ポリラクテートとその共重合体生成能が改善された変異微生物を利用したポリラクテートとその共重合体の製造方法
本発明は、コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を利用してポリラクテートまたはその共重合体を製造する方法に関する。本発明によれば、微生物の代謝経路中にコエンザイムＡ供与体とラクテートの量を同時に増加させることによって、ポリラクテートとラクテート含量が高いヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を効率的に生合成することができ、産業的に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリラクテートとその共重合体生成能が改善された変異微生物を利用したポリラクテートとその共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（polylactate；ＰＬＡ）は、ラクテートから由来する代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子または医療用高分子としての応用性が高い高分子である。現在ＰＬＡは、微生物発酵によって生産されたラクテートを重合して製造さALP-33835 れているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（１０００−５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためには、ラクテートの直接重合により得られた低分子量のＰＬＡから鎖連結剤（chain coupling agent）を利用してさらに分子量が大きいＰＬＡに重合する方法があるが、鎖連結剤を利用するので、高分子量のＰＬＡを製造する方法は、有機溶剤や鎖連結剤の添加によって工程が複雑になり、また、これらの除去が容易でないという短所がある。現在商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチドに転換した後、ラクチドリングの開環縮合反応によりＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００３】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（polyhydroxyalkanoate；ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在し、且つリン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が足りないとき、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来する合成高分子と類似な物性を有し、且つ完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００４】
微生物からＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素とＰＨＡモノマーを利用してＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素が必須である。
【０００５】
ＰＨＡ合成酵素は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（hydroxyacyl−ＣｏＡ）を基質として使用してＰＨＡを合成する。しかし、２番−炭素位置に水酸化されたラクテートのようなヒドロキシアルカノエートは、ＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適していないため、自然的に、または組み換え細胞や植物を利用してＰＬＡ及びその共重合体を製造した例はなかった。これより、本発明者らは、ラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼとこれを基質として利用するシュードモナス属６−１９（Pseudomonas sp. 6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して成功的にＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成することができた（特許文献１）。
【０００６】
しかし、既存に開発された微生物のＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体の生成効率は、未だ低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体の生成能がさらに良好な微生物の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国特許出願第１０−２００５−００４３７９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に生産する変異微生物を利用してポリラクテートまたはその共重合体を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を利用してポリラクテートまたはその共重合体を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物の代謝経路中にラクテートとコエンザイムＡ供与体の量を同時に増加させることによって、ポリラクテートとラクテート含量が高いヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を効率的に生合成することができ、産業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡ遺伝子を不活性化または増幅させて、ポリラクテートとその共重合体の生成能を高めた変異微生物の内部代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に合成するためには、ポリラクテートの単量体であるラクチルＣｏＡの生成を増加させなければならない。このためには、ラクチルＣｏＡの生合成に必要なコエンザイムＡ供与体の量が増加すると同時に、主要前駆基質であるラクテートの量が増加するように、微生物の代謝フローが変更される必要がある。コエンザイムＡ供与体及びラクテートのうちいずれか１つの量が増加するといって、ラクチルＣｏＡの生合成効率が大きく増進されるわけではない。したがって、本発明では、微生物の代謝過程中にコエンザイムＡ供与体及びラクテートの量を同時に増加させて、ポリラクテートまたはその共重合体の生合成効率を高め、高分子内のラクテート含量を高めようとする。
【００１３】
ラクテートの供給は、外部でラクテートを供給し、ラクテートトランスポーター（lactate transporter）を通じて細胞内に導入する方法と、嫌気条件でブドウ糖から生成される細胞内ラクテートを利用する方法がある。外部で供給する場合は、ラクテートの取り込み（uptake）が制限されることができる。また、細胞外で供給されたラクテートは、大膓菌の細胞膜に存在するＤ−ラクテート脱水素化酵素（Ｄ−lactatede hydrogenase）とＬ−ラクテート脱水素化酵素（Ｌ−lactatede hydrogenase）によってピルベートに転換されながら細胞内に伝達されるが、これは、ラクチルＣｏＡの生成を増加させようとする本発明の目的に適していない。したがって、本発明では、グルコースを利用してラクテートを生成し、これからラクチル−ＣｏＡを合成する経路を選択し、ラクチル−ＣｏＡの生成が増加するように、微生物の代謝経路を遺伝工学的に操作しようとする。
【００１４】
このために、本発明は、コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を製造し；上記変異微生物をグルコースまたはグルコースとヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養し；上記変異微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含むポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法を提供しようとする。
【００１５】
本発明の一態様において、上記コエンザイムＡ供与体は、アセチルコエンザイムＡであることができる。コエンザイムＡ供与体のうち、アセチルコエンザイムＡは、グルコースを利用してラクテートを合成する微生物の代謝経路中でコエンザイム供与体になることができる可能性が高い。
【００１６】
コエンザイムＡ供与体の１つであるアセチルコエンザイムＡの量を増加させるために、微生物のアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子またはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子を不活性化させるか、または、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子を増幅させることができる。上記遺伝子のうち２つ以上の遺伝子を不活性化または増幅させることによって、アセチルコエンザイムＡの量をさらに増加させることもできる。
【００１７】
ラクチルＣｏＡの生成のためにコエンザイムＡを提供することができるコエンザイムＡ供与体は、アセチルコエンザイムＡ以外にも、β−ケトアジピル−ＣｏＡ（β−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、γ−ブチロベタイニル−ＣｏＡ（γ−ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡ（（Ｒ）−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｓ）−メチル−マロニル−ＣｏＡ（（Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−ホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−トリホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、３、４−ジヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ（３−ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、４−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡのｃｉｓ−ジヒドロジオール誘導体（ｃｉｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、Δ２−エノイル−ＣｏＡ（Δ２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ジエノイル−ＣｏＡ（２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、３−ケトアシル−ＣｏＡ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２、３−ｄｅｈｙｄｒｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｄ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、脂肪アシルＣｏＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ＣｏＡ）、長鎖アシル−ＣｏＡ（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ＣｏＡ誘導体（ＣｏＡ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アセトアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、アセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ω−カルボキシアシル−ＣｏＡ（ω−ｃａｒｂｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ブチリル−ＣｏＡ（ｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、コエンザイム−Ａ−グループ（ＣｏＡ）、クマロイル−ＣｏＡ（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ）、クロトノベタイニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、クロトニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｄ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、デホスホ−ＣｏＡ（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、ホルミル−ＣｏＡ（ｆｏｒｍｙｌ−ＣｏＡ）、イソバレリル−ＣｏＡ（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、マロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｏ−スクシニルベンゾイル−ＣｏＡ（Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｂｅｎｚｏｙｌ−ＣｏＡ）、オキサリル−ＣｏＡ（ｏｘａｌｙｌ−ＣｏＡ）、パルミトイルＣｏＡ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡ（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ピメロイル−ＣｏＡ（ｐｉｍｅｌｏｙｌ−ＣｏＡ）、プロピオニル−ＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、スクシニル−ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−デカジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２−デセノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２−ｄｅｃｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ ＣｏＡ）などが利用されることができる。コエンザイムＡ供与体としてアセチルコエンザイムＡ以外のものを利用する場合、これらのコエンザイムＡ供与体の量の増加のために、上記不活性化または増幅される遺伝子の種類が変化することができる。
【００１８】
これと同時に、微生物の代謝フロー中にラクテートの量を増加させるために、微生物のホスホエノールピルベート（phosphoenolpyruvate）の消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子を不活性化させるか、または、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子を増幅させることができる。上記遺伝子のうち２つ以上の遺伝子を不活性化または増幅させることによって、ラクテートの量をさらに増加させることもできる。一般的に嫌気条件でブドウ糖から生成される細胞内ラクテートを利用するためには、まず、細胞成長のために好気条件で充分に成長させた後、ラクテート生成のために嫌気条件またはマイクロ嫌気条件に変更させなければならないが、上記のようにラクテートの量が増加するように遺伝子を操作する場合には、１段階培養だけでも細胞成長とともに細胞内ラクテートを利用した高分子生産が同時に達成されることができる効率的な生産システムを構築することができるようになる。
【００１９】
本発明において、上記微生物は、ポリラクテートまたはその共重合体を合成することができる微生物であれば、いずれのものでも使用可能である。このような微生物としては、バクテリア、酵母、かびなどが含まれることができる。上記バクテリアとしては、例えば、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バシルロス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが含まれることができる。これらに限定されるものではないが、本発明の一態様において、上記バクテリアは、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよい。本発明の一実施例では、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを遺伝工学的に操作した変異大膓菌を開示するが、本発明の微生物は、これに限定されない。
【００２０】
本発明の一態様において、上記アセテートの生成経路に関与する酵素は、例えば、アセテートキナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｃｋＡであってもよい。
【００２１】
本発明の一態様において、上記エタノールの主要生成経路に関与する酵素は、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｄｈＥであってもよい。
【００２２】
本発明の一態様において、上記アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素は、例えば、アセチルコエンザイムＡ合成酵素であってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｃｓであってもよい。
【００２３】
本発明の一態様において、上記ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素は、例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ｐｐｃであってもよい。
【００２４】
本発明の一態様において、上記ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ｌｄｈＡであってもよい。
【００２５】
本発明の他の態様において、上記変異微生物は、アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていてもよい。
【００２６】
本発明のさらに他の態様において、上記変異微生物は、アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていて、同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていてもよい。
【００２７】
本発明において、「不活性化」というのは、遺伝子が変異によって転写されないか、または、転写されたｍＲＮＡが本来のタンパク質に正確に翻訳されないことを言う。遺伝子を「不活性化」させるためには、遺伝子を欠失させるか、または、遺伝子の核酸配列に変化を起こして変異させることができる。
【００２８】
本発明において、「増幅」というのは、遺伝子の発現量が本来の発現量より増加したことを言う。変異させる前の微生物に増幅させようとする遺伝子が存在しない場合には、１つ以上の上記遺伝子を上記微生物に導入して増幅させることができ、変異させる前の微生物に増幅させようとする遺伝子が存在する場合には、同じ方法で１つ以上の遺伝子を上記微生物に追加に導入するか、または、既存に存在する遺伝子の発現量が増加するように遺伝工学的に操作することができる。例えば、発現を増幅させる遺伝子が変異させようとする微生物内に存在する場合、上記遺伝子の発現を作動させる固有のプロモータを強力プロモータに置換することによって、上記遺伝子の発現を増幅させることができる。したがって、本発明の一態様において、上記遺伝子の増幅は、固有プロモータ（native promoter）の強力プロモータ（strong promoter）への置換によるものであることができる。このような強力プロモータの例としては、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータなどが含まれる。
【００２９】
上記変異微生物は、ピルベートが増加するように追加に操作されることができる。ピルベートは、コエンザイムＡ供与体の１つであるアセチルコエンザイムＡとラクテートの共通的な前具体として、ピルベートが増加すればアセチルコエンザイムＡとラクテートの量が増加するようになる。したがって、本発明のさらに他の態様において、上記変異微生物は、ピルベートが増加するように追加に１つ以上の下記遺伝子が追加に弱化または不活性化されていてもよい：ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｐｃ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ、ｐｆｌＢなど。例えば、ピルベートをアセチルコエンザイムＡに転換させるピルベート脱水素化酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡまたはピルベートをポルメートに転換させるピルベートポルメートリアーゼをコーディングする遺伝子であるｐｆｌＢを弱化または不活性化させれば、ピルベートが増加し、且つアセチルコエンザイムＡとラクテートの量が増加するようになる。また、マレートをオキサロアセテートに転換させるマレート脱水素化酵素をコーディングする遺伝子であるｍｄｈを弱化または不活性化させることによって、マレートからピルベートへの代謝フローを強化させることができる。これとは異なって、ピルベートの前具体であるホスホエノールピルベートを消耗しながらブドウ糖を取り込む役目をするホスホトランスフェラーゼ酵素群の１つをコーディングする遺伝子であるｐｔｓＧ、または、ブドウ糖からピルベートに転換される当該過程中にグリセルアルデヒド３−フォスフェートをジヒドロキシアセトンフォスフェートに転換させるトリオースフォスフェート異性化酵素をコーディングする遺伝子であるｔｐｉＡを弱化または不活性させることによって、ピルベートへの代謝フローを増加させることもできる。
【００３０】
上記変異微生物をグルコースを含む培地で培養すれば、微生物からポリラクテートを収得することができ、上記変異微生物をグルコース及びヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養すれば、微生物からヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を収得することができる。培地に含ませるヒドロキシアルカノエートの種類によって収得されるヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の種類は変わることができる。
【００３１】
本発明の一態様において、上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（（Ｄ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシプロピオン酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシ吉草酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘキサン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘプタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシオクタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシデカン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシ吉草酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシヘキサン酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシドデカン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｃｉｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｔｒａｎｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｎｏｎｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｚｅｌａｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｂｅｎｚｉｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ａｃｅｔｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ａｃｅｔｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（３、１２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４、５−ｅｐｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６、７−ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８、９−ｅｐｏｘｙ−５、６−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（７−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（９−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｈｌｏｒｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｃｈｌｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｂｒｏｍｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｂｒｏｍｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２、６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１つ以上のものであることができる。
【００３２】
本発明の一実施例では、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを遺伝工学的に操作し、ポリ（Ｄ−ラクテート）とラクテート含量が高いポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−Ｄ−ラクテート）を効率的に生産する方法について開示している。本発明の方法によれば、その他のの多様なポリ（ヒドロキシアルカノエート−ラクテート）を製造することが可能である。
【００３３】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現され、ただ本実施例は、本発明の開示が完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００３４】
実施例１：ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の製作
下記実施例１では、膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいてアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｋＡまたはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるａｄｈＥを不活性化させるか、アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｓを増幅させると同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるｐｐｃを不活性化させるか、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるｌｄｈＡを増幅させ、上記のように変異させた大膓菌をＰＨＡ合成酵素の遺伝子とプロピオニル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼの遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換することによって、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に生産する変異大膓菌を製造した。図１は、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡ遺伝子を不活性化または増幅させて、ポリラクテートとその共重合体生成能を高めた変異微生物の内部代謝経路を示すものである。
【００３５】
実施例１−１：アセチル−ＣｏＡ及びラクテートの量が増加した変異微生物の製作
１−１−１：ａｃｋＡ、ａｄｈＥまたはｐｐｃ遺伝子の欠失
大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において下記プライマーでｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ方法（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ６；９７（１２）：６６４０−６６４５、２０００）を利用して、ａｃｋＡ、ａｄｈＥまたはｐｐｃを欠失させた。
【００３６】
ａｃｋＡ遺伝子の欠失のために、ｐＭｌｏｃＸベクター［Ｌｅｅ Ｋ．Ｈ．， Ｐａｒｋ Ｊ．Ｈ．， Ｋｉｍ Ｔ．Ｙ．， Ｋｉｍ Ｈ．Ｕ． ＆ Ｌｅｅ Ｓ．Ｙ．， Ｓｙｓｔｅｍｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ３， １４９（２００７）］を鋳型にして配列番号１及び３のプライマーで１次ＰＣＲを行った。この時、得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２及び４のプライマーを使用して２次プライマー延長ＰＣＲを行った。２次ＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ切片を獲得し、ラムダレッドリコンビナーゼ（λ−red recombinase）が発現されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株のコンピテント細胞（electroporation-competent cell）にエレクトロポレーション（electroporation）し、ａｃｋＡ遺伝子欠失突然変異菌株を製作した。ａｃｋＡ遺伝子欠失の確認のために、配列番号５及び６のプライマーでコロニーＰＣＲを行った。
【００３７】
また、ｐｐｃ遺伝子の欠失のために、同じ方法で配列番号７及び９、８及び１０のプライマーが順次に使用され、欠失の確認のために、配列番号１１及び１２のプライマーが使用された。
【００３８】
また、ａｄｈＥ遺伝子の欠失のために、同じ方法で配列番号１３及び１５、１４及び１６のプライマーが順次に使用され、欠失の確認のために、配列番号１７及び１８のプライマーが使用された。
【００３９】
１−１−２：ａｃｓまたはｌｄｈＡ遺伝子の増幅
上記１−１−１に記述したように、ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ方法（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ６；９７（１２）：６６４０−６６４５， ２０００）を利用して、ａｃｓとｌｄｈＡの大膓菌染色体ＤＮＡ上の各々の固有プロモータを強力プロモータの１つであるｔｒｃプロモータに置換させて増幅した。
【００４０】
ａｃｓ遺伝子の固有プロモットーのｔｒｃプロモータへの置換のために、ｐＭｌｏｘＣベクターを鋳型にして配列番号１９及び２２のプライマーで１次ＰＣＲを行い、この時、得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２０及び２３のプライマーで２次ＰＣＲを行った。２次ＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２１及び２４のプライマーで３次ＰＣＲを行い、最後のＤＮＡ切片を獲得した。これをラムダレッドリコンビナーゼ（λ−red recombinase）が発現されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株のコンピテント細胞（electroporation-competent cell）にエレクトロポレーション（electroporation）し、ａｃｓ遺伝子の固有プロモータがｔｒｃプロモータに置換された突然変異菌株を製作した。ａｃｓ遺伝子のプロモータ置換を確認するために、配列番号２５及び２６のプライマーでコロニーＰＣＲを行った。
【００４１】
また、ｌｄｈＡ遺伝子の固有遺伝子のｔｒｃプロモータへの置換のために、同じ方法で配列番号２７及び３０、２８及び３１、２９及び３２のプライマーが順次に使用され、置換の確認のために、配列番号３３及び３４のプライマーが使用された。
【００４２】
１−１−３：ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡが不活性化または増幅された変異微生物の製造
上記１−１−１または１−１−２の過程を通じて、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡが様々な組合で不活性化または増幅された変異微生物ＪＬＸ１−９を製作した。
【００４３】
表１は、上記方法で製作された大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株の染色体ＤＮＡ特徴を示すものである。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例１−２：ＰＨＡ合成酵素の遺伝子とプロピオニル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼの遺伝子を含む組み換えベクターの製作
１−２−１．ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組み換えベクターの製作
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ １１０２７ＢＰ）由来のＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-Jin Song，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＫＡＩＳＴ， ２００４）に基づく配列番号３５及び３６の塩基配列を有するプライマーを製作し、ＰＣＲを行い、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を収得した。ＰＣＲ反応物をアガロスゲル電気泳動し、ｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐサイズの遺伝子切片を確認した。
【００４６】
ｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９合成酵素の発現のために単量体供給酵素と合成酵素が一緒に発現されるオペロン形態の常時的発現システムを導入した。
【００４７】
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．， １９９４， ４４：１３３７−１３４７）においてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４８】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ＆ｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモータによって常時的に発現され、大膓菌でも良好に作動すると知られている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １９９４， ４４：１３３７−１３４７）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６ ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で収得したｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４９】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位が各々両端に１つずつ含まれたｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換なしに除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び配列番号４２の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５０】
上記ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のＰＨＢ合成可否を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成が観察されなかった。
【００５１】
ＳＣＬ（short chain length）活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３ヶ所をアミノ酸配列配列分析を通じて探し出し、配列番号４３乃至４８のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用して下記表２のようなｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体を作った。
【００５２】
【表２】
【００５３】
これらの組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた。その結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ及びｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ＢｌｕｅにおいていずれもＰＨＢ生成を確認することができた。
【００５４】
すなわち、単量体供給酵素であるｐｈａＡＲＥとｐｈａＢＲＥによってグルコースから３ＨＢ−ＣｏＡが生成され、これを基質にしてｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００＆ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）がＰＨＢを合成したものである。
【００５５】
これに、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するためのプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼが一緒に発現されるオペロン形態の常時的発現されるシステムを構築するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用した。
【００５６】
ｃｐ−ｐｃｔは、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）の染色体ＤＮＡを配列番号４９及び配列番号５０のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用した。この時、元々野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ ｓｉｔｅをクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去した。また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号５１と５２の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５７】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含むｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ ＆ ｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組み換えベクターを製造した。
【００５８】
１−２−２．ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ５３２組み換えベクターの製作
ＣＰ−ＰＣＴの場合、大膓菌で高発現される場合、深刻な代謝障害を起こし、毒性を示すと知られているが、一般的に組み換えタンパク質発現に広く使用されるｔａｃプロモータやＴ７プロモータを使用したＩＰＴＧによる発現誘導システムでは、誘導体添加と同時に組み換え大膓菌がすべて死滅した。
【００５９】
したがって、ｌａｃｔｙｌ−ＣｏＡを効率的に提供することができるクロストリジウム・プロピオニカム由来プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Clostridium propionicum propionate CoA transferase）変異体の開発が必要である。
【００６０】
このために、弱く発現されるが微生物成長によって持続的に発現される常時的発現システムを使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体の合成に成功した。
【００６１】
ｃｐ−ｐｃｔに無作為的突然変異（random mutagenesis）を導入するために、上記１−２−１で製作されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを鋳型にし、配列番号５３及び５４のプライマーを利用してＭｎ２＋が添加され、ｄＮＴＰｓの濃度差が存在する条件でＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを実施した。
【００６２】
その後、無作為的突然変異が含まれたＰＣＲ断片を増幅するために、上記配列番号５３及び５４のプライマーを利用して一般条件でＰＣＲした。
【００６３】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、野生型ｃｐ−ｐｃｔを除去した後、上記増幅された突然変異ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたライゲーションミックスを作り、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、〜１０＾５程度規模のＣＰ−ＰＣＴライブラリを製作した。
【００６４】
上記製作されたＣＰ−ＰＣＴライブラリは、高分子検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ １ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で３日間生育させた後、高分子生成可否を確認するスクリーニング作業を行い、〜８０余個体の候補を１次選定した。これら候補を高分子が生成される条件で４日間液体培養（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ １ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、３７℃）し、ＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析し、最終２個体を選定した。
【００６５】
上記製作されたＣＰ−ＰＣＴ変異体の突然変異位置を探すために、遺伝子塩基配列を分析した。その結果は、下記の表３の通りである。
【００６６】
【表３】
【００６７】
上記最終選別された突然変異体（ＣＰ−ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５１２， ＣＰ−ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５２２）を基本にさらに上記Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの方法で無作為的突然変異を行い、下記表４に示されたようなＣＰ−ＰＣＴ変異体５３１−５３６を得た。
【００６８】
【表４】
【００６９】
その後、ＣｐＰｃｔ５３２突然変異が含まれたＰＣＲ断片を増幅するために、上記配列番号５３及び５４のプライマーを利用して一般条件でＰＣＲした。上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、ＣＰＰＣＴ部分を除去した後、上記増幅されたＣｐＰｃｔ５３２ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたライゲーションミックスを作り、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを製造した。
【００７０】
１−２−３．ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２（ｐ４００−５３２）組み換えベクターの製作
ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用しないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用することができるＰＨＡ合成酵素が非常に重要であると言える。これより、本発明者らは、シュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体を高効率で製造することができるシステムを発明した。
【００７１】
上記１−２−１で製作されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を基礎にして配列番号５５及び５６のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用してＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９４００）を製作した。
【００７２】
これから得た組み換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２）をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換させ、これを３ＨＢが含まれた重合体検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、重合体生成を確認することができた。
【００７３】
１−２−４．ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２（ｐ３１０−５３２）組み換えベクターの製作
ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用しないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用することができるＰＨＡ合成酵素が非常に重要であると言える。これより、上記１−２−１で製作されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を基礎にして配列番号５７及び５８、５９、６０のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用してＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３１０）を製作した。
【００７４】
これから得た組み換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２）をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換させ、これを３ＨＢが含まれた重合体検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、重合体生成を確認することができた。
【００７５】
１−３．ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の製作
実施例１−１で製作されたアセチル−ＣｏＡ及びラクテートの量が増加した変異微生物に上記実施例１−２−３及び１−２−４で製作されたｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２またはｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを導入することによって、ポリラクテートとポーリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）を効率的に生成する変異微生物を製作した。
【００７６】
上記変異微生物をテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びグルコース２０ｇ／Ｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３０℃で１２時間、前培養を行った。その後、蒸留水１リットル当たり２０ｇのグルコース、６．６７ｇのＫＨ２ＰＯ４、４ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇのクエン酸、０．８ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＬのｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（蒸留水１リットル当たり１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇのＣａＣｌ２、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの３５％ＨＣｌを含む）の成分があり、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整した１００ｍＬの培地を含む２５０ｍＬフラスコに上記前培養液１ｍＬをテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びチアミン１０μｇ／ｍＬとともに接種し、３０℃で２００ｒｐｍで７２時間乃至９６時間培養した。この時、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）共重合体の生成のために、培養初期にＤＬ−３−ヒドロキシブチレートナトリウム塩（ＡＣＲＯＳ）２ｇ／Ｌを一回乃至二回供給した。突然変異菌株のうちｐｐｃ遺伝子の欠失に起因して細胞成長が難しい菌株を培養するためにスクシネート４ｇ／Ｌが添加された。また、ｔｒｃプロモータに置換されたｌｄｈＡ及びａｃｓ遺伝子の発現のために、ＯＤ６００ ０．５程度に１ｍＭのＩＰＴＧが添加された。
【００７７】
培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で３回洗浄した後、１００℃の乾燥器で２４時間乾燥し、乾燥した菌体のうち一部を採取し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析を行うことによって、細胞内合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量を測定した。分析に使用された標準物質は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体（これらのうち３ＨＶの含量は重量比で約１２％）及びポリラクテートホモポリマーであった。上記代謝操作によってＰＬＡホモポリマーの３〜１０ｗｔ％程度の生成が可能になり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の生成は、高分子内のＬＡ分率が１．７〜４．３倍増加し、高分子含量が１．４〜２７．３倍増加する優れた改善効果を示した。
【００７８】
実施例２：ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の培養体積条件による高分子生成能比較
フラスコ培養において、培養条件とこれによるラクテート生成程度が微生物の細胞成長（バイオマス）とＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）生成に及ぼす影響を調べるために、培養体積を異ならしめて培養することにした。このために、２５０ｍＬフラスコに５０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬの培地を入れ、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株を培養した。上記ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株は、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの代謝フローを操作しないまま、ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを導入した菌株である。
【００７９】
下記表５は、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株の培養体積条件による高分子生成結果を示すものである。
【００８０】
【表５】
【００８１】
予想の通り、培地体積が増加するにつれて、相対的に（マイクロ）嫌気条件が形成されながら細胞成長は弱化し、これにより、高分子含量は、約１．５倍増加した。また、（マイクロ）嫌気条件によるラクテートの生成が増加しながら高分子内のラクテート分率は、２．２倍程度増加した。
【００８２】
これを基盤にして代謝的に操作された本発明の変異微生物ＪＬＸ７／ｐ４００−５３２の効果を確認するために、培養体積を５０ｍＬ、１００ｍＬにしてフラスコ培養を施行した。
【００８３】
下記表６は、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株と本発明の変異微生物ＪＬＸ７／ｐ４００−５３２の培養体積条件による高分子生成結果を示したものである。
【００８４】
【表６】
【００８５】
５０ｍＬの培養体積で培養した時、宿主菌株としてＸＢ／ｐ４００−５３２を使用した場合と比較して、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量は、１．２４倍増加し、高分子濃度も１．９８倍増加した。また、高分子内のラクテート（ＬＡ）分率が１４．３２ｍｏｌ％から４９．５５ｍｏｌ％と約３．４６倍増加した。１００ｍＬの培養体積で培養した時、宿主菌株としてＸＢ／ｐ４００−５３２を使用した場合と比較して、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量は、１．６２倍増加し、高分子濃度も２．９８倍増加した。高分子内のＬＡ分率も４０．４５ｍｏｌ％から６３．９５ｍｏｌ％と１．５８倍増加した。
【００８６】
ＰＬＡ共重合体内のＬＡ分率が高分子物性において重要な影響を及ぼすので、ＬＡ分率の増大及び調節は、菌株改良において重要な部分である。
【００８７】
５０ｍＬの培養体積で培養した時、ＬＡ分率が１４．３２ｍｏｌ％から４９．５５ｍｏｌ％と約３．４６倍増加したのに対し、１００ｍＬの培養体積で培養した時は、４０．４５ｍｏｌ％から６３．９５ｍｏｌ％と１．５８倍増加する、相対的に増加幅が低い結果を示したが、ＬＡ分率の絶対値は、最も高い値（６３．９５ｍｏｌ％）を示した。言い換えれば、５０ｍＬの培養場合、その増加幅は、相対的に高いが５０ｍｏｌ％水準であって、１００ｍｌ培養での値（６３．９５ｍｏｌ％）を超えなかった。これは、遺伝子水準での代謝工学とともに培養条件もＰＬＡとその共重合体生産において最適化しなければならない調節因子であることを意味する。
【００８８】
実施例３：変異遺伝子の組合による変異微生物の高分子生成能比較
本発明の変異微生物に適用された遺伝的突然変異の組合が高分子生成能増加に及ぼす効果を確認した。
【００８９】
上記場合のように、基本培地は、ＭＲ培地に炭素源としてグルコース２０ｇ／Ｌ、マーカーとしてテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びチアミン１０μｇ／ｍＬを供給した。また、培養初期にＤＬ−３−ヒドロキシブチレートナトリウム塩（ＡＣＲＯＳ）２ｇ／Ｌを１回（ｐ３１０−５３２の場合、Ｍ２０）乃至２回（ｐ４００−５３２の場合、−Ｍ１８）供給し、３０℃で２００ｒｐｍで７２時間培養した。
【００９０】
宿主菌株としてＸＢ、ＪＬＸ１菌株を使用した場合は、追加事項なしに上記培養条件のまま培養し、ＪＬＸ３、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を使用した場合には、ｐｐｃ遺伝子の欠失による細胞成長阻害を補完するために、スクシネート４ｇ／Ｌを培養初期に追加に供給した。ＪＬＸ２、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を使用した場合は、ｐｔｒｃ−ｌｄｈＡまたはｐｔｒｃ−ｌｄｈＡとｐｔｒｃ−ａｃｓの発現を誘導するために、ＯＤ６００ ０．５程度に１ｍＭ ＩＰＴＧを供給した。
【００９１】
下記表７は、ＸＢ野生型及び表１のＪＬＸ１、ＪＬＸ２、ＪＬＸ３、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７菌株を宿主菌株にしてｐ４００−５３２ベクターを各々導入した変異微生物の高分子生成能を示したものである。
【００９２】
【表７】
【００９３】
また、下記表８は、ＸＢ野生型及び表１のＪＬＸ１、ＪＬＸ２、ＪＬＸ３、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を宿主菌株にしてｐ３１０−５３２ベクターを各々導入した変異微生物の高分子生成能を示したものである。
【００９４】
【表８】
【００９５】
ポリマーの生成は、宿主菌株の代謝フローとポリマー生成に直接的に影響を及ぼす酵素の活性すべてによって影響を受ける。したがって、表７及び表８から明らかなように、同じ宿主細胞であるとしても、適用された酵素活性によって生成されるポリマー内ＬＡ分率、ポリマー含量などが変わることが分かり、それにもかかわらず、全般的に、ＪＬＸ５、ＪＬＸ７またはＪＬＸ８菌株の場合、高分子生成能が常に優れていることが分かった。
【００９６】
実施例４：３−ヒドロキシブチレートの供給量による高分子生成能比較
ＰＬＡ単一重合体とラクテート（ＬＡ）含量が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の生合成のために、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）供給量を調節し、その生成能を調べた。
【００９７】
表９は、宿主菌株としてＸＢ野生型及びＪＬＸ７菌株を使用し、ｐ４００−５３２ベクターを導入した時、３ＨＢ供給量（０、０．５、１、２、４、８ｇ／Ｌ）による高分子生成能を示したものである。
【００９８】
【表９】
【００９９】
表１０は、宿主菌株としてＸＢ野生型及びＪＬＸ７、ＪＬＸ８、ＪＬＸ９菌株を使用し、ｐ３１０−５３２ベクターを導入した時、３ＨＢ供給量（０、０．５、１、２、４ｇ／Ｌ）による高分子生成能を示したものである。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
ｐ４００−５３２とｐ３１０−５３２の場合、いずれも、宿主細胞がＸＢ野生型の場合は、ＰＬＡホモポリマーと５０ｍｏｌ％以上のＬＡを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体を生成しないのに対し、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８、またはＪＬＸ９の場合、ＰＬＡホモポリマーを３〜１０ｗｔ％生成することができ、５０〜８６ｍｏｌ％水準のＬＡを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体を１３〜６５ｗｔ％生成することができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリラクテートとその共重合体生成能が改善された変異微生物を利用したポリラクテートとその共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（polylactate；ＰＬＡ）は、ラクテートから由来する代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子または医療用高分子としての応用性が高い高分子である。現在ＰＬＡは、微生物発酵によって生産されたラクテートを重合して製造さALP-33835 れているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（１０００−５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためには、ラクテートの直接重合により得られた低分子量のＰＬＡから鎖連結剤（chain coupling agent）を利用してさらに分子量が大きいＰＬＡに重合する方法があるが、鎖連結剤を利用するので、高分子量のＰＬＡを製造する方法は、有機溶剤や鎖連結剤の添加によって工程が複雑になり、また、これらの除去が容易でないという短所がある。現在商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチドに転換した後、ラクチドリングの開環縮合反応によりＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００３】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（polyhydroxyalkanoate；ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在し、且つリン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が足りないとき、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来する合成高分子と類似な物性を有し、且つ完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００４】
微生物からＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素とＰＨＡモノマーを利用してＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素が必須である。
【０００５】
ＰＨＡ合成酵素は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（hydroxyacyl−ＣｏＡ）を基質として使用してＰＨＡを合成する。しかし、２番−炭素位置に水酸化されたラクテートのようなヒドロキシアルカノエートは、ＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適していないため、自然的に、または組み換え細胞や植物を利用してＰＬＡ及びその共重合体を製造した例はなかった。これより、本発明者らは、ラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼとこれを基質として利用するシュードモナス属６−１９（Pseudomonas sp. 6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して成功的にＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成することができた（特許文献１）。
【０００６】
しかし、既存に開発された微生物のＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体の生成効率は、未だ低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体の生成能がさらに良好な微生物の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国特許出願第１０−２００５−００４３７９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に生産する変異微生物を利用してポリラクテートまたはその共重合体を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を利用してポリラクテートまたはその共重合体を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物の代謝経路中にラクテートとコエンザイムＡ供与体の量を同時に増加させることによって、ポリラクテートとラクテート含量が高いヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を効率的に生合成することができ、産業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡ遺伝子を不活性化または増幅させて、ポリラクテートとその共重合体の生成能を高めた変異微生物の内部代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に合成するためには、ポリラクテートの単量体であるラクチルＣｏＡの生成を増加させなければならない。このためには、ラクチルＣｏＡの生合成に必要なコエンザイムＡ供与体の量が増加すると同時に、主要前駆基質であるラクテートの量が増加するように、微生物の代謝フローが変更される必要がある。コエンザイムＡ供与体及びラクテートのうちいずれか１つの量が増加するといって、ラクチルＣｏＡの生合成効率が大きく増進されるわけではない。したがって、本発明では、微生物の代謝過程中にコエンザイムＡ供与体及びラクテートの量を同時に増加させて、ポリラクテートまたはその共重合体の生合成効率を高め、高分子内のラクテート含量を高めようとする。
【００１３】
ラクテートの供給は、外部でラクテートを供給し、ラクテートトランスポーター（lactate transporter）を通じて細胞内に導入する方法と、嫌気条件でブドウ糖から生成される細胞内ラクテートを利用する方法がある。外部で供給する場合は、ラクテートの取り込み（uptake）が制限されることができる。また、細胞外で供給されたラクテートは、大膓菌の細胞膜に存在するＤ−ラクテート脱水素化酵素（Ｄ−lactatede hydrogenase）とＬ−ラクテート脱水素化酵素（Ｌ−lactatede hydrogenase）によってピルベートに転換されながら細胞内に伝達されるが、これは、ラクチルＣｏＡの生成を増加させようとする本発明の目的に適していない。したがって、本発明では、グルコースを利用してラクテートを生成し、これからラクチル−ＣｏＡを合成する経路を選択し、ラクチル−ＣｏＡの生成が増加するように、微生物の代謝経路を遺伝工学的に操作しようとする。
【００１４】
このために、本発明は、コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を製造し；上記変異微生物をグルコースまたはグルコースとヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養し；上記変異微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含むポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法を提供しようとする。
【００１５】
本発明の一態様において、上記コエンザイムＡ供与体は、アセチルコエンザイムＡであることができる。コエンザイムＡ供与体のうち、アセチルコエンザイムＡは、グルコースを利用してラクテートを合成する微生物の代謝経路中でコエンザイム供与体になることができる可能性が高い。
【００１６】
コエンザイムＡ供与体の１つであるアセチルコエンザイムＡの量を増加させるために、微生物のアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子またはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子を不活性化させるか、または、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子を増幅させることができる。上記遺伝子のうち２つ以上の遺伝子を不活性化または増幅させることによって、アセチルコエンザイムＡの量をさらに増加させることもできる。
【００１７】
ラクチルＣｏＡの生成のためにコエンザイムＡを提供することができるコエンザイムＡ供与体は、アセチルコエンザイムＡ以外にも、β−ケトアジピル−ＣｏＡ（β−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、γ−ブチロベタイニル−ＣｏＡ（γ−ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡ（（Ｒ）−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｓ）−メチル−マロニル−ＣｏＡ（（Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−ホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−トリホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、３、４−ジヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ（３−ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、４−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡのｃｉｓ−ジヒドロジオール誘導体（ｃｉｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、Δ２−エノイル−ＣｏＡ（Δ２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ジエノイル−ＣｏＡ（２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、３−ケトアシル−ＣｏＡ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２、３−ｄｅｈｙｄｒｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｄ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、脂肪アシルＣｏＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ＣｏＡ）、長鎖アシル−ＣｏＡ（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ＣｏＡ誘導体（ＣｏＡ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アセトアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、アセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ω−カルボキシアシル−ＣｏＡ（ω−ｃａｒｂｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ブチリル−ＣｏＡ（ｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、コエンザイム−Ａ−グループ（ＣｏＡ）、クマロイル−ＣｏＡ（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ）、クロトノベタイニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、クロトニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｄ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、デホスホ−ＣｏＡ（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、ホルミル−ＣｏＡ（ｆｏｒｍｙｌ−ＣｏＡ）、イソバレリル−ＣｏＡ（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、マロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｏ−スクシニルベンゾイル−ＣｏＡ（Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｂｅｎｚｏｙｌ−ＣｏＡ）、オキサリル−ＣｏＡ（ｏｘａｌｙｌ−ＣｏＡ）、パルミトイルＣｏＡ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡ（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ピメロイル−ＣｏＡ（ｐｉｍｅｌｏｙｌ−ＣｏＡ）、プロピオニル−ＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、スクシニル−ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−デカジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２−デセノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２−ｄｅｃｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ ＣｏＡ）などが利用されることができる。コエンザイムＡ供与体としてアセチルコエンザイムＡ以外のものを利用する場合、これらのコエンザイムＡ供与体の量の増加のために、上記不活性化または増幅される遺伝子の種類が変化することができる。
【００１８】
これと同時に、微生物の代謝フロー中にラクテートの量を増加させるために、微生物のホスホエノールピルベート（phosphoenolpyruvate）の消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子を不活性化させるか、または、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子を増幅させることができる。上記遺伝子のうち２つ以上の遺伝子を不活性化または増幅させることによって、ラクテートの量をさらに増加させることもできる。一般的に嫌気条件でブドウ糖から生成される細胞内ラクテートを利用するためには、まず、細胞成長のために好気条件で充分に成長させた後、ラクテート生成のために嫌気条件またはマイクロ嫌気条件に変更させなければならないが、上記のようにラクテートの量が増加するように遺伝子を操作する場合には、１段階培養だけでも細胞成長とともに細胞内ラクテートを利用した高分子生産が同時に達成されることができる効率的な生産システムを構築することができるようになる。
【００１９】
本発明において、上記微生物は、ポリラクテートまたはその共重合体を合成することができる微生物であれば、いずれのものでも使用可能である。このような微生物としては、バクテリア、酵母、かびなどが含まれることができる。上記バクテリアとしては、例えば、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バシルロス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが含まれることができる。これらに限定されるものではないが、本発明の一態様において、上記バクテリアは、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよい。本発明の一実施例では、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを遺伝工学的に操作した変異大膓菌を開示するが、本発明の微生物は、これに限定されない。
【００２０】
本発明の一態様において、上記アセテートの生成経路に関与する酵素は、例えば、アセテートキナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｃｋＡであってもよい。
【００２１】
本発明の一態様において、上記エタノールの主要生成経路に関与する酵素は、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｄｈＥであってもよい。
【００２２】
本発明の一態様において、上記アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素は、例えば、アセチルコエンザイムＡ合成酵素であってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ａｃｓであってもよい。
【００２３】
本発明の一態様において、上記ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素は、例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ｐｐｃであってもよい。
【００２４】
本発明の一態様において、上記ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼであってもよく、上記酵素をコーディングする遺伝子は、ｌｄｈＡであってもよい。
【００２５】
本発明の他の態様において、上記変異微生物は、アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていてもよい。
【００２６】
本発明のさらに他の態様において、上記変異微生物は、アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていて、同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていてもよい。
【００２７】
本発明において、「不活性化」というのは、遺伝子が変異によって転写されないか、または、転写されたｍＲＮＡが本来のタンパク質に正確に翻訳されないことを言う。遺伝子を「不活性化」させるためには、遺伝子を欠失させるか、または、遺伝子の核酸配列に変化を起こして変異させることができる。
【００２８】
本発明において、「増幅」というのは、遺伝子の発現量が本来の発現量より増加したことを言う。変異させる前の微生物に増幅させようとする遺伝子が存在しない場合には、１つ以上の上記遺伝子を上記微生物に導入して増幅させることができ、変異させる前の微生物に増幅させようとする遺伝子が存在する場合には、同じ方法で１つ以上の遺伝子を上記微生物に追加に導入するか、または、既存に存在する遺伝子の発現量が増加するように遺伝工学的に操作することができる。例えば、発現を増幅させる遺伝子が変異させようとする微生物内に存在する場合、上記遺伝子の発現を作動させる固有のプロモータを強力プロモータに置換することによって、上記遺伝子の発現を増幅させることができる。したがって、本発明の一態様において、上記遺伝子の増幅は、固有プロモータ（native promoter）の強力プロモータ（strong promoter）への置換によるものであることができる。このような強力プロモータの例としては、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータなどが含まれる。
【００２９】
上記変異微生物は、ピルベートが増加するように追加に操作されることができる。ピルベートは、コエンザイムＡ供与体の１つであるアセチルコエンザイムＡとラクテートの共通的な前具体として、ピルベートが増加すればアセチルコエンザイムＡとラクテートの量が増加するようになる。したがって、本発明のさらに他の態様において、上記変異微生物は、ピルベートが増加するように追加に１つ以上の下記遺伝子が追加に弱化または不活性化されていてもよい：ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｐｃ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ、ｐｆｌＢなど。例えば、ピルベートをアセチルコエンザイムＡに転換させるピルベート脱水素化酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡまたはピルベートをポルメートに転換させるピルベートポルメートリアーゼをコーディングする遺伝子であるｐｆｌＢを弱化または不活性化させれば、ピルベートが増加し、且つアセチルコエンザイムＡとラクテートの量が増加するようになる。また、マレートをオキサロアセテートに転換させるマレート脱水素化酵素をコーディングする遺伝子であるｍｄｈを弱化または不活性化させることによって、マレートからピルベートへの代謝フローを強化させることができる。これとは異なって、ピルベートの前具体であるホスホエノールピルベートを消耗しながらブドウ糖を取り込む役目をするホスホトランスフェラーゼ酵素群の１つをコーディングする遺伝子であるｐｔｓＧ、または、ブドウ糖からピルベートに転換される当該過程中にグリセルアルデヒド３−フォスフェートをジヒドロキシアセトンフォスフェートに転換させるトリオースフォスフェート異性化酵素をコーディングする遺伝子であるｔｐｉＡを弱化または不活性させることによって、ピルベートへの代謝フローを増加させることもできる。
【００３０】
上記変異微生物をグルコースを含む培地で培養すれば、微生物からポリラクテートを収得することができ、上記変異微生物をグルコース及びヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養すれば、微生物からヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を収得することができる。培地に含ませるヒドロキシアルカノエートの種類によって収得されるヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の種類は変わることができる。
【００３１】
本発明の一態様において、上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（（Ｄ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシプロピオン酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシ吉草酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘキサン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘプタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシオクタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシデカン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシ吉草酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシヘキサン酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシドデカン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｃｉｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｔｒａｎｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｎｏｎｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｚｅｌａｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｂｅｎｚｉｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ａｃｅｔｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ａｃｅｔｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（３、１２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４、５−ｅｐｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６、７−ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８、９−ｅｐｏｘｙ−５、６−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（７−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（９−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｈｌｏｒｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｃｈｌｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｂｒｏｍｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｂｒｏｍｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２、６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１つ以上のものであることができる。
【００３２】
本発明の一実施例では、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを遺伝工学的に操作し、ポリ（Ｄ−ラクテート）とラクテート含量が高いポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−Ｄ−ラクテート）を効率的に生産する方法について開示している。本発明の方法によれば、その他のの多様なポリ（ヒドロキシアルカノエート−ラクテート）を製造することが可能である。
【００３３】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下に開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現され、ただ本実施例は、本発明の開示が完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【００３４】
実施例１：ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の製作
下記実施例１では、膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおいてアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｋＡまたはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるａｄｈＥを不活性化させるか、アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子であるａｃｓを増幅させると同時に、ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるｐｐｃを不活性化させるか、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子であるｌｄｈＡを増幅させ、上記のように変異させた大膓菌をＰＨＡ合成酵素の遺伝子とプロピオニル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼの遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換することによって、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に生産する変異大膓菌を製造した。図１は、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡ遺伝子を不活性化または増幅させて、ポリラクテートとその共重合体生成能を高めた変異微生物の内部代謝経路を示すものである。
【００３５】
実施例１−１：アセチル−ＣｏＡ及びラクテートの量が増加した変異微生物の製作
１−１−１：ａｃｋＡ、ａｄｈＥまたはｐｐｃ遺伝子の欠失
大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において下記プライマーでｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ方法（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ６；９７（１２）：６６４０−６６４５、２０００）を利用して、ａｃｋＡ、ａｄｈＥまたはｐｐｃを欠失させた。
【００３６】
ａｃｋＡ遺伝子の欠失のために、ｐＭｌｏｃＸベクター［Ｌｅｅ Ｋ．Ｈ．， Ｐａｒｋ Ｊ．Ｈ．， Ｋｉｍ Ｔ．Ｙ．， Ｋｉｍ Ｈ．Ｕ． ＆ Ｌｅｅ Ｓ．Ｙ．， Ｓｙｓｔｅｍｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ３， １４９（２００７）］を鋳型にして配列番号１及び３のプライマーで１次ＰＣＲを行った。この時、得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２及び４のプライマーを使用して２次プライマー延長ＰＣＲを行った。２次ＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ切片を獲得し、ラムダレッドリコンビナーゼ（λ−red recombinase）が発現されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株のコンピテント細胞（electroporation-competent cell）にエレクトロポレーション（electroporation）し、ａｃｋＡ遺伝子欠失突然変異菌株を製作した。ａｃｋＡ遺伝子欠失の確認のために、配列番号５及び６のプライマーでコロニーＰＣＲを行った。
【００３７】
また、ｐｐｃ遺伝子の欠失のために、同じ方法で配列番号７及び９、８及び１０のプライマーが順次に使用され、欠失の確認のために、配列番号１１及び１２のプライマーが使用された。
【００３８】
また、ａｄｈＥ遺伝子の欠失のために、同じ方法で配列番号１３及び１５、１４及び１６のプライマーが順次に使用され、欠失の確認のために、配列番号１７及び１８のプライマーが使用された。
【００３９】
１−１−２：ａｃｓまたはｌｄｈＡ遺伝子の増幅
上記１−１−１に記述したように、ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ方法（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ６；９７（１２）：６６４０−６６４５， ２０００）を利用して、ａｃｓとｌｄｈＡの大膓菌染色体ＤＮＡ上の各々の固有プロモータを強力プロモータの１つであるｔｒｃプロモータに置換させて増幅した。
【００４０】
ａｃｓ遺伝子の固有プロモットーのｔｒｃプロモータへの置換のために、ｐＭｌｏｘＣベクターを鋳型にして配列番号１９及び２２のプライマーで１次ＰＣＲを行い、この時、得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２０及び２３のプライマーで２次ＰＣＲを行った。２次ＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ切片を鋳型にして配列番号２１及び２４のプライマーで３次ＰＣＲを行い、最後のＤＮＡ切片を獲得した。これをラムダレッドリコンビナーゼ（λ−red recombinase）が発現されたＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株のコンピテント細胞（electroporation-competent cell）にエレクトロポレーション（electroporation）し、ａｃｓ遺伝子の固有プロモータがｔｒｃプロモータに置換された突然変異菌株を製作した。ａｃｓ遺伝子のプロモータ置換を確認するために、配列番号２５及び２６のプライマーでコロニーＰＣＲを行った。
【００４１】
また、ｌｄｈＡ遺伝子の固有遺伝子のｔｒｃプロモータへの置換のために、同じ方法で配列番号２７及び３０、２８及び３１、２９及び３２のプライマーが順次に使用され、置換の確認のために、配列番号３３及び３４のプライマーが使用された。
【００４２】
１−１−３：ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡが不活性化または増幅された変異微生物の製造
上記１−１−１または１−１−２の過程を通じて、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ａｃｓ、ｐｐｃまたはｌｄｈＡが様々な組合で不活性化または増幅された変異微生物ＪＬＸ１−９を製作した。
【００４３】
表１は、上記方法で製作された大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ由来の突然変異菌株の染色体ＤＮＡ特徴を示すものである。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例１−２：ＰＨＡ合成酵素の遺伝子とプロピオニル−ＣｏＡ−トランスフェラーゼの遺伝子を含む組み換えベクターの製作
１−２−１．ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組み換えベクターの製作
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ １１０２７ＢＰ）由来のＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-Jin Song，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＫＡＩＳＴ， ２００４）に基づく配列番号３５及び３６の塩基配列を有するプライマーを製作し、ＰＣＲを行い、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を収得した。ＰＣＲ反応物をアガロスゲル電気泳動し、ｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐサイズの遺伝子切片を確認した。
【００４６】
ｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９合成酵素の発現のために単量体供給酵素と合成酵素が一緒に発現されるオペロン形態の常時的発現システムを導入した。
【００４７】
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．， １９９４， ４４：１３３７−１３４７）においてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４８】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ＆ｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモータによって常時的に発現され、大膓菌でも良好に作動すると知られている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．， １９９４， ４４：１３３７−１３４７）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６ ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で収得したｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４９】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位が各々両端に１つずつ含まれたｐｈａＣ１ Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換なしに除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び配列番号４２の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５０】
上記ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のＰＨＢ合成可否を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成が観察されなかった。
【００５１】
ＳＣＬ（short chain length）活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３ヶ所をアミノ酸配列配列分析を通じて探し出し、配列番号４３乃至４８のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用して下記表２のようなｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体を作った。
【００５２】
【表２】
【００５３】
これらの組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた。その結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ及びｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ＢｌｕｅにおいていずれもＰＨＢ生成を確認することができた。
【００５４】
すなわち、単量体供給酵素であるｐｈａＡＲＥとｐｈａＢＲＥによってグルコースから３ＨＢ−ＣｏＡが生成され、これを基質にしてｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００＆ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）がＰＨＢを合成したものである。
【００５５】
これに、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するためのプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼが一緒に発現されるオペロン形態の常時的発現されるシステムを構築するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用した。
【００５６】
ｃｐ−ｐｃｔは、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）の染色体ＤＮＡを配列番号４９及び配列番号５０のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用した。この時、元々野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ ｓｉｔｅをクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去した。また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号５１と５２の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５７】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含むｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ ＆ ｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組み換えベクターを製造した。
【００５８】
１−２−２．ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ５３２組み換えベクターの製作
ＣＰ−ＰＣＴの場合、大膓菌で高発現される場合、深刻な代謝障害を起こし、毒性を示すと知られているが、一般的に組み換えタンパク質発現に広く使用されるｔａｃプロモータやＴ７プロモータを使用したＩＰＴＧによる発現誘導システムでは、誘導体添加と同時に組み換え大膓菌がすべて死滅した。
【００５９】
したがって、ｌａｃｔｙｌ−ＣｏＡを効率的に提供することができるクロストリジウム・プロピオニカム由来プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（Clostridium propionicum propionate CoA transferase）変異体の開発が必要である。
【００６０】
このために、弱く発現されるが微生物成長によって持続的に発現される常時的発現システムを使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体の合成に成功した。
【００６１】
ｃｐ−ｐｃｔに無作為的突然変異（random mutagenesis）を導入するために、上記１−２−１で製作されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを鋳型にし、配列番号５３及び５４のプライマーを利用してＭｎ２＋が添加され、ｄＮＴＰｓの濃度差が存在する条件でＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを実施した。
【００６２】
その後、無作為的突然変異が含まれたＰＣＲ断片を増幅するために、上記配列番号５３及び５４のプライマーを利用して一般条件でＰＣＲした。
【００６３】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、野生型ｃｐ−ｐｃｔを除去した後、上記増幅された突然変異ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたライゲーションミックスを作り、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、〜１０＾５程度規模のＣＰ−ＰＣＴライブラリを製作した。
【００６４】
上記製作されたＣＰ−ＰＣＴライブラリは、高分子検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ １ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で３日間生育させた後、高分子生成可否を確認するスクリーニング作業を行い、〜８０余個体の候補を１次選定した。これら候補を高分子が生成される条件で４日間液体培養（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ １ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、３７℃）し、ＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析し、最終２個体を選定した。
【００６５】
上記製作されたＣＰ−ＰＣＴ変異体の突然変異位置を探すために、遺伝子塩基配列を分析した。その結果は、下記の表３の通りである。
【００６６】
【表３】
【００６７】
上記最終選別された突然変異体（ＣＰ−ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５１２， ＣＰ−ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５２２）を基本にさらに上記Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの方法で無作為的突然変異を行い、下記表４に示されたようなＣＰ−ＰＣＴ変異体５３１−５３６を得た。
【００６８】
【表４】
【００６９】
その後、ＣｐＰｃｔ５３２突然変異が含まれたＰＣＲ断片を増幅するために、上記配列番号５３及び５４のプライマーを利用して一般条件でＰＣＲした。上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、ＣＰＰＣＴ部分を除去した後、上記増幅されたＣｐＰｃｔ５３２ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたライゲーションミックスを作り、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを製造した。
【００７０】
１−２−３．ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２（ｐ４００−５３２）組み換えベクターの製作
ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用しないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用することができるＰＨＡ合成酵素が非常に重要であると言える。これより、本発明者らは、シュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体を高効率で製造することができるシステムを発明した。
【００７１】
上記１−２−１で製作されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を基礎にして配列番号５５及び５６のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用してＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９４００）を製作した。
【００７２】
これから得た組み換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２）をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換させ、これを３ＨＢが含まれた重合体検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、重合体生成を確認することができた。
【００７３】
１−２−４．ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２（ｐ３１０−５３２）組み換えベクターの製作
ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用しないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成する時には、合成効率が非常に低いため、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用することができるＰＨＡ合成酵素が非常に重要であると言える。これより、上記１−２−１で製作されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を基礎にして配列番号５７及び５８、５９、６０のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用してＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３１０）を製作した。
【００７４】
これから得た組み換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２）をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換させ、これを３ＨＢが含まれた重合体検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、 ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、重合体生成を確認することができた。
【００７５】
１−３．ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の製作
実施例１−１で製作されたアセチル−ＣｏＡ及びラクテートの量が増加した変異微生物に上記実施例１−２−３及び１−２−４で製作されたｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２またはｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを導入することによって、ポリラクテートとポーリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）を効率的に生成する変異微生物を製作した。
【００７６】
上記変異微生物をテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びグルコース２０ｇ／Ｌが添加されたＬＢ平板培地で選別した。この形質転換菌株を１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３０℃で１２時間、前培養を行った。その後、蒸留水１リットル当たり２０ｇのグルコース、６．６７ｇのＫＨ２ＰＯ４、４ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇのクエン酸、０．８ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＬのｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（蒸留水１リットル当たり１０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇのＣａＣｌ２、２．２５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの３５％ＨＣｌを含む）の成分があり、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整した１００ｍＬの培地を含む２５０ｍＬフラスコに上記前培養液１ｍＬをテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びチアミン１０μｇ／ｍＬとともに接種し、３０℃で２００ｒｐｍで７２時間乃至９６時間培養した。この時、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）共重合体の生成のために、培養初期にＤＬ−３−ヒドロキシブチレートナトリウム塩（ＡＣＲＯＳ）２ｇ／Ｌを一回乃至二回供給した。突然変異菌株のうちｐｐｃ遺伝子の欠失に起因して細胞成長が難しい菌株を培養するためにスクシネート４ｇ／Ｌが添加された。また、ｔｒｃプロモータに置換されたｌｄｈＡ及びａｃｓ遺伝子の発現のために、ＯＤ６００ ０．５程度に１ｍＭのＩＰＴＧが添加された。
【００７７】
培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で３回洗浄した後、１００℃の乾燥器で２４時間乾燥し、乾燥した菌体のうち一部を採取し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析を行うことによって、細胞内合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量を測定した。分析に使用された標準物質は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体（これらのうち３ＨＶの含量は重量比で約１２％）及びポリラクテートホモポリマーであった。上記代謝操作によってＰＬＡホモポリマーの３〜１０ｗｔ％程度の生成が可能になり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の生成は、高分子内のＬＡ分率が１．７〜４．３倍増加し、高分子含量が１．４〜２７．３倍増加する優れた改善効果を示した。
【００７８】
実施例２：ポリラクテートと３−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を効率的に生成する変異微生物の培養体積条件による高分子生成能比較
フラスコ培養において、培養条件とこれによるラクテート生成程度が微生物の細胞成長（バイオマス）とＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）生成に及ぼす影響を調べるために、培養体積を異ならしめて培養することにした。このために、２５０ｍＬフラスコに５０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬの培地を入れ、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株を培養した。上記ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株は、大膓菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの代謝フローを操作しないまま、ｐＰｓ６１９Ｃ１４００−ＣＰＰＣＴ５３２ベクターを導入した菌株である。
【００７９】
下記表５は、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株の培養体積条件による高分子生成結果を示すものである。
【００８０】
【表５】
【００８１】
予想の通り、培地体積が増加するにつれて、相対的に（マイクロ）嫌気条件が形成されながら細胞成長は弱化し、これにより、高分子含量は、約１．５倍増加した。また、（マイクロ）嫌気条件によるラクテートの生成が増加しながら高分子内のラクテート分率は、２．２倍程度増加した。
【００８２】
これを基盤にして代謝的に操作された本発明の変異微生物ＪＬＸ７／ｐ４００−５３２の効果を確認するために、培養体積を５０ｍＬ、１００ｍＬにしてフラスコ培養を施行した。
【００８３】
下記表６は、ＸＢ／ｐ４００−５３２菌株と本発明の変異微生物ＪＬＸ７／ｐ４００−５３２の培養体積条件による高分子生成結果を示したものである。
【００８４】
【表６】
【００８５】
５０ｍＬの培養体積で培養した時、宿主菌株としてＸＢ／ｐ４００−５３２を使用した場合と比較して、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量は、１．２４倍増加し、高分子濃度も１．９８倍増加した。また、高分子内のラクテート（ＬＡ）分率が１４．３２ｍｏｌ％から４９．５５ｍｏｌ％と約３．４６倍増加した。１００ｍＬの培養体積で培養した時、宿主菌株としてＸＢ／ｐ４００−５３２を使用した場合と比較して、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）含量は、１．６２倍増加し、高分子濃度も２．９８倍増加した。高分子内のＬＡ分率も４０．４５ｍｏｌ％から６３．９５ｍｏｌ％と１．５８倍増加した。
【００８６】
ＰＬＡ共重合体内のＬＡ分率が高分子物性において重要な影響を及ぼすので、ＬＡ分率の増大及び調節は、菌株改良において重要な部分である。
【００８７】
５０ｍＬの培養体積で培養した時、ＬＡ分率が１４．３２ｍｏｌ％から４９．５５ｍｏｌ％と約３．４６倍増加したのに対し、１００ｍＬの培養体積で培養した時は、４０．４５ｍｏｌ％から６３．９５ｍｏｌ％と１．５８倍増加する、相対的に増加幅が低い結果を示したが、ＬＡ分率の絶対値は、最も高い値（６３．９５ｍｏｌ％）を示した。言い換えれば、５０ｍＬの培養場合、その増加幅は、相対的に高いが５０ｍｏｌ％水準であって、１００ｍｌ培養での値（６３．９５ｍｏｌ％）を超えなかった。これは、遺伝子水準での代謝工学とともに培養条件もＰＬＡとその共重合体生産において最適化しなければならない調節因子であることを意味する。
【００８８】
実施例３：変異遺伝子の組合による変異微生物の高分子生成能比較
本発明の変異微生物に適用された遺伝的突然変異の組合が高分子生成能増加に及ぼす効果を確認した。
【００８９】
上記場合のように、基本培地は、ＭＲ培地に炭素源としてグルコース２０ｇ／Ｌ、マーカーとしてテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びチアミン１０μｇ／ｍＬを供給した。また、培養初期にＤＬ−３−ヒドロキシブチレートナトリウム塩（ＡＣＲＯＳ）２ｇ／Ｌを１回（ｐ３１０−５３２の場合、Ｍ２０）乃至２回（ｐ４００−５３２の場合、−Ｍ１８）供給し、３０℃で２００ｒｐｍで７２時間培養した。
【００９０】
宿主菌株としてＸＢ、ＪＬＸ１菌株を使用した場合は、追加事項なしに上記培養条件のまま培養し、ＪＬＸ３、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を使用した場合には、ｐｐｃ遺伝子の欠失による細胞成長阻害を補完するために、スクシネート４ｇ／Ｌを培養初期に追加に供給した。ＪＬＸ２、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を使用した場合は、ｐｔｒｃ−ｌｄｈＡまたはｐｔｒｃ−ｌｄｈＡとｐｔｒｃ−ａｃｓの発現を誘導するために、ＯＤ６００ ０．５程度に１ｍＭ ＩＰＴＧを供給した。
【００９１】
下記表７は、ＸＢ野生型及び表１のＪＬＸ１、ＪＬＸ２、ＪＬＸ３、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７菌株を宿主菌株にしてｐ４００−５３２ベクターを各々導入した変異微生物の高分子生成能を示したものである。
【００９２】
【表７】
【００９３】
また、下記表８は、ＸＢ野生型及び表１のＪＬＸ１、ＪＬＸ２、ＪＬＸ３、ＪＬＸ４、ＪＬＸ５、ＪＬＸ６、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８菌株を宿主菌株にしてｐ３１０−５３２ベクターを各々導入した変異微生物の高分子生成能を示したものである。
【００９４】
【表８】
【００９５】
ポリマーの生成は、宿主菌株の代謝フローとポリマー生成に直接的に影響を及ぼす酵素の活性すべてによって影響を受ける。したがって、表７及び表８から明らかなように、同じ宿主細胞であるとしても、適用された酵素活性によって生成されるポリマー内ＬＡ分率、ポリマー含量などが変わることが分かり、それにもかかわらず、全般的に、ＪＬＸ５、ＪＬＸ７またはＪＬＸ８菌株の場合、高分子生成能が常に優れていることが分かった。
【００９６】
実施例４：３−ヒドロキシブチレートの供給量による高分子生成能比較
ＰＬＡ単一重合体とラクテート（ＬＡ）含量が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の生合成のために、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）供給量を調節し、その生成能を調べた。
【００９７】
表９は、宿主菌株としてＸＢ野生型及びＪＬＸ７菌株を使用し、ｐ４００−５３２ベクターを導入した時、３ＨＢ供給量（０、０．５、１、２、４、８ｇ／Ｌ）による高分子生成能を示したものである。
【００９８】
【表９】
【００９９】
表１０は、宿主菌株としてＸＢ野生型及びＪＬＸ７、ＪＬＸ８、ＪＬＸ９菌株を使用し、ｐ３１０−５３２ベクターを導入した時、３ＨＢ供給量（０、０．５、１、２、４ｇ／Ｌ）による高分子生成能を示したものである。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
ｐ４００−５３２とｐ３１０−５３２の場合、いずれも、宿主細胞がＸＢ野生型の場合は、ＰＬＡホモポリマーと５０ｍｏｌ％以上のＬＡを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体を生成しないのに対し、ＪＬＸ７、ＪＬＸ８、またはＪＬＸ９の場合、ＰＬＡホモポリマーを３〜１０ｗｔ％生成することができ、５０〜８６ｍｏｌ％水準のＬＡを有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体を１３〜６５ｗｔ％生成することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を製造し、
上記変異微生物をグルコースまたはグルコースとヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養し、
上記変異微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含むことを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。
【請求項２】
上記コエンザイムＡ供与体が、アセチルコエンザイムＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、β−ケトアジピル−ＣｏＡ（β−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、γ−ブチロベタイニル−ＣｏＡ（γ−ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡ（（Ｒ）−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｓ）−メチル−マロニル−ＣｏＡ（（Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−ホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−トリホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、３、４−ジヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ（３−ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、４−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡのｃｉｓ−ジヒドロジオール誘導体（ｃｉｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、Δ２−エノイル−ＣｏＡ（Δ２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ジエノイル−ＣｏＡ（２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、３−ケトアシル−ＣｏＡ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２、３−ｄｅｈｙｄｒｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｄ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、脂肪アシルＣｏＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ＣｏＡ）、長鎖アシル−ＣｏＡ（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ＣｏＡ誘導体（ＣｏＡ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アセトアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、アセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ω−カルボキシアシル−ＣｏＡ（ω−ｃａｒｂｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ブチリル−ＣｏＡ（ｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、コエンザイム−Ａ−グループ（ＣｏＡ）、クマロイル−ＣｏＡ（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ）、クロトノベタイニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、クロトニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｄ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、デホスホ−ＣｏＡ（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、ホルミル−ＣｏＡ（ｆｏｒｍｙｌ−ＣｏＡ）、イソバレリル−ＣｏＡ（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、マロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｏ−スクシニルベンゾイル−ＣｏＡ（Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｂｅｎｚｏｙｌ−ＣｏＡ）、オキサリル−ＣｏＡ（ｏｘａｌｙｌ−ＣｏＡ）、パルミトイルＣｏＡ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡ（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ピメロイル−ＣｏＡ（ｐｉｍｅｌｏｙｌ−ＣｏＡ）、プロピオニル−ＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、スクシニル−ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−デカジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２−デセノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２−ｄｅｃｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）及びラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ ＣｏＡ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子またはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されているか、アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
上記変異微生物が、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されているか、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
上記変異微生物が、バクテリア、酵母及びかびよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
上記バクテリアは、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バシルロス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属よりなる郡から選択されることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
上記バクテリアは、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
上記アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子がａｃｋＡであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項９】
上記エタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子がａｄｈＥであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項１０】
アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子がａｃｓであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子がｐｐｃであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項１２】
ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子がｌｄｈＡであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項１３】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていて、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１５】
上記遺伝子の発現の増幅は、固有プロモータ（native promoter）の強力プロモータ（strong promoter）への置換により行われることを特徴とする請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項１６】
上記強力プロモータは、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ及びｌａｃプロモータよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
上記変異微生物は、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ及びｐｆｌＢよりなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子が追加に弱化または不活性化されていることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
上記ヒドロキシアルカノエートは、
３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（（Ｄ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシプロピオン酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシ吉草酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘキサン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘプタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシオクタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシデカン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシ吉草酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシヘキサン酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシドデカン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｃｉｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｔｒａｎｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｎｏｎｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｚｅｌａｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｂｅｎｚｉｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ａｃｅｔｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ａｃｅｔｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（３、１２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４、５−ｅｐｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６、７−ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８、９−ｅｐｏｘｙ−５、６−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（７−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（９−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｈｌｏｒｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｃｈｌｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｂｒｏｍｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｂｒｏｍｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２、６− ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１】
コエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成の増加のためにコエンザイムＡ供与体及びラクテートの生成経路に関与する１つ以上の遺伝子が遺伝工学的に操作されている変異微生物を製造し、
上記変異微生物をグルコースまたはグルコースとヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養し、
上記変異微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含むことを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。
【請求項２】
上記コエンザイムＡ供与体が、アセチルコエンザイムＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、β−ケトアジピル−ＣｏＡ（β−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、γ−ブチロベタイニル−ＣｏＡ（γ−ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡ（（Ｒ）−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、（Ｓ）−メチル−マロニル−ＣｏＡ（（Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−ホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、２’−（５’’−トリホスホリボシル）−３’−デホスホ−ＣｏＡ（２’−（５’’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）−３’−ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、３、４−ジヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ（３−ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、４−ヒドロキシフェニルアセチル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡのｃｉｓ−ジヒドロジオール誘導体（ｃｉｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、Δ２−エノイル−ＣｏＡ（Δ２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ジエノイル−ＣｏＡ（２−ｔｒａｎｓ−４−ｃｉｓ−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、３−ケトアシル−ＣｏＡ（３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−３−エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−３−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｃｉｓ−２、３−デヒドロアシル−ＣｏＡ（ｃｉｓ−２、３−ｄｅｈｙｄｒｏａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｄ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、脂肪アシルＣｏＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ＣｏＡ）、長鎖アシル−ＣｏＡ（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−Δ２−Δ４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ＣｏＡ誘導体（ＣｏＡ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、アセトアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、アセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ω−カルボキシアシル−ＣｏＡ（ω−ｃａｒｂｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、アシル−ＣｏＡ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）、ブチリル−ＣｏＡ（ｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、コエンザイム−Ａ−グループ（ＣｏＡ）、クマロイル−ＣｏＡ（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ）、クロトノベタイニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｏｂｅｔａｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、クロトニル−ＣｏＡ（ｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｄ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｄ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、デホスホ−ＣｏＡ（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ−ＣｏＡ）、ホルミル−ＣｏＡ（ｆｏｒｍｙｌ−ＣｏＡ）、イソバレリル−ＣｏＡ（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌ−ＣｏＡ）、Ｌ−カルニチニル−ＣｏＡ（Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、マロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、Ｏ−スクシニルベンゾイル−ＣｏＡ（Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｂｅｎｚｏｙｌ−ＣｏＡ）、オキサリル−ＣｏＡ（ｏｘａｌｙｌ−ＣｏＡ）、パルミトイルＣｏＡ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ ＣｏＡ）、フェニルアセチル−ＣｏＡ（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）、ピメロイル−ＣｏＡ（ｐｉｍｅｌｏｙｌ−ＣｏＡ）、プロピオニル−ＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ）、スクシニル−ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−デカジエノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２、ｃｉｓ−Δ４−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）、ｔｒａｎｓ−Δ２−デセノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−Δ２−ｄｅｃｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ）及びラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ ＣｏＡ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子またはエタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されているか、アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
上記変異微生物が、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されているか、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
上記変異微生物が、バクテリア、酵母及びかびよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
上記バクテリアは、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、バシルロス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属よりなる郡から選択されることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
上記バクテリアは、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
上記アセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子がａｃｋＡであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項９】
上記エタノールの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子がａｄｈＥであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項１０】
アセテートをアセチルコエンザイムＡに再転換する酵素をコーディングする遺伝子がａｃｓであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記ホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子がｐｐｃであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項１２】
ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子がｌｄｈＡであることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項１３】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
上記変異微生物が、コエンザイムＡ供与体の生成の増加のためにアセテートの生成経路に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、アセテートをアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に再転換する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていて、ラクテートの生成の増加のためにホスホエノールピルベートの消耗反応に関与する酵素をコーディングする遺伝子が不活性化されていて、ピルベートからラクテートへの転換に関与する酵素をコーディングする遺伝子が増幅されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項１５】
上記遺伝子の発現の増幅は、固有プロモータ（native promoter）の強力プロモータ（strong promoter）への置換により行われることを特徴とする請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項１６】
上記強力プロモータは、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ及びｌａｃプロモータよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
上記変異微生物は、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｔｐｉＡ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｅｐｔＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＢ、ｐｔｓＧ、ｍｄｈ、ｐｇｉ、ｇｌｇＣ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｒｉｂＡ、ｆｏｌＥ及びｐｆｌＢよりなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子が追加に弱化または不活性化されていることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
上記ヒドロキシアルカノエートは、
３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（（Ｄ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシプロピオン酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシ吉草酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘキサン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシヘプタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシオクタン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−ヒドロキシデカン酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシ吉草酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、５−ヒドロキシヘキサン酸（５−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシドデカン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｃｉｓ−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｈｅｘｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｔｒａｎｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｎｏｎｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｉｓ−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｍｅｔｈｙｌｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｍｅｔｈｙｌｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｃｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｚｅｌａｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｂｅｒｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｍｅｌｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｅｂａｃｉｃ ａｃｉｄ−ｂｅｎｚｉｌｅｓｔｅｒ）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ａｃｅｔｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ａｃｅｔｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（ｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｃｙａｎｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（３、１２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（３、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４、５−ｅｐｏｘｙｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６、７−ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８、９−ｅｐｏｘｙ−５、６−ｃｉｓ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（７−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（９−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｃｈｌｏｒｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｃｈｌｏｒｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｂｒｏｍｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｂｒｏｍｏｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１１−ｂｒｏｍｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｄｏｄｅｃｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２、６− ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５２５８０７（Ｐ２０１１−５２５８０７Ａ）
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６１２４（Ｐ２０１１−５１６１２４）
【出願日】平成２１年６月２４日（２００９．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３３８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５７７０２
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【出願人】（５００１９２４７０）コリア・アドヴァンスド・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２４日（２００９．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３３８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５７７０２
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【出願人】（５００１９２４７０）コリア・アドヴァンスド・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (12)
【Ｆターム（参考）】
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