ヘモグロビンＡ１ｃ測定法およびそれに用いる酵素とその製造法
【課題】糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に
測定する方法、測定試薬キットを提供する。
【解決手段】糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼをスクリーニングする。
該スクリーニング法により得たプロテアーゼを用いることで糖化ヘモグロビンの糖化され
たβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定する方法、測定試薬キットを提供できる。
本発明によれば、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測
定する事が可能になる。
測定する方法、測定試薬キットを提供する。
【解決手段】糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼをスクリーニングする。
該スクリーニング法により得たプロテアーゼを用いることで糖化ヘモグロビンの糖化され
たβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定する方法、測定試薬キットを提供できる。
本発明によれば、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測
定する事が可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに酵素を用いて特
異的に測定する方法、測定試薬キット、該特異的測定に用いることができるプロテアーゼ
、その製造方法、そのスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いることができるケト
アミンオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、中でもヘモグロ
ビンＡ１ｃは近年の研究により７％以下に値を管理すれば合併症の発症および進展の危険
率を有意に低下させることが証明され、臨床の現場では無くてはならない指標として多用
されている。ヘモグロビンＡ１ｃの定量法としては、通常、電気泳動法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、免疫法及び酵素法が知られてい
る。しかしながら電気泳動法、クロマトグラフィー法は高価な専用装置を必要とするうえ
に処理速度が遅く、多数の検体を処理する臨床検査には適していない。また免疫法は分
析方法が比較的簡単で時間も短時間で済むことから近年急速に広まってきたが、抗原抗体
反応を用いる為に、再現性や共存物質の影響の点で必ずしも精度が良くない点が問題とな
っている。
他方、酵素法は専用装置が不必要であり、処理速度が速く、高精度、簡便、安価な定量
方法として提案されている（特許文献１：特開平８−３３６３８６号公報、特許文献２：
国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特許文献３：特開２００１−９５５９８号
公報、特許文献４：特開２０００−３００２９４号公報、非特許文献１：Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３））。
しかし、ヘモグロビンは分子内リジンのε−アミノ基とαおよびβ鎖Ｎ末端のバリンの
α−アミノ基とに糖化を受けうるが、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の
バリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるから（非特許文献２Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４０（
１）：７８−８９（２００２）において国際的に標準とされる定義）、糖化ヘモグロビン
の糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せずにプロテアーゼおよびケトアミンオキシダーゼを
用いて特異的に測定するためには、プロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼのどちらかの
酵素反応、または両方の酵素反応において特異性が必要とされる。
具体的には、糖化ヘモグロビンには分子内リジン、α鎖Ｎ末端、β鎖Ｎ末端の３種の糖
化部位があることから、糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを測定するためには、以下のように特
異性にしたがった組み合わせが必要となる。
すなわち、、プロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミンオキシダーゼを（Ｋ１）
〜（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ３）または
（Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ１）または（Ｋ
２）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（
Ｋ５）と（Ｋ４）＞の組み合わせが必要となる。
それぞれに分類された酵素の性質は以下の通りである。
（Ｐ１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す（Ｐ２）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端から
のみ糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す（Ｐ３）糖化ヘモグロビンの糖
化されたβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部位からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す（Ｐ４）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端およ
び分子内リジンを含む部位から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す（Ｋ
１）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸およ
び／または糖化ペプチドにのみ作用する（Ｋ２）組み合わせて用いるプロテアーゼにより
糖化ヘモグロビンから切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖
化されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用
する（Ｋ３）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来および分子
内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する（Ｋ
４）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化され
たαおよびβ鎖Ｎ末端由来および分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／ま
たは糖化ペプチドに作用する（Ｋ５）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグ
ロビンから切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ
鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドには作用せずに分子内リジンを
含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用する。
しかし、これまで糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからケトアミンオキシダ
ーゼの基質となる糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを生じさせるプロテアーゼは
特開平８−３３６３８６号公報、国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特開２０
０１−９５５９８号公報、特開２００１−５７８９７号公報、国際公開第００／５０５７
９号パンフレット、国際公開第００／６１７３２号パンフレットおよびＣｌｉｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３）など知られているが、
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントから糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸
または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドを切り出すといった特異性を示した記載はない。
また、特開２０００−３００２９４号公報で記載されているアンギオテンシン変換酵素
についてもその公知の基質特異性からβ鎖Ｎ末端糖化トリペプチドに作用する可能性は推
定されるが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すことを具体的に示すような記載、例え
ばα鎖Ｎ末端糖化トリペプチドとβ鎖Ｎ末端糖化トリペプチドに対するアンギオテンシン
変換酵素の特異性を定量して示した記載はない。
また、特開２０００−３００２９４号公報では糖化ヘモグロビンからβ鎖Ｎ末端糖化ト
リペプチドを生成させる際用いたトリプシン、プロリン特異エンドプロテアーゼ、カルボ
キシペプチダーゼＰが分子内リジンを含む部位や糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ
酸または糖化ペプチドを生成していないことを示した記載もない。
さらにまた、本発明者らはアンギオテンシン変換酵素が通常の反応条件においてはβ鎖
Ｎ末端糖化トリペプチドからフルクトシルバリンをほとんど切り出さないことを確認して
おり、アンギオテンシン変換酵素がα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプ
チドを切り出すプロテアーゼであるとは言えない。
以上のように、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、つまり、上記（Ｐ１）または（
Ｐ３）の特異性をもつプロテアーゼ、もしくは上記（Ｐ１）または（Ｐ３）の特異性を達
成するように工夫されたプロテアーゼの反応条件はこれまで知られていなかった。
また、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化ア
ミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化ア
ミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼ、つまり、上記（Ｐ１）また
は（Ｐ３）の性質をもつプロテアーゼのスクリーニング法としては、一般的に次のような
ものが想定される。すなわち、糖化ヘモグロビンをα鎖Ｎ末端が糖化されたものとβ鎖Ｎ
末端が糖化されたものとに分離し、これらを基質として用いたときにβ鎖Ｎ末端が糖化さ
れたものからのみ選択的に糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテア
ーゼを、プロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作
用するケトアミンオキシダーゼなどの酵素を用いて、発色を指標に探すというスクリーニ
ング方法である。しかし、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化割合は約５％程度と
糖化率が低いために、α鎖Ｎ末端が糖化されたもの又はβ鎖Ｎ末端が糖化されたものに分
離する収率が極めて悪いのみならず、これらの物質を基質として該プロテアーゼ活性を検
出することはヘモグロビンの赤色ゆえに検出も困難であった。このように、簡便で有効な
スクリーニング方法はこれまで知られていなかった。
一方、ケトアミンオキシダーゼについては、以下のものがある。
１）フザリウム属（特開平７−２８９２５３号公報）、ギベレラ属、カンジダ属（特開
平６−４６８４６号公報）、又はアスペルギルス属由来（国際公開第９７／２００３９号
パンフレット）のであって、おもにε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジン（以下、
ＦＫともいう）もしくはそれを含むペプチドとフルクトシルバリン（以下、ＦＶともいう
）に作用するもの、
２）コリネバクテリウム属（特開昭６１−２８０２９７号公報）、ペニシリウム属（特
開平８−３３６３８６号公報）、トリコスポロン属由来（特開２０００−２４５４５４号
公報）であって、おもにＦＶに作用するもの、
また、一般にプロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドからＦＶを切り
出す工程は一般に反応がほとんど進行せず大量の酵素で長時間の反応が必要といった欠点
があるのでその欠点を補うために、ヘモグロビンＡ１ｃを測定する際に用いるケトアミン
オキシダーゼとして、プロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドから切り
出された糖化ペプチドにも作用するものが必要とされていた。そして、そのような
３）コリネバクテリウム由来のケトアミンオキシダーゼの変異型（特開２００１−９５
５９８号公報）やアカエトミエラ属、アカエトミウム属、チエラビア属、カエトミウム属
、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属（欧州特
許出願公開第１２９１４１６号明細書）の１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−
ヒスチジン（以下、ＦＶＨともいう）に作用するケトアミンオキシダーゼが近年報告され
ている。
しかし、１）に属するケトアミンオキシダーゼは（Ｋ４）の性質のものであり、２）に
属するケトアミンオキシダーゼは（Ｋ２）の性質のものであるがＦＶＨに作用するという
記載はなく、３）に属するケトアミンオキシダーゼは、ＦＫに対する作用が最も低いユー
ペニシリウム属のケトアミンオキシダーゼにおいてもＦＶＨに対する作用を１００％とし
たときに９．７８％もＦＫに対して作用する（欧州特許出願公開第１２９１４１６号明細
書）ことから、プロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された分子内リジンを含
む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに十分に作用すると考えられ、ま
たプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖
化ペプチド、例えば１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（以下、ＦＶ
Ｌともいう）に対する作用は記載されていないため、（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ
３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼであるとは言えない。
以上のように、これまで（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３
）の性質のケトアミンオキシダーゼはこれまで報告されていなかった。
また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質のケトアミンオキシダーゼ
を既知のケトアミンオキシダーゼをアミノ酸置換、欠失、挿入などにより改変することで
、作製することが考えられるが、酵素の一次構造上のどのアミノ酸残基がＦＫもしくはＦ
ＺＫに対する作用の低減に寄与しているのかは分っていない。従って、任意のケトアミン
オキシダーゼ遺伝子を改変し、ＦＫもしくはε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）（以下、ＦＺＫともいう）に対する活性の低減を図
ることはこれまでできなかった、つまり、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用す
る性質のケトアミンオキシダーゼを改変によって作製することは知られていなかった。
また、ＦＶＨに作用することのできるケトアミンオキシダーゼの反応条件を工夫するこ
とで、ＦＫもしくはＦＺＫへの活性をＦＶＨへの活性と比較して、その比率を低減させる
ことは知られていなかった。
プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンに存在するβ鎖Ｎ末
端のバリンのα−アミノ基の糖化を明確に分別して測定するためには、プロテアーゼとケ
トアミンオキシダーゼの特異性を前述のように組み合わせる必要があるが、特開平８−３
３６３８６号公報、国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特開２００１−９５５
９８号公報およびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４
（２００３）においてはヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を特異的に測定していると
いう記述もなく、ＨＰＬＣ法で得られた値もしくは得られうる値と開示された酵素法によ
る測定値とが良い相関を示すという記載があるのみである。そして、用いたプロテアーゼ
とケトアミンオキシダーゼの特異性には言及することなく単にプロテアーゼで糖化ヘモグ
ロビンを分解することにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドをケ
トアミンオキシダーゼにより検出しており、分子内リジンのε−アミノ基とαおよびβ鎖
Ｎ末端のバリンのα−アミノ基が糖化されたものを混合して検出していると考えられる。
さらに、特開２００１−９５５９８号公報においてはプロテアーゼとＦＶＨに作用するケ
トアミンオキシダーゼを用いて実施例において糖化ヘモグロビンを測定しているが、操作
において遠心分離を行っており、分離操作なく測定できるとの記載はない。
特開２０００−３００２９４号公報においてはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンのα−
アミノ基が糖化されたものだけを特異的に測定する酵素法が提案されている。この方法に
おいてはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端から３番目のロイシンのカルボキシル基側を切断できる
プロテアーゼ、次いでｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−ＬｅｕよりＨｉｓ−Ｌｅｕ
を切り取ることができるプロテアーゼで順次処理することでフルクトシルバリンを生成さ
せ、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンのα−アミノ基が糖化された量を特異的に測定する
としている。しかし、この方法はプロテアーゼ反応を２段階で行う必要があり、第１段階
でのヘモグロビンβ鎖Ｎ末端から３番目のロイシンのカルボキシル基側を切断するプロテ
アーゼ反応を厳密に制御することが困難である、第２段階のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化
ペプチドからα−糖化アミノ酸を切り出す工程は一般に反応がほとんど進行せず大量の酵
素で長時間の反応が必要である、といった欠点がある上に実施例において示される方法は
煩雑な限外ろ過という分離操作を２回行っており、本願発明の方法で糖化ヘモグロビンの
糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定できるという記載はない。
欧州特許出願公開第１２９１４１６号明細書においてはヘモグロビンＡ１ｃなどの糖化
タンパク質をモルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（キッコーマン販売）、カルボ
キシペプチダーゼＹ、プロチンＰ（大和化成販売）といったプロテアーゼによりＦＶＨを
遊離させ、ＦＶＨに作用しうるオキシダーゼで測定する方法が提案されている。そして、
プロテアーゼにより生成するＦＫが問題となる場合はＦＫに作用するフルクトシルアミン
オキシダーゼで消去してからＦＶＨに作用しうるオキシダーゼで測定する、またはＦＶＨ
に作用してＦＫに作用しにくいオキシダーゼを用いて測定することが提案されている。し
かし、糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端由来による糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドとの区別については言及されておらず、提案された方法により糖化ヘモグロ
ビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を測定した実施例も明示されておらず、提案された方法が分
離操作不要で可能であるとの記載もない。
上記のような糖化ヘモグロビンに関する測定法はこれまで知られていたが、糖化ヘモグ
ロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法および
試薬キットはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平８−３３６３８６号公報
【特許文献２】国際公開第９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特開２０００−３００２９４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを、分離操作せずに特
異的に測定できる方法、測定試薬キット、該特異的測定に用いることができるプロテアー
ゼ、その製造方法、そのスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いることができるケ
トアミンオキシダーゼを提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、まず、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントのα
鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、β鎖Ｎ末端の
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法
を考案した。すなわち、糖化ヘモグロビンのα鎖Ｎ末端およびβ鎖Ｎ末端に存在する糖化
ペプチドをプロテアーゼの基質として用いることで、糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖
Ｎ末端からケトアミンオキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質
的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端からケトアミンオキシダーゼの基質となる
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼ活性の検出方法を考案
した。
次に、考案したスクリーニング方法により、α鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドからケトア
ミンオキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すこと
なく、β鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドからケトアミンオキシダーゼの基質となる糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼを広くスクリーニングした結果
、バチラス・エスピー由来ニュートラルプロテイナーゼ（東洋紡製）などの市販プロテア
ーゼ製剤やバチラス・エスピー、エアロモナス・ヒドロフィラ、リゾバクター・エンザイ
モゲネスなどの微生物が産生するプロテアーゼに当該プロテアーゼ反応を見出した。
加えて、これらのプロテアーゼのうち、エアロモナス・ヒドロフィラ、リゾバクター・
エンザイモゲネスが産生するプロテアーゼは既知のエラスターゼと相同性を示した。従来
、エラスターゼは、その基質特異性としてロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンの
Ｃ末端側のペプチド結合を切断する酵素として知られている。本発明では、エラスターゼ
が1−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオ
ニル−Ｌ−プロリン（以下、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドともいう）のロ
イシンのＣ末端側ではなく、Ｎ末端側のペプチド結合を切断し、ＦＶＨを遊離することを
はじめて明らかにした。
次に、当該プロテアーゼが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された
α鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末
端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すのみならず、糖化ヘモグロビ
ン若しくはそのフラグメントからＦＫおよび／またはＦＫを含む糖化ペプチドをも切り出
す場合においては、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ペプチドに作用せずにＦＫおよび／
またはＦＫを含む糖化ペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼであらかじめＦＫおよ
び／またはＦＫを含む糖化ペプチドを消去することで糖化ヘモグロビン若しくはそのフラ
グメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法を完
成するに至った。
さらに、当該プロテアーゼが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化され
たα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ
末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すのみならず、糖化ヘモグロ
ビン若しくはそのフラグメントからＦＫおよび／またはＦＫを含むペプチドをも切り出す
場合において、ケトアミンオキシダーゼのＦＺＫに対する反応性が大きく低減できる反応
条件を見出し、また、ＦＶＨに対する作用を１００％としたときＦＺＫに対する作用が５
％以下というこれまでにない高特異性のケトアミンオキシダーゼを作製して用いることに
より、糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
のみを特異的に測定できた。すなわち、カーブラリア・クラベータ由来ケトアミンオキシ
ダーゼ遺伝子の５８番目と６２番目のアミノ酸置換がＦＺＫへの作用低減に寄与している
ことを発見し、これにもとづき該オキシダーゼを作製し用いることで、糖化ヘモグロビン
若しくはそのフラグメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せずに酵素を用いて特異的
に測定する方法を完成するに至った。
さらにまた、当該プロテアーゼによる糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメント分解
の反応条件について、
ｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用することの
できるＦＫおよび／またはＦＫを含む糖化ペプチドを切り出さない、かつ、
ｉｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用すること
のできる糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出さない、
かつ、
ｉｉｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用するこ
とのできる糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す、反
応条件を見出した。これにより、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化され
たβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端から、糖化アミノ酸または糖化ペプチ
ドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、プロテアーゼ。
（２）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端を含むフラグメントから、糖化アミノ
酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖
Ｎ末端を含むフラグメントから糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、プ
ロテアーゼ。
（３）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化
ペプチドを切り出す反応を１００％としたときに糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末
端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す反応が１０％以下である、プロテアー
ゼ。
（４）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端又は糖化ヘモグロビンの糖化されたβ
鎖Ｎ末端を含むフラグメントから切り出される糖化ペプチドが１−デオキシフルクトシル
−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンである上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプロテアー
ゼ。
（５）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端又は糖化ヘモグロビンの糖化されたα
鎖Ｎ末端を含むフラグメントから実質的に切り出されない糖化アミノ酸が１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリンであり、実質的に切り出されない糖化ペプチドが１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンである上記（１）〜（４）のいずれかに記載のプ
ロテアーゼ。
（６）リゾバクター属由来のプロテアーゼである上記（１）〜（５）のいずれかに記載
のプロテアーゼ。
（７）バチラス．エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）又はエア
ロモナス．ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼである上記（１）〜（５
）のいずれかに記載のプロテアーゼ。
（８）プロテアーゼがメタロプロテアーゼ、ニュートラルプロテアーゼ、またはエラス
ターゼのいずれかである上記（１）〜（７）のいずれかに記載のプロテアーゼ。
（９）タンパク質又はペプチドにおけるロイシンのＮ末端側のペプチド結合を切断する
エラスターゼ。
（１０）リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
）菌株。
（１１）バチラス・エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）菌株。
（１２）上記（６）に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、以下の（ａ）及び
（ｂ）の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
（ａ）リゾバクター属に属する菌を培養液にて培養する。
（ｂ）培養液からプロテアーゼを抽出する。
（１３）上記（７）に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、以下の（ａ）及び
（ｂ）の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
（ａ）バチラス・エスピーＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）又はエアロモ
ナス・ヒドロフィラＮＢＲＣ３８２０を培養液にて培養する。
（ｂ）培養液からプロテアーゼを抽出する。
（１４）以下の（Ａ）の性質を有するケトアミンオキシダーゼ。
（Ａ）ε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）
に対する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応
性に比べて５％以下であること。
（１５）さらに以下の（Ｂ）及び（Ｃ）の性質を有する上記（１４）に記載のケトアミ
ンオキシダーゼ。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列
で構成されること。
（Ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列において少なくとも５８番目もしくは６２番目のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換されていること。
（１６）（Ｃ）のアミノ酸置換は５８番目がバリン、スレオニン、アスパラギン、シス
テイン、セリン、アラニン、６２番目がヒスチジンへの置換である上記（１５）に記載の
ケトアミンオキシダーゼ。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載のケトアミンオキシダーゼのアミノ
酸配列をコードする遺伝子。
（１８）上記（１７）に記載の遺伝子を含有するケトアミンオキシダーゼ発現ベクター
。
（１９）上記（１８）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（２０）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せず酵素を用いて特異
的に測定する方法。
（２１）酵素が（ｉ）プロテアーゼを含む上記（２０）に記載の測定方法。
（２２）酵素はさらに（ｉｉ）ケトアミンオキシダーゼを含む上記（２１）に記載の測
定方法。
（２３）以下の（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）の反応工程を経由して特異的に測定
する上記（２２）に記載の測定方法。
（ｉｉｉ）（ｉ）のプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから実質的に、（ｉｉ）のケトアミ
ンオキシダーゼが作用するε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε
−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを含む糖化ペプチドを切り出すことなく、糖化
ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からから糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
を切り出す反応工程。
（ｉｖ）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼのε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）に対する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ
−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応性の３０％以下となる反応工程。
（２４）（ｉｉｉ）の反応工程がｐＨ５．０〜６．０の反応条件下である上記（２３）
に記載の測定方法。
（２５）（ｉｖ）の反応工程がｐＨ５．５〜６．５の反応条件下である上記（２３）又
は（２４）に記載の測定方法。
（２６）（ｉ）のプロテアーゼが上記（１）〜（８）のいずれかに記載のプロテアーゼ
である、上記（２１）〜（２５）のいずれかに記載の測定方法。
（２７）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末
端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用
するケトアミンオキシダーゼである上記（２２）〜（２６）のいずれかに記載の測定方法
。
（２８）ケトアミンオキシダーゼがカーブラリア属由来である上記（２７）に記載の測
定方法。
（２９）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが以下の（ａ）及び（ｂ）の２種類である
上記（２２）〜（２８）のいずれかに記載の測定方法。
（ａ）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼ。
（ｂ）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドに実質的に作用することなく、ε−１−デオキシ
フルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを
含む糖化ペプチドには作用するケトアミンオキシダーゼ。
（３０）（ａ）のケトアミンオキシダーゼがカーブラリア属由来である及び／又は（ｂ
）のケトアミンオキシダーゼがフザリウム属由来である上記（２９）に記載の測定法。
（３１）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが上記（１４）〜（１６）のいずれかに記
載のケトアミンオキシダーゼである、上記（２２）〜（２６）のいずれかに記載の測定法
。
（３２）糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化
アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼをスクリーニングする方
法であって、長さが３アミノ酸から２０アミノ酸であるヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプ
チドおよび長さが３アミノ酸から２０アミノ酸であるヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチ
ドを用いるスクリーニング方法。
（３３）ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよびヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプ
チドの長さが５アミノ酸である上記（３２）に記載のスクリーニング方法。
（３４）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに特異的に測定す
る、以下の（ｉ）、（ｉｉ）を含んでなる試薬キット。
（ｉ）プロテアーゼ
（ｉｉ）上記（１４）に記載のケトアミンオキシダーゼ
【発明の効果】
【０００７】
このような本発明によれば、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを分離操作
せず特異的に測定できる方法、測定試薬キット、該特異的測定に用られるプロテアーゼ、
該プロテアーゼの製造方法若しくはスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いること
ができるケトアミンオキシダーゼを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ケトアミンオキシダーゼのアミノ酸配列における相同性を示す図である。
【図２】図２は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】図３は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】図４は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図５】図５は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図６】図６は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図７】図７は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図８】図８は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図９】図９は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図１０】図１０は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１１】図１１は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１２】図１２は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図１３】図１３は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図１５】図１５は、吸光度差ΔＡｓとＦＶＨ濃度との関係を示す図である。
【図１６】図１６は、プロテアーゼ反応の時間と得られる測定値との関係を示す図である。
【図１７】図１７は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【図１８】図１８は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【図１９】図１９は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなくＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
＜アマドリ化合物＞
本発明に於けるアマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基をもつ化合物とグルコー
ス等のアルデヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、生じる一般式−（ＣＯ）−Ｃ
ＨＲ−ＮＨ−（Ｒは、水素原子か水酸基を示す）で表されるケトアミン構造を有する化合
物のことを指す。アマドリ化合物には糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンのような糖化タ
ンパク質やペプチドが糖化された糖化ペプチド等が含まれる。
【００１０】
＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさし、α鎖及
びβ鎖Ｎ末端のバリンのα−アミノ基や分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されている
と言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとは糖化ヘモグロビンが分解されるこ
とでできるペプチドのことをいう。
【００１１】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端
のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされている（Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６（５
）：２９９−３０８（１９９８））。
【００１２】
＜特異的に＞
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を特異的に測定するといった表現は、糖化ヘ
モグロビンの糖化量を測定して得る値のうち、８０％以上、望ましくは９０％以上、更に
望ましくは９５％以上が、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にあるバリンのα−アミノ基の糖化由
来である場合に用いる。
【００１３】
＜糖化アミノ酸、糖化ペプチド＞
プロテアーゼが糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、といった表現のなかで
の糖化アミノ酸とは１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンであり、糖化ペプチドとはヘ
モグロビンのα鎖Ｎ末端から長さが２０アミノ酸以下のペプチドであってＮ末端のバリン
が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンになっているもののうちプロテアーゼと組み合
わせて用いるケトアミンオキシダーゼにより検出されるもののことであり、例えばカーブ
ラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシ
ダーゼを組み合わせて用いる場合は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシ
ンのことである。
プロテアーゼが糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す、といった表現のなかでの糖化アミノ酸と
は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンであり、糖化ペプチドとはヘモグロビンのβ鎖
Ｎ末端から長さが２０アミノ酸以下のペプチドであってＮ末端のバリンが１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリンになっているもののうちプロテアーゼと組み合わせて用いるケト
アミンオキシダーゼにより検出されるもののことである。例えば、カーブラリア・クラベ
ータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを組み合
わせて用いる場合は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンのことであ
る。プロテアーゼが糖化ヘモグロビンからε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを
含む糖化ペプチドを切り出す、といった表現における糖化ペプチドとは長さが５０アミノ
酸以下の糖化ペプチドのことである。
なお、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）は、平
成１５年２月１２日、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
【００１４】
＜実質的に＞
プロテアーゼ反応において、糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチ
ドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖
化ペプチドを切り出す、といった表現は、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドを切り出す反応性を１００％としたときに、糖化されたα鎖Ｎ末端
から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す反応性が１０％以下、望ましくは１％以
下、更に望ましくは０．１％以下であることを言う。ただし、上記プロテアーゼ反応は切
り出された生成物をケトアミンオキシダーゼ好ましくはカーブラリア・クラベータＹＨ９
２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼまたはフザリウム・
オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製）を用いて検出するこ
とによるものとする。
ケトアミンオキシダーゼ反応において、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより
切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに実質的に作用することなくε−
糖化アミノ酸には作用する、といった表現は、ε−糖化アミノ酸に対する反応性を１００
％とした場合に、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ
酸および／または糖化ペプチドに対する反応性が１０％以下、好ましくは８％以下、さら
に好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下であることを言う。また、ケトアミ
ンオキシダーゼ反応においてε−糖化アミノ酸に実質的に作用することなく糖化されたβ
鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
には作用する、といった表現は、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出さ
れた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに対する反応性を１００％とした場合に、
ε−糖化アミノ酸に対する反応性が８％以下、望ましくは１％以下、更に望ましくは０．
１％以下であることを言う。ただし、ケトアミンオキシダーゼの反応は生成する過酸化水
素を検出することによるものとする。
【００１５】
＜ケトアミンオキシダーゼ＞
ケトアミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のことで、別名フ
ルクトシルアミンオキシダーゼともいう。
【００１６】
＜ε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）に対
する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応性に
比べて５％以下であるケトアミンオキシダーゼ＞
ケトアミンオキシダーゼのε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−リジン）（以下、ＦＺＫともいう）に対する反応性が１−デオキシフルクト
シル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（以下、ＦＶＨともいう）に対する反応性に比べて５
％以下であるとは、反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯ
Ｓ、５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、２ｍＭ ＦＺＫまたはＦＶＨ）２００μｌにケトア
ミンオキシダーゼ液２０μｌを添加し、３７℃で５分間反応させた後、０．５％ ＳＤＳ
を０．５ｍｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定し、さらにＦＺＫおよびＦＶ
Ｈを含まない反応液で同様の操作を行って測定した吸光度（Ａｂ）との差（Ａ１−Ａｂ）
から反応性を測定したときに、その反応性の比率が５％以下であることをいう。
【００１７】
＜分離操作＞
分離操作とは、全血検体または血球溶血検体などをサンプルとして、サンプル中の糖化
ヘモグロビンを測定する一連の測定工程の過程において、カラムクロマトグラフィー操作
、膜ろ過操作、吸着分離操作、沈殿分離操作など糖化ヘモグロビンもしくは糖化ヘモグロ
ビンから派生する物質の純度、濃度を上げるために行う操作のことをいう。
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに酵素を用いて特異的に測
定するためには、用いる酵素の反応において糖化ヘモグロビン中にある分子内リジン、α
鎖Ｎ末端、β鎖Ｎ末端の３種の糖化部位のうちβ鎖Ｎ末端の糖化部位のみに特異性がなけ
ればならない。そのような特異性を出すために用いる酵素としては、１種類の酵素でも複
数の種類の酵素を組み合わせたものでもよい。例えば、プロテアーゼで糖化ヘモグロビン
を分解し、切り出された糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペ
プチドに作用する酵素であるオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、キナーゼなどを組み合わ
せて特異性を出せばよい。そして、プロテアーゼおよびケトアミンオキシダーゼを用いて
糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを測定するためには、以下のように特異性にしたがった組み合
わせが必要である。
【００１８】
すなわち、プロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミンオキシダーゼを（Ｋ１）〜
（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ３）または（
Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ１）または（Ｋ２
）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ
５）と（Ｋ４）＞の組み合わせが必要である。それぞれに分類された酵素の性質は以下の
通りである。
（Ｐ１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ２）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ３）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部位からの
み糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ４）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部
位から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｋ１）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ２）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来の糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ３）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来および分子内リ
ジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ４）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来および分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドに作用する
（Ｋ５）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドには作用せずに分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドに作用する
【００１９】
＜プロテアーゼのスクリーニング＞
そして、本発明者らは鋭意検討の結果、（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）の特異性をもつプロ
テアーゼを得るスクリーニング方法としては、ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよ
びヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドを基質として用い、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化
ペプチドを基質としたときにのみ糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプ
ロテアーゼを選択する方法を考案した。このときに用いるα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよび
β鎖Ｎ末端糖化ペプチドの長さは特に限定されないが、長さ３アミノ酸から２０アミノ酸
の糖化ペプチドでスクリーニング可能であることを見出した。その由来は化学合成であっ
ても良いし、糖化ヘモグロビン等の天然物由来であっても良い。
具体的な１例として、β鎖Ｎ末端糖化ペプチドとして１−デオキシフルクトシル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−プロリン（ペプチド研究
所製：以下、β糖化ペンタペプチドともいう）を、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドとして１−デ
オキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラ
ニン（ペプチド研究所製：以下、α糖化ペンタペプチドともいう）が挙げられ、これらの
糖化ペンタペプチドを基質として用いる場合、糖化アミノ酸、糖化ジペプチド、糖化トリ
ペプチドまたは糖化テトラペプチドがプロテアーゼにより切り出される可能性がある。そ
して、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよびβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドからプロテアーゼにより切
り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドは、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよび
β鎖Ｎ末端糖化ペプチドに実質的に作用することなく切り出された糖化アミノ酸および／
または糖化ペプチドには作用する酵素を用いて検出すればよく、そのような酵素としてオ
キシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、キナーゼが挙げられる。
例えば、オキシダーゼとしてはケトアミンオキシダーゼがあり、ケトアミンオキシダー
ゼとしてはアカエトミエラ属、アカエトミウム属、チエラビア属、カエトミウム属、ゲラ
シノスポラ属、マイクロアスカス属、コニオカエタ属、ユーペニシリウム属（以上、欧州
特許出願公開第１２９１４１６号明細書）、コリネバクテリウム属（特開昭６１−２６８
１７８号明細書）、アスペルギルス属（特開平３−１５５７８０）、ペニシリウム属（特
開平４−４８７４号明細書）、フザリウム属（特開平５−１９２１９３号公報、特開平７
−２８９２５３号公報、特開平８−１５４６７２号公報）、ギベレラ属（特開平５−１９
２１５３号公報、特開平７−２８９２５３号公報、）、カンジダ属（特開平６−４６８４
６号公報、）、アスペルギルス属（特開平１０−３３１７７号公報、特開平１０−３３１
８０号公報）、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（ＮＢＲＣ７５９０）、コニオケチジ
ウム・サボリ（ＡＴＣＣ３６５４７）、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ
−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（ＮＢＲＣ３１９５０）、アルス
リニウム・ファエオスペルマム（ＮＢＲＣ６６２０）、アルスリニウム・ジャポニカム（
ＮＢＲＣ３１０９８）、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０
）、ピレノケータ・ゲンチアニコラ（ＭＡＦＦ４２５５３１）、ピレノケータ・テレスト
リス（ＮＢＲＣ３０９２９）、レプトスフェリア・ノドラム（分生子世代名フォーマ・ヘ
ンネべルギー）（ＮＢＲＣ７４８０）、レプトスフェリア・ドリオラム（ＪＣＭ２７４２
）、レプトスフェリア・マクランス（分生子世代名フォーマ・リンガム）（ＭＡＦＦ７２
６５２８）、プレオスポラ・ハーブラム（ＮＢＲＣ３２０１２）、プレオスポラ・ベタエ
（分生子世代名フォーマ・ベタエ）（ＮＢＲＣ５９１８）、オフィオボラス・ヘルポトリ
カス（ＮＢＲＣ６１５８）、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
０００９）由来のもの、およびそれらの変異型の酵素が挙げられる。
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミ
ンオキシダーゼは基質特異性がＦＶＨに対して１００％とすると１−デオキシフルクトシ
ル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（以下、β糖化トリペプチドまたはＦＶ
ＨＬともいう）に対して０．０９％、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオニン（以下、β糖化テトラペプチドまたはＦＶＨＬＴ
ともいう）に対して０．０００９％、β糖化ペンタペプチドに対して０％、１−デオキシ
フルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（以下、ＦＶＬともいう）に対して３．４％、
α糖化ペンタペプチドに対して０．０１％であるから、このケトアミンオキシダーゼを用
いるとβ糖化ペンタペプチドからＦＶＨを切り出すプロテアーゼ活性およびα糖化ペンタ
ペプチドからＦＶＬを切り出すプロテアーゼ活性を検出できる。オキシダーゼを用いてプ
ロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを検出する場合
には生成した過酸化水素の量を電極、発光、蛍光、吸光などで検出することができるが、
パーオキシダーゼと色原体を用いて吸光検出することが簡便であり、例えば色原体として
４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）およびＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）をもち
いて５４０〜５７０ｎｍにおける吸光度変化を測定すればプロテアーゼ活性を簡便に確認
ができる。
上記スクリーニング方法により得られた（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）の特異性をもつプロ
テアーゼとしてバチラス属、エアロモナス属、リゾバクター属等の微生物由来のプロテア
ーゼが挙げられ、より具体的には例えばバチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
）エアロモナス・ヒドロフィラＮＢＲＣ３８２０、リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ
−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来のプロテアーゼが挙げられる。
これらの菌株のうち、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４
１）、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）
は本発明者等が新規に単離した菌株であり、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−０８６４１）は、２００４年２月２４日、リゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）は、平成１６年１月３０日に日本国茨城県
つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに寄託した。
寄託したこれらの菌学的性質を示すと次の通りであり、以下のように同定した。
【００２０】
１．ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）はグラム陽性の桿菌（０．８−１．０
ｘ２．０−３．０μｍ）で表１に示すような特徴により、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９８４）では、バチラス
．エスピーと同定された。
【００２１】
【表１−１】
【表１−２】
【００２２】
２． ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）はグラム陰性の好気性桿菌で大きさ
が０．４×５〜５０μｍで表２に示すような特徴により、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９８９）では、リゾバク
ター・エンザイモゲネスと同定された。
【００２３】
【表２】
【００２４】
＜プロテアーゼの培養物からの製造＞
次に、本発明に使用しうるプロテアーゼ生産菌の培養方法およびプロテアーゼの製造方
法について述べる。本発明のプロテアーゼ生産菌の培養手段としては固体培養でも液体培
養でもよいが、好ましくはフラスコまたはジャーファーメンター等による通気液体培養で
ある。培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源として
はグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースまたはマンノースなど、窒素源
としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。培養
条件としてはｐＨ５．０〜８．０、培養温度２５〜３７℃で目的とするプロテアーゼが最
高力価または最高純度となる培養時間、例えば１６時間〜７２時間培養をすればよい。
次いで、プロテアーゼの採取について説明する。プロテアーゼが菌体外に分泌される場
合には、培養液から菌体を濾過、遠心分離等によって除くことで得られた粗製のプロテア
ーゼ含有液を用いる。また、プロテアーゼが菌体内にある場合には培養液から菌体を濾過
、遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に必要
の応じて界面活性剤、金属塩、糖類、アミノ酸、ポリオール、キレート剤などを加えて懸
濁し、リゾチーム、超音波、ガラスビーズ等によって破砕した後濾過、遠心分離などによ
り不溶物を除去して得られる粗製のプロテアーゼ含有液を用いる。これらの粗製のプロテ
アーゼ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製
されたプロテアーゼを得ることができる。例えば、アセトン、エタノールなどの有機溶媒
による分別沈殿法、硫安アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー
法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲル濾過法など
の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製プロテアーゼを得ることができ、適
宜安定化剤、例えばショ糖、グリセロールまたはアミノ酸などを１〜５０％程度、補酵素
などを０．０１〜１％程度として単独または２種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存し
てもよい。
【００２５】
＜ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞
また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつケ
トアミンオキシダーゼを得るスクリーニング法としては、例えば、プロテアーゼにより糖
化ヘモグロビンから切り出された、α鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペ
プチドの代表例としてＦＶＬを、β鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプ
チドの代表例としてＦＶＨを、分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／また
は糖化ペプチドの代表例としてＦＫもしくはＦＺＫを用いて、それぞれに対する反応性を
指標にする方法が挙げられる。特に、ＦＫもしくはＦＺＫに対する反応性においてはＦＶ
Ｈに対する反応性の５％以下であることが指標となる。好ましくは４％以下、さらに好ま
しくは２％以下である。このようにして得られた（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに
作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとしては自然界から分離し
てきた天然型ケトアミンオキシダーゼおよび天然型ケトアミンオキシダーゼを既知の遺伝
子工学技術を利用してアミノ酸置換、欠失、挿入など人工的に改変することで得られる変
異型ケトアミンオキシダーゼ、さらに天然型および変異型のケトアミンオキシダーゼをポ
リエチレングリコ−ル誘導体、スクシニルイミド誘導体、マレイミド誘導体などを用いて
化学修飾することで得ることができるケトアミンオキシダーゼでも良い。
【００２６】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼ＞
既存のケトアミンオキシダーゼの１つもしくは複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入など
人工的に改変することで（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）
の性質をもつ変異型ケトアミンオキシダーゼを得る際に用いることができる既存のケトア
ミンオキシダーゼとしては特に限定はしない。例えば、前述の（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）
の特異性をもつプロテアーゼを得るスクリーニング方法で述べたケトアミンオキシダーゼ
が挙げられる。
また、ＦＶＨに作用するケトアミンオキシダーゼとして、コニオカエタ属（欧州特許出
願公開第１２９１４１６号明細書）、ユーペニシリウム属（欧州特許出願公開第１２９１
４１６号明細書）、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属由来のケトアミンオキシダーゼ
が挙げられる。
そして、これらの酵素は遺伝子レベルでも解析され、その一次構造も図１に示したよう
に推定されており、これらの酵素のアミノ酸レベルでの相同性は７５％以上で、＊がつい
たところのように保存された領域が存在しているので、配列番号１記載のアミノ酸配列と
少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列で構成されるケトアミンオキシダーゼの
例としても挙げられる。また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（
Ｋ３）の性質をもつような変異であるならばどのようなアミノ酸を置換、欠失、挿入であ
ってもよいが、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において５８番目、６２番目に対
応するのアミノ酸のうち少なくとも１ヶ所が置換されていることが望ましく、さらに望ま
しくは５８番目に対応するアミノ酸がバリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、
セリン、アラニンに、６２番目に対応するのアミノ酸がヒスチジンに置換されていること
である。
【００２７】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼ発現ベクター、宿主細胞＞
（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつ変異型の
ケトアミンオキシダーゼは、それをコードする遺伝子を必要に応じてプラスミドベクター
に連結してサッカロマイセス属、ピキア属、アクレモニウム属、バチラス属、シュードモ
ナス属、サーマス属、エシェリヒア属などの宿主微生物に移入して培養し、またはコード
する遺伝子を試験管内で転写、翻訳し、その後、公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を
用いて処理することにより得ることができる。
【００２８】
＜測定試薬キット＞
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端をプロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを
用いて分離操作せず特異的に測定する方法および試薬キットは、糖化されたβ鎖Ｎ末端に
対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミンオキシダーゼの組み合わせに加えて
パーオキシダーゼ、色原体、および必要に応じて緩衝液成分、塩類、界面活性剤、金属イ
オン、電子受容体、キレート剤、糖、アミノ酸、アスコルビンオキシダーゼ、テトラゾリ
ウム塩、ポリオール類、酵素安定化剤、酵素反応促進剤、抗菌剤、酸化剤、還元剤、補酵
素などの成分を適宜追加して構成しても良い。
糖化されたβ鎖Ｎ末端に対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミンオキシダ
ーゼの組み合わせとしては、前述のようにプロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミ
ンオキシダーゼを（Ｋ１）〜（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ
２）または（Ｋ３）または（Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ
３）と（Ｋ１）または（Ｋ２）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（
Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ４）＞の組み合わせであればどれでも良い。ただ
し、プロテアーゼは、一般的に、蛋白質のＮ末端のアミノ基が糖化を受けている場合、Ｎ
末端領域から糖化アミノ酸を切り出してくることは反応性が悪いため、β鎖Ｎ末端の糖化
アミノ酸より糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼが望ましい。例えば、上記のプロテア
ーゼのスクリーニングで得られた（Ｐ３）の性質であって糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶ
Ｈを切り出す性質をもつプロテアーゼとしてバチラス属、エアロモナス属、リゾバクター
属等の微生物由来のプロテアーゼが挙げられる。より具体的には、例えば、バチラス．エ
スピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ−
８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０
、リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来の
プロテアーゼが挙げられる。また、特異性を持たせたまま反応性を向上させるために、ス
クリーニングしたプロテアーゼと他のプロテアーゼとを適宜組み合わせたものも用いるこ
とができる。
プロテアーゼによりヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出される糖化ペプチ
ドの長さは２０アミノ酸以下で、かつ、組み合わせにより用いられるケトアミンオキシダ
ーゼにて検出できるのであれば特に限定されない。例えば、カーブラリア．クラベータ
ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを用いた場合
は、プロテアーゼによりヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出される糖化ペプ
チドはＦＶＨであることが望ましい。
ケトアミンオキシダーゼは、プロテアーゼと上記の組み合わせを構成できるものであれ
ばいずれでも良いが、反応性の点からβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸より糖化ペプチドを切り
出すプロテアーゼが望ましいため、（Ｋ１）〜（Ｋ５）における糖化されたβ鎖Ｎ末端由
来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドは糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ペプチ
ドであることが望ましい。例えばカーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼは、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ジペ
プチド（ＦＶＨ）に作用し、糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化ジペプチド（ＦＶＬ）に実
質的に作用しないので（Ｋ３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることが
できる。また、ＦＺＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の５％以下になった変異体
はこれを（Ｋ１）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることができ、フザリ
ウム．オキシスポラム由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製）を（
Ｋ５）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることができる。
【００２９】
＜反応条件＞
プロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸お
よび／または糖化ペプチドを切り出す反応条件は、その反応が十分に進行する条件であれ
ばいずれでも良い。例えば、ｐＨ、塩濃度、界面活性剤添加量、金属イオン添加量、反応
温度、酸化還元剤添加量、緩衝液濃度を調節することで、通常は、（Ｐ３）もしくは（Ｐ
２）の性質のプロテアーゼの特異性を高めて、（Ｐ１）の性質にするような反応条件が望
ましい。特に、（Ｐ３）の性質をもつバチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイネ
ース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
）、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０、リゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来のプロテアーゼにおいては、組み合わ
せのケトアミンオキシダーゼとしてカーブラリア．クラベータ ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを用いると、少なくともｐＨ５．０〜
６．０の反応条件において（Ｐ１）の性質のプロテアーゼとなるのでこの反応条件が望ま
しい。
ケトアミンオキシダーゼの反応条件は、その反応が十分に進行する条件であればいずれ
でも良いが、例えば、ｐＨ、塩濃度、界面活性剤添加量、金属イオン添加量、反応温度、
酸化還元剤添加量、緩衝液濃度を調節することでＦＺＫに対する反応性が３０％以下とな
る反応条件、特にｐＨ５．５〜６．５の反応条件はプロテアーゼにより切り出されたβ鎖
Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドであるＦＶＨに対する特異性を高
めることができるので望ましい。
上記に示した糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せず、プロテアー
ゼとケトアミンオキシダーゼを用いて特異的に測定する方法および試薬キットにより、糖
化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を正確に測定していることは、ヘモグロビン含量
とそのヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化された割合とが正確に示されているサンプルを用
いることで確認できる。ヘモグロビン含量とヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化された割合
とが正確に示されているサンプルとしては、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４０（１）：７８−８９（２００２）
に記載の方法で測定された値（ＩＦＣＣ値）が標記されているサンプルを用いることが望
ましいが、他の方法で測定された値が標記されているサンプルにおいても臨床検査 ４６
（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式によってもＩＦＣＣ値を得ることがで
きる。また、糖化ヘモグロビンサンプルはヒト血液から、血球分離、溶血、遠心分離、透
析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の操作を適宜組
み合わせて調製しても良いし（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６（５）：２９９−３０８（１９９８））、市販
のものを購入して用いても良い。
【００３０】
＜測定対象物＞
上記に示した糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずプロテアーゼ
とケトアミンオキシダーゼを用いて特異的に測定する方法および試薬キットの測定対象物
は糖化ヘモグロビンを含むものであればいずれでも良いが、例えば、全血サンプル、血球
溶血サンプル、精製ヘモグロビンサンプルが挙げられる。
次に、参考例、実施例によって本発明を説明する。
【００３１】
[参考例：カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来の
ケトアミンオキシダーゼの製法]
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）がＦＶＨに作用
するケトアミンオキシダーゼ（以下、ＦＯＤ９２３ともいう）を生産しているが生産量が
低いため以下に示すようにＦＯＤ９２３遺伝子を大腸菌において発現をさせた後、精製し
てＦＯＤ９２３を得た。
【００３２】
（１）カーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）染色体ＤＮ
Ａの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌ
を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、カーブラリア・クラベー
タＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）を植菌し、２５℃で４日間振盪培養した後
、Ｎｏ．２ろ紙で培養液をろ過して菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素で凍結し、
乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ ＳＤＳ、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加え、ゆっくり振盪して
溶解した。続いて、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、室温）により上清を回収し
、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、水層に残存するエー
テルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃
で３０分間放置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色
体ＤＮＡを回収し、７０％エタノールにて洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に
、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ １０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間
処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）を加え、５０℃で１時間処理し、フ
ェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回
）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。続いて７０％エタノール溶液によ
り洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解し、染色体ＤＮＡ溶液を得た
。
【００３３】
（２）ＦＯＤ９２３遺伝子断片の増幅
（ａ）ＦＯＤ９２３遺伝子断片の取得
これまでに知られているケトアミンオキシダーゼの遺伝子情報を基に下記のＰ１１およ
びＰ１２プライマーを設計した。
Ｐ１１ ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＣＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／
Ｔ）ＧＧ（配列番号２）
Ｐ１２ ＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＧＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＴＴ（配列番
号３）前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１１プライマーとＰ１２
プライマーの組み合わせでＰＣＲを３５サイクル行った結果、約８００ｂｐのＤＮＡ断片
が特異的に増幅され、増幅ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１の１０２１〜１７９０番目
までの塩基配列）を決定した。
（ｂ）ＦＯＤ９２３遺伝子の塩基配列の決定
（ａ）で得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片に隣接する５’上流域のＤＮＡ断片の増幅
は、染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化した後、ＬＡ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲで行った。即ち、染色体ＤＮＡ制限酵素処理断片にＸｂ
ａＩカセット（タカラバイオ製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライ
マ−（タカラバイオ製）及び下記のＰ１３プライマ−を使用して、ＰＣＲを３５サイクル
行った後、この反応液を１００倍希釈したものを鋳型としてＣ２プライマ−（タカラバイ
オ製）及び下記のＰ１４プライマ−を使用してＰＣＲをさらに３５サイクル行った結果、
１，２００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅した。そして、そのＤＮＡ断片の塩基配列（
配列番号１の１〜１０４４番目までの塩基配列）を決定した。
（ａ）で得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片に隣接する３’下流域のＤＮＡ断片の増幅
は、染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、ＬＡ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲで行った。即ち、染色体ＤＮＡ制限酵素処理断片にＳａ
ｌＩカセット（タカラバイオ製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライ
マ−（タカラバイオ製）及び下記のＰ１５プライマ−を使用して、ＰＣＲを３５サイクル
行った後、この反応液を１００倍希釈したものを鋳型としてＣ２プライマ−（タカラバイ
オ製）及び下記のＰ１６プライマ−を使用してＰＣＲをさらに３５サイクル行った結果、
１，０００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅した。そして、そのＤＮＡ断片の塩基配列（
配列番号１の１７７５〜２２１２番目までの塩基配列）を決定した。
以上のようにして決定した塩基配列をつなぎ合わせて、ＦＯＤ９２３遺伝子の塩基配列
（配列番号１）を決定した。
Ｐ１３ ＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＧＡＴ
（配列番号１の１０８３〜１１０６番目までの塩基配列の相補配列）
Ｐ１４ ＣＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣ
（配列番号１の１０６２〜１０８６番目までの塩基配列の相補配列）
Ｐ１５ ＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＣＣ
（配列番号１の１７１３〜１７３８番目までの塩基配列）
Ｐ１６ ＡＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＣＡ
（配列番号１の１７３６〜１７５７番目までの塩基配列）
【００３４】
（３）カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ-１０００９）由来ケトア
ミンオキシダーゼを発現する大腸菌の作製
ＦＯＤ９２３を大腸菌で発現させるため、ペニシリウム・ヤンシネラムのケトアミンオ
キシダーゼ（特開平１１−４６７６９号公報）とアスペルギルス・ニドランスのケトアミ
ンオキシダーゼとの相同性からイントロンとして３つの領域、すなわち配列番号１の塩基
配列の７５３〜８０７番目と、配列番号１の塩基配列の１２３１〜１２７９番目と、配列
番号１の塩基配列の１６９６〜１７５０番目を推定した。
イントロンを除去して大腸菌での発現プラスミドを作成するために次の操作を行った。
まず、イントロン存在領域を挟み込むようなイントロンが除去された４０〜５０塩基の
配列の正配列と相補配列を有するＤＮＡ断片Ｐ２２〜Ｐ２７と、ＦＯＤ９２３遺伝子の開
始コドンＡＴＧ上に制限酵素ＮｃｏＩの配列を付加したＤＮＡ断片Ｐ２１、およびＦＯＤ
９２３遺伝子の終止コドン直後に制限酵素ＳａｃＩを付加した相補配列を有するＤＮＡ断
片Ｐ２８を合成した。
続いて、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）の染色
体ＤＮＡを鋳型とし、Ｐ２１とＰ２３、Ｐ２２とＰ２５、Ｐ２４とＰ２７、Ｐ２６とＰ２
８のプライマーをそれぞれ組み合わせとして４種のＰＣＲを行い、それぞれからイントロ
ン領域が除去された３２７ｂｐ、４８０ｂｐ、４７１ｂｐ、２５４ｂｐの増幅ＤＮＡ断片
を得た。そして、得た４本のフラグメントを混合して鋳型とし、Ｐ２１とＰ２８をプライ
マーとして再度ＰＣＲを行うことにより４本のフラグメントが３ヶ所のイントロンの除去
された相同領域で連結している１本のＦＯＤ９２３遺伝子を有する約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片を得た。
ＦＯＤ９２３を大腸菌内で高生産させるために高発現プロモーターであるエアロコッカ
ス・ビリダンス由来のピルビン酸オキシダーゼプロモーター（特公平７−６７３９０号公
報）を使用した。その具体的手順を以下に述べる。
１）特公平７−６７３９０号公報に示されたエアロコッカス・ビリダンスのピルビン酸
オキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＯＸＩ３から、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の
プロモーター領域を得るため、ｐＯＸＩ３をＤｒａＩで切断して、配列番号６記載の２０
２ｂｐのＤＮＡ配列を有するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域を分取し
、これとｐＵＣ１３をＳａｌＩで切断した後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端にした
ものとを連結し、ｐＵＣ１３のアンピシリン耐性遺伝子とピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
のプロモーター領域が同じ向きのプラスミドｐＫＮ１９を得た。
２）さらにプロモーターによる発現を効率的にするためｐＫＮ１９のピルビン酸オキシ
ダーゼ遺伝子のプロモーター下流にリボゾーム結合配列領域とマルチクローニングサイト
ができるように設計した配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｐ３１と、その相
補配列で配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｐ３２を合成し、アニーリングさ
せた後、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＫＮ１９に連結してプラスミドｐＰＯＳ２を
作製した。
３）先に述べたイントロンを除去したＦＯＤ９２３遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片をＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、同じくＮｃｏＩとＳａｃＩで切断したｐＰＯＳ２へ
組み込み、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター下流にＦＯＤ９２３遺伝子が組
み込まれたプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３を作製した。
４）得られたｐＰＯＳＦＯＤ９２３で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換しＦＯＤ９２３を発
現する大腸菌ＦＡＯＤ９２３を作製した。
Ｐ２１ ＣＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧ
ＡＧＣＡＡＡＣ（配列番号４）
Ｐ２２ ＣＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧ
ＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１の７２５〜７５２番目と８０８〜８３
２番目の塩基配列）
Ｐ２３ ＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴ
ＴＧＴＧＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧ（配列番号１の７２５〜７５２番目と８０８〜８３
２番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２４ ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡ
ＴＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣ（配列番号１の１２０４〜１２３０番目と１
２８０〜１３０８番目の塩基配列）
Ｐ２５ ＧＴＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡ
ＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣ（配列番号１の１２０４１２３０番目と１２
８０〜１３０８番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２６ ＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴ
ＣＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣ（配列番号１の１６６９〜１６９５番目と１７
５１〜１７７８番目の塩基配列）
Ｐ２７ ＧＡＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣ
ＣＣＣＴＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧ（配列番号１の１６６９〜１６９５番目と１７
５１〜１７７８番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２８ ＣＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＧＧ
ＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号５）
Ｐ３１ ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴ
ＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧ（配列番号７）
Ｐ３２ ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧ
ＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴ（配列番号８）
【００３５】
（４）カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来ケトア
ミンオキシダーゼの製造
１０ｍｌの３％のソルビトール、１．５％のペプトン、１．５％のビール酵母エキス、
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（ｐＨ７．０）の入った８分の試験管に、
前述のように作製した大腸菌ＦＡＯＤ９２３を植菌し、２８℃、１２時間振盪培養し、種
菌とした。この種菌を２０Ｌの３％のソルビトール、１．５％のペプトン、１．５％のビ
ール酵母エキス、０．１％の消泡剤、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（ｐ
Ｈ７．０）の入った３０Ｌのジャーファンメンターに植菌し、３７℃で１８時間、攪拌培
養を行った。
培養終了後、集菌し、４Ｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に菌体を懸濁
させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（２１２ＫＵ）。この可溶化液を８０００
ｒｐｍで３０分間遠心し、その遠心上清をＱ−セファロース・ビッグビーズ樹脂（２Ｌ）
（アマシャム社製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０Ｍ、０．
１Ｍ、０．３Ｍ、０．５ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った
。その結果、０．３Ｍと０．５ＭのＮａＣｌ溶出画分が活性画分として回収された（１８
０ＫＵ）。この酵素液をモジュール（アミコン社製）にて７５０ｍｌまで濃縮した後１０
ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に一夜透析した。この透析液をＱ−セファロース
・ＨＰ樹脂（５００ｍｌ）（アマシャム製）を用いて再度イオンクロマトグラフィーを行
った。溶出は０〜０．３ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によるリニ
アグラジエントにより行い、０．１５〜０．２ＭのＮａＣｌの溶出画分（９２ＫＵ）を回
収した。この酵素液を５００ｍｌまで濃縮し、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）にて一夜透析した後、凍結乾燥を行い、精製ＦＯＤ９２３を得た。なお、ＦＯＤ９２３
活性測定試薬および測定方法を以下に記載する。
＜測定試薬＞
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＦＶＨ（ペプチド研究所製）
０．０２％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０２％ ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）
５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
（ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシ
アニリン）
＜測定方法＞
測定試薬１ｍｌを試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素
液を添加して５分間反応させた。反応後、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止
させ、波長５５０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨ
を含まない測定試薬を用いて同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度
（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とし
た。
【００３６】
[参考例：ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４由来のケトアミンオキシダーゼの製
法]
ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４がＦＶＨに作用するケトアミンオキシダーゼ
（以下、ＦＯＤ４７４ともいう）を生産しているが、生産量が低いため、以下に示すよう
に当該ケトアミンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌において発現させた後、精製して当該ケト
アミンオキシダーゼを得た。
【００３７】
（１）ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４染色体ＤＮＡの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを
５００ｍｌ容坂口フラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、ネオコスモスポラ・バシン
フェクタ４７４を植菌し、２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙で培養液をろ過
して菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し
、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン製）を使用して染色体ＤＮＡ
溶液を得た。
【００３８】
（２）ケトアミンオキシダーゼ遺伝子のクローニング
（ａ）放射性ＤＮＡプローブの作製
ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４のケトアミンオキシダーゼ遺伝子はＦＯＤ９
２３の遺伝子と相同性を有することが予想された。そこで前記のＦＯＤ９２３の遺伝子を
含むプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、ケトアミ
ンオキシダーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、このＤＮＡ断片をＢｃ
ａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを
使用して放射性ＤＮＡプローブを作製した。
（ｂ） サザンハイブリダイゼーションによるケトアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡ
断片の検定
（１）の操作で得られたネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡから
遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含
有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。まず、ネオコスモスポラ．
バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル
で電気泳動し、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ製：バイオダインＡ）
にＤＮＡを転写した。次に、このメンブレンを風乾後、ハイブリダイゼーション溶液（０
．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン、０．１％ ウシ血清アルブミン
、０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、５０ｍＭ リン酸３
ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、
５０％ ホルムアミド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
プレハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、（
ａ）で作成した放射性ＤＮＡプローブを添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション
処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄液（７５ｍＭ 塩化
ナトリウム，７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）で５０℃、１０分間
洗浄後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルムに重ね、−
７０℃で２４時間感光させた。
感光後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサ
イズを観察した。その結果、ＳａｃＩ切断による約８ｋｂのＤＮＡフラグメント上にケト
アミンオキシダーゼ遺伝子が存在することが明らかとなり、ＳａｃＩで切断した染色体Ｄ
ＮＡの８ｋｂフラグメントを用いて遺伝子ライブラリーを作成することとした。
（ｃ）遺伝子ライブラリーの作成
（１）の操作で得られたネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを制
限酵素ＳａｃＩで切断し、アガロース電気泳動で約８ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し
た。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳａｃＩで切断した後、アルカリフォスファタ
ーゼで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９と、ＤＮＡライゲーションキット（タカラ
バイオ製）で連結させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイ
オ製）を形質転換して５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（ベクトンデッキン
ソン製）にて培養することで、約５，０００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子
ライブラリーとした。
（ｄ）コロニーハイブリダイゼーションによるケトアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡ
断片保持組換え大腸菌のスクリーニング
（ｃ）により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ製：バイオダ
インＡ）にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定
した。このＤＮＡを固定したメンブレンを（ｂ）に示したハイブリダイゼーション溶液に
浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーション行った。プレハイブリダイゼーション
後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、（ａ）で作成した放射性ＤＮＡ
プローブを添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーションを１晩行った。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブレンを（ｂ）に示した５０℃の洗浄液で１０分間洗浄後、自然乾燥
した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルムに重ね、−７０℃で２４時間感光させた。
感光後フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを８個確認した。
（ｅ）組み換えプラスミドの抽出とケトアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
（ｄ）で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
含有ＬＢ液体培地（ベクトンデッキンソン製）１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪
培養した後、プラスミドを抽出した。その結果、８個のコロニー由来のプラスミドは同じ
染色体ＤＮＡ断片を含むものであった。このプラスミドのうちの１つについて、挿入され
た染色体断片のなかに、ＦＯＤ９２３の遺伝子と相同性を有する領域を確認し、ＦＯＤ４
７４の遺伝子の塩基配列を決定した。決定したＦＯＤ４７４の遺伝子の塩基配列とそのコ
ードするアミノ酸配列を配列番号９に示した。
【００３９】
（３）ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼを発現する
大腸菌の作製
ＦＯＤ４７４を大腸菌で発現させるため、ＦＯＤ４７４遺伝子の開始コドンＡＴＧ上に
制限酵素ＢｓｐＨＩの配列を付加したＰ４１プライマー（配列番号１０）、およびケトア
ミンオキシダーゼ遺伝子の終止コドン直後に制限酵素ＳａｃＩを付加した相補配列を有す
るＰ４２プライマー（配列番号１１）を合成した。
続いて、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｐ４１
とＰ４２をプライマーとしてＰＣＲを２５サイクル行い、ＦＯＤ４７４遺伝子を含む約１
．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＢｓｐＨＩとＳａｃＩで切断し、Ｎｃｏ
ＩとＳａｃＩで切断したｐＰＯＳ２に組み込み、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモ
ーター下流にケトアミンオキシダーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ４
７４を作製した。またこのプラスミドをＸｂａＩとＳａｃＩで切断して得られるＦＯＤ４
７４遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１１９に組み込んで、プラ
スミドｐ１１９−ＦＯＤ４７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２）を作成し、塩基配列の解
析を行い、ＰＣＲによる変異が発生していないことを確認した。得られたｐＰＯＳＦＯＤ
４７４で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換しＦＯＤ４７４を発現する大腸菌ＦＡＯＤ４７４を
作製した。
なお、プラスミドｐ１１９−ＦＯＤ４７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２）は、２００
４年２月２４日、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業
技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
Ｐ４１ ＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴ
ＣＣＴＣ（配列番号１０）
Ｐ４２ ＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧ
ＣＴＴＣ（配列番号１１）
【００４０】
（４）ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼの製造
大腸菌ＦＡＯＤ４７４を用いて、上記のＦＯＤ９２３と同様に行った。また、ＦＯＤ４
７４活性測定試薬および方法も上記のＦＯＤ９２３と同様に行った。
[参考例：カーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来の
ケトアミンオキシダーゼ、ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４由来のケトアミンオ
キシダーゼ、フザリウム．オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファー
マ製）の基質特異性]
反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５Ｕ／ｍｌ パ
ーオキシダーゼ、２ｍＭ 基質）２００μｌに酵素液２０μｌを添加し、３７℃で５分間
反応させた後、０．５％ ＳＤＳを０．５ｍｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度（Ａ１）を
測定し、基質を含まない反応液で同様の操作を行って測定した吸光度（Ａｂ）との差（Ａ
１−Ａｂ）から反応性を測定した。用いるＦＯＤ９２３、ＦＯＤ４７４、フザリウム．オ
キシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製：以下、ＦＯＤ２ともい
う）酵素液の濃度、用いた基質、吸光度差（Ａ１−Ａｂ）および相対活性（％）を表３に
示した。
【００４１】
[参考例：アンギオテンシン変換酵素によるＦＶＨＬからフルクトシルバリンの遊離反応]
ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来アンギオテンシン変換酵素（シグマ製：以下ＡＣＥ
Ｐという）とｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ由来アンギオテンシン変換酵素（シグマ製：以下Ａ
ＣＥＲという）を酵素溶解液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．３）、３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で２０Ｕ／ｍｌになるように溶解し、ＡＣＥＰ液とＡＣＥＲ液を作製した。つぎ
に２ｍＭのＦＶＨＬ（ペプチド研究所製）溶液が２０μｌ入ったチューブ３本にそれぞれ
酵素溶解液、ＡＣＥＰ液、ＡＣＥＲ液を２０μｌづつ添加し、３７℃で１時間反応させた
後、発色液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ２、０．０２ｍＭ ＤＡ−６４）２
００μｌを加えて３７℃で５分間反応させた後、０．５％ＳＤＳを５００μｌ加えて発色
反応を停止させて７３０ｎｍの吸光度を測定した。同様に２ｍＭのＦＶＨＬ溶液のかわり
に蒸留水でも同様な反応を行い、また４０μｌのＦＶ溶液（０、５、１０、２０，５０μ
Ｍ）に発色液２００μｌを加えて同様の測定を行い検量線を作成することで、ＡＣＥＰ、
ＡＣＥＲがＦＶＨＬからＦＶを遊離する量を測定した。ＦＶの検量線でＦＶ（μＭ）と吸
光度差は、それぞれ５μＭで０．０１９、１０μＭで０．０３３、２０μＭで０．０６５
、５０μＭで０．０１５４であったが、ＡＣＥＰの反応によるＦＶ遊離を示す吸光度差は
−０．００６であり、ＡＣＥＲの反応によるＦＶ遊離を示す吸光度差は０．０００であっ
た。これらの結果から、ＡＣＥＰおよびＡＣＥＲはＦＶＨＬからＦＶを通常の反応におい
てほとんど遊離しないことがわかった。また、４０μｌのサンプル（２５μＭ ＦＶ、１
０Ｕ／ｍｌ ＡＣＥＲ）に発色液を添加して同様の測定を行ったときの吸光度差が０．０
６２であったことから、ＡＣＥＲが発色液での発色反応をほとんど阻害しないことがわか
る。
【００４２】
【表３】
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング（ｐＨ７．５）
ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチド
を切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法を示す。９６穴プレートにおいてスクリー
ニング対象サンプルを１０μｌずつ３箇所のウエルに入れた後、１箇所目にα液５０μｌ
、２箇所目にβ液５０μｌ、３箇所目に対照液を５０μｌを入れてから、３７℃で６０分
保温した後、蒸留水５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放置した後にマイク
ロプレートリーダー（バイオラッド製 ｍｏｄｅｌ ５５０）で主波長５５０ｎｍ、副波
長５９５ｎｍで吸光度を測定し、α液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差
に比べて、β液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差が大きいものを選ぶこ
とで目的のプロテアーゼをスクリーニングした。サンプルはカルボキシペプチダーゼＢ（
シグマ製）、カルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬工業製）、カルボキシペプチダーゼＹ
（オリエンタル酵母工業製）、プロテアーゼ（タイプＸＸＶＩＩ ナガーゼ：シグマ製）
、プロテアーゼ（タイプＶＩＩＩ ズブチリシンカールスベルグ：シグマ製）、プロテア
ーゼ（タイプＸＸＩＶ バクテリアル：シグマ製）、プロテイネースＫ（和光純薬工業製
）、ニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、カルボキシペプチダーゼＡ
（和光純薬工業製）、サーモライシン（和光純薬工業製）および蒸留水を用いた。また、
発色液による発色の度合いを確認するために１ｍＭのＦＶＨ（ペプチド研究所製）および
１ｍＭのＦＶＬ（ペプチド研究所製）を１０μｌウエルに入れた後、対照液５０μｌを入
れ３７℃で６０分保温した後、蒸留水５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放
置した後に上記と同様に測定した。その結果を表４および表５に示した。カルボキシペプ
チダーゼＢ、カルボキシペ
プチダーゼＷ、ニュートラルプロテイネース、サーモライシンが、ｐＨ７．５においてヘ
モグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的
に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチドを切
り出すプロテアーゼであることがわかる。
＜α液＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ α糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜β液＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ β糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜対照液＞
５０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
＜発色液＞
１００ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．０９％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０６％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）
１５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
１８．７５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
（ＴＯＤＢ：Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン）
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
〔実施例２〕
ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング（ｐＨ３．５）
ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなくヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチドを
切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法をしめす。９６穴プレートにおいてスクリー
ニング対象サンプルを１０μｌずつ３箇所のウエルに入れた後、１箇所目にα液５０μｌ
、２箇所目にβ液５０μｌ、３箇所目に対照液を５０μｌを入れてから、３７℃で６０分
保温した後、ｐＨ調整液５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放置した後にマ
イクロプレートリーダー（バイオラッド製 ｍｏｄｅｌ ５５０）で主波長５５０ｎｍ、
副波長５９５ｎｍで吸光度を測定し、α液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光
度差に比べて、β液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差が大きいものを選
ぶことで目的のプロテアーゼをスクリーニングした。サンプルはカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（シグマ製）、カルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬工業製）、カルボキシペプチダー
ゼＹ（オリエンタル酵母工業製）、プロテアーゼ（タイプＸＸＶＩＩ ナガーゼ：シグマ
製）、プロテアーゼ（タイプＶＩＩＩ ズブチリシンカールスベルグ：シグマ製）、プロ
テアーゼ（タイプＸＸＩＶ バクテリアル：シグマ製）、プロテイネースＫ（和光純薬工
業製）、ニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、および蒸留水を用いた
。また、発色液による発色の度合いを確認するために１ｍＭのＦＶＨ（ペプチド研究所製
）および１ｍＭのＦＶＬ（ペプチド研究所製）を１０μｌウエルに入れた後、対照液５０
μｌを入れ３７℃で６０分保温した後、ｐＨ調整液５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室
温で３０分放置した後に上記と同様に測定した。その結果を表６に示した。カルボキシペ
プチダーゼＢが、ｐＨ３．５に
おいてヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチド
を実質的に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプ
チドを切り出すプロテアーゼであることがわかる。
＜α液＞
５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ α糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜β液＞
５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ β糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜対照液＞
５０ｍM 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
＜ｐＨ調整液＞
１００ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）
（ＣＡＰＳ：３−シクロヘキシルアミノプロパンスルフォニックアシッド：同仁化学研究
所製）
＜発色液＞
１００ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．０９％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０６％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）
１５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
１８．７５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
（ＴＯＤＢ：Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン）
【００４７】
【表６】
【００４８】
〔実施例３〕
微生物からのヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング
各種微生物をＤｉｆｃｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（ベクトン
デッキンソン製）、ＭＭ培地（２．５％マンノース、２．５％ビール酵母エキス、ｐＨ７
．０）、ＹＰＧ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、２％酵母エキス、０．１％リ
ン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、ｐＨ７．０）で２８〜３
０℃、１〜７日間振盪培養し、培養液から遠心分離により菌体を除去して培養上清を得た
。得られた培養上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈して
サンプルとし、実施例１と同様に測定をした。ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで培養した微生物の結
果を表７に、ＭＭ培地で培養した微生物の結果を表８に、ＹＰＧ培地で培養した微生物の
結果を表９（ただし、表９は副波長を測定していない）に示す。
【００４９】
【表７】
【００５０】
【表８】
【００５１】
【表９】
【００５２】
〔実施例４〕
バチラス．エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）由来のプロテアー
ゼの精製方法と理化学的性質
１５０ ｍｌのＤｉｆｃｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（ベクト
ンデッキンソン製）を入れた５００ｍｌ容三角フラスコ４本でバチラス．エスピー ＡＳ
Ｐ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）を２８℃、３日間振盪培養した後、培養液から
遠心分離により菌体を除き培養上清（７７ｍＵ／ｍｌ、５６０ｍｌ）を得た。この培養上
清に硫酸アンモニウム２１０ｇとパーライト（東興パーライト工業製）８．４ｇ加えて撹
拌した後に径９０ｍｍの濾紙Ｎｏ．５Ａ（東洋濾紙製）で濾過することで析出したプロテ
アーゼを捕集し、続いてこの析出物を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で懸
濁した後径９０ｍｍの濾紙５Ａ（東洋濾紙製）で濾過することでプロテアーゼ活性を含む
濾液（２１５ｍＵ／ｍｌ、９０ｍｌ）を得て、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）５Ｌに透析をした。透析済みプロテアーゼ液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャム製）のカラム（２
６φｘ９４ｍｍ）に吸着させた後、０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌのグラジエントで溶出さ
せてプロテアーゼ活性を含む画分（２１７ｍＵ／ｍｌ、５４ｍｌ）を得た。この画分に１
Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した後、１Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−
４Ｂ（アマシャム製）のカラム（１５φｘ１５０ｍｍ）に吸着させた。その後、１Ｍ硫酸
アンモニウム、０％エチレングリコールから０Ｍ硫酸アンモニウム、２０％エチレングリ
コールのグラジエントで溶出させた後プロテアーゼ活性を含む画分（２３７ｍＵ／ｍｌ、
１８ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００００ＭＷＣＯ（ミリポア製）で濃縮して
精製プロテアーゼ（１３．９Ｕ／ｍｌ、０．４２ｍｌ）を得た。なお、本プロテアーゼの
活性測定試薬および方法を以下に記載する。
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
２ｍＭ 塩化カルシウム
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ ＴＯＯＳ
５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ
５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
０．２５ｍＭ 基質
＜測定方法＞
測定試薬０．２ｍｌを試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの
酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後、０．５％のＳＤＳを０．５ｍｌ添加して
反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクと
して酵素液の代わりに蒸留水で同様の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この吸光
度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた
。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量と
した。ただし、基質はβ糖化ペンタペプチドを用いた。
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
実施例４に記載の＜測定方法＞において、ＦＯＤ９２３の濃度を５０Ｕ／ｍｌに変更し
、基質として０．２５ｍＭのβ糖化ペンタペプチド、０．２５ｍＭのα糖化ペンタペプチ
ド、０．０３ｍＭのＦＶＨ、０．０３ｍＭのＦＶＬ、０．０３ｍＭのＦＶを用いて測定し
た。また、これと同様の測定をＦＯＤ９２３にかえてＦＯＤ２を用いて行った。さらにま
た、比較のためにニュートラルプロテアーゼ（東洋紡製）においても同様の測定を行った
。得られた吸光度差（Ａａ−Ａｂ）を表１０に示した。本プロテアーゼがニュートラルプ
ロテアーゼ（東洋紡製）と同様にα糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプ
チドを切り出すことなくβ糖化ペンタペプチドからＦＶＨを切り出していることがわかる
。
【００５３】
【表１０】
（２）至適ｐＨ
実施例４に記載の測定法において５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）のかわりに
５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０、８．５）、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０
、６．５、７．０）、５０ｍＭのクエン酸−クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５、６．０、
６．５）を用いて、０．２５ｍＭの基質を０．１ｍＭのβ糖化ペンタペプチドにして測定
をした結果を図２に示す。ｐＨ６．０付近が至適であることがわかる。
（３）ｐＨ安定性
酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５、８．０、８．５）および５０ｍＭのＰ
ＩＰＥＳ（ｐＨ６．０、６．５、７．０）中で５０℃、２０分間処理し、その残存活性を
測定した。その結果を図３に示す。
（４）至適温度
プロテアーゼ溶液２０μｌを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍ
Ｍ 塩化カルシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭ βペンタペプチ
ド）１００μｌに添加し、３０，３７，４２，５０，５５，６０，６５℃の各温度で１０
分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌ加えて反応を停止させた。その後、発色
液（０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５０Ｕ／ｍｌ パー
オキシダーゼ、１０．５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３）９５μｌ添加して３７℃５分間反応さ
せ、続いて０．５％ ＳＤＳを０．５ｍｌ添加してから５５５ｎｍの吸光度を測定するこ
とで至適温度を測定した。結果を図４に示す。
（５）熱安定性
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）中にプロテアーゼを入れ、４、３７、５０、
６０、７０℃の各温度で１０分間処理した後に残存活性を測定した。結果を図５に示す。
（６）分子量
３５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
３２７２１Ｄａ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析）
【００５４】
〔実施例５〕
エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０ 菌株由来のプロテアーゼの培養方法、
精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコ１０本に１００ ｍｌのＹＰＧ培地（２．０％グルコース、
１．０％ポリペプトン、２．０％酵母エキス、０．１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ ７．０）を入れ、殺菌後、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢ
ＲＣ３８２０を植菌し、３０℃、２日間振盪培養した。
＜精製方法＞
得られた培養液を遠心分離して培養上清に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え、遠心分離した上清を４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた ０．１ Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で平衡化した Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ (３０
φ×１５０ ｍｍ, 東ソー製) のカラムに供与した。１０％飽和になるように硫酸アンモ
ニウムを加えた ０．１ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で洗浄を行い、０．１ Ｍ
トリス塩酸 緩衝液（ｐＨ ７．３）で溶出した。その溶出液の活性画分を５０ ｍＭ トリ
ス塩酸 緩衝液（ｐＨ ７．３）で透析した後、同緩衝液で平衡化した ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (３０φ×１５０ ｍｍ, アマシャム製) のカラムに
供与し、０ から ０．５ Ｍ までの ＮａＣｌ のリニアグラジエントで溶出した。その溶
出液の活性画分に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４０％ 飽和硫酸
アンモニウムを加えた０．１ Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で平衡化した Ｂｕｔ
ｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（１８φ×１５０ ｍｍ, 東ソー製） のカラムに供
与し、４０％ から ０％ までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出した
。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製プロテアーゼを得た。精製の過程を表
１１にまとめた。
本酵素の活性は次のようにして測定した。β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるよ
うに溶解した１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍ
のセルに入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分
間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチ
ピリン、パーオキシダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミン
オキシダーゼ１０Ｕを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））０．５ｍｌを加
え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５０
ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとして基質を含まない各種緩衝
液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブラン
クの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００５５】
【表１１】
＜理化学的性質＞
（１）作用
本発明のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼのα糖化ペ
ンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用は表１２の通りである。反応時の各基
質濃度を ０．２５ｍＭ とし、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロ
テアーゼ（１．０Ｕ）を加えて３０℃で５〜６０分間反応させ、反応液をプロテインシー
ケンサー(島津製)に供与し、プロテアーゼの作用により生成したペプチドのＮ末端アミノ
酸配列を決定した。
その結果、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼはα糖化
ペンタペプチドには作用せず、β糖化ペンタペプチドのヒスチジンとロイシンの間のペプ
チド結合を切断し、ＦＶＨとロイシル-トレオニル-プロリン（ＬＴＰ）を生成した。
（２）至適ｐＨ
β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるように溶解したｐＨ３．０〜１１．０の各種
緩衝液（ｐＨ３〜５は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５〜７は１００ｍＭのクエン酸緩衝
液、ｐＨ７〜９は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１１は１００ｍＭのホウ酸緩
衝液）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．
０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯ
ＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・ク
ラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼ１０Ｕを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添
加して反応を停止させ、波長５５０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブラ
ンクとして基質を含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａ
ｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵
素活性を求めた。その結果を図６に示した。
（３）ｐＨ安定性
酵素液を１０ｍＭの各種緩衝液中で４℃、２４時間処理し、その残存活性を本酵素の＜
精製方法＞で記載した活性測定法に従って測定した。その結果を図７に示した。
（４）至適温度
β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるように溶解した１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ、１５〜７０℃で５分間予備加
温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後氷中で冷却した
後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシ
ダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼ１０Ｕ
を含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた
後、０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５０ｎｍにおける吸光
度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない各種緩衝液を加え、同様
の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａ
ｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。１５〜７０℃の範囲で変化させて
至適温度を求めた結果を図８に示した。
（５）熱安定性
酵素液を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度３０分間加熱処理した
後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図９に示した。
（６）分子量
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ-２００Ｇ（６．０φ×３００ ｍｍ、ワイエムシー製）に
よるゲル濾過から本酵素の分子量を求めた。標準蛋白質として牛血清アルブミン、オボア
ルブミン、大豆トリプシンインヒビター（全てシグマ製）を使用した。その結果、分子量
は約３３,０００であった。
Ｌａｅｍｍｌｉの方法での １０％ ｇｅｌ による ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ドデシル硫酸
ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、分子量は約 ３３,０００ であっ
た。尚、標準蛋白質は ＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード Ｌｏｗ （バイオラッド製）を使
用した。
以上の結果から、本発明のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテ
アーゼは単量体であることが明らかである。
（７）Ｎ末端部分アミノ酸配列
前記方法に従って、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０培養液から得た精
製酵素を蒸留水に溶解し、Ｎ末端配列シークエンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）
を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号１２に示すようになった。得られたＮ末
端部分アミノ酸配列をもとに、既知のプロテアーゼとの相同性を検索した結果、エアロモ
ナス・ヒドロフィラ由来エラスターゼと９８％の相同性を示した。
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly（配列番
号１２）
（８）部分アミノ酸配列
前記方法に従って、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０培養液から得た精
製酵素の凍結乾燥品６０μｇを用い、「マイクロシークエンスのための微量タンパク質精
製法、ｐ４８−５２、羊土社（１９９２年）」に準じて、酵素の断片を得て、その配列を
決定した。即ち、５０μｌの４５ｍＭジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処理
を行い、５μｌの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。続いて、１
４０μｌの蒸留水を加え、１．０μｇエンドプロテーナーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ・ダイ
アグノスティックス製）を添加後、３７℃、一晩インキュベートした。その断片化した酵
素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエン
サー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号
１３，１４に示すようになった。得られた２つの部分アミノ酸配列はいずれもエアロモナ
ス・ヒドロフィラ由来エラスターゼのアミノ酸配列と完全に一致した。
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His（配列番号１３）
Phe Gly Asp Gly Ala Thr（配列番号１４）
以上のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼの性質を表１
２にまとめた。
【００５６】
【表１２】
【００５７】
〔実施例６〕
リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）菌株
由来のプロテアーゼの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜精製方法＞
実施例５で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対
して透析し、精製プロテアーゼを得た。精製の過程を表１３にまとめた。活性測定法も実
施例５と同様に行った。
【００５８】
【表１３】
＜理化学的性質＞
（１）作用
本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのα糖化ペ
ンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用は表１４の通りである。実施例５の（
１）で記載した方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６
由来プロテアーゼのα糖化ペンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用を調べた
結果、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼはα糖化ペンタ
ペプチドには作用せず、β糖化ペンタペプチドのヒスチジンとロイシンの間のペプチド結
合を切断し、ＦＶＨとＬＴＰを生成することがわかった。
（２）至適ｐＨ
実施例５の（２）に記載した方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−
３６６由来プロテアーゼの至適ｐＨを調べた結果を図１０に示した。
（３）ｐＨ安定性
実施例５の（３）に記載に方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのｐＨ安定性を調べた結果を図１１に示した。
（４）至適温度
実施例５の（４）に記載の方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適温度を調べた結果を図１２に示した。
（５）熱安定性
実施例５の（５）に記載の方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの熱安定性を調べた結果を図１３に示した。
（６）分子量
実施例５の（６）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
子量を求めた結果、分子量は約３５,０００であった。
以上の結果から、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテ
アーゼは単量体であることが明らかである。
（７）Ｎ末端部分アミノ酸配列
前記方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６培養液から得た精
製酵素を蒸留水に溶解し、Ｎ末端配列シークエンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）
を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号１５に示すようになった。
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln Tyr Glu Tyr Gly Thr
（配列番号１５）
（８）部分アミノ酸配列
前記方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６培養液から得た精
製酵素の凍結乾燥品６０μｇを用い、常法（マイクロシークエンスのための微量タンパク
質精製法、ｐ４８−５２、羊土社、１９９２年）に準じて、酵素の断片を得て、その配列
を決定した。即ち、５０μｌの４５ｍＭジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処
理を行い、５μlの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。つづいて
１４０μｌの蒸留水を加え、１．０μｇエンドプロテーナーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ・ダ
イアグノスティックス製）を添加後、３７℃、一晩インキュベートした。その断片化した
酵素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエ
ンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）を用いて解析した。得られた配列は次の配列番
号１６、１７に示すようになった。
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala（配列番号１６）
Phe Gly Asp Gly Ala Thr（配列番号１７）
以上のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼの性質を表１
４にまとめた。
【００５９】
【表１４】
【００６０】
〔実施例７〕
遺伝子改変によるＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼの取得
＜カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼの変異ライブラリー
の構築＞
ＦＯＤ９２３の変異ライブラリーの構築はＤＮＡポリメラーゼの誤読を利用したエラー
プローンＰＣＲにより作成した。エラープローンＰＣＲは上記参考例に記載のｐＰＯＳＦ
ＯＤ９２３を鋳型とし、Ｐ５１プライマー及びＰ５２プライマー（次の配列番号１８及び
１９に示す）を用いてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（アマシャム製）で塩
化マグネシウムを終濃度２．５ｍＭになるよう添加して行なった。サイクル条件は９４℃
×４０秒→５５℃×３０秒→７２℃×１分；２５サイクルで行った。
Ｐ５１ ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴ（配列番号１８
）
Ｐ５２ ＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣ（
配列番号１９）
増幅されたＰＣＲ産物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ−キット（アマシャム製）を用いて精製した。
この精製されたＰＣＲ産物０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｃＩで消化した後、
エタノール沈殿により回収した。一方、０．５μgのｐＰＯＳＦＯＤ９２３も同じ制限酵
素で消化し、ケトアミンオキシダーゼ遺伝子を含まない２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動により分離し、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ-キットを用いて回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキット（東
洋紡製）にて前述の両ＤＮＡ断片を１６℃にて３０分間反応させて結合し、大腸菌ＪＭ１
０９のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地に塗布し、コロニーが１〜２ｍｍ程度に生育するまで３７℃で静置培養
した。
＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞
９６穴マイクロプレートにあらかじめ滅菌しておいた発現用培地（３％のソルビトール
、１．５％のポリペプトン，１．５％の酵母エキス、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
み、ｐＨ７．０に調整した培地）１００μｌを加え、そこに生育した形質転換体を接種し
、３０℃で一晩培養した。培養終了後、培養液から５μｌずつ９６穴プレートの２つのウ
エルに分注し、測定試薬（１ｍＭ ＦＶＨまたはＦＺＫ、 ０．０２％ ＴＯＯＳ、 ０．
０２％ ４-アミノアンチピリン、１０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼを含む５０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））５０μｌを加え、３０℃で１０〜６０分間反応させた。０．
５％ ＳＤＳを１５０μｌ添加して反応を停止させ、マイクロリーダー（バイオラッド製
ｍｏｄｅｌ４５０）で５５０ｎｍの吸収を測定した。
構築した変異ライブラリーより、ＦＶＨには作用するが、ＦＺＫへの作用が低下したケト
アミンオキシダーゼを生産している組換え体を選抜した。スクリーニングの結果、優良変
異株として９２３−Ｆ１及び９２３−Ｆ２を得た。これらの変異株の有するケトアミンオ
キシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定したところ、表１５−１に示したような塩基に変異が
導入されていた。
【００６１】
【表１５−１】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼの基質特異性の確認＞
選抜した１株のコロニーをＬＢ培地（５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを含む）５ｍｌに
植菌し、３０℃，２０時間振盪培養を行った。培養終了後の培養液から遠心分離により菌
体を集菌し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに菌体を懸濁させ、超音波
破砕により菌体の可溶化を行った。この可溶化液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０分
間）し、その上清をケトアミンオキシダーゼ粗酵素液とした。これらの粗酵素液を用いて
ＦＶＨとＦＺＫを基質として＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼ
のスクリーニング＞で記載した活性測定方法に従って特異性（ＦＺＫへの活性のＦＶＨへ
の活性に対する相対活性、以後ＦＺＫ／ＦＶＨと示す）を求めた。その結果、表１５に示
したように９２３−Ｆ１と９２３−Ｆ２のＦＺＫ／ＦＶＨはそれぞれ０．２４と０．０２
５であり、変異型酵素はＦＺＫへの作用が大きく低下したといえる。
＜有効変異箇所の特定＞
前述した基質特異性の改良に影響した有効変異箇所を特定するために表１５に示した点
変異が導入された変異型ケトアミンオキシダーゼを以下に示す方法により作成した。
１）変異型酵素９２３−Ｆ３３０Ｌと９２３−Ｆｒｏ２は、図１４に示したプラスミドｐ
ＰＯＳＦＯＤ９２３の制限酵素地図を基に、野生型もしくは変異型酵素９２３−Ｆ２の遺
伝子を表１５に示した制限酵素で処理し、目的とする変異箇所を含む断片を切り出し、同
じ制限酵素で処理した他方のプラスミドに挿入し、得られたプラスミドを用いて形質転換
した大腸菌から取得した。
２）変異型酵素９２３−Ｉ５８Ｖは目的とする変異を含む領域を変異プライマーＰ５３と
Ｐ５４（配列番号２０，２１に示す）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片を表１５に示
した制限酵素で処理し、同じ制限酵素で切断したpＰＯＳＦＯＤ９２３に挿入し、得られ
たプラスミドを用いて形質転換した大腸菌から取得した。これらの変異型酵素を＜ＦＺＫ
への作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞で記載した測定法
で評価した結果を表１５に示した。アミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）のバリ
ンへの置換、または６２番のアルギニン（Ｒ６２）のヒスチジンへの置換がＦＺＫに対す
る活性の低減に有効であることが分った。
Ｐ５３ ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣ（配列番
号２０：ｐＰＯＳ２のマルチクローニングサイト下流のＸｂａＩサイトを含む）
Ｐ５４ ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＣ
ＡＡＧＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴ（配列番号２１：ＦＯＤ９２３において
５８Ｉ→Ｖとなるような変異を含む配列番号１記載の６３７番目から６９４番目の配列の
相補配列）
＜有効変異アミノ酸残基の点変異試験＞
効果の高いアミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）を他のアミノ酸に置換し、有
効な点変異型ケトアミンオキシダーゼの検索を試みた。Ｐ５３（配列番号２０）と（表１
５−２）に示した配列をもつプライマー（Ｐ５５〜Ｐ６４）とを用いて、＜有効変異箇所
の特定＞の２）に示す方法で変異株を作成した。得られた変異型酵素のＦＶＨに対するＦ
ＺＫの活性を＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニン
グ＞で記載した方法で測定した結果を（表１５−２）に示した。
【００６２】
【表１５−２】
アミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）のバリンへの置換の他に、スレオニン、ア
スパラギン、システイン、セリン、アラニンへの置換がＦＺＫに対する活性の低減に有効
であることが分かった。
＜変異型ケトアミンオキシダーゼの製造＞
変異型ケトアミンオキシダーゼの精製は参考例に記載の方法と同様の方法で行い製造し
た。
本発明の変異型フルクトシルアミノキシダーゼの各種基質に対する特異性は表１６の通
りである。なお、反応時の各基質濃度は１ｍＭ とし、その他の反応条件は＜ＦＺＫへの
作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞で記載した活性測定方
法に従った。９２３−Ｆ２（以後、ＦＯＤ９２３Ｍともいう）はＦＶに対して最も高い反
応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＺＫ、ＦＶＬに対しては、それぞれ２
．５%、０．５%とＦＶＨと比較してごくわずかであり、本酵素はＦＺＫやＦＶＬへ実質的
に作用しない酵素であるといえる。
【００６３】
【表１６】
＜ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼの変異型＞
ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４ 由来ケトアミンオキシダーゼ（ＦＯＤ４
７４）は、ＦＯＤ９２３を含むケトアミンオキシダーゼと高い相同性があり、図１に示し
たように、ＦＯＤ９２３のＩ５８を含むＮ末端側領域のアミノ酸配列が高く保存されてい
る。ｐＰＯＳＦＯＤ４７４を用い、ＦＯＤ４７４のＩ５８を異なるアミノ酸(トレオニン)
に置換したＦＯＤ４７４変異株４７４−Ｆ１を獲得した。表１７にはＦＯＤ４７４及び４
７４−Ｆ１の各種基質に対する特異性を示す。ＦＯＤ４７４においてもＦＶＨに対する基
質特異性が改良されたことから、他の菌種由来のケトアミンオキシダーゼにおいても５８
番目アミノ酸領域はＦＶＨに対する基質特異性に強く関与する部位であると考えられる。
【００６４】
【表１７】
【００６５】
〔実施例８〕
ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３、ＦＯＤ４７４、ＦＯＤ９２３ＭのＦＶＨ、ＦＺＫ
への作用のｐＨ依存性
反応液（５０ｍＭ 緩衝液、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％ ４−ア
ミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、２ｍＭ 基
質）２００μｌに酵素液２０μｌを添加し、３７℃５分間保温後、０．５％ ＳＤＳを５
００μｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度を測定した。緩衝液はＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．
５、８．０、８．５）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０、６．５、７．０）、Ｂｉｓｔｒｉｓ−
塩酸（ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５）を用いて測定し、基質を含まない反応液を
用いて同様に吸光度を測定し、基質にＦＶＨとＦＺＫとを用いたときのそれぞれの吸光度
差、用いた酵素液の酵素濃度を表１８に記載した。基質にＦＶＨとＦＺＫとを用いたとき
の（ＦＺＫ／ＦＶＨ）で表される相対活性（％）を表１９に示した。ｐＨ６付近でＦＶＨ
に対する特異性が著しく向上することがわかる。
【００６６】
〔実施例９〕
ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３Ｍの基質特異性
＜参考例：カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来
のケトアミンオキシダーゼ、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来のケトアミン
オキシダーゼ、フザリウム．オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファ
ーマ製）の基質特異性＞で記載した方法と同様に測定した。結果を表３に示した。
【００６７】
【表１８】
【００６８】
【表１９】
【００６９】
〔実施例１０〕
＜ヘモグロビンＡ１ｃの測定＞
まず検量線を作製するために、光路長１ｃｍのセルの中でＦＶＨ添加ヘモグロビンＡ１
ｃ標準液３６μｌにＲ１（−プロテアーゼ）を３２４μｌおよびＲ２を９０μｌ加えて３
７℃で２００秒保温した後にＲ３を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温し、続いてＲ４
を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温する。その過程でＲ２を加えて１８０秒後の７３
０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｓ）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ２ｓ）
、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｓ）を測定する。また、同様にＦ
ＶＨ未添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液においても同様の操作を行い、Ｒ２を加えて１８０
秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｓｂ）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度
値（Ａ２ｓｂ）、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｓｂ）を測定する
。吸光度差ΔＡｓ＝（Ａ３ｓ−Ａ２ｓ）−（Ａ３ｓｂ−Ａ２ｓｂ）とＦＶＨ濃度との関係
から図１５の検量線を作製した。
次に、低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液３６μｌにＲ１（＋プロテアーゼ）を
３２４μｌ加え３７℃で６０分保温した後にＲ２を９０μｌ加えて、光路長１ｃｍのセル
の中において３７℃で２００秒保温した後にＲ３を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温
し、続いてＲ４を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温する。その過程でＲ２を加えて１
８０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度
値（Ａ２）、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３）を測定する。また、
同一サンプルでＲ１（＋プロテアーゼ）のかわりにＲ１（−プロテアーゼ）を用いた以外
は上記と同一の操作をして、Ｒ２を加えて１８０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｂ）
、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ２ｂ）、Ｒ４を加えて９０秒後の７
３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｂ）を測定する。低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液に
おけるヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化の量は吸光度差ΔＡ＝（Ａ３−Ａ２）−（Ａ３ｂ−
Ａ２ｂ）と、ＦＶＨ濃度と吸光度の関係から得ることができ、表２０に示すように理論値
と測定値が良く一致していることがわかる。なお、吸光度差ΔＡε＝（Ａ２−Ａ１）−（
Ａ２ｂ−Ａ１ｂ）は糖化ヘモグロビン中のリジン残基のε−アミノ基が糖化されている量
と比例するものと考えられる。
＜Ｒ１（＋プロテアーゼ）＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
２ｍＭ 塩化カルシウム
２．１ｋＵ／ｍｌ バチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）
＜Ｒ１（−プロテアーゼ）＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
２ｍＭ 塩化カルシウム
＜Ｒ２＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
６．３５ｍＭ ＷＳＴ３（同仁化学研究所製）
０．０８ｍＭ ＤＡ−６４（和光純薬工業製）
２５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
（ＷＳＴ−３：２−（４−イオドフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−
（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＤＡ−６４：Ｎ−（カルボキ
シメチルアミノカルボニル）−４，４‘−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）
＜Ｒ３＞
５００Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ２
＜Ｒ４＞
５００Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
＜低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
市販凍結乾燥品ヘモグロビン測定用キャリブレーター（デタミナーコントロールＨｂＡ１
ｃ用：協和メデックス製）低値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＪＤＳ値）：５．６％）を
蒸留水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解して作製。
なお、臨床検査 ４６（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式（ＪＤＳ値）
＝０．９２５９（ＩＦＣＣ値）＋１．６６９７よりヘモグロビンＡ１ｃ値（ＩＦＣＣ値）
：４．２％と換算される。よって、ヘモグロビンがα鎖２本、β鎖２本からなる４量体で
分子量６４５５０であるとすると、この標準液の糖化されたβ鎖Ｎ末端の濃度は理論値と
して０．００５２ｍＭとなる。
＜高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
市販凍結乾燥品ヘモグロビン測定用キャリブレーター（デタミナーコントロールＨｂＡ
１ｃ用：協和メデックス製）高値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＪＤＳ値）：１０．２％
）を蒸留水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解して作製。
なお、臨床検査 ４６（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式（ＪＤＳ値）
＝０．９２５９（ＩＦＣＣ値）＋１．６６９７よりヘモグロビンＡ１ｃ値（ＩＦＣＣ値）
：９．２％と換算される。よって、ヘモグロビンがα鎖２本、β鎖２本からなる４量体で
分子量６４５５０であるとすると、この標準液の糖化されたβ鎖Ｎ末端の濃度は理論値と
して０．０１１４ｍＭとなる。
＜ＦＶＨ添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
上記の低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液にＦＶＨ（ペプチド研究所製）を０．０３０ｍＭ
および０．０１５ｍＭになるように添加して作製。
＜ＦＶＨ未添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
上記の低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液を用いる。
【００７０】
〔実施例１１〕
＜プロテアーゼ反応時間とヘモグロビンＡ１ｃの測定値の関係＞
実施例１０での低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液におけるプロテアーゼ反応の
時間を３０分から３６０分まで変化させ、得られるヘモグロビンＡ１ｃの測定値を図１６
に示した。これは実施例１０での測定値が理論値と一致したのはプロテアーゼ反応の時間
を６０分に限定したことにより偶然得られたものではなく、プロテアーゼ反応の時間が３
０分から３６０分において経時的にほぼ安定しており、真の糖化ヘモグロビンの糖化され
たβ鎖Ｎ末端の量を本測定法により測定していることを示すものである。
【００７１】
〔実施例１２〕
１）バチラス・エスピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）による糖化ヘモ
グロビン分解反応におけるｐＨの影響評価
１−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイネース（東洋紡製））３２４μｌに２０ｍ
Ｍ ＷＳＴ３を３０．４μｌと糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌを添加してから６０秒
後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、０．１６ｍＭ
ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐ
Ｈ調製液１５μｌを加え、さらに５０秒後に１５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ２を１０μｌ加え
、さらに２５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ加えて、１５０秒間反応さ
せた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行い、７３０ｎｍの吸光度をモニターし
ておき、ＦＯＤ２を加えてから２４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加えてから１４０秒
後の吸光度の差（Ａ１）を求めた。測定スキームを図１７に示した。
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の
操作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。また０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐＨ調製液
１５μｌをＲ２反応液を加えた後ではなく糖化ヘモグロビンを添加する前に加える以外は
同様の操作を行うことでブランク反応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができた。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは
「測定値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。なお、ＥＤ
ＴＡはプロテアーゼの反応を停止または阻害するために添加した。ｐＨ調製液はケトアミ
ンオキシダーゼＦＯＤ２およびＦＯＤ９２３反応時にｐＨが約７．５になる目的で添加し
、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製
液の組み合わせ、および測定結果を表２１に示した。
１−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイネース（東洋紡製））３２４μｌに２０ｍ
Ｍ ＷＳＴ３を３０．４μｌ添加し、さらに糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌを添加し
てから６０秒後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、
０．１６ｍＭ ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａを５μｌとｐＨ調製液１５μｌを加え、さらに５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２
３を５μｌ加えて、１５０秒間反応させた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行
い、７３０ｎｍの吸光度をモニターしておき、０．５Ｍ ＥＤＴＡとｐＨ調製液を加えて
から４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加えてから１４０秒後の吸光度の差（Ａ１）を求
めた。測定スキームを図１８に示した。
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の
操作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。また０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐＨ調製液
１５μｌをＲ２反応液を加えた後ではなく糖化ヘモグロビンを添加する前に加える以外は
同様の操作を行うことでブランク反応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができた。これ
らの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは「測定
値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。なお、ＥＤＴＡは
プロテアーゼの反応を停止または阻害するために添加した。ｐＨ調製液はケトアミンオキ
シダーゼＦＯＤ２およびＦＯＤ９２３反応時にｐＨが約７．５になる目的で添加し、Ｒ１
およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組
み合わせ、および測定結果を表２１に示した。
【００７２】
【表２０】
（２）バチラス．エスピーＡＳＰ８４２由来のプロテアーゼによる糖化ヘモグロビン分解
反応におけるｐＨの影響評価
２−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ａ）のＲ１反応液において１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）のかわりに０．８５Ｕ／ｍｌになるようにバチラス．エスピーＡＳＰ
８４２由来のプロテアーゼを入れ、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤
と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組み合わせを表２２で示したものを用い、１−ａ）
と同様の操作を行った。測定結果を表２２に示した。
２−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ｂ）のＲ１反応液において１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）のかわりに０．８５Ｕ／ｍｌになるようにバチラス．エスピーＡＳＰ
８４２由来のプロテアーゼを入れ、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤
と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組み合わせを表２２で示したようにして１−ｂ）と
同様の操作を行った。測定結果を表２２に示した。
（３）リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来のプロテアーゼによる糖化ヘ
モグロビン分解反応におけるｐＨの影響評価
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、０．４３Ｕ／ｍｌ リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来のプロテア
ーゼ）に２０ｍＭ ＷＳＴ３を３０．４μｌと糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌと蒸留
水５μｌを添加してから６０秒後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パ
ーオキシダーゼ、０．１６ｍＭ ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に
ｐＨ調製液１５μｌを加え、５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ加えて、
１５０秒間反応させた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行い、７３０ｎｍの吸
光度をモニターしておき、ｐＨ調整液を加えてから４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加
えてから１４０秒後の吸光度の差（Ａ１）を求めた。測定スキームを図１９に示した。
【００７３】
【表２１】
【００７４】
【表２２】
【００７５】
【表２３】
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の操
作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。またＲ１反応液に入れるプロテアーゼをあらかじ
め９５℃で１０分間処理して失活させたものを用いて同様の操作を行うことでブランク反
応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができる。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは
「測定値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。
Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製
液の組み合わせを表２３で示したようにして実施例１２の１−ｂ）と同様の操作を行った
。測定結果を表２３に示した。
なお、糖化ヘモグロビンサンプルとしては５．９ｍｇ／ｍｌで換算ＩＦＣＣ値１６．７
％のもの（糖化されたβ鎖Ｎ末端濃度の理論値は３０．５μＭとなる）を用いた。表２１
〜２３の結果からプロテアーゼ反応時のｐＨが５．０〜６．０においてはプロテアーゼが
糖化ヘモグロビンからＦＯＤ９２３が作用することができる糖化リジンを含むペプチドを
切り出さず、ＦＯＤ２による消去なく特異的にＦＶＨ量（糖化ヘモグロビンの糖化された
β鎖Ｎ末端の量）を正確に測定でき、つまりヘモグロビンＡ１ｃ量を正確に測定できたこ
とがわかる。
【００７６】
〔実施例１３〕
特異性の高い変異型ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３Ｍを用いたプロテアーゼによ
る糖化ヘモグロビン分解産物中のＦＶＨの測定
１−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ａ）において、Ｒ１反応液の緩衝液をＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
、界面活性剤を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭ
とし、５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ添加する代わりに、３２Ｕ／ｍｌのＦＯＤ
９２３Ｍを５μｌ添加すること以外は同様の操作をして測定したところ、ＦＶＨの測定値
は２８．６μＭであった。
１−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ｂ）において、Ｒ１反応液の緩衝液をＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
、界面活性剤を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭ
とし、５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ添加する代わりに、３２Ｕ／ｍｌのＦＯＤ
９２３Ｍを５μｌ添加すること以外は同様の操作をして測定したところ、ＦＶＨの測定値
は３０．０μＭであった。。
以上のことから、ｐＨ７．５つまりプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから糖化リジンお
よび糖化リジンを含むペプチドを切り出してくるような条件においても特異性の高いケト
アミンオキシダーゼを用いることで、ＦＯＤ２による消去なく特異的にＦＶＨ量（糖化ヘ
モグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端の量）を測定でき、つまりヘモグロビンＡ１ｃ量を正
確に測定できることがわかる。
【００７７】
[寄託生物材料への言及]
（１）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１５年２月１２日（原寄託日）
平成１６年4月１２日（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９
（２）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２００４年2月２４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
（３）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１６年１月３０日（原寄託日）
平成１６年4月１２日（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
（４）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２００４年2月２４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２
【産業上の利用可能性】
【００７８】
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定す
る方法、測定試薬キットを提供することが可能となる。
【受託番号】
【００７９】
（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
（３）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
（４）ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに酵素を用いて特
異的に測定する方法、測定試薬キット、該特異的測定に用いることができるプロテアーゼ
、その製造方法、そのスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いることができるケト
アミンオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、中でもヘモグロ
ビンＡ１ｃは近年の研究により７％以下に値を管理すれば合併症の発症および進展の危険
率を有意に低下させることが証明され、臨床の現場では無くてはならない指標として多用
されている。ヘモグロビンＡ１ｃの定量法としては、通常、電気泳動法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、免疫法及び酵素法が知られてい
る。しかしながら電気泳動法、クロマトグラフィー法は高価な専用装置を必要とするうえ
に処理速度が遅く、多数の検体を処理する臨床検査には適していない。また免疫法は分
析方法が比較的簡単で時間も短時間で済むことから近年急速に広まってきたが、抗原抗体
反応を用いる為に、再現性や共存物質の影響の点で必ずしも精度が良くない点が問題とな
っている。
他方、酵素法は専用装置が不必要であり、処理速度が速く、高精度、簡便、安価な定量
方法として提案されている（特許文献１：特開平８−３３６３８６号公報、特許文献２：
国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特許文献３：特開２００１−９５５９８号
公報、特許文献４：特開２０００−３００２９４号公報、非特許文献１：Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３））。
しかし、ヘモグロビンは分子内リジンのε−アミノ基とαおよびβ鎖Ｎ末端のバリンの
α−アミノ基とに糖化を受けうるが、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の
バリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるから（非特許文献２Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４０（
１）：７８−８９（２００２）において国際的に標準とされる定義）、糖化ヘモグロビン
の糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せずにプロテアーゼおよびケトアミンオキシダーゼを
用いて特異的に測定するためには、プロテアーゼ、ケトアミンオキシダーゼのどちらかの
酵素反応、または両方の酵素反応において特異性が必要とされる。
具体的には、糖化ヘモグロビンには分子内リジン、α鎖Ｎ末端、β鎖Ｎ末端の３種の糖
化部位があることから、糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを測定するためには、以下のように特
異性にしたがった組み合わせが必要となる。
すなわち、、プロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミンオキシダーゼを（Ｋ１）
〜（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ３）または
（Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ１）または（Ｋ
２）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（
Ｋ５）と（Ｋ４）＞の組み合わせが必要となる。
それぞれに分類された酵素の性質は以下の通りである。
（Ｐ１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す（Ｐ２）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端から
のみ糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す（Ｐ３）糖化ヘモグロビンの糖
化されたβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部位からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す（Ｐ４）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端およ
び分子内リジンを含む部位から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す（Ｋ
１）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸およ
び／または糖化ペプチドにのみ作用する（Ｋ２）組み合わせて用いるプロテアーゼにより
糖化ヘモグロビンから切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖
化されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用
する（Ｋ３）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来および分子
内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する（Ｋ
４）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化され
たαおよびβ鎖Ｎ末端由来および分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／ま
たは糖化ペプチドに作用する（Ｋ５）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグ
ロビンから切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ
鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドには作用せずに分子内リジンを
含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用する。
しかし、これまで糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからケトアミンオキシダ
ーゼの基質となる糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを生じさせるプロテアーゼは
特開平８−３３６３８６号公報、国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特開２０
０１−９５５９８号公報、特開２００１−５７８９７号公報、国際公開第００／５０５７
９号パンフレット、国際公開第００／６１７３２号パンフレットおよびＣｌｉｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３）など知られているが、
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントから糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸
または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドを切り出すといった特異性を示した記載はない。
また、特開２０００−３００２９４号公報で記載されているアンギオテンシン変換酵素
についてもその公知の基質特異性からβ鎖Ｎ末端糖化トリペプチドに作用する可能性は推
定されるが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すことを具体的に示すような記載、例え
ばα鎖Ｎ末端糖化トリペプチドとβ鎖Ｎ末端糖化トリペプチドに対するアンギオテンシン
変換酵素の特異性を定量して示した記載はない。
また、特開２０００−３００２９４号公報では糖化ヘモグロビンからβ鎖Ｎ末端糖化ト
リペプチドを生成させる際用いたトリプシン、プロリン特異エンドプロテアーゼ、カルボ
キシペプチダーゼＰが分子内リジンを含む部位や糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ
酸または糖化ペプチドを生成していないことを示した記載もない。
さらにまた、本発明者らはアンギオテンシン変換酵素が通常の反応条件においてはβ鎖
Ｎ末端糖化トリペプチドからフルクトシルバリンをほとんど切り出さないことを確認して
おり、アンギオテンシン変換酵素がα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプ
チドを切り出すプロテアーゼであるとは言えない。
以上のように、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、つまり、上記（Ｐ１）または（
Ｐ３）の特異性をもつプロテアーゼ、もしくは上記（Ｐ１）または（Ｐ３）の特異性を達
成するように工夫されたプロテアーゼの反応条件はこれまで知られていなかった。
また、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化ア
ミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化ア
ミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼ、つまり、上記（Ｐ１）また
は（Ｐ３）の性質をもつプロテアーゼのスクリーニング法としては、一般的に次のような
ものが想定される。すなわち、糖化ヘモグロビンをα鎖Ｎ末端が糖化されたものとβ鎖Ｎ
末端が糖化されたものとに分離し、これらを基質として用いたときにβ鎖Ｎ末端が糖化さ
れたものからのみ選択的に糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテア
ーゼを、プロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作
用するケトアミンオキシダーゼなどの酵素を用いて、発色を指標に探すというスクリーニ
ング方法である。しかし、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化割合は約５％程度と
糖化率が低いために、α鎖Ｎ末端が糖化されたもの又はβ鎖Ｎ末端が糖化されたものに分
離する収率が極めて悪いのみならず、これらの物質を基質として該プロテアーゼ活性を検
出することはヘモグロビンの赤色ゆえに検出も困難であった。このように、簡便で有効な
スクリーニング方法はこれまで知られていなかった。
一方、ケトアミンオキシダーゼについては、以下のものがある。
１）フザリウム属（特開平７−２８９２５３号公報）、ギベレラ属、カンジダ属（特開
平６−４６８４６号公報）、又はアスペルギルス属由来（国際公開第９７／２００３９号
パンフレット）のであって、おもにε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジン（以下、
ＦＫともいう）もしくはそれを含むペプチドとフルクトシルバリン（以下、ＦＶともいう
）に作用するもの、
２）コリネバクテリウム属（特開昭６１−２８０２９７号公報）、ペニシリウム属（特
開平８−３３６３８６号公報）、トリコスポロン属由来（特開２０００−２４５４５４号
公報）であって、おもにＦＶに作用するもの、
また、一般にプロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドからＦＶを切り
出す工程は一般に反応がほとんど進行せず大量の酵素で長時間の反応が必要といった欠点
があるのでその欠点を補うために、ヘモグロビンＡ１ｃを測定する際に用いるケトアミン
オキシダーゼとして、プロテアーゼによりヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドから切り
出された糖化ペプチドにも作用するものが必要とされていた。そして、そのような
３）コリネバクテリウム由来のケトアミンオキシダーゼの変異型（特開２００１−９５
５９８号公報）やアカエトミエラ属、アカエトミウム属、チエラビア属、カエトミウム属
、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属（欧州特
許出願公開第１２９１４１６号明細書）の１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−
ヒスチジン（以下、ＦＶＨともいう）に作用するケトアミンオキシダーゼが近年報告され
ている。
しかし、１）に属するケトアミンオキシダーゼは（Ｋ４）の性質のものであり、２）に
属するケトアミンオキシダーゼは（Ｋ２）の性質のものであるがＦＶＨに作用するという
記載はなく、３）に属するケトアミンオキシダーゼは、ＦＫに対する作用が最も低いユー
ペニシリウム属のケトアミンオキシダーゼにおいてもＦＶＨに対する作用を１００％とし
たときに９．７８％もＦＫに対して作用する（欧州特許出願公開第１２９１４１６号明細
書）ことから、プロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された分子内リジンを含
む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに十分に作用すると考えられ、ま
たプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖
化ペプチド、例えば１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（以下、ＦＶ
Ｌともいう）に対する作用は記載されていないため、（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ
３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼであるとは言えない。
以上のように、これまで（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３
）の性質のケトアミンオキシダーゼはこれまで報告されていなかった。
また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質のケトアミンオキシダーゼ
を既知のケトアミンオキシダーゼをアミノ酸置換、欠失、挿入などにより改変することで
、作製することが考えられるが、酵素の一次構造上のどのアミノ酸残基がＦＫもしくはＦ
ＺＫに対する作用の低減に寄与しているのかは分っていない。従って、任意のケトアミン
オキシダーゼ遺伝子を改変し、ＦＫもしくはε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）（以下、ＦＺＫともいう）に対する活性の低減を図
ることはこれまでできなかった、つまり、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用す
る性質のケトアミンオキシダーゼを改変によって作製することは知られていなかった。
また、ＦＶＨに作用することのできるケトアミンオキシダーゼの反応条件を工夫するこ
とで、ＦＫもしくはＦＺＫへの活性をＦＶＨへの活性と比較して、その比率を低減させる
ことは知られていなかった。
プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンに存在するβ鎖Ｎ末
端のバリンのα−アミノ基の糖化を明確に分別して測定するためには、プロテアーゼとケ
トアミンオキシダーゼの特異性を前述のように組み合わせる必要があるが、特開平８−３
３６３８６号公報、国際公開第９７／１３８７２号パンフレット、特開２００１−９５５
９８号公報およびＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４
（２００３）においてはヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を特異的に測定していると
いう記述もなく、ＨＰＬＣ法で得られた値もしくは得られうる値と開示された酵素法によ
る測定値とが良い相関を示すという記載があるのみである。そして、用いたプロテアーゼ
とケトアミンオキシダーゼの特異性には言及することなく単にプロテアーゼで糖化ヘモグ
ロビンを分解することにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドをケ
トアミンオキシダーゼにより検出しており、分子内リジンのε−アミノ基とαおよびβ鎖
Ｎ末端のバリンのα−アミノ基が糖化されたものを混合して検出していると考えられる。
さらに、特開２００１−９５５９８号公報においてはプロテアーゼとＦＶＨに作用するケ
トアミンオキシダーゼを用いて実施例において糖化ヘモグロビンを測定しているが、操作
において遠心分離を行っており、分離操作なく測定できるとの記載はない。
特開２０００−３００２９４号公報においてはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンのα−
アミノ基が糖化されたものだけを特異的に測定する酵素法が提案されている。この方法に
おいてはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端から３番目のロイシンのカルボキシル基側を切断できる
プロテアーゼ、次いでｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−ＬｅｕよりＨｉｓ−Ｌｅｕ
を切り取ることができるプロテアーゼで順次処理することでフルクトシルバリンを生成さ
せ、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンのα−アミノ基が糖化された量を特異的に測定する
としている。しかし、この方法はプロテアーゼ反応を２段階で行う必要があり、第１段階
でのヘモグロビンβ鎖Ｎ末端から３番目のロイシンのカルボキシル基側を切断するプロテ
アーゼ反応を厳密に制御することが困難である、第２段階のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化
ペプチドからα−糖化アミノ酸を切り出す工程は一般に反応がほとんど進行せず大量の酵
素で長時間の反応が必要である、といった欠点がある上に実施例において示される方法は
煩雑な限外ろ過という分離操作を２回行っており、本願発明の方法で糖化ヘモグロビンの
糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず特異的に測定できるという記載はない。
欧州特許出願公開第１２９１４１６号明細書においてはヘモグロビンＡ１ｃなどの糖化
タンパク質をモルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（キッコーマン販売）、カルボ
キシペプチダーゼＹ、プロチンＰ（大和化成販売）といったプロテアーゼによりＦＶＨを
遊離させ、ＦＶＨに作用しうるオキシダーゼで測定する方法が提案されている。そして、
プロテアーゼにより生成するＦＫが問題となる場合はＦＫに作用するフルクトシルアミン
オキシダーゼで消去してからＦＶＨに作用しうるオキシダーゼで測定する、またはＦＶＨ
に作用してＦＫに作用しにくいオキシダーゼを用いて測定することが提案されている。し
かし、糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端由来による糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドとの区別については言及されておらず、提案された方法により糖化ヘモグロ
ビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を測定した実施例も明示されておらず、提案された方法が分
離操作不要で可能であるとの記載もない。
上記のような糖化ヘモグロビンに関する測定法はこれまで知られていたが、糖化ヘモグ
ロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法および
試薬キットはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平８−３３６３８６号公報
【特許文献２】国際公開第９７／１３８７２号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特開２０００−３００２９４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（２）：２６９−２７４（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを、分離操作せずに特
異的に測定できる方法、測定試薬キット、該特異的測定に用いることができるプロテアー
ゼ、その製造方法、そのスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いることができるケ
トアミンオキシダーゼを提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、まず、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントのα
鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、β鎖Ｎ末端の
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法
を考案した。すなわち、糖化ヘモグロビンのα鎖Ｎ末端およびβ鎖Ｎ末端に存在する糖化
ペプチドをプロテアーゼの基質として用いることで、糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖
Ｎ末端からケトアミンオキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質
的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端からケトアミンオキシダーゼの基質となる
糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼ活性の検出方法を考案
した。
次に、考案したスクリーニング方法により、α鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドからケトア
ミンオキシダーゼの基質となる糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すこと
なく、β鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドからケトアミンオキシダーゼの基質となる糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼを広くスクリーニングした結果
、バチラス・エスピー由来ニュートラルプロテイナーゼ（東洋紡製）などの市販プロテア
ーゼ製剤やバチラス・エスピー、エアロモナス・ヒドロフィラ、リゾバクター・エンザイ
モゲネスなどの微生物が産生するプロテアーゼに当該プロテアーゼ反応を見出した。
加えて、これらのプロテアーゼのうち、エアロモナス・ヒドロフィラ、リゾバクター・
エンザイモゲネスが産生するプロテアーゼは既知のエラスターゼと相同性を示した。従来
、エラスターゼは、その基質特異性としてロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンの
Ｃ末端側のペプチド結合を切断する酵素として知られている。本発明では、エラスターゼ
が1−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオ
ニル−Ｌ−プロリン（以下、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドともいう）のロ
イシンのＣ末端側ではなく、Ｎ末端側のペプチド結合を切断し、ＦＶＨを遊離することを
はじめて明らかにした。
次に、当該プロテアーゼが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された
α鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末
端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すのみならず、糖化ヘモグロビ
ン若しくはそのフラグメントからＦＫおよび／またはＦＫを含む糖化ペプチドをも切り出
す場合においては、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ペプチドに作用せずにＦＫおよび／
またはＦＫを含む糖化ペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼであらかじめＦＫおよ
び／またはＦＫを含む糖化ペプチドを消去することで糖化ヘモグロビン若しくはそのフラ
グメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法を完
成するに至った。
さらに、当該プロテアーゼが、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化され
たα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ
末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すのみならず、糖化ヘモグロ
ビン若しくはそのフラグメントからＦＫおよび／またはＦＫを含むペプチドをも切り出す
場合において、ケトアミンオキシダーゼのＦＺＫに対する反応性が大きく低減できる反応
条件を見出し、また、ＦＶＨに対する作用を１００％としたときＦＺＫに対する作用が５
％以下というこれまでにない高特異性のケトアミンオキシダーゼを作製して用いることに
より、糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
のみを特異的に測定できた。すなわち、カーブラリア・クラベータ由来ケトアミンオキシ
ダーゼ遺伝子の５８番目と６２番目のアミノ酸置換がＦＺＫへの作用低減に寄与している
ことを発見し、これにもとづき該オキシダーゼを作製し用いることで、糖化ヘモグロビン
若しくはそのフラグメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せずに酵素を用いて特異的
に測定する方法を完成するに至った。
さらにまた、当該プロテアーゼによる糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメント分解
の反応条件について、
ｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用することの
できるＦＫおよび／またはＦＫを含む糖化ペプチドを切り出さない、かつ、
ｉｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用すること
のできる糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出さない、
かつ、
ｉｉｉ）当該プロテアーゼと組み合わせて用いるケトアミンオキシダーゼが作用するこ
とのできる糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す、反
応条件を見出した。これにより、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化され
たβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定する方法を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端から、糖化アミノ酸または糖化ペプチ
ドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミ
ノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、プロテアーゼ。
（２）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端を含むフラグメントから、糖化アミノ
酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖
Ｎ末端を含むフラグメントから糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す、プ
ロテアーゼ。
（３）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化
ペプチドを切り出す反応を１００％としたときに糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末
端から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す反応が１０％以下である、プロテアー
ゼ。
（４）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端又は糖化ヘモグロビンの糖化されたβ
鎖Ｎ末端を含むフラグメントから切り出される糖化ペプチドが１−デオキシフルクトシル
−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンである上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプロテアー
ゼ。
（５）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端又は糖化ヘモグロビンの糖化されたα
鎖Ｎ末端を含むフラグメントから実質的に切り出されない糖化アミノ酸が１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリンであり、実質的に切り出されない糖化ペプチドが１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシンである上記（１）〜（４）のいずれかに記載のプ
ロテアーゼ。
（６）リゾバクター属由来のプロテアーゼである上記（１）〜（５）のいずれかに記載
のプロテアーゼ。
（７）バチラス．エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）又はエア
ロモナス．ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼである上記（１）〜（５
）のいずれかに記載のプロテアーゼ。
（８）プロテアーゼがメタロプロテアーゼ、ニュートラルプロテアーゼ、またはエラス
ターゼのいずれかである上記（１）〜（７）のいずれかに記載のプロテアーゼ。
（９）タンパク質又はペプチドにおけるロイシンのＮ末端側のペプチド結合を切断する
エラスターゼ。
（１０）リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
）菌株。
（１１）バチラス・エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）菌株。
（１２）上記（６）に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、以下の（ａ）及び
（ｂ）の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
（ａ）リゾバクター属に属する菌を培養液にて培養する。
（ｂ）培養液からプロテアーゼを抽出する。
（１３）上記（７）に記載のプロテアーゼを製造する方法であって、以下の（ａ）及び
（ｂ）の工程を含むプロテアーゼを製造する方法。
（ａ）バチラス・エスピーＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）又はエアロモ
ナス・ヒドロフィラＮＢＲＣ３８２０を培養液にて培養する。
（ｂ）培養液からプロテアーゼを抽出する。
（１４）以下の（Ａ）の性質を有するケトアミンオキシダーゼ。
（Ａ）ε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）
に対する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応
性に比べて５％以下であること。
（１５）さらに以下の（Ｂ）及び（Ｃ）の性質を有する上記（１４）に記載のケトアミ
ンオキシダーゼ。
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列
で構成されること。
（Ｃ）配列番号１記載のアミノ酸配列において少なくとも５８番目もしくは６２番目のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換されていること。
（１６）（Ｃ）のアミノ酸置換は５８番目がバリン、スレオニン、アスパラギン、シス
テイン、セリン、アラニン、６２番目がヒスチジンへの置換である上記（１５）に記載の
ケトアミンオキシダーゼ。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載のケトアミンオキシダーゼのアミノ
酸配列をコードする遺伝子。
（１８）上記（１７）に記載の遺伝子を含有するケトアミンオキシダーゼ発現ベクター
。
（１９）上記（１８）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（２０）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せず酵素を用いて特異
的に測定する方法。
（２１）酵素が（ｉ）プロテアーゼを含む上記（２０）に記載の測定方法。
（２２）酵素はさらに（ｉｉ）ケトアミンオキシダーゼを含む上記（２１）に記載の測
定方法。
（２３）以下の（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）の反応工程を経由して特異的に測定
する上記（２２）に記載の測定方法。
（ｉｉｉ）（ｉ）のプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから実質的に、（ｉｉ）のケトアミ
ンオキシダーゼが作用するε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε
−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを含む糖化ペプチドを切り出すことなく、糖化
ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からから糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
を切り出す反応工程。
（ｉｖ）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼのε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）に対する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ
−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応性の３０％以下となる反応工程。
（２４）（ｉｉｉ）の反応工程がｐＨ５．０〜６．０の反応条件下である上記（２３）
に記載の測定方法。
（２５）（ｉｖ）の反応工程がｐＨ５．５〜６．５の反応条件下である上記（２３）又
は（２４）に記載の測定方法。
（２６）（ｉ）のプロテアーゼが上記（１）〜（８）のいずれかに記載のプロテアーゼ
である、上記（２１）〜（２５）のいずれかに記載の測定方法。
（２７）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末
端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用
するケトアミンオキシダーゼである上記（２２）〜（２６）のいずれかに記載の測定方法
。
（２８）ケトアミンオキシダーゼがカーブラリア属由来である上記（２７）に記載の測
定方法。
（２９）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが以下の（ａ）及び（ｂ）の２種類である
上記（２２）〜（２８）のいずれかに記載の測定方法。
（ａ）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用するケトアミンオキシダーゼ。
（ｂ）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドに実質的に作用することなく、ε−１−デオキシ
フルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを
含む糖化ペプチドには作用するケトアミンオキシダーゼ。
（３０）（ａ）のケトアミンオキシダーゼがカーブラリア属由来である及び／又は（ｂ
）のケトアミンオキシダーゼがフザリウム属由来である上記（２９）に記載の測定法。
（３１）（ｉｉ）のケトアミンオキシダーゼが上記（１４）〜（１６）のいずれかに記
載のケトアミンオキシダーゼである、上記（２２）〜（２６）のいずれかに記載の測定法
。
（３２）糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化
アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖
化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼをスクリーニングする方
法であって、長さが３アミノ酸から２０アミノ酸であるヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプ
チドおよび長さが３アミノ酸から２０アミノ酸であるヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチ
ドを用いるスクリーニング方法。
（３３）ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよびヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプ
チドの長さが５アミノ酸である上記（３２）に記載のスクリーニング方法。
（３４）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに特異的に測定す
る、以下の（ｉ）、（ｉｉ）を含んでなる試薬キット。
（ｉ）プロテアーゼ
（ｉｉ）上記（１４）に記載のケトアミンオキシダーゼ
【発明の効果】
【０００７】
このような本発明によれば、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを分離操作
せず特異的に測定できる方法、測定試薬キット、該特異的測定に用られるプロテアーゼ、
該プロテアーゼの製造方法若しくはスクリーニング方法、及び該特異的測定に用いること
ができるケトアミンオキシダーゼを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ケトアミンオキシダーゼのアミノ酸配列における相同性を示す図である。
【図２】図２は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３】図３は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図４】図４は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図５】図５は、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図６】図６は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図７】図７は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図８】図８は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図９】図９は、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図１０】図１０は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１１】図１１は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１２】図１２は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適温度を示す図である。
【図１３】図１３は、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図１５】図１５は、吸光度差ΔＡｓとＦＶＨ濃度との関係を示す図である。
【図１６】図１６は、プロテアーゼ反応の時間と得られる測定値との関係を示す図である。
【図１７】図１７は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【図１８】図１８は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【図１９】図１９は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解後、糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチド由来のシグナルを消去することなくＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合の測定スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
＜アマドリ化合物＞
本発明に於けるアマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基をもつ化合物とグルコー
ス等のアルデヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、生じる一般式−（ＣＯ）−Ｃ
ＨＲ−ＮＨ−（Ｒは、水素原子か水酸基を示す）で表されるケトアミン構造を有する化合
物のことを指す。アマドリ化合物には糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンのような糖化タ
ンパク質やペプチドが糖化された糖化ペプチド等が含まれる。
【００１０】
＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことをさし、α鎖及
びβ鎖Ｎ末端のバリンのα−アミノ基や分子内のリジンのε−アミノ基が糖化されている
と言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとは糖化ヘモグロビンが分解されるこ
とでできるペプチドのことをいう。
【００１１】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
国際的に標準とされる定義において、ヘモグロビンＡ１ｃとはヘモグロビンβ鎖Ｎ末端
のバリンのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンであるとされている（Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６（５
）：２９９−３０８（１９９８））。
【００１２】
＜特異的に＞
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を特異的に測定するといった表現は、糖化ヘ
モグロビンの糖化量を測定して得る値のうち、８０％以上、望ましくは９０％以上、更に
望ましくは９５％以上が、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にあるバリンのα−アミノ基の糖化由
来である場合に用いる。
【００１３】
＜糖化アミノ酸、糖化ペプチド＞
プロテアーゼが糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたα鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、といった表現のなかで
の糖化アミノ酸とは１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンであり、糖化ペプチドとはヘ
モグロビンのα鎖Ｎ末端から長さが２０アミノ酸以下のペプチドであってＮ末端のバリン
が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンになっているもののうちプロテアーゼと組み合
わせて用いるケトアミンオキシダーゼにより検出されるもののことであり、例えばカーブ
ラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシ
ダーゼを組み合わせて用いる場合は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシ
ンのことである。
プロテアーゼが糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化されたβ鎖Ｎ末端か
ら糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す、といった表現のなかでの糖化アミノ酸と
は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリンであり、糖化ペプチドとはヘモグロビンのβ鎖
Ｎ末端から長さが２０アミノ酸以下のペプチドであってＮ末端のバリンが１−デオキシフ
ルクトシル−Ｌ−バリンになっているもののうちプロテアーゼと組み合わせて用いるケト
アミンオキシダーゼにより検出されるもののことである。例えば、カーブラリア・クラベ
ータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを組み合
わせて用いる場合は１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンのことであ
る。プロテアーゼが糖化ヘモグロビンからε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを
含む糖化ペプチドを切り出す、といった表現における糖化ペプチドとは長さが５０アミノ
酸以下の糖化ペプチドのことである。
なお、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）は、平
成１５年２月１２日、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
【００１４】
＜実質的に＞
プロテアーゼ反応において、糖化されたα鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸または糖化ペプチ
ドを実質的に切り出すことなく糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖
化ペプチドを切り出す、といった表現は、糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドを切り出す反応性を１００％としたときに、糖化されたα鎖Ｎ末端
から糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す反応性が１０％以下、望ましくは１％以
下、更に望ましくは０．１％以下であることを言う。ただし、上記プロテアーゼ反応は切
り出された生成物をケトアミンオキシダーゼ好ましくはカーブラリア・クラベータＹＨ９
２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼまたはフザリウム・
オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製）を用いて検出するこ
とによるものとする。
ケトアミンオキシダーゼ反応において、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより
切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに実質的に作用することなくε−
糖化アミノ酸には作用する、といった表現は、ε−糖化アミノ酸に対する反応性を１００
％とした場合に、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ
酸および／または糖化ペプチドに対する反応性が１０％以下、好ましくは８％以下、さら
に好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下であることを言う。また、ケトアミ
ンオキシダーゼ反応においてε−糖化アミノ酸に実質的に作用することなく糖化されたβ
鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド
には作用する、といった表現は、糖化されたβ鎖Ｎ末端からプロテアーゼにより切り出さ
れた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに対する反応性を１００％とした場合に、
ε−糖化アミノ酸に対する反応性が８％以下、望ましくは１％以下、更に望ましくは０．
１％以下であることを言う。ただし、ケトアミンオキシダーゼの反応は生成する過酸化水
素を検出することによるものとする。
【００１５】
＜ケトアミンオキシダーゼ＞
ケトアミン構造をもつ化合物に作用して過酸化水素を発生させる酵素のことで、別名フ
ルクトシルアミンオキシダーゼともいう。
【００１６】
＜ε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン）に対
する反応性が１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンに対する反応性に
比べて５％以下であるケトアミンオキシダーゼ＞
ケトアミンオキシダーゼのε−１−デオキシフルクトシル−（α−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−リジン）（以下、ＦＺＫともいう）に対する反応性が１−デオキシフルクト
シル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（以下、ＦＶＨともいう）に対する反応性に比べて５
％以下であるとは、反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯ
Ｓ、５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、２ｍＭ ＦＺＫまたはＦＶＨ）２００μｌにケトア
ミンオキシダーゼ液２０μｌを添加し、３７℃で５分間反応させた後、０．５％ ＳＤＳ
を０．５ｍｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定し、さらにＦＺＫおよびＦＶ
Ｈを含まない反応液で同様の操作を行って測定した吸光度（Ａｂ）との差（Ａ１−Ａｂ）
から反応性を測定したときに、その反応性の比率が５％以下であることをいう。
【００１７】
＜分離操作＞
分離操作とは、全血検体または血球溶血検体などをサンプルとして、サンプル中の糖化
ヘモグロビンを測定する一連の測定工程の過程において、カラムクロマトグラフィー操作
、膜ろ過操作、吸着分離操作、沈殿分離操作など糖化ヘモグロビンもしくは糖化ヘモグロ
ビンから派生する物質の純度、濃度を上げるために行う操作のことをいう。
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずに酵素を用いて特異的に測
定するためには、用いる酵素の反応において糖化ヘモグロビン中にある分子内リジン、α
鎖Ｎ末端、β鎖Ｎ末端の３種の糖化部位のうちβ鎖Ｎ末端の糖化部位のみに特異性がなけ
ればならない。そのような特異性を出すために用いる酵素としては、１種類の酵素でも複
数の種類の酵素を組み合わせたものでもよい。例えば、プロテアーゼで糖化ヘモグロビン
を分解し、切り出された糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペ
プチドに作用する酵素であるオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、キナーゼなどを組み合わ
せて特異性を出せばよい。そして、プロテアーゼおよびケトアミンオキシダーゼを用いて
糖化されたβ鎖Ｎ末端のみを測定するためには、以下のように特異性にしたがった組み合
わせが必要である。
【００１８】
すなわち、プロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミンオキシダーゼを（Ｋ１）〜
（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ２）または（Ｋ３）または（
Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ１）または（Ｋ２
）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ
５）と（Ｋ４）＞の組み合わせが必要である。それぞれに分類された酵素の性質は以下の
通りである。
（Ｐ１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および／または
糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ２）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端からのみ糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ３）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部位からの
み糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｐ４）糖化ヘモグロビンの糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端および分子内リジンを含む部
位から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す
（Ｋ１）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ２）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来の糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ３）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来および分子内リ
ジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドにのみ作用する
（Ｋ４）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
されたαおよびβ鎖Ｎ末端由来および分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および
／または糖化ペプチドに作用する
（Ｋ５）組み合わせて用いるプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出された糖化
アミノ酸および／または糖化ペプチドのうち、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドには作用せずに分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸
および／または糖化ペプチドに作用する
【００１９】
＜プロテアーゼのスクリーニング＞
そして、本発明者らは鋭意検討の結果、（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）の特異性をもつプロ
テアーゼを得るスクリーニング方法としては、ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよ
びヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドを基質として用い、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化
ペプチドを基質としたときにのみ糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すプ
ロテアーゼを選択する方法を考案した。このときに用いるα鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよび
β鎖Ｎ末端糖化ペプチドの長さは特に限定されないが、長さ３アミノ酸から２０アミノ酸
の糖化ペプチドでスクリーニング可能であることを見出した。その由来は化学合成であっ
ても良いし、糖化ヘモグロビン等の天然物由来であっても良い。
具体的な１例として、β鎖Ｎ末端糖化ペプチドとして１−デオキシフルクトシル−Ｌ−
バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−プロリン（ペプチド研究
所製：以下、β糖化ペンタペプチドともいう）を、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドとして１−デ
オキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラ
ニン（ペプチド研究所製：以下、α糖化ペンタペプチドともいう）が挙げられ、これらの
糖化ペンタペプチドを基質として用いる場合、糖化アミノ酸、糖化ジペプチド、糖化トリ
ペプチドまたは糖化テトラペプチドがプロテアーゼにより切り出される可能性がある。そ
して、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよびβ鎖Ｎ末端糖化ペプチドからプロテアーゼにより切
り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドは、α鎖Ｎ末端糖化ペプチドおよび
β鎖Ｎ末端糖化ペプチドに実質的に作用することなく切り出された糖化アミノ酸および／
または糖化ペプチドには作用する酵素を用いて検出すればよく、そのような酵素としてオ
キシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、キナーゼが挙げられる。
例えば、オキシダーゼとしてはケトアミンオキシダーゼがあり、ケトアミンオキシダー
ゼとしてはアカエトミエラ属、アカエトミウム属、チエラビア属、カエトミウム属、ゲラ
シノスポラ属、マイクロアスカス属、コニオカエタ属、ユーペニシリウム属（以上、欧州
特許出願公開第１２９１４１６号明細書）、コリネバクテリウム属（特開昭６１−２６８
１７８号明細書）、アスペルギルス属（特開平３−１５５７８０）、ペニシリウム属（特
開平４−４８７４号明細書）、フザリウム属（特開平５−１９２１９３号公報、特開平７
−２８９２５３号公報、特開平８−１５４６７２号公報）、ギベレラ属（特開平５−１９
２１５３号公報、特開平７−２８９２５３号公報、）、カンジダ属（特開平６−４６８４
６号公報、）、アスペルギルス属（特開平１０−３３１７７号公報、特開平１０−３３１
８０号公報）、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（ＮＢＲＣ７５９０）、コニオケチジ
ウム・サボリ（ＡＴＣＣ３６５４７）、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ
−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（ＮＢＲＣ３１９５０）、アルス
リニウム・ファエオスペルマム（ＮＢＲＣ６６２０）、アルスリニウム・ジャポニカム（
ＮＢＲＣ３１０９８）、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０
）、ピレノケータ・ゲンチアニコラ（ＭＡＦＦ４２５５３１）、ピレノケータ・テレスト
リス（ＮＢＲＣ３０９２９）、レプトスフェリア・ノドラム（分生子世代名フォーマ・ヘ
ンネべルギー）（ＮＢＲＣ７４８０）、レプトスフェリア・ドリオラム（ＪＣＭ２７４２
）、レプトスフェリア・マクランス（分生子世代名フォーマ・リンガム）（ＭＡＦＦ７２
６５２８）、プレオスポラ・ハーブラム（ＮＢＲＣ３２０１２）、プレオスポラ・ベタエ
（分生子世代名フォーマ・ベタエ）（ＮＢＲＣ５９１８）、オフィオボラス・ヘルポトリ
カス（ＮＢＲＣ６１５８）、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
０００９）由来のもの、およびそれらの変異型の酵素が挙げられる。
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミ
ンオキシダーゼは基質特異性がＦＶＨに対して１００％とすると１−デオキシフルクトシ
ル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（以下、β糖化トリペプチドまたはＦＶ
ＨＬともいう）に対して０．０９％、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−トレオニン（以下、β糖化テトラペプチドまたはＦＶＨＬＴ
ともいう）に対して０．０００９％、β糖化ペンタペプチドに対して０％、１−デオキシ
フルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（以下、ＦＶＬともいう）に対して３．４％、
α糖化ペンタペプチドに対して０．０１％であるから、このケトアミンオキシダーゼを用
いるとβ糖化ペンタペプチドからＦＶＨを切り出すプロテアーゼ活性およびα糖化ペンタ
ペプチドからＦＶＬを切り出すプロテアーゼ活性を検出できる。オキシダーゼを用いてプ
ロテアーゼにより切り出された糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを検出する場合
には生成した過酸化水素の量を電極、発光、蛍光、吸光などで検出することができるが、
パーオキシダーゼと色原体を用いて吸光検出することが簡便であり、例えば色原体として
４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）およびＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）をもち
いて５４０〜５７０ｎｍにおける吸光度変化を測定すればプロテアーゼ活性を簡便に確認
ができる。
上記スクリーニング方法により得られた（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）の特異性をもつプロ
テアーゼとしてバチラス属、エアロモナス属、リゾバクター属等の微生物由来のプロテア
ーゼが挙げられ、より具体的には例えばバチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
）エアロモナス・ヒドロフィラＮＢＲＣ３８２０、リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ
−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来のプロテアーゼが挙げられる。
これらの菌株のうち、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４
１）、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）
は本発明者等が新規に単離した菌株であり、バチラス・エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−０８６４１）は、２００４年２月２４日、リゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）は、平成１６年１月３０日に日本国茨城県
つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに寄託した。
寄託したこれらの菌学的性質を示すと次の通りであり、以下のように同定した。
【００２０】
１．ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）はグラム陽性の桿菌（０．８−１．０
ｘ２．０−３．０μｍ）で表１に示すような特徴により、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９８４）では、バチラス
．エスピーと同定された。
【００２１】
【表１−１】
【表１−２】
【００２２】
２． ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）はグラム陰性の好気性桿菌で大きさ
が０．４×５〜５０μｍで表２に示すような特徴により、Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９８９）では、リゾバク
ター・エンザイモゲネスと同定された。
【００２３】
【表２】
【００２４】
＜プロテアーゼの培養物からの製造＞
次に、本発明に使用しうるプロテアーゼ生産菌の培養方法およびプロテアーゼの製造方
法について述べる。本発明のプロテアーゼ生産菌の培養手段としては固体培養でも液体培
養でもよいが、好ましくはフラスコまたはジャーファーメンター等による通気液体培養で
ある。培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源として
はグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースまたはマンノースなど、窒素源
としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。培養
条件としてはｐＨ５．０〜８．０、培養温度２５〜３７℃で目的とするプロテアーゼが最
高力価または最高純度となる培養時間、例えば１６時間〜７２時間培養をすればよい。
次いで、プロテアーゼの採取について説明する。プロテアーゼが菌体外に分泌される場
合には、培養液から菌体を濾過、遠心分離等によって除くことで得られた粗製のプロテア
ーゼ含有液を用いる。また、プロテアーゼが菌体内にある場合には培養液から菌体を濾過
、遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に必要
の応じて界面活性剤、金属塩、糖類、アミノ酸、ポリオール、キレート剤などを加えて懸
濁し、リゾチーム、超音波、ガラスビーズ等によって破砕した後濾過、遠心分離などによ
り不溶物を除去して得られる粗製のプロテアーゼ含有液を用いる。これらの粗製のプロテ
アーゼ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製
されたプロテアーゼを得ることができる。例えば、アセトン、エタノールなどの有機溶媒
による分別沈殿法、硫安アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー
法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲル濾過法など
の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製プロテアーゼを得ることができ、適
宜安定化剤、例えばショ糖、グリセロールまたはアミノ酸などを１〜５０％程度、補酵素
などを０．０１〜１％程度として単独または２種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存し
てもよい。
【００２５】
＜ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞
また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつケ
トアミンオキシダーゼを得るスクリーニング法としては、例えば、プロテアーゼにより糖
化ヘモグロビンから切り出された、α鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペ
プチドの代表例としてＦＶＬを、β鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプ
チドの代表例としてＦＶＨを、分子内リジンを含む部位からの糖化アミノ酸および／また
は糖化ペプチドの代表例としてＦＫもしくはＦＺＫを用いて、それぞれに対する反応性を
指標にする方法が挙げられる。特に、ＦＫもしくはＦＺＫに対する反応性においてはＦＶ
Ｈに対する反応性の５％以下であることが指標となる。好ましくは４％以下、さらに好ま
しくは２％以下である。このようにして得られた（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに
作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとしては自然界から分離し
てきた天然型ケトアミンオキシダーゼおよび天然型ケトアミンオキシダーゼを既知の遺伝
子工学技術を利用してアミノ酸置換、欠失、挿入など人工的に改変することで得られる変
異型ケトアミンオキシダーゼ、さらに天然型および変異型のケトアミンオキシダーゼをポ
リエチレングリコ−ル誘導体、スクシニルイミド誘導体、マレイミド誘導体などを用いて
化学修飾することで得ることができるケトアミンオキシダーゼでも良い。
【００２６】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼ＞
既存のケトアミンオキシダーゼの１つもしくは複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入など
人工的に改変することで（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）
の性質をもつ変異型ケトアミンオキシダーゼを得る際に用いることができる既存のケトア
ミンオキシダーゼとしては特に限定はしない。例えば、前述の（Ｐ１）もしくは（Ｐ３）
の特異性をもつプロテアーゼを得るスクリーニング方法で述べたケトアミンオキシダーゼ
が挙げられる。
また、ＦＶＨに作用するケトアミンオキシダーゼとして、コニオカエタ属（欧州特許出
願公開第１２９１４１６号明細書）、ユーペニシリウム属（欧州特許出願公開第１２９１
４１６号明細書）、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属由来のケトアミンオキシダーゼ
が挙げられる。
そして、これらの酵素は遺伝子レベルでも解析され、その一次構造も図１に示したよう
に推定されており、これらの酵素のアミノ酸レベルでの相同性は７５％以上で、＊がつい
たところのように保存された領域が存在しているので、配列番号１記載のアミノ酸配列と
少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列で構成されるケトアミンオキシダーゼの
例としても挙げられる。また、（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（
Ｋ３）の性質をもつような変異であるならばどのようなアミノ酸を置換、欠失、挿入であ
ってもよいが、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において５８番目、６２番目に対
応するのアミノ酸のうち少なくとも１ヶ所が置換されていることが望ましく、さらに望ま
しくは５８番目に対応するアミノ酸がバリン、スレオニン、アスパラギン、システイン、
セリン、アラニンに、６２番目に対応するのアミノ酸がヒスチジンに置換されていること
である。
【００２７】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼ発現ベクター、宿主細胞＞
（Ｋ１）の性質、（Ｋ２）かつＦＶＨに作用する性質、（Ｋ３）の性質をもつ変異型の
ケトアミンオキシダーゼは、それをコードする遺伝子を必要に応じてプラスミドベクター
に連結してサッカロマイセス属、ピキア属、アクレモニウム属、バチラス属、シュードモ
ナス属、サーマス属、エシェリヒア属などの宿主微生物に移入して培養し、またはコード
する遺伝子を試験管内で転写、翻訳し、その後、公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を
用いて処理することにより得ることができる。
【００２８】
＜測定試薬キット＞
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端をプロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを
用いて分離操作せず特異的に測定する方法および試薬キットは、糖化されたβ鎖Ｎ末端に
対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミンオキシダーゼの組み合わせに加えて
パーオキシダーゼ、色原体、および必要に応じて緩衝液成分、塩類、界面活性剤、金属イ
オン、電子受容体、キレート剤、糖、アミノ酸、アスコルビンオキシダーゼ、テトラゾリ
ウム塩、ポリオール類、酵素安定化剤、酵素反応促進剤、抗菌剤、酸化剤、還元剤、補酵
素などの成分を適宜追加して構成しても良い。
糖化されたβ鎖Ｎ末端に対して特異性を得るためのプロテアーゼとケトアミンオキシダ
ーゼの組み合わせとしては、前述のようにプロテアーゼを（Ｐ１）〜（Ｐ４）、ケトアミ
ンオキシダーゼを（Ｋ１）〜（Ｋ５）に分類した場合、＜（Ｐ１）と（Ｋ１）または（Ｋ
２）または（Ｋ３）または（Ｋ４）＞、＜（Ｐ２）と（Ｋ１）または（Ｋ３）＞、＜（Ｐ
３）と（Ｋ１）または（Ｋ２）＞、＜（Ｐ４）と（Ｋ１）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（
Ｋ３）＞、＜（Ｐ３）と（Ｋ５）と（Ｋ４）＞の組み合わせであればどれでも良い。ただ
し、プロテアーゼは、一般的に、蛋白質のＮ末端のアミノ基が糖化を受けている場合、Ｎ
末端領域から糖化アミノ酸を切り出してくることは反応性が悪いため、β鎖Ｎ末端の糖化
アミノ酸より糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼが望ましい。例えば、上記のプロテア
ーゼのスクリーニングで得られた（Ｐ３）の性質であって糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶ
Ｈを切り出す性質をもつプロテアーゼとしてバチラス属、エアロモナス属、リゾバクター
属等の微生物由来のプロテアーゼが挙げられる。より具体的には、例えば、バチラス．エ
スピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ−
８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０
、リゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来の
プロテアーゼが挙げられる。また、特異性を持たせたまま反応性を向上させるために、ス
クリーニングしたプロテアーゼと他のプロテアーゼとを適宜組み合わせたものも用いるこ
とができる。
プロテアーゼによりヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出される糖化ペプチ
ドの長さは２０アミノ酸以下で、かつ、組み合わせにより用いられるケトアミンオキシダ
ーゼにて検出できるのであれば特に限定されない。例えば、カーブラリア．クラベータ
ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを用いた場合
は、プロテアーゼによりヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から切り出される糖化ペプ
チドはＦＶＨであることが望ましい。
ケトアミンオキシダーゼは、プロテアーゼと上記の組み合わせを構成できるものであれ
ばいずれでも良いが、反応性の点からβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸より糖化ペプチドを切り
出すプロテアーゼが望ましいため、（Ｋ１）〜（Ｋ５）における糖化されたβ鎖Ｎ末端由
来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドは糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ペプチ
ドであることが望ましい。例えばカーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼは、糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化ジペ
プチド（ＦＶＨ）に作用し、糖化されたα鎖Ｎ末端由来の糖化ジペプチド（ＦＶＬ）に実
質的に作用しないので（Ｋ３）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることが
できる。また、ＦＺＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の５％以下になった変異体
はこれを（Ｋ１）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることができ、フザリ
ウム．オキシスポラム由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製）を（
Ｋ５）の性質をもつケトアミンオキシダーゼとして用いることができる。
【００２９】
＜反応条件＞
プロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから糖化されたβ鎖Ｎ末端由来の糖化アミノ酸お
よび／または糖化ペプチドを切り出す反応条件は、その反応が十分に進行する条件であれ
ばいずれでも良い。例えば、ｐＨ、塩濃度、界面活性剤添加量、金属イオン添加量、反応
温度、酸化還元剤添加量、緩衝液濃度を調節することで、通常は、（Ｐ３）もしくは（Ｐ
２）の性質のプロテアーゼの特異性を高めて、（Ｐ１）の性質にするような反応条件が望
ましい。特に、（Ｐ３）の性質をもつバチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイネ
ース（東洋紡製）、バチラス・エスピー ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
）、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０、リゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）由来のプロテアーゼにおいては、組み合わ
せのケトアミンオキシダーゼとしてカーブラリア．クラベータ ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０００９）由来のケトアミンオキシダーゼを用いると、少なくともｐＨ５．０〜
６．０の反応条件において（Ｐ１）の性質のプロテアーゼとなるのでこの反応条件が望ま
しい。
ケトアミンオキシダーゼの反応条件は、その反応が十分に進行する条件であればいずれ
でも良いが、例えば、ｐＨ、塩濃度、界面活性剤添加量、金属イオン添加量、反応温度、
酸化還元剤添加量、緩衝液濃度を調節することでＦＺＫに対する反応性が３０％以下とな
る反応条件、特にｐＨ５．５〜６．５の反応条件はプロテアーゼにより切り出されたβ鎖
Ｎ末端由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドであるＦＶＨに対する特異性を高
めることができるので望ましい。
上記に示した糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せず、プロテアー
ゼとケトアミンオキシダーゼを用いて特異的に測定する方法および試薬キットにより、糖
化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を正確に測定していることは、ヘモグロビン含量
とそのヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化された割合とが正確に示されているサンプルを用
いることで確認できる。ヘモグロビン含量とヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化された割合
とが正確に示されているサンプルとしては、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４０（１）：７８−８９（２００２）
に記載の方法で測定された値（ＩＦＣＣ値）が標記されているサンプルを用いることが望
ましいが、他の方法で測定された値が標記されているサンプルにおいても臨床検査 ４６
（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式によってもＩＦＣＣ値を得ることがで
きる。また、糖化ヘモグロビンサンプルはヒト血液から、血球分離、溶血、遠心分離、透
析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の操作を適宜組
み合わせて調製しても良いし（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６（５）：２９９−３０８（１９９８））、市販
のものを購入して用いても良い。
【００３０】
＜測定対象物＞
上記に示した糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を、分離操作せずプロテアーゼ
とケトアミンオキシダーゼを用いて特異的に測定する方法および試薬キットの測定対象物
は糖化ヘモグロビンを含むものであればいずれでも良いが、例えば、全血サンプル、血球
溶血サンプル、精製ヘモグロビンサンプルが挙げられる。
次に、参考例、実施例によって本発明を説明する。
【００３１】
[参考例：カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来の
ケトアミンオキシダーゼの製法]
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）がＦＶＨに作用
するケトアミンオキシダーゼ（以下、ＦＯＤ９２３ともいう）を生産しているが生産量が
低いため以下に示すようにＦＯＤ９２３遺伝子を大腸菌において発現をさせた後、精製し
てＦＯＤ９２３を得た。
【００３２】
（１）カーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）染色体ＤＮ
Ａの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌ
を５００ｍｌ容坂口フラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、カーブラリア・クラベー
タＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）を植菌し、２５℃で４日間振盪培養した後
、Ｎｏ．２ろ紙で培養液をろ過して菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素で凍結し、
乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ ＳＤＳ、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加え、ゆっくり振盪して
溶解した。続いて、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、室温）により上清を回収し
、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、水層に残存するエー
テルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃
で３０分間放置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色
体ＤＮＡを回収し、７０％エタノールにて洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に
、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ １０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間
処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）を加え、５０℃で１時間処理し、フ
ェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回
）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。続いて７０％エタノール溶液によ
り洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解し、染色体ＤＮＡ溶液を得た
。
【００３３】
（２）ＦＯＤ９２３遺伝子断片の増幅
（ａ）ＦＯＤ９２３遺伝子断片の取得
これまでに知られているケトアミンオキシダーゼの遺伝子情報を基に下記のＰ１１およ
びＰ１２プライマーを設計した。
Ｐ１１ ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＡＣＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ｃ／
Ｔ）ＧＧ（配列番号２）
Ｐ１２ ＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＧＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＴＴ（配列番
号３）前述の方法で得られた染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰ１１プライマーとＰ１２
プライマーの組み合わせでＰＣＲを３５サイクル行った結果、約８００ｂｐのＤＮＡ断片
が特異的に増幅され、増幅ＤＮＡ断片の塩基配列（配列番号１の１０２１〜１７９０番目
までの塩基配列）を決定した。
（ｂ）ＦＯＤ９２３遺伝子の塩基配列の決定
（ａ）で得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片に隣接する５’上流域のＤＮＡ断片の増幅
は、染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化した後、ＬＡ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲで行った。即ち、染色体ＤＮＡ制限酵素処理断片にＸｂ
ａＩカセット（タカラバイオ製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライ
マ−（タカラバイオ製）及び下記のＰ１３プライマ−を使用して、ＰＣＲを３５サイクル
行った後、この反応液を１００倍希釈したものを鋳型としてＣ２プライマ−（タカラバイ
オ製）及び下記のＰ１４プライマ−を使用してＰＣＲをさらに３５サイクル行った結果、
１，２００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅した。そして、そのＤＮＡ断片の塩基配列（
配列番号１の１〜１０４４番目までの塩基配列）を決定した。
（ａ）で得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片に隣接する３’下流域のＤＮＡ断片の増幅
は、染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、ＬＡ−ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲで行った。即ち、染色体ＤＮＡ制限酵素処理断片にＳａ
ｌＩカセット（タカラバイオ製）を結合させ、このＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＣ１プライ
マ−（タカラバイオ製）及び下記のＰ１５プライマ−を使用して、ＰＣＲを３５サイクル
行った後、この反応液を１００倍希釈したものを鋳型としてＣ２プライマ−（タカラバイ
オ製）及び下記のＰ１６プライマ−を使用してＰＣＲをさらに３５サイクル行った結果、
１，０００ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅した。そして、そのＤＮＡ断片の塩基配列（
配列番号１の１７７５〜２２１２番目までの塩基配列）を決定した。
以上のようにして決定した塩基配列をつなぎ合わせて、ＦＯＤ９２３遺伝子の塩基配列
（配列番号１）を決定した。
Ｐ１３ ＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＧＡＴ
（配列番号１の１０８３〜１１０６番目までの塩基配列の相補配列）
Ｐ１４ ＣＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣ
（配列番号１の１０６２〜１０８６番目までの塩基配列の相補配列）
Ｐ１５ ＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＡＣＣ
（配列番号１の１７１３〜１７３８番目までの塩基配列）
Ｐ１６ ＡＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＣＡ
（配列番号１の１７３６〜１７５７番目までの塩基配列）
【００３４】
（３）カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ-１０００９）由来ケトア
ミンオキシダーゼを発現する大腸菌の作製
ＦＯＤ９２３を大腸菌で発現させるため、ペニシリウム・ヤンシネラムのケトアミンオ
キシダーゼ（特開平１１−４６７６９号公報）とアスペルギルス・ニドランスのケトアミ
ンオキシダーゼとの相同性からイントロンとして３つの領域、すなわち配列番号１の塩基
配列の７５３〜８０７番目と、配列番号１の塩基配列の１２３１〜１２７９番目と、配列
番号１の塩基配列の１６９６〜１７５０番目を推定した。
イントロンを除去して大腸菌での発現プラスミドを作成するために次の操作を行った。
まず、イントロン存在領域を挟み込むようなイントロンが除去された４０〜５０塩基の
配列の正配列と相補配列を有するＤＮＡ断片Ｐ２２〜Ｐ２７と、ＦＯＤ９２３遺伝子の開
始コドンＡＴＧ上に制限酵素ＮｃｏＩの配列を付加したＤＮＡ断片Ｐ２１、およびＦＯＤ
９２３遺伝子の終止コドン直後に制限酵素ＳａｃＩを付加した相補配列を有するＤＮＡ断
片Ｐ２８を合成した。
続いて、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）の染色
体ＤＮＡを鋳型とし、Ｐ２１とＰ２３、Ｐ２２とＰ２５、Ｐ２４とＰ２７、Ｐ２６とＰ２
８のプライマーをそれぞれ組み合わせとして４種のＰＣＲを行い、それぞれからイントロ
ン領域が除去された３２７ｂｐ、４８０ｂｐ、４７１ｂｐ、２５４ｂｐの増幅ＤＮＡ断片
を得た。そして、得た４本のフラグメントを混合して鋳型とし、Ｐ２１とＰ２８をプライ
マーとして再度ＰＣＲを行うことにより４本のフラグメントが３ヶ所のイントロンの除去
された相同領域で連結している１本のＦＯＤ９２３遺伝子を有する約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片を得た。
ＦＯＤ９２３を大腸菌内で高生産させるために高発現プロモーターであるエアロコッカ
ス・ビリダンス由来のピルビン酸オキシダーゼプロモーター（特公平７−６７３９０号公
報）を使用した。その具体的手順を以下に述べる。
１）特公平７−６７３９０号公報に示されたエアロコッカス・ビリダンスのピルビン酸
オキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＯＸＩ３から、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の
プロモーター領域を得るため、ｐＯＸＩ３をＤｒａＩで切断して、配列番号６記載の２０
２ｂｐのＤＮＡ配列を有するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域を分取し
、これとｐＵＣ１３をＳａｌＩで切断した後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端にした
ものとを連結し、ｐＵＣ１３のアンピシリン耐性遺伝子とピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
のプロモーター領域が同じ向きのプラスミドｐＫＮ１９を得た。
２）さらにプロモーターによる発現を効率的にするためｐＫＮ１９のピルビン酸オキシ
ダーゼ遺伝子のプロモーター下流にリボゾーム結合配列領域とマルチクローニングサイト
ができるように設計した配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｐ３１と、その相
補配列で配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片Ｐ３２を合成し、アニーリングさ
せた後、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＫＮ１９に連結してプラスミドｐＰＯＳ２を
作製した。
３）先に述べたイントロンを除去したＦＯＤ９２３遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ
断片をＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、同じくＮｃｏＩとＳａｃＩで切断したｐＰＯＳ２へ
組み込み、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター下流にＦＯＤ９２３遺伝子が組
み込まれたプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３を作製した。
４）得られたｐＰＯＳＦＯＤ９２３で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換しＦＯＤ９２３を発
現する大腸菌ＦＡＯＤ９２３を作製した。
Ｐ２１ ＣＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧ
ＡＧＣＡＡＡＣ（配列番号４）
Ｐ２２ ＣＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧ
ＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１の７２５〜７５２番目と８０８〜８３
２番目の塩基配列）
Ｐ２３ ＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴ
ＴＧＴＧＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧ（配列番号１の７２５〜７５２番目と８０８〜８３
２番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２４ ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡ
ＴＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣ（配列番号１の１２０４〜１２３０番目と１
２８０〜１３０８番目の塩基配列）
Ｐ２５ ＧＴＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡ
ＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣ（配列番号１の１２０４１２３０番目と１２
８０〜１３０８番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２６ ＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴ
ＣＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣ（配列番号１の１６６９〜１６９５番目と１７
５１〜１７７８番目の塩基配列）
Ｐ２７ ＧＡＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣ
ＣＣＣＴＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧ（配列番号１の１６６９〜１６９５番目と１７
５１〜１７７８番目の塩基配列の相補配列）
Ｐ２８ ＣＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＧＧ
ＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号５）
Ｐ３１ ＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴ
ＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧ（配列番号７）
Ｐ３２ ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧ
ＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴ（配列番号８）
【００３５】
（４）カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来ケトア
ミンオキシダーゼの製造
１０ｍｌの３％のソルビトール、１．５％のペプトン、１．５％のビール酵母エキス、
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（ｐＨ７．０）の入った８分の試験管に、
前述のように作製した大腸菌ＦＡＯＤ９２３を植菌し、２８℃、１２時間振盪培養し、種
菌とした。この種菌を２０Ｌの３％のソルビトール、１．５％のペプトン、１．５％のビ
ール酵母エキス、０．１％の消泡剤、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（ｐ
Ｈ７．０）の入った３０Ｌのジャーファンメンターに植菌し、３７℃で１８時間、攪拌培
養を行った。
培養終了後、集菌し、４Ｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に菌体を懸濁
させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（２１２ＫＵ）。この可溶化液を８０００
ｒｐｍで３０分間遠心し、その遠心上清をＱ−セファロース・ビッグビーズ樹脂（２Ｌ）
（アマシャム社製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０Ｍ、０．
１Ｍ、０．３Ｍ、０．５ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて行った
。その結果、０．３Ｍと０．５ＭのＮａＣｌ溶出画分が活性画分として回収された（１８
０ＫＵ）。この酵素液をモジュール（アミコン社製）にて７５０ｍｌまで濃縮した後１０
ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に一夜透析した。この透析液をＱ−セファロース
・ＨＰ樹脂（５００ｍｌ）（アマシャム製）を用いて再度イオンクロマトグラフィーを行
った。溶出は０〜０．３ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によるリニ
アグラジエントにより行い、０．１５〜０．２ＭのＮａＣｌの溶出画分（９２ＫＵ）を回
収した。この酵素液を５００ｍｌまで濃縮し、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）にて一夜透析した後、凍結乾燥を行い、精製ＦＯＤ９２３を得た。なお、ＦＯＤ９２３
活性測定試薬および測定方法を以下に記載する。
＜測定試薬＞
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＦＶＨ（ペプチド研究所製）
０．０２％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０２％ ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）
５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
（ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシ
アニリン）
＜測定方法＞
測定試薬１ｍｌを試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素
液を添加して５分間反応させた。反応後、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止
させ、波長５５０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨ
を含まない測定試薬を用いて同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度
（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とし
た。
【００３６】
[参考例：ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４由来のケトアミンオキシダーゼの製
法]
ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４がＦＶＨに作用するケトアミンオキシダーゼ
（以下、ＦＯＤ４７４ともいう）を生産しているが、生産量が低いため、以下に示すよう
に当該ケトアミンオキシダーゼ遺伝子を大腸菌において発現させた後、精製して当該ケト
アミンオキシダーゼを得た。
【００３７】
（１）ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４染色体ＤＮＡの調製
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを
５００ｍｌ容坂口フラスコに入れてオートクレーブで滅菌し、ネオコスモスポラ・バシン
フェクタ４７４を植菌し、２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙で培養液をろ過
して菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し
、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン製）を使用して染色体ＤＮＡ
溶液を得た。
【００３８】
（２）ケトアミンオキシダーゼ遺伝子のクローニング
（ａ）放射性ＤＮＡプローブの作製
ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４のケトアミンオキシダーゼ遺伝子はＦＯＤ９
２３の遺伝子と相同性を有することが予想された。そこで前記のＦＯＤ９２３の遺伝子を
含むプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ９２３を制限酵素ＮｃｏＩとＳａｃＩで切断し、ケトアミ
ンオキシダーゼ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、このＤＮＡ断片をＢｃ
ａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを
使用して放射性ＤＮＡプローブを作製した。
（ｂ） サザンハイブリダイゼーションによるケトアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡ
断片の検定
（１）の操作で得られたネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡから
遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含
有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。まず、ネオコスモスポラ．
バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル
で電気泳動し、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ製：バイオダインＡ）
にＤＮＡを転写した。次に、このメンブレンを風乾後、ハイブリダイゼーション溶液（０
．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン、０．１％ ウシ血清アルブミン
、０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、５０ｍＭ リン酸３
ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、２５０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、
５０％ ホルムアミド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
プレハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、（
ａ）で作成した放射性ＤＮＡプローブを添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーション
処理を１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを洗浄液（７５ｍＭ 塩化
ナトリウム，７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）で５０℃、１０分間
洗浄後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルムに重ね、−
７０℃で２４時間感光させた。
感光後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサ
イズを観察した。その結果、ＳａｃＩ切断による約８ｋｂのＤＮＡフラグメント上にケト
アミンオキシダーゼ遺伝子が存在することが明らかとなり、ＳａｃＩで切断した染色体Ｄ
ＮＡの８ｋｂフラグメントを用いて遺伝子ライブラリーを作成することとした。
（ｃ）遺伝子ライブラリーの作成
（１）の操作で得られたネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを制
限酵素ＳａｃＩで切断し、アガロース電気泳動で約８ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し
た。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳａｃＩで切断した後、アルカリフォスファタ
ーゼで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１９と、ＤＮＡライゲーションキット（タカラ
バイオ製）で連結させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイ
オ製）を形質転換して５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（ベクトンデッキン
ソン製）にて培養することで、約５，０００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子
ライブラリーとした。
（ｄ）コロニーハイブリダイゼーションによるケトアミンオキシダーゼ遺伝子含有ＤＮＡ
断片保持組換え大腸菌のスクリーニング
（ｃ）により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ製：バイオダ
インＡ）にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定
した。このＤＮＡを固定したメンブレンを（ｂ）に示したハイブリダイゼーション溶液に
浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーション行った。プレハイブリダイゼーション
後、ハイブリダイゼーション溶液を新しいものに交換し、（ａ）で作成した放射性ＤＮＡ
プローブを添加し、同じく４２℃でハイブリダイゼーションを１晩行った。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブレンを（ｂ）に示した５０℃の洗浄液で１０分間洗浄後、自然乾燥
した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルムに重ね、−７０℃で２４時間感光させた。
感光後フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを８個確認した。
（ｅ）組み換えプラスミドの抽出とケトアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
（ｄ）で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
含有ＬＢ液体培地（ベクトンデッキンソン製）１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪
培養した後、プラスミドを抽出した。その結果、８個のコロニー由来のプラスミドは同じ
染色体ＤＮＡ断片を含むものであった。このプラスミドのうちの１つについて、挿入され
た染色体断片のなかに、ＦＯＤ９２３の遺伝子と相同性を有する領域を確認し、ＦＯＤ４
７４の遺伝子の塩基配列を決定した。決定したＦＯＤ４７４の遺伝子の塩基配列とそのコ
ードするアミノ酸配列を配列番号９に示した。
【００３９】
（３）ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼを発現する
大腸菌の作製
ＦＯＤ４７４を大腸菌で発現させるため、ＦＯＤ４７４遺伝子の開始コドンＡＴＧ上に
制限酵素ＢｓｐＨＩの配列を付加したＰ４１プライマー（配列番号１０）、およびケトア
ミンオキシダーゼ遺伝子の終止コドン直後に制限酵素ＳａｃＩを付加した相補配列を有す
るＰ４２プライマー（配列番号１１）を合成した。
続いて、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｐ４１
とＰ４２をプライマーとしてＰＣＲを２５サイクル行い、ＦＯＤ４７４遺伝子を含む約１
．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＢｓｐＨＩとＳａｃＩで切断し、Ｎｃｏ
ＩとＳａｃＩで切断したｐＰＯＳ２に組み込み、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモ
ーター下流にケトアミンオキシダーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＰＯＳＦＯＤ４
７４を作製した。またこのプラスミドをＸｂａＩとＳａｃＩで切断して得られるＦＯＤ４
７４遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１１９に組み込んで、プラ
スミドｐ１１９−ＦＯＤ４７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２）を作成し、塩基配列の解
析を行い、ＰＣＲによる変異が発生していないことを確認した。得られたｐＰＯＳＦＯＤ
４７４で大腸菌Ｗ３１１０を形質転換しＦＯＤ４７４を発現する大腸菌ＦＡＯＤ４７４を
作製した。
なお、プラスミドｐ１１９−ＦＯＤ４７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２）は、２００
４年２月２４日、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人 産業
技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託した。
Ｐ４１ ＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴ
ＣＣＴＣ（配列番号１０）
Ｐ４２ ＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧ
ＣＴＴＣ（配列番号１１）
【００４０】
（４）ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼの製造
大腸菌ＦＡＯＤ４７４を用いて、上記のＦＯＤ９２３と同様に行った。また、ＦＯＤ４
７４活性測定試薬および方法も上記のＦＯＤ９２３と同様に行った。
[参考例：カーブラリア．クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来の
ケトアミンオキシダーゼ、ネオコスモスポラ．バシンフェクタ４７４由来のケトアミンオ
キシダーゼ、フザリウム．オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファー
マ製）の基質特異性]
反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５Ｕ／ｍｌ パ
ーオキシダーゼ、２ｍＭ 基質）２００μｌに酵素液２０μｌを添加し、３７℃で５分間
反応させた後、０．５％ ＳＤＳを０．５ｍｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度（Ａ１）を
測定し、基質を含まない反応液で同様の操作を行って測定した吸光度（Ａｂ）との差（Ａ
１−Ａｂ）から反応性を測定した。用いるＦＯＤ９２３、ＦＯＤ４７４、フザリウム．オ
キシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファーマ製：以下、ＦＯＤ２ともい
う）酵素液の濃度、用いた基質、吸光度差（Ａ１−Ａｂ）および相対活性（％）を表３に
示した。
【００４１】
[参考例：アンギオテンシン変換酵素によるＦＶＨＬからフルクトシルバリンの遊離反応]
ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来アンギオテンシン変換酵素（シグマ製：以下ＡＣＥ
Ｐという）とｒａｂｂｉｔ ｌｕｎｇ由来アンギオテンシン変換酵素（シグマ製：以下Ａ
ＣＥＲという）を酵素溶解液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．３）、３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で２０Ｕ／ｍｌになるように溶解し、ＡＣＥＰ液とＡＣＥＲ液を作製した。つぎ
に２ｍＭのＦＶＨＬ（ペプチド研究所製）溶液が２０μｌ入ったチューブ３本にそれぞれ
酵素溶解液、ＡＣＥＰ液、ＡＣＥＲ液を２０μｌづつ添加し、３７℃で１時間反応させた
後、発色液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、５Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ２、０．０２ｍＭ ＤＡ−６４）２
００μｌを加えて３７℃で５分間反応させた後、０．５％ＳＤＳを５００μｌ加えて発色
反応を停止させて７３０ｎｍの吸光度を測定した。同様に２ｍＭのＦＶＨＬ溶液のかわり
に蒸留水でも同様な反応を行い、また４０μｌのＦＶ溶液（０、５、１０、２０，５０μ
Ｍ）に発色液２００μｌを加えて同様の測定を行い検量線を作成することで、ＡＣＥＰ、
ＡＣＥＲがＦＶＨＬからＦＶを遊離する量を測定した。ＦＶの検量線でＦＶ（μＭ）と吸
光度差は、それぞれ５μＭで０．０１９、１０μＭで０．０３３、２０μＭで０．０６５
、５０μＭで０．０１５４であったが、ＡＣＥＰの反応によるＦＶ遊離を示す吸光度差は
−０．００６であり、ＡＣＥＲの反応によるＦＶ遊離を示す吸光度差は０．０００であっ
た。これらの結果から、ＡＣＥＰおよびＡＣＥＲはＦＶＨＬからＦＶを通常の反応におい
てほとんど遊離しないことがわかった。また、４０μｌのサンプル（２５μＭ ＦＶ、１
０Ｕ／ｍｌ ＡＣＥＲ）に発色液を添加して同様の測定を行ったときの吸光度差が０．０
６２であったことから、ＡＣＥＲが発色液での発色反応をほとんど阻害しないことがわか
る。
【００４２】
【表３】
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング（ｐＨ７．５）
ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチド
を切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法を示す。９６穴プレートにおいてスクリー
ニング対象サンプルを１０μｌずつ３箇所のウエルに入れた後、１箇所目にα液５０μｌ
、２箇所目にβ液５０μｌ、３箇所目に対照液を５０μｌを入れてから、３７℃で６０分
保温した後、蒸留水５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放置した後にマイク
ロプレートリーダー（バイオラッド製 ｍｏｄｅｌ ５５０）で主波長５５０ｎｍ、副波
長５９５ｎｍで吸光度を測定し、α液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差
に比べて、β液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差が大きいものを選ぶこ
とで目的のプロテアーゼをスクリーニングした。サンプルはカルボキシペプチダーゼＢ（
シグマ製）、カルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬工業製）、カルボキシペプチダーゼＹ
（オリエンタル酵母工業製）、プロテアーゼ（タイプＸＸＶＩＩ ナガーゼ：シグマ製）
、プロテアーゼ（タイプＶＩＩＩ ズブチリシンカールスベルグ：シグマ製）、プロテア
ーゼ（タイプＸＸＩＶ バクテリアル：シグマ製）、プロテイネースＫ（和光純薬工業製
）、ニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、カルボキシペプチダーゼＡ
（和光純薬工業製）、サーモライシン（和光純薬工業製）および蒸留水を用いた。また、
発色液による発色の度合いを確認するために１ｍＭのＦＶＨ（ペプチド研究所製）および
１ｍＭのＦＶＬ（ペプチド研究所製）を１０μｌウエルに入れた後、対照液５０μｌを入
れ３７℃で６０分保温した後、蒸留水５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放
置した後に上記と同様に測定した。その結果を表４および表５に示した。カルボキシペプ
チダーゼＢ、カルボキシペ
プチダーゼＷ、ニュートラルプロテイネース、サーモライシンが、ｐＨ７．５においてヘ
モグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的
に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチドを切
り出すプロテアーゼであることがわかる。
＜α液＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ α糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜β液＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ β糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜対照液＞
５０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
＜発色液＞
１００ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．０９％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０６％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）
１５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
１８．７５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
（ＴＯＤＢ：Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン）
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
〔実施例２〕
ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング（ｐＨ３．５）
ヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実
質的に切り出すことなくヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプチドを
切り出すプロテアーゼのスクリーニング方法をしめす。９６穴プレートにおいてスクリー
ニング対象サンプルを１０μｌずつ３箇所のウエルに入れた後、１箇所目にα液５０μｌ
、２箇所目にβ液５０μｌ、３箇所目に対照液を５０μｌを入れてから、３７℃で６０分
保温した後、ｐＨ調整液５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室温で３０分放置した後にマ
イクロプレートリーダー（バイオラッド製 ｍｏｄｅｌ ５５０）で主波長５５０ｎｍ、
副波長５９５ｎｍで吸光度を測定し、α液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光
度差に比べて、β液添加ウエルの吸光度と対照液添加ウエルの吸光度差が大きいものを選
ぶことで目的のプロテアーゼをスクリーニングした。サンプルはカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（シグマ製）、カルボキシペプチダーゼＷ（和光純薬工業製）、カルボキシペプチダー
ゼＹ（オリエンタル酵母工業製）、プロテアーゼ（タイプＸＸＶＩＩ ナガーゼ：シグマ
製）、プロテアーゼ（タイプＶＩＩＩ ズブチリシンカールスベルグ：シグマ製）、プロ
テアーゼ（タイプＸＸＩＶ バクテリアル：シグマ製）、プロテイネースＫ（和光純薬工
業製）、ニュートラルプロテイネース（東洋紡製）、および蒸留水を用いた
。また、発色液による発色の度合いを確認するために１ｍＭのＦＶＨ（ペプチド研究所製
）および１ｍＭのＦＶＬ（ペプチド研究所製）を１０μｌウエルに入れた後、対照液５０
μｌを入れ３７℃で６０分保温した後、ｐＨ調整液５０μｌ、発色液５０μｌを入れて室
温で３０分放置した後に上記と同様に測定した。その結果を表６に示した。カルボキシペ
プチダーゼＢが、ｐＨ３．５に
おいてヘモグロビンα鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプチド
を実質的に切り出すことなく、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端糖化ペンタペプチドから糖化ペプ
チドを切り出すプロテアーゼであることがわかる。
＜α液＞
５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ α糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜β液＞
５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．２ｍＭ β糖化ペンタペプチド（ペプチド研究所製）
＜対照液＞
５０ｍM 酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
＜ｐＨ調整液＞
１００ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）
（ＣＡＰＳ：３−シクロヘキシルアミノプロパンスルフォニックアシッド：同仁化学研究
所製）
＜発色液＞
１００ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．０９％ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業製）
０．０６％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所製）
１５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
１８．７５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
（ＴＯＤＢ：Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン）
【００４７】
【表６】
【００４８】
〔実施例３〕
微生物からのヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング
各種微生物をＤｉｆｃｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（ベクトン
デッキンソン製）、ＭＭ培地（２．５％マンノース、２．５％ビール酵母エキス、ｐＨ７
．０）、ＹＰＧ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、２％酵母エキス、０．１％リ
ン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、ｐＨ７．０）で２８〜３
０℃、１〜７日間振盪培養し、培養液から遠心分離により菌体を除去して培養上清を得た
。得られた培養上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈して
サンプルとし、実施例１と同様に測定をした。ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈで培養した微生物の結
果を表７に、ＭＭ培地で培養した微生物の結果を表８に、ＹＰＧ培地で培養した微生物の
結果を表９（ただし、表９は副波長を測定していない）に示す。
【００４９】
【表７】
【００５０】
【表８】
【００５１】
【表９】
【００５２】
〔実施例４〕
バチラス．エスピー ＡＳＰ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）由来のプロテアー
ゼの精製方法と理化学的性質
１５０ ｍｌのＤｉｆｃｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（ベクト
ンデッキンソン製）を入れた５００ｍｌ容三角フラスコ４本でバチラス．エスピー ＡＳ
Ｐ８４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１）を２８℃、３日間振盪培養した後、培養液から
遠心分離により菌体を除き培養上清（７７ｍＵ／ｍｌ、５６０ｍｌ）を得た。この培養上
清に硫酸アンモニウム２１０ｇとパーライト（東興パーライト工業製）８．４ｇ加えて撹
拌した後に径９０ｍｍの濾紙Ｎｏ．５Ａ（東洋濾紙製）で濾過することで析出したプロテ
アーゼを捕集し、続いてこの析出物を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で懸
濁した後径９０ｍｍの濾紙５Ａ（東洋濾紙製）で濾過することでプロテアーゼ活性を含む
濾液（２１５ｍＵ／ｍｌ、９０ｍｌ）を得て、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）５Ｌに透析をした。透析済みプロテアーゼ液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャム製）のカラム（２
６φｘ９４ｍｍ）に吸着させた後、０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌのグラジエントで溶出さ
せてプロテアーゼ活性を含む画分（２１７ｍＵ／ｍｌ、５４ｍｌ）を得た。この画分に１
Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した後、１Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−
４Ｂ（アマシャム製）のカラム（１５φｘ１５０ｍｍ）に吸着させた。その後、１Ｍ硫酸
アンモニウム、０％エチレングリコールから０Ｍ硫酸アンモニウム、２０％エチレングリ
コールのグラジエントで溶出させた後プロテアーゼ活性を含む画分（２３７ｍＵ／ｍｌ、
１８ｍｌ）をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００００ＭＷＣＯ（ミリポア製）で濃縮して
精製プロテアーゼ（１３．９Ｕ／ｍｌ、０．４２ｍｌ）を得た。なお、本プロテアーゼの
活性測定試薬および方法を以下に記載する。
＜測定試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
２ｍＭ 塩化カルシウム
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ ＴＯＯＳ
５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ
５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
０．２５ｍＭ 基質
＜測定方法＞
測定試薬０．２ｍｌを試験管に入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの
酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後、０．５％のＳＤＳを０．５ｍｌ添加して
反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクと
して酵素液の代わりに蒸留水で同様の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この吸光
度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた
。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量と
した。ただし、基質はβ糖化ペンタペプチドを用いた。
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
実施例４に記載の＜測定方法＞において、ＦＯＤ９２３の濃度を５０Ｕ／ｍｌに変更し
、基質として０．２５ｍＭのβ糖化ペンタペプチド、０．２５ｍＭのα糖化ペンタペプチ
ド、０．０３ｍＭのＦＶＨ、０．０３ｍＭのＦＶＬ、０．０３ｍＭのＦＶを用いて測定し
た。また、これと同様の測定をＦＯＤ９２３にかえてＦＯＤ２を用いて行った。さらにま
た、比較のためにニュートラルプロテアーゼ（東洋紡製）においても同様の測定を行った
。得られた吸光度差（Ａａ−Ａｂ）を表１０に示した。本プロテアーゼがニュートラルプ
ロテアーゼ（東洋紡製）と同様にα糖化ペンタペプチドから糖化アミノ酸または糖化ペプ
チドを切り出すことなくβ糖化ペンタペプチドからＦＶＨを切り出していることがわかる
。
【００５３】
【表１０】
（２）至適ｐＨ
実施例４に記載の測定法において５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）のかわりに
５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０、８．５）、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０
、６．５、７．０）、５０ｍＭのクエン酸−クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５、６．０、
６．５）を用いて、０．２５ｍＭの基質を０．１ｍＭのβ糖化ペンタペプチドにして測定
をした結果を図２に示す。ｐＨ６．０付近が至適であることがわかる。
（３）ｐＨ安定性
酵素を５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５、８．０、８．５）および５０ｍＭのＰ
ＩＰＥＳ（ｐＨ６．０、６．５、７．０）中で５０℃、２０分間処理し、その残存活性を
測定した。その結果を図３に示す。
（４）至適温度
プロテアーゼ溶液２０μｌを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍ
Ｍ 塩化カルシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭ βペンタペプチ
ド）１００μｌに添加し、３０，３７，４２，５０，５５，６０，６５℃の各温度で１０
分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌ加えて反応を停止させた。その後、発色
液（０．０３％ ４−アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５０Ｕ／ｍｌ パー
オキシダーゼ、１０．５Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３）９５μｌ添加して３７℃５分間反応さ
せ、続いて０．５％ ＳＤＳを０．５ｍｌ添加してから５５５ｎｍの吸光度を測定するこ
とで至適温度を測定した。結果を図４に示す。
（５）熱安定性
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）中にプロテアーゼを入れ、４、３７、５０、
６０、７０℃の各温度で１０分間処理した後に残存活性を測定した。結果を図５に示す。
（６）分子量
３５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
３２７２１Ｄａ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ分析）
【００５４】
〔実施例５〕
エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０ 菌株由来のプロテアーゼの培養方法、
精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコ１０本に１００ ｍｌのＹＰＧ培地（２．０％グルコース、
１．０％ポリペプトン、２．０％酵母エキス、０．１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ ７．０）を入れ、殺菌後、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢ
ＲＣ３８２０を植菌し、３０℃、２日間振盪培養した。
＜精製方法＞
得られた培養液を遠心分離して培養上清に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え、遠心分離した上清を４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた ０．１ Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で平衡化した Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ (３０
φ×１５０ ｍｍ, 東ソー製) のカラムに供与した。１０％飽和になるように硫酸アンモ
ニウムを加えた ０．１ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で洗浄を行い、０．１ Ｍ
トリス塩酸 緩衝液（ｐＨ ７．３）で溶出した。その溶出液の活性画分を５０ ｍＭ トリ
ス塩酸 緩衝液（ｐＨ ７．３）で透析した後、同緩衝液で平衡化した ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (３０φ×１５０ ｍｍ, アマシャム製) のカラムに
供与し、０ から ０．５ Ｍ までの ＮａＣｌ のリニアグラジエントで溶出した。その溶
出液の活性画分に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４０％ 飽和硫酸
アンモニウムを加えた０．１ Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．３）で平衡化した Ｂｕｔ
ｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（１８φ×１５０ ｍｍ, 東ソー製） のカラムに供
与し、４０％ から ０％ までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出した
。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製プロテアーゼを得た。精製の過程を表
１１にまとめた。
本酵素の活性は次のようにして測定した。β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるよ
うに溶解した１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍ
のセルに入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分
間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチ
ピリン、パーオキシダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミン
オキシダーゼ１０Ｕを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））０．５ｍｌを加
え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５０
ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとして基質を含まない各種緩衝
液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブラン
クの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００５５】
【表１１】
＜理化学的性質＞
（１）作用
本発明のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼのα糖化ペ
ンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用は表１２の通りである。反応時の各基
質濃度を ０．２５ｍＭ とし、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロ
テアーゼ（１．０Ｕ）を加えて３０℃で５〜６０分間反応させ、反応液をプロテインシー
ケンサー(島津製)に供与し、プロテアーゼの作用により生成したペプチドのＮ末端アミノ
酸配列を決定した。
その結果、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテアーゼはα糖化
ペンタペプチドには作用せず、β糖化ペンタペプチドのヒスチジンとロイシンの間のペプ
チド結合を切断し、ＦＶＨとロイシル-トレオニル-プロリン（ＬＴＰ）を生成した。
（２）至適ｐＨ
β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるように溶解したｐＨ３．０〜１１．０の各種
緩衝液（ｐＨ３〜５は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５〜７は１００ｍＭのクエン酸緩衝
液、ｐＨ７〜９は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１１は１００ｍＭのホウ酸緩
衝液）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ、３７℃で５分間予備加温した後、０．
０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯ
ＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・ク
ラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼ１０Ｕを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添
加して反応を停止させ、波長５５０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブラ
ンクとして基質を含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａ
ｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵
素活性を求めた。その結果を図６に示した。
（３）ｐＨ安定性
酵素液を１０ｍＭの各種緩衝液中で４℃、２４時間処理し、その残存活性を本酵素の＜
精製方法＞で記載した活性測定法に従って測定した。その結果を図７に示した。
（４）至適温度
β糖化ペンタペプチドを０．５ｍＭになるように溶解した１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ、１５〜７０℃で５分間予備加
温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後氷中で冷却した
後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０６％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシ
ダーゼ１０Ｕ、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼ１０Ｕ
を含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた
後、０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５０ｎｍにおける吸光
度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない各種緩衝液を加え、同様
の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａ
ｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。１５〜７０℃の範囲で変化させて
至適温度を求めた結果を図８に示した。
（５）熱安定性
酵素液を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度３０分間加熱処理した
後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図９に示した。
（６）分子量
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ-２００Ｇ（６．０φ×３００ ｍｍ、ワイエムシー製）に
よるゲル濾過から本酵素の分子量を求めた。標準蛋白質として牛血清アルブミン、オボア
ルブミン、大豆トリプシンインヒビター（全てシグマ製）を使用した。その結果、分子量
は約３３,０００であった。
Ｌａｅｍｍｌｉの方法での １０％ ｇｅｌ による ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ドデシル硫酸
ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、分子量は約 ３３,０００ であっ
た。尚、標準蛋白質は ＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード Ｌｏｗ （バイオラッド製）を使
用した。
以上の結果から、本発明のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来プロテ
アーゼは単量体であることが明らかである。
（７）Ｎ末端部分アミノ酸配列
前記方法に従って、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０培養液から得た精
製酵素を蒸留水に溶解し、Ｎ末端配列シークエンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）
を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号１２に示すようになった。得られたＮ末
端部分アミノ酸配列をもとに、既知のプロテアーゼとの相同性を検索した結果、エアロモ
ナス・ヒドロフィラ由来エラスターゼと９８％の相同性を示した。
Val Asp Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Val Lys Thr Gly Lys Tyr Phe Tyr Gly（配列番
号１２）
（８）部分アミノ酸配列
前記方法に従って、エアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０培養液から得た精
製酵素の凍結乾燥品６０μｇを用い、「マイクロシークエンスのための微量タンパク質精
製法、ｐ４８−５２、羊土社（１９９２年）」に準じて、酵素の断片を得て、その配列を
決定した。即ち、５０μｌの４５ｍＭジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処理
を行い、５μｌの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。続いて、１
４０μｌの蒸留水を加え、１．０μｇエンドプロテーナーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ・ダイ
アグノスティックス製）を添加後、３７℃、一晩インキュベートした。その断片化した酵
素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエン
サー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号
１３，１４に示すようになった。得られた２つの部分アミノ酸配列はいずれもエアロモナ
ス・ヒドロフィラ由来エラスターゼのアミノ酸配列と完全に一致した。
Leu Asp Val Ala Ala His Glu Val Ser His（配列番号１３）
Phe Gly Asp Gly Ala Thr（配列番号１４）
以上のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼの性質を表１
２にまとめた。
【００５６】
【表１２】
【００５７】
〔実施例６〕
リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０）菌株
由来のプロテアーゼの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜精製方法＞
実施例５で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対
して透析し、精製プロテアーゼを得た。精製の過程を表１３にまとめた。活性測定法も実
施例５と同様に行った。
【００５８】
【表１３】
＜理化学的性質＞
（１）作用
本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのα糖化ペ
ンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用は表１４の通りである。実施例５の（
１）で記載した方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６
由来プロテアーゼのα糖化ペンタペプチドとβ糖化ペンタペプチドに対する作用を調べた
結果、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテアーゼはα糖化ペンタ
ペプチドには作用せず、β糖化ペンタペプチドのヒスチジンとロイシンの間のペプチド結
合を切断し、ＦＶＨとＬＴＰを生成することがわかった。
（２）至適ｐＨ
実施例５の（２）に記載した方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−
３６６由来プロテアーゼの至適ｐＨを調べた結果を図１０に示した。
（３）ｐＨ安定性
実施例５の（３）に記載に方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼのｐＨ安定性を調べた結果を図１１に示した。
（４）至適温度
実施例５の（４）に記載の方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの至適温度を調べた結果を図１２に示した。
（５）熱安定性
実施例５の（５）に記載の方法に従って、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス
ＹＫ−３６６由来プロテアーゼの熱安定性を調べた結果を図１３に示した。
（６）分子量
実施例５の（６）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
子量を求めた結果、分子量は約３５,０００であった。
以上の結果から、本発明のリゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来プロテ
アーゼは単量体であることが明らかである。
（７）Ｎ末端部分アミノ酸配列
前記方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６培養液から得た精
製酵素を蒸留水に溶解し、Ｎ末端配列シークエンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）
を用いて解析した。得られた配列は次の配列番号１５に示すようになった。
Ala Leu Val Gly Thr Gly Pro Gly Gly Asn Gln Lys Thr Gly Gln Tyr Glu Tyr Gly Thr
（配列番号１５）
（８）部分アミノ酸配列
前記方法に従って、リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６培養液から得た精
製酵素の凍結乾燥品６０μｇを用い、常法（マイクロシークエンスのための微量タンパク
質精製法、ｐ４８−５２、羊土社、１９９２年）に準じて、酵素の断片を得て、その配列
を決定した。即ち、５０μｌの４５ｍＭジチオスレイトールを加え、５０℃、１５分間処
理を行い、５μlの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、１５分間放置した。つづいて
１４０μｌの蒸留水を加え、１．０μｇエンドプロテーナーゼＬｙｓ−Ｃ（ロッシュ・ダ
イアグノスティックス製）を添加後、３７℃、一晩インキュベートした。その断片化した
酵素をＨＰＬＣにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をＮ末端配列シークエ
ンサー（島津製作所製 ＰＰＳＱ−２１）を用いて解析した。得られた配列は次の配列番
号１６、１７に示すようになった。
Tyr Ser Xaa Asn Tyr Glu Asn Ala（配列番号１６）
Phe Gly Asp Gly Ala Thr（配列番号１７）
以上のエアロモナス・ヒドロフィラ ＮＢＲＣ３８２０由来のプロテアーゼの性質を表１
４にまとめた。
【００５９】
【表１４】
【００６０】
〔実施例７〕
遺伝子改変によるＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼの取得
＜カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ケトアミンオキシダーゼの変異ライブラリー
の構築＞
ＦＯＤ９２３の変異ライブラリーの構築はＤＮＡポリメラーゼの誤読を利用したエラー
プローンＰＣＲにより作成した。エラープローンＰＣＲは上記参考例に記載のｐＰＯＳＦ
ＯＤ９２３を鋳型とし、Ｐ５１プライマー及びＰ５２プライマー（次の配列番号１８及び
１９に示す）を用いてＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（アマシャム製）で塩
化マグネシウムを終濃度２．５ｍＭになるよう添加して行なった。サイクル条件は９４℃
×４０秒→５５℃×３０秒→７２℃×１分；２５サイクルで行った。
Ｐ５１ ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＴ（配列番号１８
）
Ｐ５２ ＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣ（
配列番号１９）
増幅されたＰＣＲ産物はＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ−キット（アマシャム製）を用いて精製した。
この精製されたＰＣＲ産物０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｃＩで消化した後、
エタノール沈殿により回収した。一方、０．５μgのｐＰＯＳＦＯＤ９２３も同じ制限酵
素で消化し、ケトアミンオキシダーゼ遺伝子を含まない２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動により分離し、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ-キットを用いて回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキット（東
洋紡製）にて前述の両ＤＮＡ断片を１６℃にて３０分間反応させて結合し、大腸菌ＪＭ１
０９のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地に塗布し、コロニーが１〜２ｍｍ程度に生育するまで３７℃で静置培養
した。
＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞
９６穴マイクロプレートにあらかじめ滅菌しておいた発現用培地（３％のソルビトール
、１．５％のポリペプトン，１．５％の酵母エキス、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
み、ｐＨ７．０に調整した培地）１００μｌを加え、そこに生育した形質転換体を接種し
、３０℃で一晩培養した。培養終了後、培養液から５μｌずつ９６穴プレートの２つのウ
エルに分注し、測定試薬（１ｍＭ ＦＶＨまたはＦＺＫ、 ０．０２％ ＴＯＯＳ、 ０．
０２％ ４-アミノアンチピリン、１０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼを含む５０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））５０μｌを加え、３０℃で１０〜６０分間反応させた。０．
５％ ＳＤＳを１５０μｌ添加して反応を停止させ、マイクロリーダー（バイオラッド製
ｍｏｄｅｌ４５０）で５５０ｎｍの吸収を測定した。
構築した変異ライブラリーより、ＦＶＨには作用するが、ＦＺＫへの作用が低下したケト
アミンオキシダーゼを生産している組換え体を選抜した。スクリーニングの結果、優良変
異株として９２３−Ｆ１及び９２３−Ｆ２を得た。これらの変異株の有するケトアミンオ
キシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定したところ、表１５−１に示したような塩基に変異が
導入されていた。
【００６１】
【表１５−１】
＜変異型ケトアミンオキシダーゼの基質特異性の確認＞
選抜した１株のコロニーをＬＢ培地（５０μｇ/ｍｌのアンピシリンを含む）５ｍｌに
植菌し、３０℃，２０時間振盪培養を行った。培養終了後の培養液から遠心分離により菌
体を集菌し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに菌体を懸濁させ、超音波
破砕により菌体の可溶化を行った。この可溶化液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０分
間）し、その上清をケトアミンオキシダーゼ粗酵素液とした。これらの粗酵素液を用いて
ＦＶＨとＦＺＫを基質として＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼ
のスクリーニング＞で記載した活性測定方法に従って特異性（ＦＺＫへの活性のＦＶＨへ
の活性に対する相対活性、以後ＦＺＫ／ＦＶＨと示す）を求めた。その結果、表１５に示
したように９２３−Ｆ１と９２３−Ｆ２のＦＺＫ／ＦＶＨはそれぞれ０．２４と０．０２
５であり、変異型酵素はＦＺＫへの作用が大きく低下したといえる。
＜有効変異箇所の特定＞
前述した基質特異性の改良に影響した有効変異箇所を特定するために表１５に示した点
変異が導入された変異型ケトアミンオキシダーゼを以下に示す方法により作成した。
１）変異型酵素９２３−Ｆ３３０Ｌと９２３−Ｆｒｏ２は、図１４に示したプラスミドｐ
ＰＯＳＦＯＤ９２３の制限酵素地図を基に、野生型もしくは変異型酵素９２３−Ｆ２の遺
伝子を表１５に示した制限酵素で処理し、目的とする変異箇所を含む断片を切り出し、同
じ制限酵素で処理した他方のプラスミドに挿入し、得られたプラスミドを用いて形質転換
した大腸菌から取得した。
２）変異型酵素９２３−Ｉ５８Ｖは目的とする変異を含む領域を変異プライマーＰ５３と
Ｐ５４（配列番号２０，２１に示す）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片を表１５に示
した制限酵素で処理し、同じ制限酵素で切断したpＰＯＳＦＯＤ９２３に挿入し、得られ
たプラスミドを用いて形質転換した大腸菌から取得した。これらの変異型酵素を＜ＦＺＫ
への作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞で記載した測定法
で評価した結果を表１５に示した。アミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）のバリ
ンへの置換、または６２番のアルギニン（Ｒ６２）のヒスチジンへの置換がＦＺＫに対す
る活性の低減に有効であることが分った。
Ｐ５３ ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣ（配列番
号２０：ｐＰＯＳ２のマルチクローニングサイト下流のＸｂａＩサイトを含む）
Ｐ５４ ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＧＣ
ＡＡＧＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴ（配列番号２１：ＦＯＤ９２３において
５８Ｉ→Ｖとなるような変異を含む配列番号１記載の６３７番目から６９４番目の配列の
相補配列）
＜有効変異アミノ酸残基の点変異試験＞
効果の高いアミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）を他のアミノ酸に置換し、有
効な点変異型ケトアミンオキシダーゼの検索を試みた。Ｐ５３（配列番号２０）と（表１
５−２）に示した配列をもつプライマー（Ｐ５５〜Ｐ６４）とを用いて、＜有効変異箇所
の特定＞の２）に示す方法で変異株を作成した。得られた変異型酵素のＦＶＨに対するＦ
ＺＫの活性を＜ＦＺＫへの作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニン
グ＞で記載した方法で測定した結果を（表１５−２）に示した。
【００６２】
【表１５−２】
アミノ酸番号５８番のイソロイシン（Ｉ５８）のバリンへの置換の他に、スレオニン、ア
スパラギン、システイン、セリン、アラニンへの置換がＦＺＫに対する活性の低減に有効
であることが分かった。
＜変異型ケトアミンオキシダーゼの製造＞
変異型ケトアミンオキシダーゼの精製は参考例に記載の方法と同様の方法で行い製造し
た。
本発明の変異型フルクトシルアミノキシダーゼの各種基質に対する特異性は表１６の通
りである。なお、反応時の各基質濃度は１ｍＭ とし、その他の反応条件は＜ＦＺＫへの
作用が低下した変異型ケトアミンオキシダーゼのスクリーニング＞で記載した活性測定方
法に従った。９２３−Ｆ２（以後、ＦＯＤ９２３Ｍともいう）はＦＶに対して最も高い反
応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＺＫ、ＦＶＬに対しては、それぞれ２
．５%、０．５%とＦＶＨと比較してごくわずかであり、本酵素はＦＺＫやＦＶＬへ実質的
に作用しない酵素であるといえる。
【００６３】
【表１６】
＜ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来ケトアミンオキシダーゼの変異型＞
ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４ 由来ケトアミンオキシダーゼ（ＦＯＤ４
７４）は、ＦＯＤ９２３を含むケトアミンオキシダーゼと高い相同性があり、図１に示し
たように、ＦＯＤ９２３のＩ５８を含むＮ末端側領域のアミノ酸配列が高く保存されてい
る。ｐＰＯＳＦＯＤ４７４を用い、ＦＯＤ４７４のＩ５８を異なるアミノ酸(トレオニン)
に置換したＦＯＤ４７４変異株４７４−Ｆ１を獲得した。表１７にはＦＯＤ４７４及び４
７４−Ｆ１の各種基質に対する特異性を示す。ＦＯＤ４７４においてもＦＶＨに対する基
質特異性が改良されたことから、他の菌種由来のケトアミンオキシダーゼにおいても５８
番目アミノ酸領域はＦＶＨに対する基質特異性に強く関与する部位であると考えられる。
【００６４】
【表１７】
【００６５】
〔実施例８〕
ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３、ＦＯＤ４７４、ＦＯＤ９２３ＭのＦＶＨ、ＦＺＫ
への作用のｐＨ依存性
反応液（５０ｍＭ 緩衝液、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％ ４−ア
ミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＯＳ、５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、２ｍＭ 基
質）２００μｌに酵素液２０μｌを添加し、３７℃５分間保温後、０．５％ ＳＤＳを５
００μｌ加えてから５５５ｎｍの吸光度を測定した。緩衝液はＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．
５、８．０、８．５）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０、６．５、７．０）、Ｂｉｓｔｒｉｓ−
塩酸（ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５）を用いて測定し、基質を含まない反応液を
用いて同様に吸光度を測定し、基質にＦＶＨとＦＺＫとを用いたときのそれぞれの吸光度
差、用いた酵素液の酵素濃度を表１８に記載した。基質にＦＶＨとＦＺＫとを用いたとき
の（ＦＺＫ／ＦＶＨ）で表される相対活性（％）を表１９に示した。ｐＨ６付近でＦＶＨ
に対する特異性が著しく向上することがわかる。
【００６６】
〔実施例９〕
ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３Ｍの基質特異性
＜参考例：カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９）由来
のケトアミンオキシダーゼ、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ４７４由来のケトアミン
オキシダーゼ、フザリウム．オキシスポラム由来のケトアミンオキシダーゼ（旭化成ファ
ーマ製）の基質特異性＞で記載した方法と同様に測定した。結果を表３に示した。
【００６７】
【表１８】
【００６８】
【表１９】
【００６９】
〔実施例１０〕
＜ヘモグロビンＡ１ｃの測定＞
まず検量線を作製するために、光路長１ｃｍのセルの中でＦＶＨ添加ヘモグロビンＡ１
ｃ標準液３６μｌにＲ１（−プロテアーゼ）を３２４μｌおよびＲ２を９０μｌ加えて３
７℃で２００秒保温した後にＲ３を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温し、続いてＲ４
を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温する。その過程でＲ２を加えて１８０秒後の７３
０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｓ）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ２ｓ）
、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｓ）を測定する。また、同様にＦ
ＶＨ未添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液においても同様の操作を行い、Ｒ２を加えて１８０
秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｓｂ）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度
値（Ａ２ｓｂ）、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｓｂ）を測定する
。吸光度差ΔＡｓ＝（Ａ３ｓ−Ａ２ｓ）−（Ａ３ｓｂ−Ａ２ｓｂ）とＦＶＨ濃度との関係
から図１５の検量線を作製した。
次に、低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液３６μｌにＲ１（＋プロテアーゼ）を
３２４μｌ加え３７℃で６０分保温した後にＲ２を９０μｌ加えて、光路長１ｃｍのセル
の中において３７℃で２００秒保温した後にＲ３を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温
し、続いてＲ４を１０μｌ加えて３７℃で１００秒保温する。その過程でＲ２を加えて１
８０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１）、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度
値（Ａ２）、Ｒ４を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ３）を測定する。また、
同一サンプルでＲ１（＋プロテアーゼ）のかわりにＲ１（−プロテアーゼ）を用いた以外
は上記と同一の操作をして、Ｒ２を加えて１８０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ１ｂ）
、Ｒ３を加えて９０秒後の７３０ｎｍの吸光度値（Ａ２ｂ）、Ｒ４を加えて９０秒後の７
３０ｎｍの吸光度値（Ａ３ｂ）を測定する。低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液に
おけるヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化の量は吸光度差ΔＡ＝（Ａ３−Ａ２）−（Ａ３ｂ−
Ａ２ｂ）と、ＦＶＨ濃度と吸光度の関係から得ることができ、表２０に示すように理論値
と測定値が良く一致していることがわかる。なお、吸光度差ΔＡε＝（Ａ２−Ａ１）−（
Ａ２ｂ−Ａ１ｂ）は糖化ヘモグロビン中のリジン残基のε−アミノ基が糖化されている量
と比例するものと考えられる。
＜Ｒ１（＋プロテアーゼ）＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
２ｍＭ 塩化カルシウム
２．１ｋＵ／ｍｌ バチラス．エスピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）
＜Ｒ１（−プロテアーゼ）＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１５０ｍＭ 塩化ナトリウム
２ｍＭ 塩化カルシウム
＜Ｒ２＞
２０ｍM Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
６．３５ｍＭ ＷＳＴ３（同仁化学研究所製）
０．０８ｍＭ ＤＡ−６４（和光純薬工業製）
２５Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ（シグマ製）
（ＷＳＴ−３：２−（４−イオドフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−
（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＤＡ−６４：Ｎ−（カルボキ
シメチルアミノカルボニル）−４，４‘−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）
＜Ｒ３＞
５００Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ２
＜Ｒ４＞
５００Ｕ／ｍｌ ＦＯＤ９２３
＜低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
市販凍結乾燥品ヘモグロビン測定用キャリブレーター（デタミナーコントロールＨｂＡ１
ｃ用：協和メデックス製）低値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＪＤＳ値）：５．６％）を
蒸留水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解して作製。
なお、臨床検査 ４６（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式（ＪＤＳ値）
＝０．９２５９（ＩＦＣＣ値）＋１．６６９７よりヘモグロビンＡ１ｃ値（ＩＦＣＣ値）
：４．２％と換算される。よって、ヘモグロビンがα鎖２本、β鎖２本からなる４量体で
分子量６４５５０であるとすると、この標準液の糖化されたβ鎖Ｎ末端の濃度は理論値と
して０．００５２ｍＭとなる。
＜高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
市販凍結乾燥品ヘモグロビン測定用キャリブレーター（デタミナーコントロールＨｂＡ
１ｃ用：協和メデックス製）高値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＪＤＳ値）：１０．２％
）を蒸留水で４ｍｇ／ｍｌになるように溶解して作製。
なお、臨床検査 ４６（６）７２９−７３４（２００２）に記載の換算式（ＪＤＳ値）
＝０．９２５９（ＩＦＣＣ値）＋１．６６９７よりヘモグロビンＡ１ｃ値（ＩＦＣＣ値）
：９．２％と換算される。よって、ヘモグロビンがα鎖２本、β鎖２本からなる４量体で
分子量６４５５０であるとすると、この標準液の糖化されたβ鎖Ｎ末端の濃度は理論値と
して０．０１１４ｍＭとなる。
＜ＦＶＨ添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
上記の低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液にＦＶＨ（ペプチド研究所製）を０．０３０ｍＭ
および０．０１５ｍＭになるように添加して作製。
＜ＦＶＨ未添加ヘモグロビンＡ１ｃ標準液＞
上記の低値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液を用いる。
【００７０】
〔実施例１１〕
＜プロテアーゼ反応時間とヘモグロビンＡ１ｃの測定値の関係＞
実施例１０での低値および高値ヘモグロビンＡ１ｃ標準液におけるプロテアーゼ反応の
時間を３０分から３６０分まで変化させ、得られるヘモグロビンＡ１ｃの測定値を図１６
に示した。これは実施例１０での測定値が理論値と一致したのはプロテアーゼ反応の時間
を６０分に限定したことにより偶然得られたものではなく、プロテアーゼ反応の時間が３
０分から３６０分において経時的にほぼ安定しており、真の糖化ヘモグロビンの糖化され
たβ鎖Ｎ末端の量を本測定法により測定していることを示すものである。
【００７１】
〔実施例１２〕
１）バチラス・エスピー由来のニュートラルプロテイネース（東洋紡製）による糖化ヘモ
グロビン分解反応におけるｐＨの影響評価
１−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイネース（東洋紡製））３２４μｌに２０ｍ
Ｍ ＷＳＴ３を３０．４μｌと糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌを添加してから６０秒
後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、０．１６ｍＭ
ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐ
Ｈ調製液１５μｌを加え、さらに５０秒後に１５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ２を１０μｌ加え
、さらに２５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ加えて、１５０秒間反応さ
せた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行い、７３０ｎｍの吸光度をモニターし
ておき、ＦＯＤ２を加えてから２４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加えてから１４０秒
後の吸光度の差（Ａ１）を求めた。測定スキームを図１７に示した。
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の
操作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。また０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐＨ調製液
１５μｌをＲ２反応液を加えた後ではなく糖化ヘモグロビンを添加する前に加える以外は
同様の操作を行うことでブランク反応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができた。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは
「測定値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。なお、ＥＤ
ＴＡはプロテアーゼの反応を停止または阻害するために添加した。ｐＨ調製液はケトアミ
ンオキシダーゼＦＯＤ２およびＦＯＤ９２３反応時にｐＨが約７．５になる目的で添加し
、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製
液の組み合わせ、および測定結果を表２１に示した。
１−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイネース（東洋紡製））３２４μｌに２０ｍ
Ｍ ＷＳＴ３を３０．４μｌ添加し、さらに糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌを添加し
てから６０秒後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パーオキシダーゼ、
０．１６ｍＭ ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａを５μｌとｐＨ調製液１５μｌを加え、さらに５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２
３を５μｌ加えて、１５０秒間反応させた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行
い、７３０ｎｍの吸光度をモニターしておき、０．５Ｍ ＥＤＴＡとｐＨ調製液を加えて
から４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加えてから１４０秒後の吸光度の差（Ａ１）を求
めた。測定スキームを図１８に示した。
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の
操作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。また０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μｌとｐＨ調製液
１５μｌをＲ２反応液を加えた後ではなく糖化ヘモグロビンを添加する前に加える以外は
同様の操作を行うことでブランク反応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができた。これ
らの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは「測定
値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。なお、ＥＤＴＡは
プロテアーゼの反応を停止または阻害するために添加した。ｐＨ調製液はケトアミンオキ
シダーゼＦＯＤ２およびＦＯＤ９２３反応時にｐＨが約７．５になる目的で添加し、Ｒ１
およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組
み合わせ、および測定結果を表２１に示した。
【００７２】
【表２０】
（２）バチラス．エスピーＡＳＰ８４２由来のプロテアーゼによる糖化ヘモグロビン分解
反応におけるｐＨの影響評価
２−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ａ）のＲ１反応液において１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）のかわりに０．８５Ｕ／ｍｌになるようにバチラス．エスピーＡＳＰ
８４２由来のプロテアーゼを入れ、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤
と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組み合わせを表２２で示したものを用い、１−ａ）
と同様の操作を行った。測定結果を表２２に示した。
２−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３でＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ｂ）のＲ１反応液において１．２ｋＵ／ｍｌ ニュートラルプロテイ
ネース（東洋紡製）のかわりに０．８５Ｕ／ｍｌになるようにバチラス．エスピーＡＳＰ
８４２由来のプロテアーゼを入れ、Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤
と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製液の組み合わせを表２２で示したようにして１−ｂ）と
同様の操作を行った。測定結果を表２２に示した。
（３）リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来のプロテアーゼによる糖化ヘ
モグロビン分解反応におけるｐＨの影響評価
Ｒ１反応液（２０ｍＭ 緩衝液、界面活性剤、塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カルシウ
ム、０．４３Ｕ／ｍｌ リゾバクター・エンザイモゲネス ＹＫ−３６６由来のプロテア
ーゼ）に２０ｍＭ ＷＳＴ３を３０．４μｌと糖化ヘモグロビンサンプル３６μｌと蒸留
水５μｌを添加してから６０秒後にＲ２反応液（１００ｍＭ 緩衝液、５０Ｕ／ｍｌ パ
ーオキシダーゼ、０．１６ｍＭ ＤＡ−６４）４４．６μｌ加えて、さらに３００秒後に
ｐＨ調製液１５μｌを加え、５０秒後に５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ加えて、
１５０秒間反応させた。反応はすべて３７℃で吸光度計のセル中で行い、７３０ｎｍの吸
光度をモニターしておき、ｐＨ調整液を加えてから４０秒後の吸光度とＦＯＤ９２３を加
えてから１４０秒後の吸光度の差（Ａ１）を求めた。測定スキームを図１９に示した。
【００７３】
【表２１】
【００７４】
【表２２】
【００７５】
【表２３】
Ｒ１反応液にあらかじめ３．３３μＭになるようにＦＶＨを入れておいた場合に同様の操
作を行い、吸光度差（Ａ２）を求めた。またＲ１反応液に入れるプロテアーゼをあらかじ
め９５℃で１０分間処理して失活させたものを用いて同様の操作を行うことでブランク反
応時の吸光度差（Ａｂ）を求めることができる。
これらの吸光度差からプロテアーゼにより糖化ヘモグロビンから切り出されたＦＶＨは
「測定値（μＭ）＝（Ａ１−Ａｂ）／（Ａ２−Ａ１）Ｘ３０」で計算できる。
Ｒ１およびＲ２反応液中で用いる緩衝液と界面活性剤と塩化ナトリウム濃度とｐＨ調製
液の組み合わせを表２３で示したようにして実施例１２の１−ｂ）と同様の操作を行った
。測定結果を表２３に示した。
なお、糖化ヘモグロビンサンプルとしては５．９ｍｇ／ｍｌで換算ＩＦＣＣ値１６．７
％のもの（糖化されたβ鎖Ｎ末端濃度の理論値は３０．５μＭとなる）を用いた。表２１
〜２３の結果からプロテアーゼ反応時のｐＨが５．０〜６．０においてはプロテアーゼが
糖化ヘモグロビンからＦＯＤ９２３が作用することができる糖化リジンを含むペプチドを
切り出さず、ＦＯＤ２による消去なく特異的にＦＶＨ量（糖化ヘモグロビンの糖化された
β鎖Ｎ末端の量）を正確に測定でき、つまりヘモグロビンＡ１ｃ量を正確に測定できたこ
とがわかる。
【００７６】
〔実施例１３〕
特異性の高い変異型ケトアミンオキシダーゼＦＯＤ９２３Ｍを用いたプロテアーゼによ
る糖化ヘモグロビン分解産物中のＦＶＨの測定
１−ａ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去してからＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ａ）において、Ｒ１反応液の緩衝液をＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
、界面活性剤を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭ
とし、５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ添加する代わりに、３２Ｕ／ｍｌのＦＯＤ
９２３Ｍを５μｌ添加すること以外は同様の操作をして測定したところ、ＦＶＨの測定値
は２８．６μＭであった。
１−ｂ）プロテアーゼ反応後、ＦＯＤ２で糖化リジンおよび糖化リジンを含むペプチドを
消去することなくＦＯＤ９２３ＭでＦＶＨ量を測定する場合
実施例１２の１−ｂ）において、Ｒ１反応液の緩衝液をＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
、界面活性剤を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、塩化ナトリウム濃度を１５０ｍＭ
とし、５００Ｕ／ｍｌのＦＯＤ９２３を５μｌ添加する代わりに、３２Ｕ／ｍｌのＦＯＤ
９２３Ｍを５μｌ添加すること以外は同様の操作をして測定したところ、ＦＶＨの測定値
は３０．０μＭであった。。
以上のことから、ｐＨ７．５つまりプロテアーゼが糖化ヘモグロビンから糖化リジンお
よび糖化リジンを含むペプチドを切り出してくるような条件においても特異性の高いケト
アミンオキシダーゼを用いることで、ＦＯＤ２による消去なく特異的にＦＶＨ量（糖化ヘ
モグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端の量）を測定でき、つまりヘモグロビンＡ１ｃ量を正
確に測定できることがわかる。
【００７７】
[寄託生物材料への言及]
（１）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１５年２月１２日（原寄託日）
平成１６年4月１２日（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９
（２）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２００４年2月２４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
（３）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１６年１月３０日（原寄託日）
平成１６年4月１２日（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
（４）
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２００４年2月２４日（原寄託日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２
【産業上の利用可能性】
【００７８】
糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端を分離操作せず酵素を用いて特異的に測定す
る方法、測定試薬キットを提供することが可能となる。
【受託番号】
【００７９】
（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０００９
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４１
（３）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１０
（４）ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の反応工程を含む、糖化ヘモグロビンを測定する方法。
（１）試料中の糖化ヘモグロビンと下記（ａ）および（ｂ）の性質を有するプロテアーゼを反応させる工程
プロテアーゼ；
（ａ）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端から、糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出す
（ｂ）糖化ヘモグロビンから実質的にε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを含む糖化ペプチドを切り出さない
（２）前記（１）の反応後の液にケトアミンオキシダーゼを添加して、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンと反応させる工程
（３）（２）の反応生成物あるいは消費物を検出することにより、糖化ヘモグロビンを定量する工程
【請求項１】
以下の反応工程を含む、糖化ヘモグロビンを測定する方法。
（１）試料中の糖化ヘモグロビンと下記（ａ）および（ｂ）の性質を有するプロテアーゼを反応させる工程
プロテアーゼ；
（ａ）糖化ヘモグロビンの糖化されたα鎖Ｎ末端から、糖化アミノ酸または糖化ペプチドを実質的に切り出すことなく、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンを切り出す
（ｂ）糖化ヘモグロビンから実質的にε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンおよび／またはε−１−デオキシフルクトシル−Ｌ−リジンを含む糖化ペプチドを切り出さない
（２）前記（１）の反応後の液にケトアミンオキシダーゼを添加して、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジンと反応させる工程
（３）（２）の反応生成物あるいは消費物を検出することにより、糖化ヘモグロビンを定量する工程
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１３−９９３５９（Ｐ２０１３−９９３５９Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−２２９９６（Ｐ２０１３−２２９９６）
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２０１０−３５７９７（Ｐ２０１０−３５７９７）の分割
【原出願日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２０１０−３５７９７（Ｐ２０１０−３５７９７）の分割
【原出願日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]