ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法
【課題】醸造酒の非生物学的混濁安定性を損なう主要因子であるヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法を提供する。
【解決手段】醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法を提供する。また、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法を提供する。詳しくは、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法。
【解決手段】醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法を提供する。また、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法を提供する。詳しくは、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法に関する。特に、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法に関する。
【０００２】
従来の技術
酒類には、糖類やでんぷん質を原料にし、酵母などの働きで、アルコール発酵により作られる、ワイン、ビール、清酒、ワイン等の醸造酒がある。
【０００３】
例えば、ビールは麦芽を主原料として糖化によって麦汁を得、この麦汁と酵母を用いて主発酵を行い、次いで若ビールを後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造される。
【０００４】
このようにして製造されているビール等の醸造酒（特に色のうすいもの）は、製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないような、いわゆる「混濁安定性」が醸造酒の品質上きわめて重要な項目である。
【０００５】
例えばビール混濁の原因は、微生物の混入に起因する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって生じるヘイズ蛋白と総称される蛋白質成分（非特許文献１）の生成による非生物学的混濁の２つに大別できる。一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁である。
【非特許文献１】K. Asano et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982；J.A.Delcour et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 1988
【０００６】
発明が解決しようとする課題
非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、このような非生物学的混濁を低減することが、醸造酒の品質管理上、強く求められていた。そこで、本発明は、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法を提供すること、また、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法を提供することを目的とする。
【０００７】
課題を解決するための手段
非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムについて、図１に示すように、酵母由来の細胞壁成分（マンノプロテインやβグルカン）と麦芽、ホップ由来の蛋白質成分やポリフェノールなどが結合して次第に大きな粒子が形成されていくと考えられる（図２）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、酵母からのマンノプロテイン、特に分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン（以下、「ＭＰ１２０」という。）の剥落の程度とビールのヘイズの高さに良い相関性があることを見出し、その知見に基づき、醸造酒中のマンノプロテイン量を測定するにより混濁安定性を評価することができることを見出した（特願２００５−９４９０４）。
【特許文献１】特願２００５−９４９０４
【０００９】
そしてさらに、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、酵母からのマンノプロテイン、特にＭＰ１２０および分子量約５７ｋＤａのマンノプロテイン（以下、「ＭＰ５７」という。）の剥落の程度を抑制することができること、すなわちヘイズの生成が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施する、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。また、本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
【００１１】
本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、用いる酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、用いる酵母がＭＰ１２０の生成量の低い酵母である、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
【００１２】
本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、酵母がビール酵母である方法である。
さらに、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施し、ヘイズの生成を抑制した方法によって製造される醸造酒である。
【００１３】
さらに、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。
本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。また、本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。
【００１４】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、用いる酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、ヘイズ生成の抑制方法である。
【００１５】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、用いる酵母がＭＰ１２０の生成量の低い酵母である、ヘイズの抑制方法である。
【００１６】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、ビール酵母を用いる方法である。
発明の実施の形態
ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法
本発明のヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することに特徴がある。
【００１７】
醸造酒の製造においては、発酵に供する酵母を得る工程、すなわち酵母増殖工程によって酵母懸濁液を調製したのち、その懸濁液を穀類や糖質原料から調製した液に添加して発酵させる方法が一般的である。本発明においては、上記酵母増殖工程を好気条件下で実施する。
【００１８】
本発明における「好気条件」とは、通気・攪拌等により、培養液中の溶存酸素濃度が３ｐｐｍ以上の条件をいい、好ましくは５〜１５ｐｐｍ、特に好ましくは８〜１２ｐｐｍである。溶存酸素濃度が上記範囲内となればよく、通気・攪拌条件に制限はないが、通気量は０．００５ｖ／ｖ／ｍ（供給空気体積／培養液体積／分）以上であるのが好ましい。
【００１９】
本発明における「醸造酒」とは、酵母による発酵工程を経て製造される飲料を全て包含する。例えば、ビール、雑酒、発泡酒、リキュール類、低アルコール発酵飲料（例えばアルコール分１％未満の麦芽発酵飲料）が含まれる。
【００２０】
本発明で用いる酵母は、製造すべき発酵飲料の種類、目的とする香味や発酵条件などを考慮して自由に選択できる。例えば、市販のビール酵母を用いることができる。但し、ヘイズの生成をより低レベルに抑制する場合は、マンノプロテインの生成量の低い酵母、特にＭＰ１２０および／またはＭＰ５７の生成量の低い酵母を用いるのが好ましい。
【００２１】
マンノプロテインの生成量の低い酵母とは、発酵液または醸造酒中にマンノプロテイン剥離量が相対的に低い酵母のことである。
マンノプロテインとは、蛋白（ポリペプチド鎖）にマンノースが修飾糖として結合しているもので、酵母の細胞壁表層に異なる種類のものが存在している。上述のように、例えばビールのヘイズの原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、酵母由来の細胞壁成分（マンノプロテインやβグルカン）と麦芽、ホップ由来の蛋白質やポリフェノールなどが結合して次第に大きな粒子が形成されていくと考えられる。
【００２２】
マンノプロテインの検出および定量は、マンノプロテインを検出および定量することができる方法であれば、いずれの方法であっても用いることができる。但し、特にＭＰ１２０およびＭＰ５７を検出および定量する場合は、マンノプロテインの分子量の違いにより分離する手段と共に用いる必要がある。一例を挙げれば、サンプルをSDS-電気泳動により分子量的に分離し、そのサンプルに対して、コンカナバリンAというレクチンがマンノプロテインのマンノース部分を認識し、これに結合する性質を利用して、アフィノブロッティング (Faye L and Chrispeels MJ, Anal Biochem, 1985)という手法を用いると、フィルター上でマンノプロテインのみを検出することができる（図３および図４参照）。
【００２３】
醸造酒のヘイズ生成の抑制方法
本発明の醸造酒のヘイズ生成の抑制方法は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することに特徴がある。
【００２４】
上述のように、醸造酒の製造においては、発酵に供する酵母を得る工程、すなわち酵母増殖工程によって酵母懸濁液を調製したのち、その懸濁液を穀類や糖質原料から調製した液に添加して発酵させる方法が一般的である。本発明においては、上記酵母増殖工程を好気条件下で実施する。
【００２５】
本発明における「好気条件」とは、通気・攪拌等により、培養液中の溶存酸素濃度が３ｐｐｍ以上の条件をいい、好ましくは５〜１５ｐｐｍ、特に好ましくは８〜１２ｐｐｍである。溶存酸素濃度が上記範囲内となればよく、通気・攪拌条件に制限はないが、通気量は０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上であるのが好ましい。
【００２６】
本発明で用いる酵母は、製造すべき発酵飲料の種類、目的とする香味や発酵条件などを考慮して自由に選択できる。例えば、市販のビール酵母を用いることができる。但し、ヘイズの生成をより低レベルに抑制する場合は、マンノプロテインの生成量の低い酵母、特にＭＰ１２０および／またはＭＰ５７の生成量の低い酵母を用いるのが好ましい。
【００２７】
マンノプロテインの生成量の低い酵母とは、発酵液または醸造酒中にマンノプロテイン剥離量が相対的に低い酵母のことである。
実施例
以下に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．ヘイズ画分の単離・解析
製品ビール20mLを透析チューブ（カットオフ分子量300,000）に入れ、100倍体積の純水に対して4℃12時間透析した。純水を替え、これを3回繰り返した。このサンプルを300,000 x G、3時間の条件で遠心したところ、遠心管の底にゼリー状の沈殿が認められたので（図５）、これをヘイズ画分とした。
【００２９】
実施例２．アフィノブロッティングを利用したマンノプロテインの検出
ＢＨ４４９株（Weihenstephan Nr.164）およびＢＨ２２５株（AJL 3062）醗酵終了もろみ（図６）を1.2mLエッペンチューブにとり、15,000rpm、10分間遠心し、上清1mLを別のエッペンチューブに移した。そこへ250μLの50%トリクロロ酢酸を加え、室温で10分間放置後、15,000rpm、10分間遠心し、上清を捨てた。チューブに1ｍLのアセトンを加えて沈殿をリンスした後、沈殿を風乾した。
【００３０】
SDS-ゲル電気泳動はLaemmli（Nature 227巻、680-685ページ）の方法に従って行った。沈殿サンプルにSDS電気泳動用サンプルバッファー100μLを加え、完全に溶かした。これを100℃、10分間熱処理し、タンパクを変成させたのち、サンプル8μLをポリアクリルアミドゲル（7.5%または9%）を用いたSDS-電気泳動で展開した。電気泳動後のゲルをトランスファーバッファー（48mM トリス、39mM グリシン、20% メタノール、1.3mM SDS、pH9.0）中で10分間浸潤させた後、ニトロセルロース製のメンブレンに転写した（16V、40分）。転写後のメンブレンを2% スキムミルクを含むTTBSバッファー（20mM トリス、137mM NaCl、0.1% Tween20、pH7.6）中で室温にて1時間ブロッキングした後、ハイブリバッグ中でセイヨウワサビ由来過酸化酵素（HRP）-コンカナバリンA複合体と室温で15分間インキュベーションした。HRP-コンカナバリンAは市販品（シグマ社L-6397）を水で1mg/mLの濃度に溶解したものをTTBSバッファーで 1/2000倍希釈して用いた。HRP-コンカナバリンAとのインキュベーション後、100mLのTTBSバッファーで5分づつ3回液を交換してメンブレンを洗い、メンブレンから余剰のHRP-コンカナバリンAを除いた。メンブレン上のマンノプロテインはAmersham Biosciences社のECL（登録商標） Western Blotting Analysis Systemを用い、ケミルミネッセンスによって検出した。
【００３１】
図６の左半分の蛋白染色は、アフィノブロッティングの結果との比較のために行った。蛋白染色はCoomassie Brilliant Blue R-250を用いて行った。
図６の右図に示すように、酵母株に依存せず、ヘイズ画分にはＭＰ１２０が多く含まれている一方、ビール（醗酵終了もろみ）中のＭＰ１２０の割合は相対的にあまり高くなかった。従って、ＭＰ１２０等のマンノプロテインが選択的に不溶化し、不溶物の核となってヘイズを形成していることが示唆された。
【００３２】
実施例３．試験醗酵の投入酵母の好気・嫌気状態と醗酵終了後のヘイズ生成の関係
2Lスケールの試験醗酵をする際、投入酵母（ＢＨ４４９株（Weihenstephan Nr.164））を嫌気的（2Lのプラスチックボトル中で静置培養）、または好気的（羽根付き2Lマイヤーを用い120rpmの速度で攪拌、空気通気量：２L／min、溶存酸素濃度：１０ppm）に培養してプロパゲーション（酵母増殖工程）を行った。プロパゲーション終了時のもろみ中に遊離されているマンノプロテインを、上述したアフィノブロッティングによって検出した（図７左）。2種の投入酵母を用いた２Ｌスケール醗酵（麦汁：オールモルト、ピッチィング酵母量：１５×１０６cells/ml、溶存酸素濃度：１０ppm、醗酵温度：１５℃）の終了もろみについてもアフィノブロッティングで解析した（図７右）。好気・嫌気条件で発現、遊離量の異なるMP１２０やマンノプロテイン分子量５７ｋDａ（MP５７）について醗酵終了もろみ中の量を上述したように決定し、その比を求めた（図８）。
【００３３】
また、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水（0℃）で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター（シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30）を用いて測定し、この値をT-haze（全混濁量）とした。単位はHelmを用いて表現した（1 Helm＝０．1 FTU(Formazin Turbidity Unit)）。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
好気条件下でプロパゲーションを行うことによりヘイズの生成が抑制され、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造が可能であることが判明した。
発明の効果
本発明によれば、醸造酒品質管理のひとつの項目として重要である混濁安定性に優れた、すなわちヘイズ生成を抑制された醸造酒の製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、酵母の細胞壁とマンノプロテインの模式図である。
【図２】図２は、ヘイズのモデルを示す。
【図３】図３は、アフィノブロッティングによるマンノプロテインの検出方法を示す。
【図４】図４は、アフィノブロッティングによるマンノプロテインの検出方法を示す。
【図５】図５は、超遠心によりより沈殿したヘイズを示す。
【図６】図６は、ヘイズ画分の電気泳動・アフィノブロッティングによる解析結果を示す。
【図７】図７は、通気条件の異なるプロパゲーションが、プロパゲーション終了時および最終ビールもろみ中のマンノプロテインプロファイルに与える影響を示す。
【図８】図８は、プロパゲーション時の通気条件と最終ビールもろみ中のマンノプロテインプロファイルを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法に関する。特に、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法に関する。
【０００２】
従来の技術
酒類には、糖類やでんぷん質を原料にし、酵母などの働きで、アルコール発酵により作られる、ワイン、ビール、清酒、ワイン等の醸造酒がある。
【０００３】
例えば、ビールは麦芽を主原料として糖化によって麦汁を得、この麦汁と酵母を用いて主発酵を行い、次いで若ビールを後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造される。
【０００４】
このようにして製造されているビール等の醸造酒（特に色のうすいもの）は、製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないような、いわゆる「混濁安定性」が醸造酒の品質上きわめて重要な項目である。
【０００５】
例えばビール混濁の原因は、微生物の混入に起因する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって生じるヘイズ蛋白と総称される蛋白質成分（非特許文献１）の生成による非生物学的混濁の２つに大別できる。一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁である。
【非特許文献１】K. Asano et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982；J.A.Delcour et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 1988
【０００６】
発明が解決しようとする課題
非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、このような非生物学的混濁を低減することが、醸造酒の品質管理上、強く求められていた。そこで、本発明は、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法を提供すること、また、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法を提供することを目的とする。
【０００７】
課題を解決するための手段
非生物学的混濁の原因物質や形成メカニズムについて、図１に示すように、酵母由来の細胞壁成分（マンノプロテインやβグルカン）と麦芽、ホップ由来の蛋白質成分やポリフェノールなどが結合して次第に大きな粒子が形成されていくと考えられる（図２）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、酵母からのマンノプロテイン、特に分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン（以下、「ＭＰ１２０」という。）の剥落の程度とビールのヘイズの高さに良い相関性があることを見出し、その知見に基づき、醸造酒中のマンノプロテイン量を測定するにより混濁安定性を評価することができることを見出した（特願２００５−９４９０４）。
【特許文献１】特願２００５−９４９０４
【０００９】
そしてさらに、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施することにより、酵母からのマンノプロテイン、特にＭＰ１２０および分子量約５７ｋＤａのマンノプロテイン（以下、「ＭＰ５７」という。）の剥落の程度を抑制することができること、すなわちヘイズの生成が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施する、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。また、本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
【００１１】
本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、用いる酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、用いる酵母がＭＰ１２０の生成量の低い酵母である、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法である。
【００１２】
本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施するヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法であって、酵母がビール酵母である方法である。
さらに、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施し、ヘイズの生成を抑制した方法によって製造される醸造酒である。
【００１３】
さらに、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。
本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。また、本発明は、酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法である。
【００１４】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、用いる酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、ヘイズ生成の抑制方法である。
【００１５】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、用いる酵母がＭＰ１２０の生成量の低い酵母である、ヘイズの抑制方法である。
【００１６】
また、本発明は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法であって、ビール酵母を用いる方法である。
発明の実施の形態
ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法
本発明のヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することに特徴がある。
【００１７】
醸造酒の製造においては、発酵に供する酵母を得る工程、すなわち酵母増殖工程によって酵母懸濁液を調製したのち、その懸濁液を穀類や糖質原料から調製した液に添加して発酵させる方法が一般的である。本発明においては、上記酵母増殖工程を好気条件下で実施する。
【００１８】
本発明における「好気条件」とは、通気・攪拌等により、培養液中の溶存酸素濃度が３ｐｐｍ以上の条件をいい、好ましくは５〜１５ｐｐｍ、特に好ましくは８〜１２ｐｐｍである。溶存酸素濃度が上記範囲内となればよく、通気・攪拌条件に制限はないが、通気量は０．００５ｖ／ｖ／ｍ（供給空気体積／培養液体積／分）以上であるのが好ましい。
【００１９】
本発明における「醸造酒」とは、酵母による発酵工程を経て製造される飲料を全て包含する。例えば、ビール、雑酒、発泡酒、リキュール類、低アルコール発酵飲料（例えばアルコール分１％未満の麦芽発酵飲料）が含まれる。
【００２０】
本発明で用いる酵母は、製造すべき発酵飲料の種類、目的とする香味や発酵条件などを考慮して自由に選択できる。例えば、市販のビール酵母を用いることができる。但し、ヘイズの生成をより低レベルに抑制する場合は、マンノプロテインの生成量の低い酵母、特にＭＰ１２０および／またはＭＰ５７の生成量の低い酵母を用いるのが好ましい。
【００２１】
マンノプロテインの生成量の低い酵母とは、発酵液または醸造酒中にマンノプロテイン剥離量が相対的に低い酵母のことである。
マンノプロテインとは、蛋白（ポリペプチド鎖）にマンノースが修飾糖として結合しているもので、酵母の細胞壁表層に異なる種類のものが存在している。上述のように、例えばビールのヘイズの原因物質や形成メカニズムは詳細には明らかにされていないが、酵母由来の細胞壁成分（マンノプロテインやβグルカン）と麦芽、ホップ由来の蛋白質やポリフェノールなどが結合して次第に大きな粒子が形成されていくと考えられる。
【００２２】
マンノプロテインの検出および定量は、マンノプロテインを検出および定量することができる方法であれば、いずれの方法であっても用いることができる。但し、特にＭＰ１２０およびＭＰ５７を検出および定量する場合は、マンノプロテインの分子量の違いにより分離する手段と共に用いる必要がある。一例を挙げれば、サンプルをSDS-電気泳動により分子量的に分離し、そのサンプルに対して、コンカナバリンAというレクチンがマンノプロテインのマンノース部分を認識し、これに結合する性質を利用して、アフィノブロッティング (Faye L and Chrispeels MJ, Anal Biochem, 1985)という手法を用いると、フィルター上でマンノプロテインのみを検出することができる（図３および図４参照）。
【００２３】
醸造酒のヘイズ生成の抑制方法
本発明の醸造酒のヘイズ生成の抑制方法は、酵母増殖工程を好気条件下で実施することに特徴がある。
【００２４】
上述のように、醸造酒の製造においては、発酵に供する酵母を得る工程、すなわち酵母増殖工程によって酵母懸濁液を調製したのち、その懸濁液を穀類や糖質原料から調製した液に添加して発酵させる方法が一般的である。本発明においては、上記酵母増殖工程を好気条件下で実施する。
【００２５】
本発明における「好気条件」とは、通気・攪拌等により、培養液中の溶存酸素濃度が３ｐｐｍ以上の条件をいい、好ましくは５〜１５ｐｐｍ、特に好ましくは８〜１２ｐｐｍである。溶存酸素濃度が上記範囲内となればよく、通気・攪拌条件に制限はないが、通気量は０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上であるのが好ましい。
【００２６】
本発明で用いる酵母は、製造すべき発酵飲料の種類、目的とする香味や発酵条件などを考慮して自由に選択できる。例えば、市販のビール酵母を用いることができる。但し、ヘイズの生成をより低レベルに抑制する場合は、マンノプロテインの生成量の低い酵母、特にＭＰ１２０および／またはＭＰ５７の生成量の低い酵母を用いるのが好ましい。
【００２７】
マンノプロテインの生成量の低い酵母とは、発酵液または醸造酒中にマンノプロテイン剥離量が相対的に低い酵母のことである。
実施例
以下に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．ヘイズ画分の単離・解析
製品ビール20mLを透析チューブ（カットオフ分子量300,000）に入れ、100倍体積の純水に対して4℃12時間透析した。純水を替え、これを3回繰り返した。このサンプルを300,000 x G、3時間の条件で遠心したところ、遠心管の底にゼリー状の沈殿が認められたので（図５）、これをヘイズ画分とした。
【００２９】
実施例２．アフィノブロッティングを利用したマンノプロテインの検出
ＢＨ４４９株（Weihenstephan Nr.164）およびＢＨ２２５株（AJL 3062）醗酵終了もろみ（図６）を1.2mLエッペンチューブにとり、15,000rpm、10分間遠心し、上清1mLを別のエッペンチューブに移した。そこへ250μLの50%トリクロロ酢酸を加え、室温で10分間放置後、15,000rpm、10分間遠心し、上清を捨てた。チューブに1ｍLのアセトンを加えて沈殿をリンスした後、沈殿を風乾した。
【００３０】
SDS-ゲル電気泳動はLaemmli（Nature 227巻、680-685ページ）の方法に従って行った。沈殿サンプルにSDS電気泳動用サンプルバッファー100μLを加え、完全に溶かした。これを100℃、10分間熱処理し、タンパクを変成させたのち、サンプル8μLをポリアクリルアミドゲル（7.5%または9%）を用いたSDS-電気泳動で展開した。電気泳動後のゲルをトランスファーバッファー（48mM トリス、39mM グリシン、20% メタノール、1.3mM SDS、pH9.0）中で10分間浸潤させた後、ニトロセルロース製のメンブレンに転写した（16V、40分）。転写後のメンブレンを2% スキムミルクを含むTTBSバッファー（20mM トリス、137mM NaCl、0.1% Tween20、pH7.6）中で室温にて1時間ブロッキングした後、ハイブリバッグ中でセイヨウワサビ由来過酸化酵素（HRP）-コンカナバリンA複合体と室温で15分間インキュベーションした。HRP-コンカナバリンAは市販品（シグマ社L-6397）を水で1mg/mLの濃度に溶解したものをTTBSバッファーで 1/2000倍希釈して用いた。HRP-コンカナバリンAとのインキュベーション後、100mLのTTBSバッファーで5分づつ3回液を交換してメンブレンを洗い、メンブレンから余剰のHRP-コンカナバリンAを除いた。メンブレン上のマンノプロテインはAmersham Biosciences社のECL（登録商標） Western Blotting Analysis Systemを用い、ケミルミネッセンスによって検出した。
【００３１】
図６の左半分の蛋白染色は、アフィノブロッティングの結果との比較のために行った。蛋白染色はCoomassie Brilliant Blue R-250を用いて行った。
図６の右図に示すように、酵母株に依存せず、ヘイズ画分にはＭＰ１２０が多く含まれている一方、ビール（醗酵終了もろみ）中のＭＰ１２０の割合は相対的にあまり高くなかった。従って、ＭＰ１２０等のマンノプロテインが選択的に不溶化し、不溶物の核となってヘイズを形成していることが示唆された。
【００３２】
実施例３．試験醗酵の投入酵母の好気・嫌気状態と醗酵終了後のヘイズ生成の関係
2Lスケールの試験醗酵をする際、投入酵母（ＢＨ４４９株（Weihenstephan Nr.164））を嫌気的（2Lのプラスチックボトル中で静置培養）、または好気的（羽根付き2Lマイヤーを用い120rpmの速度で攪拌、空気通気量：２L／min、溶存酸素濃度：１０ppm）に培養してプロパゲーション（酵母増殖工程）を行った。プロパゲーション終了時のもろみ中に遊離されているマンノプロテインを、上述したアフィノブロッティングによって検出した（図７左）。2種の投入酵母を用いた２Ｌスケール醗酵（麦汁：オールモルト、ピッチィング酵母量：１５×１０６cells/ml、溶存酸素濃度：１０ppm、醗酵温度：１５℃）の終了もろみについてもアフィノブロッティングで解析した（図７右）。好気・嫌気条件で発現、遊離量の異なるMP１２０やマンノプロテイン分子量５７ｋDａ（MP５７）について醗酵終了もろみ中の量を上述したように決定し、その比を求めた（図８）。
【００３３】
また、もろみを5,000rpm、10分の遠心をすることによって、浮遊酵母を沈殿させ、遠心上清を回収し、このサンプルを珪藻土濾過およびヘイズ測定に供した。上述したサンプルをポアサイズ50μmの金属製メッシュに乗せた珪藻土を用いて濾過した。濾過後、ヘイズを生じやすい環境にするため24時間氷水（0℃）で保持した。サンプルのヘイズをヘイズメーター（シグリスト社製、シグリスト光電計 KTL30）を用いて測定し、この値をT-haze（全混濁量）とした。単位はHelmを用いて表現した（1 Helm＝０．1 FTU(Formazin Turbidity Unit)）。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
好気条件下でプロパゲーションを行うことによりヘイズの生成が抑制され、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造が可能であることが判明した。
発明の効果
本発明によれば、醸造酒品質管理のひとつの項目として重要である混濁安定性に優れた、すなわちヘイズ生成を抑制された醸造酒の製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、酵母の細胞壁とマンノプロテインの模式図である。
【図２】図２は、ヘイズのモデルを示す。
【図３】図３は、アフィノブロッティングによるマンノプロテインの検出方法を示す。
【図４】図４は、アフィノブロッティングによるマンノプロテインの検出方法を示す。
【図５】図５は、超遠心によりより沈殿したヘイズを示す。
【図６】図６は、ヘイズ画分の電気泳動・アフィノブロッティングによる解析結果を示す。
【図７】図７は、通気条件の異なるプロパゲーションが、プロパゲーション終了時および最終ビールもろみ中のマンノプロテインプロファイルに与える影響を示す。
【図８】図８は、プロパゲーション時の通気条件と最終ビールもろみ中のマンノプロテインプロファイルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施する、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法。
【請求項２】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
酵母増殖工程の空気通気量が０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酵母が分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン生成量の低い酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵母がビール酵母である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項の方法によって製造される醸造酒。
【請求項９】
酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法。
【請求項１０】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
酵母増殖工程の空気通気量が０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
酵母が分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン生成量の低い酵母である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
酵母がビール酵母である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
醸造酒の製造において、酵母増殖工程を好気条件下で実施する、ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法。
【請求項２】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
酵母増殖工程の空気通気量が０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酵母が分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン生成量の低い酵母である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵母がビール酵母である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項の方法によって製造される醸造酒。
【請求項９】
酵母増殖工程を好気条件下で実施することによる、醸造酒のヘイズ生成の抑制方法。
【請求項１０】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が５〜１５ｐｐｍである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
酵母増殖工程の溶存酸素濃度が８〜１２ｐｐｍである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
酵母増殖工程の空気通気量が０．００５ｖ／ｖ／ｍ以上である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
酵母がマンノプロテインの生成量の低い酵母である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
酵母が分子量約１２０ｋＤａのマンノプロテイン生成量の低い酵母である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
酵母がビール酵母である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−３１１８３１（Ｐ２００６−３１１８３１Ａ）
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３６７５２（Ｐ２００５−１３６７５２）
【出願日】平成１７年５月９日（２００５．５．９）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月９日（２００５．５．９）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【Ｆターム（参考）】
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