ホスホリパーゼＤ
【課題】安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができ、かつ、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するホスホリパーゼＤを提供する。
【解決手段】モモあるいはナスを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素として抽出する。例えば、ホスファチジルコリンを原料として、ホスファチジルセリンを製造する際に酵素として用いる。
【解決手段】モモあるいはナスを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素として抽出する。例えば、ホスファチジルコリンを原料として、ホスファチジルセリンを製造する際に酵素として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホスホリパーゼＤに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＤは、グリセロリン脂質のリン酸ジエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸とアルコールを生成する酵素であり、極性基を他の水酸基を持つ化合物と交換する反応（極性基交換反応）を触媒する酵素である。このようなホスホリパーゼＤは、広く生物界に分布しており、特に微生物に由来する酵素については、性状などが詳しく研究されている。
【０００３】
近年、細胞内外の情報伝達機構が解明されるに伴い、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣあるいはホスホリパーゼＤが細胞内外の情報伝達の一端を担うことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。これらの酵素の市販品としては、植物を起源とするものでは、キャベツに由来するものがあり（例えば、特許文献１，２参照）、微生物を起源とするのものでは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓなどがある（例えば、特許文献３，４参照）。現在では、微生物に由来するホスホリパーゼが工業的に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５０１５５９号公報
【特許文献２】特開２００２−２１８９９１号公報
【特許文献３】特開２００４−２５６４７５号公報
【特許文献４】特開２００５−２６１２８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ Ｖｏｌ．５８ Ｎｏ．８ Ｐ．４５７−４６１（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、微生物由来のホスホリパーゼは、一部のものについて病原性が指摘されており、すべてのものについて安全であるということはできず、特に、食品分野に利用するには問題があった。また、キャベツ由来のホスホリパーゼＤは、加水分解活性あるいは極性基交換活性が低いという問題があった。
【０００７】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができ、かつ、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のホスホリパーゼＤは、モモ又はナスから抽出されたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のホスホリパーゼＤによれば、モモ又はナスから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するので、リン脂質の加水分解反応および極性基交換反応が効率的に行われる。よって、例えばホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の一実施の形態に係るホスホリパーゼＤは、モモ又はナスから抽出されるものである。モモ又はナスから抽出されるものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用できるようになっている。
【００１２】
なお、モモは、桃（学名 Amygdalus persica）であり、バラ科モモ属の落葉小高木である。春には五弁又は多重弁の花を咲かせ、夏には水分が多く甘い球形の果実を実らせる中国原産の植物である。モモは食用あるいは観賞用として世界各地で栽培されている。本実施の形態に係るホスホリパーゼＤは、モモの果実を原料とする。モモの品種としては、例えば、日本の市場に出回っているものでは、白桃系の桃、白鳳系の桃、果肉の黄色い黄桃、あかつき、ゆうぞら、川中島、白桃、まどか、名月などがあり、これらのうち１種又は２種以上を原料とすることができる。
【００１３】
また、ナスは、ナス科ナス属の植物の果実である。ナスの品種としては山科なす、賀茂なす、田屋なす、十市なす、水なす、下田なす、民田なす、ていざなす、やきなすなどがあり、これらのうち１種又は２種以上を原料とすることができる。
【００１４】
このホスホリパーゼＤは、例えば、モモあるいはナスを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素として抽出することができる。更に、例えば、この粗酵素を塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、ホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件下で行うことにより、濃縮して採取することができる。
【００１５】
モモ又はナスから抽出されるホスホリパーゼＤは、例えば、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有しており、リン脂質の加水分解反応あるいは極性基交換反応を効率的に行うことができる。例えば、ホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。なお、このホスホリパーゼＤを用いてリン脂質の加水分解反応あるいは極性基交換反応を行う際に、金属イオン又は金属イオンを生ずる化合物を添加することにより、反応性を高めることができるので好ましい。
【００１６】
このように本実施の形態のホスホリパーゼＤによれば、モモ又はナスから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するので、リン脂質の加水分解反応および極性基交換反応が効率的に行われる。よって、例えばホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
モモ果実（福島県産）４００ｇに純水６００ｍｌを加え、氷冷下にてワーリングブレンダー（ハイパワーホモジナイザー，広沢鉄工所社製）でホモジナイズ（１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、５回）した。これをガーゼ濾過したのち、濾液を遠心分離機（ＣＸ−２５０、Ｔｏｍｙ社製）で遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ）して、上澄み液を回収した。続いて、回収した上澄み液に対して２倍量の冷アセトンを撹拌しながら加え、氷冷下で１時間静置したのち、生じた沈殿を遠心分離（１００００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）して回収し、真空凍結乾燥機（ＶＤ−８００Ｆ、Ｔａｉｔｅｃ社製）で凍結乾燥した。凍結乾燥物を氷冷させた乳鉢で微粉末にし、得られた粉末をモモホスホリパーゼＤとして、−２０℃で保存した。得られたモモホスホリパーゼＤについて加水分解活性を測定したところ、７５．５Ｕ／ｇであった。
【００１８】
なお、加水分解活性は、コリンオキシダーゼ法により、次のようにして求めた。まず、基質として、卵黄レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）含量９９・１％ Ｑ．Ｐ． Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）０．１ｇに４０ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）１０ｍｌを加え、氷冷下で超音波ホモジナイザー（ＵＳ１５０ 日本精機製作所社製）を用いて、完全にレシチンを分散させ、１％（ｗ／ｖ）ＰＣ乳化液を調製した。次いで、０．２Ｍ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）０．１ｍｌと、０．１Ｍ塩化カルシウム０．１ｍｌと、蒸留水０．６ｍｌとを混合し、酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃で５分間予備加温した後、基質として１％（ｗ／ｖ）ＰＣ乳化液を加え、全量を１．０ｍｌ（終濃度：２０ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、４ｍＭＳＤＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＣ）として、３７℃で１０分間酵素反応を行った。続いて、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２ｍｌを加え、酵素反応を停止させた。次に、（１）コリンオキシダーゼの全量約４８ｍｇを４００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）２０ｍｌに溶解したコリンオキシダーゼ溶液２５Ｕ／ｍｌと、（２）パーオキシダーゼ４ｍｇを２０ｍｌの純水に溶解したパーオキシダーゼ溶液２０Ｕ／ｍｌと、（３）２０ｍＭ４−アミノアンチピリン溶液と、（４）３２ｍＭフェノール溶液とを等量混合したコリン発色液０．２ｍｌを加えて、３７℃で１時間酵素反応させた。その後、非イオン性界面活性剤（１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）２ｍｌを加え、吸収波長５００ｎｍの吸光度を測定した。なお、塩化コリンの水溶液を標準液として酵素液の代わりに用いて同様に操作し、検量線を作成した。酵素力価は３７℃で１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素活性を１Ｕとした。
【００１９】
（実施例２）
モモに代えてナス（会津丸：福島県産）を用いたことを除き、他は実施例１と同様にしてナスホスホリパーゼＤを得た。得られたナスホスホリパーゼＤについても、実施例１と同様にして加水分解活性を測定したところ、６９．３Ｕ／ｇであった。
【００２０】
続いて、ナスホスホリパーゼＤの２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の５０ｍＬにて溶解し、それを同一の緩衝液にて透析して脱塩した。次いで、これを陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製 ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ７５）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、食塩濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。更に、その溶出したナスホスホリパーゼＤを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析して脱塩した。次いで、これを陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製 ＤＥＡＥ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、食塩濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。その後、このようにして得られたナスホスホリパーゼＤの画分を、更に、疎水性クロマトグラフィー用充填剤（東ソー株式会社製 Ｂｕｔｙｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、硫酸アンモニウム濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。次いで、得られたナスホスホリパーゼＤの画分を集めて、限外濾過手法にて濃縮した後、ゲル濾過用充填剤（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００）を充填したカラムに通して、ゲル濾過と真空凍結乾燥を行なうことにより、ナスホスホリパーゼＤの精製物を０．０２ｇ得た。得られたナスホスホリパーゼＤの精製物についても、実施例１と同様にして加水分解活性を測定したところ、５２５Ｕ／ｇであった。また、極性基交換活性を測定したところ、１３５０Ｕ／ｇであった。
【００２１】
なお、極性基交換活性は、極性基交換活性測定法により、次のようにして求めた。まず、ホスファチジルパラニトロフェノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶解して、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液０．２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液０．１ｍｌと、２０ｍｇ／ｍｌの牛アルブミン溶液０．０５ｍｌとを混合し、１５分間超音波にて分散してエマルジョン化する。これを３７℃で５分間加温したのち、酵素溶液０．０５ｍｌを加えて反応を開始する。これと並行して、酵素溶液の代わりにパラニトロフェノールを１．０、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０μｍｏｌ含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とする。３７℃、１０分間反応を行ったのち、１Ｎ塩酸溶液０．１ｍｌを加えて反応を停止し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／１（体積比）溶液０．４ｍｌを加えて混合したのち、４℃で１０分間遠心分離する。水相を０．０２ｍｌとり、０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）０．１８ｍｌと混合し、マイクロプレートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノール量を換算し、転移活性を決定することにより求めた。なお、この反応での１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義する。
【００２２】
（実施例３）
実施例２において得られたナスホスホリパーゼＤの精製物を用いてリン脂質の極性基交換反応を調べた。まず、酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌに、セリン１０ｇと、塩化カルシウム０．２２２ｇと、ナスホスホリパーゼＤの精製物１０ｍｇとを溶解し、原料のホスホリポン１００（ナッターマン社製品、ホスホリルコリン純度９５％、ホスファチジルセリンの含有量は０％）を０．２ｇ加えて超音波乳化機（ソニファイヤー、ブランソン社）で均質化した。次いで、反応温度４５℃で反応させながら、経時的にサンプリングして、全リン脂質中のホスファチジルセリンの含量を測定した。その結果、ホスファチジルセリンの含量は、１時間程度で平衡に近づいたので、１時間１５分で反応を終了させた。続いて、反応溶液に食塩４ｇを添加し、溶解して塩析を行った後、デカンテーションにより上層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０℃、８時間）で上層に残った水分を蒸発させてリン脂質０．１９４ｇを得た。得られた物質中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８８重量％、ホスファチジルコリン４．０重量％、その他のリン脂質６．０重量％であった。
【００２３】
なお、リン脂質の定量分析は次のようにして行った。装置には、高速液体クロマトグラフィー（アジレント社製、機種モデル１１００）を用い、固定相はシリカゲルカラム（径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）、移動相（溶離液）はアセトニトリルとメタノールと１０ｍＭリン酸二水素アンモニウムとの混合溶媒（アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝６１２：２８９：１００体積比）とし、紫外線ＵＶ波長２０２ｎｍにおける吸収を測定した。分離温度は４０℃、試料量は５μＬ、流出速度は１．５ｍｌ／分とし、予め作成した検量線と試料の紫外吸収強度を比較して、試料中の各種リン脂質含量（重量％）を求めた。なお、原料は試料１ｍｇを１ｍｌの上述した溶離液に溶解して分析した。また、反応液の場合は、反応液１ｍｇに精製水５ｍｌとｎ−ヘキサン５ｍｌとを添加し、１分間撹拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液１ｍｌを分離し、エバポレートで溶媒を除去して不揮発成分の重量を求め、濃度が１ｍｇ／１ｍｌとなるように溶離液を加えて溶解したものを試料として用いた。
【００２４】
（比較例１）
モモに代えてキャベツ（愛知県産）を用い、実施例１と同様にしてキャベツホスホリパーゼＤを調製した。得られたキャベツホスホリパーゼＤについても、実施例１と同様にして加水分解活性および極性基交換活性を測定したところ、加水分解活性は１４Ｕ／ｇ、極性基交換活性は７Ｕ／ｇであった。
【００２５】
（比較例２）
モモに代えて大根（埼玉県産）を用い、実施例１と同様にして大根ホスホリパーゼＤを調製した後、実施例２と同様にして精製した。得られた大根ホスホリパーゼＤの精製物についても、実施例１と同様にして加水分解活性および極性基交換活性を測定したところ、加水分解活性は９２Ｕ／ｇ、極性基交換活性は１０Ｕ／ｇであった。
【００２６】
（比較例３）
比較例２において得られた大根ホスホリパーゼＤの精製物を用い、実施例３と同様にしてリン脂質の極性基交換反応を調べた。得られた物質中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８重量％、ホスファチジルコリン４０重量％、その他のリン脂質４８重量％であった。その他のリン脂質の主成分はホスファチジン酸であった。
【００２７】
（実施例と比較例との比較）
実施例１，２によれば、比較例１，２に比べて、高い加水分解活性および極性基交換活性が得られた。また、実施例３によれば、比較例３に比べて、得られたホスファチジルセリンの純度および収率が高かった。すなわち、モモ又はナスから抽出されたホスホリパーゼＤによれば、高い加水分解活性および高い極性基交換活性を得ることができ、ホスファチジルセリン等の希少なリン脂質を高い純度および高い収率で製造することができることがわかった。
【００２８】
以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明したが、本発明は、上記実施の形態および実施例に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態および上記実施例では、ホスホリパーゼＤの抽出方法、精製方法およびホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の加水分解方法、極性基交換方法について具体的に説明したが、他の方法により行うようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
リン脂質の加水分解又は極性基交換反応に用いることができ、例えば、ホスファチジン酸やホスファチジルセリンの製造に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホスホリパーゼＤに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＤは、グリセロリン脂質のリン酸ジエステル結合を加水分解して、ホスファチジン酸とアルコールを生成する酵素であり、極性基を他の水酸基を持つ化合物と交換する反応（極性基交換反応）を触媒する酵素である。このようなホスホリパーゼＤは、広く生物界に分布しており、特に微生物に由来する酵素については、性状などが詳しく研究されている。
【０００３】
近年、細胞内外の情報伝達機構が解明されるに伴い、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣあるいはホスホリパーゼＤが細胞内外の情報伝達の一端を担うことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。これらの酵素の市販品としては、植物を起源とするものでは、キャベツに由来するものがあり（例えば、特許文献１，２参照）、微生物を起源とするのものでは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓなどがある（例えば、特許文献３，４参照）。現在では、微生物に由来するホスホリパーゼが工業的に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５０１５５９号公報
【特許文献２】特開２００２−２１８９９１号公報
【特許文献３】特開２００４−２５６４７５号公報
【特許文献４】特開２００５−２６１２８４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ Ｖｏｌ．５８ Ｎｏ．８ Ｐ．４５７−４６１（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、微生物由来のホスホリパーゼは、一部のものについて病原性が指摘されており、すべてのものについて安全であるということはできず、特に、食品分野に利用するには問題があった。また、キャベツ由来のホスホリパーゼＤは、加水分解活性あるいは極性基交換活性が低いという問題があった。
【０００７】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができ、かつ、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のホスホリパーゼＤは、モモ又はナスから抽出されたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のホスホリパーゼＤによれば、モモ又はナスから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するので、リン脂質の加水分解反応および極性基交換反応が効率的に行われる。よって、例えばホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の一実施の形態に係るホスホリパーゼＤは、モモ又はナスから抽出されるものである。モモ又はナスから抽出されるものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用できるようになっている。
【００１２】
なお、モモは、桃（学名 Amygdalus persica）であり、バラ科モモ属の落葉小高木である。春には五弁又は多重弁の花を咲かせ、夏には水分が多く甘い球形の果実を実らせる中国原産の植物である。モモは食用あるいは観賞用として世界各地で栽培されている。本実施の形態に係るホスホリパーゼＤは、モモの果実を原料とする。モモの品種としては、例えば、日本の市場に出回っているものでは、白桃系の桃、白鳳系の桃、果肉の黄色い黄桃、あかつき、ゆうぞら、川中島、白桃、まどか、名月などがあり、これらのうち１種又は２種以上を原料とすることができる。
【００１３】
また、ナスは、ナス科ナス属の植物の果実である。ナスの品種としては山科なす、賀茂なす、田屋なす、十市なす、水なす、下田なす、民田なす、ていざなす、やきなすなどがあり、これらのうち１種又は２種以上を原料とすることができる。
【００１４】
このホスホリパーゼＤは、例えば、モモあるいはナスを粉砕して濾過した濾液、あるいは遠心分離した際の上澄み液を、アセトンなどの有機溶媒と混合したのち、沈殿物を必要に応じて、凍結乾燥等することにより、粗酵素として抽出することができる。更に、例えば、この粗酵素を塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、ホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件下で行うことにより、濃縮して採取することができる。
【００１５】
モモ又はナスから抽出されるホスホリパーゼＤは、例えば、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有しており、リン脂質の加水分解反応あるいは極性基交換反応を効率的に行うことができる。例えば、ホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。なお、このホスホリパーゼＤを用いてリン脂質の加水分解反応あるいは極性基交換反応を行う際に、金属イオン又は金属イオンを生ずる化合物を添加することにより、反応性を高めることができるので好ましい。
【００１６】
このように本実施の形態のホスホリパーゼＤによれば、モモ又はナスから抽出されたものであるので、安全性が高く、食品分野にも安心して利用することができる。また、高い加水分解活性あるいは極性基交換活性を有するので、リン脂質の加水分解反応および極性基交換反応が効率的に行われる。よって、例えばホスファチジルコリンを原料として、希少なホスファチジン酸やホスファチジルセリンを安全にかつ効率的に製造することができる。
【実施例】
【００１７】
（実施例１）
モモ果実（福島県産）４００ｇに純水６００ｍｌを加え、氷冷下にてワーリングブレンダー（ハイパワーホモジナイザー，広沢鉄工所社製）でホモジナイズ（１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ、５回）した。これをガーゼ濾過したのち、濾液を遠心分離機（ＣＸ−２５０、Ｔｏｍｙ社製）で遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ）して、上澄み液を回収した。続いて、回収した上澄み液に対して２倍量の冷アセトンを撹拌しながら加え、氷冷下で１時間静置したのち、生じた沈殿を遠心分離（１００００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）して回収し、真空凍結乾燥機（ＶＤ−８００Ｆ、Ｔａｉｔｅｃ社製）で凍結乾燥した。凍結乾燥物を氷冷させた乳鉢で微粉末にし、得られた粉末をモモホスホリパーゼＤとして、−２０℃で保存した。得られたモモホスホリパーゼＤについて加水分解活性を測定したところ、７５．５Ｕ／ｇであった。
【００１８】
なお、加水分解活性は、コリンオキシダーゼ法により、次のようにして求めた。まず、基質として、卵黄レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）含量９９・１％ Ｑ．Ｐ． Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）０．１ｇに４０ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）１０ｍｌを加え、氷冷下で超音波ホモジナイザー（ＵＳ１５０ 日本精機製作所社製）を用いて、完全にレシチンを分散させ、１％（ｗ／ｖ）ＰＣ乳化液を調製した。次いで、０．２Ｍ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）０．１ｍｌと、０．１Ｍ塩化カルシウム０．１ｍｌと、蒸留水０．６ｍｌとを混合し、酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃で５分間予備加温した後、基質として１％（ｗ／ｖ）ＰＣ乳化液を加え、全量を１．０ｍｌ（終濃度：２０ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、４ｍＭＳＤＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＣ）として、３７℃で１０分間酵素反応を行った。続いて、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２ｍｌを加え、酵素反応を停止させた。次に、（１）コリンオキシダーゼの全量約４８ｍｇを４００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）２０ｍｌに溶解したコリンオキシダーゼ溶液２５Ｕ／ｍｌと、（２）パーオキシダーゼ４ｍｇを２０ｍｌの純水に溶解したパーオキシダーゼ溶液２０Ｕ／ｍｌと、（３）２０ｍＭ４−アミノアンチピリン溶液と、（４）３２ｍＭフェノール溶液とを等量混合したコリン発色液０．２ｍｌを加えて、３７℃で１時間酵素反応させた。その後、非イオン性界面活性剤（１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）２ｍｌを加え、吸収波長５００ｎｍの吸光度を測定した。なお、塩化コリンの水溶液を標準液として酵素液の代わりに用いて同様に操作し、検量線を作成した。酵素力価は３７℃で１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素活性を１Ｕとした。
【００１９】
（実施例２）
モモに代えてナス（会津丸：福島県産）を用いたことを除き、他は実施例１と同様にしてナスホスホリパーゼＤを得た。得られたナスホスホリパーゼＤについても、実施例１と同様にして加水分解活性を測定したところ、６９．３Ｕ／ｇであった。
【００２０】
続いて、ナスホスホリパーゼＤの２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の５０ｍＬにて溶解し、それを同一の緩衝液にて透析して脱塩した。次いで、これを陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製 ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ７５）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、食塩濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。更に、その溶出したナスホスホリパーゼＤを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析して脱塩した。次いで、これを陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製 ＤＥＡＥ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、食塩濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。その後、このようにして得られたナスホスホリパーゼＤの画分を、更に、疎水性クロマトグラフィー用充填剤（東ソー株式会社製 Ｂｕｔｙｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ）を充填したカラムに通して、ナスホスホリパーゼＤを吸着させた後、硫酸アンモニウム濃度勾配法にて吸着させたナスホスホリパーゼＤを溶出させた。次いで、得られたナスホスホリパーゼＤの画分を集めて、限外濾過手法にて濃縮した後、ゲル濾過用充填剤（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００）を充填したカラムに通して、ゲル濾過と真空凍結乾燥を行なうことにより、ナスホスホリパーゼＤの精製物を０．０２ｇ得た。得られたナスホスホリパーゼＤの精製物についても、実施例１と同様にして加水分解活性を測定したところ、５２５Ｕ／ｇであった。また、極性基交換活性を測定したところ、１３５０Ｕ／ｇであった。
【００２１】
なお、極性基交換活性は、極性基交換活性測定法により、次のようにして求めた。まず、ホスファチジルパラニトロフェノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶解して、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液０．２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液０．１ｍｌと、２０ｍｇ／ｍｌの牛アルブミン溶液０．０５ｍｌとを混合し、１５分間超音波にて分散してエマルジョン化する。これを３７℃で５分間加温したのち、酵素溶液０．０５ｍｌを加えて反応を開始する。これと並行して、酵素溶液の代わりにパラニトロフェノールを１．０、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０μｍｏｌ含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とする。３７℃、１０分間反応を行ったのち、１Ｎ塩酸溶液０．１ｍｌを加えて反応を停止し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／１（体積比）溶液０．４ｍｌを加えて混合したのち、４℃で１０分間遠心分離する。水相を０．０２ｍｌとり、０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）０．１８ｍｌと混合し、マイクロプレートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノール量を換算し、転移活性を決定することにより求めた。なお、この反応での１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義する。
【００２２】
（実施例３）
実施例２において得られたナスホスホリパーゼＤの精製物を用いてリン脂質の極性基交換反応を調べた。まず、酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）２０ｍｌに、セリン１０ｇと、塩化カルシウム０．２２２ｇと、ナスホスホリパーゼＤの精製物１０ｍｇとを溶解し、原料のホスホリポン１００（ナッターマン社製品、ホスホリルコリン純度９５％、ホスファチジルセリンの含有量は０％）を０．２ｇ加えて超音波乳化機（ソニファイヤー、ブランソン社）で均質化した。次いで、反応温度４５℃で反応させながら、経時的にサンプリングして、全リン脂質中のホスファチジルセリンの含量を測定した。その結果、ホスファチジルセリンの含量は、１時間程度で平衡に近づいたので、１時間１５分で反応を終了させた。続いて、反応溶液に食塩４ｇを添加し、溶解して塩析を行った後、デカンテーションにより上層のみを分離し、真空凍結乾燥機（２０℃、８時間）で上層に残った水分を蒸発させてリン脂質０．１９４ｇを得た。得られた物質中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８８重量％、ホスファチジルコリン４．０重量％、その他のリン脂質６．０重量％であった。
【００２３】
なお、リン脂質の定量分析は次のようにして行った。装置には、高速液体クロマトグラフィー（アジレント社製、機種モデル１１００）を用い、固定相はシリカゲルカラム（径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）、移動相（溶離液）はアセトニトリルとメタノールと１０ｍＭリン酸二水素アンモニウムとの混合溶媒（アセトニトリル：メタノール：１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム＝６１２：２８９：１００体積比）とし、紫外線ＵＶ波長２０２ｎｍにおける吸収を測定した。分離温度は４０℃、試料量は５μＬ、流出速度は１．５ｍｌ／分とし、予め作成した検量線と試料の紫外吸収強度を比較して、試料中の各種リン脂質含量（重量％）を求めた。なお、原料は試料１ｍｇを１ｍｌの上述した溶離液に溶解して分析した。また、反応液の場合は、反応液１ｍｇに精製水５ｍｌとｎ−ヘキサン５ｍｌとを添加し、１分間撹拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液１ｍｌを分離し、エバポレートで溶媒を除去して不揮発成分の重量を求め、濃度が１ｍｇ／１ｍｌとなるように溶離液を加えて溶解したものを試料として用いた。
【００２４】
（比較例１）
モモに代えてキャベツ（愛知県産）を用い、実施例１と同様にしてキャベツホスホリパーゼＤを調製した。得られたキャベツホスホリパーゼＤについても、実施例１と同様にして加水分解活性および極性基交換活性を測定したところ、加水分解活性は１４Ｕ／ｇ、極性基交換活性は７Ｕ／ｇであった。
【００２５】
（比較例２）
モモに代えて大根（埼玉県産）を用い、実施例１と同様にして大根ホスホリパーゼＤを調製した後、実施例２と同様にして精製した。得られた大根ホスホリパーゼＤの精製物についても、実施例１と同様にして加水分解活性および極性基交換活性を測定したところ、加水分解活性は９２Ｕ／ｇ、極性基交換活性は１０Ｕ／ｇであった。
【００２６】
（比較例３）
比較例２において得られた大根ホスホリパーゼＤの精製物を用い、実施例３と同様にしてリン脂質の極性基交換反応を調べた。得られた物質中のリン脂質含量は、ホスファチジルセリン８重量％、ホスファチジルコリン４０重量％、その他のリン脂質４８重量％であった。その他のリン脂質の主成分はホスファチジン酸であった。
【００２７】
（実施例と比較例との比較）
実施例１，２によれば、比較例１，２に比べて、高い加水分解活性および極性基交換活性が得られた。また、実施例３によれば、比較例３に比べて、得られたホスファチジルセリンの純度および収率が高かった。すなわち、モモ又はナスから抽出されたホスホリパーゼＤによれば、高い加水分解活性および高い極性基交換活性を得ることができ、ホスファチジルセリン等の希少なリン脂質を高い純度および高い収率で製造することができることがわかった。
【００２８】
以上、実施の形態および実施例を挙げて本発明を説明したが、本発明は、上記実施の形態および実施例に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態および上記実施例では、ホスホリパーゼＤの抽出方法、精製方法およびホスホリパーゼＤを用いたリン脂質の加水分解方法、極性基交換方法について具体的に説明したが、他の方法により行うようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
リン脂質の加水分解又は極性基交換反応に用いることができ、例えば、ホスファチジン酸やホスファチジルセリンの製造に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モモ又はナスから抽出されることを特徴とするホスホリパーゼＤ。
【請求項１】
モモ又はナスから抽出されることを特徴とするホスホリパーゼＤ。
【公開番号】特開２０１１−１０６１０（Ｐ２０１１−１０６１０Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５８２７５（Ｐ２００９−１５８２７５）
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５０８９６１４）国立大学法人福島大学 (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０５０８９６１４）国立大学法人福島大学 (34)
【Ｆターム（参考）】
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