ポリヌクレオチドアセンブリに関する組成物及び方法
本発明は、複数の成分ポリヌクレオチドからの1以上のアセンブルドポリヌクレオチドの迅速なアセンブリのための組成物及び方法を提供する。本発明の方法は、アニール可能なリンカー配列、アニール可能なリンカー配列の対LA及びLB、又はアニール可能なリンカー配列/プライマー結合セグメントの対LA及びPB若しくはPA及びLBにより隣接されたDNAセグメントDを含む環状核酸ベクターを利用する。アセンブルされるべきDNAセグメントを含む複数のベクターの制限エンドヌクレアーゼ消化は、エレメントPA-D-LB、LA-D-LB、及びLA-D-PB又はD-LB、LA-D-LB、及びLA-Dを含む、複数のDNA断片を作製する。アニール可能なリンカー配列LA及びLBの配列は、このDNA断片への相補的末端を提供し、これは宿主細胞介在性相同組換えにおいて、又は様々なDNAセグメントの1以上のアセンブルドポリヌクレオチドへの順序づけられたアセンブリのためのポリメラーゼサイクリングアセンブリ反応においてプライマー(promer)結合セグメントPA及びPBと一緒に、利用される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(b)中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、ここでnは、1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(c)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmは、中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子；であって、
制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(p-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体にハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつここで各群D0,...Dn,...Dmは独立して、1以上のDNAセグメントからなるもの：を含有する、組成物。
【請求項２】
前記1以上の最初の核酸分子の各々が、群D0から選択されたDNAセグメントの5'側に位置したプライマー結合セグメントPAを更に含み、かつここで該1以上の最後の核酸分子の各々が、群Dmから選択されたDNAセグメントの3'側に位置したプライマー結合セグメントPBを更に含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体に、該組成物中の他のアニール可能なリンカー配列又はそれらの相補体と比べ、選択的にハイブリダイズすることが可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項４】
前記アニール可能なリンカーLB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAP、又はそれらの相補体と配列が同一である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項５】
1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項６】
前記制限部位RA0からRBmの各々が、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項７】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項８】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項９】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１１】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び融解温度少なくとも65℃を有し、かつ配列モチーフ
【化１】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１４】
前記プライマー結合セグメントの各々が、配列番号：24〜25、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項2記載の組成物。
【請求項１５】
前記制限部位RB0からRBmの切断が可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼを更に含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１６】
SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼを更に含有する、請求項8記載の組成物。
【請求項１７】
前記制限部位RA0からRBmの切断が可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼによる、請求項1又は2記載の組成物の消化により形成された複数の直線状核酸分子を含有する、組成物。
【請求項１８】
前記直線状核酸分子の各々が、粘着末端を含む、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
前記プライマー結合セグメントPAに相補的である第一のプライマー、又はそれらの相補体、及びプライマー結合セグメントPBに相補的である第二のプライマー、又はそれらの相補体を更に含有する、請求項2記載の組成物。
【請求項２０】
DNAポリメラーゼを更に含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項２１】
SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼによる、請求項8記載の組成物の消化により形成される複数の直線状核酸分子を含有する、組成物。
【請求項２２】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(d)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(e)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；から選択され、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、ベクター。
【請求項２３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２４】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２５】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化２】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項22記載のベクター。
【請求項２６】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２７】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２８】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項22記載のベクター。
【請求項２９】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項22記載のベクター。
【請求項３０】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(d)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(e)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；から選択され、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、ベクター。
【請求項３１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項30記載のベクター。
【請求項３２】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項30記載のベクター。
【請求項３３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化３】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項30記載のベクター。
【請求項３４】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項30記載のベクター。
【請求項３５】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項30記載のベクター。
【請求項３６】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３７】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３８】
前記制限部位RY及びRZが、同じ制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３９】
前記制限部位RY及びRZが、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項４０】
前記制限部位RY及びRZが、SchIにより切断可能である、請求項39記載のベクター。
【請求項４１】
(a)請求項30記載のベクターを1以上；
(b)制限部位RA及びRBの切断が可能なIIS型制限エンドヌクレアーゼを1以上；並びに
(c)制限部位RY及びRZの切断が可能な制限エンドヌクレアーゼを1以上：備える、ポリヌクレオチドのアセンブリのためのキット。
【請求項４２】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター：であって、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、各ベクターを少なくとも1つ含む、核酸分子のライブラリー。
【請求項４３】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター：であって、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、各ベクターを少なくとも1つ含む、核酸分子のライブラリー。
【請求項４４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化４】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４７】
前記アニール可能なリンカー配列LA及びアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４８】
前記プライマー結合セグメントPA及びプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項43記載のライブラリー。
【請求項４９】
前記DNAセグメントDが、選択マーカー、プロモーター、ゲノム標的化配列、エピトープタグをコードしている核酸配列、関心対象の遺伝子、終止コドンをコードしている核酸配列、及びlacZをコードしている核酸からなる群から選択される核配列(nucleic sequence)を含む、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５０】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５１】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５２】
(a)最初の核酸分子が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、最初の核酸分子；
(b)中間の核酸分子nが、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnは1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、中間の核酸分子；並びに
(c)最後の核酸分子が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmは中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、最後の核酸分子；である各核酸分子の少なくとも1つを含む、核酸分子のライブラリーであって、
ここで制限部位RA0からRBmの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり；
制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつ各群D0,... Dn, ...及びDmは独立して、1以上のDNAセグメントからなる、ライブラリー。
【請求項５３】
前記最初の核酸分子が、群D0から選択されたDNAセグメントに対し5'側に位置したプライマー結合セグメントPAを更に含み、かつ前期最後の核酸分子が、群Dmから選択されたDNAセグメントに対し3'側に位置したプライマー結合セグメントPBを更に含む、請求項52記載のライブラリー。
【請求項５４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化５】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５８】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５９】
前記プライマー結合セグメントの各々が独立して、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項53記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記最初の核酸分子2つ及び最後の核酸分子2つを含むライブラリーであって、
ここで最初の核酸分子の一方が、ゲノム標的化配列の第一セグメントを含むDNAセグメントD01を含み、かつ他方の最初の核酸分子が、ゲノム標的化配列の第二セグメントを含むDNAセグメントD02を含み、ここでDNAセグメントD01及びD02は、2つの最初の核酸分子の制限部位RA0及びRB0に対し同一配向に配向され；
ここで最後の核酸分子の一方が、選択マーカーの第一の非機能性セグメントをコードしているDNAセグメントDm1を含み、かつ他方の最後の核酸分子が、選択マーカーの第二の非機能性セグメントをコードしているDNAセグメントDm2を含み、ここでDNAセグメントDm1及びDm2は、2つの最後の核酸分子の制限部位RAm及びRBmに対し反対配向に配向され；
並びに、ここで選択マーカーの第一の非機能性セグメントと選択マーカーの第二の非機能性セグメントの間のギャップ修復による組換えは、機能性選択マーカーの作出を生じる、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項６１】
(a)アセンブリ組成物を、1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼにより消化し、成分組成物を作製する工程であって、該アセンブリ組成物が：
(i)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群PAから選択された任意のプライマー結合セグメント、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(ii)中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(iii)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択されたDNAセグメント、群PBから選択された任意のプライマー結合セグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子：を含み；制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつここで各群D0,... Dn,... 及びDnは、1以上のDNAセグメントからなる工程；並びに
(b)前記成分組成物を、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸及び1以上の第一のプライマー及び1以上の第二のプライマーと、核酸分子の変性に適した条件下で接触させ、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)をアニール可能なリンカー配列LAPにアニールし、かつそれらを伸長させ；ここで該第一のプライマーの各々は、群PAから選択された該プライマー結合セグメントの1つとハイブリダイズすることが可能であり、かつ該第二のプライマーの各々は、群PBから選択された該プライマー結合セグメントの1つとハイブリダイズすることが可能であり；並びに、この成分組成物を、ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程であり、
ここで5'から3'の配向で、群D0,... Dn,...及びDmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含むポリヌクレオチドがアセンブルされる工程：
を含む、複数の成分ポリヌクレオチドからアセンブルドポリヌクレオチドを作製する方法。
【請求項６２】
前記1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼが、制限部位RA0からRBmの切断が可能である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記アセンブリ組成物が、1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化６】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPと配列が同一である、請求項61記載の方法。
【請求項６８】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項61記載の方法。
【請求項６９】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり、かつ工程(a)の制限エンドヌクレアーゼが、SapI又はLguIである、請求項61記載の方法。
【請求項７０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７２】
前記プライマー結合セグメントの各々が、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７３】
前記DNAポリメラーゼが、Pfuである、請求項61記載の方法。
【請求項７４】
(a)宿主細胞を、請求項61に従いアセンブルされた1以上のポリヌクレオチドにより形質転換する工程；及び
(b)この1以上のアセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項７５】
前記アセンブルドポリヌクレオチドが、選択マーカーを含み、かつ工程(b)が、選択培地上で形質転換された宿主細胞を増殖することを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
(i)プライマー結合セグメントPAと相同な第一の領域；及び
(ii)プライマー結合セグメントPBと相同な第二の領域：を含む直線化されたプラスミドにより、宿主細胞を形質転換する工程を更に含み：
ここで該相同な第一及び第二の領域は、該ポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
(a)(i)分子の各々が、5'から3'の配向で、群D0から選択された任意のDNAセグメント、及びアニール可能なリンカー配列LB0を含む、1以上の最初の直線状核酸分子；
(ii)任意に、中間の直線状核酸分子の各々が、5'から3'の配向で、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、及び第二のアニール可能なリンカー配列LBnを含み、ここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の直線状核酸分子；並びに
(iii)最後の直線状核酸分子の各々が、5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LAm、及び群Dmから選択された任意のDNAセグメントを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の直線状核酸分子：
を含有する組成物により、宿主細胞を形質転換する工程であり；
ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、
ここで各群D0,... Dn,...Dmは、1以上のDNAセグメントからなり、
ここでアニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、LB(P-1)とLAPの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さのアニール可能なリンカー配列LAPと相同な領域を含み、ここでpは1〜mの整数を表し、ここで該相同組換えは、ポリヌクレオチドのアセンブリを生じる、工程；並びに
(b)アセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程であり、ここでアセンブルドポリヌクレオチドが、5'から3'の配向で、群D0,...Dn,...Dmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含む工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項７８】
(a)1以上の最初の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第一の組込み部位と相同な第一の領域を更に含み；及び
(b)1以上の最後の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第二の組込み部位と相同な第二の領域を更に含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、各々、該第一及び第二の組込み部位と宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さであり、ここで該相同組換えは、アセンブルドポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの組込みを生じる、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)及びLAPの少なくとも1つの相同組換えが、選択マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を形成する、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
前記工程(a)が、直線化されたプラスミドにより宿主細胞を形質転換することを更に含み、ここで直線化されたプラスミドが：
(i)1以上の最初の直線状核酸分子と相同な第一の領域；及び
(ii)1以上の最後の直線状核酸分子と相同な第二の領域：を含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、アセンブルドポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物が、1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含む、請求項77記載の方法。
【請求項８２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項77記載の方法。
【請求項８３】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化７】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPと配列が同一である、請求項77記載の方法。
【請求項８５】
請求項77記載の方法により作製されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項８６】
(a)(i)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、プライマー結合セグメントPA、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(ii)任意に、中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(iii)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、プライマー結合セグメントPB、第二の制限部位RBmを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子：であって；制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでpは1〜mの整数を表し、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、かつ各群D0,... Dn,... Dmは、1以上のDNAセグメントからなる組成物を、1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼにより消化する工程であって、
ここで1以上のIIS型エンドヌクレアーゼは、制限部位RA0からRBmを切断することが可能である工程；並びに
(b)工程(a)から生じる消化された組成物により、宿主細胞を形質転換する工程であり、ここでアニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、LB(P-1)とLAPの間の宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さのアニール可能なリンカー配列LAPと相同な領域を含み、ここで該相同組換えは、該ポリヌクレオチドのアセンブリを生じ、ここでpは1〜mの整数を表す工程；並びに
(c)アセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程であり、ここでアセンブルドポリヌクレオチドが、5'から3'の配向で、群D0,... Dn,...Dmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含む工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項８７】
(a)1以上の最初の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第一の組込み部位と相同な第一の領域を更に含み；及び
(b)1以上の最後の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第二の組込み部位と相同な第二の領域を更に含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、各々、該第一及び第二の組込み部位と宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さであり、ここで該相同組換えは、アセンブルドポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの組込みを生じる、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)及びLAPの少なくとも1つの相同組換えが、選択マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を形成する、請求項86記載の方法。
【請求項８９】
前記工程(b)が、宿主細胞を直線化されたプラスミドにより形質転換することを更に含み、ここでこの直線化されたプラスミドが：
(i)1以上の最初の直線状核酸分子と相同な第一の領域；及び
(ii)1以上の最後の直線状核酸分子と相同な第二の領域：を含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域が、アセンブルドポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項86記載の方法。
【請求項９０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項86記載の方法。
【請求項９１】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項86記載の方法。
【請求項９２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化８】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項86記載の方法。
【請求項９３】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAP、又はそれらの相補体と配列が同一である、請求項86記載の方法。
【請求項９４】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項86記載の方法。
【請求項９５】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり、かつ工程(a)の制限エンドヌクレアーゼが、SapI又はLguIである、請求項86記載の方法。
【請求項９６】
請求項86記載の方法により作製されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９７】
配列番号：1〜25からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９８】
請求項97記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９９】
(a)(i)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、 制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(ii)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(iii)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、制限部位RY、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(iv)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(v)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
から選択されたベクターを、制限部位RY及びRZを切断することが可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ここで該消化は、直線化されたベクターを作製する工程；並びに
(b)この直線化されたベクターを、直線状DNAセグメントDと、リガーゼの存在下で接触させ、ここで該接触は、DNAセグメントDを含む環状ベクターを作製し、ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である工程：
を含む、ベクターを作製する方法。
【請求項１００】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクターを、制限部位RY及びRZを切断することが可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ここで該消化は、直線化されたベクターを形成する工程；並びに
(b)この直線化されたベクターを：
(i)5'から3'の配向で、DNAセグメントD及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；
(ii)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、及びDNAセグメントを含む直線状ポリヌクレオチド；
(iii)5'から3'の配向で、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；
(iv)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；並びに
(v)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及びプライマー結合セグメントPBを含む直線状ポリヌクレオチド：から選択された直線状ポリヌクレオチドと、リガーゼの存在下で接触させる工程であり、ここで該接触が、DNAセグメントDを含む環状ベクターを作製し、ここで制限部位RA及びRBの各々が、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である工程：
を含む、ベクターを作製する方法。
【請求項１０１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０２】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化９】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０４】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０５】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０６】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０７】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０８】
前記制限部位RY及びRZが、同じ制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０９】
前記制限部位RY及びRZが、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１１０】
前記制限部位RY及びRZが、SchIにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１】
(a)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(b)中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、ここでnは、1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(c)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmは、中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子；であって、
制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(p-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体にハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつここで各群D0,...Dn,...Dmは独立して、1以上のDNAセグメントからなるもの：を含有する、組成物。
【請求項２】
前記1以上の最初の核酸分子の各々が、群D0から選択されたDNAセグメントの5'側に位置したプライマー結合セグメントPAを更に含み、かつここで該1以上の最後の核酸分子の各々が、群Dmから選択されたDNAセグメントの3'側に位置したプライマー結合セグメントPBを更に含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体に、該組成物中の他のアニール可能なリンカー配列又はそれらの相補体と比べ、選択的にハイブリダイズすることが可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項４】
前記アニール可能なリンカーLB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAP、又はそれらの相補体と配列が同一である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項５】
1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項６】
前記制限部位RA0からRBmの各々が、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項７】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項８】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項９】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１１】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び融解温度少なくとも65℃を有し、かつ配列モチーフ
【化１】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１４】
前記プライマー結合セグメントの各々が、配列番号：24〜25、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項2記載の組成物。
【請求項１５】
前記制限部位RB0からRBmの切断が可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼを更に含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項１６】
SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼを更に含有する、請求項8記載の組成物。
【請求項１７】
前記制限部位RA0からRBmの切断が可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼによる、請求項1又は2記載の組成物の消化により形成された複数の直線状核酸分子を含有する、組成物。
【請求項１８】
前記直線状核酸分子の各々が、粘着末端を含む、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
前記プライマー結合セグメントPAに相補的である第一のプライマー、又はそれらの相補体、及びプライマー結合セグメントPBに相補的である第二のプライマー、又はそれらの相補体を更に含有する、請求項2記載の組成物。
【請求項２０】
DNAポリメラーゼを更に含有する、請求項1又は2記載の組成物。
【請求項２１】
SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼによる、請求項8記載の組成物の消化により形成される複数の直線状核酸分子を含有する、組成物。
【請求項２２】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(d)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(e)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；から選択され、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、ベクター。
【請求項２３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２４】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２５】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化２】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項22記載のベクター。
【請求項２６】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２７】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される配列を有する、請求項22記載のベクター。
【請求項２８】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項22記載のベクター。
【請求項２９】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項22記載のベクター。
【請求項３０】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(d)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(e)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、DNAセグメントD、制限部位RZ、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；から選択され、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、ベクター。
【請求項３１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項30記載のベクター。
【請求項３２】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項30記載のベクター。
【請求項３３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化３】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項30記載のベクター。
【請求項３４】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項30記載のベクター。
【請求項３５】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項30記載のベクター。
【請求項３６】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３７】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３８】
前記制限部位RY及びRZが、同じ制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項３９】
前記制限部位RY及びRZが、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項30記載のベクター。
【請求項４０】
前記制限部位RY及びRZが、SchIにより切断可能である、請求項39記載のベクター。
【請求項４１】
(a)請求項30記載のベクターを1以上；
(b)制限部位RA及びRBの切断が可能なIIS型制限エンドヌクレアーゼを1以上；並びに
(c)制限部位RY及びRZの切断が可能な制限エンドヌクレアーゼを1以上：備える、ポリヌクレオチドのアセンブリのためのキット。
【請求項４２】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター：であって、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、各ベクターを少なくとも1つ含む、核酸分子のライブラリー。
【請求項４３】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(b)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(c)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む、環状ポリヌクレオチドからなるベクター：であって、
ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、各ベクターを少なくとも1つ含む、核酸分子のライブラリー。
【請求項４４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化４】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４７】
前記アニール可能なリンカー配列LA及びアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項４８】
前記プライマー結合セグメントPA及びプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項43記載のライブラリー。
【請求項４９】
前記DNAセグメントDが、選択マーカー、プロモーター、ゲノム標的化配列、エピトープタグをコードしている核酸配列、関心対象の遺伝子、終止コドンをコードしている核酸配列、及びlacZをコードしている核酸からなる群から選択される核配列(nucleic sequence)を含む、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５０】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５１】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項42又は43記載のライブラリー。
【請求項５２】
(a)最初の核酸分子が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、最初の核酸分子；
(b)中間の核酸分子nが、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnは1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、中間の核酸分子；並びに
(c)最後の核酸分子が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmは中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、最後の核酸分子；である各核酸分子の少なくとも1つを含む、核酸分子のライブラリーであって、
ここで制限部位RA0からRBmの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり；
制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつ各群D0,... Dn, ...及びDmは独立して、1以上のDNAセグメントからなる、ライブラリー。
【請求項５３】
前記最初の核酸分子が、群D0から選択されたDNAセグメントに対し5'側に位置したプライマー結合セグメントPAを更に含み、かつ前期最後の核酸分子が、群Dmから選択されたDNAセグメントに対し3'側に位置したプライマー結合セグメントPBを更に含む、請求項52記載のライブラリー。
【請求項５４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化５】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５８】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項５９】
前記プライマー結合セグメントの各々が独立して、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項53記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記最初の核酸分子2つ及び最後の核酸分子2つを含むライブラリーであって、
ここで最初の核酸分子の一方が、ゲノム標的化配列の第一セグメントを含むDNAセグメントD01を含み、かつ他方の最初の核酸分子が、ゲノム標的化配列の第二セグメントを含むDNAセグメントD02を含み、ここでDNAセグメントD01及びD02は、2つの最初の核酸分子の制限部位RA0及びRB0に対し同一配向に配向され；
ここで最後の核酸分子の一方が、選択マーカーの第一の非機能性セグメントをコードしているDNAセグメントDm1を含み、かつ他方の最後の核酸分子が、選択マーカーの第二の非機能性セグメントをコードしているDNAセグメントDm2を含み、ここでDNAセグメントDm1及びDm2は、2つの最後の核酸分子の制限部位RAm及びRBmに対し反対配向に配向され；
並びに、ここで選択マーカーの第一の非機能性セグメントと選択マーカーの第二の非機能性セグメントの間のギャップ修復による組換えは、機能性選択マーカーの作出を生じる、請求項52又は53記載のライブラリー。
【請求項６１】
(a)アセンブリ組成物を、1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼにより消化し、成分組成物を作製する工程であって、該アセンブリ組成物が：
(i)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、群PAから選択された任意のプライマー結合セグメント、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(ii)中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(iii)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択されたDNAセグメント、群PBから選択された任意のプライマー結合セグメント、第二の制限部位RBmを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子：を含み；制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、ここでpは1〜mの整数を表し、かつここで各群D0,... Dn,... 及びDnは、1以上のDNAセグメントからなる工程；並びに
(b)前記成分組成物を、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸及び1以上の第一のプライマー及び1以上の第二のプライマーと、核酸分子の変性に適した条件下で接触させ、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)をアニール可能なリンカー配列LAPにアニールし、かつそれらを伸長させ；ここで該第一のプライマーの各々は、群PAから選択された該プライマー結合セグメントの1つとハイブリダイズすることが可能であり、かつ該第二のプライマーの各々は、群PBから選択された該プライマー結合セグメントの1つとハイブリダイズすることが可能であり；並びに、この成分組成物を、ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程であり、
ここで5'から3'の配向で、群D0,... Dn,...及びDmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含むポリヌクレオチドがアセンブルされる工程：
を含む、複数の成分ポリヌクレオチドからアセンブルドポリヌクレオチドを作製する方法。
【請求項６２】
前記1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼが、制限部位RA0からRBmの切断が可能である、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
前記アセンブリ組成物が、1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含む、請求項61記載の方法。
【請求項６４】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化６】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPと配列が同一である、請求項61記載の方法。
【請求項６８】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項61記載の方法。
【請求項６９】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり、かつ工程(a)の制限エンドヌクレアーゼが、SapI又はLguIである、請求項61記載の方法。
【請求項７０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７２】
前記プライマー結合セグメントの各々が、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項７３】
前記DNAポリメラーゼが、Pfuである、請求項61記載の方法。
【請求項７４】
(a)宿主細胞を、請求項61に従いアセンブルされた1以上のポリヌクレオチドにより形質転換する工程；及び
(b)この1以上のアセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項７５】
前記アセンブルドポリヌクレオチドが、選択マーカーを含み、かつ工程(b)が、選択培地上で形質転換された宿主細胞を増殖することを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
(i)プライマー結合セグメントPAと相同な第一の領域；及び
(ii)プライマー結合セグメントPBと相同な第二の領域：を含む直線化されたプラスミドにより、宿主細胞を形質転換する工程を更に含み：
ここで該相同な第一及び第二の領域は、該ポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
(a)(i)分子の各々が、5'から3'の配向で、群D0から選択された任意のDNAセグメント、及びアニール可能なリンカー配列LB0を含む、1以上の最初の直線状核酸分子；
(ii)任意に、中間の直線状核酸分子の各々が、5'から3'の配向で、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、及び第二のアニール可能なリンカー配列LBnを含み、ここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の直線状核酸分子；並びに
(iii)最後の直線状核酸分子の各々が、5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LAm、及び群Dmから選択された任意のDNAセグメントを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の直線状核酸分子：
を含有する組成物により、宿主細胞を形質転換する工程であり；
ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、
ここで各群D0,... Dn,...Dmは、1以上のDNAセグメントからなり、
ここでアニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、LB(P-1)とLAPの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さのアニール可能なリンカー配列LAPと相同な領域を含み、ここでpは1〜mの整数を表し、ここで該相同組換えは、ポリヌクレオチドのアセンブリを生じる、工程；並びに
(b)アセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程であり、ここでアセンブルドポリヌクレオチドが、5'から3'の配向で、群D0,...Dn,...Dmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含む工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項７８】
(a)1以上の最初の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第一の組込み部位と相同な第一の領域を更に含み；及び
(b)1以上の最後の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第二の組込み部位と相同な第二の領域を更に含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、各々、該第一及び第二の組込み部位と宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さであり、ここで該相同組換えは、アセンブルドポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの組込みを生じる、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)及びLAPの少なくとも1つの相同組換えが、選択マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を形成する、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
前記工程(a)が、直線化されたプラスミドにより宿主細胞を形質転換することを更に含み、ここで直線化されたプラスミドが：
(i)1以上の最初の直線状核酸分子と相同な第一の領域；及び
(ii)1以上の最後の直線状核酸分子と相同な第二の領域：を含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、アセンブルドポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物が、1つの最初の核酸分子及び1つの最後の核酸分子を含む、請求項77記載の方法。
【請求項８２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項77記載の方法。
【請求項８３】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列が、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化７】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAPと配列が同一である、請求項77記載の方法。
【請求項８５】
請求項77記載の方法により作製されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項８６】
(a)(i)最初の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RA0、プライマー結合セグメントPA、群D0から選択された任意のDNAセグメント、アニール可能なリンカー配列LB0、及び第二の制限部位RB0を含む、1以上の最初の核酸分子；
(ii)任意に、中間の核酸分子nの各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAn、第一のアニール可能なリンカー配列LAn、群Dnから選択された任意のDNAセグメント、第二のアニール可能なリンカー配列LBn、及び第二の制限部位RBnを含み、かつここでnが1から中間の核酸分子の数までの整数を表す、1以上の中間の核酸分子；並びに
(iii)最後の核酸分子の各々が、環状であり、かつ5'から3'の配向で、第一の制限部位RAm、アニール可能なリンカー配列LAm、群Dmから選択された任意のDNAセグメント、プライマー結合セグメントPB、第二の制限部位RBmを含み、ここでmが中間の核酸分子の数よりも1大きい整数を表す、1以上の最後の核酸分子：であって；制限部位RA0からRBmの切断及び生じる直線状核酸分子の変性時に、アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、アニール可能なリンカー配列LAPの相補体とハイブリダイズすることが可能であり、ここでpは1〜mの整数を表し、ここでnは1〜(m-1)で変動する整数であり、かつ各群D0,... Dn,... Dmは、1以上のDNAセグメントからなる組成物を、1以上のIIS型制限エンドヌクレアーゼにより消化する工程であって、
ここで1以上のIIS型エンドヌクレアーゼは、制限部位RA0からRBmを切断することが可能である工程；並びに
(b)工程(a)から生じる消化された組成物により、宿主細胞を形質転換する工程であり、ここでアニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々は、LB(P-1)とLAPの間の宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さのアニール可能なリンカー配列LAPと相同な領域を含み、ここで該相同組換えは、該ポリヌクレオチドのアセンブリを生じ、ここでpは1〜mの整数を表す工程；並びに
(c)アセンブルドポリヌクレオチドを含む宿主細胞を選択する工程であり、ここでアセンブルドポリヌクレオチドが、5'から3'の配向で、群D0,... Dn,...Dmの各々から選択された1つのDNAセグメントを含む工程：
を含む、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を作製する方法。
【請求項８７】
(a)1以上の最初の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第一の組込み部位と相同な第一の領域を更に含み；及び
(b)1以上の最後の直線状核酸分子の各々が、宿主細胞ゲノムの第二の組込み部位と相同な第二の領域を更に含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域は、各々、該第一及び第二の組込み部位と宿主細胞介在性相同組換えを開始するのに十分な長さであり、ここで該相同組換えは、アセンブルドポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの組込みを生じる、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)及びLAPの少なくとも1つの相同組換えが、選択マーカー遺伝子をコードしている核酸配列を形成する、請求項86記載の方法。
【請求項８９】
前記工程(b)が、宿主細胞を直線化されたプラスミドにより形質転換することを更に含み、ここでこの直線化されたプラスミドが：
(i)1以上の最初の直線状核酸分子と相同な第一の領域；及び
(ii)1以上の最後の直線状核酸分子と相同な第二の領域：を含み、
ここで該相同な第一及び第二の領域が、アセンブルドポリヌクレオチドと該プラスミドの間で宿主細胞介在性相同組換えを開始し、宿主細胞において環状化されたプラスミドを形成するのに十分な長さである、請求項86記載の方法。
【請求項９０】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項86記載の方法。
【請求項９１】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項86記載の方法。
【請求項９２】
前記2以上のアニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化８】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項86記載の方法。
【請求項９３】
前記アニール可能なリンカー配列LB(P-1)の各々が、アニール可能なリンカー配列LAP、又はそれらの相補体と配列が同一である、請求項86記載の方法。
【請求項９４】
前記制限部位RA0からRBmが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項86記載の方法。
【請求項９５】
前記制限部位RA0からRBmが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能であり、かつ工程(a)の制限エンドヌクレアーゼが、SapI又はLguIである、請求項86記載の方法。
【請求項９６】
請求項86記載の方法により作製されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９７】
配列番号：1〜25からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９８】
請求項97記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９９】
(a)(i)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、 制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(ii)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(iii)5'から3'の配向で、制限部位RA、プライマー結合セグメントPA、制限部位RY、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
(iv)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、アニール可能なリンカー配列LB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；並びに
(v)5'から3'の配向で、制限部位RA、アニール可能なリンカー配列LA、制限部位RY、制限部位RZ、プライマー結合セグメントPB、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクター；
から選択されたベクターを、制限部位RY及びRZを切断することが可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ここで該消化は、直線化されたベクターを作製する工程；並びに
(b)この直線化されたベクターを、直線状DNAセグメントDと、リガーゼの存在下で接触させ、ここで該接触は、DNAセグメントDを含む環状ベクターを作製し、ここで制限部位RA及びRBの各々は、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である工程：
を含む、ベクターを作製する方法。
【請求項１００】
(a)5'から3'の配向で、制限部位RA、制限部位RY、制限部位RZ、及び制限部位RBを含む環状ポリヌクレオチドからなるベクターを、制限部位RY及びRZを切断することが可能である1以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ここで該消化は、直線化されたベクターを形成する工程；並びに
(b)この直線化されたベクターを：
(i)5'から3'の配向で、DNAセグメントD及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；
(ii)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、及びDNAセグメントを含む直線状ポリヌクレオチド；
(iii)5'から3'の配向で、プライマー結合セグメントPA、DNAセグメントD、及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；
(iv)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及びアニール可能なリンカー配列LBを含む直線状ポリヌクレオチド；並びに
(v)5'から3'の配向で、アニール可能なリンカー配列LA、DNAセグメントD、及びプライマー結合セグメントPBを含む直線状ポリヌクレオチド：から選択された直線状ポリヌクレオチドと、リガーゼの存在下で接触させる工程であり、ここで該接触が、DNAセグメントDを含む環状ベクターを作製し、ここで制限部位RA及びRBの各々が、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である工程：
を含む、ベクターを作製する方法。
【請求項１０１】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、長さが少なくとも24ヌクレオチドであり、かつ少なくとも60℃の融解温度を有する、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０２】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも70％のG-C含量及び少なくとも70℃の融解温度を有する、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０３】
前記アニール可能なリンカー配列の各々が独立して、少なくとも30％のA-T含量及び少なくとも65℃の融解温度を有し、かつ配列モチーフ
【化９】
を含み、ここでAはアデニン、Nは任意のヌクレオチド、及びTはチミンを表す、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０４】
前記アニール可能なリンカー配列LA及び/又はアニール可能なリンカー配列LBが、配列番号：1〜23、及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０５】
前記プライマー結合セグメントPA及び/又はプライマー結合セグメントPBが、配列番号：24及び25、並びにそれらの相補体からなる群から選択される、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０６】
前記制限部位RA及びRBが、同じIIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０７】
前記制限部位RA及びRBが、SapI又はLguI制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０８】
前記制限部位RY及びRZが、同じ制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１０９】
前記制限部位RY及びRZが、IIS型制限エンドヌクレアーゼにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【請求項１１０】
前記制限部位RY及びRZが、SchIにより切断可能である、請求項99又は100記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５０９０８４（Ｐ２０１２−５０９０８４Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７５９６（Ｐ２０１１−５３７５９６）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７６３
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０８３４７６４９）アムイリス， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７６３
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０８３４７６４９）アムイリス， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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