ペリオスチン測定の正確性の改善方法
【課題】試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法を提供する。
【解決手段】試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法として、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とするものである。
【解決手段】試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法として、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の抗原抗体反応を利用した測定の正確性（感度及び特異度）の改善方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２）は、細胞外マトリックスタンパク質であるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した（特許文献２参照。）。
【０００３】
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献３参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献４参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献５参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献６参照。）。
【０００４】
しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、感度及び特異度等の正確性の改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２００６号
【特許文献２】国際公開第０９／１４８１８４号
【特許文献３】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献４】特表２００２−５０２２５０号公報
【特許文献５】特表２００５−５０００５９号公報
【特許文献６】国際公開０７／０７７９３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ.Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｖｏｌ．１１８，９８〜１０４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、その感度及び特異度等の正確性は十分なものではなかった。
このため、試料に含まれるペリオスチンの測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、更なる感度及び特異度等の正確性の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の測定の正確性の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することにより、その測定の感度〔その測定における罹患者群での陽性率（真の陽性率）〕及び特異度〔その測定における非罹患者群での陰性率（真の陰性率；すなわち、１−偽陽性率）〕を向上させ、測定の正確性を改善することができるものである。
これにより、ペリオスチン以外の物質を測り込んでしまうことを防ぐことができ、かつ、ペリオスチンだけを正確に測定することが可能となったものである。
すなわち、本発明の測定の正確性の改善方法は、正確なペリオスチンの測定値を得ることができ、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別を向上させ、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、胆管細胞癌の罹患者及び対照者の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を示した図である。
【図２】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、胆管細胞癌の罹患者及び対照者の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示した図である。
【図３】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、肺線維症の罹患者及び健常人の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を示した図である。
【図４】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、肺線維症の罹患者及び健常人の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
（１）抗体
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体であれば、いかなるものでもよい。
【００１２】
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦａｂ’等）をも含むものである。
【００１３】
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得する方法は、特に限定されないものの、下記の方法等が挙げられる。
【００１４】
例えば、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製し、取得し、これを免疫原として動物に免疫する等して、又は、ペリオスチンタンパク質の全部又は一部をコードする配列を含有するＤＮＡ又はＲＮＡを直接動物に注入するか、同配列を含有するウイルスベクターを動物に感染させることにより、動物体内で発現させたペリオスチンタンパク質を免疫原として、モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞等を取得する。
そして、モノクローナル抗体がペリオスチンに（特異的に）結合するモノクローナル抗体であることを確認するか、又はそのようなモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞等を選択して、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得する。
【００１５】
（２）免疫原
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
前記した通り、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質等を用いることができる。
【００１６】
このペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質等を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００１７】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
【００１８】
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、このペプチド又はタンパク質等を免疫原としてモノクローナル抗体を調製したときに、ペリオスチンに結合するモノクローナル抗体を得ることができるものでなければならない。
【００１９】
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト又は他の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
【００２０】
なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【００２１】
例えば、ペリオスチンを取得する方法として、次の方法等を挙げることができる。
（ａ） まず、ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．Ｄ１３６６６のヌクレオチド配列；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．ＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
【００２２】
（ｂ） すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＣｏＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、Ｖ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
【００２３】
（ｃ） Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたペリオスチンタンパク質を取得する。
【００２４】
また、ペリオスチンは、例えば、以下の文献等に記載の方法等によっても取得することができる（Ｉ.Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行）。
【００２５】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００２６】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００２７】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００２８】
なお、抗体を産生させる際に担体を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００２９】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００３０】
（３）モノクローナル抗体の取得方法
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
【００３１】
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
【００３２】
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００３３】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００３４】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００３５】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００３６】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
【００３７】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００３８】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又はヒト若しくは他の動物（ヒトのペリオスチンを測定する場合にはヒト由来のものが好ましい）のペリオスチン等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ペリオスチンに（特異的に）結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００３９】
このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００４０】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００４１】
このようにして得られた抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４２】
２．ペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定
（１）総論
本発明は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法である。
【００４３】
即ち、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することにより、測定の正確性を改善することができるものである。
【００４４】
なお、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、ペリオスチンに結合する抗体として２つ以上の抗体を使用する場合、これらの測定において試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体のいずれもが、抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
【００４５】
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
この抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体の詳細については、前記の「１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体」の項に記載した通りである。
【００４６】
なお、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において好適である。
【００４７】
そして、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、癌又は肺疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において、より好適である。
【００４８】
更に、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、胆管細胞癌又は肺繊維症の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において、特に好適である。
【００４９】
なお、ペリオスチンは、胆管細胞癌の罹患者においては高値となるものの、他の疾患、例えば、肝細胞癌、肝硬変、硬化型肝細胞癌、肉腫様肝細胞癌、血管筋脂肪腫、若しくは血管肉腫の罹患者、又は健常人においては、低値である。
このことは、本発明者らによる特許出願（特願２００９−２７４８７３）の明細書等に本発明者らが記載し、また、Ｕｔｉｓｐａｎらの文献〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１３，ｐａｇｅ１〜２０，２０１０年〕に記載されている。
【００５０】
（２）抗原抗体反応を利用した測定方法
本発明の測定の正確性の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００５１】
この試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００５２】
そして、前記の抗原抗体反応を利用した測定においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定の正確性の改善方法を適用することができる。
また、本発明における抗原抗体反応を利用した測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００５３】
（３）試料
本発明における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００５４】
（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
【００５５】
この標識抗体を用いた免疫学的測定方法において用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
固相化抗体は、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００５６】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００５７】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００５８】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００５９】
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００６０】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００６１】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
【００６２】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００６３】
（５）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００６４】
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００６５】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００６６】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００６７】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【００６８】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【００６９】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」と試料中に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【００７０】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００７１】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【００７２】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体、又は試料と「固相担体に感作させた抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に感作させた抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【００７３】
（６）測定時の他の成分
本発明の測定の正確性の改善方法における、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００７４】
また、本発明における測定においては、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化した固相担体、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を感作した固相担体、及び／又は前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００７５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１〕（ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体の調製）
以下の手順により、ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体の調製を行った。
【００７８】
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．Ｄ１３６６６のヌクレオチド配列；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．ＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。
【００７９】
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎとした。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＣｏＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
【００８０】
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、Ｖ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。
【００８１】
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
【００８２】
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出した。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳに透析し、これを動物の免疫原とした。
【００８３】
次に、これらのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）〔Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ〕と混合してラビットに免疫し、その後血清を採取した。
【００８４】
この具体的な手順は次の通りである。
ラビットとして、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅラビット（雌、体重１．５〜２Ｋｇ）〔ケービーティーオリエンタル社、日本国佐賀県鳥栖市〕を用いた。
【００８５】
これらのラビットは、免疫原であるＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質とＣＦＡの混合物をラビット背部皮下数カ所に注射することにより免疫した。
【００８６】
免疫の５〜７週後、免疫ラビットの耳静脈より注射針と注射器を用いて採血し、血清を得た。
【００８７】
最後に、血清からＩｇＧを次のように精製した。
すなわち、採取した血清に二倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．０）を加えた後、塩酸でｐＨを４．０に調整した。
この血清を撹拌しながら、血清の１／１５量のカプリル酸を加え、３０分間撹拌した後、９，２００ｇで１０分間遠心した。
上清をＰＢＳに透析し、精製ＩｇＧとして、ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体を取得した。
【００８８】
〔実施例２〕（ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製）
以下の手順により、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。
【００８９】
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質（２０〜５０μｇ／ラット）を、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（化学合成アジュバント）〔フナコシ社、日本国東京都〕と混合して、一対の相互に結合したものを免疫原とした。
【００９０】
具体的な手順は次の通りである。
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は、次のように調製した。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
【００９１】
この培養上清をＰＢＳに透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出した。
【００９２】
ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）としてＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いた。
また、化学合成アジュバントとしてＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を用いた。
そして、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液１容に対して、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄを１容の割合で混合した。
【００９３】
次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、２０〜５０μｇのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液と、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日〜２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、２０〜５０μｇのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液と、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット（雌、６〜８週齢）〔日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市〕を用いた。
【００９４】
最終免疫より３〜４日後、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。
【００９５】
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００９６】
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、免疫原に使用したタンパク質を固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの免疫原に使用したタンパク質を９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固相化させた。
この固相化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。
融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。
この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９７】
生育した融合細胞株の中から二つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株、ＳＳ１８Ａ株とそれぞれ命名した。
そして、これらの選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
【００９８】
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。
溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体をそれぞれのモノクロナール抗体産生細胞株より取得した。
すなわち、ＳＳ１７Ｂ株、ＳＳ１８Ａ株各々のモノクローナル抗体産生細胞株から、それぞれラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができた。
【００９９】
〔実施例３〕（本発明の効果の確認−１）
本発明の測定の正確性の改善方法の効果を確かめた。
【０１００】
１．試料
試料として、次の通り、胆管細胞癌の罹患者の血清、又は対照者の血清を用いた。
（１）胆管細胞癌の罹患者（計８例）の血清
（２）対照者（計７１例）の血清
対照者の内訳：
・ 肝細胞癌の罹患者（計２４例）
・ 混合型肝細胞癌の罹患者（計７例）
・ 肝硬変の罹患者（計２６例）
・ 硬化型肝細胞癌の罹患者（計３例）
・ 肉腫様肝細胞癌の罹患者（計２例）
・ 血管筋脂肪腫の罹患者（計１例）
・ 血管肉腫の罹患者（計１例）
・ 健常人（計７例）
【０１０１】
２．試料中のペリオスチン濃度の測定
（１）抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンポリクローナル抗体を使用した蛍光免疫測定法により測定した。
【０１０２】
（ａ） まず、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により１０μｇ／ｍＬに希釈した前記の実施例１のラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体を５０μＬ注入し、４℃で一晩静置し、このラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
【０１０３】
（ｂ） 次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除いた後、ブロッキング液−Ａ〔３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ〕を各ウェルに１８０μＬ注入し、室温で１時間静置した。
【０１０４】
（ｃ） 次に、各ウェルを洗浄液−Ａ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ〕で３回洗浄した。
【０１０５】
（ｄ） 次に、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれについて、試料希釈液−Ａ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝生理食塩水［ＴＢＳ］〕で１０倍に希釈した後、その５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固相化したラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体に結合させた。
【０１０６】
（ｅ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ａで３回洗浄した。
【０１０７】
（ｆ） 前記の実施例１のラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体にビオチンを結合させ標識したビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体を、前記の試料希釈液−Ａで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、その５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１時間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の固相化ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体に結合したペリオスチンに、ビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体を結合させた。
【０１０８】
（ｇ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ａで３回洗浄した。
【０１０９】
（ｈ） 次に、１，０００倍に希釈したユーロピウム（Ｅｕ）で標識されたストレプトアビジン（ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）の５０μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて６０分間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の「９６穴マイクロタイタープレートのウェル」−「ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体」−「ペリオスチン」−「ビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体」のビオチンに、「ユーロピウム標識ストレプトアビジン」のストレプトアビジンを結合させた。
【０１１０】
（ｉ） 次に、各ウェルを前記のユーロピウム標識ストレプトアビジン専用の洗浄液（ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）で５回洗浄した。
【０１１１】
（ｊ） 次に、増強溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）の５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１０〜１５分間静置し、反応を行わせた後、時間分解蛍光光度計を用いて各ウェルについて蛍光強度の測定を行った。
【０１１２】
（ｋ） なお、精製したペリオスチンタンパク質を前記の試料希釈液で希釈して、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を作成し、これらの試料のそれぞれについて、前記（ａ）〜（ｊ）の記載に従って測定を行い、この蛍光免疫測定法における「ペリオスチン濃度−蛍光強度」の標準曲線を作成した。
【０１１３】
（ｌ） 前記（ｊ）において測定した各ウェルの蛍光強度を、前記（ｋ）で作成した「ペリオスチン濃度−蛍光強度」の標準曲線に当てはめ、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれのペリオスチン濃度を求めた。
【０１１４】
（２）抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。
【０１１５】
（ａ） まず、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬに希釈した前記の実施例２のラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（モノクローナル抗体産生細胞株：ＳＳ１８Ａ株）を１００μＬ注入し、２５℃で１８時間静置し、このラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
【０１１６】
（ｂ） 次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除いた後、ブロッキング液−Ｂ〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン緩衝液［トリス緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２５０μＬ注入し、４℃で１８時間静置した。
【０１１７】
（ｃ） 次に、各ウェルを洗浄液−Ｂ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕で３回洗浄した。
【０１１８】
（ｄ） 次に、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれについて、試料希釈液−Ｂ〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン緩衝液［トリス緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で２００倍に希釈した後、その１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて１８時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固相化したラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）に結合させた。
【０１１９】
（ｅ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ｂで５回洗浄した。
【０１２０】
（ｆ） 前記の実施例２のラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（モノクローナル抗体産生細胞株：ＳＳ１７Ｂ株）にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させ標識したＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を、前記の試料希釈液−Ｂで５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の固相化ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）に結合したペリオスチンに、ＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ株）を結合させた。
【０１２１】
（ｇ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ｂで５回洗浄した。
【０１２２】
（ｈ） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液〕の１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
その後、各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
【０１２３】
（ｉ） 次に、分光光度計を用いて各ウェルについて４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１２４】
（ｊ） なお、精製したペリオスチンタンパク質を前記の試料希釈液で希釈して、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を作成し、これらの試料のそれぞれについて、前記（ａ）〜（ｉ）の記載に従って測定を行い、この酵素免疫測定法における「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線を作成した。
【０１２５】
（ｋ） 前記（ｉ）において測定した各ウェルの吸光度を、前記（ｊ）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線に当てはめ、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれのペリオスチン濃度を求めた。
【０１２６】
３．測定結果
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける胆管細胞癌の罹患者（計８例）及び対照者（計７１例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を、図１に示した。
【０１２７】
この図１の左側に、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
また、この図１の右側に、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
【０１２８】
そして、この図１の左側及び右側のいずれにおいても、横軸は試料が胆管細胞癌の罹患者の血清であるか、又は対照者の血清であるかの別を表し、縦軸は測定した各試料に含まれるペリオスチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【０１２９】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける胆管細胞癌の罹患者（計８例）及び対照者（計７１例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）を作成した。
このＲＯＣ曲線を図２に示した。
この図２において、横軸は「１−特異度」を、縦軸は「感度」を表す。
【０１３０】
そして、この図２において、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を破線で表し、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を実線で表した。
【０１３１】
なお、前記のポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）は、０．７９１であった。
また、前記のモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８５２であった。
【０１３２】
４．考察
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果について
（ａ） 図１の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、胆管細胞癌の罹患者のみならず、対照者においても、その血清中のペリオスチン濃度は低値から高値まで広く分布していることが分かる。
【０１３３】
ところで、先に記載した通り、ペリオスチンは、胆管細胞癌の罹患者においては高値となるものの、他の疾患、例えば、肝細胞癌、肝硬変、硬化型肝細胞癌、肉腫様肝細胞癌、血管筋脂肪腫、若しくは血管肉腫の罹患者、又は健常人においては、低値である。
よって、この図１の左側のポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果で、対照者において、その血清中のペリオスチン濃度が中程度値〜高値となっているのは、偽陽性によるものである。
従って、このペリオスチン濃度の測定では、胆管細胞癌の罹患者においては陽性であると明確に判別され、そして、対象者、すなわち非罹患者においては陰性であると明確に判別されることが望ましい。
【０１３４】
この図１の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このポリクローナル抗体を使用した場合の測定の感度〔この測定における罹患者群での陽性率（真の陽性率）〕は６２．５％であり、特異度〔この測定における非罹患者群での陰性率（真の陰性率；すなわち、１−偽陽性率）〕は７４．６％であった。
【０１３５】
（ｂ） 図１の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、対照者の血清中のペリオスチン濃度の分布は、より低値域に纏まっていることが分かる。
この図１の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度１５４ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このモノクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は７５．０％であり、特異度は９４．４％であった。
【０１３６】
（ｃ） すなわち、このことより、ペリオスチンの測定に使用する抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値を、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬから１５４ｎｇ／ｍＬへと２３％も低下させることができたことが分かる。
【０１３７】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、測定の感度を６２．５％から７５．０％へと高めることができたことが分かる。
【０１３８】
更に、同じく、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の特異度を７４．６％から９４．４％へと高めることができたことが分かる。
【０１３９】
これらのことより、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１４０】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線について
図２より、抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（破線）に比較し、モノクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（実線）は、感度、及び特異度のそれぞれが向上していることが分かる。
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合（破線）に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合（実線）は、曲線下面積（ＡＵＣ）が、０．７９１から０．８５２へと増加（向上）しており、測定の正確性が改善されていることが分かる。
【０１４１】
このＲＯＣ曲線の結果からも、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１４２】
〔実施例４〕（本発明の効果の確認−２）
本発明の測定の正確性の改善方法の効果を確かめた。
【０１４３】
１．試料
試料として、次の通り、肺線維症の罹患者の血清、又は健常人の血清を用いた。
（１）肺線維症の罹患者（計３７例）の血清
（２）健常人（計６６例）の血清
【０１４４】
２．試料中のペリオスチン濃度の測定
（１）抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンポリクローナル抗体を使用した蛍光免疫測定法により測定した。
【０１４５】
なお、この測定の操作は、前記の実施例３の２の（１）の（ａ）〜（ｌ）の手順に従って行った。
【０１４６】
（２）抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。
【０１４７】
なお、この測定の操作は、前記の実施例３の２の（２）の（ａ）〜（ｋ）の手順に従って行った。
【０１４８】
３．測定結果
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける肺線維症の罹患者（計３７例）及び健常人（計６６例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を、図３に示した。
【０１４９】
この図３の左側に、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
また、この図３の右側に、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
【０１５０】
そして、この図３の左側及び右側のいずれにおいても、横軸は試料が肺線維症の罹患者の血清であるか、又は健常人の血清であるかの別を表し、縦軸は測定した各試料に含まれるペリオスチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【０１５１】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける肺線維症の罹患者（計３７例）及び健常人（計６６例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線を作成した。
このＲＯＣ曲線を図４に示した。
この図４において、横軸は「１−特異度」を、縦軸は「感度」を表す。
【０１５２】
そして、この図４において、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を破線で表し、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を実線で表した。
【０１５３】
なお、前記のポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．７７６であった。
また、前記のモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９０５であった。
【０１５４】
４．考察
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果について
（ａ） 図３の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、肺線維症の罹患者のみならず、健常人においても、その血清中のペリオスチン濃度は低値から高値まで広く分布していることが分かる。
【０１５５】
この図３の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このポリクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は５６．８％であり、特異度は８３．３％であった。
【０１５６】
（ｂ） 図３の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、健常人の血清中のペリオスチン濃度の分布は、より低値域に纏まっていることが分かる。
この図３の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度８２ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このモノクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は６２．２％であり、特異度は９５．５％であった。
【０１５７】
（ｃ） すなわち、このことより、ペリオスチンの測定に使用する抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値を、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬから８２ｎｇ／ｍＬへと５９％も低下させることができたことが分かる。
【０１５８】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、測定の感度を５６．８％から６２．２％へと高めることができたことが分かる。
【０１５９】
更に、同じく、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の特異度を８３．３％から９５．５％へと高めることができたことが分かる。
【０１６０】
これらのことより、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１６１】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線について
図４より、抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（破線）に比較し、モノクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（実線）は、感度、及び特異度のそれぞれが向上していることが分かる。
【０１６２】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合（破線）に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合（実線）は、曲線下面積（ＡＵＣ）が、０．７７６から０．９０５へと増加（向上）しており、測定の正確性が改善されていることが分かる。
【０１６３】
このＲＯＣ曲線の結果からも、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の抗原抗体反応を利用した測定の正確性（感度及び特異度）の改善方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２）は、細胞外マトリックスタンパク質であるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した（特許文献２参照。）。
【０００３】
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献３参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献４参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献５参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献６参照。）。
【０００４】
しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、感度及び特異度等の正確性の改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２００６号
【特許文献２】国際公開第０９／１４８１８４号
【特許文献３】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献４】特表２００２−５０２２５０号公報
【特許文献５】特表２００５−５０００５９号公報
【特許文献６】国際公開０７／０７７９３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ.Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｖｏｌ．１１８，９８〜１０４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、その感度及び特異度等の正確性は十分なものではなかった。
このため、試料に含まれるペリオスチンの測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、更なる感度及び特異度等の正確性の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の測定の正確性の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することにより、その測定の感度〔その測定における罹患者群での陽性率（真の陽性率）〕及び特異度〔その測定における非罹患者群での陰性率（真の陰性率；すなわち、１−偽陽性率）〕を向上させ、測定の正確性を改善することができるものである。
これにより、ペリオスチン以外の物質を測り込んでしまうことを防ぐことができ、かつ、ペリオスチンだけを正確に測定することが可能となったものである。
すなわち、本発明の測定の正確性の改善方法は、正確なペリオスチンの測定値を得ることができ、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別を向上させ、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、胆管細胞癌の罹患者及び対照者の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を示した図である。
【図２】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、胆管細胞癌の罹患者及び対照者の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示した図である。
【図３】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、肺線維症の罹患者及び健常人の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を示した図である。
【図４】抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合、及びモノクローナル抗体を使用した場合のそれぞれにおける、肺線維症の罹患者及び健常人の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に作成したＲＯＣ曲線を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
（１）抗体
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体であれば、いかなるものでもよい。
【００１２】
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦａｂ’等）をも含むものである。
【００１３】
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得する方法は、特に限定されないものの、下記の方法等が挙げられる。
【００１４】
例えば、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質を調製し、取得し、これを免疫原として動物に免疫する等して、又は、ペリオスチンタンパク質の全部又は一部をコードする配列を含有するＤＮＡ又はＲＮＡを直接動物に注入するか、同配列を含有するウイルスベクターを動物に感染させることにより、動物体内で発現させたペリオスチンタンパク質を免疫原として、モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞等を取得する。
そして、モノクローナル抗体がペリオスチンに（特異的に）結合するモノクローナル抗体であることを確認するか、又はそのようなモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞等を選択して、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得する。
【００１５】
（２）免疫原
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
前記した通り、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質等を用いることができる。
【００１６】
このペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチド又はタンパク質等を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００１７】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
【００１８】
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体を産生させるための免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、このペプチド又はタンパク質等を免疫原としてモノクローナル抗体を調製したときに、ペリオスチンに結合するモノクローナル抗体を得ることができるものでなければならない。
【００１９】
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト又は他の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
【００２０】
なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【００２１】
例えば、ペリオスチンを取得する方法として、次の方法等を挙げることができる。
（ａ） まず、ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．Ｄ１３６６６のヌクレオチド配列；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．ＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
【００２２】
（ｂ） すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＣｏＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、Ｖ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
【００２３】
（ｃ） Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたペリオスチンタンパク質を取得する。
【００２４】
また、ペリオスチンは、例えば、以下の文献等に記載の方法等によっても取得することができる（Ｉ.Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行）。
【００２５】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００２６】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１
遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００２７】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００２８】
なお、抗体を産生させる際に担体を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００２９】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００３０】
（３）モノクローナル抗体の取得方法
本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
【００３１】
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
【００３２】
この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００３３】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００３４】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００３５】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００３６】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
【００３７】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００３８】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又はヒト若しくは他の動物（ヒトのペリオスチンを測定する場合にはヒト由来のものが好ましい）のペリオスチン等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ペリオスチンに（特異的に）結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００３９】
このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００４０】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００４１】
このようにして得られた抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４２】
２．ペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定
（１）総論
本発明は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法である。
【００４３】
即ち、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することにより、測定の正確性を改善することができるものである。
【００４４】
なお、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、ペリオスチンに結合する抗体として２つ以上の抗体を使用する場合、これらの測定において試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体のいずれもが、抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
【００４５】
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
この抗ペリオスチンモノクローナル抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
なお、この抗ペリオスチンモノクローナル抗体の詳細については、前記の「１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体」の項に記載した通りである。
【００４６】
なお、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において好適である。
【００４７】
そして、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、癌又は肺疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において、より好適である。
【００４８】
更に、本発明の、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定における、測定の正確性の改善方法は、胆管細胞癌又は肺繊維症の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において、特に好適である。
【００４９】
なお、ペリオスチンは、胆管細胞癌の罹患者においては高値となるものの、他の疾患、例えば、肝細胞癌、肝硬変、硬化型肝細胞癌、肉腫様肝細胞癌、血管筋脂肪腫、若しくは血管肉腫の罹患者、又は健常人においては、低値である。
このことは、本発明者らによる特許出願（特願２００９−２７４８７３）の明細書等に本発明者らが記載し、また、Ｕｔｉｓｐａｎらの文献〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１３，ｐａｇｅ１〜２０，２０１０年〕に記載されている。
【００５０】
（２）抗原抗体反応を利用した測定方法
本発明の測定の正確性の改善方法は、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００５１】
この試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００５２】
そして、前記の抗原抗体反応を利用した測定においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定の正確性の改善方法を適用することができる。
また、本発明における抗原抗体反応を利用した測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００５３】
（３）試料
本発明における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００５４】
（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体のいずれの抗体もが抗ペリオスチンモノクローナル抗体である必要がある。
【００５５】
この標識抗体を用いた免疫学的測定方法において用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
固相化抗体は、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００５６】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００５７】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００５８】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００５９】
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００６０】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００６１】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
【００６２】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００６３】
（５）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００６４】
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００６５】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００６６】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００６７】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【００６８】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【００６９】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」と試料中に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【００７０】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００７１】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【００７２】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体、又は試料と「固相担体に感作させた抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に感作させた抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【００７３】
（６）測定時の他の成分
本発明の測定の正確性の改善方法における、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００７４】
また、本発明における測定においては、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を固相化した固相担体、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体を感作した固相担体、及び／又は前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体等の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００７５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１〕（ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体の調製）
以下の手順により、ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体の調製を行った。
【００７８】
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．Ｄ１３６６６のヌクレオチド配列；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ．ＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。
【００７９】
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎとした。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＣｏＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
【００８０】
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、Ｖ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。
【００８１】
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
【００８２】
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出した。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳに透析し、これを動物の免疫原とした。
【００８３】
次に、これらのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）〔Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ〕と混合してラビットに免疫し、その後血清を採取した。
【００８４】
この具体的な手順は次の通りである。
ラビットとして、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅラビット（雌、体重１．５〜２Ｋｇ）〔ケービーティーオリエンタル社、日本国佐賀県鳥栖市〕を用いた。
【００８５】
これらのラビットは、免疫原であるＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質とＣＦＡの混合物をラビット背部皮下数カ所に注射することにより免疫した。
【００８６】
免疫の５〜７週後、免疫ラビットの耳静脈より注射針と注射器を用いて採血し、血清を得た。
【００８７】
最後に、血清からＩｇＧを次のように精製した。
すなわち、採取した血清に二倍量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．０）を加えた後、塩酸でｐＨを４．０に調整した。
この血清を撹拌しながら、血清の１／１５量のカプリル酸を加え、３０分間撹拌した後、９，２００ｇで１０分間遠心した。
上清をＰＢＳに透析し、精製ＩｇＧとして、ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体を取得した。
【００８８】
〔実施例２〕（ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製）
以下の手順により、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。
【００８９】
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質（２０〜５０μｇ／ラット）を、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（化学合成アジュバント）〔フナコシ社、日本国東京都〕と混合して、一対の相互に結合したものを免疫原とした。
【００９０】
具体的な手順は次の通りである。
Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は、次のように調製した。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
【００９１】
この培養上清をＰＢＳに透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出した。
【００９２】
ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）としてＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いた。
また、化学合成アジュバントとしてＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を用いた。
そして、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液１容に対して、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄを１容の割合で混合した。
【００９３】
次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、２０〜５０μｇのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液と、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日〜２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、２０〜５０μｇのＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質溶液と、ＣＦＡ又はＴｉｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット（雌、６〜８週齢）〔日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市〕を用いた。
【００９４】
最終免疫より３〜４日後、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。
【００９５】
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００９６】
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、免疫原に使用したタンパク質を固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの免疫原に使用したタンパク質を９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固相化させた。
この固相化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。
融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。
この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９７】
生育した融合細胞株の中から二つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株、ＳＳ１８Ａ株とそれぞれ命名した。
そして、これらの選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
【００９８】
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。
溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体をそれぞれのモノクロナール抗体産生細胞株より取得した。
すなわち、ＳＳ１７Ｂ株、ＳＳ１８Ａ株各々のモノクローナル抗体産生細胞株から、それぞれラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を得ることができた。
【００９９】
〔実施例３〕（本発明の効果の確認−１）
本発明の測定の正確性の改善方法の効果を確かめた。
【０１００】
１．試料
試料として、次の通り、胆管細胞癌の罹患者の血清、又は対照者の血清を用いた。
（１）胆管細胞癌の罹患者（計８例）の血清
（２）対照者（計７１例）の血清
対照者の内訳：
・ 肝細胞癌の罹患者（計２４例）
・ 混合型肝細胞癌の罹患者（計７例）
・ 肝硬変の罹患者（計２６例）
・ 硬化型肝細胞癌の罹患者（計３例）
・ 肉腫様肝細胞癌の罹患者（計２例）
・ 血管筋脂肪腫の罹患者（計１例）
・ 血管肉腫の罹患者（計１例）
・ 健常人（計７例）
【０１０１】
２．試料中のペリオスチン濃度の測定
（１）抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンポリクローナル抗体を使用した蛍光免疫測定法により測定した。
【０１０２】
（ａ） まず、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により１０μｇ／ｍＬに希釈した前記の実施例１のラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体を５０μＬ注入し、４℃で一晩静置し、このラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
【０１０３】
（ｂ） 次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除いた後、ブロッキング液−Ａ〔３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ〕を各ウェルに１８０μＬ注入し、室温で１時間静置した。
【０１０４】
（ｃ） 次に、各ウェルを洗浄液−Ａ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ〕で３回洗浄した。
【０１０５】
（ｄ） 次に、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれについて、試料希釈液−Ａ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝生理食塩水［ＴＢＳ］〕で１０倍に希釈した後、その５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固相化したラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体に結合させた。
【０１０６】
（ｅ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ａで３回洗浄した。
【０１０７】
（ｆ） 前記の実施例１のラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体にビオチンを結合させ標識したビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体を、前記の試料希釈液−Ａで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、その５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１時間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の固相化ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体に結合したペリオスチンに、ビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体を結合させた。
【０１０８】
（ｇ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ａで３回洗浄した。
【０１０９】
（ｈ） 次に、１，０００倍に希釈したユーロピウム（Ｅｕ）で標識されたストレプトアビジン（ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）の５０μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて６０分間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の「９６穴マイクロタイタープレートのウェル」−「ラビット抗ペリオスチンポリクローナル抗体」−「ペリオスチン」−「ビオチン標識抗ペリオスチンポリクローナル抗体」のビオチンに、「ユーロピウム標識ストレプトアビジン」のストレプトアビジンを結合させた。
【０１１０】
（ｉ） 次に、各ウェルを前記のユーロピウム標識ストレプトアビジン専用の洗浄液（ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）で５回洗浄した。
【０１１１】
（ｊ） 次に、増強溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＤＥＬＦＩＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国マサチューセッツ州）の５０μＬを前記のウェルに注入し、室温にて１０〜１５分間静置し、反応を行わせた後、時間分解蛍光光度計を用いて各ウェルについて蛍光強度の測定を行った。
【０１１２】
（ｋ） なお、精製したペリオスチンタンパク質を前記の試料希釈液で希釈して、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を作成し、これらの試料のそれぞれについて、前記（ａ）〜（ｊ）の記載に従って測定を行い、この蛍光免疫測定法における「ペリオスチン濃度−蛍光強度」の標準曲線を作成した。
【０１１３】
（ｌ） 前記（ｊ）において測定した各ウェルの蛍光強度を、前記（ｋ）で作成した「ペリオスチン濃度−蛍光強度」の標準曲線に当てはめ、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれのペリオスチン濃度を求めた。
【０１１４】
（２）抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。
【０１１５】
（ａ） まず、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬに希釈した前記の実施例２のラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（モノクローナル抗体産生細胞株：ＳＳ１８Ａ株）を１００μＬ注入し、２５℃で１８時間静置し、このラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
【０１１６】
（ｂ） 次に、このマイクロタイタープレートのウェル中の液を除いた後、ブロッキング液−Ｂ〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン緩衝液［トリス緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２５０μＬ注入し、４℃で１８時間静置した。
【０１１７】
（ｃ） 次に、各ウェルを洗浄液−Ｂ〔０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕で３回洗浄した。
【０１１８】
（ｄ） 次に、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれについて、試料希釈液−Ｂ〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン緩衝液［トリス緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で２００倍に希釈した後、その１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて１８時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固相化したラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）に結合させた。
【０１１９】
（ｅ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ｂで５回洗浄した。
【０１２０】
（ｆ） 前記の実施例２のラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（モノクローナル抗体産生細胞株：ＳＳ１７Ｂ株）にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させ標識したＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を、前記の試料希釈液−Ｂで５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
これにより、前記の固相化ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ株）に結合したペリオスチンに、ＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ株）を結合させた。
【０１２１】
（ｇ） 次に、各ウェルを前記の洗浄液−Ｂで５回洗浄した。
【０１２２】
（ｈ） 次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液〕の１００μＬを前記のウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
その後、各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
【０１２３】
（ｉ） 次に、分光光度計を用いて各ウェルについて４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１２４】
（ｊ） なお、精製したペリオスチンタンパク質を前記の試料希釈液で希釈して、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を作成し、これらの試料のそれぞれについて、前記（ａ）〜（ｉ）の記載に従って測定を行い、この酵素免疫測定法における「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線を作成した。
【０１２５】
（ｋ） 前記（ｉ）において測定した各ウェルの吸光度を、前記（ｊ）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線に当てはめ、前記１の（１）及び（２）の各試料それぞれのペリオスチン濃度を求めた。
【０１２６】
３．測定結果
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける胆管細胞癌の罹患者（計８例）及び対照者（計７１例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を、図１に示した。
【０１２７】
この図１の左側に、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
また、この図１の右側に、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
【０１２８】
そして、この図１の左側及び右側のいずれにおいても、横軸は試料が胆管細胞癌の罹患者の血清であるか、又は対照者の血清であるかの別を表し、縦軸は測定した各試料に含まれるペリオスチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【０１２９】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける胆管細胞癌の罹患者（計８例）及び対照者（計７１例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）を作成した。
このＲＯＣ曲線を図２に示した。
この図２において、横軸は「１−特異度」を、縦軸は「感度」を表す。
【０１３０】
そして、この図２において、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を破線で表し、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を実線で表した。
【０１３１】
なお、前記のポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）は、０．７９１であった。
また、前記のモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８５２であった。
【０１３２】
４．考察
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果について
（ａ） 図１の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、胆管細胞癌の罹患者のみならず、対照者においても、その血清中のペリオスチン濃度は低値から高値まで広く分布していることが分かる。
【０１３３】
ところで、先に記載した通り、ペリオスチンは、胆管細胞癌の罹患者においては高値となるものの、他の疾患、例えば、肝細胞癌、肝硬変、硬化型肝細胞癌、肉腫様肝細胞癌、血管筋脂肪腫、若しくは血管肉腫の罹患者、又は健常人においては、低値である。
よって、この図１の左側のポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果で、対照者において、その血清中のペリオスチン濃度が中程度値〜高値となっているのは、偽陽性によるものである。
従って、このペリオスチン濃度の測定では、胆管細胞癌の罹患者においては陽性であると明確に判別され、そして、対象者、すなわち非罹患者においては陰性であると明確に判別されることが望ましい。
【０１３４】
この図１の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このポリクローナル抗体を使用した場合の測定の感度〔この測定における罹患者群での陽性率（真の陽性率）〕は６２．５％であり、特異度〔この測定における非罹患者群での陰性率（真の陰性率；すなわち、１−偽陽性率）〕は７４．６％であった。
【０１３５】
（ｂ） 図１の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、対照者の血清中のペリオスチン濃度の分布は、より低値域に纏まっていることが分かる。
この図１の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度１５４ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このモノクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は７５．０％であり、特異度は９４．４％であった。
【０１３６】
（ｃ） すなわち、このことより、ペリオスチンの測定に使用する抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値を、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬから１５４ｎｇ／ｍＬへと２３％も低下させることができたことが分かる。
【０１３７】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、測定の感度を６２．５％から７５．０％へと高めることができたことが分かる。
【０１３８】
更に、同じく、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の特異度を７４．６％から９４．４％へと高めることができたことが分かる。
【０１３９】
これらのことより、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１４０】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線について
図２より、抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（破線）に比較し、モノクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（実線）は、感度、及び特異度のそれぞれが向上していることが分かる。
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合（破線）に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合（実線）は、曲線下面積（ＡＵＣ）が、０．７９１から０．８５２へと増加（向上）しており、測定の正確性が改善されていることが分かる。
【０１４１】
このＲＯＣ曲線の結果からも、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１４２】
〔実施例４〕（本発明の効果の確認−２）
本発明の測定の正確性の改善方法の効果を確かめた。
【０１４３】
１．試料
試料として、次の通り、肺線維症の罹患者の血清、又は健常人の血清を用いた。
（１）肺線維症の罹患者（計３７例）の血清
（２）健常人（計６６例）の血清
【０１４４】
２．試料中のペリオスチン濃度の測定
（１）抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンポリクローナル抗体を使用した蛍光免疫測定法により測定した。
【０１４５】
なお、この測定の操作は、前記の実施例３の２の（１）の（ａ）〜（ｌ）の手順に従って行った。
【０１４６】
（２）抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定
前記１の（１）及び（２）の各試料に含まれるペリオスチンの濃度を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。
【０１４７】
なお、この測定の操作は、前記の実施例３の２の（２）の（ａ）〜（ｋ）の手順に従って行った。
【０１４８】
３．測定結果
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける肺線維症の罹患者（計３７例）及び健常人（計６６例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を、図３に示した。
【０１４９】
この図３の左側に、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
また、この図３の右側に、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果を示した。
【０１５０】
そして、この図３の左側及び右側のいずれにおいても、横軸は試料が肺線維症の罹患者の血清であるか、又は健常人の血清であるかの別を表し、縦軸は測定した各試料に含まれるペリオスチンの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【０１５１】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線
前記２の（１）及び（２）のそれぞれにおける肺線維症の罹患者（計３７例）及び健常人（計６６例）の各試料中のペリオスチン濃度の測定結果を基に、ＲＯＣ曲線を作成した。
このＲＯＣ曲線を図４に示した。
この図４において、横軸は「１−特異度」を、縦軸は「感度」を表す。
【０１５２】
そして、この図４において、前記２の（１）の抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を破線で表し、前記２の（２）の抗ペリオスチン抗体としてモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線を実線で表した。
【０１５３】
なお、前記のポリクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．７７６であった。
また、前記のモノクローナル抗体を使用した測定における測定結果のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９０５であった。
【０１５４】
４．考察
（１）試料中のペリオスチン濃度の測定結果について
（ａ） 図３の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、肺線維症の罹患者のみならず、健常人においても、その血清中のペリオスチン濃度は低値から高値まで広く分布していることが分かる。
【０１５５】
この図３の左側の、ポリクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このポリクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は５６．８％であり、特異度は８３．３％であった。
【０１５６】
（ｂ） 図３の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果より、健常人の血清中のペリオスチン濃度の分布は、より低値域に纏まっていることが分かる。
この図３の右側の、モノクローナル抗体を使用した場合の前記の測定結果において、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値は、特異度が高くかつ感度がより高く取れるようこの両方のバランスが良くなるようにカットオフ値を設定し、ペリオスチン濃度８２ｎｇ／ｍＬに設定した。
このとき、このモノクローナル抗体を使用した場合の測定の感度は６２．２％であり、特異度は９５．５％であった。
【０１５７】
（ｃ） すなわち、このことより、ペリオスチンの測定に使用する抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、罹患（陽性）と非罹患（陰性）とを判別するためのカットオフ値を、ペリオスチン濃度２００ｎｇ／ｍＬから８２ｎｇ／ｍＬへと５９％も低下させることができたことが分かる。
【０１５８】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合は、測定の感度を５６．８％から６２．２％へと高めることができたことが分かる。
【０１５９】
更に、同じく、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の特異度を８３．３％から９５．５％へと高めることができたことが分かる。
【０１６０】
これらのことより、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【０１６１】
（２）測定結果を基にしたＲＯＣ曲線について
図４より、抗ペリオスチン抗体として、ポリクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（破線）に比較し、モノクローナル抗体を使用した場合の測定結果のＲＯＣ曲線（実線）は、感度、及び特異度のそれぞれが向上していることが分かる。
【０１６２】
そして、抗ペリオスチン抗体としてポリクローナル抗体を使用した場合（破線）に比べ、モノクローナル抗体を使用した場合（実線）は、曲線下面積（ＡＵＣ）が、０．７７６から０．９０５へと増加（向上）しており、測定の正確性が改善されていることが分かる。
【０１６３】
このＲＯＣ曲線の結果からも、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチン抗体として、モノクローナル抗体を使用することにより、測定の感度及び測定の特異度をそれぞれ改善することができること、すなわち、測定の正確性を改善することができることが確かめられた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法。
【請求項１】
試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、測定の正確性の改善方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−５８０４８（Ｐ２０１２−５８０４８Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２００５６４（Ｐ２０１０−２００５６４）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【出願人】（０００１３１４７４）株式会社シノテスト (28)
【出願人】（５０４２０９６５５）国立大学法人佐賀大学 (176)
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
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