ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物結晶
【課題】 ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘと薬物との複合体結晶構造解析を再現性良く実施できる良質の結晶を提供する。
【解決手段】 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘのトリプシン消化物を調製し、再現性良く得られる結晶を作製した。これを用いて特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレン複合体結晶をソーキング法により調製し、分解能２．６Åの薬物複合体結晶構造解析に成功した。
【解決手段】 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘのトリプシン消化物を調製し、再現性良く得られる結晶を作製した。これを用いて特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレン複合体結晶をソーキング法により調製し、分解能２．６Åの薬物複合体結晶構造解析に成功した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析に利用するための肺炎連鎖球菌ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には６種類のＰＢＰが確認されているが、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌では主に３種類のＰＢＰ（ＰＢＰ１ａ、ＰＢＰ２ｘ、ＰＢＰ２ｂ）における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に関与しており、ＰＢＰ２ｘはβ−ラクタム薬の耐性に重要な役割を果たしている（非特許文献１参照。）。従って、ＰＢＰ２ｘとβ−ラクタム薬との原子レベルでの相互作用をＰＢＰ２ｘ−薬物複合体のＸ線結晶構造解析により明らかにすることは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
ＰＢＰ２ｘの結晶構造は膜結合部位を除いた可溶性部分については既に解析されており、薬剤感受性菌であるＲ６株由来ＰＢＰ２ｘについては分解能が３．５Å（非特許文献２参照。）、２．４Å（非特許文献３参照。）、耐性菌に見られる点変異を２箇所導入したＰＢＰ２ｘについては分解能が２．４Å（非特許文献４参照。）、薬剤耐性菌由来ＰＢＰ２ｘについては分解能が３．２Å（非特許文献５参照。）、３．０Å（非特許文献６参照。）である。また、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されている配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＲ６株由来ＰＢＰ２ｘのアミノ酸残基７４〜９３、１８４〜１９９、２１８〜２２９および２５７〜７５０を１から３アミノ酸残基のリンカーでつないで発現させたｍｉｎｉ−ＰＢＰ２ｘについて結晶化の報告がある（特許文献１参照。）。しかしながら、薬物複合体の結晶構造解析はわずか２例であり、その内の１例は３．５Å分解能でのセフロキシム複合体であるが、分解能が悪いために電子密度が不明瞭であり、ＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用は明らかでなく、ドラッグデザインには役立たない（非特許文献２参照。）。残りの１例は２．８Å分解能でのセフロキシム複合体の例であるが、この解析に使用した結晶は結晶が得られるまで数ヶ月以上かかり、結晶化の最中にプロテアーゼにより部分的に切断されることから結晶作製の再現性が悪く、化合物複合体結晶作製に利用するのは困難である（特許文献１および非特許文献３参照。）。また、セフロキシムは複合体中において３位側鎖が切断されていることから、セフジトレンに代表される耐性菌にも有効なセフェム系β−ラクタム薬の３位側鎖とＰＢＰ２ｘとの相互作用様式は未だ明らかではない。従って、特徴的な側鎖を有するβ−ラクタム薬との複合体結晶作製が可能で、高分解能のＸ線回折能を持ち、なおかつ再現性良く調製が可能なＰＢＰ２ｘ結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献７参照。）。その一つの方法としてプロテアーゼであるトリプシンを利用してタンパク質を切断する方法が知られている。トリプシンは表面に露出している塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニン残基の直後を選択的に切断することにより、タンパク質の揺らいでいる領域を除去できる場合がある。肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ａではトリプシン消化物において分解能２．８ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、消化物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため１箇所点変異を導入している（非特許文献８参照。）。また、肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ｂではトリプシン消化物において分解能１．９ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、消化物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため３箇所点変異を導入している（非特許文献９参照。）。しかしながら、トリプシン消化のパターンは個々のタンパク質に依存し、ＰＢＰ２ｘでは未だ明らかになっていないことから、点変異導入の必要性も含め結晶化に適したトリプシン消化物の作製には試行錯誤が必要であり、そもそもＰＢＰ２ｘに対してトリプシン消化が有効な手段であるかも明らかではない。結晶化に適したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物を新規に見出すことができれば、ＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用の解明および新薬の創出につながると期待される。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７５４１
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（６）２２４４−５０（２００４）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（３）２８４−９（１９９６）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９（２）４７７−８５（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４５）４４４４８−５６（２００３）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４８）４５１０６−１２（２００１）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１６）１６４６３−７０（２００４）
【非特許文献７】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献８】Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５９（６）１０６７−９（２００３）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３）５７７−８２（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の肺炎連鎖球菌ＰＢＰ２ｘ結晶は分解能が悪い、側鎖の大きい薬物との複合体が作製できない、結晶作製の再現性が悪い、のいずれかの理由により薬物複合体のＸ線結晶構造解析に不適である。そのため、創薬において重要な情報であるＰＢＰ２ｘとβ−ラクタム薬の詳細な相互作用様式を得ることができない。一般にトリプシン消化により良質の結晶が得られる可能性があるが、ＰＢＰ２ｘへの適用はない。本発明が解決しようとする課題は、結晶化に適したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物を新規に見出し、高分解能の薬物複合体結晶構造解析を再現性良く実施できる良質の結晶を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、配列番号５に示される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘのアミノ酸残基番号４９〜７５０からなる可溶性部分をトリプシン消化することにより、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物および配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を見出した。これらのトリプシン消化物結晶を用いて良質の結晶が得られる条件を探索したところ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物の結晶を再現性良く得ることに成功し、Ｘ線回折実験により分解能２．９ÅのＸ線回折強度データが得られた。また、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレン複合体結晶をソーキング法により調製し、分解能２．６ÅのＸ線回折強度データを得ることに成功した。分子置換法による位相決定の結果、酵素活性部位に化合物の電子密度が観測され、薬物複合体の結晶構造解析に成功した。すなわち、本発明は、Ｘ線結晶構造解析に利用するための肺炎連鎖球菌ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶に関する。前記結晶において、その空間群はＰ２１２１２であり、格子定数はａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【０００７】
本発明は以下の発明を含有する。
（１）Ｘ線結晶構造解析により立体構造を解析し得ることを特徴とする肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物の結晶。
（２）空間群がＰ２１２１２である（１）に記載の結晶。
（３）空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）に記載の結晶。
（４）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２である（１）に記載の結晶。
（５）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）に記載の結晶。
（６）配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成される（１）に記載の結晶。
（７）Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるタンパク質。
（８）Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるタンパク質。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は再現性良く調製が可能である。また、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレンとの複合体結晶の調製が可能であり、分解能２．６Åでの結晶構造解析に成功した。従来の技術で得られる結晶は分解能が悪い、側鎖の大きい薬物複合体が作製できない、結晶作製の再現性が悪い、のいずれかの理由により薬物複合体のＸ線結晶構造解析に不適であったが、本発明のトリプシン消化物結晶を利用することにより、創薬において重要な情報であるＰＢＰ２ｘと薬物の詳細な相互作用様式を迅速に解明することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物＞＞
本発明において、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、好ましくは肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来ＰＢＰ２ｘの膜結合機能を有するＮ末端領域を除いた部分である。ＰＢＰ２ｘ可溶性部分は由来となる株およびＮ末端が異なる種々のものが存在するが、好ましくは、配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号４９から７５０で構成される。本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物は、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分をプロテアーゼであるトリプシンで消化することにより得られる。トリプシン消化の反応条件により種々の断片が得られるが、反応条件をコントロールすることにより、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物と配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を得ることができる。
【００１０】
＜＜ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の発現＞＞
ＰＢＰ２ｘ可溶性部分は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ２ｘ可溶性部分をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分に付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製＞＞
Ｈｉｓ−ｔａｇを融合して大腸菌で発現させたＰＢＰ２ｘ可溶性部分は、金属イオン、好ましくはニッケルイオンを配位させたアフィニティーカラムを用いた慣用の技術により容易に精製が可能である。精製したＰＢＰ２ｘ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後、適当量のトリプシンを加え、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう加えることでトリプシン消化物が得られる。添加するトリプシンの終濃度は典型的には０．１〜１ｍｇ／ｍｌであるが、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分のタンパク質濃度に依存するため、好ましくは、毎回、少量での確認実験により決定する必要がある。トリプシン消化物は陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いた一般的なクロマトグラフィーの手法を組み合わせて精製することが可能であり、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物と配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を各々分取することができる。
【００１２】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化＞＞
一般的に蛋白質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに沈殿剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。蛋白質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いる蛋白質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。また、薬物複合体結晶を作製するには、薬物結合部位に空間のあるパッキングを有する結晶を作製しなければならない。本発明におけるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶化の方法は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法などのいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは蒸気拡散法であるハンギングドロップ法が用いられる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化に用いるタンパク質としては、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物が望ましい。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ程度であることが望ましい。そして、蛋白質溶液に沈殿剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化に用いられる沈殿剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。本発明においては、ポリエチレングリコールを好ましく用いることができ、ポリエチレングリコール４０００を特に好ましく用いることができる。また、塩類として、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを加えることも可能である。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができるが、本発明においては、好ましくは用いる必要がない。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒などを用いることができるが、好ましくは、イソプロパノールを用いることができる。沈殿剤の組み合わせについては、（１）１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、（２）１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、５％ イソプロパノール、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムの２通りの組み合わせが好ましい。薬物複合体結晶の作製には、共結晶化法、ソーキング法のいずれの方法を使用しても良いが、好ましくはソーキング法が用いられ、結晶を薬物溶液に浸漬することで複合体結晶が作製できる。
【００１３】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にグリセロールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは２０％〜３０％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８などの第３世代の放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。例えば、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数はａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００１４】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定＞＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法などが用いられるが、ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定には、好ましくは、分子置換法が用いられる。サーチモデルには、既に構造解析されたＰＢＰ２ｘのいかなるモデルも利用可能であるが、好ましくはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に登録されているＰＤＢ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：１ＱＭＥのモデルを用いることができる。化合物複合体の結晶構造解析も同様に実施可能であるが、好ましくは、構造決定したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物Ｆｒｅｅ体のモデルをサーチモデルとして用いることができる。
【００１５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００１６】
＜＜肺炎連鎖球菌由来ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の大腸菌発現系の構築＞＞
（１）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来のゲノムＤＮＡの単離
肺炎連鎖球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）を血液寒天基礎培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で二酸化炭素５％、３７℃の条件下で１８時間培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付の説明書記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００１７】
（２）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘ可溶性部分発現ベクターの構築
膜結合領域を除いたＰＢＰ２ｘ可溶性部分をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００１８】
ＰＮ−ＰＢＰ２ｘ−５：５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＧＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号６）
ＰＮ−ＰＢＰ２ｘ−３：５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴ−３’（配列番号７）
【００１９】
上記（１）で単離したゲノムＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。この断片を予めＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−Ｒ６−ＰＢＰ２ｘ）を調製しＤＮＡ配列を確認し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されている肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘの配列（配列番号５）の可溶性部分（アミノ酸残基番号４９から７５０）をコードすることを確認した。
【実施例２】
【００２０】
＜＜ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の発現＞＞
実施例１の（２）で得られたｐＥＴ１５ｂ−Ｒ６−ＰＢＰ２ｘの組み換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１０Ｌ中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）４００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．４ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、５μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、５ｍ ｕｎｉｔ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製））に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を２回施し、細胞を破砕した。遠心分離（３０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続くガラスろ紙および０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製＞＞
（１）ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の精製
以下の精製は４℃で行った。細胞抽出液は２等分し、以下の精製操作を２回繰り返して実施した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（アマシャムバイオサイエンス社製）を３本直列に連結し、マニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、３カラム容量の洗浄バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（４カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２２】
（２）トリプシン消化
上記（１）で精製したＰＢＰ２ｘ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後回収し、まずはじめに小スケールでのトリプシン消化の条件検討を実施した。回収液１０μＬを０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液と等量混合し、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．５３ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン消化を実施した。
【００２３】
（３）ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製
（３−１）
＜＜陰イオン交換カラムによる精製＞＞
上記（２）で得られたトリプシン消化物を陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、トリプシン消化物溶液を等量に分けて精製は２度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにトリプシン消化物溶液をアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１２カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、約９０〜１４０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分をＦｒ．１、約１８０〜２１０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分をＦｒ．２として別々にまとめ、以後の精製は別個に実施した。
【００２４】
（３−２）
＜＜ハイドロキシアパタイトカラムによる精製＞＞
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍｌのカラムを作製した。次に、（３−１）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８）に対して透析しバッファー置換を行い、平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速３ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５−５００ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（３０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をＦｒ．１、Ｆｒ．２に関して各々まとめた。
【００２５】
（３−３）
＜＜陽イオン交換カラムによる精製＞＞
上記（３−２）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０）に対して透析しバッファー置換を行い、平衡化バッファーで平衡化した陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速４ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０中の０−１Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（４０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をＦｒ．２に関してまとめた。Ｆｒ．１は非吸着画分を回収した。
【００２６】
（３−４）
＜＜ゲルろ過カラムによる精製＞＞
上記（３−３）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて各々０．７ｍＬ、０．７５ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な画分を各々まとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【００２７】
（３−５）
＜＜精製したトリプシン消化物の同定＞＞
上記（３−４）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１ ８０μｇおよびＦｒ．２ ６０μｇを限外ろ過膜ウルトラフリーＭＣ５０００（ミリポア社製）を用いて１％ギ酸にバッファー置換し、５０μＬ回収した。エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により、分子量を解析したところＦｒ．１は分子量４１９８１、１８４６１、１３６９８の３本の主要なピークが観測された。Ｆｒ．２は分子量６１５５０、１３６９９の２本の主要なピークが観測された。また、Ｆｒ．１、Ｆｒ．２各１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｆｒ．１の分子量４２ｋ、１６ｋ、１３ｋおよびＦｒ．２の分子量６４ｋ、１３ｋ付近のバンドを切り出しプロテインシークエンサーを利用してＮ末端アミノ酸配列を各々５残基確認した。その結果、Ｆｒ．１の分子量４２ｋ、１６ｋ、１３ｋ、Ｆｒ．２の分子量６４ｋ、１３ｋ付近のバンドのＮ末端５残基は各々ＬＧＮＩＶ、ＴＶＰＡＫ、ＡＬＥＱＶ、ＫＶＨＱＴ、ＡＬＥＱＶであった。これらの結果からＦｒ．１は配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、Ｆｒ．２は配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されることが判明した。
【実施例４】
【００２８】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化＞＞
（１）Ｆｒｅｅ体結晶の作製
ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例３で精製した配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物溶液２．０μＬと結晶化剤（１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）２．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２５０μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日から数週間で結晶が得られた。得られたトリプシン消化物結晶の顕微鏡写真を図1に示す。また、結晶化セットアップ１日後にストリークシーディング法により種結晶を植え付けた場合においても同様の結晶が得られた。
【００２９】
（２）セフジトレン複合体結晶の調製
セフェム系β−ラクタム薬セフジトレンピボキシルはプロドラッグであり、活性本体であるセフジトレンのナトリウム塩（セフジトレンナトリウム）を当社工場から入手した。上記（１）で作製した結晶をセフジトレン溶液（５ｍｇ／ｍｌ セフジトレンナトリウム、２３％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）中に移し、室温で１時間４５分反応させることによりセフジトレン複合体結晶を調製した。
【実施例５】
【００３０】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
実施例４で得られた結晶を、安定化母液（１８−２３％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）、１２．５％グリセロール含有の安定化母液、２５％グリセロール含有の安定化母液に順々に移し、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）またはＪｕｐｉｔｅｒ２１０（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は０．５°または１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データをＦｒｅｅ体について分解能２．９Å、セフジトレン複合体について２．６Åで処理した。その結果、Ｆｒｅｅ体結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０６．８８Å、ｂ＝１７１．７１Å、ｃ＝８９．３６Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは９９．８％、Ｒｍｅｒｇｅは６．１％であった。また、セフジトレン複合体結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０７．７４Å、ｂ＝１７１．２０Å、ｃ＝８９．１５Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは８９．９％、Ｒｍｅｒｇｅは５．４％であった。
【実施例６】
【００３１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定＞＞
実施例５で得られた回折強度データを、ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４）に含まれるプログラムＭｏｌｒｅｐを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）にＰＤＢ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：１ＱＭＥとして登録されているＰＢＰ２ｘ可溶性部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に２分子のモデルを見出すことができた。次に構造精密化プログラムであるＣＮＸ（アクセルリス社製）、ＨＴ ＸＰＩＰＥ（アクセルリス社製）およびＣＣＰ４に含まれるＲｅｆｍａｃ５を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるＤＳ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ（アクセルリス社製）、Ｔｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ（ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ製）を用いたモデルの修正を繰り返し実施し、Ｆｒｅｅ体およびセフジトレン複合体の結晶構造を得た。セフジトレン複合体においては、酵素活性部位にセフジトレンに相当する電子密度が観測された（図２）。決定した結晶構造の正確さの指標であるＲ因子は、Ｆｒｅｅ体において０．２３７、セフジトレン複合体において０．２６０であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子はＦｒｅｅ体において０．３００、セフジトレン複合体において０．２９０であった。
【００３２】
今回決定したセフジトレン複合体結晶においては、セフジトレン３位側鎖の電子密度も明瞭に観測され、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレンと標的タンパク質であるＰＢＰ２ｘとの相互作用様式が世界で初めて明らかとなった。今回得られた情報は新規化合物のデザインを可能とし、今後の新薬の創出に多いに活用できるものである。また、本発明のトリプシン消化物結晶を用いて、他の薬物との複合体結晶作製もセフジトレン同様の手順で可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は、Ｘ線結晶構造解析によるＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用の解明および新薬の創出に活用できるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶の顕微鏡写真である。
【図２】ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶／セフジトレン複合体における薬物結合部位近傍の図である。タンパク質をＣαモデルで表示し、セフジトレンを除いたモデルから計算したＦｏ−Ｆｃ電子密度図およびセフジトレンモデルを重ねて表示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線結晶構造解析に利用するための肺炎連鎖球菌ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は細菌における細胞壁を構成する構造ユニットであるムレインモノマーを基質として細胞壁ペプチドグリカンを組み立てる一連の酵素群であり、細菌のペプチドグリカンの重合および架橋反応に働く膜結合型のタンパク質である。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）には６種類のＰＢＰが確認されているが、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌では主に３種類のＰＢＰ（ＰＢＰ１ａ、ＰＢＰ２ｘ、ＰＢＰ２ｂ）における変異がβ−ラクタム薬の感受性低下に関与しており、ＰＢＰ２ｘはβ−ラクタム薬の耐性に重要な役割を果たしている（非特許文献１参照。）。従って、ＰＢＰ２ｘとβ−ラクタム薬との原子レベルでの相互作用をＰＢＰ２ｘ−薬物複合体のＸ線結晶構造解析により明らかにすることは、耐性のメカニズムを説明するだけでなく、耐性菌に有効な新薬を創出する上でも非常に重要である。
【０００３】
ＰＢＰ２ｘの結晶構造は膜結合部位を除いた可溶性部分については既に解析されており、薬剤感受性菌であるＲ６株由来ＰＢＰ２ｘについては分解能が３．５Å（非特許文献２参照。）、２．４Å（非特許文献３参照。）、耐性菌に見られる点変異を２箇所導入したＰＢＰ２ｘについては分解能が２．４Å（非特許文献４参照。）、薬剤耐性菌由来ＰＢＰ２ｘについては分解能が３．２Å（非特許文献５参照。）、３．０Å（非特許文献６参照。）である。また、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されている配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＲ６株由来ＰＢＰ２ｘのアミノ酸残基７４〜９３、１８４〜１９９、２１８〜２２９および２５７〜７５０を１から３アミノ酸残基のリンカーでつないで発現させたｍｉｎｉ−ＰＢＰ２ｘについて結晶化の報告がある（特許文献１参照。）。しかしながら、薬物複合体の結晶構造解析はわずか２例であり、その内の１例は３．５Å分解能でのセフロキシム複合体であるが、分解能が悪いために電子密度が不明瞭であり、ＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用は明らかでなく、ドラッグデザインには役立たない（非特許文献２参照。）。残りの１例は２．８Å分解能でのセフロキシム複合体の例であるが、この解析に使用した結晶は結晶が得られるまで数ヶ月以上かかり、結晶化の最中にプロテアーゼにより部分的に切断されることから結晶作製の再現性が悪く、化合物複合体結晶作製に利用するのは困難である（特許文献１および非特許文献３参照。）。また、セフロキシムは複合体中において３位側鎖が切断されていることから、セフジトレンに代表される耐性菌にも有効なセフェム系β−ラクタム薬の３位側鎖とＰＢＰ２ｘとの相互作用様式は未だ明らかではない。従って、特徴的な側鎖を有するβ−ラクタム薬との複合体結晶作製が可能で、高分解能のＸ線回折能を持ち、なおかつ再現性良く調製が可能なＰＢＰ２ｘ結晶の創出が望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質のＮ末端、Ｃ末端やループ領域は構造が揺らいでいる場合があり、その際には複数のコンフォメーションを取り得ることから、タンパク質の揺らいでいる領域の除去やドメインの切り出しは均一のコンフォメーションから構成される高分解能のＸ線回折能を有する結晶を作製するために有効な手段である（非特許文献７参照。）。その一つの方法としてプロテアーゼであるトリプシンを利用してタンパク質を切断する方法が知られている。トリプシンは表面に露出している塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニン残基の直後を選択的に切断することにより、タンパク質の揺らいでいる領域を除去できる場合がある。肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ａではトリプシン消化物において分解能２．８ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、消化物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため１箇所点変異を導入している（非特許文献８参照。）。また、肺炎連鎖球菌ＰＢＰ１ｂではトリプシン消化物において分解能１．９ÅのＸ線回折能を示す結晶が得られており、その際、消化物の純度を確保しマイナー部位での切断を避けるため３箇所点変異を導入している（非特許文献９参照。）。しかしながら、トリプシン消化のパターンは個々のタンパク質に依存し、ＰＢＰ２ｘでは未だ明らかになっていないことから、点変異導入の必要性も含め結晶化に適したトリプシン消化物の作製には試行錯誤が必要であり、そもそもＰＢＰ２ｘに対してトリプシン消化が有効な手段であるかも明らかではない。結晶化に適したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物を新規に見出すことができれば、ＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用の解明および新薬の創出につながると期待される。
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７５４１
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４８（６）２２４４−５０（２００４）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３（３）２８４−９（１９９６）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９（２）４７７−８５（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４５）４４４４８−５６（２００３）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４８）４５１０６−１２（２００１）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１６）１６４６３−７０（２００４）
【非特許文献７】ＢＩＯベンチャー ３（５）、３６−３９（２００３）
【非特許文献８】Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５９（６）１０６７−９（２００３）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３）５７７−８２（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の肺炎連鎖球菌ＰＢＰ２ｘ結晶は分解能が悪い、側鎖の大きい薬物との複合体が作製できない、結晶作製の再現性が悪い、のいずれかの理由により薬物複合体のＸ線結晶構造解析に不適である。そのため、創薬において重要な情報であるＰＢＰ２ｘとβ−ラクタム薬の詳細な相互作用様式を得ることができない。一般にトリプシン消化により良質の結晶が得られる可能性があるが、ＰＢＰ２ｘへの適用はない。本発明が解決しようとする課題は、結晶化に適したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物を新規に見出し、高分解能の薬物複合体結晶構造解析を再現性良く実施できる良質の結晶を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、配列番号５に示される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘのアミノ酸残基番号４９〜７５０からなる可溶性部分をトリプシン消化することにより、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物および配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を見出した。これらのトリプシン消化物結晶を用いて良質の結晶が得られる条件を探索したところ、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物の結晶を再現性良く得ることに成功し、Ｘ線回折実験により分解能２．９ÅのＸ線回折強度データが得られた。また、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレン複合体結晶をソーキング法により調製し、分解能２．６ÅのＸ線回折強度データを得ることに成功した。分子置換法による位相決定の結果、酵素活性部位に化合物の電子密度が観測され、薬物複合体の結晶構造解析に成功した。すなわち、本発明は、Ｘ線結晶構造解析に利用するための肺炎連鎖球菌ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶に関する。前記結晶において、その空間群はＰ２１２１２であり、格子定数はａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【０００７】
本発明は以下の発明を含有する。
（１）Ｘ線結晶構造解析により立体構造を解析し得ることを特徴とする肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物の結晶。
（２）空間群がＰ２１２１２である（１）に記載の結晶。
（３）空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）に記載の結晶。
（４）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２である（１）に記載の結晶。
（５）配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である（１）に記載の結晶。
（６）配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成される（１）に記載の結晶。
（７）Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるタンパク質。
（８）Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるタンパク質。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は再現性良く調製が可能である。また、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレンとの複合体結晶の調製が可能であり、分解能２．６Åでの結晶構造解析に成功した。従来の技術で得られる結晶は分解能が悪い、側鎖の大きい薬物複合体が作製できない、結晶作製の再現性が悪い、のいずれかの理由により薬物複合体のＸ線結晶構造解析に不適であったが、本発明のトリプシン消化物結晶を利用することにより、創薬において重要な情報であるＰＢＰ２ｘと薬物の詳細な相互作用様式を迅速に解明することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物＞＞
本発明において、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分とは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、好ましくは肺炎連鎖球菌Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）由来ＰＢＰ２ｘの膜結合機能を有するＮ末端領域を除いた部分である。ＰＢＰ２ｘ可溶性部分は由来となる株およびＮ末端が異なる種々のものが存在するが、好ましくは、配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基番号４９から７５０で構成される。本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物は、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分をプロテアーゼであるトリプシンで消化することにより得られる。トリプシン消化の反応条件により種々の断片が得られるが、反応条件をコントロールすることにより、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物と配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を得ることができる。
【００１０】
＜＜ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の発現＞＞
ＰＢＰ２ｘ可溶性部分は、それをコードするＤＮＡ断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、特にＤＮＡ発現ベクターの形態とし、それによって宿主細胞の形質転換を行い、その形質転換体を培養することによって得られる。このＤＮＡ分子は、ベクター分子にＰＢＰ２ｘ可溶性部分をコードするＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案して、ウィルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択することができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合はｐＵＣ、ｐＢＲ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。宿主細胞としては、宿主−ベクター系が確立されているものであれば利用可能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質転換体は、適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に従い回収することができる。ここで、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分に付加的ポリペプチド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン残基に富むポリペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
【００１１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製＞＞
Ｈｉｓ−ｔａｇを融合して大腸菌で発現させたＰＢＰ２ｘ可溶性部分は、金属イオン、好ましくはニッケルイオンを配位させたアフィニティーカラムを用いた慣用の技術により容易に精製が可能である。精製したＰＢＰ２ｘ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後、適当量のトリプシンを加え、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう加えることでトリプシン消化物が得られる。添加するトリプシンの終濃度は典型的には０．１〜１ｍｇ／ｍｌであるが、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分のタンパク質濃度に依存するため、好ましくは、毎回、少量での確認実験により決定する必要がある。トリプシン消化物は陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いた一般的なクロマトグラフィーの手法を組み合わせて精製することが可能であり、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物と配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるトリプシン消化物を各々分取することができる。
【００１２】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化＞＞
一般的に蛋白質の結晶化は容易ではない。結晶化できる条件が比較的容易に見出される場合もあるが、通常は種々の結晶化条件をスクリーニングしなければならない。さらに沈殿剤の濃度、ｐＨ、塩の種類と濃度、添加剤などの条件を最適化することによって、Ｘ線結晶構造解析に供することができる良質の結晶が得られる。また、いかなる条件でも結晶化しない蛋白質も存在すると考えられている。蛋白質の結晶が得られなければＸ線結晶構造解析を行うことができない。また、Ｘ線結晶構造解析に用いる蛋白質の結晶は、結晶であればいかなるものでも解析可能であるわけではない。実際にＸ線を照射した際に、高分解能の回折強度データが得られることが必要である。また、薬物複合体結晶を作製するには、薬物結合部位に空間のあるパッキングを有する結晶を作製しなければならない。本発明におけるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶化の方法は、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法などのいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは蒸気拡散法であるハンギングドロップ法が用いられる。また、シーディング法またはリザーバー溶液にオイルを重層することにより結晶核の形成および結晶成長をコントロールすることもできる。結晶化に用いるタンパク質としては、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるトリプシン消化物が望ましい。結晶化に用いる精製タンパク質の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ程度であることが望ましい。そして、蛋白質溶液に沈殿剤、塩類、緩衝液、添加剤などを適当量加えて、結晶化を行う。本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化に用いられる沈殿剤としては、硫酸アンモニウムなどの無機塩類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、イソプロパノールやエタノールなどの有機溶媒などが挙げられる。本発明においては、ポリエチレングリコールを好ましく用いることができ、ポリエチレングリコール４０００を特に好ましく用いることができる。また、塩類として、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを加えることも可能である。また、緩衝液としては、公知の緩衝液のいずれも用いることができるが、本発明においては、好ましくは用いる必要がない。さらに添加剤としては、種々の金属イオン、有機溶媒などを用いることができるが、好ましくは、イソプロパノールを用いることができる。沈殿剤の組み合わせについては、（１）１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、（２）１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、５％ イソプロパノール、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムの２通りの組み合わせが好ましい。薬物複合体結晶の作製には、共結晶化法、ソーキング法のいずれの方法を使用しても良いが、好ましくはソーキング法が用いられ、結晶を薬物溶液に浸漬することで複合体結晶が作製できる。
【００１３】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
上記のようにして得られる結晶の外観、単位格子の種類・大きさなどはその結晶に固有のものであり、良質の結晶を用いれば、Ｘ線回折実験により高分解能の回折強度データを取得することができる。結晶を多価アルコールを含有する抗凍結溶液中に浸した後凍結させ、凍結状態でＸ線回折データを収集し、Ｘ線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられる。これらの中で特にグリセロールが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は、好ましくは２０％〜３０％である。Ｘ線を照射して回折強度データを取得するには、いかなるＸ線発生装置を用いることができるが、好ましくは、（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８などの第３世代の放射光施設を利用することができる。得られたＸ線回折強度データを処理することにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。例えば、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数はａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００１４】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定＞＞
上記のように得られたデータを用いてＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定が可能となる。一般に位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、多波長異常分散法などが用いられるが、ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定には、好ましくは、分子置換法が用いられる。サーチモデルには、既に構造解析されたＰＢＰ２ｘのいかなるモデルも利用可能であるが、好ましくはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に登録されているＰＤＢ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：１ＱＭＥのモデルを用いることができる。化合物複合体の結晶構造解析も同様に実施可能であるが、好ましくは、構造決定したＰＢＰ２ｘトリプシン消化物Ｆｒｅｅ体のモデルをサーチモデルとして用いることができる。
【００１５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は実施例によって限定されるものではない。また、各種ベクターの作製、蛋白質の発現等は、特に記載のない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊（２００１））などに記載の公知の手法に従って実施できる。
【実施例１】
【００１６】
＜＜肺炎連鎖球菌由来ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の大腸菌発現系の構築＞＞
（１）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来のゲノムＤＮＡの単離
肺炎連鎖球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６株（ＡＴＣＣ４９６１９）を血液寒天基礎培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で二酸化炭素５％、３７℃の条件下で１８時間培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付の説明書記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００１７】
（２）肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘ可溶性部分発現ベクターの構築
膜結合領域を除いたＰＢＰ２ｘ可溶性部分をコードするＤＮＡを単離するため以下のプライマーを設計した。
【００１８】
ＰＮ−ＰＢＰ２ｘ−５：５’−ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＧＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号６）
ＰＮ−ＰＢＰ２ｘ−３：５’−ＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴ−３’（配列番号７）
【００１９】
上記（１）で単離したゲノムＤＮＡを鋳型に、前記プライマーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を添付の説明書に従い実施した。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。この断片を予めＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断したベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添付の説明書の方法に従い用い、サブクローニングした。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の説明書の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ ａｇａｒプレート上にて、３７℃で一晩培養し、アンピシリン耐性コロニーを取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（ｐＥＴ１５ｂ−Ｒ６−ＰＢＰ２ｘ）を調製しＤＮＡ配列を確認し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｐ１４６７７に登録されている肺炎連鎖球菌Ｒ６株由来ＰＢＰ２ｘの配列（配列番号５）の可溶性部分（アミノ酸残基番号４９から７５０）をコードすることを確認した。
【実施例２】
【００２０】
＜＜ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の発現＞＞
実施例１の（２）で得られたｐＥＴ１５ｂ−Ｒ６−ＰＢＰ２ｘの組み換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１０Ｌ中で６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．８に達するまで増殖させた。終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３時間誘導後、遠心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）４００ｍＬに懸濁した後、再度、遠心分離機によって集菌し、−２０℃で凍結保存した。菌体を菌体破砕バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、１μＭ ロイペプチン、１μＭ ペプスタチンＡ、０．４ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、５μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、５ｍ ｕｎｉｔ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製））に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。次に１分間の超音波処理を２回施し、細胞を破砕した。遠心分離（３０分間、１２０００ｒｐｍ）とそれに続くガラスろ紙および０．２μｍのフィルターによって超音波処理の残渣を除去し、細胞抽出液を得た。
【実施例３】
【００２１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製＞＞
（１）ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の精製
以下の精製は４℃で行った。細胞抽出液は２等分し、以下の精製操作を２回繰り返して実施した。ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム ５ｍＬ（アマシャムバイオサイエンス社製）を３本直列に連結し、マニュアル記載の方法でニッケルを結合させた後、平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ イミダゾール）で平衡化した。そこへ細胞抽出液を流速１ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、３カラム容量の洗浄バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、５００ｍＭ 塩化ナトリウム中の２０ｍＭ−５００ｍＭ イミダゾールの直線勾配（４カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、ＰＢＰ２ｘ可溶性部分の主要なフラクションをまとめて回収した。
【００２２】
（２）トリプシン消化
上記（１）で精製したＰＢＰ２ｘ可溶性部分を２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に対して透析した後回収し、まずはじめに小スケールでのトリプシン消化の条件検討を実施した。回収液１０μＬを０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、Ｓｉｇｍａ社製）溶液と等量混合し、２５℃、１時間反応させた後、フッ化フェニルメチルスルホニルを終濃度１ｍＭになるよう添加し反応を止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各濃度におけるトリプシン消化のパターンを確認し、トリプシンの添加量を終濃度０．５３ｍｇ／ｍｌと決定し、残りの全サンプルのトリプシン消化を実施した。
【００２３】
（３）ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の精製
（３−１）
＜＜陰イオン交換カラムによる精製＞＞
上記（２）で得られたトリプシン消化物を陰イオン交換カラムであるＰＯＲＯＳ ＨＱ／２０（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製した。流速は１０ｍＬ／ｍｉｎであり、トリプシン消化物溶液を等量に分けて精製は２度実施した。平衡化バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化したカラムにトリプシン消化物溶液をアプライした。３カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０−３００ｍＭ 塩化ナトリウムの直線勾配（１２カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出画分を確認し、約９０〜１４０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分をＦｒ．１、約１８０〜２１０ｍＭ 塩化ナトリウムで溶出した画分をＦｒ．２として別々にまとめ、以後の精製は別個に実施した。
【００２４】
（３−２）
＜＜ハイドロキシアパタイトカラムによる精製＞＞
ハイドロキシアパタイトカラムは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ ２０μｍ（バイオラッド社製）を担体として用い、マニュアル記載の方法でカラム容量８ｍｌのカラムを作製した。次に、（３−１）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を平衡化バッファー（５ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８）に対して透析しバッファー置換を行い、平衡化バッファーで平衡化したカラムに流速３ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５−５００ｍＭ リン酸カリウムバッファー ｐＨ ６．８の直線勾配（３０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をＦｒ．１、Ｆｒ．２に関して各々まとめた。
【００２５】
（３−３）
＜＜陽イオン交換カラムによる精製＞＞
上記（３−２）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０）に対して透析しバッファー置換を行い、平衡化バッファーで平衡化した陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ ＨＲ１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速４ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ ５．０中の０−１Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配（４０カラム容量）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な溶出画分をＦｒ．２に関してまとめた。Ｆｒ．１は非吸着画分を回収した。
【００２６】
（３−４）
＜＜ゲルろ過カラムによる精製＞＞
上記（３−３）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１およびＦｒ．２を保持分子量３００００以上の限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ ３０ｋＤａ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）を用いて各々０．７ｍＬ、０．７５ｍＬまで濃縮し、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で平衡化したゲルろ過カラムＨｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより主要な画分を各々まとめ、上記記載の限外ろ過膜を用いて１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮後、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【００２７】
（３−５）
＜＜精製したトリプシン消化物の同定＞＞
上記（３−４）で得られたトリプシン消化物Ｆｒ．１ ８０μｇおよびＦｒ．２ ６０μｇを限外ろ過膜ウルトラフリーＭＣ５０００（ミリポア社製）を用いて１％ギ酸にバッファー置換し、５０μＬ回収した。エレクトロスプレイイオン化法による質量分析装置により、分子量を解析したところＦｒ．１は分子量４１９８１、１８４６１、１３６９８の３本の主要なピークが観測された。Ｆｒ．２は分子量６１５５０、１３６９９の２本の主要なピークが観測された。また、Ｆｒ．１、Ｆｒ．２各１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、Ｆｒ．１の分子量４２ｋ、１６ｋ、１３ｋおよびＦｒ．２の分子量６４ｋ、１３ｋ付近のバンドを切り出しプロテインシークエンサーを利用してＮ末端アミノ酸配列を各々５残基確認した。その結果、Ｆｒ．１の分子量４２ｋ、１６ｋ、１３ｋ、Ｆｒ．２の分子量６４ｋ、１３ｋ付近のバンドのＮ末端５残基は各々ＬＧＮＩＶ、ＴＶＰＡＫ、ＡＬＥＱＶ、ＫＶＨＱＴ、ＡＬＥＱＶであった。これらの結果からＦｒ．１は配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、Ｆｒ．２は配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されることが判明した。
【実施例４】
【００２８】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶化＞＞
（１）Ｆｒｅｅ体結晶の作製
ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。実施例３で精製した配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるＰＢＰ２ｘトリプシン消化物溶液２．０μＬと結晶化剤（１０−２５％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）２．０μＬをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として上記結晶化剤５００μＬをＶＤＸプレート（ハンプトンリサーチ社製）のウェルに分注し、Ａｌ’ｓオイル（ハンプトンリサーチ社製）２５０μＬをリザーバー溶液の上に重層した。ウェルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉した。プレートを２０℃の恒温槽内に静置すると数日から数週間で結晶が得られた。得られたトリプシン消化物結晶の顕微鏡写真を図1に示す。また、結晶化セットアップ１日後にストリークシーディング法により種結晶を植え付けた場合においても同様の結晶が得られた。
【００２９】
（２）セフジトレン複合体結晶の調製
セフェム系β−ラクタム薬セフジトレンピボキシルはプロドラッグであり、活性本体であるセフジトレンのナトリウム塩（セフジトレンナトリウム）を当社工場から入手した。上記（１）で作製した結晶をセフジトレン溶液（５ｍｇ／ｍｌ セフジトレンナトリウム、２３％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）中に移し、室温で１時間４５分反応させることによりセフジトレン複合体結晶を調製した。
【実施例５】
【００３０】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶のＸ線回折強度データの収集＞＞
実施例４で得られた結晶を、安定化母液（１８−２３％ ポリエチレングリコール４０００、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ 酢酸ナトリウム）、１２．５％グリセロール含有の安定化母液、２５％グリセロール含有の安定化母液に順々に移し、−１７０℃の窒素ガス気流にて急速凍結した。これを（財）高輝度光科学研究センターの大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８の創薬産業ビームラインＢＬ３２Ｂ２を利用しイメージングプレートを装備したＲ−ＡＸＩＳ Ｖ（リガク社製）またはＪｕｐｉｔｅｒ２１０（リガク社製）を検出装置としてＸ線回折データを振動法にて測定した。Ｘ線の波長は１Å、振動角は０．５°または１°／フレームであった。次に、回折強度データ処理プログラムＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ(リガク社製)を使用して、回折強度データをＦｒｅｅ体について分解能２．９Å、セフジトレン複合体について２．６Åで処理した。その結果、Ｆｒｅｅ体結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０６．８８Å、ｂ＝１７１．７１Å、ｃ＝８９．３６Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは９９．８％、Ｒｍｅｒｇｅは６．１％であった。また、セフジトレン複合体結晶は、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０７．７４Å、ｂ＝１７１．２０Å、ｃ＝８９．１５Å、α＝β＝γ＝９０°であった。得られたデータのＣｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓは８９．９％、Ｒｍｅｒｇｅは５．４％であった。
【実施例６】
【００３１】
＜＜ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物の結晶構造の決定＞＞
実施例５で得られた回折強度データを、ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４）に含まれるプログラムＭｏｌｒｅｐを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）にＰＤＢ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：１ＱＭＥとして登録されているＰＢＰ２ｘ可溶性部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に２分子のモデルを見出すことができた。次に構造精密化プログラムであるＣＮＸ（アクセルリス社製）、ＨＴ ＸＰＩＰＥ（アクセルリス社製）およびＣＣＰ４に含まれるＲｅｆｍａｃ５を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるＤＳ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ（アクセルリス社製）、Ｔｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ（ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ製）を用いたモデルの修正を繰り返し実施し、Ｆｒｅｅ体およびセフジトレン複合体の結晶構造を得た。セフジトレン複合体においては、酵素活性部位にセフジトレンに相当する電子密度が観測された（図２）。決定した結晶構造の正確さの指標であるＲ因子は、Ｆｒｅｅ体において０．２３７、セフジトレン複合体において０．２６０であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の５％に相当する構造因子から計算されるＲｆｒｅｅ因子はＦｒｅｅ体において０．３００、セフジトレン複合体において０．２９０であった。
【００３２】
今回決定したセフジトレン複合体結晶においては、セフジトレン３位側鎖の電子密度も明瞭に観測され、特徴的な３位側鎖を有するセフェム系β−ラクタム薬であるセフジトレンと標的タンパク質であるＰＢＰ２ｘとの相互作用様式が世界で初めて明らかとなった。今回得られた情報は新規化合物のデザインを可能とし、今後の新薬の創出に多いに活用できるものである。また、本発明のトリプシン消化物結晶を用いて、他の薬物との複合体結晶作製もセフジトレン同様の手順で可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶は、Ｘ線結晶構造解析によるＰＢＰ２ｘと薬物との詳細な相互作用の解明および新薬の創出に活用できるため、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶の顕微鏡写真である。
【図２】ＰＢＰ２ｘトリプシン消化物結晶／セフジトレン複合体における薬物結合部位近傍の図である。タンパク質をＣαモデルで表示し、セフジトレンを除いたモデルから計算したＦｏ−Ｆｃ電子密度図およびセフジトレンモデルを重ねて表示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線結晶構造解析により立体構造を解析し得ることを特徴とする肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物の結晶。
【請求項２】
空間群がＰ２１２１２である請求項１記載の結晶。
【請求項３】
空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１記載の結晶。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２である請求項１記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１記載の結晶。
【請求項６】
配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成される請求項１記載の結晶。
【請求項７】
Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるタンパク質。
【請求項８】
Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるタンパク質。
【請求項１】
Ｘ線結晶構造解析により立体構造を解析し得ることを特徴とする肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）２ｘトリプシン消化物の結晶。
【請求項２】
空間群がＰ２１２１２である請求項１記載の結晶。
【請求項３】
空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１記載の結晶。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２である請求項１記載の結晶。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成され、空間群がＰ２１２１２であり、格子定数がａ＝１０５〜１０９Å、ｂ＝１７０〜１７４Å、ｃ＝８７〜９１Å、α＝β＝γ＝９０°である請求項１記載の結晶。
【請求項６】
配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成される請求項１記載の結晶。
【請求項７】
Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する３つの断片から構成されるタンパク質。
【請求項８】
Ｘ線結晶構造解析に利用可能な結晶を作製し得ることを特徴とする配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する２つの断片から構成されるタンパク質。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１６９１７０（Ｐ２００７−１６９１７０Ａ）
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６４８６９（Ｐ２００５−３６４８６９）
【出願日】平成１７年１２月１９日（２００５．１２．１９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１９日（２００５．１２．１９）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]