ポリヌクレオチド合成法
反応物質が低濃度で存在する場合の二分子相互作用の速度式を向上させる方法が提供される。高濃度のユニバーサルプライマーを用いて1種または複数種のオリゴヌクレオチドを予め増幅する方法が提供される。オリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド合成中のエラー率を改善する方法が同様に提供される。配列最適化およびオリゴヌクレオチド設計の方法がさらに提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、所定の配列を有するポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 以下の段階を含む、構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階
i) 該ポリヌクレオチド構築体の配列を規定（define）する部分的に重複する配列、
ii) 該構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位、ならびに
iii) プライマーハイブリダイゼーション部位と構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位;
b) プライマーハイブリダイゼーション部位に結合する少なくとも1つのプライマーを用いて、該構築用オリゴヌクレオチドのプールを増幅させる段階;
c) 該プライマーハイブリダイゼーション部位を該切断部位で該構築用オリゴヌクレオチドから除去する段階;
d) 該構築用オリゴヌクレオチドの相補鎖を分離する段階; ならびに
e) 該構築用オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露し、ポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項２】
構築用オリゴヌクレオチドが固体支持体上で合成される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
構築用オリゴヌクレオチドが増幅の前に支持体から切断される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
合成が光誘導による反応を支持体上の別々の位置で利用する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
マスクを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
光案内マスクレスオプティクス(light directing maskless optics)を用いて光が別々の位置に向けられる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
PCRを用いて構築用オリゴヌクレオチドのプールが増幅される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
構築用オリゴヌクレオチドをアッセンブリの前にエラー低減過程に供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
構築用オリゴヌクレオチドをアッセンブリの前に少なくとも2ラウンドの増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
エラー低減過程がハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールに曝露する段階および選択用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる際にミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階によるエラーろ過である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド構築体をさらなるアッセンブリに供して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド構築体をエラー低減過程に供する段階をさらに含む、請求項1または11記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド構築体を増幅に供する段階をさらに含む、請求項1または12記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1キロベースである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約10キロベースである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約100キロベースである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1メガベースである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1ギガベースである、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチド構築体をベクターに挿入する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチド構築体を宿主細胞に導入する段階をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも1種のポリペプチド配列をコードする、請求項1または20記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド構築体から少なくとも1種のポリペプチドを発現させる段階をさらに含む、請求項1または20記載の方法。
【請求項２３】
構築用オリゴヌクレオチドの全てが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
構築用オリゴヌクレオチドが光切断可能なリンカーによって固体支持体に結合される、請求項2記載の方法。
【請求項２５】
制限エンドヌクレアーゼを用いてプライマーハイブリダイゼーション部位が構築用オリゴヌクレオチドから除去される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
制限エンドヌクレアーゼがIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを調製する方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階;
b) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階; ならびに
c) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去し、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階。
【請求項２８】
以下の段階を含む、所定の配列を有するポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
d) 該ポリヌクレオチド構築体の配列を規定する部分的に重複する配列を含んだ構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階;
e) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階; および
f) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階;
g) 残存する複合体を変性させ、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階; ならびに
h) 精製済みの構築用オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド構築体を形成させる段階の前に構築用オリゴヌクレオチドを増幅させる段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと少なくとも二度接触させる段階および不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階をさらに含む、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化される、請求項27または28記載の方法。
【請求項３２】
選択用オリゴヌクレオチドがカラム中に含まれる、請求項27または28記載の方法。
【請求項３３】
構築用オリゴヌクレオチドのプールへの曝露の前に選択用オリゴヌクレオチドを増幅させる段階をさらに含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項３４】
選択用オリゴヌクレオチドが、該選択用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項27、28または33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
選択用オリゴヌクレオチドの全てが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
構築用オリゴヌクレオチドが、該構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも大量の構築用オリゴヌクレオチドが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上で合成される、請求項27または28記載の方法。
【請求項３９】
構築用オリゴヌクレオチドが増幅の前に支持体から切断される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
合成が光誘導による反応を支持体上の別々の位置で利用する、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
マスクを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
光案内マスクレスオプティクスを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
選択用オリゴヌクレオチドが光切断可能なリンカーによって固体支持体に結合される、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが500塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項27、28、または30のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが1,000塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが10,000塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
構築用オリゴヌクレオチドのプールが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項27記載の方法。
【請求項４８】
以下の段階を含む、単一のプール中で異なる所定の配列を有する複数のポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 該複数のポリヌクレオチド構築体の各々の配列を規定する部分的に重複する配列を含む構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階; および
b) 該構築用オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件ならびに以下の条件: (i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件のうちの少なくとも1つの下でインキュベートし、それにより単一のプール中で該複数のポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項４９】
構築用オリゴヌクレオチドのプールが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも4種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも10種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも約100種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
複数のポリヌクレオチド構築体をさらなるアッセンブリに供して、それにより少なくとも1種のさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５４】
さらなるアッセンブリが以下の段階を含む、請求項53記載の方法:
a) ポリヌクレオチド構築体を融解させる段階; および
b) ポリヌクレオチド構築体をハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５５】
さらなるアッセンブリが以下の段階を含む、請求項51記載の方法:
a) ポリヌクレオチド構築体を制限酵素と接触させる段階; および
b) ポリヌクレオチド構築体をハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５６】
構築用オリゴヌクレオチドを少なくとも1ラウンドの(i) 増幅、(ii) エラー低減、または(iii) いずれかの順序の増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５７】
ポリヌクレオチド構築体を少なくとも1ラウンドの(i) 増幅、(ii) エラー低減、または(iii) いずれかの順序の増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む、異なる所定の配列を有する複数のポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 各ポリヌクレオチド構築体の配列を部分的に重複する配列セグメントにコンピュータにより分割する段階;
b) 部分的に重複する配列セグメントのセットに応答する配列を含む構築用オリゴヌクレオチドを合成する段階; および
c) 該構築用オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件ならびに以下の条件: (i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件のうちの少なくとも1つの下でインキュベートし、それにより複数のポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５９】
構築用オリゴヌクレオチドが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
以下の段階をさらに含む、請求項58記載の方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分の末端に、該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通するおよびプライマーハイブリダイゼーション部位と構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位を規定する1組または複数組のプライマーハイブリダイゼーション部位をコンピュータにより付加する段階;
b) 該プライマーハイブリダイゼーション部位に結合する少なくとも1つのプライマーを用いて該構築用オリゴヌクレオチドを増幅する段階; および
c) 該プライマーハイブリダイゼーション部位を該切断部位で該構築用オリゴヌクレオチドから除去する段階。
【請求項６１】
ポリヌクレオチド構築体の少なくとも一部分の末端を規定する構築用オリゴヌクレオチドに、該ポリヌクレオチド構築体の少なくともサブセットに共通する1組または複数組のプライマーハイブリダイゼーション部位をコンピュータにより付加する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
プライマーハイブリダイゼーション部位と末端を規定する構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位を規定する配列をコンピュータにより設計する段階をさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ポリヌクレオチド構築体を増幅する段階をさらに含む、請求項61または62記載の方法。
【請求項６４】
プライマーハイブリダイゼーション部位をポリヌクレオチド構築体から除去する段階をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ポリヌクレオチド構築体をさらに長いポリヌクレオチド構築体にアッセンブルする段階をさらに含む、請求項58、63、または64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
構築用オリゴヌクレオチドを少なくとも1ラウンドのエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６７】
エラー低減過程が以下の段階を含む、請求項66記載の方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である配列を含む選択用オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのプールをコンピュータにより設計する段階;
b) 該選択用オリゴヌクレオチドを合成する段階;
c) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階;
d) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階; および
e) 残存する二重鎖を変性させ、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階。
【請求項６８】
二重鎖の融解温度を最適化するため、構築用オリゴヌクレオチド、選択用オリゴヌクレオチド、またはその両方の長さ、コドン使用頻度、または長さおよびコドン使用頻度をコンピュータにより最適化する段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化される、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
選択用オリゴヌクレオチドのプール中の1種または複数種の選択用オリゴヌクレオチドの配列が構築用オリゴヌクレオチドのプール中の構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分の配列全体に相補的である、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
構築用オリゴヌクレオチド、選択用オリゴヌクレオチド、またはその両方が固体支持体上で合成される、請求項58または67記載の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチド構築体のコピーの配列を決定する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項７３】
ポリヌクレオチド構築体を細胞に導入する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項７４】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも1種のポリペプチドをコードする、請求項58記載の方法。
【請求項７５】
ポリヌクレオチド構築体が特定の宿主細胞で発現させるためにコドン最適化された、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
以下の段階を含む、単一のプール中で複数の異なるポリヌクレオチド配列をアッセンブルする方法:
a) 相補的な末端領域と該異なるポリヌクレオチド配列の末端を含んだオリゴヌクレオチドに隣接するプライマー部位とを有する合成オリゴヌクレオチドの群を提供する段階;
b) 該合成オリゴヌクレオチドをdNTPsおよびポリメラーゼとともに混合する段階;
c) 以下をもたらすよう混合物をサイクリングにかける段階:
該相補的な末端領域のハイブリダイゼーション;
重複するオリゴヌクレオチドを伸長させるおよび完全長の異なるポリヌクレオチド配列のコピーを産生させるポリメラーゼを介した塩基の取込み; および
複数の該完全長配列の増幅。
【請求項７７】
産生されたポリヌクレオチド配列をさらにアッセンブルしてより大きなポリヌクレオチドを産生させる段階を含む請求項76記載の方法であって、以下のさらなる段階を含む方法:
d) 複数の別個のプール中で請求項76記載の方法を行い、異なる合成ポリヌクレオチド配列の少なくともいくつかをそれにより、相補的な末端領域と該より大きなポリヌクレオチドの末端を含んだ異なるポリヌクレオチド配列に隣接するプライマー部位とを有するポリヌクレオチドを含む各プール中で産生させる段階;
e) 該複数のプールの少なくともいくつかをdNTPsおよびポリメラーゼとともに混合する段階; ならびに
f) 以下をもたらすよう混合物をサイクリングにかける段階:
該異なるポリヌクレオチド配列の該相補的な末端領域のハイブリダイゼーション;
重複するオリゴヌクレオチド配列を伸長させるおよび完全長のより大きなポリヌクレオチドのコピーを産生させるポリメラーゼを介した塩基の取込み; および
複数の該完全長のより大きなポリヌクレオチドの増幅。
【請求項７８】
合成オリゴヌクレオチドが複数の塩基配列の連続自動並行アッセンブリにより並行して合成され、精製されて、配列エラーを包含するオリゴヌクレオチドコピーの濃度を減らす、請求項76記載の方法。
【請求項７９】
精製がハイブリダイゼーションにより行われる、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
合成オリゴヌクレオチドが表面上で合成される、請求項76記載の方法。
【請求項８１】
相補的な末端領域の複数のペアがほぼ同じ融解温度を有するように設計される、請求項76または77記載の方法。
【請求項８２】
プールがウェルまたはマイクロチャネルである、請求項76記載の方法。
【請求項８３】
混合する段階e)が微小流体システムの中に混合物の成分をともに流すことで行われる、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項76記載の方法。
【請求項８５】
多数の異なる回収可能なポリヌクレオチドを含む製造物品であって、以下を含む物品:
容器由来の異なるポリヌクレオチドの部分集団の増幅を可能にするプライマー配列の異なるペアを含んだ異なるポリヌクレオチド混合物を含むポリヌクレオチド用容器; および
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器。
【請求項８６】
ポリヌクレオチド用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列ペアが互いに異なる、請求項85記載の物品。
【請求項８７】
ポリヌクレオチドが合成DNAを含む、請求項85記載の物品。
【請求項８８】
ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、請求項85記載の物品。
【請求項８９】
ポリヌクレオチドが野生型配列の複数の変異体を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９０】
ポリヌクレオチドがベクターを含む、請求項85記載の物品。
【請求項９１】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも1 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９２】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも2 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９３】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも10 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９４】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が環状化される、請求項85記載の物品。
【請求項９５】
ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド配列の操作を容易にするアダプター配列に隣接しているポリヌクレオチド配列を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９６】
アダプター配列がベクターへの挿入、固定化、および配列の機能の同定の1つまたは複数を容易にする、請求項95記載の物品。
【請求項９７】
ポリヌクレオチドの混合物が哺乳類の配列、酵母の配列、原核生物の配列、植物の配列、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)の配列、線虫(C. elegans)の配列、およびアフリカツメガエル(Xenopus)の配列からなる群より選択される1つまたは複数の配列を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９８】
異なる回収可能なポリヌクレオチド構築体の混合物が独立して回収可能である、請求項85記載の物品。
【請求項９９】
複数の異なるポリヌクレオチドを含有する複数のポリヌクレオチド用容器、プライマー配列の同一のペアを含んだ異なる容器中のポリヌクレオチドを含む、請求項85記載の物品。
【請求項１００】
複数のプライマー用容器の1つまたは複数が相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０１】
ポリヌクレオチド用容器がD個の異なる独立して回収可能なポリヌクレオチドであって、それぞれがN個のネスティッドプライマーペアを含むポリヌクレオチド、少なくともN/2×D1/Nであるプライマー用容器の数を含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０２】
ポリヌクレオチド用容器がD個の異なるポリヌクレオチドおよびプライマーのペアを含有するD個のプライマー用容器を含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０３】
ポリヌクレオチド用容器が、プライマー配列の複数のネスティッドペアを含む異なるポリヌクレオチドであって、該複数のネスティッドペアのそれぞれが該容器中の選択のポリヌクレオチド群のまたはその容器中の該異なるポリヌクレオチドの個々のものの増幅を可能にするポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０４】
102個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０５】
103個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０６】
104個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０７】
105個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項99記載の物品。
【請求項１０８】
106個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項99記載の物品。
【請求項１０９】
多数の異なる回収可能なポリヌクレオチドを含有する包装を含む製造物品であって、以下を含む物品:
異なるポリヌクレオチドの少なくともいくつかがプライマー配列の複数のネスティッドペアを含み、該複数のネスティッドペアのそれぞれが容器中の選択のポリヌクレオチド群のまたはその容器中の該異なるポリヌクレオチドの個々のものの増幅を可能にする異なるポリヌクレオチドの混合物を含んだポリヌクレオチド用容器; および
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器。
【請求項１１０】
容器中の各ポリヌクレオチド上のネスティッドペアの組合せが、該容器中のその他全てのポリヌクレオチドのネスティッドペアの組合せと異なる、請求項109記載の物品。
【請求項１１１】
それぞれが複数の異なるポリヌクレオチドを含む複数の構築用容器、所与のプライマーペアが異なる容器中の異なるポリヌクレオチドとアニーリングするようにプライマー配列の同一のペアを含んだ異なる容器中のポリヌクレオチドを含む、請求項85または109記載の物品。
【請求項１１２】
ポリヌクレオチド構築体の選択の1つまたは選択の群に富む溶液を供給する装置であって、以下を含む装置:
容器由来の異なるポリヌクレオチドのうち選択のものの増幅を可能にするおよび該容器中のその他のポリヌクレオチドのプライマー配列のその他のペアとは異なる、プライマー配列の少なくとも1ペアを含む同定済みのポリヌクレオチドの混合物を含んだポリヌクレオチド用容器;
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中の異なるポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器;
同定済みのポリヌクレオチドと各同定済みのポリヌクレオチドに相補的なプライマーのペアまたは複数ペアを含む1つまたは複数の容器の位置とを収載するデータ保存庫;
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの群を利用者が指定するのを可能にするインターフェース;
該インターフェースで入力された仕様に応答する自動的手段、および該指定されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの群を選択的に増幅するのに必要とされる試薬を調製するよう該構築用容器からポリヌクレオチドおよび選択のプライマー用容器からプライマーの一定分量を抽出するために該データ保存庫からアクセスされる命令。
【請求項１１３】
異なる同定済みのポリヌクレオチドを含んだ複数のポリヌクレオチド用容器を含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１４】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の同一ペアを含む、請求項113記載の装置。
【請求項１１５】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の複数のネスティッドペアを含む、請求項113記載の装置。
【請求項１１６】
少なくとも10個のポリヌクレオチド用容器を含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１７】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の固有のネスティッドペアを含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１８】
構築用容器から回収される選択の同定済みポリヌクレオチドを選択のプライマーペアによる指定のとおりに増幅するよう適合された増幅用チャンバをさらに含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１９】
増幅用チャンバから回収される同定済みのポリヌクレオチドの1つまたは部分集団を選択のプライマーペアによる指定のとおりに増幅するよう適合された第2の増幅用チャンバをさらに含む、請求項118記載の装置。
【請求項１２０】
以下の段階を含む、選択のポリヌクレオチドを得る方法:
容器由来のポリヌクレオチドのうち選択のものの増幅を可能にするプライマー配列の複数のネスティッドペアを含み、該容器中のあるポリヌクレオチドのプライマーペアの組合せが該容器中のその他のポリヌクレオチドのプライマー配列のその他のペアとは異なる同定済みの合成ポリヌクレオチドの混合物を含有する複数の構築用容器を提供する段階;
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含む容器を提供する段階;
第1の増幅手順を、選択の該構築用容器から回収されるポリヌクレオチドの該混合物と1つまたは複数のプライマー用容器から回収される、プライマー配列の外側ネスティッドペアに相補的なプライマーのペアの一定分量を含む第1の増幅混合物で行う段階; および
第2の増幅手順を、該第1の増幅混合物から回収される単位複製配列と1つまたは複数のプライマー用容器から回収される、プライマー配列の内側ネスティッドペアに相補的なプライマーのペアの一定分量を含む第2の増幅混合物で行う段階。
【請求項１２１】
多数のポリヌクレオチド種であって、少なくともいくつかがライブラリーから回収される種のうちの選択群の増幅を可能とするのに十分な長さのプライマー配列の外側ペアを有する種、および該外側ペアを用いた増幅によって産生された単位複製配列の混合物から回収される種のうちの1つまたは選択群の増幅を可能とするのに十分な長さを有するプライマー配列の内側ペアを含む、ライブラリーを形成する混合物中の多数の合成ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
ライブラリー中の個々の種の濃度が、該ライブラリーから直接的にその選択的増幅を可能とするには十分ではないが、外側のプライマー配列ペアを用いた増幅後にその選択的増幅を可能とするには十分である、請求項121記載のライブラリー。
【請求項１２３】
合成ポリヌクレオチドがプライマー配列の3組のネスティッドペアを含む、請求項121記載のライブラリー。
【請求項１２４】
合成ポリヌクレオチドが各々、ライブラリー中のプライマー配列のその他全てのネスティッドペアとは異なる核酸配列を有するプライマー配列のネスティッドペアを含む、請求項121記載のライブラリー。
【請求項１】
以下の段階を含む、所定の配列を有するポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 以下の段階を含む、構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階
i) 該ポリヌクレオチド構築体の配列を規定（define）する部分的に重複する配列、
ii) 該構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位、ならびに
iii) プライマーハイブリダイゼーション部位と構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位;
b) プライマーハイブリダイゼーション部位に結合する少なくとも1つのプライマーを用いて、該構築用オリゴヌクレオチドのプールを増幅させる段階;
c) 該プライマーハイブリダイゼーション部位を該切断部位で該構築用オリゴヌクレオチドから除去する段階;
d) 該構築用オリゴヌクレオチドの相補鎖を分離する段階; ならびに
e) 該構築用オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露し、ポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項２】
構築用オリゴヌクレオチドが固体支持体上で合成される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
構築用オリゴヌクレオチドが増幅の前に支持体から切断される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
合成が光誘導による反応を支持体上の別々の位置で利用する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
マスクを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
光案内マスクレスオプティクス(light directing maskless optics)を用いて光が別々の位置に向けられる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
PCRを用いて構築用オリゴヌクレオチドのプールが増幅される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
構築用オリゴヌクレオチドをアッセンブリの前にエラー低減過程に供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
構築用オリゴヌクレオチドをアッセンブリの前に少なくとも2ラウンドの増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
エラー低減過程がハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールに曝露する段階および選択用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる際にミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階によるエラーろ過である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド構築体をさらなるアッセンブリに供して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド構築体をエラー低減過程に供する段階をさらに含む、請求項1または11記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド構築体を増幅に供する段階をさらに含む、請求項1または12記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1キロベースである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約10キロベースである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約100キロベースである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1メガベースである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも約1ギガベースである、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチド構築体をベクターに挿入する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチド構築体を宿主細胞に導入する段階をさらに含む、請求項1または19記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも1種のポリペプチド配列をコードする、請求項1または20記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド構築体から少なくとも1種のポリペプチドを発現させる段階をさらに含む、請求項1または20記載の方法。
【請求項２３】
構築用オリゴヌクレオチドの全てが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
構築用オリゴヌクレオチドが光切断可能なリンカーによって固体支持体に結合される、請求項2記載の方法。
【請求項２５】
制限エンドヌクレアーゼを用いてプライマーハイブリダイゼーション部位が構築用オリゴヌクレオチドから除去される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
制限エンドヌクレアーゼがIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを調製する方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階;
b) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階; ならびに
c) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去し、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階。
【請求項２８】
以下の段階を含む、所定の配列を有するポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
d) 該ポリヌクレオチド構築体の配列を規定する部分的に重複する配列を含んだ構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階;
e) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階; および
f) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階;
g) 残存する複合体を変性させ、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階; ならびに
h) 精製済みの構築用オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド構築体を形成させる段階の前に構築用オリゴヌクレオチドを増幅させる段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと少なくとも二度接触させる段階および不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階をさらに含む、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化される、請求項27または28記載の方法。
【請求項３２】
選択用オリゴヌクレオチドがカラム中に含まれる、請求項27または28記載の方法。
【請求項３３】
構築用オリゴヌクレオチドのプールへの曝露の前に選択用オリゴヌクレオチドを増幅させる段階をさらに含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項３４】
選択用オリゴヌクレオチドが、該選択用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項27、28または33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
選択用オリゴヌクレオチドの全てが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
構築用オリゴヌクレオチドが、該構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分で隣接するおよび該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも大量の構築用オリゴヌクレオチドが共通する少なくとも1組のプライマーハイブリダイゼーション部位を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上で合成される、請求項27または28記載の方法。
【請求項３９】
構築用オリゴヌクレオチドが増幅の前に支持体から切断される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
合成が光誘導による反応を支持体上の別々の位置で利用する、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
マスクを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
光案内マスクレスオプティクスを用いて光が別々の位置に向けられる、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
選択用オリゴヌクレオチドが光切断可能なリンカーによって固体支持体に結合される、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが500塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項27、28、または30のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが1,000塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
精製済みの構築用オリゴヌクレオチドが10,000塩基中約1エラー未満の塩基エラー率を有する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
構築用オリゴヌクレオチドのプールが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項27記載の方法。
【請求項４８】
以下の段階を含む、単一のプール中で異なる所定の配列を有する複数のポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 該複数のポリヌクレオチド構築体の各々の配列を規定する部分的に重複する配列を含む構築用オリゴヌクレオチドのプールを提供する段階; および
b) 該構築用オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件ならびに以下の条件: (i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件のうちの少なくとも1つの下でインキュベートし、それにより単一のプール中で該複数のポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項４９】
構築用オリゴヌクレオチドのプールが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも4種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも10種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも約100種のポリヌクレオチド構築体が単一のプール中で調製される、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
複数のポリヌクレオチド構築体をさらなるアッセンブリに供して、それにより少なくとも1種のさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５４】
さらなるアッセンブリが以下の段階を含む、請求項53記載の方法:
a) ポリヌクレオチド構築体を融解させる段階; および
b) ポリヌクレオチド構築体をハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５５】
さらなるアッセンブリが以下の段階を含む、請求項51記載の方法:
a) ポリヌクレオチド構築体を制限酵素と接触させる段階; および
b) ポリヌクレオチド構築体をハイブリダイゼーション条件ならびに(i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件に曝露して、それによりさらに長いポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５６】
構築用オリゴヌクレオチドを少なくとも1ラウンドの(i) 増幅、(ii) エラー低減、または(iii) いずれかの順序の増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５７】
ポリヌクレオチド構築体を少なくとも1ラウンドの(i) 増幅、(ii) エラー低減、または(iii) いずれかの順序の増幅およびエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む、異なる所定の配列を有する複数のポリヌクレオチド構築体を調製する方法:
a) 各ポリヌクレオチド構築体の配列を部分的に重複する配列セグメントにコンピュータにより分割する段階;
b) 部分的に重複する配列セグメントのセットに応答する配列を含む構築用オリゴヌクレオチドを合成する段階; および
c) 該構築用オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件ならびに以下の条件: (i) ライゲーション条件、(ii) 鎖伸長条件、または(iii) 鎖伸長およびライゲーション条件のうちの少なくとも1つの下でインキュベートし、それにより複数のポリヌクレオチド構築体を形成させる段階。
【請求項５９】
構築用オリゴヌクレオチドが重複領域において相補的なプラス鎖およびマイナス鎖を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
以下の段階をさらに含む、請求項58記載の方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分の末端に、該構築用オリゴヌクレオチドの少なくともサブセットに共通するおよびプライマーハイブリダイゼーション部位と構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位を規定する1組または複数組のプライマーハイブリダイゼーション部位をコンピュータにより付加する段階;
b) 該プライマーハイブリダイゼーション部位に結合する少なくとも1つのプライマーを用いて該構築用オリゴヌクレオチドを増幅する段階; および
c) 該プライマーハイブリダイゼーション部位を該切断部位で該構築用オリゴヌクレオチドから除去する段階。
【請求項６１】
ポリヌクレオチド構築体の少なくとも一部分の末端を規定する構築用オリゴヌクレオチドに、該ポリヌクレオチド構築体の少なくともサブセットに共通する1組または複数組のプライマーハイブリダイゼーション部位をコンピュータにより付加する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
プライマーハイブリダイゼーション部位と末端を規定する構築用オリゴヌクレオチドとの間の切断部位を規定する配列をコンピュータにより設計する段階をさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
ポリヌクレオチド構築体を増幅する段階をさらに含む、請求項61または62記載の方法。
【請求項６４】
プライマーハイブリダイゼーション部位をポリヌクレオチド構築体から除去する段階をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ポリヌクレオチド構築体をさらに長いポリヌクレオチド構築体にアッセンブルする段階をさらに含む、請求項58、63、または64のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
構築用オリゴヌクレオチドを少なくとも1ラウンドのエラー低減に供する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６７】
エラー低減過程が以下の段階を含む、請求項66記載の方法:
a) 構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的である配列を含む選択用オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのプールをコンピュータにより設計する段階;
b) 該選択用オリゴヌクレオチドを合成する段階;
c) ハイブリダイゼーション条件の下で構築用オリゴヌクレオチドのプールを選択用オリゴヌクレオチドのプールと接触させ、それにより、少なくとも、二重鎖の一部分が相補的な領域中にミスマッチを含まない構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ安定な二重鎖でありおよび二重鎖の一部分が相補的な領域中に1つまたは複数のミスマッチを含む構築用オリゴヌクレオチドのコピーと選択用オリゴヌクレオチドのコピーとを含んだ不安定な二重鎖である、二重鎖を形成させる段階;
d) 不安定な二重鎖を形成した構築用オリゴヌクレオチドのコピーを除去する段階; および
e) 残存する二重鎖を変性させ、それにより精製済みの構築用オリゴヌクレオチドのプールを形成させる段階。
【請求項６８】
二重鎖の融解温度を最適化するため、構築用オリゴヌクレオチド、選択用オリゴヌクレオチド、またはその両方の長さ、コドン使用頻度、または長さおよびコドン使用頻度をコンピュータにより最適化する段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
選択用オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化される、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
選択用オリゴヌクレオチドのプール中の1種または複数種の選択用オリゴヌクレオチドの配列が構築用オリゴヌクレオチドのプール中の構築用オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分の配列全体に相補的である、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
構築用オリゴヌクレオチド、選択用オリゴヌクレオチド、またはその両方が固体支持体上で合成される、請求項58または67記載の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチド構築体のコピーの配列を決定する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項７３】
ポリヌクレオチド構築体を細胞に導入する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項７４】
ポリヌクレオチド構築体が少なくとも1種のポリペプチドをコードする、請求項58記載の方法。
【請求項７５】
ポリヌクレオチド構築体が特定の宿主細胞で発現させるためにコドン最適化された、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
以下の段階を含む、単一のプール中で複数の異なるポリヌクレオチド配列をアッセンブルする方法:
a) 相補的な末端領域と該異なるポリヌクレオチド配列の末端を含んだオリゴヌクレオチドに隣接するプライマー部位とを有する合成オリゴヌクレオチドの群を提供する段階;
b) 該合成オリゴヌクレオチドをdNTPsおよびポリメラーゼとともに混合する段階;
c) 以下をもたらすよう混合物をサイクリングにかける段階:
該相補的な末端領域のハイブリダイゼーション;
重複するオリゴヌクレオチドを伸長させるおよび完全長の異なるポリヌクレオチド配列のコピーを産生させるポリメラーゼを介した塩基の取込み; および
複数の該完全長配列の増幅。
【請求項７７】
産生されたポリヌクレオチド配列をさらにアッセンブルしてより大きなポリヌクレオチドを産生させる段階を含む請求項76記載の方法であって、以下のさらなる段階を含む方法:
d) 複数の別個のプール中で請求項76記載の方法を行い、異なる合成ポリヌクレオチド配列の少なくともいくつかをそれにより、相補的な末端領域と該より大きなポリヌクレオチドの末端を含んだ異なるポリヌクレオチド配列に隣接するプライマー部位とを有するポリヌクレオチドを含む各プール中で産生させる段階;
e) 該複数のプールの少なくともいくつかをdNTPsおよびポリメラーゼとともに混合する段階; ならびに
f) 以下をもたらすよう混合物をサイクリングにかける段階:
該異なるポリヌクレオチド配列の該相補的な末端領域のハイブリダイゼーション;
重複するオリゴヌクレオチド配列を伸長させるおよび完全長のより大きなポリヌクレオチドのコピーを産生させるポリメラーゼを介した塩基の取込み; および
複数の該完全長のより大きなポリヌクレオチドの増幅。
【請求項７８】
合成オリゴヌクレオチドが複数の塩基配列の連続自動並行アッセンブリにより並行して合成され、精製されて、配列エラーを包含するオリゴヌクレオチドコピーの濃度を減らす、請求項76記載の方法。
【請求項７９】
精製がハイブリダイゼーションにより行われる、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
合成オリゴヌクレオチドが表面上で合成される、請求項76記載の方法。
【請求項８１】
相補的な末端領域の複数のペアがほぼ同じ融解温度を有するように設計される、請求項76または77記載の方法。
【請求項８２】
プールがウェルまたはマイクロチャネルである、請求項76記載の方法。
【請求項８３】
混合する段階e)が微小流体システムの中に混合物の成分をともに流すことで行われる、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項76記載の方法。
【請求項８５】
多数の異なる回収可能なポリヌクレオチドを含む製造物品であって、以下を含む物品:
容器由来の異なるポリヌクレオチドの部分集団の増幅を可能にするプライマー配列の異なるペアを含んだ異なるポリヌクレオチド混合物を含むポリヌクレオチド用容器; および
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器。
【請求項８６】
ポリヌクレオチド用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列ペアが互いに異なる、請求項85記載の物品。
【請求項８７】
ポリヌクレオチドが合成DNAを含む、請求項85記載の物品。
【請求項８８】
ポリヌクレオチドが遺伝子を含む、請求項85記載の物品。
【請求項８９】
ポリヌクレオチドが野生型配列の複数の変異体を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９０】
ポリヌクレオチドがベクターを含む、請求項85記載の物品。
【請求項９１】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも1 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９２】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも2 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９３】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が少なくとも10 Kb長である、請求項85記載の物品。
【請求項９４】
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分が環状化される、請求項85記載の物品。
【請求項９５】
ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド配列の操作を容易にするアダプター配列に隣接しているポリヌクレオチド配列を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９６】
アダプター配列がベクターへの挿入、固定化、および配列の機能の同定の1つまたは複数を容易にする、請求項95記載の物品。
【請求項９７】
ポリヌクレオチドの混合物が哺乳類の配列、酵母の配列、原核生物の配列、植物の配列、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)の配列、線虫(C. elegans)の配列、およびアフリカツメガエル(Xenopus)の配列からなる群より選択される1つまたは複数の配列を含む、請求項85記載の物品。
【請求項９８】
異なる回収可能なポリヌクレオチド構築体の混合物が独立して回収可能である、請求項85記載の物品。
【請求項９９】
複数の異なるポリヌクレオチドを含有する複数のポリヌクレオチド用容器、プライマー配列の同一のペアを含んだ異なる容器中のポリヌクレオチドを含む、請求項85記載の物品。
【請求項１００】
複数のプライマー用容器の1つまたは複数が相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０１】
ポリヌクレオチド用容器がD個の異なる独立して回収可能なポリヌクレオチドであって、それぞれがN個のネスティッドプライマーペアを含むポリヌクレオチド、少なくともN/2×D1/Nであるプライマー用容器の数を含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０２】
ポリヌクレオチド用容器がD個の異なるポリヌクレオチドおよびプライマーのペアを含有するD個のプライマー用容器を含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０３】
ポリヌクレオチド用容器が、プライマー配列の複数のネスティッドペアを含む異なるポリヌクレオチドであって、該複数のネスティッドペアのそれぞれが該容器中の選択のポリヌクレオチド群のまたはその容器中の該異なるポリヌクレオチドの個々のものの増幅を可能にするポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０４】
102個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０５】
103個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０６】
104個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項85または99記載の物品。
【請求項１０７】
105個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項99記載の物品。
【請求項１０８】
106個の異なるポリヌクレオチドを含む、請求項99記載の物品。
【請求項１０９】
多数の異なる回収可能なポリヌクレオチドを含有する包装を含む製造物品であって、以下を含む物品:
異なるポリヌクレオチドの少なくともいくつかがプライマー配列の複数のネスティッドペアを含み、該複数のネスティッドペアのそれぞれが容器中の選択のポリヌクレオチド群のまたはその容器中の該異なるポリヌクレオチドの個々のものの増幅を可能にする異なるポリヌクレオチドの混合物を含んだポリヌクレオチド用容器; および
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器。
【請求項１１０】
容器中の各ポリヌクレオチド上のネスティッドペアの組合せが、該容器中のその他全てのポリヌクレオチドのネスティッドペアの組合せと異なる、請求項109記載の物品。
【請求項１１１】
それぞれが複数の異なるポリヌクレオチドを含む複数の構築用容器、所与のプライマーペアが異なる容器中の異なるポリヌクレオチドとアニーリングするようにプライマー配列の同一のペアを含んだ異なる容器中のポリヌクレオチドを含む、請求項85または109記載の物品。
【請求項１１２】
ポリヌクレオチド構築体の選択の1つまたは選択の群に富む溶液を供給する装置であって、以下を含む装置:
容器由来の異なるポリヌクレオチドのうち選択のものの増幅を可能にするおよび該容器中のその他のポリヌクレオチドのプライマー配列のその他のペアとは異なる、プライマー配列の少なくとも1ペアを含む同定済みのポリヌクレオチドの混合物を含んだポリヌクレオチド用容器;
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中の異なるポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含んだ容器;
同定済みのポリヌクレオチドと各同定済みのポリヌクレオチドに相補的なプライマーのペアまたは複数ペアを含む1つまたは複数の容器の位置とを収載するデータ保存庫;
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの群を利用者が指定するのを可能にするインターフェース;
該インターフェースで入力された仕様に応答する自動的手段、および該指定されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの群を選択的に増幅するのに必要とされる試薬を調製するよう該構築用容器からポリヌクレオチドおよび選択のプライマー用容器からプライマーの一定分量を抽出するために該データ保存庫からアクセスされる命令。
【請求項１１３】
異なる同定済みのポリヌクレオチドを含んだ複数のポリヌクレオチド用容器を含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１４】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の同一ペアを含む、請求項113記載の装置。
【請求項１１５】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の複数のネスティッドペアを含む、請求項113記載の装置。
【請求項１１６】
少なくとも10個のポリヌクレオチド用容器を含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１７】
異なる容器中の同定済みのポリヌクレオチドが、プライマー配列の固有のネスティッドペアを含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１８】
構築用容器から回収される選択の同定済みポリヌクレオチドを選択のプライマーペアによる指定のとおりに増幅するよう適合された増幅用チャンバをさらに含む、請求項112記載の装置。
【請求項１１９】
増幅用チャンバから回収される同定済みのポリヌクレオチドの1つまたは部分集団を選択のプライマーペアによる指定のとおりに増幅するよう適合された第2の増幅用チャンバをさらに含む、請求項118記載の装置。
【請求項１２０】
以下の段階を含む、選択のポリヌクレオチドを得る方法:
容器由来のポリヌクレオチドのうち選択のものの増幅を可能にするプライマー配列の複数のネスティッドペアを含み、該容器中のあるポリヌクレオチドのプライマーペアの組合せが該容器中のその他のポリヌクレオチドのプライマー配列のその他のペアとは異なる同定済みの合成ポリヌクレオチドの混合物を含有する複数の構築用容器を提供する段階;
複数のプライマー用容器であって、それぞれが構築用容器中のポリヌクレオチドのプライマー配列のペアに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを含む容器を提供する段階;
第1の増幅手順を、選択の該構築用容器から回収されるポリヌクレオチドの該混合物と1つまたは複数のプライマー用容器から回収される、プライマー配列の外側ネスティッドペアに相補的なプライマーのペアの一定分量を含む第1の増幅混合物で行う段階; および
第2の増幅手順を、該第1の増幅混合物から回収される単位複製配列と1つまたは複数のプライマー用容器から回収される、プライマー配列の内側ネスティッドペアに相補的なプライマーのペアの一定分量を含む第2の増幅混合物で行う段階。
【請求項１２１】
多数のポリヌクレオチド種であって、少なくともいくつかがライブラリーから回収される種のうちの選択群の増幅を可能とするのに十分な長さのプライマー配列の外側ペアを有する種、および該外側ペアを用いた増幅によって産生された単位複製配列の混合物から回収される種のうちの1つまたは選択群の増幅を可能とするのに十分な長さを有するプライマー配列の内側ペアを含む、ライブラリーを形成する混合物中の多数の合成ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
ライブラリー中の個々の種の濃度が、該ライブラリーから直接的にその選択的増幅を可能とするには十分ではないが、外側のプライマー配列ペアを用いた増幅後にその選択的増幅を可能とするには十分である、請求項121記載のライブラリー。
【請求項１２３】
合成ポリヌクレオチドがプライマー配列の3組のネスティッドペアを含む、請求項121記載のライブラリー。
【請求項１２４】
合成ポリヌクレオチドが各々、ライブラリー中のプライマー配列のその他全てのネスティッドペアとは異なる核酸配列を有するプライマー配列のネスティッドペアを含む、請求項121記載のライブラリー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【公表番号】特表２００７−５３４３２０（Ｐ２００７−５３４３２０Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００８０８（Ｐ２００７−５００８０８）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９１１０
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５９２２５７３１０）プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００６４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９１１０
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５９２２５７３１０）プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ (31)
【Ｆターム（参考）】
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