮を単離するために使用される例示的な取り外し可能な多孔性ブロックの概略図である。
【００５６】
【図１２】図１２は、二極性メンブランを向かい合う面に有する電気泳動容器で、ｐＨ段階化を生じさせるために設計される、本発明のいくつかの実施形態による電気泳動容器の概略図である。
【００５７】
【図１３】図１３は、本発明のいくつかの実施形態に従って規定される例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションによって生じる様々なｐＨプロフィルを示すグラフである。
【００５８】
【図１４】図１４は、本発明のいくつかの実施形態に従って規定される例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションによって生じる様々なｐＨプロフィルを示すグラフである。
【００５９】
【図１５】図１５は、例示的なフォーカシングデバイスのフォーカシング流路の一連の９個の画像、および、電気分解期間を示す一組のドットである。
【００６０】
【図１６】図１６は、２段差のｐＨプロフィルの例示的な生成を示すグラフ、および、例示的なフォーカシングデバイスの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子分析および分子相互作用に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、等電点フォーカシングのための方法およびシステムに関連する。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、安定した段階化ｐＨ勾配を電解質溶液においてもたらし、その結果、生体分子（例えば、タンパク質およびペプチドなど）をそれらのｐＩに従って濃縮することを促進するようにするための方法およびシステムが提供される。安定した段階化ｐＨ勾配は、異なるｐＨレベルをそれぞれが有する複数の段差を有する。それぞれ２つの連続する段差が、０．１超のｐＨ単位（例えば、０．５のｐＨ単位）の急峻なｐＨ傾斜部によって隔てられる。そのような勾配は、生体分子を約１０００秒で段階化ｐＨ勾配に沿って濃縮することを可能にする。場合によっては、安定した段階化ｐＨ勾配は１０未満の段差（例えば、５、４、３および２）を有する。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生体分子の濃縮を分離および／または診断するためのフォーカシングデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液を生体分子の混合物と一緒に含有するためのフォーカシング容器（例えば、フォーカシング流路など）を含む。本デバイスはさらに、電場を電解質溶液において加えるための電極を含む。電場により、生体分子が電解質溶液においてある軸に沿って並ばされる。フォーカシング流路は、１つまたは複数の電気分解ユニット（これは本明細書中ではｐＨ発生器として示される）がＨ＋イオンまたはＯＨ−イオンをフォーカシング流路に注入することを可能にする１つまたは複数のスリットを有する。Ｈ＋イオンまたはＯＨ−イオンが、場合によっては無気泡性であるが、二極性メンブランを使用することによって生じる。Ｈ＋イオンまたはＯＨ−イオンにより、ｐＨ勾配が軸に沿って決定される。このことは、生体分子がそれらのｐＩに従ってｐＨ勾配に沿って濃縮することを可能にする。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、画像処理を、フォーカシング容器における電解質溶液の１つまたは複数のセグメントでのｐＨレベルをコンピューター計算するために使用するための方法が提供される。そのような実施形態において、ｐＨ指示薬が電解質溶液に加えられる。ｐＨ指示薬は電解質溶液の色を、フォーカシング容器において形成されるｐＨ勾配に従ってフォーカシング容器に沿って変化させる。変化した色が、画像センサーを使用して取り込まれる。取り込まれたデータにより、フォーカシング容器に沿った１つまたは複数のセグメントのｐＨレベルをコンピューター計算することができる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電解質溶液を生体分子の混合物と一緒に吸収するための多孔性ブロックを含む着脱可能な溶液カートリッジが提供される。着脱可能な溶液カートリッジの多孔性ブロックは、フォーカシング流路（例えば、上記で概略され、また、下記で記載されるようなフォーカシング流路など）にはまるようなサイズおよび形状を有する。場合によっては、使用時において、多孔性ブロックは、電解質溶液と、分離されるべき生体分子の混合物とにより湿らされ、フォーカシング流路に挿入される。その後、ｐＨ勾配が、大きい電場と一緒にフォーカシング流路に沿ってもたらされる。ｐＨ勾配は、混合物の生体分子の濃縮を多孔性ブロックに沿ったいくつかの濃縮において促進させる。これは、異なるｐＩを有する生体分子が異なる場所に集中するからである。次いで、多孔性ブロックが取り出され、これにより、使用者は、多孔性ブロックを、例えば、濃縮がセグメント毎に制限される様式で切り取ることによってセグメント化することができる。
【００６６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００６７】
次に、図１が参照される。図１は、１つもしくは複数の生体分子を含む混合物における生体分子の分離、および／または、１つもしくは複数の生体分子を有する分析物の診断を行うための、本発明のいくつかの実施形態による例示的な等電点フォーカシングデバイス１００の側面図の概略的例示である。本明細書中で使用される場合、生体分子には、タンパク質、ペプチド、ペプチドに基づく医薬用化合物、および、生体分子に基づく医薬用化合物が含まれる。
【００６８】
等電点フォーカシングデバイス１００は、場合によってはフォーカシング容器（これは本明細書中ではフォーカシング流路１０２として示される）に近接してアレイとして配置される複数の電気分解ユニット１０１を含む。場合によっては、フォーカシング流路は、例えば、１００ｍｍの長さ、５ｍｍの幅および０．５ｍｍの厚さの矩形のガラスキャピラリーである。電気分解ユニット１０１は、イオン流を生じさせ、そのイオン流をフォーカシング流路１０２に注入することによって、フォーカシング流路１０２の長さ軸９９またはそれと平行する任意の他の軸に沿った異なるセグメントにおけるｐＨレベルを制御する。これらの電気分解ユニットは本明細書中ではｐＨ発生器として示されることがある。そのような様式において、急峻なｐＨ傾斜部によって互いに隔てられ、フォーカシング流路１０２においてもたらされ、かつ、場合によっては、例えば、イオンが種々のセグメントにおいて注入される限りは数分間を超える期間にわたって維持される複数のｐＨ段階を有する勾配。そのような勾配は、段階化勾配、および／または、段差形状プロフィルを有するｐＨ勾配として示されることがある。
【００６９】
２つだけのｐＨ発生器が示されるが、等電点フォーカシングデバイス１００は任意の数のｐＨ発生器１０１（例えば、４個、８個、１２個、１６個、２０個、１００個または任意の中間数またはより大きい数のｐＨ発生器１０１）を有し得ることには留意しなければならない。
【００７０】
図１に示されるように、フォーカシング流路１０２の左側面および右側面のそれぞれ一方が電解質溶液受器（１０３、１０４）に対して開いている。電解質溶液受器の一方１０３が陰極１０５に接続され、他方１０４が陽極１０６に接続される。陰極および陽極の受器（１０３、１０４）は、場合によっては高電圧（ＨＶ）のために設計され、フォーカシング流路１０２を主電流源１０８（場合によってはＨＶ電流源、例えば、およそ３００Ｖを超える電圧を有する電源）に接続する。他の電場が生体分子の混合物に依存して加えられ得ることには留意しなければならない。
【００７１】
場合によっては、システム１０１はさらに、主電流源１０８およびｐＨ発生器１０１を場合によっては別々に制御するコントローラー１１０を含む。例えば、ｐＨ発生器１０１の電極を、コントローラーにより、それぞれの電極が、選択された電流により別々にバイアス付加することを可能にする様式でコントローラー１１０に別々に接続することができる。
【００７２】
場合によっては、図１に示されるように、１つまたは複数のｐＨプローブ１０９がフォーカシング流路１０２に沿って置かれる。それぞれのｐＨプローブ１０９が、局所的ｐＨをモニターするために、１つまたは複数のｐＨ発生器１０１に隣接して設置される。場合によっては、コントローラーはｐＨプローブ１０９の出力を受け取る。場合によっては、コントローラー１１０はｐＨプローブ１０９の出力を受け取り、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日公開、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、ｐＨ発生器１０１に送られる電流をそれに従って調節する。
【００７３】
次にまた、図２が参照される。図２は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示される例示的なｐＨ発生器１０１の拡大図である。ｐＨ発生器１０１は、フォーカシング流路１０２に隣接して配置される二極性メンブラン（ＢＰＭ）２００を含む。場合によっては、ＢＰＭは、Ｆ．Ｇ．Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｉ．他、Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｐｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓａｌｔ ｉｏｎ ｌｅａｋａｇｅ ｉｎ ａｃｉｄ−ｂａｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１８２（１−２）、１３〜２８、および、Ｇ．Ｐｏｕｒｃｅｌｌｙ、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｐｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、３８（８）、９１９〜９２６において定義される通りである。ｐＨ発生器１０１はさらに、コントローラー１１０によって制御される発生器電流源２０２に接続される電極２０１（例えば、白金電極）を含む。場合によっては、電極２０１は、発生器電流源２０２に接続される白金線である。電極２０１は、チャンバー２０５として示されることがある空間（例えば、体積において１ｃｍ３；これは場合によっては接する）に配置される。場合によっては、チャンバー２０５は水性の電解質溶液で満たされる。
【００７４】
次にまた、図３が参照される。図３は、本発明のいくつかの実施形態による、デバイス１００の構成要素を支持するための例示的な構造物１２０の概略図である。場合によっては、上記で概略されるように、流路は矩形のガラスキャピラリーである。フォーカシング流路１０２が、場合によってはＰｅｒｓｐｅｘブロックである構造物１２０に取り付けられる。フォーカシング流路１０２は、ｐＨ発生器１０１のアレイからのイオンの通過およびｐＨプローブ１０９からのｐＨ検知を可能にする薄いスリット２１１を有する。構造物１２０は、１２１において示されるように、ｐＨプローブが挿入されるｐＨプローブソケットと、例えば、図２において示されるように、ＢＰＭ２００および電極２０１が挿入される発生器チャンバー２０５とを収容する。場合によっては、それぞれのｐＨプローブがＳＥＮＲＯＮのＭｉｃｒｏ電極９０７０−００８を含む（その仕様書が参照によって本明細書中に組み込まれる）。Ｍｉｃｒｏ電極が、流路からのイオンがその中では自由に小さいスリットに達し、これを通り抜け、これにより、ｐＨ検知を可能にするｐＨプローブソケットに挿入される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、発生器電流源２０２が、例えば、図１では１１１において示されるように、場合によってはホイートストンブリッジを経由して陽極１０６および陰極１０５に接続される。ホイートストンブリッジ１１１が、陰極１０５と、陽極１０６との間を接続するために置かれる。ホイートストンブリッジ１１１は、ｐＨ発生器１０１が高電圧で作動することを可能にするために使用される。１０ボルトを超える電圧が存在する場合、電位差がＢＰＭ２００の両方の面において現れるかもしれない。具体的には、電源１０８を介した電位差はＢＰＭの２つの面の間における電位差をもたらす。ＢＰＭの２つの面の間における電位差が１０Ｖを超えるならば、ＰＢＭが損傷するかもしれない。そのような電位差は、発生器電流源２０２と同様に、ＢＰＭ２００を傷つけるかもしれない。場合によっては、ブリッジは、メンブランの２つの面の間における電位をバランスさせ、これにより、２つの面の間における電位差を、ＢＰＭ２００および／または発生器電流源２０２の運転を妨げることなく低下させる一連の抵抗器からなる。代替では、高電圧が加えられず、発生器電流源２０２が陰極１０５および陽極１０６に直接にワイヤ接続される。
【００７６】
ｐＨ発生器１０１（これには発生器電流源２０２によって通電され得る）により、ｐＨ勾配がフォーカシング流路１０２においてもたらされる。二極性メンブラン２００は、ｐＨ発生器１０１が水分子を水素Ｈ＋およびヒドロキシルＯＨ−に効率よく解離することを可能にする。一般に知られているように、二極性メンブランは、Ｈ＋を放出することを可能にする面１５１と、ヒドロキシルＯＨ−を放出することを可能にする別の面１５２との２つの面を有する。ＢＰＭ２００は、例えば、１０１Ａにおいて示されるように、Ｈ＋をフォーカシング流路１０２の中に放出し、かつ、ヒドロキシルＯＨ−をチャンバー２０５の中に放出するために配置することができ、または、例えば、１０１Ｂにおいて示されるように、ＯＨ−がフォーカシング流路１０２の中に放出され、かつ、Ｈ＋がチャンバー２０５の中に放出されるように逆配置で配置することができる。
【００７７】
図４もまた参照される。図４は、本発明のいくつかの実施形態による、等電点フォーカシングのための方法９０のフローチャートである。
【００７８】
最初に、９１において示されるように、フォーカシング容器が提供される（例えば、１００において示される等電点フォーカシングデバイスの容器など）。その後、９２において示されるように、電解質溶液により、等電点フォーカシングデバイスのフォーカシング容器が満たされる。場合によっては、２つの電解質溶液受器（１０３、１０４）と、流路１０２とが、溶液で満たされる。９４において示されるように、１つまたは複数の異なる生体分子（例えば、タンパク質など）の混合物がフォーカシング容器における溶液に加えられる。混合物は、下記で記載されるようなｐＨ勾配を確立する前および／または確立している期間中に加えられ得ることには留意しなければならない。９３において示されるように、電場（例えば、上記ＨＶなど）が、例えば、陰極１０５と、陽極１０６との間に、長さ軸９９に沿って電解質溶液において加えられる。その後、９５において示されるように、１つまたは複数のイオン流が長さ軸９９に沿った１つまたは複数の地点において注入されて、９６において示されるように、急峻なｐＨ傾斜部によって隔てられる複数の段差によって規定されるｐＨ勾配を確立し、その結果、生体分子が、急峻なｐＨ傾斜部をｐＨ発生器１０１の前方の空間にもたらす注入地点の近くに蓄積する。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フォーカシング流路１０２は、電場をイオンスリットの近くで増大させるための狭くなったセグメントを有するいくつかの狭くなったセグメントを含む。具体的には、これらのセグメントは、例えば、図５の数字１３１において示されるように、流路の他のセグメントよりも狭いので、これらのセグメントにおいて形成される電場は流路の他のセグメントにおける電場よりも強い。そのような実施形態において、イオンスリット２１１が流路１０２の狭くなったセグメント１３１において形成される。強い電場は、生体分子を流路のより狭いセグメントにおいて濃縮するようにｐＨ傾斜部を狭くする。
【００８０】
次に、水素Ｈ＋イオンおよび／またはヒドロキシルＯＨ−イオンを、安定なｐＨ勾配をフォーカシング流路１０２において保証する様式で電解質溶液に注入するプロセスの説明が示される。明確化のために、電解質溶液における化学種ｉのイオンの挙動が下記の式によって支配される：
式中、Ｃｉは化学種ｉの濃度を示し、ＤＣｉはＣｉの拡散係数を示し、μＣｉはＣｉの電気移動度を示し、Ｚｉは電子単位でのＣｉの電荷を示し、Ｆはファラデー定数を示し、Ｒｉは化学種ｉの反応項を示し、Ｅはフォーカシング流路１０２における電場を示す。基本的に、式１は、電解質溶液においてイオンに作用する２つの駆動力、すなわち、拡散移動および電気的移動を記述する。デバイス１００において、電場がＨＶ電流源１０８に従って決定され、したがって、主要な駆動力として機能する。ポアソン方程式によれば、イオン濃度に対するＥの依存性を下記のように表すことができる：
式中、εは水の誘電率を示す。
【００８１】
場合によっては、Ｅの存在下での安定したｐＨ勾配をフォーカシング流路１０２においてもたらすために、化学種の１つ（Ｈ＋またはＯＨ−）が多く存在する電解質溶液が流路に通される。例えば、ｐＨ１０の電解質溶液を、多く存在する化学種としてのＯＨ−の１０−４Ｍの濃度、および、Ｈ＋の１０−１０Ｍの濃度で、流路に通すことができる。そのような実施形態において、多く存在する化学種の濃度を、他の化学種（例えば、Ｈ＋イオン）をフォーカシング流路１０２の途中で注入することによって徐々に低下させることができる。
【００８２】
他の化学種がフォーカシング流路１０２に注入されるとき、ｐＨレベルにおける急峻な傾斜部が注入点においてもたらされる。傾斜部は、イオン注入が行われない場合には保たれる一定のｐＨ値に関して急峻である。簡単に述べると、そのような注入により、分析物が蓄積するまさにその地点、すなわち、注入装置の前方のまさにその地点を規定する段差形状のプロフィルを有するｐＨ勾配がもたらされる。このことは、生体分子を検出および／または集めることをより容易にする。場合によっては、傾斜部の長さ、すなわち、フォーカシング流路１０２の長さ軸の部分と、傾斜部の高さ、すなわち、ｐＨレベルの変化との比率が、１ｐＨ単位あたり１０−４ｍである。
【００８３】
使用時において、注入された生体分子は移動させられ、ついには、注入された生体分子は、それらのｐＩと実質的または完全に一致するｐＨレベルを有するフォーカシング流路１０２のセグメントに到達する。例えば、図７に示されるように、デバイス１００によって形成される段階化勾配は、フォーカシングプロセスを速めることを可能する。生体分子を取り巻くｐＨと、それらのｐＩとの差がより大きいとき、生体分子において加えられる駆動力がより強くなる。フォーカシング流路１０２における電解質溶液のｐＨ勾配がｐＨ段階に分割されるので、生体分子のｐＩと、周囲ｐＨとの差は、生体分子が、ほとんどの場合、他の段階との関連で、それらのｐＩと実質的または完全に一致するｐＨを有するｐＨ段階に到達するまでは比較的大きい。そのｐＨ段階において、生体分子は２つの異なるｐＨ段階の間の領域に静止し、濃縮する。そのような様式においては、タンパク質がそのｐＩに近づくにつれて速度が低下する既存の方法とは異なり、フォーカシング流路１０２における生体分子の速度は大きく、かつ、一定のままであり、したがって、フォーカシングが比較的速く、例えば、２つの段階を有する勾配をもたらすデバイス１００では１０００秒である。
【００８４】
他方で、段差形状でないｐＨ勾配では、生体分子の駆動力が、ｐＨ勾配が徐々に増大または低下することにより徐々に低下する。そのような勾配におけるフォーカシングでは、比較的長いフォーカシング時間が要求される。これは、生体分子が、ｐＨレベルがそれらのｐＩと一致する点に一層接近するときには生体分子の駆動力が実質的に低下するからである。さらに、段差形状プロフィルにより、生体分子が蓄積するまさにその地点、すなわち、注入装置の前方のまさにその地点が規定される。
【００８５】
場合によっては、段差形状のプロフィルの安定性が、フォーカシング流路１０２における電解質溶液の段差形状のｐＨプロフィルと類似または同一である酸解離定数（ｐＫａ）を有する緩衝剤を加えることによって維持される。ｐＫａの値は好ましくは、急峻なｐＨ傾斜部の両側のｐＨレベルの範囲にある。例えば、傾斜部を、ｐＨ５の段差と、ｐＨ６の段差との間にもたらすためには、５〜６の間のｐＫａ（例えば、５．４）を有する緩衝剤を選ばなければならない。場合によっては、異なるｐＫａを有する緩衝剤の混合物が加えられる。そのような様式において、複数の傾斜部を同時に安定化することができる。そのような混合物の一例が、支持電解質として機能する０．００５ＭのＮａ２ＳＯ４と、２、７．２および／または１２．３３のｐＫａを有する０．００２５Ｍリン酸塩緩衝液と、３．１３、４．７６および／または６．４０のｐＫａを有する０．００２５Ｍクエン酸塩とを含む混合物である。
【００８６】
次に、図６が参照される。図６は、本発明のいくつかの実施形態による、ｐＨ発生器１０１の近くに配置されるフォーカシング流路１０２のセグメント、および、Ｎａ２ＳＯ４電解質溶液を使用するときに形成される段差形状の勾配である。場合によっては、ｐＨ８でのリン酸塩緩衝剤がＮａ２ＳＯ４電解質溶液に加えられる。図６に示されるように、Ｅは正イオン（カチオン）を左側に移動させ、負イオン（アニオン）を右側に移動させる。ｐＨ発生器１０１を始動させたとき、Ｈ＋イオンがフォーカシング流路１０２に注入され、直ちに左側に移動し、同時に、緩衝剤イオンと反応する。反応に応答してもたらされるが、Ｈ＋イオンおよび緩衝剤イオンの濃縮により、３０１において示されるように、段差形状のｐＨ勾配がもたらされる。
【００８７】
この電解質溶液において、このｐＨ付近で高い濃度で存在する緩衝剤分子の化学種が、ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−である。これらの緩衝剤分子は下記のプロトン化反応に関与する：
ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−の相対的濃度の対するｐＨの依存性を、下記のように、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式によって表すことができる：
式中、Ｋａは反応の平衡定数である。
【００８８】
一般に知られているように、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンは反応して、水を生じさせる：
ただし、平衡定数Ｋｗは下記を満たす：
【００８９】
ｐＨ発生器１０１が始動されないならば、すべての化学種の濃度が一定であり、電解質溶液のｐＨレベルもまた一定である。しかしながら、ｐＨ発生器１０１の１つまたは複数がプロトンをフォーカシング流路１０２に対して注入するとき、プロトンは、ＨＰＯ４−２イオンがＨ２ＰＯ４−イオンに変換される式３における順方向の反応において示されるように反応する。その結果、式４に記載されるように、発生器の右手側でのフォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルが低下する。したがって、それぞれのｐＨ発生器１０１におけるプロトンの注入により、段差形状の勾配が、フォーカシング流路１０２におけるＨ＋イオン、ＨＰＯ４−２イオンおよびＨ２ＰＯ４−イオンの濃度を同時に変化させることによってもたらされる。Ｅは正イオンを左側に移動させ、負イオンを右側に移動させるので、それぞれのフォーカシング流路１０２の左手側におけるＨ＋、ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−の濃度は留まったままであり、それぞれのフォーカシング流路１０２の右手側におけるＨ＋およびＨ２ＰＯ４−の濃度、ならびに、ＨＰＯ４−２の濃度がそれぞれ増大および低下する。
【００９０】
式５および式６に従って、Ｈ＋イオンがＯＨ−イオンと反応するとき、上記の段差形状のｐＨプロフィルが緩衝剤の非存在下で生じ得ることには留意しなければならない。しかしながら、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンの濃度は小さいかもしれないので（例えば、１０−６〜１０−８の間）、比較的低い電流により、プロフィルにおける段差が生じるかもしれない。そのような敏感さは、提供された電流におけるどの変化も、フォーカシング流路１０２における所望されるｐＨ勾配の段差形状のｐＨプロフィルに影響することを生じさせるか、または、フォーカシング流路１０２における所望されるｐＨ勾配の段差形状のｐＨプロフィルをなくすことを生じさせる。
【００９１】
ｐＨ発生器１０１は、注入されたＨ＋イオンの流れがＨＰＯ４−２イオンの流れよりも小さい様式で通電される。そうでない場合には、ＨＰＯ４−２イオンの流れがＨ＋イオンの流れによって消され、これにより、フォーカシング流路１０２全体にわたるｐＨ低下が引き起こされる。
【００９２】
場合によっては、いくつかのｐＨ発生器１０１を、段階化ｐＨプロフィルをもたらすために使用することができる。そのような実施形態において、複数のｐＨ発生器１０１により、これらはフォーカシング流路１０２に沿って配置されるので、これらのｐＨ発生器１０１によって加えられる異なる電流によって制御され得る勾配状の多数のｐＨ段差がもたらされる。段階化プロフィルを有するそのような勾配は、異なるｐＩを有する複数の生体分子を同時に集中させるために利用することができる。コントローラーはこれらのｐＨ発生器１０１に通電して、種々の混合物の生体分子のプローブ探査および／または分離するためにそれぞれが選択される異なる段差形状のｐＨプロフィルを有する異なる勾配を確立することができる。それぞれのｐＨプロフィルが、異なるｐＨレベルを有するセグメントを有する。それぞれのセグメント（これは段階化ｐＨプロフィルにおける段差に対応する）を混合物における異なる生体分子のｐＩに従って選択することができる。使用時において、電解質溶液に加えられる種々の生体分子がフォーカシング流路１０２の異なるセグメントを占める。異なるｐＩを有する種々の生体分子をフォーカシング流路１０２に加えることにより、複数の濃縮を生じさせることができる。例えば、図７は、上記で記載されるデバイス１００または方法９０によってもたらされる、第１の傾斜部が７〜５．７の間のｐＨレベルを有し、第２の傾斜部が５．７〜５の間のｐＨレベルを有する段階化ｐＨプロフィルを有する例示的な勾配を示す。この勾配のプロフィルは、これらの傾斜部が、５．３のｐＩおよび６のｐＩをそれぞれ有するタンパク質Ａおよびタンパク質ＢのｐＩと一致するように構築される。そのような様式において、タンパク質Ａが、ｐＨ５と、ｐＨ５．７との間の接合部４０１に静止し、タンパク質Ｂが、ｐＨ５．７と、ｐＨ７との間に静止する。そのようなｐＨプロフィルは、これらの生体分子の混合物を分離するために使用することができる。
【００９３】
次に、再びではあるが、図２が参照される。上記で記載されるように、ｐＨ発生器はＢＰＭ２００を含む。上記で記載されるように、ＢＰＭ２００は、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンを、水分子を分割することによって生じさせる。場合によっては、ＢＰＭ２００は、膨れまたは泡を電気分解期間中にその表面上および／またはそれらの間に生じさせない１つまたは複数の無気泡性メンブランを含む。簡略化のために、そのようなＢＰＭ２００は無気泡性ＢＰＭ２００として示されることがある。そのような無気泡性ＢＰＭ２００を使用するとき、フォーカシング流路１０２は、気泡が実質的に存在しない状態のままであり、したがって、流路のより近くに置くことができる。そのような近接は、ｐＨ勾配をより速い速度（例えば、数秒）で生じさせることを可能にし、また、より長期間にわたって安定なままにすることができる。同様にまた、無気泡性ＢＰＭ２００は、他のｐＨ発生器よりも正確かつ安定であるｐＨプロフィルを生じさせることを可能にするので、一定ｐＨの領域における変動がより少なくなる。
【００９４】
電極が、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日公開）に記載されるように、ｐＨ発生器として使用されるとき、気泡がフォーカシング流路の中に拡散することを防止するために、当該電極は、フォーカシング流路１０２から距離をとって、例えば、３ｍｍ離れて置かれることには留意しなければならない。そのような距離は、電極によって生じたイオンが典型的なフォーカシング流路に移動して、ｐＨ勾配をもたらすために要する時間を、例えば、およそ４００秒に遅らせる。上記で記載されるように、無気泡性ＢＰＭ２００を使用することにより、気泡の生成が防止され、したがって、ｐＨ発生器１０１をフォーカシング流路１０２の比較的ごく近くに、例えば、０．１ｍｍ未満に置くことが可能になる。
【００９５】
さらに、そのようなｐＨ発生器のアレイは、生体分子をより大きい分離度で分離をすることを可能にする。そのようなデバイス１００において生じる勾配の大きい安定性は、限定された範囲からのｐＩを有する生体分子を分離することを可能にする。
【００９６】
次に、図８もまた参照される。図８は、本発明のいくつかの実施形態による、通過する電流に対する無気泡性ＢＰＭ２００の応答の概略図である。ＢＰＭ２００は水分子をＨ＋イオンおよびＯＨ−イオンに分割する。場合によっては、ＢＰＭは、アニオン交換層１５２と、カチオン交換層１５１とからなり、これらの層は、水が通って拡散し得る薄い境界５０５を残して互いに平行に置かれる。アニオン交換層１５２およびカチオン交換層１５１は、アニオンおよびカチオンをそれぞれ伝え、一方、逆電荷のイオンに対しては不透過性である半透過性メンブランである。水の電気分解が、ＢＰＭ２００を、アニオン交換層１５２が陽極５０３に面し、カチオン交換層１５１が陰極５０４に面するように陽極５０３と、陰極５０４との間に置くことによって達成される。電圧が、陽極５０３と、陰極５０４との間に加えられたとき、層１５１と、層１５２との間の水分子が、逆方向ではあるが、Ｈ＋イオンと、ＯＨ−イオンとに分かれる。
【００９７】
水が分かれることに加えて、水の加水分解が生じ、これにより、Ｈ＋およびＯ２ガス分子が陽極５０３で生じ、ＯＨ−およびＨ２ガス分子が陽極５０４で生じる。
【００９８】
次に、もう一度ではあるが、図１が参照される。使用時において、主電流源１０８によって生じる電流により、電圧差が、フォーカシング流路１０２において、陰極１０５と、陽極１０６との間に生じる。ｐＨ発生器１０１（これらはフォーカシング流路１０２に沿って置かれる）は、イオンを、図３の２１１において示されるように、小さいスリット（例えば、およそ０．５ｍｍ）を介して流路に注入する。図１に示されるように、ｐＨ発生器１０１の電極のそれぞれ１つがそのそれぞれの発生器電流源２０２に接続され、次に、発生器電流源２０２はホイートストンブリッジを介して陰極１０５および陽極１０６につながる。そのような様式において、発生器電流源２０２は、電流を、ｐＨ発生器１０１の白金電極を介して陰極１０５および陽極１０６に向かわせるか、または、逆に、陰極１０５および陽極１０６介してｐＨ発生器１０１の白金電極に向かわせる。上記で記載されるように、ＢＰＭの配向により、どのイオンがフォーカシング流路１０２に注入されるかが決定されることには留意しなければならない。
【００９９】
図１において、図８に関しては、左側のｐＨ発生器１０１Ａの電極が陽極５０３として機能し、陰極１０５および陽極１０６が一緒になって、陰極５０４として機能する。ｐＨ発生器１０１Ａおよび類似するｐＨ発生器は、Ｈ＋イオンをフォーカシング流路１０２に注入するように配向されるそれらの二極性メンブランを有する。そのようなｐＨ発生器は電流をそれぞれの電極から陰極１０５および陽極１０６に向かわせる。反対に、右側のｐＨ発生器１０１Ｂの電極は陰極５０４として機能し、陰極１０５および陽極１０６は一緒になって、陽極５０３として機能する。ｐＨ発生器１０１Ｂおよび類似するｐＨ発生器は、ＯＨ−イオンをフォーカシング流路１０２に注入するように配向されるそれらの二極性メンブランを有する。そのようなｐＨ発生器は電流を陽極１０５および陰極１０６からそれぞれの電極に向かわせる。
【０１００】
次に、もう一度ではあるが、図２が参照される。上記で概略されるように、ｐＨ発生器１０１の内側で生じる化学的プロセスは、Ｈ＋イオンをフォーカシング流路１０２に注入することを可能にする。使用時において、上記で記載されるように、電流が電極２０１を介して流れる。通電された電極２０１は、水分子をＨ＋およびＯ２ガス分子に分解する電気分解を引き起こす。電流が、ＯＨ−およびＨ２ガスが生じる陰極１０５および陽極１０６に流れる。電極２０１と、陰極１０５および陽極１０６との間において、ＢＰＭ２００は水分子をＨ＋イオンおよびＯＨ−イオンに分解する。電極２０１およびＢＰＭ２００は互いに近接しているので、ＢＰＭ２００によって生じるＯＨ−イオンと、電極２０１によって生じるＨ＋イオンとは、式５に従って絶え間なく再結合し、一定のｐＨをチャンバーにおいて維持する。他方で、陰極１０５および陽極１０６と、ＢＰＭ２００との距離は、フォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルを長期間にわたって制御することを可能にする。
【０１０１】
上記で記載されるように、また、図２に示されるように、ｐＨ発生器１０１は、イオンを、薄いスリット２１１を介してフォーカシング流路１０２に注入する。代替では、ｐＨ発生器１０１は、イオンを、例えば、図９に示されるように、より幅広い開口物を介して注入する。そのような実施形態において、イオンが、数ｃｍの幅であるスリットを介して注入される。この構成は、互い非常に接近して置かれる非常に多数の薄いスリットと等価であるので、結果は、数多くの短い段差から構成される平滑なｐＨプロフィルである。そのような実施形態において、注入は、多数の小さい段差からなる中程度の傾斜部を有するｐＨプロフィルを引き起こす。
【０１０２】
次に、もう一度ではあるが、図１が参照される。本発明のいくつかの実施形態によれば、コントローラー１１０が、ユーザーインターフェース（示されず）に、例えば、クライアント端末（例えば、パーソナルコンピューターまたはノート型コンピューターなど）に対して実行されるグラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含むモジュールなどに接続される。そのような実施形態において、コントローラーは、使用者によって提供される値に従ってｐＨ発生器１０１に通電することができる。例えば、使用者は所望のｐＨレベルを入力することができ、コントローラー１１０はｐＨ発生器をそれに従って作動させることができる。別の実施形態において、使用者は１つまたは複数の生体分子を選択し、コントローラー１１０はｐＨ発生器をそれに従って作動させることができる。そのような実施形態において、通電することが、例えば、上記で記載されるように、生体分子をフォーカシング流路１０２の種々のセグメントにおいて分けることを可能にするｐＨプロフィルをもたらすために行われる。
【０１０３】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連するシステムおよび方法が開発されることが予想され、電源、ＧＵＩ、およびコントローラーの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、デバイス１００は、生体分子濃縮を固定することを可能にする。上記で記載されるように、デバイス１００において通る電流により、フォーカシング流路１０２内へのイオンの注入が誘導され、そのｐＨ勾配が場合によっては動的ではあるが、様々な生体分子濃縮を生じさせることを可能にする様式で調節される。しかしながら、電流およびイオン注入が停止するとき、これらの濃縮は解消することがある。解消は、生体分子濃縮物の診断および／または分離された生体分子濃縮物の回収を制限し、かつ／あるいは、電流およびイオン注入を診断期間の期間中に維持することを必要とする。次に、図１０が参照される。図１０は、本発明のいくつかの実施形態による、濃縮の解消を遅くするか、または防止する多孔性ブロック１１８を有する着脱可能な溶液カートリッジ１１９を有するデバイス１００の概略図である。デバイス１００は、図１に示される構成要素のすべてを含み、しかしながら、フォーカシング流路１０２は、着脱可能な溶液カートリッジ１１９を含有するための空間と、その挿入および／または取り出しのための挿入開口部とを形成する。多孔性ブロック１１８が多孔性材料（例えば、セルロース）から構成される。使用時において、多孔性ブロック１１８は、電解質溶液により、また、分析される生体分子の混合物により湿らされ、その後、フォーカシング流路１０２に挿入される。次に、イオンが、上記で記載されるように、ｐＨ発生器１０１によって注入される。多孔性ブロック１１８の多孔性材料は、注入されたイオンが多孔性ブロック１１８におけるｐＨレベルを変化させることを可能にし、これにより、例えば、上記と同様に、段階化プロフィルを場合によっては有するそれに沿ったｐＨ勾配をもたらす。そのような様式において、上記の分離プロセスおよびフォーカシングプロセスが多孔性ブロック１１８の中で生じ得る。フォーカシングが安定化するとき、多孔性ブロック１１８は、生体分子濃縮のうちのそれぞれ１つを単離することを可能にするようにセグメント化することができる。セグメント化を、多孔性ブロック１１８における種々の生体分子濃縮の間を隔てる中間領域を切り取ること、切断すること、連結することおよび／または結ぶことによって行うことができる。例えば、図１１は、生体分子を例示的な多孔性ブロック１１８において単離することを概略的に示す。数字１３１は、いくつかの生体分子濃縮物を伴って吸収される取り外し可能な構造物であり、数字１３２は、それに対する切り取られた形態である。次に、セグメント化された多孔性ブロック１１８は、生体分子濃縮を維持するために電流をそれに対して通すことなく分析することができる。加えて、または、代替において、診断および／または生体分子回収を、濃縮が形成された後、より長期間にわたって行うことができる。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フォーカシング流路（例えば、デバイス１００のフォーカシング流路１０２など）におけるｐＨレベルが色分析に従って測定される。そのような実施形態において、ｐＨ指示薬、例えば、リトマス、フェノールレッド、ブロムクレゾールパープルおよび／または任意のｐＨ感受性色素などが、フォーカシング流路１０２における電解質溶液に加えられる。電解質溶液におけるｐＨ指示薬はその色をフォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルに従って変化させるので、画像処理を、ｐＨレベルを検出するために使用することができる。場合によっては、画像センサー、例えば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）および／または相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）に基づくセンサーなどが、フォーカシング流路の画像を取り込み、フォーカシング流路の種々のセグメントの１つまたは複数の色特性を色分析の一般に知られている方法によってコンピューター計算するために使用される。そのような色特性は、種々のセグメントにおけるｐＨレベルを前記に従って計算することを可能にする。場合によっては、求められたｐＨレベルが上記ＧＵＩに転送され、使用者に示される。
【０１０６】
画像処理を上記のように使用することにより、比較的速いｐＨレベル推定を受け取ることが可能になることには留意しなければならない。Ｍｉｃｒｏ電極に基づくｐＨプローブが使用されるとき、マイクロ電極と、電解質溶液との間における接触を容易にするスリットが形成される。このスリットは、例えば、図３の１２１において示されるように、ｐＨプローブが挿入されるｐＨプローブソケットに接続される。これらのソケットは、流路からのイオンの移動を可能にし、これにより、ソケットにおけるｐＨレベルを変化させる溶液で満たされる。Ｍｉｃｒｏ電極はソケットにおけるｐＨレベルを検知し、流路のそれぞれのセグメントにおけるｐＨレベルを推定することを可能にする。しかしながら、ソケット内へのイオンの移動は時間がかかるので、ｐＨプローブの読み取りにおける遅れが誘導される。さらに、ソケットは電解質溶液の要求される体積を増大させ、したがって、プロセス期間中に流路に注入しなければならないイオンの量を増大させる。他方で、画像センサーは電解質溶液との接触を必要とせず、したがって、ソケットが全く必要ない。画像センサーは、イオン移動を待つ必要がないので、ｐＨ確認プロセスがより速くなる。加えて、ソケットが全く必要ないので、電解質溶液の体積を減らすことができる。さらに、画像センサーは電解質溶液と接触していないので、溶液中に置かれる要素において通常の場合には形成される汚染を軽減または回避することができる。そのような様式では、画像センサーによって行われる測定は信頼性がより大きい。具体的には、ｐＨ電極に基づくプローブは、溶液によって容易に汚染される傾向がある。この汚染は誤差をそれらの読み取りに加える。画像センサーはそのような汚染にさらされない。さらに、ＨＶ電流が流路１０２において流れる。そのような電流は、溶液と接触しているプローブ（例えば、ｐＨ電極など）を損傷させることがある。画像センサーを使用することにより、ＨＶ電流を流路１０１において流すことが、システムの信頼性および寿命を低下させることなく可能になる。
【０１０７】
次に、図１２が参照される。図１２は、二極性メンブラン（２９０、２９１）を向かい合う面に有する電気泳動容器１９２で、電解質溶液において電気泳動容器１９２の長さ軸に対して横方向であるｐＨ段階化２９２をもたらすために設計される、本発明のいくつかの実施形態による電気泳動容器１９２の概略図である。
【０１０８】
図１２に記載される電気泳動容器１９２は、ｐＨ勾配を、電気泳動容器１９２が含有する電解質溶液において、向かい合う二極性メンブラン（２９０、２９１）の間にもたらすことを可能にする。ｐＨ勾配の種々のセグメントが、例えば、Ｃｌｙｄｅ Ａ．Ｄｕｂｂｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６６年１月２８日、第１５１巻、第３７０９号、４６３頁〜４６４頁（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ Ｔｅｓｔ ａｎｄ Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、異なるｐＨレベルを有する。
【０１０９】
ｐＨ勾配２９２は、本明細書中では横方向ｐＨ勾配２９２として示されることがあるが、電気泳動容器１９２に置かれる混合物におけるタンパク質を、タンパク質をフォーカシングすることなく分離することを可能にする。横方向ｐＨ勾配２９２はタンパク質移動方向に対して横方向であり、かつ、混合物におけるタンパク質をそれらの移動度に従って分離することを可能にするように電気泳動容器１９２を介して伝えられる電場２９３に対して直交する。タンパク質の移動度はｐＨに依存するので、同じ種類のタンパク質は、それらの周囲のｐＨに依存する異なる速度を獲得する。得られる分離パターンが、流路に沿った斜線からなる。
【０１１０】
横方向ｐＨ勾配２９２が、二極性メンブラン（２９１、２９２）の間に流されるイオンによってもたらされる。具体的には、図８に関連して上記で記載されるように、二極性メンブランは、アニオン交換層１５２と、カチオン交換層１５１とからなり、これらは互いに平行に置かれる。アニオン交換層１５２およびカチオン交換層１５１はアニオンおよびカチオンをそれぞれ伝え、一方、逆電荷のイオンに対しては不透過性である。水の電気分解が、二極性メンブランを、アニオン交換層１５２が陽極に面し、カチオン交換層１５１が陰極に面するように置くことによって達成される。電圧が、陽極と、陰極との間に加えられたとき、層１５１と、層１５２との間の水分子が、逆方向ではあるが、Ｈ＋イオンと、ＯＨ−イオンとに分かれる。二極性メンブラン（２９１、２９２）の間にもたらされるＨ＋イオンの流れにより、ｐＨ勾配がもたらされる。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１２】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含する。
【０１１３】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１１５】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１１６】
用語「任意選択的（場合によって）」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１１７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１１８】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１１９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１２１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１２２】
実施例は、例えば、図１および図２に関して上記で記載されるように、段差形状のｐＨプロフィルを生じさせるためにただ１つだけのｐＨ発生器を使用する例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションに基づく。シミュレーションされたｐＨ発生器は、上記で記載されるように、無気泡性ＢＰＭに基づく。シミュレーションされた例示的なフォーカシングデバイスはただ１つだけのｐＨ発生器を含むが、上記で記載されるように、任意の数のｐＨ発生器が使用され得ることには留意しなければならない。シミュレーションが、一組の偏微分方程式（ＰＤＥ）を解くことによって行われる。この一組には、式２と、それぞれの式が電解質溶液における化学種について定義される式１の形式の一組の式とが含まれる。適切な境界条件が、例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路の両側における一定の濃度、および、例えば、図２に示されるように、また、上記で記載されるように、ｐＨ発生器からのＨ＋イオンの一定の電流である。初期条件が、例示的フォーカシングデバイスにおける任意の場所での一定の濃度として加えられる。完全な一組の式は下記の通りである：
上記式において、Ｋｗおよびｋｗは、式５に示される反応についての平衡定数および会合速度定数を示し、Ｋｐおよびｋｐは、式３に示される反応についての平衡定数および会合速度定数を示す。
【０１２３】
そのようなシミュレーションは、大きい電場と、ｘ＝０の位置にあるｐＨ発生器電流の存在下でもたらされるｐＨプロフィルのグラフとをそれぞれ示す図１１および図１２に示されるような結果をもたらす。図１３は、Ｅ＝１０−６ｍｏｌ／ｍ２ｓの場合における様々な時点でのｐＨプロフィルを示し、図１４は、定常状態のｐＨプロフィル、すなわち、様々な電流の結果を示す。
【０１２４】
図１３は、一定の電流（１０−６ｍｏｌ／ｍ２ｓ）を通し、かつ、ｘ＝０の位置にあるｐＨ発生器の存在下における、時間の関数として生じるｐＨプロフィルを示す。図１１に示されるように、酸性前線が、急なｐＨ段差を有するプロフィルを数秒以内にもたらすように進行する。５ｍｍの長さの酸性状況が右側におよそ１００秒でもたらされ、一方で、左側では、初期のｐＨレベルが維持される。図１４は、様々な大きさの電流において定常状態のｐＨプロフィルを有する勾配を示す。認められるように、電流の大きさにより、ｐＨ段差の高さが決定される。
【０１２５】
次に、図１１および図１２に関連して記載される実施例で使用される例示的なフォーカシングデバイスによるｐＨ勾配の生成を例証する実施例が参照される。本明細書中で使用される場合、ｐＨ勾配生成速度は、ｐＨ勾配が例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路において安定化するために要する期間を意味する。図１３に示されるように、ただ１段だけのｐＨプロフィルが、シミュレーションされた例示的フォーカシングデバイスのｐＨ発生器によってもたらされる。例示的フォーカシングデバイスのｐＨ勾配生成速度を近似するために、例示的フォーカシングデバイスのｐＨ勾配が期間中の多数の瞬間でモニターされている。図１５は、例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路の一連の９個の画像、および、電気分解期間を示す一組のドットである。画像が８分の期間ｔにおいて１分の画像間隔により連続して取り込まれた。ｐＨ指示薬が例示的フォーカシングデバイスにおける電解質溶液に加えられた。９０１〜９０３の数字は、例示的フォーカシングデバイスに沿って挿入される３つのｐＨプローブ（黒色の棒）を示す。数字９０４はｐＨ発生器を示す。電流がｐＨ発生器によって加えられることが黒塗りドットによって示され、電流の非存在が白塗りドットによって示される。電解質溶液は、ｐＨ指示薬を含む場合、ｐＨレベルが７を超えるならば、紫色に変わり、または、ｐＨレベルが４．５未満であるならば、赤色に変わる。ｔ＝０．５において、例示的フォーカシングデバイスのｐＨ発生器に通電し、これにより、ｐＨ発生器は８０μＡの電流を生じさせた。結果として、図１１および図１２に示されるシミュレーションが予測するように、Ｈ＋イオンがフォーカシング流路に注入され、これにより、右側に進行した酸性前線をもたらした。ｔ＝４．５分において、電流が切られると、酸性状況が消えた。ｔ＝６．５分において、ｐＨ発生器が再び通電され、酸性状況がもう一度、生じた。画像に示されるように、急なｐＨ増加が、ｐＨプローブ９０２と、ｐＨプローブ９０３との間のセグメントにおける色の変化によって示され、一方、９０２と、９０１との間のセグメントの色は、８分の間中、一定のままであり、８のｐＨレベルを示している。
【０１２６】
急なｐＨ増加がまた、２段差のｐＨプロフィルの例示的な生成を示すグラフ１００５、および、上記で記載される例示的なフォーカシングデバイスの画像１００６である図１６によって示され得る。画像は、流路１００１、ｐＨ発生器９０４およびｐＨプローブ９０１〜ｐＨプローブ９０３、ならびに、電場方向１００７を示す。グラフは、ｐＨプローブ９０１〜ｐＨプローブ９０３の読み取りを時間の関数として示す。示されるように、ｐＨプローブ９０３は、ｐＨ発生器の右手側での酸性状況の生成を示す途切れることなく低下するｐＨレベルを読み取っている。ｐＨプローブ９０１およびｐＨプローブ９０２は、加えられた電流によって影響されない一定のｐＨレベルを示す実質的に一定のｐＨレベルを読み取っている。初期の発生器電流が１００μＡであり、後で１１０μＡおよび１２０μＡに上昇した。
【０１２７】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１２８】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行）の内容は、本明細書中に完全に述べられているかのように組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、等電点フォーカシングのための方法およびシステムに関連する。
【背景技術】
【０００３】
等電点フォーカシングは、分析物サンプルにおける分子を、分子の異なるイオン的性質を利用することによって分離するための分析技術である。
【０００４】
等電点フォーカシングは通常、固定化されたプロトン濃度勾配、一般には、所与の方向でより高いｐＨからより低いｐＨにまで変化するプロトン濃度勾配を有する電解質溶液（場合によっては、例えば、ポリアクリルアミド、デンプンおよび／またはアガロースに基づくゲル形態での電解質溶液）において行われる。一部の実施では、溶液は、電場のもとでｐＨ勾配を生じさせる両性電解質を含有する。等電点フォーカシングでは、分離が、分離距離全体を占め、かつ、勾配におけるｐＨが陽極から陰極に向かって増大するｐＨ勾配において生じる。使用時において、分析物が電解質溶液におけるある場所に負荷される。それぞれの異なる分子の電荷が、分子の様々な官能基の酸性度（ｐＫａ）に従って周囲のプロトン濃度に応答して変化する。
【０００５】
電位が、等電点フォーカシング陽極と、等電点フォーカシング陰極との間でプロトン濃度勾配と平行に加えられる。正味の正電荷を有する分子が電解質溶液を通って陰極に向かって移動し、一方、正味の負電荷を有する分子が電解質溶液を通って陽極に向かって移動する。
【０００６】
これらの分子が移動するにつれ、周囲のｐＨが変化して、分子における正味の電荷を減少させ、ついには、分子が、周囲のｐＨのためではあるが、分子における正味の電荷がゼロとなる等電点（ｐＩ）に達する。この地点で、移動中の分子は、ゼロの電荷を有するので停止する。そのような様式において、等電点フォーカシングは、特定のｐＩを有する分子を電解質溶液の比較的狭い体積に集中させる。等電点フォーカシングは、タンパク質をその酸性度に従って特徴づけることによってタンパク質の分析のために有用である。より重要なことであるが、等電点フォーカシングは、タンパク質の混合物を分離するために有用である。
【０００７】
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、プロトンの局所的濃度、プロトン濃度勾配および所望されるプロトン濃度トポグラフィーを、電解質を含む環境（例えば、電解質溶液またはゲルなど）において生じさせる際に有用な方法およびデバイスを記載する。この特許出願はまた、等電点フォーカシングおよびデータ表示のための方法およびデバイスを開示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、長さ軸を有し、かつ、電解質溶液を含有するために構成されるフォーカシング容器と、長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含む。それぞれの電気分解ユニットが、イオン流をフォーカシング容器の中に注入して、その結果、長さ軸に沿った電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配をもたらすようにするために構成される。それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、ｐＨ勾配が、複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される。
【０００９】
場合によっては、ｐＨ傾斜部は少なくとも０．１のｐＨである。
【００１０】
場合によっては、それぞれの段差が少なくとも３ｍｍの長さである。
【００１１】
場合によっては、少なくとも１つの電気分解ユニットは複数の電気分解ユニットを含み、この場合、それぞれの電気分解ユニットを別個に制御するためのコントローラーをさらに含む。
【００１２】
場合によっては、電解質溶液は複数の生体分子を含み、これらの複数の生体分子がｐＨ勾配に沿った少なくとも１つのｐＨ傾斜部にのみ濃縮する。
【００１３】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの１０未満を含む。
【００１４】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの５未満を含む。
【００１５】
場合によっては、勾配は複数の段差のうちの２つを含む。
【００１６】
場合によっては、少なくとも１つの電気分解ユニットの１つが、複数のヒドロキシルイオンを注入するために構成され、かつ、少なくとも１つの電気分解ユニットの別の１つが、複数の水素イオンを注入するために構成される。
【００１７】
場合によっては、フォーカシング容器は複数の狭くなったセグメントを有する。それぞれの電気分解ユニットが、イオン流をそれぞれの狭いセグメントに注入するために構成される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液を含有するために構成され、かつ、第１および第２の末端部ならびに長さ軸を有するフォーカシング容器であって、少なくとも１つのスリットを第１および第２の末端部までの途中に有するフォーカシング容器と、第１の末端部および第２の末端部にそれぞれ取り付けられ、かつ、第１の電流を、電解質溶液を介してそれらの間に通すために構成される陽極および陰極とを含む。本デバイスはさらに、少なくとも１つのスリットに近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランと、それぞれの少なくとも１つの二極性メンブランの前方にそれぞれが取り付けられ、かつ、第２の電流を少なくとも１つのそれぞれの二極性メンブランに付与し、その結果、少なくとも１つのスリットを介するイオン流を促進するようにするために構成される少なくとも１つの制御可能な電極とを含む。
【００１９】
場合によっては、本デバイスは、第１および第２の電流を、陽極および陰極に対して、また、少なくとも１つの制御可能な電極に対してそれぞれ供給する電流源を含む。
【００２０】
さらに場合によっては、本デバイスはさらに、発生器電流源を経由して上記制御可能な電極に物理的に接続されるホイートストンブリッジを含む。
【００２１】
場合によっては、第１および第２の電流は高電圧の電流である。
【００２２】
場合によっては、少なくとも１つの二極性メンブランは少なくとも１つの無気泡性の二極性メンブランである。
【００２３】
場合によっては、本デバイスは、第１および第２の末端部にそれぞれ接続される第１および第２の受器を含み、ただし、この場合、陽極および陰極が第１および第２の受器にそれぞれ少なくとも部分的に取り付けられる。
【００２４】
場合によっては、本デバイスは、フォーカシング容器を支持するための適所の前方において複数のソケットを有する支持構造物を含む。それぞれのソケットが、少なくとも１つの二極性メンブランの１つと、少なくとも１つの制御可能な電極の１つとを含有する。
【００２５】
場合によっては、本デバイスは、ｐＨレベルを少なくとも１つの二極性メンブランのそれぞれの近くで測定するために構成される少なくとも１つのｐＨプローブを含む。
【００２６】
場合によっては、少なくとも１つのスリットの幅が３ｍｍ未満である。
【００２７】
場合によっては、少なくとも１つの制御可能な電極と、二極性メンブランとの間の距離が３ｍｍ未満である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、長さ軸を有するフォーカシング容器を提供すること、複数の生体分子を有する電解質溶液を前記容器に加えること、電場を長さ軸に沿って電解質溶液において加えること、および、イオン流を長さ軸に沿った少なくとも１つの地点に注入して、電解質溶液における複数の段差によって定義されるｐＨ勾配を確立し、その結果、複数の生体分子が少なくとも１つの地点の近くで少なくとも１つの濃縮において蓄積することを含み、ただし、それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、ｐＨ勾配が、複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される。
【００２９】
場合によっては、本方法はさらに、ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤を加えることを含む。
【００３０】
場合によっては、ｐＨ勾配が上記複数の段差の中の複数の傾斜部によって定義され、この場合、ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤の混合物を加えることをさらに含む。
【００３１】
場合によっては、複数の生体分子が上記少なくとも１つの濃縮にだけ蓄積する。
【００３２】
場合によっては、注入することは、電流を、それぞれの上記少なくとも１つの地点で電解質溶液に近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランにおいて加えることを含む。
【００３３】
場合によっては、本方法はさらに、上記複数の生体分子を少なくとも１つの濃縮に従って診断することを含む。
【００３４】
場合によっては、本方法はさらに、少なくとも１つの濃縮の少なくとも１つを別々に集めることを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、電解質溶液を有する容器に少なくとも１つの生体分子を提供すること、少なくとも１つのｐＨ指示薬を電解質溶液に加えること、および、ｐＨ勾配を電解質溶液においてもたらすことを含む。本方法はさらに、電解質溶液の少なくとも１つの画像を取り込むこと、電解質溶液の少なくとも１つのセグメントの少なくとも１つの色特性を少なくとも１つの画像に従ってコンピューター計算すること、および、セグメントにおける少なくとも１つのｐＨレベルを少なくとも１つの色特性に従って計算することを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのためのデバイスが提供される。本デバイスは、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをその長さ軸の途中で、取り外し可能に保持するために構成されるフォーカシング容器と、第１の電流を、多孔性ブロックにおいて電解質溶液を介して通すために構成される複数の電極と、イオン流をフォーカシング容器の中に注入して、その結果、ｐＨ勾配を多孔性ブロックにおける電解質溶液において変化させるようにするためにそれぞれが構成される、長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含む。生体分子の混合物がｐＨ勾配に従って多孔性ブロックにおいて配置される。
【００３７】
場合によっては、フォーカシング容器は、多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、および、多孔性ブロックをフォーカシング容器から取り出すことの少なくとも一方のための開口部を有する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための方法が提供される。本方法は、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、ｐＨ勾配を、多孔性ブロックにおける生体分子の複数の濃縮を促進するように電解質溶液においてもたらすこと、および、多孔性ブロックを、複数の濃縮のうちの１つをそれぞれが別々に含有する複数のセグメントにセグメント化することを含む。
【００３９】
場合によっては、セグメント化することが、多孔性ブロックを複数の濃縮のうちのそれぞれ２つの間で切り取って、複数のセグメントを作製することによって行われる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、等電点フォーカシングのための着脱可能な溶液カートリッジが提供される。着脱可能な溶液カートリッジは、等電点フォーカシングシステムのフォーカシング流路にはまるようなサイズおよび形状を有し、かつ、複数の生体分子を有する電解質溶液により湿潤化されて、その結果、複数の生体分子の移動を電解質溶液において形成されるｐＨ勾配に従って可能にするようにするために構成される多孔性ブロックを含む。
【００４１】
場合によっては、多孔性ブロックは、複数の生体分子濃縮のうちのただ１つの濃縮をそれぞれが含む複数のセグメントを作製するために切り取ることができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質の混合物を分離するためのデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液および混合物を含有するために構成される電気泳動容器であって、長さ軸と、長さ軸と平行する第１および第２の向き合う側面とを有する電気泳動容器と、第１および第２の側面にそれぞれ取り付けられる第１および第２の二極性メンブランと、電場を電解質溶液において加えて、その結果、タンパク質を長さ軸に沿って動かすようにするための少なくとも１つ電極とを含む。第１および第２の二極性メンブランのうちの１つが、イオン流を電気泳動容器の中に注入して、その結果、電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を長さ軸と直交してもたらすようにするために構成される。それぞれの段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有する。
【００４３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４５】
【図１】図１は、生体分子の分離、および／または、１つもしくは複数の生体分子を有する分析物の診断を行うための、本発明のいくつかの実施形態による例示的な等電点フォーカシングデバイスの側面図の概略図である。
【００４６】
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示されるｐＨ発生器の拡大図である。
【００４７】
【図３】図３は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示されるデバイスの構成要素のいくつかを支持するための例示的な構造物の概略図である。
【００４８】
【図４】図４は、本発明のいくつかの実施形態による、等電点フォーカシングのための方法のフローチャートである。
【００４９】
【図５】図５は、本発明のいくつかの実施形態による、電場をイオンスリットの近くで増大させるための狭くなったセグメントを有するフォーカシング流路の概略図である。
【００５０】
【図６】図６は、本発明のいくつかの実施形態による、ｐＨ発生器の近くに配置されるフォーカシング流路のセグメント、ならびに、Ｎａ２ＳＯ４電解質溶液およびリン酸塩緩衝剤系（ＨＰＯ４−２／Ｈ２ＰＯ４−）を使用するときの段差形状の勾配である。
【００５１】
【図７】図７は、本発明のいくつかの実施形態に従ってもたらされる段階化ｐＨプロフィルを有する例示的な勾配、および、タンパク質の濃縮である。
【００５２】
【図８】図８は、本発明のいくつかの実施形態による、通過する電流に対する無気泡性ＢＰＭの応答の概略図である。
【００５３】
【図９】図９は、本発明のいくつかの実施形態による、幅広いスリットを有するｐＨ発生器である。
【００５４】
【図１０】図１０は、図１に示されるデバイスに類似するデバイスで、電解質溶液および生体分子により湿らされる多孔性ブロックを有する、本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの概略図である。
【００５５】
【図１１】図１１は、本発明のいくつかの実施形態による、生体分子濃縮を単離するために使用される例示的な取り外し可能な多孔性ブロックの概略図である。
【００５６】
【図１２】図１２は、二極性メンブランを向かい合う面に有する電気泳動容器で、ｐＨ段階化を生じさせるために設計される、本発明のいくつかの実施形態による電気泳動容器の概略図である。
【００５７】
【図１３】図１３は、本発明のいくつかの実施形態に従って規定される例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションによって生じる様々なｐＨプロフィルを示すグラフである。
【００５８】
【図１４】図１４は、本発明のいくつかの実施形態に従って規定される例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションによって生じる様々なｐＨプロフィルを示すグラフである。
【００５９】
【図１５】図１５は、例示的なフォーカシングデバイスのフォーカシング流路の一連の９個の画像、および、電気分解期間を示す一組のドットである。
【００６０】
【図１６】図１６は、２段差のｐＨプロフィルの例示的な生成を示すグラフ、および、例示的なフォーカシングデバイスの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子分析および分子相互作用に関連し、より具体的には、しかし、限定的ではなく、等電点フォーカシングのための方法およびシステムに関連する。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、安定した段階化ｐＨ勾配を電解質溶液においてもたらし、その結果、生体分子（例えば、タンパク質およびペプチドなど）をそれらのｐＩに従って濃縮することを促進するようにするための方法およびシステムが提供される。安定した段階化ｐＨ勾配は、異なるｐＨレベルをそれぞれが有する複数の段差を有する。それぞれ２つの連続する段差が、０．１超のｐＨ単位（例えば、０．５のｐＨ単位）の急峻なｐＨ傾斜部によって隔てられる。そのような勾配は、生体分子を約１０００秒で段階化ｐＨ勾配に沿って濃縮することを可能にする。場合によっては、安定した段階化ｐＨ勾配は１０未満の段差（例えば、５、４、３および２）を有する。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生体分子の濃縮を分離および／または診断するためのフォーカシングデバイスが提供される。本デバイスは、電解質溶液を生体分子の混合物と一緒に含有するためのフォーカシング容器（例えば、フォーカシング流路など）を含む。本デバイスはさらに、電場を電解質溶液において加えるための電極を含む。電場により、生体分子が電解質溶液においてある軸に沿って並ばされる。フォーカシング流路は、１つまたは複数の電気分解ユニット（これは本明細書中ではｐＨ発生器として示される）がＨ＋イオンまたはＯＨ−イオンをフォーカシング流路に注入することを可能にする１つまたは複数のスリットを有する。Ｈ＋イオンまたはＯＨ−イオンが、場合によっては無気泡性であるが、二極性メンブランを使用することによって生じる。Ｈ＋イオンまたはＯＨ−イオンにより、ｐＨ勾配が軸に沿って決定される。このことは、生体分子がそれらのｐＩに従ってｐＨ勾配に沿って濃縮することを可能にする。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、画像処理を、フォーカシング容器における電解質溶液の１つまたは複数のセグメントでのｐＨレベルをコンピューター計算するために使用するための方法が提供される。そのような実施形態において、ｐＨ指示薬が電解質溶液に加えられる。ｐＨ指示薬は電解質溶液の色を、フォーカシング容器において形成されるｐＨ勾配に従ってフォーカシング容器に沿って変化させる。変化した色が、画像センサーを使用して取り込まれる。取り込まれたデータにより、フォーカシング容器に沿った１つまたは複数のセグメントのｐＨレベルをコンピューター計算することができる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電解質溶液を生体分子の混合物と一緒に吸収するための多孔性ブロックを含む着脱可能な溶液カートリッジが提供される。着脱可能な溶液カートリッジの多孔性ブロックは、フォーカシング流路（例えば、上記で概略され、また、下記で記載されるようなフォーカシング流路など）にはまるようなサイズおよび形状を有する。場合によっては、使用時において、多孔性ブロックは、電解質溶液と、分離されるべき生体分子の混合物とにより湿らされ、フォーカシング流路に挿入される。その後、ｐＨ勾配が、大きい電場と一緒にフォーカシング流路に沿ってもたらされる。ｐＨ勾配は、混合物の生体分子の濃縮を多孔性ブロックに沿ったいくつかの濃縮において促進させる。これは、異なるｐＩを有する生体分子が異なる場所に集中するからである。次いで、多孔性ブロックが取り出され、これにより、使用者は、多孔性ブロックを、例えば、濃縮がセグメント毎に制限される様式で切り取ることによってセグメント化することができる。
【００６６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００６７】
次に、図１が参照される。図１は、１つもしくは複数の生体分子を含む混合物における生体分子の分離、および／または、１つもしくは複数の生体分子を有する分析物の診断を行うための、本発明のいくつかの実施形態による例示的な等電点フォーカシングデバイス１００の側面図の概略的例示である。本明細書中で使用される場合、生体分子には、タンパク質、ペプチド、ペプチドに基づく医薬用化合物、および、生体分子に基づく医薬用化合物が含まれる。
【００６８】
等電点フォーカシングデバイス１００は、場合によってはフォーカシング容器（これは本明細書中ではフォーカシング流路１０２として示される）に近接してアレイとして配置される複数の電気分解ユニット１０１を含む。場合によっては、フォーカシング流路は、例えば、１００ｍｍの長さ、５ｍｍの幅および０．５ｍｍの厚さの矩形のガラスキャピラリーである。電気分解ユニット１０１は、イオン流を生じさせ、そのイオン流をフォーカシング流路１０２に注入することによって、フォーカシング流路１０２の長さ軸９９またはそれと平行する任意の他の軸に沿った異なるセグメントにおけるｐＨレベルを制御する。これらの電気分解ユニットは本明細書中ではｐＨ発生器として示されることがある。そのような様式において、急峻なｐＨ傾斜部によって互いに隔てられ、フォーカシング流路１０２においてもたらされ、かつ、場合によっては、例えば、イオンが種々のセグメントにおいて注入される限りは数分間を超える期間にわたって維持される複数のｐＨ段階を有する勾配。そのような勾配は、段階化勾配、および／または、段差形状プロフィルを有するｐＨ勾配として示されることがある。
【００６９】
２つだけのｐＨ発生器が示されるが、等電点フォーカシングデバイス１００は任意の数のｐＨ発生器１０１（例えば、４個、８個、１２個、１６個、２０個、１００個または任意の中間数またはより大きい数のｐＨ発生器１０１）を有し得ることには留意しなければならない。
【００７０】
図１に示されるように、フォーカシング流路１０２の左側面および右側面のそれぞれ一方が電解質溶液受器（１０３、１０４）に対して開いている。電解質溶液受器の一方１０３が陰極１０５に接続され、他方１０４が陽極１０６に接続される。陰極および陽極の受器（１０３、１０４）は、場合によっては高電圧（ＨＶ）のために設計され、フォーカシング流路１０２を主電流源１０８（場合によってはＨＶ電流源、例えば、およそ３００Ｖを超える電圧を有する電源）に接続する。他の電場が生体分子の混合物に依存して加えられ得ることには留意しなければならない。
【００７１】
場合によっては、システム１０１はさらに、主電流源１０８およびｐＨ発生器１０１を場合によっては別々に制御するコントローラー１１０を含む。例えば、ｐＨ発生器１０１の電極を、コントローラーにより、それぞれの電極が、選択された電流により別々にバイアス付加することを可能にする様式でコントローラー１１０に別々に接続することができる。
【００７２】
場合によっては、図１に示されるように、１つまたは複数のｐＨプローブ１０９がフォーカシング流路１０２に沿って置かれる。それぞれのｐＨプローブ１０９が、局所的ｐＨをモニターするために、１つまたは複数のｐＨ発生器１０１に隣接して設置される。場合によっては、コントローラーはｐＨプローブ１０９の出力を受け取る。場合によっては、コントローラー１１０はｐＨプローブ１０９の出力を受け取り、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日公開、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、ｐＨ発生器１０１に送られる電流をそれに従って調節する。
【００７３】
次にまた、図２が参照される。図２は、本発明のいくつかの実施形態による、図１に示される例示的なｐＨ発生器１０１の拡大図である。ｐＨ発生器１０１は、フォーカシング流路１０２に隣接して配置される二極性メンブラン（ＢＰＭ）２００を含む。場合によっては、ＢＰＭは、Ｆ．Ｇ．Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｉ．他、Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｐｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｓａｌｔ ｉｏｎ ｌｅａｋａｇｅ ｉｎ ａｃｉｄ−ｂａｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、１８２（１−２）、１３〜２８、および、Ｇ．Ｐｏｕｒｃｅｌｌｙ、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｐｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、３８（８）、９１９〜９２６において定義される通りである。ｐＨ発生器１０１はさらに、コントローラー１１０によって制御される発生器電流源２０２に接続される電極２０１（例えば、白金電極）を含む。場合によっては、電極２０１は、発生器電流源２０２に接続される白金線である。電極２０１は、チャンバー２０５として示されることがある空間（例えば、体積において１ｃｍ３；これは場合によっては接する）に配置される。場合によっては、チャンバー２０５は水性の電解質溶液で満たされる。
【００７４】
次にまた、図３が参照される。図３は、本発明のいくつかの実施形態による、デバイス１００の構成要素を支持するための例示的な構造物１２０の概略図である。場合によっては、上記で概略されるように、流路は矩形のガラスキャピラリーである。フォーカシング流路１０２が、場合によってはＰｅｒｓｐｅｘブロックである構造物１２０に取り付けられる。フォーカシング流路１０２は、ｐＨ発生器１０１のアレイからのイオンの通過およびｐＨプローブ１０９からのｐＨ検知を可能にする薄いスリット２１１を有する。構造物１２０は、１２１において示されるように、ｐＨプローブが挿入されるｐＨプローブソケットと、例えば、図２において示されるように、ＢＰＭ２００および電極２０１が挿入される発生器チャンバー２０５とを収容する。場合によっては、それぞれのｐＨプローブがＳＥＮＲＯＮのＭｉｃｒｏ電極９０７０−００８を含む（その仕様書が参照によって本明細書中に組み込まれる）。Ｍｉｃｒｏ電極が、流路からのイオンがその中では自由に小さいスリットに達し、これを通り抜け、これにより、ｐＨ検知を可能にするｐＨプローブソケットに挿入される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、発生器電流源２０２が、例えば、図１では１１１において示されるように、場合によってはホイートストンブリッジを経由して陽極１０６および陰極１０５に接続される。ホイートストンブリッジ１１１が、陰極１０５と、陽極１０６との間を接続するために置かれる。ホイートストンブリッジ１１１は、ｐＨ発生器１０１が高電圧で作動することを可能にするために使用される。１０ボルトを超える電圧が存在する場合、電位差がＢＰＭ２００の両方の面において現れるかもしれない。具体的には、電源１０８を介した電位差はＢＰＭの２つの面の間における電位差をもたらす。ＢＰＭの２つの面の間における電位差が１０Ｖを超えるならば、ＰＢＭが損傷するかもしれない。そのような電位差は、発生器電流源２０２と同様に、ＢＰＭ２００を傷つけるかもしれない。場合によっては、ブリッジは、メンブランの２つの面の間における電位をバランスさせ、これにより、２つの面の間における電位差を、ＢＰＭ２００および／または発生器電流源２０２の運転を妨げることなく低下させる一連の抵抗器からなる。代替では、高電圧が加えられず、発生器電流源２０２が陰極１０５および陽極１０６に直接にワイヤ接続される。
【００７６】
ｐＨ発生器１０１（これには発生器電流源２０２によって通電され得る）により、ｐＨ勾配がフォーカシング流路１０２においてもたらされる。二極性メンブラン２００は、ｐＨ発生器１０１が水分子を水素Ｈ＋およびヒドロキシルＯＨ−に効率よく解離することを可能にする。一般に知られているように、二極性メンブランは、Ｈ＋を放出することを可能にする面１５１と、ヒドロキシルＯＨ−を放出することを可能にする別の面１５２との２つの面を有する。ＢＰＭ２００は、例えば、１０１Ａにおいて示されるように、Ｈ＋をフォーカシング流路１０２の中に放出し、かつ、ヒドロキシルＯＨ−をチャンバー２０５の中に放出するために配置することができ、または、例えば、１０１Ｂにおいて示されるように、ＯＨ−がフォーカシング流路１０２の中に放出され、かつ、Ｈ＋がチャンバー２０５の中に放出されるように逆配置で配置することができる。
【００７７】
図４もまた参照される。図４は、本発明のいくつかの実施形態による、等電点フォーカシングのための方法９０のフローチャートである。
【００７８】
最初に、９１において示されるように、フォーカシング容器が提供される（例えば、１００において示される等電点フォーカシングデバイスの容器など）。その後、９２において示されるように、電解質溶液により、等電点フォーカシングデバイスのフォーカシング容器が満たされる。場合によっては、２つの電解質溶液受器（１０３、１０４）と、流路１０２とが、溶液で満たされる。９４において示されるように、１つまたは複数の異なる生体分子（例えば、タンパク質など）の混合物がフォーカシング容器における溶液に加えられる。混合物は、下記で記載されるようなｐＨ勾配を確立する前および／または確立している期間中に加えられ得ることには留意しなければならない。９３において示されるように、電場（例えば、上記ＨＶなど）が、例えば、陰極１０５と、陽極１０６との間に、長さ軸９９に沿って電解質溶液において加えられる。その後、９５において示されるように、１つまたは複数のイオン流が長さ軸９９に沿った１つまたは複数の地点において注入されて、９６において示されるように、急峻なｐＨ傾斜部によって隔てられる複数の段差によって規定されるｐＨ勾配を確立し、その結果、生体分子が、急峻なｐＨ傾斜部をｐＨ発生器１０１の前方の空間にもたらす注入地点の近くに蓄積する。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フォーカシング流路１０２は、電場をイオンスリットの近くで増大させるための狭くなったセグメントを有するいくつかの狭くなったセグメントを含む。具体的には、これらのセグメントは、例えば、図５の数字１３１において示されるように、流路の他のセグメントよりも狭いので、これらのセグメントにおいて形成される電場は流路の他のセグメントにおける電場よりも強い。そのような実施形態において、イオンスリット２１１が流路１０２の狭くなったセグメント１３１において形成される。強い電場は、生体分子を流路のより狭いセグメントにおいて濃縮するようにｐＨ傾斜部を狭くする。
【００８０】
次に、水素Ｈ＋イオンおよび／またはヒドロキシルＯＨ−イオンを、安定なｐＨ勾配をフォーカシング流路１０２において保証する様式で電解質溶液に注入するプロセスの説明が示される。明確化のために、電解質溶液における化学種ｉのイオンの挙動が下記の式によって支配される：
式中、Ｃｉは化学種ｉの濃度を示し、ＤＣｉはＣｉの拡散係数を示し、μＣｉはＣｉの電気移動度を示し、Ｚｉは電子単位でのＣｉの電荷を示し、Ｆはファラデー定数を示し、Ｒｉは化学種ｉの反応項を示し、Ｅはフォーカシング流路１０２における電場を示す。基本的に、式１は、電解質溶液においてイオンに作用する２つの駆動力、すなわち、拡散移動および電気的移動を記述する。デバイス１００において、電場がＨＶ電流源１０８に従って決定され、したがって、主要な駆動力として機能する。ポアソン方程式によれば、イオン濃度に対するＥの依存性を下記のように表すことができる：
式中、εは水の誘電率を示す。
【００８１】
場合によっては、Ｅの存在下での安定したｐＨ勾配をフォーカシング流路１０２においてもたらすために、化学種の１つ（Ｈ＋またはＯＨ−）が多く存在する電解質溶液が流路に通される。例えば、ｐＨ１０の電解質溶液を、多く存在する化学種としてのＯＨ−の１０−４Ｍの濃度、および、Ｈ＋の１０−１０Ｍの濃度で、流路に通すことができる。そのような実施形態において、多く存在する化学種の濃度を、他の化学種（例えば、Ｈ＋イオン）をフォーカシング流路１０２の途中で注入することによって徐々に低下させることができる。
【００８２】
他の化学種がフォーカシング流路１０２に注入されるとき、ｐＨレベルにおける急峻な傾斜部が注入点においてもたらされる。傾斜部は、イオン注入が行われない場合には保たれる一定のｐＨ値に関して急峻である。簡単に述べると、そのような注入により、分析物が蓄積するまさにその地点、すなわち、注入装置の前方のまさにその地点を規定する段差形状のプロフィルを有するｐＨ勾配がもたらされる。このことは、生体分子を検出および／または集めることをより容易にする。場合によっては、傾斜部の長さ、すなわち、フォーカシング流路１０２の長さ軸の部分と、傾斜部の高さ、すなわち、ｐＨレベルの変化との比率が、１ｐＨ単位あたり１０−４ｍである。
【００８３】
使用時において、注入された生体分子は移動させられ、ついには、注入された生体分子は、それらのｐＩと実質的または完全に一致するｐＨレベルを有するフォーカシング流路１０２のセグメントに到達する。例えば、図７に示されるように、デバイス１００によって形成される段階化勾配は、フォーカシングプロセスを速めることを可能する。生体分子を取り巻くｐＨと、それらのｐＩとの差がより大きいとき、生体分子において加えられる駆動力がより強くなる。フォーカシング流路１０２における電解質溶液のｐＨ勾配がｐＨ段階に分割されるので、生体分子のｐＩと、周囲ｐＨとの差は、生体分子が、ほとんどの場合、他の段階との関連で、それらのｐＩと実質的または完全に一致するｐＨを有するｐＨ段階に到達するまでは比較的大きい。そのｐＨ段階において、生体分子は２つの異なるｐＨ段階の間の領域に静止し、濃縮する。そのような様式においては、タンパク質がそのｐＩに近づくにつれて速度が低下する既存の方法とは異なり、フォーカシング流路１０２における生体分子の速度は大きく、かつ、一定のままであり、したがって、フォーカシングが比較的速く、例えば、２つの段階を有する勾配をもたらすデバイス１００では１０００秒である。
【００８４】
他方で、段差形状でないｐＨ勾配では、生体分子の駆動力が、ｐＨ勾配が徐々に増大または低下することにより徐々に低下する。そのような勾配におけるフォーカシングでは、比較的長いフォーカシング時間が要求される。これは、生体分子が、ｐＨレベルがそれらのｐＩと一致する点に一層接近するときには生体分子の駆動力が実質的に低下するからである。さらに、段差形状プロフィルにより、生体分子が蓄積するまさにその地点、すなわち、注入装置の前方のまさにその地点が規定される。
【００８５】
場合によっては、段差形状のプロフィルの安定性が、フォーカシング流路１０２における電解質溶液の段差形状のｐＨプロフィルと類似または同一である酸解離定数（ｐＫａ）を有する緩衝剤を加えることによって維持される。ｐＫａの値は好ましくは、急峻なｐＨ傾斜部の両側のｐＨレベルの範囲にある。例えば、傾斜部を、ｐＨ５の段差と、ｐＨ６の段差との間にもたらすためには、５〜６の間のｐＫａ（例えば、５．４）を有する緩衝剤を選ばなければならない。場合によっては、異なるｐＫａを有する緩衝剤の混合物が加えられる。そのような様式において、複数の傾斜部を同時に安定化することができる。そのような混合物の一例が、支持電解質として機能する０．００５ＭのＮａ２ＳＯ４と、２、７．２および／または１２．３３のｐＫａを有する０．００２５Ｍリン酸塩緩衝液と、３．１３、４．７６および／または６．４０のｐＫａを有する０．００２５Ｍクエン酸塩とを含む混合物である。
【００８６】
次に、図６が参照される。図６は、本発明のいくつかの実施形態による、ｐＨ発生器１０１の近くに配置されるフォーカシング流路１０２のセグメント、および、Ｎａ２ＳＯ４電解質溶液を使用するときに形成される段差形状の勾配である。場合によっては、ｐＨ８でのリン酸塩緩衝剤がＮａ２ＳＯ４電解質溶液に加えられる。図６に示されるように、Ｅは正イオン（カチオン）を左側に移動させ、負イオン（アニオン）を右側に移動させる。ｐＨ発生器１０１を始動させたとき、Ｈ＋イオンがフォーカシング流路１０２に注入され、直ちに左側に移動し、同時に、緩衝剤イオンと反応する。反応に応答してもたらされるが、Ｈ＋イオンおよび緩衝剤イオンの濃縮により、３０１において示されるように、段差形状のｐＨ勾配がもたらされる。
【００８７】
この電解質溶液において、このｐＨ付近で高い濃度で存在する緩衝剤分子の化学種が、ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−である。これらの緩衝剤分子は下記のプロトン化反応に関与する：
ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−の相対的濃度の対するｐＨの依存性を、下記のように、ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式によって表すことができる：
式中、Ｋａは反応の平衡定数である。
【００８８】
一般に知られているように、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンは反応して、水を生じさせる：
ただし、平衡定数Ｋｗは下記を満たす：
【００８９】
ｐＨ発生器１０１が始動されないならば、すべての化学種の濃度が一定であり、電解質溶液のｐＨレベルもまた一定である。しかしながら、ｐＨ発生器１０１の１つまたは複数がプロトンをフォーカシング流路１０２に対して注入するとき、プロトンは、ＨＰＯ４−２イオンがＨ２ＰＯ４−イオンに変換される式３における順方向の反応において示されるように反応する。その結果、式４に記載されるように、発生器の右手側でのフォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルが低下する。したがって、それぞれのｐＨ発生器１０１におけるプロトンの注入により、段差形状の勾配が、フォーカシング流路１０２におけるＨ＋イオン、ＨＰＯ４−２イオンおよびＨ２ＰＯ４−イオンの濃度を同時に変化させることによってもたらされる。Ｅは正イオンを左側に移動させ、負イオンを右側に移動させるので、それぞれのフォーカシング流路１０２の左手側におけるＨ＋、ＨＰＯ４−２およびＨ２ＰＯ４−の濃度は留まったままであり、それぞれのフォーカシング流路１０２の右手側におけるＨ＋およびＨ２ＰＯ４−の濃度、ならびに、ＨＰＯ４−２の濃度がそれぞれ増大および低下する。
【００９０】
式５および式６に従って、Ｈ＋イオンがＯＨ−イオンと反応するとき、上記の段差形状のｐＨプロフィルが緩衝剤の非存在下で生じ得ることには留意しなければならない。しかしながら、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンの濃度は小さいかもしれないので（例えば、１０−６〜１０−８の間）、比較的低い電流により、プロフィルにおける段差が生じるかもしれない。そのような敏感さは、提供された電流におけるどの変化も、フォーカシング流路１０２における所望されるｐＨ勾配の段差形状のｐＨプロフィルに影響することを生じさせるか、または、フォーカシング流路１０２における所望されるｐＨ勾配の段差形状のｐＨプロフィルをなくすことを生じさせる。
【００９１】
ｐＨ発生器１０１は、注入されたＨ＋イオンの流れがＨＰＯ４−２イオンの流れよりも小さい様式で通電される。そうでない場合には、ＨＰＯ４−２イオンの流れがＨ＋イオンの流れによって消され、これにより、フォーカシング流路１０２全体にわたるｐＨ低下が引き起こされる。
【００９２】
場合によっては、いくつかのｐＨ発生器１０１を、段階化ｐＨプロフィルをもたらすために使用することができる。そのような実施形態において、複数のｐＨ発生器１０１により、これらはフォーカシング流路１０２に沿って配置されるので、これらのｐＨ発生器１０１によって加えられる異なる電流によって制御され得る勾配状の多数のｐＨ段差がもたらされる。段階化プロフィルを有するそのような勾配は、異なるｐＩを有する複数の生体分子を同時に集中させるために利用することができる。コントローラーはこれらのｐＨ発生器１０１に通電して、種々の混合物の生体分子のプローブ探査および／または分離するためにそれぞれが選択される異なる段差形状のｐＨプロフィルを有する異なる勾配を確立することができる。それぞれのｐＨプロフィルが、異なるｐＨレベルを有するセグメントを有する。それぞれのセグメント（これは段階化ｐＨプロフィルにおける段差に対応する）を混合物における異なる生体分子のｐＩに従って選択することができる。使用時において、電解質溶液に加えられる種々の生体分子がフォーカシング流路１０２の異なるセグメントを占める。異なるｐＩを有する種々の生体分子をフォーカシング流路１０２に加えることにより、複数の濃縮を生じさせることができる。例えば、図７は、上記で記載されるデバイス１００または方法９０によってもたらされる、第１の傾斜部が７〜５．７の間のｐＨレベルを有し、第２の傾斜部が５．７〜５の間のｐＨレベルを有する段階化ｐＨプロフィルを有する例示的な勾配を示す。この勾配のプロフィルは、これらの傾斜部が、５．３のｐＩおよび６のｐＩをそれぞれ有するタンパク質Ａおよびタンパク質ＢのｐＩと一致するように構築される。そのような様式において、タンパク質Ａが、ｐＨ５と、ｐＨ５．７との間の接合部４０１に静止し、タンパク質Ｂが、ｐＨ５．７と、ｐＨ７との間に静止する。そのようなｐＨプロフィルは、これらの生体分子の混合物を分離するために使用することができる。
【００９３】
次に、再びではあるが、図２が参照される。上記で記載されるように、ｐＨ発生器はＢＰＭ２００を含む。上記で記載されるように、ＢＰＭ２００は、Ｈ＋イオンおよびＯＨ−イオンを、水分子を分割することによって生じさせる。場合によっては、ＢＰＭ２００は、膨れまたは泡を電気分解期間中にその表面上および／またはそれらの間に生じさせない１つまたは複数の無気泡性メンブランを含む。簡略化のために、そのようなＢＰＭ２００は無気泡性ＢＰＭ２００として示されることがある。そのような無気泡性ＢＰＭ２００を使用するとき、フォーカシング流路１０２は、気泡が実質的に存在しない状態のままであり、したがって、流路のより近くに置くことができる。そのような近接は、ｐＨ勾配をより速い速度（例えば、数秒）で生じさせることを可能にし、また、より長期間にわたって安定なままにすることができる。同様にまた、無気泡性ＢＰＭ２００は、他のｐＨ発生器よりも正確かつ安定であるｐＨプロフィルを生じさせることを可能にするので、一定ｐＨの領域における変動がより少なくなる。
【００９４】
電極が、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日公開）に記載されるように、ｐＨ発生器として使用されるとき、気泡がフォーカシング流路の中に拡散することを防止するために、当該電極は、フォーカシング流路１０２から距離をとって、例えば、３ｍｍ離れて置かれることには留意しなければならない。そのような距離は、電極によって生じたイオンが典型的なフォーカシング流路に移動して、ｐＨ勾配をもたらすために要する時間を、例えば、およそ４００秒に遅らせる。上記で記載されるように、無気泡性ＢＰＭ２００を使用することにより、気泡の生成が防止され、したがって、ｐＨ発生器１０１をフォーカシング流路１０２の比較的ごく近くに、例えば、０．１ｍｍ未満に置くことが可能になる。
【００９５】
さらに、そのようなｐＨ発生器のアレイは、生体分子をより大きい分離度で分離をすることを可能にする。そのようなデバイス１００において生じる勾配の大きい安定性は、限定された範囲からのｐＩを有する生体分子を分離することを可能にする。
【００９６】
次に、図８もまた参照される。図８は、本発明のいくつかの実施形態による、通過する電流に対する無気泡性ＢＰＭ２００の応答の概略図である。ＢＰＭ２００は水分子をＨ＋イオンおよびＯＨ−イオンに分割する。場合によっては、ＢＰＭは、アニオン交換層１５２と、カチオン交換層１５１とからなり、これらの層は、水が通って拡散し得る薄い境界５０５を残して互いに平行に置かれる。アニオン交換層１５２およびカチオン交換層１５１は、アニオンおよびカチオンをそれぞれ伝え、一方、逆電荷のイオンに対しては不透過性である半透過性メンブランである。水の電気分解が、ＢＰＭ２００を、アニオン交換層１５２が陽極５０３に面し、カチオン交換層１５１が陰極５０４に面するように陽極５０３と、陰極５０４との間に置くことによって達成される。電圧が、陽極５０３と、陰極５０４との間に加えられたとき、層１５１と、層１５２との間の水分子が、逆方向ではあるが、Ｈ＋イオンと、ＯＨ−イオンとに分かれる。
【００９７】
水が分かれることに加えて、水の加水分解が生じ、これにより、Ｈ＋およびＯ２ガス分子が陽極５０３で生じ、ＯＨ−およびＨ２ガス分子が陽極５０４で生じる。
【００９８】
次に、もう一度ではあるが、図１が参照される。使用時において、主電流源１０８によって生じる電流により、電圧差が、フォーカシング流路１０２において、陰極１０５と、陽極１０６との間に生じる。ｐＨ発生器１０１（これらはフォーカシング流路１０２に沿って置かれる）は、イオンを、図３の２１１において示されるように、小さいスリット（例えば、およそ０．５ｍｍ）を介して流路に注入する。図１に示されるように、ｐＨ発生器１０１の電極のそれぞれ１つがそのそれぞれの発生器電流源２０２に接続され、次に、発生器電流源２０２はホイートストンブリッジを介して陰極１０５および陽極１０６につながる。そのような様式において、発生器電流源２０２は、電流を、ｐＨ発生器１０１の白金電極を介して陰極１０５および陽極１０６に向かわせるか、または、逆に、陰極１０５および陽極１０６介してｐＨ発生器１０１の白金電極に向かわせる。上記で記載されるように、ＢＰＭの配向により、どのイオンがフォーカシング流路１０２に注入されるかが決定されることには留意しなければならない。
【００９９】
図１において、図８に関しては、左側のｐＨ発生器１０１Ａの電極が陽極５０３として機能し、陰極１０５および陽極１０６が一緒になって、陰極５０４として機能する。ｐＨ発生器１０１Ａおよび類似するｐＨ発生器は、Ｈ＋イオンをフォーカシング流路１０２に注入するように配向されるそれらの二極性メンブランを有する。そのようなｐＨ発生器は電流をそれぞれの電極から陰極１０５および陽極１０６に向かわせる。反対に、右側のｐＨ発生器１０１Ｂの電極は陰極５０４として機能し、陰極１０５および陽極１０６は一緒になって、陽極５０３として機能する。ｐＨ発生器１０１Ｂおよび類似するｐＨ発生器は、ＯＨ−イオンをフォーカシング流路１０２に注入するように配向されるそれらの二極性メンブランを有する。そのようなｐＨ発生器は電流を陽極１０５および陰極１０６からそれぞれの電極に向かわせる。
【０１００】
次に、もう一度ではあるが、図２が参照される。上記で概略されるように、ｐＨ発生器１０１の内側で生じる化学的プロセスは、Ｈ＋イオンをフォーカシング流路１０２に注入することを可能にする。使用時において、上記で記載されるように、電流が電極２０１を介して流れる。通電された電極２０１は、水分子をＨ＋およびＯ２ガス分子に分解する電気分解を引き起こす。電流が、ＯＨ−およびＨ２ガスが生じる陰極１０５および陽極１０６に流れる。電極２０１と、陰極１０５および陽極１０６との間において、ＢＰＭ２００は水分子をＨ＋イオンおよびＯＨ−イオンに分解する。電極２０１およびＢＰＭ２００は互いに近接しているので、ＢＰＭ２００によって生じるＯＨ−イオンと、電極２０１によって生じるＨ＋イオンとは、式５に従って絶え間なく再結合し、一定のｐＨをチャンバーにおいて維持する。他方で、陰極１０５および陽極１０６と、ＢＰＭ２００との距離は、フォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルを長期間にわたって制御することを可能にする。
【０１０１】
上記で記載されるように、また、図２に示されるように、ｐＨ発生器１０１は、イオンを、薄いスリット２１１を介してフォーカシング流路１０２に注入する。代替では、ｐＨ発生器１０１は、イオンを、例えば、図９に示されるように、より幅広い開口物を介して注入する。そのような実施形態において、イオンが、数ｃｍの幅であるスリットを介して注入される。この構成は、互い非常に接近して置かれる非常に多数の薄いスリットと等価であるので、結果は、数多くの短い段差から構成される平滑なｐＨプロフィルである。そのような実施形態において、注入は、多数の小さい段差からなる中程度の傾斜部を有するｐＨプロフィルを引き起こす。
【０１０２】
次に、もう一度ではあるが、図１が参照される。本発明のいくつかの実施形態によれば、コントローラー１１０が、ユーザーインターフェース（示されず）に、例えば、クライアント端末（例えば、パーソナルコンピューターまたはノート型コンピューターなど）に対して実行されるグラフィックユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含むモジュールなどに接続される。そのような実施形態において、コントローラーは、使用者によって提供される値に従ってｐＨ発生器１０１に通電することができる。例えば、使用者は所望のｐＨレベルを入力することができ、コントローラー１１０はｐＨ発生器をそれに従って作動させることができる。別の実施形態において、使用者は１つまたは複数の生体分子を選択し、コントローラー１１０はｐＨ発生器をそれに従って作動させることができる。そのような実施形態において、通電することが、例えば、上記で記載されるように、生体分子をフォーカシング流路１０２の種々のセグメントにおいて分けることを可能にするｐＨプロフィルをもたらすために行われる。
【０１０３】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連するシステムおよび方法が開発されることが予想され、電源、ＧＵＩ、およびコントローラーの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、デバイス１００は、生体分子濃縮を固定することを可能にする。上記で記載されるように、デバイス１００において通る電流により、フォーカシング流路１０２内へのイオンの注入が誘導され、そのｐＨ勾配が場合によっては動的ではあるが、様々な生体分子濃縮を生じさせることを可能にする様式で調節される。しかしながら、電流およびイオン注入が停止するとき、これらの濃縮は解消することがある。解消は、生体分子濃縮物の診断および／または分離された生体分子濃縮物の回収を制限し、かつ／あるいは、電流およびイオン注入を診断期間の期間中に維持することを必要とする。次に、図１０が参照される。図１０は、本発明のいくつかの実施形態による、濃縮の解消を遅くするか、または防止する多孔性ブロック１１８を有する着脱可能な溶液カートリッジ１１９を有するデバイス１００の概略図である。デバイス１００は、図１に示される構成要素のすべてを含み、しかしながら、フォーカシング流路１０２は、着脱可能な溶液カートリッジ１１９を含有するための空間と、その挿入および／または取り出しのための挿入開口部とを形成する。多孔性ブロック１１８が多孔性材料（例えば、セルロース）から構成される。使用時において、多孔性ブロック１１８は、電解質溶液により、また、分析される生体分子の混合物により湿らされ、その後、フォーカシング流路１０２に挿入される。次に、イオンが、上記で記載されるように、ｐＨ発生器１０１によって注入される。多孔性ブロック１１８の多孔性材料は、注入されたイオンが多孔性ブロック１１８におけるｐＨレベルを変化させることを可能にし、これにより、例えば、上記と同様に、段階化プロフィルを場合によっては有するそれに沿ったｐＨ勾配をもたらす。そのような様式において、上記の分離プロセスおよびフォーカシングプロセスが多孔性ブロック１１８の中で生じ得る。フォーカシングが安定化するとき、多孔性ブロック１１８は、生体分子濃縮のうちのそれぞれ１つを単離することを可能にするようにセグメント化することができる。セグメント化を、多孔性ブロック１１８における種々の生体分子濃縮の間を隔てる中間領域を切り取ること、切断すること、連結することおよび／または結ぶことによって行うことができる。例えば、図１１は、生体分子を例示的な多孔性ブロック１１８において単離することを概略的に示す。数字１３１は、いくつかの生体分子濃縮物を伴って吸収される取り外し可能な構造物であり、数字１３２は、それに対する切り取られた形態である。次に、セグメント化された多孔性ブロック１１８は、生体分子濃縮を維持するために電流をそれに対して通すことなく分析することができる。加えて、または、代替において、診断および／または生体分子回収を、濃縮が形成された後、より長期間にわたって行うことができる。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フォーカシング流路（例えば、デバイス１００のフォーカシング流路１０２など）におけるｐＨレベルが色分析に従って測定される。そのような実施形態において、ｐＨ指示薬、例えば、リトマス、フェノールレッド、ブロムクレゾールパープルおよび／または任意のｐＨ感受性色素などが、フォーカシング流路１０２における電解質溶液に加えられる。電解質溶液におけるｐＨ指示薬はその色をフォーカシング流路１０２におけるｐＨレベルに従って変化させるので、画像処理を、ｐＨレベルを検出するために使用することができる。場合によっては、画像センサー、例えば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）および／または相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）に基づくセンサーなどが、フォーカシング流路の画像を取り込み、フォーカシング流路の種々のセグメントの１つまたは複数の色特性を色分析の一般に知られている方法によってコンピューター計算するために使用される。そのような色特性は、種々のセグメントにおけるｐＨレベルを前記に従って計算することを可能にする。場合によっては、求められたｐＨレベルが上記ＧＵＩに転送され、使用者に示される。
【０１０６】
画像処理を上記のように使用することにより、比較的速いｐＨレベル推定を受け取ることが可能になることには留意しなければならない。Ｍｉｃｒｏ電極に基づくｐＨプローブが使用されるとき、マイクロ電極と、電解質溶液との間における接触を容易にするスリットが形成される。このスリットは、例えば、図３の１２１において示されるように、ｐＨプローブが挿入されるｐＨプローブソケットに接続される。これらのソケットは、流路からのイオンの移動を可能にし、これにより、ソケットにおけるｐＨレベルを変化させる溶液で満たされる。Ｍｉｃｒｏ電極はソケットにおけるｐＨレベルを検知し、流路のそれぞれのセグメントにおけるｐＨレベルを推定することを可能にする。しかしながら、ソケット内へのイオンの移動は時間がかかるので、ｐＨプローブの読み取りにおける遅れが誘導される。さらに、ソケットは電解質溶液の要求される体積を増大させ、したがって、プロセス期間中に流路に注入しなければならないイオンの量を増大させる。他方で、画像センサーは電解質溶液との接触を必要とせず、したがって、ソケットが全く必要ない。画像センサーは、イオン移動を待つ必要がないので、ｐＨ確認プロセスがより速くなる。加えて、ソケットが全く必要ないので、電解質溶液の体積を減らすことができる。さらに、画像センサーは電解質溶液と接触していないので、溶液中に置かれる要素において通常の場合には形成される汚染を軽減または回避することができる。そのような様式では、画像センサーによって行われる測定は信頼性がより大きい。具体的には、ｐＨ電極に基づくプローブは、溶液によって容易に汚染される傾向がある。この汚染は誤差をそれらの読み取りに加える。画像センサーはそのような汚染にさらされない。さらに、ＨＶ電流が流路１０２において流れる。そのような電流は、溶液と接触しているプローブ（例えば、ｐＨ電極など）を損傷させることがある。画像センサーを使用することにより、ＨＶ電流を流路１０１において流すことが、システムの信頼性および寿命を低下させることなく可能になる。
【０１０７】
次に、図１２が参照される。図１２は、二極性メンブラン（２９０、２９１）を向かい合う面に有する電気泳動容器１９２で、電解質溶液において電気泳動容器１９２の長さ軸に対して横方向であるｐＨ段階化２９２をもたらすために設計される、本発明のいくつかの実施形態による電気泳動容器１９２の概略図である。
【０１０８】
図１２に記載される電気泳動容器１９２は、ｐＨ勾配を、電気泳動容器１９２が含有する電解質溶液において、向かい合う二極性メンブラン（２９０、２９１）の間にもたらすことを可能にする。ｐＨ勾配の種々のセグメントが、例えば、Ｃｌｙｄｅ Ａ．Ｄｕｂｂｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６６年１月２８日、第１５１巻、第３７０９号、４６３頁〜４６４頁（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ Ｔｅｓｔ ａｎｄ Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、異なるｐＨレベルを有する。
【０１０９】
ｐＨ勾配２９２は、本明細書中では横方向ｐＨ勾配２９２として示されることがあるが、電気泳動容器１９２に置かれる混合物におけるタンパク質を、タンパク質をフォーカシングすることなく分離することを可能にする。横方向ｐＨ勾配２９２はタンパク質移動方向に対して横方向であり、かつ、混合物におけるタンパク質をそれらの移動度に従って分離することを可能にするように電気泳動容器１９２を介して伝えられる電場２９３に対して直交する。タンパク質の移動度はｐＨに依存するので、同じ種類のタンパク質は、それらの周囲のｐＨに依存する異なる速度を獲得する。得られる分離パターンが、流路に沿った斜線からなる。
【０１１０】
横方向ｐＨ勾配２９２が、二極性メンブラン（２９１、２９２）の間に流されるイオンによってもたらされる。具体的には、図８に関連して上記で記載されるように、二極性メンブランは、アニオン交換層１５２と、カチオン交換層１５１とからなり、これらは互いに平行に置かれる。アニオン交換層１５２およびカチオン交換層１５１はアニオンおよびカチオンをそれぞれ伝え、一方、逆電荷のイオンに対しては不透過性である。水の電気分解が、二極性メンブランを、アニオン交換層１５２が陽極に面し、カチオン交換層１５１が陰極に面するように置くことによって達成される。電圧が、陽極と、陰極との間に加えられたとき、層１５１と、層１５２との間の水分子が、逆方向ではあるが、Ｈ＋イオンと、ＯＨ−イオンとに分かれる。二極性メンブラン（２９１、２９２）の間にもたらされるＨ＋イオンの流れにより、ｐＨ勾配がもたらされる。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１２】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含する。
【０１１３】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１１５】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１１６】
用語「任意選択的（場合によって）」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１１７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１１８】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１１９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１２１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１２２】
実施例は、例えば、図１および図２に関して上記で記載されるように、段差形状のｐＨプロフィルを生じさせるためにただ１つだけのｐＨ発生器を使用する例示的なフォーカシングデバイスのシミュレーションに基づく。シミュレーションされたｐＨ発生器は、上記で記載されるように、無気泡性ＢＰＭに基づく。シミュレーションされた例示的なフォーカシングデバイスはただ１つだけのｐＨ発生器を含むが、上記で記載されるように、任意の数のｐＨ発生器が使用され得ることには留意しなければならない。シミュレーションが、一組の偏微分方程式（ＰＤＥ）を解くことによって行われる。この一組には、式２と、それぞれの式が電解質溶液における化学種について定義される式１の形式の一組の式とが含まれる。適切な境界条件が、例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路の両側における一定の濃度、および、例えば、図２に示されるように、また、上記で記載されるように、ｐＨ発生器からのＨ＋イオンの一定の電流である。初期条件が、例示的フォーカシングデバイスにおける任意の場所での一定の濃度として加えられる。完全な一組の式は下記の通りである：
上記式において、Ｋｗおよびｋｗは、式５に示される反応についての平衡定数および会合速度定数を示し、Ｋｐおよびｋｐは、式３に示される反応についての平衡定数および会合速度定数を示す。
【０１２３】
そのようなシミュレーションは、大きい電場と、ｘ＝０の位置にあるｐＨ発生器電流の存在下でもたらされるｐＨプロフィルのグラフとをそれぞれ示す図１１および図１２に示されるような結果をもたらす。図１３は、Ｅ＝１０−６ｍｏｌ／ｍ２ｓの場合における様々な時点でのｐＨプロフィルを示し、図１４は、定常状態のｐＨプロフィル、すなわち、様々な電流の結果を示す。
【０１２４】
図１３は、一定の電流（１０−６ｍｏｌ／ｍ２ｓ）を通し、かつ、ｘ＝０の位置にあるｐＨ発生器の存在下における、時間の関数として生じるｐＨプロフィルを示す。図１１に示されるように、酸性前線が、急なｐＨ段差を有するプロフィルを数秒以内にもたらすように進行する。５ｍｍの長さの酸性状況が右側におよそ１００秒でもたらされ、一方で、左側では、初期のｐＨレベルが維持される。図１４は、様々な大きさの電流において定常状態のｐＨプロフィルを有する勾配を示す。認められるように、電流の大きさにより、ｐＨ段差の高さが決定される。
【０１２５】
次に、図１１および図１２に関連して記載される実施例で使用される例示的なフォーカシングデバイスによるｐＨ勾配の生成を例証する実施例が参照される。本明細書中で使用される場合、ｐＨ勾配生成速度は、ｐＨ勾配が例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路において安定化するために要する期間を意味する。図１３に示されるように、ただ１段だけのｐＨプロフィルが、シミュレーションされた例示的フォーカシングデバイスのｐＨ発生器によってもたらされる。例示的フォーカシングデバイスのｐＨ勾配生成速度を近似するために、例示的フォーカシングデバイスのｐＨ勾配が期間中の多数の瞬間でモニターされている。図１５は、例示的フォーカシングデバイスのフォーカシング流路の一連の９個の画像、および、電気分解期間を示す一組のドットである。画像が８分の期間ｔにおいて１分の画像間隔により連続して取り込まれた。ｐＨ指示薬が例示的フォーカシングデバイスにおける電解質溶液に加えられた。９０１〜９０３の数字は、例示的フォーカシングデバイスに沿って挿入される３つのｐＨプローブ（黒色の棒）を示す。数字９０４はｐＨ発生器を示す。電流がｐＨ発生器によって加えられることが黒塗りドットによって示され、電流の非存在が白塗りドットによって示される。電解質溶液は、ｐＨ指示薬を含む場合、ｐＨレベルが７を超えるならば、紫色に変わり、または、ｐＨレベルが４．５未満であるならば、赤色に変わる。ｔ＝０．５において、例示的フォーカシングデバイスのｐＨ発生器に通電し、これにより、ｐＨ発生器は８０μＡの電流を生じさせた。結果として、図１１および図１２に示されるシミュレーションが予測するように、Ｈ＋イオンがフォーカシング流路に注入され、これにより、右側に進行した酸性前線をもたらした。ｔ＝４．５分において、電流が切られると、酸性状況が消えた。ｔ＝６．５分において、ｐＨ発生器が再び通電され、酸性状況がもう一度、生じた。画像に示されるように、急なｐＨ増加が、ｐＨプローブ９０２と、ｐＨプローブ９０３との間のセグメントにおける色の変化によって示され、一方、９０２と、９０１との間のセグメントの色は、８分の間中、一定のままであり、８のｐＨレベルを示している。
【０１２６】
急なｐＨ増加がまた、２段差のｐＨプロフィルの例示的な生成を示すグラフ１００５、および、上記で記載される例示的なフォーカシングデバイスの画像１００６である図１６によって示され得る。画像は、流路１００１、ｐＨ発生器９０４およびｐＨプローブ９０１〜ｐＨプローブ９０３、ならびに、電場方向１００７を示す。グラフは、ｐＨプローブ９０１〜ｐＨプローブ９０３の読み取りを時間の関数として示す。示されるように、ｐＨプローブ９０３は、ｐＨ発生器の右手側での酸性状況の生成を示す途切れることなく低下するｐＨレベルを読み取っている。ｐＨプローブ９０１およびｐＨプローブ９０２は、加えられた電流によって影響されない一定のｐＨレベルを示す実質的に一定のｐＨレベルを読み取っている。初期の発生器電流が１００μＡであり、後で１１０μＡおよび１２０μＡに上昇した。
【０１２７】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１２８】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、長さ軸を有し、かつ、電解質溶液を含有するために構成されるフォーカシング容器と、前記長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含み、それぞれの前記電気分解ユニットが、イオン流を前記フォーカシング容器の中に注入して、その結果、前記長さ軸に沿った前記電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を作るようにするために構成され、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、前記ｐＨ勾配が、前記複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される、デバイス。
【請求項２】
前記ｐＨ傾斜部は少なくとも０．１のｐＨである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
それぞれの前記段差が少なくとも３ｍｍの長さである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記少なくとも１つの電気分解ユニットは複数の電気分解ユニットを含み、それぞれの前記電気分解ユニットを別個に制御するためのコントローラーをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記電解質溶液は複数の生体分子を含み、前記複数の生体分子が前記ｐＨ勾配に沿った前記少なくとも１つのｐＨ傾斜部にのみ濃縮する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記勾配は前記複数の段差のうちの１０未満を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記勾配は前記複数の段差のうちの５未満を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記勾配は前記複数の段差のうちの２つを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記少なくとも１つの電気分解ユニットの１つが、複数のヒドロキシルイオンを注入するために構成され、かつ、前記少なくとも１つの電気分解ユニットの別の１つが、複数の水素イオンを注入するために構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記フォーカシング容器は複数の狭くなったセグメントを有し、それぞれの前記電気分解ユニットが、前記イオン流をそれぞれの前記狭いセグメントに注入するために構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、電解質溶液を含有するために構成され、かつ、第１および第２の末端部ならびに長さ軸を有するフォーカシング容器であって、少なくとも１つのスリットを第１および第２の末端部までの途中に有するフォーカシング容器と、前記第１の末端部および前記第２の末端部にそれぞれ取り付けられ、かつ、第１の電流を、前記電解質溶液を介してそれらの間に通すために構成される陽極および陰極と、前記少なくとも１つのスリットに近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランと、それぞれの少なくとも１つの二極性メンブランの前方にそれぞれが取り付けられ、かつ、第２の電流を前記少なくとも１つのそれぞれの二極性メンブランに付与し、その結果、前記少なくとも１つのスリットを介するイオン流を促進するようにするために構成される少なくとも１つの制御可能な電極とを含む、デバイス。
【請求項１２】
前記第１および第２の電流を、前記陽極および陰極に対して、および前記少なくとも１つの制御可能な電極に対してそれぞれ供給する電流源をさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
発生器電流源を経由して前記制御可能な電極に物理的に接続されるホイートストンブリッジをさらに含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記第１および第２の電流は高電圧の電流である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの二極性メンブランは少なくとも１つの無気泡性の二極性メンブランである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記第１および第２の末端部にそれぞれ接続される第１および第２の受器をさらに含み、前記陽極および前記陰極が前記第１および第２の受器にそれぞれ少なくとも部分的に取り付けられる、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記フォーカシング容器を支持するための適所の前方において複数のソケットを有する支持構造物をさらに含み、それぞれの前記ソケットが、前記少なくとも１つの二極性メンブランの１つと、前記少なくとも１つの制御可能な電極の１つとを含有する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１８】
ｐＨレベルを前記少なくとも１つの二極性メンブランのそれぞれの近くで測定するために構成される少なくとも１つのｐＨプローブをさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのスリットの幅が３ｍｍ未満である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの制御可能な電極と、前記二極性メンブランとの間の距離が３ｍｍ未満である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２１】
等電点フォーカシングのための方法であって、長さ軸を有するフォーカシング容器を提供すること、複数の生体分子を有する電解質溶液を前記容器に加えること、電場を前記長さ軸に沿って前記電解質溶液において加えること、および、イオン流を前記長さ軸に沿った少なくとも１つの地点に注入して、前記電解質溶液における複数の段差によって定義されるｐＨ勾配を確立し、その結果、前記複数の生体分子が前記少なくとも１つの地点の近くで少なくとも１つの濃縮において蓄積することを含み、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、前記ｐＨ勾配が、前記複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される、方法。
【請求項２２】
前記ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤を加えることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐＨ勾配が前記複数の段差の中の複数の傾斜部によって定義され、前記方法が、前記ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤の混合物を加えることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の生体分子が前記少なくとも１つの濃縮にだけ蓄積する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記注入することは、電流を、それぞれの前記少なくとも１つの地点で前記電解質溶液に近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランにおいて付与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の生体分子を前記少なくとも１つの濃縮に従って診断することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの濃縮の少なくとも１つを別々に集めることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
等電点フォーカシングのための方法であって、電解質溶液を有する容器に少なくとも１つの生体分子を提供すること、少なくとも１つのｐＨ指示薬を前記電解質溶液に加えること、ｐＨ勾配を前記電解質溶液において作ること、前記電解質溶液の少なくとも１つの画像を取り込むこと、前記電解質溶液の少なくとも１つのセグメントの少なくとも１つの色特性を前記少なくとも１つの画像に従ってコンピューター計算すること、および、前記セグメントにおける少なくとも１つのｐＨレベルを前記少なくとも１つの色特性に従って計算することを含む、方法。
【請求項２９】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをその長さ軸の途中で、取り外し可能に保持するために構成されるフォーカシング容器と、第１の電流を、前記多孔性ブロックにおいて前記電解質溶液を介して通すために構成される複数の電極と、イオン流を前記フォーカシング容器の中に注入して、その結果、ｐＨ勾配を前記多孔性ブロックにおける前記電解質溶液において変化させるようにするためにそれぞれが構成される、前記長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含み、前記生体分子の混合物が前記ｐＨ勾配に従って前記多孔性ブロックにおいて配置される、デバイス。
【請求項３０】
前記フォーカシング容器は、前記多孔性ブロックを前記フォーカシング容器に設置すること、および、前記多孔性ブロックを前記フォーカシング容器から取り出すことの少なくとも一方のための開口部を有する、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
等電点フォーカシングのための方法であって、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、ｐＨ勾配を、前記多孔性ブロックにおける前記生体分子の複数の濃縮を促進するように前記電解質溶液において作ること、および、前記多孔性ブロックを、前記複数の濃縮のうちの１つをそれぞれが別々に含有する複数のセグメントにセグメント化することを含む、方法。
【請求項３２】
前記セグメント化することが、前記多孔性ブロックを前記複数の濃縮のうちのそれぞれ２つの間で切り取って、前記複数のセグメントを作製することによって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
等電点フォーカシングのための着脱可能な溶液カートリッジであって、等電点フォーカシングシステムのフォーカシング流路にはまるようなサイズおよび形状を有し、かつ、複数の生体分子を有する電解質溶液により湿潤化されて、その結果、前記複数の生体分子の移動を前記電解質溶液において形成されるｐＨ勾配に従って可能にするようにするために構成される多孔性ブロックを含む、溶液カートリッジ。
【請求項３４】
前記多孔性ブロックは、前記複数の生体分子の濃縮のうちのただ１つの濃縮をそれぞれが含む複数のセグメントを作製するために切り取られることができる、請求項３３に記載の溶液カートリッジ。
【請求項３５】
タンパク質の混合物を分離するためのデバイスであって、電解質溶液および前記混合物を含有するために構成される電気泳動容器であって、長さ軸と、前記長さ軸と平行する第１および第２の向き合う側面とを有する電気泳動容器と、前記第１および第２の側面にそれぞれ取り付けられる第１および第２の二極性メンブランと、電場を前記電解質溶液において加えて、その結果、タンパク質を前記長さ軸に沿って動かすようにするための少なくとも１つ電極とを含み、前記第１および第２の二極性メンブランのうちの１つが、イオン流を前記電気泳動容器の中に注入して、その結果、前記電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を前記長さ軸と直交して作るようにするために構成され、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有する、デバイス。
【請求項１】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、長さ軸を有し、かつ、電解質溶液を含有するために構成されるフォーカシング容器と、前記長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含み、それぞれの前記電気分解ユニットが、イオン流を前記フォーカシング容器の中に注入して、その結果、前記長さ軸に沿った前記電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を作るようにするために構成され、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、前記ｐＨ勾配が、前記複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される、デバイス。
【請求項２】
前記ｐＨ傾斜部は少なくとも０．１のｐＨである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
それぞれの前記段差が少なくとも３ｍｍの長さである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記少なくとも１つの電気分解ユニットは複数の電気分解ユニットを含み、それぞれの前記電気分解ユニットを別個に制御するためのコントローラーをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記電解質溶液は複数の生体分子を含み、前記複数の生体分子が前記ｐＨ勾配に沿った前記少なくとも１つのｐＨ傾斜部にのみ濃縮する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記勾配は前記複数の段差のうちの１０未満を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記勾配は前記複数の段差のうちの５未満を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記勾配は前記複数の段差のうちの２つを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記少なくとも１つの電気分解ユニットの１つが、複数のヒドロキシルイオンを注入するために構成され、かつ、前記少なくとも１つの電気分解ユニットの別の１つが、複数の水素イオンを注入するために構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記フォーカシング容器は複数の狭くなったセグメントを有し、それぞれの前記電気分解ユニットが、前記イオン流をそれぞれの前記狭いセグメントに注入するために構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、電解質溶液を含有するために構成され、かつ、第１および第２の末端部ならびに長さ軸を有するフォーカシング容器であって、少なくとも１つのスリットを第１および第２の末端部までの途中に有するフォーカシング容器と、前記第１の末端部および前記第２の末端部にそれぞれ取り付けられ、かつ、第１の電流を、前記電解質溶液を介してそれらの間に通すために構成される陽極および陰極と、前記少なくとも１つのスリットに近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランと、それぞれの少なくとも１つの二極性メンブランの前方にそれぞれが取り付けられ、かつ、第２の電流を前記少なくとも１つのそれぞれの二極性メンブランに付与し、その結果、前記少なくとも１つのスリットを介するイオン流を促進するようにするために構成される少なくとも１つの制御可能な電極とを含む、デバイス。
【請求項１２】
前記第１および第２の電流を、前記陽極および陰極に対して、および前記少なくとも１つの制御可能な電極に対してそれぞれ供給する電流源をさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
発生器電流源を経由して前記制御可能な電極に物理的に接続されるホイートストンブリッジをさらに含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記第１および第２の電流は高電圧の電流である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの二極性メンブランは少なくとも１つの無気泡性の二極性メンブランである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記第１および第２の末端部にそれぞれ接続される第１および第２の受器をさらに含み、前記陽極および前記陰極が前記第１および第２の受器にそれぞれ少なくとも部分的に取り付けられる、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記フォーカシング容器を支持するための適所の前方において複数のソケットを有する支持構造物をさらに含み、それぞれの前記ソケットが、前記少なくとも１つの二極性メンブランの１つと、前記少なくとも１つの制御可能な電極の１つとを含有する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１８】
ｐＨレベルを前記少なくとも１つの二極性メンブランのそれぞれの近くで測定するために構成される少なくとも１つのｐＨプローブをさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのスリットの幅が３ｍｍ未満である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの制御可能な電極と、前記二極性メンブランとの間の距離が３ｍｍ未満である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項２１】
等電点フォーカシングのための方法であって、長さ軸を有するフォーカシング容器を提供すること、複数の生体分子を有する電解質溶液を前記容器に加えること、電場を前記長さ軸に沿って前記電解質溶液において加えること、および、イオン流を前記長さ軸に沿った少なくとも１つの地点に注入して、前記電解質溶液における複数の段差によって定義されるｐＨ勾配を確立し、その結果、前記複数の生体分子が前記少なくとも１つの地点の近くで少なくとも１つの濃縮において蓄積することを含み、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有し、前記ｐＨ勾配が、前記複数の段差のうちの２つ毎の連続した段差の間における少なくとも１つのｐＨ傾斜部によって定義される、方法。
【請求項２２】
前記ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤を加えることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐＨ勾配が前記複数の段差の中の複数の傾斜部によって定義され、前記方法が、前記ｐＨ勾配を安定化するために緩衝剤の混合物を加えることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の生体分子が前記少なくとも１つの濃縮にだけ蓄積する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記注入することは、電流を、それぞれの前記少なくとも１つの地点で前記電解質溶液に近接してそれぞれが取り付けられる少なくとも１つの二極性メンブランにおいて付与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の生体分子を前記少なくとも１つの濃縮に従って診断することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの濃縮の少なくとも１つを別々に集めることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
等電点フォーカシングのための方法であって、電解質溶液を有する容器に少なくとも１つの生体分子を提供すること、少なくとも１つのｐＨ指示薬を前記電解質溶液に加えること、ｐＨ勾配を前記電解質溶液において作ること、前記電解質溶液の少なくとも１つの画像を取り込むこと、前記電解質溶液の少なくとも１つのセグメントの少なくとも１つの色特性を前記少なくとも１つの画像に従ってコンピューター計算すること、および、前記セグメントにおける少なくとも１つのｐＨレベルを前記少なくとも１つの色特性に従って計算することを含む、方法。
【請求項２９】
等電点フォーカシングのためのデバイスであって、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをその長さ軸の途中で、取り外し可能に保持するために構成されるフォーカシング容器と、第１の電流を、前記多孔性ブロックにおいて前記電解質溶液を介して通すために構成される複数の電極と、イオン流を前記フォーカシング容器の中に注入して、その結果、ｐＨ勾配を前記多孔性ブロックにおける前記電解質溶液において変化させるようにするためにそれぞれが構成される、前記長さ軸に近接して取り付けられる少なくとも１つの電気分解ユニットとを含み、前記生体分子の混合物が前記ｐＨ勾配に従って前記多孔性ブロックにおいて配置される、デバイス。
【請求項３０】
前記フォーカシング容器は、前記多孔性ブロックを前記フォーカシング容器に設置すること、および、前記多孔性ブロックを前記フォーカシング容器から取り出すことの少なくとも一方のための開口部を有する、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
等電点フォーカシングのための方法であって、生体分子の混合物を伴う電解質溶液により湿らされる多孔性ブロックをフォーカシング容器に設置すること、ｐＨ勾配を、前記多孔性ブロックにおける前記生体分子の複数の濃縮を促進するように前記電解質溶液において作ること、および、前記多孔性ブロックを、前記複数の濃縮のうちの１つをそれぞれが別々に含有する複数のセグメントにセグメント化することを含む、方法。
【請求項３２】
前記セグメント化することが、前記多孔性ブロックを前記複数の濃縮のうちのそれぞれ２つの間で切り取って、前記複数のセグメントを作製することによって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
等電点フォーカシングのための着脱可能な溶液カートリッジであって、等電点フォーカシングシステムのフォーカシング流路にはまるようなサイズおよび形状を有し、かつ、複数の生体分子を有する電解質溶液により湿潤化されて、その結果、前記複数の生体分子の移動を前記電解質溶液において形成されるｐＨ勾配に従って可能にするようにするために構成される多孔性ブロックを含む、溶液カートリッジ。
【請求項３４】
前記多孔性ブロックは、前記複数の生体分子の濃縮のうちのただ１つの濃縮をそれぞれが含む複数のセグメントを作製するために切り取られることができる、請求項３３に記載の溶液カートリッジ。
【請求項３５】
タンパク質の混合物を分離するためのデバイスであって、電解質溶液および前記混合物を含有するために構成される電気泳動容器であって、長さ軸と、前記長さ軸と平行する第１および第２の向き合う側面とを有する電気泳動容器と、前記第１および第２の側面にそれぞれ取り付けられる第１および第２の二極性メンブランと、電場を前記電解質溶液において加えて、その結果、タンパク質を前記長さ軸に沿って動かすようにするための少なくとも１つ電極とを含み、前記第１および第２の二極性メンブランのうちの１つが、イオン流を前記電気泳動容器の中に注入して、その結果、前記電解質溶液における複数の段差を有するｐＨ勾配を前記長さ軸と直交して作るようにするために構成され、それぞれの前記段差が、実質的に均一なｐＨレベルを有する、デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１３−５０２５７４（Ｐ２０１３−５０２５７４Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５２５３（Ｐ２０１２−５２５２５３）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２１１９６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２１１９６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
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