ペルオキシダーゼ化学発光測定試薬
【課題】西洋ワサビ由来ＰＯＤを用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る初発時発光強度を持続する担子菌由来ＰＯＤの化学発光測定試薬を提供する。
【解決手段】酸化剤の含有量、化学発光物質の含有量および緩衝液のｐＨの３因子を適正に選択し組み合わせて、担子菌由来ＰＯＤの化学発光測定を行う。
【効果】西洋ワサビ由来ＰＯＤを用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る担子菌由来ＰＯＤの化学発光測定試薬を用いて、化学発光反応開始１０分後に７０％以上の初発時発光強度を持続することができる。
【解決手段】酸化剤の含有量、化学発光物質の含有量および緩衝液のｐＨの３因子を適正に選択し組み合わせて、担子菌由来ＰＯＤの化学発光測定を行う。
【効果】西洋ワサビ由来ＰＯＤを用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る担子菌由来ＰＯＤの化学発光測定試薬を用いて、化学発光反応開始１０分後に７０％以上の初発時発光強度を持続することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌由来ペルオキシダーゼを含有する化学発光測定試薬に関する。さらに詳しくは、ペルオキシダーゼを利用した臨床検査に使用できるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という。）は、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、非競合法あるいは競合法、およびウエスタンブロッティング法などの各種の酵素免疫測定方法に利用される酵素のひとつとして、広く使用されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、西洋ワサビ由来のＰＯＤは、原料としての西洋ワサビの栽培に長時間を要する上に、植物体を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からＰＯＤを精製するという方法で製造されるため、その製造効率は高いとは言いがたく、大量生産が困難であった。その上、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作などを理由に、ＰＯＤの原料としての西洋ワサビの供給不安が生じつつある状況が懸念されており、これに代わり得る酵素に対する潜在的なニーズは大きい。
【０００３】
さらに、西洋ワサビ由来のＰＯＤには、多くのアイソザイムが存在するという問題も存在する。現在広く用いられている西洋ワサビ由来のＰＯＤの多くは、上述の通り低い生産効率の中で一定の価格で流通させるという制約があるため、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどである。しかし、このようなＰＯＤを用いて各種の測定、例えば、酵素免疫測定を行った場合、異なる反応特性を有する各種アイソザイムの含有量が、ＰＯＤの製造ロットごとにばらつき、このことに起因して、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題を生じている。
【０００４】
前記のような西洋ワサビ由来のＰＯＤが有する問題を克服し得ることが期待されるＰＯＤとして、微生物由来のＰＯＤがある。微生物は短時間で大量に培養可能であり、微生物由来のＰＯＤは、植物体から精製を行う場合よりも格段に少ない手間で精製を行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いることにより、微生物宿主内での発現量を人為的に高めることも容易である。遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするＰＯＤのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が容易であると同時に、そのＰＯＤを改変し、改良することも比較的容易である。このようなことから、微生物由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る有望な酵素といえる。
【０００５】
しかし、微生物由来のＰＯＤを用いて、酵素免疫測定における性能を検討した知見は乏しい。公知の微生物由来ＰＯＤとしては、Arthromyces属由来のＰＯＤが知られ、遊離状態で、あるいは、抗体と結合させて標識抗体を調製し、その標識抗体を、測定物を介して固層に固定した状態で用いる測定系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも反応性が優れていることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。また、過ヨウ素酸法を用いてArthromyces ramosus由来のＰＯＤで標識した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法の系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも反応性が高いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、Arthromyces属由来のＰＯＤの反応性の高さは、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の４倍程度にとどまり、さらに、耐熱性にも問題があることが報告されている。
【０００６】
上記欠点を解決するために、本発明者らは、すでに担子菌Coprinus属由来のＰＯＤ（例えば、特許文献３、非特許文献２参照）を調製し、これを遊離状態で用いて、発色反応系または発光反応系における性能に関して、西洋ワサビ由来のＰＯＤの反応性との比較を試みている。その結果、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビＰＯＤよりも９〜１０倍程度高活性であることを明らかにしている。また、ルミノールを基質とした発光反応系においては、化学発光増強剤であるｐ−ヨードフェノール等を添加しない場合、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビＰＯＤと比較して１００倍以上の発光強度が見られることを確認している。また、Coprinus属由来のＰＯＤで抗体を標識し、当該ＰＯＤ標識抗体を、化学発光増強剤を添加しない遊離状態で、ルミノールを基質とした発光反応に用いた場合にも、化学発光増強剤を添加した西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体に対して、同等もしくは同等以上の反応性を有することを確認している。また、耐熱性に関しても、Coprinus属由来ＰＯＤは、西洋ワサビ由来と同等あるいは同等以上の耐熱性を有しており、実用上問題とならないことも明らかにしている。
【０００７】
しかしながら、Coprinus属由来のＰＯＤを含む微生物由来のＰＯＤは、従来の化学発光反応の条件下では、化学発光反応開始直後に、高い発光強度を示すものの、持続性が悪いという欠点を有している。そのため、安定状態で発光量を測定することが困難で、微生物由来のＰＯＤを西洋ワサビ由来のＰＯＤに代替し、酵素免疫測定等に利用するには発光持続性向上のための解決すべき課題が残されている。
【０００８】
すなわち、化学発光強度が高く反応性・感度の優れた酵素免疫測定方法の開発が望まれており、特に、化学発光反応開始から初発時発光強度を長時間持続することができる化学発光試薬組成の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】特許第２５２８４５７号明細書
【特許文献３】特開平３−１９４９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９， １−６（１９９１）
【非特許文献２】Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９２ Ａｐｒ １７；１１２０（３）：２４８−５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、化学発光反応開始から初発時発光強度を長時間持続することができる化学発光試薬組成を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、特定の化学発光物質の含有量および酸化剤の含有量、並びに緩衝液の特定のｐＨを含む試薬を用いることにより、化学発光反応における担子菌由来ＰＯＤの初発時の発光強度を有効的に持続できることを知り、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
１）
（ａ）担子菌由来ペルオキシダーゼ
（ｂ）酸化剤
（ｃ）化学発光物質
（ｄ）緩衝液
を含んでなるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬であって、化学発光反応開始時において、（ｂ）濃度０．０５〜１．０ｍＭ、（ｃ）濃度０．５〜５．０ｍＭで、かつ（ｄ）ｐＨが７．５〜１０．０であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
２）前記１）に記載の（ａ）がCoprinus属由来ペルオキシダーゼで、（ｂ）が過酸化水素で、かつ（ｃ）がルミノールまたはその塩であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
３）前記１〜２）に記載の（ａ）が遊離状態ペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が１．０〜１０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが７．５〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
４）前記１〜２）に記載の（ａ）が抗体に標識したペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が４．０〜２０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが８．０〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、担子菌由来ＰＯＤを用いて化学発光測定をする際に、初発時の発光強度を有効的に持続できる試薬を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（担子菌由来ＰＯＤ）
本発明に使用するＰＯＤとしては、担子菌由来のＰＯＤが挙げられる。担子菌に属する微生物としては、例えば、Coprinus属、Uredinales属、Auriculariales属、Agaricales属等が挙げられる。中でも、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤと比較して、同等もしくは同等以上の優れた酵素化学的性質（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性）を有しており、しかも、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも比活性（Ｕ／ｍｇ）が９〜１０倍程度高いため好ましい。Coprinus属に属する微生物の例としては、Coprinus cinereus（NBRC30114）、Coprinus macrorhizus（ATCC20120）、Coprinellus disseminatus、Coprinus comatus（ATCC12640）、Coprinus clastophyllus、Coprinus alkalinus、Coprinus amphibius、Coprinus micaceus、Coprinus atramentarius、Coprinus luteocephalus、Coprinus trisporus、Coprinus sclerotiger、Coprinus domesticus、Coprinus stercorarius、Coprinus radiatus等が挙げられる。なお、NBRCは、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ATCCは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを示す。
【００１５】
Coprinus属由来ＰＯＤは、天然のものであってもよく、耐熱性向上や基質特異性向上、その他の何らかの１以上の変異を人為的に導入したものであってもよく、キメラタンパク質等であってもよい。また、市販のCoprinus属由来ＰＯＤを用いてもよい。測定上支障がない範囲において、アイソザイムを含む複数のＰＯＤを共に使用することもできるが、測定の安定性のためには、単一精製したものを用いることが好ましい。
【００１６】
また、分類学上Coprinus属に属さない微生物であっても、例えば、Coprinus属に近縁の微生物由来のＰＯＤや、Coprinus属由来のＰＯＤとアミノ酸配列が近似するもので、本発明の酵素免疫測定において同様の反応性を示すＰＯＤ等も用いることができる。
【００１７】
本発明に使用するＰＯＤは、後述する最終反応溶液中において、遊離状態または各種抗体を標識した状態で用いることができる。ＰＯＤへ抗体を標識（架橋）する方法としては、公知の各種の標識方法を用いることができ、例えば、一般的に知られている方法として、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、イソシアネート架橋法、ベンゾキノン架橋法等が挙げられる。特に、マレイミド法は、重合体形成の有無、抗原、抗体、酵素の活性維持、さらには標識効率の点で好適である。
【００１８】
（酸化剤）
本発明に使用する酸化剤は、無機過酸化物として、例えば、過酸化水素、過ホウ酸塩、次亜塩素酸塩等が挙げられ、有機過酸化物として、例えば、過酢酸、過プロピオン酸等が挙げられる。取扱い易さから、過酸化水素を用いるのが好ましい。
【００１９】
酸化剤の含有量は、用いる化学発光物質の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中の濃度を０．０５〜１．０ｍＭの濃度の範囲に保つ必要がある。前記濃度の範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記濃度の範囲を上回る場合、化学発光持続性が悪くなってしまう。
【００２０】
（化学発光物質）
本発明に使用する化学発光物質としては、公知の各種化学発光物質を用いることができ、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物を用いることができる。前記化学発光物質の具体的な例としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等、あるいは、これらの金属塩が挙げられる。金属塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を用いることができる。アルカリ金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、アルカリ土類金属塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。例えば、ルミノールまたはルミノール金属塩が安定性や発光量子収率の点で好ましい。ルミノール金属塩としては、ナトリウム塩を用いることができる。
【００２１】
化学発光物質の含有量は、用いる酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中の濃度を０．５〜５．０ｍＭの濃度の範囲に保つ必要がある。前記濃度の範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記濃度の範囲を上回る場合、高濃度の化学発光物質により、かえって化学発光反応が阻害され、実用的な測定感度を得ることができなくなる。
【００２２】
（緩衝液）
本発明に使用する緩衝液は、特に限定されることはなく、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、ピロリン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。緩衝作用が優れた緩衝液であればよい。
【００２３】
緩衝液のｐＨは、用いる化学発光物質もしくは酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中のｐＨを７．５〜１０．０の範囲に保つことが好ましい。前記ｐＨの範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記ｐＨの範囲を上回る場合、化学発光持続性が悪くなってしまう。なお、緩衝液のｐＨは、緩衝剤の水溶液に無機アルカリあるいは無機酸の水溶液を加えることで調整することができる。
【００２４】
（最終反応溶液）
前記のＰＯＤ、酸化剤、化学発光物質および緩衝液を含んでなる最終反応溶液中で、化学発光反応が起こる。初発時発光強度を高い値で維持するために、特に重要な因子として、最終反応溶液における酸化剤および化学発光物質の濃度、酸化剤および化学発光物質の濃度比、ｐＨが挙げられる。これらを適正に選択して組み合わせることにより、高い発光持続性を実現することができる。
【００２５】
最終反応溶液における化学発光物質ならびに酸化剤の濃度および緩衝液のｐＨは、上述したとおり、酸化剤濃度０．０５〜１．０ｍＭ、化学発光物質濃度０．５〜５．０ｍＭで、かつｐＨ７．５〜１０．０の範囲である。さらに、酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を１．０〜２０．０に保つ必要がある。最終反応溶液における各因子が前記範囲内であれば、化学発光反応開始１０分後において７０％以上の初発時発光強度を持続し、安定性、反応性および感度の優れた酵素免疫測定に供することができる。特に、酸化剤および化学発光物質の濃度比を上記の範囲に保つことが重要である。該濃度比が１．０を下回る場合は、化学発光反応開始１０分後における発光強度は、初発時発光強度の７０％を下回り、測定が極めて困難となる。一方、濃度比が２０．０を上回る場合は、化学発光反応を開始後しばらくしてから急激に発光反応が進行してしまい、安定性を欠くため、測定が極めて困難となる。化学発光反応開始５分後における発光強度が、初発時発光強度の２５０％を上回る場合は、臨床検査等への応用は不向きとなる。
【００２６】
なお、用いるＰＯＤが遊離状態であるか、抗体に標識した状態であるかの違いにより反応性が異なるため、前記の範囲で適宜選択するのが好ましく、例えば、遊離状態のＰＯＤを用いる場合、ｐＨが７．５〜９．５で、かつ、酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を１．０〜１０．０とするのが好ましく、抗体に標識したＰＯＤを用いる場合、ｐＨが８．０〜９．５で、かつ酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を４．０〜２０．０とするのが好ましい。
【００２７】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［遊離状態のＰＯＤを用いた緩衝液の検討］
緩衝液の化学発光反応の発光持続性に対する影響を検討するため、各種緩衝液を調製し、実験に供することで比較検討を行った。１００、２００、３００ｍＭトリス緩衝液、１００、１５０ｍＭリン酸緩衝液および１００、１５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液を常法に従い調製した。ＰＯＤとして、市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、約２０ｍｇ／ｍｌとなるように、酵素希釈用緩衝液（０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５を含む０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．４））に溶解し、さらに同希釈液で１００万〜５，０００万倍にＰＯＤを希釈して試験に供した。
【００２９】
化学発光反応は、最終反応溶液中のルミノール（Ｓｉｇｍａ社製）および過酸化水素（和光純薬社製）の濃度が、表１に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液にルミノールおよび過酸化水素を溶解し、希釈した前記ＰＯＤを添加して行った。初発時発光強度は、初発時（反応開始直後０分）、反応開始後５、１０、１５分における各発光量（１秒間の平均発光積算量）を、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ ＬＢ ９６Ｖ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて測定し、初発時の発光量を１００％とする相対値として算出した。この結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１に示すとおり、用いる緩衝液の種類によらず、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、化学発光反応開始１０分後においても、相対発光量が７０％以上に維持されることが確認された。
【実施例２】
【００３２】
［遊離状態のＰＯＤを用いた最終反応溶液中の各濃度の検討］
ＰＯＤの発光持続性に、ルミノールおよび過酸化水素の濃度ならびに両者の濃度比が与える影響を検討した。化学発光反応は、２００ｍＭ、ｐＨ８．５〜９．５のトリス緩衝液にルミノールおよび過酸化水素の終濃度が表２、３に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液に溶解し、同じく表２、３に示すような最終反応溶液濃度になるように調製した試薬に、実施例１と同様に希釈した市販のＰＯＤを添加することで行った。初発時発光強度は、実施例１の方法と同様に測定した。結果を表２、３に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
表２、３に示すとおり、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【００３６】
遊離状態のＰＯＤを用いて化学発光測定に供した場合、緩衝液のｐＨにもよるが、最終反応溶液中に含まれるルミノールおよび過酸化水素の濃度範囲が、それぞれ０．５〜５．０ｍＭおよび０．０５〜１．０ｍＭの範囲内で、かつ、ルミノール／過酸化水素の濃度比が、１．０〜１０．０において、高い発光安定性および発光持続性が保たれることがわかる。また、緩衝液のｐＨが８．５の場合、ルミノール／過酸化水素の濃度比は、１．０〜５．０が好ましく、緩衝液のｐＨが９．０〜９．５の場合、濃度比は５．０〜１０．０が好ましい。濃度比が１０を越える場合、反応直後に急激に発光量が増加し、安定性が保たれなくなってしまうため、正確な値を測定できなくなってしまう。一方、濃度比が低くなるにつれ、化学発光持続性が悪くなってしまい、濃度比が１を下回る場合は、実測に耐えられなくなってしまう。
【実施例３】
【００３７】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた最終反応溶液中の各濃度の検討］
次に、ＰＯＤ標識抗体を用いた際の、最終反応溶液の成分条件を検討した。
１．抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識
抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識を、以下のように行った。
１）ＩｇＧ−ＳＨの調製
ヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ）を、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に溶液置換し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。５００ｍＭ システアミン（Ｓｉｇｍａ社製；製品コード：Ｍ９７６８−２５Ｇ）（システアミン６ｍｇを０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）０．１ ｍｌに溶解）を調製し、前記の抗体溶液に１／１０（ｖ／ｖ）量加え、３７℃にて１．５時間インキュベーションした。過剰なシステアミンを透析あるいはゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ社製；製品コード：１７−００３３−０１、平衡化液：０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、溶出液：平衡化液と同様、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）により除去した。
２）マレイミド化ＰＯＤの調製
市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０〜３０ｍｇ／ｍｌとなるように、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。１００ｍＭ ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製；製品コード、２２３６０）（３．３４ｍｇを０．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解）を調製し、直ちにＰＯＤのモル濃度の５倍量を加えた。室温で３０分間インキュベーションし、前記の条件に従って、ゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に供し、過剰なＳＭＣＣを除去した。酵素濃度を、４０３ｎｍにおける吸光度測定値から、ε４０３ｎｍ＝８．３３×１０４ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）を用いて求めた。
３）マレイミド化ＰＯＤによる抗体の標識（架橋）および標識抗体の精製
前記のマレイミド化ＰＯＤおよびＳＨ基還元抗体（溶媒は０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８））を、酵素：抗体のモル比が１０：１となるように混合した。４℃で６時間以上（一晩）インキュベーションした後、標識（架橋）後の反応溶液を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥ社製；製品コード：１７−５１７５−０１、溶出：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、カラムサイズ：約２４ｍｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）に供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−ＩｇＧ）を得た。
【００３８】
２．ＥＬＩＳＡ法におけるＰＯＤ−ＩｇＧを用いたマウスＩｇＧの検出
８％ ＮａＣｌおよび０．２％ ＫＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で、１μｇ／ｍｌの濃度に調製したマウスＩｇＧ溶液（抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製））を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレート中にマウスＩｇＧを固相化した。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。ここに、１％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレートをブロッキングした。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。次に、０．１％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で、１０〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した前記ＰＯＤ標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ）を添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。
【００３９】
化学発光反応は、１００ｍＭ、ｐＨ８．０〜９．０のトリス緩衝液あるいは２００ｍＭ、ｐＨ９．０〜９．５のトリス緩衝液に、ルミノールおよび過酸化水素の終濃度が表４に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液に溶解し、同じく表４に示すような最終反応溶液濃度になるように調製した試薬を、上記のように調製した９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、一定時間反応させることで行った。初発時発光強度は、実施例１の方法と同様に測定した。結果を、表４に示す。
【００４０】
【表４】
【００４１】
表４に示すとおり、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【００４２】
市販のＰＯＤをＰＯＤ標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ）として用い、化学発光測定に供した場合、最終反応溶液中に含まれるルミノールおよび過酸化水素の濃度範囲が、それぞれ１．０〜３．０ｍＭおよび０．１１〜０．２２ｍＭの範囲内であり、かつ、ルミノール／過酸化水素の濃度比が、４．０〜２０．０において、高い発光安定性および発光持続性が保たれることがわかる。ルミノール／過酸化水素の濃度比が２０．０を越える場合、発光持続性は高く保たれるものの、絶対的な発光強度が低くなってしまい、実測に耐えられないものであった。発光強度の観点から、ルミノール／過酸化水素の濃度比は、４．０〜２０．０が好ましい。
【実施例４】
【００４３】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた緩衝液の検討］
化学発光反応は、表５に示す各種緩衝液に、ルミノールおよび過酸化水素を溶解し、同じく表５に示すような最終反応液濃度になるように調製した試薬を、実施例３と同様に作製した９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、一定時間反応させることで行った。初発時発光強度は、実施例１と同様に測定した。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
【００４５】
表５に示すとおり、緩衝液の違いによらず、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌由来ペルオキシダーゼを含有する化学発光測定試薬に関する。さらに詳しくは、ペルオキシダーゼを利用した臨床検査に使用できるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という。）は、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えば、非競合法あるいは競合法、およびウエスタンブロッティング法などの各種の酵素免疫測定方法に利用される酵素のひとつとして、広く使用されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、西洋ワサビ由来のＰＯＤは、原料としての西洋ワサビの栽培に長時間を要する上に、植物体を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からＰＯＤを精製するという方法で製造されるため、その製造効率は高いとは言いがたく、大量生産が困難であった。その上、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作などを理由に、ＰＯＤの原料としての西洋ワサビの供給不安が生じつつある状況が懸念されており、これに代わり得る酵素に対する潜在的なニーズは大きい。
【０００３】
さらに、西洋ワサビ由来のＰＯＤには、多くのアイソザイムが存在するという問題も存在する。現在広く用いられている西洋ワサビ由来のＰＯＤの多くは、上述の通り低い生産効率の中で一定の価格で流通させるという制約があるため、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどである。しかし、このようなＰＯＤを用いて各種の測定、例えば、酵素免疫測定を行った場合、異なる反応特性を有する各種アイソザイムの含有量が、ＰＯＤの製造ロットごとにばらつき、このことに起因して、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題を生じている。
【０００４】
前記のような西洋ワサビ由来のＰＯＤが有する問題を克服し得ることが期待されるＰＯＤとして、微生物由来のＰＯＤがある。微生物は短時間で大量に培養可能であり、微生物由来のＰＯＤは、植物体から精製を行う場合よりも格段に少ない手間で精製を行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いることにより、微生物宿主内での発現量を人為的に高めることも容易である。遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするＰＯＤのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が容易であると同時に、そのＰＯＤを改変し、改良することも比較的容易である。このようなことから、微生物由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る有望な酵素といえる。
【０００５】
しかし、微生物由来のＰＯＤを用いて、酵素免疫測定における性能を検討した知見は乏しい。公知の微生物由来ＰＯＤとしては、Arthromyces属由来のＰＯＤが知られ、遊離状態で、あるいは、抗体と結合させて標識抗体を調製し、その標識抗体を、測定物を介して固層に固定した状態で用いる測定系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも反応性が優れていることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。また、過ヨウ素酸法を用いてArthromyces ramosus由来のＰＯＤで標識した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法の系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも反応性が高いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、Arthromyces属由来のＰＯＤの反応性の高さは、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の４倍程度にとどまり、さらに、耐熱性にも問題があることが報告されている。
【０００６】
上記欠点を解決するために、本発明者らは、すでに担子菌Coprinus属由来のＰＯＤ（例えば、特許文献３、非特許文献２参照）を調製し、これを遊離状態で用いて、発色反応系または発光反応系における性能に関して、西洋ワサビ由来のＰＯＤの反応性との比較を試みている。その結果、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビＰＯＤよりも９〜１０倍程度高活性であることを明らかにしている。また、ルミノールを基質とした発光反応系においては、化学発光増強剤であるｐ−ヨードフェノール等を添加しない場合、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビＰＯＤと比較して１００倍以上の発光強度が見られることを確認している。また、Coprinus属由来のＰＯＤで抗体を標識し、当該ＰＯＤ標識抗体を、化学発光増強剤を添加しない遊離状態で、ルミノールを基質とした発光反応に用いた場合にも、化学発光増強剤を添加した西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体に対して、同等もしくは同等以上の反応性を有することを確認している。また、耐熱性に関しても、Coprinus属由来ＰＯＤは、西洋ワサビ由来と同等あるいは同等以上の耐熱性を有しており、実用上問題とならないことも明らかにしている。
【０００７】
しかしながら、Coprinus属由来のＰＯＤを含む微生物由来のＰＯＤは、従来の化学発光反応の条件下では、化学発光反応開始直後に、高い発光強度を示すものの、持続性が悪いという欠点を有している。そのため、安定状態で発光量を測定することが困難で、微生物由来のＰＯＤを西洋ワサビ由来のＰＯＤに代替し、酵素免疫測定等に利用するには発光持続性向上のための解決すべき課題が残されている。
【０００８】
すなわち、化学発光強度が高く反応性・感度の優れた酵素免疫測定方法の開発が望まれており、特に、化学発光反応開始から初発時発光強度を長時間持続することができる化学発光試薬組成の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】特許第２５２８４５７号明細書
【特許文献３】特開平３−１９４９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９， １−６（１９９１）
【非特許文献２】Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９２ Ａｐｒ １７；１１２０（３）：２４８−５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、化学発光反応開始から初発時発光強度を長時間持続することができる化学発光試薬組成を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、特定の化学発光物質の含有量および酸化剤の含有量、並びに緩衝液の特定のｐＨを含む試薬を用いることにより、化学発光反応における担子菌由来ＰＯＤの初発時の発光強度を有効的に持続できることを知り、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
１）
（ａ）担子菌由来ペルオキシダーゼ
（ｂ）酸化剤
（ｃ）化学発光物質
（ｄ）緩衝液
を含んでなるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬であって、化学発光反応開始時において、（ｂ）濃度０．０５〜１．０ｍＭ、（ｃ）濃度０．５〜５．０ｍＭで、かつ（ｄ）ｐＨが７．５〜１０．０であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
２）前記１）に記載の（ａ）がCoprinus属由来ペルオキシダーゼで、（ｂ）が過酸化水素で、かつ（ｃ）がルミノールまたはその塩であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
３）前記１〜２）に記載の（ａ）が遊離状態ペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が１．０〜１０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが７．５〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
４）前記１〜２）に記載の（ａ）が抗体に標識したペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が４．０〜２０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが８．０〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、担子菌由来ＰＯＤを用いて化学発光測定をする際に、初発時の発光強度を有効的に持続できる試薬を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（担子菌由来ＰＯＤ）
本発明に使用するＰＯＤとしては、担子菌由来のＰＯＤが挙げられる。担子菌に属する微生物としては、例えば、Coprinus属、Uredinales属、Auriculariales属、Agaricales属等が挙げられる。中でも、Coprinus属由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤと比較して、同等もしくは同等以上の優れた酵素化学的性質（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性）を有しており、しかも、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも比活性（Ｕ／ｍｇ）が９〜１０倍程度高いため好ましい。Coprinus属に属する微生物の例としては、Coprinus cinereus（NBRC30114）、Coprinus macrorhizus（ATCC20120）、Coprinellus disseminatus、Coprinus comatus（ATCC12640）、Coprinus clastophyllus、Coprinus alkalinus、Coprinus amphibius、Coprinus micaceus、Coprinus atramentarius、Coprinus luteocephalus、Coprinus trisporus、Coprinus sclerotiger、Coprinus domesticus、Coprinus stercorarius、Coprinus radiatus等が挙げられる。なお、NBRCは、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ATCCは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを示す。
【００１５】
Coprinus属由来ＰＯＤは、天然のものであってもよく、耐熱性向上や基質特異性向上、その他の何らかの１以上の変異を人為的に導入したものであってもよく、キメラタンパク質等であってもよい。また、市販のCoprinus属由来ＰＯＤを用いてもよい。測定上支障がない範囲において、アイソザイムを含む複数のＰＯＤを共に使用することもできるが、測定の安定性のためには、単一精製したものを用いることが好ましい。
【００１６】
また、分類学上Coprinus属に属さない微生物であっても、例えば、Coprinus属に近縁の微生物由来のＰＯＤや、Coprinus属由来のＰＯＤとアミノ酸配列が近似するもので、本発明の酵素免疫測定において同様の反応性を示すＰＯＤ等も用いることができる。
【００１７】
本発明に使用するＰＯＤは、後述する最終反応溶液中において、遊離状態または各種抗体を標識した状態で用いることができる。ＰＯＤへ抗体を標識（架橋）する方法としては、公知の各種の標識方法を用いることができ、例えば、一般的に知られている方法として、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、イソシアネート架橋法、ベンゾキノン架橋法等が挙げられる。特に、マレイミド法は、重合体形成の有無、抗原、抗体、酵素の活性維持、さらには標識効率の点で好適である。
【００１８】
（酸化剤）
本発明に使用する酸化剤は、無機過酸化物として、例えば、過酸化水素、過ホウ酸塩、次亜塩素酸塩等が挙げられ、有機過酸化物として、例えば、過酢酸、過プロピオン酸等が挙げられる。取扱い易さから、過酸化水素を用いるのが好ましい。
【００１９】
酸化剤の含有量は、用いる化学発光物質の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中の濃度を０．０５〜１．０ｍＭの濃度の範囲に保つ必要がある。前記濃度の範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記濃度の範囲を上回る場合、化学発光持続性が悪くなってしまう。
【００２０】
（化学発光物質）
本発明に使用する化学発光物質としては、公知の各種化学発光物質を用いることができ、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物を用いることができる。前記化学発光物質の具体的な例としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等、あるいは、これらの金属塩が挙げられる。金属塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を用いることができる。アルカリ金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、アルカリ土類金属塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。例えば、ルミノールまたはルミノール金属塩が安定性や発光量子収率の点で好ましい。ルミノール金属塩としては、ナトリウム塩を用いることができる。
【００２１】
化学発光物質の含有量は、用いる酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中の濃度を０．５〜５．０ｍＭの濃度の範囲に保つ必要がある。前記濃度の範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記濃度の範囲を上回る場合、高濃度の化学発光物質により、かえって化学発光反応が阻害され、実用的な測定感度を得ることができなくなる。
【００２２】
（緩衝液）
本発明に使用する緩衝液は、特に限定されることはなく、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、ピロリン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。緩衝作用が優れた緩衝液であればよい。
【００２３】
緩衝液のｐＨは、用いる化学発光物質もしくは酸化剤の種類、濃度または適用する測定方法等によって適宜設定すればよいが、初発時発光強度を高い値で維持するために、最終反応溶液中のｐＨを７．５〜１０．０の範囲に保つことが好ましい。前記ｐＨの範囲を下回る場合、初発時発光強度が減少し、実用的な測定感度を得ることができなくなる。一方、前記ｐＨの範囲を上回る場合、化学発光持続性が悪くなってしまう。なお、緩衝液のｐＨは、緩衝剤の水溶液に無機アルカリあるいは無機酸の水溶液を加えることで調整することができる。
【００２４】
（最終反応溶液）
前記のＰＯＤ、酸化剤、化学発光物質および緩衝液を含んでなる最終反応溶液中で、化学発光反応が起こる。初発時発光強度を高い値で維持するために、特に重要な因子として、最終反応溶液における酸化剤および化学発光物質の濃度、酸化剤および化学発光物質の濃度比、ｐＨが挙げられる。これらを適正に選択して組み合わせることにより、高い発光持続性を実現することができる。
【００２５】
最終反応溶液における化学発光物質ならびに酸化剤の濃度および緩衝液のｐＨは、上述したとおり、酸化剤濃度０．０５〜１．０ｍＭ、化学発光物質濃度０．５〜５．０ｍＭで、かつｐＨ７．５〜１０．０の範囲である。さらに、酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を１．０〜２０．０に保つ必要がある。最終反応溶液における各因子が前記範囲内であれば、化学発光反応開始１０分後において７０％以上の初発時発光強度を持続し、安定性、反応性および感度の優れた酵素免疫測定に供することができる。特に、酸化剤および化学発光物質の濃度比を上記の範囲に保つことが重要である。該濃度比が１．０を下回る場合は、化学発光反応開始１０分後における発光強度は、初発時発光強度の７０％を下回り、測定が極めて困難となる。一方、濃度比が２０．０を上回る場合は、化学発光反応を開始後しばらくしてから急激に発光反応が進行してしまい、安定性を欠くため、測定が極めて困難となる。化学発光反応開始５分後における発光強度が、初発時発光強度の２５０％を上回る場合は、臨床検査等への応用は不向きとなる。
【００２６】
なお、用いるＰＯＤが遊離状態であるか、抗体に標識した状態であるかの違いにより反応性が異なるため、前記の範囲で適宜選択するのが好ましく、例えば、遊離状態のＰＯＤを用いる場合、ｐＨが７．５〜９．５で、かつ、酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を１．０〜１０．０とするのが好ましく、抗体に標識したＰＯＤを用いる場合、ｐＨが８．０〜９．５で、かつ酸化剤および化学発光物質の濃度比を、酸化剤１に対して、化学発光物質を４．０〜２０．０とするのが好ましい。
【００２７】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［遊離状態のＰＯＤを用いた緩衝液の検討］
緩衝液の化学発光反応の発光持続性に対する影響を検討するため、各種緩衝液を調製し、実験に供することで比較検討を行った。１００、２００、３００ｍＭトリス緩衝液、１００、１５０ｍＭリン酸緩衝液および１００、１５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液を常法に従い調製した。ＰＯＤとして、市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、約２０ｍｇ／ｍｌとなるように、酵素希釈用緩衝液（０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５を含む０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．４））に溶解し、さらに同希釈液で１００万〜５，０００万倍にＰＯＤを希釈して試験に供した。
【００２９】
化学発光反応は、最終反応溶液中のルミノール（Ｓｉｇｍａ社製）および過酸化水素（和光純薬社製）の濃度が、表１に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液にルミノールおよび過酸化水素を溶解し、希釈した前記ＰＯＤを添加して行った。初発時発光強度は、初発時（反応開始直後０分）、反応開始後５、１０、１５分における各発光量（１秒間の平均発光積算量）を、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ ＬＢ ９６Ｖ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて測定し、初発時の発光量を１００％とする相対値として算出した。この結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
表１に示すとおり、用いる緩衝液の種類によらず、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、化学発光反応開始１０分後においても、相対発光量が７０％以上に維持されることが確認された。
【実施例２】
【００３２】
［遊離状態のＰＯＤを用いた最終反応溶液中の各濃度の検討］
ＰＯＤの発光持続性に、ルミノールおよび過酸化水素の濃度ならびに両者の濃度比が与える影響を検討した。化学発光反応は、２００ｍＭ、ｐＨ８．５〜９．５のトリス緩衝液にルミノールおよび過酸化水素の終濃度が表２、３に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液に溶解し、同じく表２、３に示すような最終反応溶液濃度になるように調製した試薬に、実施例１と同様に希釈した市販のＰＯＤを添加することで行った。初発時発光強度は、実施例１の方法と同様に測定した。結果を表２、３に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
表２、３に示すとおり、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【００３６】
遊離状態のＰＯＤを用いて化学発光測定に供した場合、緩衝液のｐＨにもよるが、最終反応溶液中に含まれるルミノールおよび過酸化水素の濃度範囲が、それぞれ０．５〜５．０ｍＭおよび０．０５〜１．０ｍＭの範囲内で、かつ、ルミノール／過酸化水素の濃度比が、１．０〜１０．０において、高い発光安定性および発光持続性が保たれることがわかる。また、緩衝液のｐＨが８．５の場合、ルミノール／過酸化水素の濃度比は、１．０〜５．０が好ましく、緩衝液のｐＨが９．０〜９．５の場合、濃度比は５．０〜１０．０が好ましい。濃度比が１０を越える場合、反応直後に急激に発光量が増加し、安定性が保たれなくなってしまうため、正確な値を測定できなくなってしまう。一方、濃度比が低くなるにつれ、化学発光持続性が悪くなってしまい、濃度比が１を下回る場合は、実測に耐えられなくなってしまう。
【実施例３】
【００３７】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた最終反応溶液中の各濃度の検討］
次に、ＰＯＤ標識抗体を用いた際の、最終反応溶液の成分条件を検討した。
１．抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識
抗マウスＩｇＧ抗体へのＰＯＤ標識を、以下のように行った。
１）ＩｇＧ−ＳＨの調製
ヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ）を、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に溶液置換し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。５００ｍＭ システアミン（Ｓｉｇｍａ社製；製品コード：Ｍ９７６８−２５Ｇ）（システアミン６ｍｇを０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）０．１ ｍｌに溶解）を調製し、前記の抗体溶液に１／１０（ｖ／ｖ）量加え、３７℃にて１．５時間インキュベーションした。過剰なシステアミンを透析あるいはゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ社製；製品コード：１７−００３３−０１、平衡化液：０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、溶出液：平衡化液と同様、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）により除去した。
２）マレイミド化ＰＯＤの調製
市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０〜３０ｍｇ／ｍｌとなるように、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。１００ｍＭ ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製；製品コード、２２３６０）（３．３４ｍｇを０．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解）を調製し、直ちにＰＯＤのモル濃度の５倍量を加えた。室温で３０分間インキュベーションし、前記の条件に従って、ゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に供し、過剰なＳＭＣＣを除去した。酵素濃度を、４０３ｎｍにおける吸光度測定値から、ε４０３ｎｍ＝８．３３×１０４ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）を用いて求めた。
３）マレイミド化ＰＯＤによる抗体の標識（架橋）および標識抗体の精製
前記のマレイミド化ＰＯＤおよびＳＨ基還元抗体（溶媒は０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８））を、酵素：抗体のモル比が１０：１となるように混合した。４℃で６時間以上（一晩）インキュベーションした後、標識（架橋）後の反応溶液を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥ社製；製品コード：１７−５１７５−０１、溶出：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、カラムサイズ：約２４ｍｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）に供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−ＩｇＧ）を得た。
【００３８】
２．ＥＬＩＳＡ法におけるＰＯＤ−ＩｇＧを用いたマウスＩｇＧの検出
８％ ＮａＣｌおよび０．２％ ＫＣｌを含む０．０１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で、１μｇ／ｍｌの濃度に調製したマウスＩｇＧ溶液（抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製））を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレート中にマウスＩｇＧを固相化した。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。ここに、１％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレートをブロッキングした。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。次に、０．１％スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で、１０〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した前記ＰＯＤ標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ）を添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）で３回洗浄した。
【００３９】
化学発光反応は、１００ｍＭ、ｐＨ８．０〜９．０のトリス緩衝液あるいは２００ｍＭ、ｐＨ９．０〜９．５のトリス緩衝液に、ルミノールおよび過酸化水素の終濃度が表４に示す濃度となるよう、あらかじめ各緩衝液に溶解し、同じく表４に示すような最終反応溶液濃度になるように調製した試薬を、上記のように調製した９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、一定時間反応させることで行った。初発時発光強度は、実施例１の方法と同様に測定した。結果を、表４に示す。
【００４０】
【表４】
【００４１】
表４に示すとおり、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【００４２】
市販のＰＯＤをＰＯＤ標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ）として用い、化学発光測定に供した場合、最終反応溶液中に含まれるルミノールおよび過酸化水素の濃度範囲が、それぞれ１．０〜３．０ｍＭおよび０．１１〜０．２２ｍＭの範囲内であり、かつ、ルミノール／過酸化水素の濃度比が、４．０〜２０．０において、高い発光安定性および発光持続性が保たれることがわかる。ルミノール／過酸化水素の濃度比が２０．０を越える場合、発光持続性は高く保たれるものの、絶対的な発光強度が低くなってしまい、実測に耐えられないものであった。発光強度の観点から、ルミノール／過酸化水素の濃度比は、４．０〜２０．０が好ましい。
【実施例４】
【００４３】
［ＰＯＤ標識マウスＩｇＧ抗体を用いた緩衝液の検討］
化学発光反応は、表５に示す各種緩衝液に、ルミノールおよび過酸化水素を溶解し、同じく表５に示すような最終反応液濃度になるように調製した試薬を、実施例３と同様に作製した９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、一定時間反応させることで行った。初発時発光強度は、実施例１と同様に測定した。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
【００４５】
表５に示すとおり、緩衝液の違いによらず、最終反応溶液のｐＨ、ルミノール濃度および過酸化水素濃度を適正に選択して組み合わせることにより、発光反応開始後も高い発光持続性を保つことが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）担子菌由来ペルオキシダーゼ
（ｂ）酸化剤
（ｃ）化学発光物質
（ｄ）緩衝液
を含んでなるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬であって、化学発光反応開始時において、（ｂ）濃度０．０５〜１．０ｍＭ、（ｃ）濃度０．５〜５．０ｍＭでかつ（ｄ）ｐＨが７．５〜１０．０であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項２】
請求項１に記載の（ａ）がCoprinus属由来ペルオキシダーゼで、（ｂ）が過酸化水素で、かつ（ｃ）がルミノールまたはその塩であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項３】
請求項１〜２に記載の（ａ）が遊離状態のペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が１．０〜１０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが７．５〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項４】
請求項１〜２に記載の（ａ）が抗体に標識したペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が４．０〜２０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが８．０〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項１】
（ａ）担子菌由来ペルオキシダーゼ
（ｂ）酸化剤
（ｃ）化学発光物質
（ｄ）緩衝液
を含んでなるペルオキシダーゼ化学発光測定試薬であって、化学発光反応開始時において、（ｂ）濃度０．０５〜１．０ｍＭ、（ｃ）濃度０．５〜５．０ｍＭでかつ（ｄ）ｐＨが７．５〜１０．０であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項２】
請求項１に記載の（ａ）がCoprinus属由来ペルオキシダーゼで、（ｂ）が過酸化水素で、かつ（ｃ）がルミノールまたはその塩であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項３】
請求項１〜２に記載の（ａ）が遊離状態のペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が１．０〜１０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが７．５〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【請求項４】
請求項１〜２に記載の（ａ）が抗体に標識したペルオキシダーゼであって、（ｂ）および（ｃ）の濃度比が、（ｂ）濃度１に対して、（ｃ）濃度が４．０〜２０．０の範囲で、かつ、（ｄ）ｐＨが８．０〜９．５の範囲であることを特徴とするペルオキシダーゼ化学発光測定試薬。
【公開番号】特開２０１０−２８１６５２（Ｐ２０１０−２８１６５２Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３４５７６（Ｐ２００９−１３４５７６）
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]