マイクロインジェクション装置
【課題】キャピラリ針の内径の製造ばらつきや、導入物質の組み合わせを考慮し、吐出較正の許容範囲を広げること。
【解決手段】マイクロインジェクション装置１００が、蛍光試薬を混入した目的物の画像を所定の露光時間で撮影し、撮影した画像から最大輝度値を取得し、当該最大輝度値が所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に調整することで、所定範囲内の輝度値を含んだ画像を取得し、吐出較正に使用する輝度値を正確に取得する。
【解決手段】マイクロインジェクション装置１００が、蛍光試薬を混入した目的物の画像を所定の露光時間で撮影し、撮影した画像から最大輝度値を取得し、当該最大輝度値が所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に調整することで、所定範囲内の輝度値を含んだ画像を取得し、吐出較正に使用する輝度値を正確に取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロインジェクション装置に関する。例えば、露光時間を調整することで、キャピラリ針と導入物質の組み合わせに起因する吐出較正の較正許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大するマイクロインジェクション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子や蛋白質等の生体分子や化合物（以下、単に導入物質とする）を細胞内に注入する際、マイクロインジェクション装置が使用されている。マイクロインジェクション装置には、導入物質と導入される細胞の組合せが自由という長所がある。
【０００３】
このマイクロインジェクション装置の長所に鑑みて、例えば、遺伝子を導入物質とする
人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）の作成や、蛋白質を導入物質とする機能解析や、化合物を導入物質とする薬物開発などへの応用が期待されている。
【０００４】
マイクロインジェクション装置は、微細な中空のガラス針（以下、キャピラリ針とする）を有し、このキャピラリ針の中に導入物質を充填した後、細胞に突き刺し、細胞内に導入物質を吐出することにより細胞内に注入する。
【０００５】
そして、マイクロインジェクション装置には、上述した使用目的から導入物質を定量的に吐出することが求められ、この要望に関し、以下に示すような技術が知られている。
【０００６】
まず、マイクロインジェクション装置が細胞内に吐出する量をサブピコリットル単位で定量制御する技術として、導入物質が充填されたキャピラリ針に、調整した空気圧を印加し、所定量の導入物質を細胞内に吐出するという技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
また、導入物質を細胞内に吐出させるための圧力と、キャピラリ針への導入物質の逆流を防止する圧力を用いて、所定量の導入物質を細胞内に吐出する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
さらに、蛍光試薬を導入物質に混合して、蛍光試薬が示す輝度値のデータに基づいて、導入物質を吐出する体積を調整し、調整した体積を吐出することで定量的な吐出を実現するという技術が知られている（特許文献３参照）。この技術に関して、以下詳細に説明する。
【０００９】
この場合、導入物質が吐出される体積Ｖは、キャピラリ針先端部内径をＤ、導入物質の粘度をμ、キャピラリ針に印加される吐出圧力をＰｉ、吐出圧力の持続時間をＴｉとして、以下に示す式（１）で表される。
【数１】
【００１０】
式（１）より、体積Ｖは、使用するキャピラリ針先端部内径と導入物質の粘度をパラメータとして、吐出圧力と吐出時間の積（以下、吐出パラメータとする）に比例することになり、比例定数をηとすると、式（２）と表される。なお、ηを吐出係数とする。
【数２】
【００１１】
したがって、吐出係数ηが分かれば、各吐出パラメータに対応する体積Ｖを求めることができ、導入物質を定量的に吐出することが可能となる。以下、蛍光試薬を用い、上述した式（２）のηを決定する過程、すなわち、「吐出較正」について説明する。
【００１２】
吐出較正の事前ステップとして、蛍光試薬の体積Ｖと、蛍光試薬が示す蛍光強度Ｉの関係を以下の図１９に示すマイクロインジェクション装置５０を使用して求める。ただし、吐出較正の事前ステップでは、シャーレには培地の代わりに表面張力の小さなパラフィンオイルまたはシリコンオイルを満たして使用する。このマイクロインジェクション装置５０について説明した後、体積Ｖと蛍光強度Ｉの関係について説明する。
【００１３】
なお、体積Ｖの単位は「ｐｌ：ピコリットル」で表され、蛍光画像全画素の輝度値の総和として定義される蛍光強度Ｉの単位は画素輝度値として以下説明する。
【００１４】
図１９は、従来のマイクロインジェクション装置を用いて行う吐出較正の事前ステップを説明するための図である。図１９に示したマイクロインジェクション装置５０は、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬をパラフィンオイル中に吐出する。パラフィンオイル中に吐出された蛍光試薬は、表面張力の関係から球形の蛍光液滴５０ｂを形成する。
【００１５】
次に、蛍光フィルタ５０ｆにより、蛍光試薬から発せられる波長以外の波長の光を除去し、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇにより、蛍光液滴５０ｂの蛍光画像を取得し、液滴の直径を計測することで蛍光液滴５０ｂの体積Ｖを求める。
【００１６】
そして、上述の蛍光画像から蛍光強度Ｉを求め、蛍光試薬の体積Ｖとの相関関係が、以下の図２０に示すグラフ５から求まる。図２０は、蛍光強度と体積との関係を示す図である。
【００１７】
図２０に示したＸ軸を蛍光強度Ｉ、Ｙ軸を体積Ｖとするグラフ５より、蛍光強度Ｉと体積Ｖの式（３）における比例定数α（試薬定数とする）が求まり、吐出較正のための事前ステップが完了する。なお、本ステップは、蛍光試薬毎に１回実施すればよい。
【数３】
【００１８】
次に、細胞に所望の物質を導入するインジェクション作業の直前に、使用するキャピラリ針と導入物質の組合せで実施する吐出較正について説明する。図２１は、キャピラリ針と導入物質の組合せ毎に実施する吐出較正を説明するための図である。
【００１９】
図２１に示すように、キャピラリ針５０ａから、吐出パラメータの値を変えて、蛍光試薬５０ｈの吐出を複数回行う。
【００２０】
このように、吐出較正を行う際に、導入物質を複数回吐出することを「テスト吐出」とする。このテスト吐出時には、蛍光試薬５０ｈに関する蛍光試薬データを入力する。
【００２１】
蛍光試薬データは、事前ステップで求められている試薬定数α、試薬定数を求めたときの蛍光試薬の濃度ρ０、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇの露光時間Ｔe０などである。なお、ρ０を基準濃度、Ｔｅ０を基準露光時間とする。
【００２２】
続いて、図２１にて吐出した蛍光試薬５０ｈが示す蛍光強度の測定について説明する。この蛍光強度は吐出ごとに取得される蛍光画像に基づいて測定される。具体的に図を用いて以下説明する。
【００２３】
図２２は、蛍光強度の取得について説明するための図である。図２２に示した背景画像２０は、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬５０ｈが吐出される前の画像を示し、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬５０ｈが吐出されると蛍光画像２１が取得される。
【００２４】
そして、背景画像２０と蛍光画像２１から差分画像２２を取得し、取得した差分画像２２における画素輝度Ｊｘｙの総和から蛍光強度Ｉを求める。この蛍光強度Ｉを算出する式を以下の式（４）に定める。
【数４】
【００２５】
そして、式（４）から求めた蛍光強度Ｉを使用して、吐出パラメータと蛍光強度の関係を求める。図２３は、吐出パラメータと蛍光強度の関係を説明するための図である。図２３のグラフのＸ軸は吐出パラメータＰｉ・Ｔｉ、Ｙ軸は蛍光強度Ｉである。
【００２６】
図２３に示されたグラフ１１より、蛍光強度Ｉと吐出パラメータＰｉ・Ｔｉの関係は、式（５）で表され、比例定数γが求まる。
【数５】
【００２７】
そして、式（３）と式（５）を組合せることで、上述した式（２）の吐出係数η＝αγが導かれ、吐出パラメータに対する体積Ｖが算出される。この吐出パラメータと体積Ｖの関係について説明する。図２４は吐出較正結果を示す図である。
【００２８】
図２４に示す吐出パラメータＰｉ・ＴｉをＸ軸、体積ＶをＹ軸にしたグラフ１２より、任意の吐出パラメータごとに体積Ｖが算出され、較正された吐出が可能となる。その結果、キャピラリ針５０ａから吐出される体積Ｖを任意に設定することができる。
【００２９】
なお、基準濃度ρ０と基準露光時間Ｔｅ０と式（２）の関係であるが、任意の濃度ρ、任意の露光時間Ｔｅの場合には、ρ０／ρと、Ｔｅ０／Ｔｅが示す各値に体積Ｖが比例することが一般的であるので、これらを右辺に乗じて計算すればよい。
【００３０】
続いて、これまで説明してきた吐出較正の流れについて説明する。図２５は、従来の吐出較正を示すフローチャートである。まず、実際に使用する蛍光試薬の濃度ρをマイクロインジェクション装置５０に入力する（ステップＳ５０）。
【００３１】
次に、あらかじめ求められ記憶されている蛍光試薬データをマイクロインジェクション装置５０が読込みを行う（ステップＳ５１）。そして、露光時間を所定のＴｅに設定する（ステップＳ５２）。
【００３２】
そして、吐出較正用の蛍光画像を取得し（ステップＳ５３）、取得した蛍光画像から各吐出パラメータに対応する体積Ｖを求める（ステップＳ５４）。そして、図２４に示したグラフ１２を一例とする吐出較正の結果を取得する（ステップＳ５５）。
【００３３】
次に、上述したステップＳ５３にて取得する蛍光画像と、取得した蛍光画像に含まれる輝度プロファイルについて説明する。図２６は、蛍光画像と輝度プロファイルを説明するための図である。
【００３４】
図２６に示した蛍光画像２３は、キャピラリ針５０ａと導入物質の組合せにより吐出体積Ｖが異なる場合に得られる蛍光画像の一例を示し、所定の露光時間Ｔｅで、撮影されたものとする。そして、蛍光画像２３から取得される輝度プロファイルが図示した輝度プロファイル３０〜３２になる。
【００３５】
輝度プロファイルとは、蛍光画像のＸ方向輝度分布（Ｙ座標は画面中央）で、図２６に示した例では、輝度プロファイル３０が最も大きな画素輝度を有し、輝度プロファイル３１、３２の順に画素輝度の最大値が小さくなる。
【００３６】
そして、図２６に示した輝度プロファイル３０〜３２が示す最大画素輝度は、図１９に示した高感度ＣＣＤカメラ５０ｇが示す上限Ｊｓ以下の値であり、蛍光画像２３から取得される最大画素輝度に基づいて、吐出較正が行われる。
【００３７】
なお、上限Ｊｓとは、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇが撮影できる最大画素輝度を示し、上限Ｊｓを超えた画素輝度は、飽和領域となり、飽和領域内に示される最大画素輝度は計測することができず、この場合、吐出較正に必要な蛍光強度を取得することが困難になる。
【００３８】
なお、図２６に示した輝度プロファイル３０〜３２に示したように、蛍光画像の輝度分布は、蛍光試薬の培地中への拡散より、基本的には、ほぼ２次元正規分布となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３９】
【特許文献１】特開２００７−３００８６８号公報
【特許文献２】特開２００８−８６２４２号公報
【特許文献３】特開２００７−２８９０８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
しかしながら、上述した従来の技術では、キャピラリ針の内径の製造ばらつきや、導入物質の組み合わせを考慮した場合に、吐出較正の許容範囲が狭く、柔軟に較正することができないという問題があった。
【００４１】
具体的に図を用いて説明する。図２７は、課題を説明するための図である。図２７に示した輝度プロファイル４０は、吐出体積Ｖが極端に小さく、画素輝度と背景ノイズとのＳＮ比が悪く、蛍光強度Ｉを計測する際に計測誤差が増大してしまう。
【００４２】
また、輝度プロファイル４１は、吐出体積Ｖが極端に大きく、真の輝度プロファイルの最大値が上限Ｊｓを超える飽和領域内に示されている。この場合、蛍光強度Ｉを正しく計測することができず、輝度プロファイル４０の場合と同様に正確な吐出較正が困難になってしまう。
【００４３】
このように、輝度プロファイルが示す最大値が、上限Ｊｓ未満で、かつ背景ノイズの影響を受けない範囲内の値でなければ、正確な吐出較正を行うことが困難であった。
【００４４】
開示の技術は、上記に鑑みてなされたものであって、キャピラリ針と導入物質の組み合わせに起因する吐出較正の較正許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大するマイクロインジェクション装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
本願の開示するマイクロインジェクション装置は、細胞内に注入する目的物に蛍光試薬を混入し、前記蛍光試薬を予め決められた露光時間で撮影して蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、前記蛍光画像から、最大画素輝度の輝度値を取得し、当該輝度値が所定範囲内に含まれるか否かを判定する判定部と、前記輝度値が前記所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に応じて前記予め決められた露光時間を調整する露光時間調整部とを有することを要件とする。
【発明の効果】
【００４６】
このマイクロインジェクション装置によれば、露光時間を調整することで、蛍光画像から取得される最大画素輝度を所定の範囲内に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１の概要を説明するための図である。
【図２】図２は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図３】図３は、定数テーブルの一例を示す図である。
【図４】図４は、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図５】図５は、実施例１に係る露光時間制御部の処理を示すフローチャートである。
【図６】図６は、実施例１の効果を説明するための図である。
【図７】図７は、吐出体積が極端に大きい場合を説明するための図である。
【図８】図８は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図９】図９は、蛍光画像と２次元正規分布をなす輝度分布を説明するための図である。
【図１０】図１０は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係について説明するための図である。
【図１１】図１１は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、実施例３に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図１４】図１４は、閾値画素数比と輝度分布の関係を説明するための図である。
【図１５】図１５は、σを任意に設定したときの飽和画素輝度について説明するための図である。
【図１６】図１６は、実施例３に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、実施例４に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例４に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、従来のマイクロインジェクション装置を用いて行う吐出較正の事前ステップを説明するための図である。
【図２０】図２０は、蛍光強度と体積の関係を示す図である。
【図２１】図２１は、キャピラリ針と導入物質の組合せ毎に実施する吐出較正を説明するための図である。
【図２２】図２２は、蛍光強度の取得について説明するための図である。
【図２３】図２３は、吐出パラメータと蛍光強度の関係を説明するための図である。
【図２４】図２４は、吐出較正結果を説明するための図である。
【図２５】図２５は、従来の吐出較正を説明するフローチャートである。
【図２６】図２６は、蛍光画像と輝度プロファイルを説明するための図である。
【図２７】図２７は、課題を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下に、本願の開示するマイクロインジェクション装置の実施例を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施例によりこの発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
まず、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の概要について説明する。本実施例１に示すマイクロインジェクション装置は、吐出較正時に、露光時間の調整を行う。
【００５０】
そして、露光時間を調整することで、蛍光画像から取得される輝度プロファイルの最大画素輝度の値に対し、上限Ｊｓを超えない所定値（以下、ＪＨＩＧＨとする）から背景ノイズの影響を受けない所定値（以下、ＪＬＯＷとする）の範囲に調整する。
【００５１】
具体的に図を用いて説明する。図１は実施例１の概要を説明するための図である。図１に示したマイクロインジェクション装置１００は、蛍光画像から取得される輝度プロファイル９０の最大画素輝度の値（単に、ＪＭＡＸとする）が上限Ｊｓに飽和している場合は、取得したＪＭＡＸを上限Ｊｓ未満の値（例えば、ＪＡとする）に調整し、調整したＪＡが蛍光画像から取得されるように露光時間を調整する。
【００５２】
一方、ＪＭＡＸが、背景ノイズの影響を受ける値である場合は、ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷが示す範囲内の値を有するようにＪＭＡＸを調整する。そして、調整したＪＭＡＸ（例えば、「ＪＡ」とする）が、蛍光画像から取得されるように露光時間を調整する。
【００５３】
このように、マイクロインジェクション装置が、露光時間を調整することで、輝度プロファイルが示す最大画素輝度をＪＨＩＧＨとＪＬｏｗによって規定される範囲内の値に調整することで、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【００５４】
なお、図１に示した最大画素輝度ＪＡが取得される露光時間を「最適な露光時間」として以下説明する。
【００５５】
次に、図１に示したマイクロインジェクション装置について説明する、図２は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図２に示したマイクロインジェクション装置１００は、吐出較正時に、露光時間を適切に調整することで、吐出較正用のデータを正確に取得し、取得したデータに基づいて導入物質を細胞内に吐出する。
【００５６】
そして、マイクロインジェクション装置１００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【００５７】
制御部１０１は、従来技術にて説明した式（２）に基づいて、所望の吐出体積Ｖより吐出パラメータＰｉ・Ｔｉを計算し、所望の体積Ｖの導入物質を吐出するようにキャピラリ針操作部１０２に命令する処理部である。
【００５８】
さらに、本実施例に密接に関連する機能として、制御部１０１は、吐出する導入物質とキャピラリ針１０３に対して吐出較正する際に、蛍光画像を取得する。そして、取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを算出し、算出したＪＭＡＸに基づいて、露光時間を調整する。
【００５９】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄとを有する。
【００６０】
記憶部１０１ａは、蛍光試薬に関する固有のデータ（蛍光試薬の種類、試薬定数α、基準濃度ρ０、基準露光時間Ｔｅ０）、吐出圧力Ｐｉと吐出圧力持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸを有している。
【００６１】
さらに、記憶部１０１ａは、上述した各種データに加えて定数テーブル１１１を有する。図３は、定数テーブルのデータ構造の一例を示す図である。
【００６２】
図３に示した定数テーブル１１１には、調整目標の上限ＪＨＩＧＨ、および、下限ＪＬＯＷが記憶されている。また、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ、および、ＴｅＬＯＷが記憶されている。
【００６３】
また、上述したように、ＪＨＩＧＨは上限Ｊｓを超えない所定値とし、ＪＬＯＷは背景ノイズの影響を受けない所定値とする。
【００６４】
図２の説明に戻り、吐出制御部１０１ｂについて説明する。吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａに記憶されている各種データに基づき、吐出する体積を制御する処理部である。
【００６５】
また、吐出較正時に、吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の露光時間Ｔｅを初期露光時間Ｔｅ１に設定し、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸにより吐出命令を出力する。なお、吐出圧力と吐出時間の積を吐出パラメータとして以下説明する。
【００６６】
画像取得部１０１ｃは、吐出較正時に蛍光画像を取得し、取得した画像を露光時間制御部１０１ｄに出力する手段である。この蛍光画像とは、高感度ＣＣＤカメラ１０６が撮影する画像である。一例として、図２６に示した蛍光画像２３が挙げられる。
【００６７】
露光時間制御部１０１ｄは、画像取得部１０１ｃから取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを算出し、算出したＪＭＡＸが、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲にある場合には、ＪＭＡＸを撮影した時間を最適な露光時間ＴｅＢとして決定する。
【００６８】
具体的には、図３に示した定数テーブル１１１を用いて説明する。まず、露光時間制御部１０１ｄは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得する。そして、取得した蛍光画像から従来の技術を用いてＪＭＡＸを算出する。
【００６９】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、定数テーブル１１１に記憶されているＪＨＩＧＨとＪＬＯＷを取得し、算出したＪＭＡＸと比較する。露光時間制御部１０１ｄは、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていないと判定した場合（ＪＭＡＸ＜ＪＨＩＧＨ）は、ＪＭＡＸとＪＬＯＷの値の比較を行う。
【００７０】
この場合、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸとＪＬＯＷを比較して、ＪＭＡＸがＪＬＯＷ未満でない場合（ＪＭＡＸ＞ＪＬＯＷ）、初期露光時間Ｔｅ１を最適な露光時間ＴｅＢとして決定する。
【００７１】
一方、露光時間制御部１０１ｄは、定数テーブル１１１から取得したＪＨＩＧＨと算出したＪＭＡＸを比較した結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていると判定した場合（ＪＭＡＸ＞ＪＨＩＧＨ）、初期露光時間Ｔｅ１に一定倍率（例えば、０．６５倍）を乗算し、乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【００７２】
その後、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定する。Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（Ｔｅ２＞ＴｅＬＯＷ）、吐出制御部１０１ｂは、露光時間ＴｅをＴｅ２に更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【００７３】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（Ｔｅ２＜ＴｅＬＯＷ）、吐出制御部１０１ｂは、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新しないで、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして吐出較正を中断する。
【００７４】
また、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸとＪＬＯＷを比較して、ＪＭＡＸがＪＬＯＷ未満である場合（ＪＭＡＸ＜ＪＬＯＷ）、初期露光時間Ｔｅ１に、Ｃ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算し、乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【００７５】
例えば、ＪＭＡＸ＝「５」、ＪＬＯＷ＝「１０」、ＪＨＩＧＨ＝「２０」、において、Ｃ１は「１５」となり、ＪＭＡＸとの比率から、初期露光時間Ｔｅ１を３倍した値がＴｅ２となる。この場合、露光時間Ｔｅ２にて撮影した場合、ＪＭＡＸは、「１５」となり、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値を有することになる。
【００７６】
そして、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えているか否かを判定する。Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（Ｔｅ２＞ＴｅＨＩＧＨ）、吐出制御部１０１ｂは、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新しないで、吐出体積Ｖが較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する。
【００７７】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２がＴｅＨＩＧＨ未満である場合（Ｔｅ２＜ＴｅＨＩＧＨ）、露光時間ＴｅをＴｅ２に更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【００７８】
このように、露光時間制御部１０１ｄは、算出したＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合には、ＪＭＡＸに対応する露光時間を０．６５倍し、ＪＬＯＷ未満である場合には、ＪＭＡＸに対応する露光時間にＣ１＝（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する。
【００７９】
また、算出したＪＭＡＸが、ＪＨＩＧＨ未満で、かつＪＬＯＷを超えている場合には、上述した処理は行わず、露光時間Ｔｅ１にて吐出を行う。このように、ＪＨＩＧＨ未満で、かつＪＬＯＷを超えているようなＪＭＡＸが取得できる蛍光画像を撮影する露光時間を最適な露光時間ＴｅＢとして以下説明する。
【００８０】
キャピラリ針操作部１０２は、吐出較正時には、制御部１０１から吐出較正の命令を受けて導入物質を吐出し、吐出較正後は、制御部１０１から出力されるデータに基づき、導入物質を吐出する。
【００８１】
キャピラリ針１０３は、キャピラリ針操作部１０２に取り付けられ、内部に充填されている導入物質を制御部１０１から出力されるデータに基づいて吐出される。
【００８２】
シャーレ１０４は、図２１に示した培地５０ｄを満たす容器を示し、顕微鏡１０５は、シャーレ上に拡散する導入物質を観察する装置である。
【００８３】
高感度ＣＣＤカメラ１０６は、映像素子を用いて光学的な画像を電子的な画像データに変換する装置であり、蛍光画像を撮影する。また、撮影時における露光時間は、制御部１０１によって制御される。
【００８４】
蛍光フィルタ１０７は、高感度ＣＣＤカメラ１０６により得られた蛍光画像から蛍光波長以外の波長の光を除去し、蛍光画像の映像素子上に結像させるフィルタである。
【００８５】
反射鏡１０８は、顕微鏡１０５が観察した状態を高感度ＣＣＤカメラ１０６へ向けて反射するための鏡であり、また、励起光源１１０から発せられる励起光をキャピラリ針１０３から吐出される導入物質に向けて反射する。
【００８６】
励起光源１１０は、蛍光物質を含む導入物質がキャピラリ針１０３の先端から吐出された際に、この導入物質に対して励起光を照射するための光源である。
【００８７】
次に、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００の処理について説明する。図４は、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。まず、実際に使用する蛍光試薬の濃度ρをマイクロインジェクション装置１００に入力する（ステップＳ９０）。
【００８８】
次に、あらかじめ求められ記憶されている蛍光試薬のデータをマイクロインジェクション装置１００が読込みを行う（ステップＳ９１）。そして、露光時間制御部１０１ｄが露光時間の調整を行う（ステップＳ９２）。
【００８９】
そして、ステップＳ１０２にて調整された露光時間が設定された後（ステップＳ９３）、吐出較正用のデータを取得する（ステップＳ９４）。その後、取得したデータに基づいて体積Ｖを計算する（ステップＳ９５）。そして、吐出較正の結果を取得する（ステップＳ９６）。
【００９０】
次に、実施例１で示した露光時間調整部１０１ｄの処理について説明する。図５は、実施例１に示す露光時間制御部の処理を示すフローチャートである。
【００９１】
マイクロインジェクション装置１００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ１００）。
【００９２】
そして、ステップＳ１００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ１０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ１０２）。
【００９３】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ１０３）。
【００９４】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ１０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ１０５）。
【００９５】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ１０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ１０６、Ｙｅｓ）、ステップＳ１０２にて設定した初期露光時間に一定倍率（例えば、０．６５倍）を乗算する（ステップＳ１０７）。
【００９６】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ１０７にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ１０８、Ｎｏ）、ステップＳ１０３に移行する。
【００９７】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ１０８、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ１０９）。
【００９８】
また、ステップＳ１０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ１０６、Ｎｏ）、ステップＳ１１０に移行し、ステップＳ１０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【００９９】
そして、比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ１１０、Ｎｏ）吐出制御部１０１ｂは、ステップＳ１０２にて設定した露光時間を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ１１４）。
【０１００】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ１１０、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ１０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ１１１）。
【０１０１】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ１１１にて算出された露光時間Ｔｅ２と、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを比較して、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ１１２、Ｎｏ）、ステップＳ１０３に移行する。
【０１０２】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ１１２、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ１１３）。
【０１０３】
このフローチャートによれば、露光時間制御部１０１ｄが、露光時間を調整することで、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【０１０４】
以上により、実施例１に示したマイクロインジェクション装置によれば、露光時間を調整することで、最大画素輝度をＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整することができる。具体的に図を用いて以下説明する。
【０１０５】
図６は、実施例１の効果を説明するための図である。図６の左側に示した例は、輝度プロファイルの最大値Ｊ０が上限Ｊｓを超えている場合で、最大画素輝度JＭＡＸは上限Ｊｓに等しくなっている。この場合、２回目のテスト吐出で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値に調整している。
【０１０６】
一方、図６の右側に示した例は、輝度プロファイルの最大画素輝度ＪＭＡＸが小さすぎて背景ノイズの影響を受けている。この場合も左側に示した場合と同様に２回目のテスト吐出で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値に調整している。
【実施例２】
【０１０７】
ところで、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００は、算出した最大画素輝度ＪＭＡＸが上限Ｊｓに等しくなる場合、１回のテスト吐出につき、０．６５倍の露光時間の引き下げを行っている。
【０１０８】
そのため、吐出体積が平均的なものより極端（例えば、１０倍以上）に大きいキャピラリ針の場合、１回のテスト吐出で０．６５倍の露光時間の引き下げしか行われない。
【０１０９】
このような場合、調整目標範囲内に最大画素輝度を調整するまでに５回以上のテスト吐出が必要となる。以下、具体的に図を用いて説明する。図７は、吐出体積が極端に大きい場合を説明するための図である。
【０１１０】
図７に示すように、１回目の輝度プロファイル９１の最大値Ｊ０が上限Ｊｓよりも極端に大きい場合において、２回目の吐出較正において０．６５倍しても、調整目標範囲内に最大画素輝度を有すことはない。
【０１１１】
結果として、調整目標の範囲内に到達するまでに５回以上のテスト吐出が必要となる。通常、吐出された導入物質が拡散して、蛍光画像全体にほぼ一様に分布するまでに待ち時間（約１０秒程度）が必要となることを考慮すると、テスト吐出を連続して５回行った場合、５回のテスト吐出には最低でも４０秒程度が必要となり、操作性や作業性を著しく損なってしまう。
【０１１２】
そこで、実施例２に示すマイクロインジェクション装置２００は、蛍光画像から図７に示した「飽和画素輝度Ｊ０」を算出する処理部を実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００に設けるものとする。
【０１１３】
なお、上述した「飽和画素輝度」とは、輝度プロファイルが示す最大値が、飽和領域に含まれている場合の真の最大画素輝度を示すものとし、これを「Ｊ０」として以下説明する。
【０１１４】
実施例２に示すマイクロインジェクション装置２００は、図２に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１１５】
図８は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図８に示したマイクロインジェクション装置２００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１１６】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、飽和画素輝度算出部１０１ｅとを有する。
【０１１７】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、飽和画素輝度の算出機能を有していることである。以下、飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１１８】
飽和画素輝度算出部１０１ｅは、蛍光画像から飽和している領域の画素数の画像全体の画素数に対する割合（飽和画素数比）を取得し、取得した画素数比に基づいて飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部である。
【０１１９】
まず、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素輝度Ｊ０を算出する際に使用する関数について説明する。一般に、蛍光画像が示す輝度の分布は２次元正規分布で表されることから、この関数を使用して、Ｊ０を算出するものとする。なお、蛍光画像が示す輝度の分布を単に「輝度分布」とする。
【０１２０】
図９は、蛍光画像と２次元正規分布をなす輝度分布を説明するための図である。図９には、２次元正規分布をとる輝度分布５００および対応する蛍光画像２４を示す。図の横軸はｘｙ座標、縦軸は画素輝度であり、輝度分布は、蛍光画像２４の縦と横のサイズを「１」とし、これを単位とした２次元正規分布：Ｊ０exp（−（ｘ２＋ｙ２）／σ２）として示している。σは分布の標準偏差であり、マイクロインジェクション装置２００の実験によれば、σ＝０．１程度である。
【０１２１】
図１０は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係について説明するための図である。図１０では、図９に示す２次元正規分布を極座標形式：Ｊ０ｅｘｐ（−ｒ２／σ２）で示している。
【０１２２】
ここで、Ｊｓは上限を示し、ｎｓ＝πrs2は、画像全体の画素数に対する飽和した領域の画素数の割合（以下、飽和画素数比とする）を示し、Ｊ０は上述したように飽和画素輝度を示す。なお、画素輝度は上限Ｊｓを１として規格化して示している。
【０１２３】
まず、図１０に示した２次元正規分布５００にて、導入物質に含まれる蛍光試薬の輝度分布が示される。そして、上限Ｊｓ以下の輝度分布（図１０の実線部）については計測できるが、上限Ｊｓを超える輝度分布（図９の点線部）については計測することができない。
【０１２４】
この場合、蛍光画像より、飽和画素数比ｎｓを算出すれば、以下に示す式（８）により、飽和画素輝度Ｊ０を求めることができる。
【０１２５】
まず、２次元正規分布５００が示す関数から、上限Ｊｓの輝度となる動径座標をｒｓとすると、以下の式（６）が得られる。
【数６】
【０１２６】
r≦ｒｓの領域が飽和領域であるから、飽和画素数比ｎｓをｒｓで表すと、以下の式（７）になる。
【数７】
【０１２７】
式（６）と式（７）より、飽和画素数比ｎｓと飽和画素輝度Ｊ０の関係が求められ、以下の式（８）が得られる。
【数８】
【０１２８】
例えば、Ｊｓ＝１、σ＝０．１とした場合、πσ２≒０．０３となり、式（８）に示した「Ｃ」の値は、Ｃ＝０．０３となる。この場合の計算結果を、Ｘ軸に飽和画素数比ｎｓ、Ｙ軸に飽和画素輝度Ｊ０をとり、図１１に示す。
【０１２９】
図１１に示したグラフ１４より、飽和画素輝度Ｊ０の対数の値は、飽和画素数比ｎｓに比例することが分かる。
【０１３０】
次に、図１１に示した関係を踏まえ、初期露光時間Ｔｅ１で蛍光画像を撮影し、蛍光画像から取得された最大画素輝度の値が上限Ｊｓであった場合を例に挙げ、飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１３１】
まず、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像から飽和領域の画素数比ｎｓを算出する。そして、算出したｎｓを式（８）に代入することで、飽和画素輝度Ｊ０を算出する。
【０１３２】
そして、初期露光時間Ｔｅ１に対して、Ｃ１／Ｊ０（ここで、Ｃ１＝(ＪＨＩＧＨ+ＪＬＯＷ)／２とする）を乗ずることにより、飽和画素輝度Ｊ０を調整目標範囲の中央レベルに調整する露光時間Ｔｅ２を算出し、露光時間制御部１０１ｄに出力する。
【０１３３】
その後、吐出制御部１０１ｂが、取得した露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合に、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新し、吐出を行う。
【０１３４】
この実施例２によれば、極端に大きな吐出体積の場合でも、２〜３回のテスト吐出により、最適な露光時間ＴｅＢを決定することができ、約２〜３倍の露光時間の調整時間の短縮が可能となる。
【０１３５】
次に、実施例２で示したマイクロインジェクション装置２００の処理について説明する。図１２は、実施例２で示したマイクロインジェクション装置２００の処理を説明するためのフローチャートである。
【０１３６】
まず、マイクロインジェクション装置２００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ２００）。
【０１３７】
そして、ステップＳ２００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ２０１）。その後、吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ２０２）。
【０１３８】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ２０３）。
【０１３９】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ２０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ２０５）。
【０１４０】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ２０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ２０６、Ｙｅｓ）、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素数比ｎｓを計算する（ステップＳ２０７）。
【０１４１】
その後、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、式（７）を用いて、飽和画素輝度Ｊ０を算出し、露光時間制御部１０１ｂに出力する（ステップＳ２０８）。
【０１４２】
そして、露光時間制御部１０１ｄが、初期露光時間Ｔｅ１にＣ１／Ｊ０を乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する（ステップＳ２０９）。
【０１４３】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ２０９にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ２１０、Ｎｏ）、ステップＳ２０３に移行する。
【０１４４】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ２１０、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ２１１）。
【０１４５】
ステップＳ２０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ２０６、Ｎｏ）、ステップＳ２１２に移行し、ステップＳ２０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【０１４６】
比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ２１２、Ｎｏ）、吐出較正は、ステップＳ２０２にて設定した露光時間Ｔｅ２を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ２１６）。
【０１４７】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ２１２、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ２０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ２１３）。
【０１４８】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ２１３にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ２１４、Ｎｏ）、ステップＳ２０３に移行する。
【０１４９】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ２１４、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ２１５）。
【０１５０】
このフローチャートによれば、飽和画素輝度算出部１０１ｅが、飽和画素輝度Ｊ０を算出することで、吐出体積が極端に大きい場合でも、最小限の回数の露光時間の調整で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【実施例３】
【０１５１】
ところで、実施例２に示したマイクロインジェクション装置２００は、蛍光画像の輝度分布の標準偏差σをあらかじめ調査して求めた一定値（例えば、０．１）としたが、蛍光試薬と混合する導入物質の種類によっては、σの値が異なる場合があり、この場合、飽和画素輝度算出部１０１ｅが算出する飽和画素輝度Ｊ０の算出精度が低下する。
【０１５２】
そこで、以下に示す実施例３では、飽和画素数比ｎｓに加えて、上限Ｊｓから一定割合だけ輝度を下げたレベルに閾値Ｊｔを設け、この閾値Ｊｔを超える輝度の画像全体の画素に対する比率ｎｔを算出する手段を設ける。なお、ｎｔを閾値画素数比とする。
【０１５３】
そして、実施例３に示すマイクロインジェクション装置３００は、蛍光画像から飽和画素数比ｎｓと上述した閾値画素数比ｎｔを算出し、算出したｎｓとｎｔとから飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部を実施例２に示したマイクロインジェクション装置２００に設けるものとする。
【０１５４】
なお、実施例２と同様に、「飽和画素輝度Ｊ０」とは、輝度プロファイルの最大値が、飽和領域に含まれている場合の真の最大画素輝度を示すものとし、これを「Ｊ０」として以下説明する。
【０１５５】
実施例３に示すマイクロインジェクション装置３００は、図２に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１５６】
図１３は、実施例３に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図１３に示したマイクロインジェクション装置３００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１５７】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、飽和画素輝度算出部１０１ｅと、閾値画素数比算出部１０１ｆを有する。
【０１５８】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、飽和画素輝度算出部１０１ｅと閾値画素数比算出部１０１ｆを有していることである。以下、飽和画素輝度算出部１０１ｅと閾値画素数比算出部１０１ｆが行う処理について説明する。
【０１５９】
閾値画素数比算出部１０１ｆは、蛍光画像より上述した閾値Ｊｔを超える輝度の画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力する。飽和輝度算出部は、蛍光画像より飽和画素数比ｎｓを算出し、飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔとより、飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部である。
【０１６０】
まず、上述したＪｔと、画素数比ｎｔの関係について説明し、その後、閾値画素数比算出部１０１ｆと飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１６１】
図１４は、閾値画素数比と輝度分布の関係について説明するための図である。ここで、図９と同様に、２次元正規分布をなす輝度分布６００を極座標形式で示す。図において、Ｊｓは撮像系の上限を示し、ｎｓは飽和画素数比を示し、Ｊ０は上述したように飽和画素輝度Ｊ０を示す。なお、画素輝度は上限Ｊｓを１として規格化して示している。
【０１６２】
Ｊｓ・Ｊｔは上限Ｊｓから所定割合（Ｊｔ）だけ画素輝度を下げた閾値を示し、ｎｔは画像全体の画素数に対するＪｓ・Ｊｔを超える領域の画素数の割合（以下、閾値画素数比とする）を示している。
【０１６３】
まず、図１４に示した２次元正規分布６００にて、導入物質に含まれる蛍光試薬の輝度分布が示される。そして、上限Ｊｓ以下の輝度分布（図１４の実線部）については計測できるが、上限Ｊｓを超える輝度分布（図１４の点線部）については計測することができない。
【０１６４】
この場合、蛍光画像より飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔを求めれば、以下の式（９）により、分布の標準偏差σが未知でも、飽和画素輝度Ｊ０を求めることができる。
【０１６５】
飽和画素数比ｎｓと飽和画素輝度Ｊ０の関係は、実施例２の場合と同様、式（８）で与えられる。
【０１６６】
次に、２次元正規分布６００が示す関数から、輝度が閾値Ｊｔ・Ｊｓを超える領域の画素数の画像全体の画素数に対する割合（閾値画素数比ｎｔ）を、同様な方法で求めると、以下の式（９）が得られる。
【数９】
【０１６７】
そして、式（８）と式（９）より、σを消去すると、最終的に、ｎｓ、ｎｔ、Ｊｔ、ＪｓよりＪ０が算出される式（１０）が得られる。
【数１０】
【０１６８】
Ｊｔ＝０．５とした場合を例に挙げて説明する。図１５は、σを任意に設定したときの飽和画素輝度について説明するための図である。
【０１６９】
図１５において、Ｘ軸は飽和画素数比ｎｓ、Ｙ軸は式（１０）により計算された飽和画素輝度Ｊ０である。このグラフ１５〜グラフ１７より、任意のσに対し、飽和画素輝度Ｊ０が求められることを示している。
【０１７０】
続いて、飽和画素輝度算出部１０１ｅおよび閾値画素数比算出部１０１ｆが行う処理を上述した計算式を踏まえて説明する。なお、初期露光時間はＴｅ１で蛍光画像を撮影し、蛍光画像から取得された最大画素輝度の値が上限Ｊｓであった場合を例にあげ説明する。また、記憶部１０１ａには、実施例１で示した各種データに加えて、Ｊｔ：０．５が記憶されているものとする。
【０１７１】
まず、閾値画素数比算出部１０１ｆは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像から閾値画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力する。次に、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、同じ蛍光画像から飽和画素数比ｎｓを算出し、ｎｓとｎｔとを用い式（１０）から飽和画素輝度Ｊ０を求める。
【０１７２】
そして、初期露光時間Ｔｅ１に対して、Ｃ１／Ｊ０（ここで、Ｃ１＝(ＪＨＩＧＨ+ＪＬＯＷ)／２とする）を乗ずることより。飽和画素輝度Ｊ０を調整目標範囲の中央レベルに調整する露光時間Ｔｅ２を取得する。
【０１７３】
その後、吐出制御部１０１ｂが取得した露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合に、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新し、再度、吐出を行う。
【０１７４】
この実施例によれば、飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔの値を求めることで、輝度分布の標準偏差σが未知の場合でも、飽和画素輝度Ｊ０を算出することが可能となる。
【０１７５】
なお、実施例２、実施例３では、輝度分布における、飽和画素数比や、閾値画素数比が示す値で飽和画素輝度を求めたが、代わりに、飽和領域の半径ｒｓ、閾値超過領域の半径ｒｔ、あるいは直径を指標として用いてもよい。
【０１７６】
例えば、半径ｒｓ、ｒｔを用いる場合、実施例２における飽和画素輝度Ｊ０は、以下の式（１１）を用いれば算出される。
【数１１】
【０１７７】
そして、半径ｒｓ、ｒｔを用いて、実施例３における飽和画素輝度Ｊ０を算出する場合、以下の式（１２）を用いれば算出される。
【数１２】
【０１７８】
この実施例３によれば、σの値が不明でも、最適な露光時間ＴｅＢを決定することがで、さらに、約２〜３倍の露光時間の調整時間の短縮が可能となる。
【０１７９】
次に、実施例３で示したマイクロインジェクション装置３００の処理について説明する。図１６は、実施例３で示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートある。
【０１８０】
まず、マイクロインジェクション装置３００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ３００）。
【０１８１】
そして、ステップＳ３００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ３０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ３０２）。
【０１８２】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ３０３）。
【０１８３】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ３０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ３０５）。
【０１８４】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ３０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ３０６、Ｙｅｓ）、閾値画素数比算出部１０１ｆが閾値画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力される。また、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素数比ｎｓを計算する（ステップＳ３０７）。
【０１８５】
その後、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、式（１０）を用いて、飽和画素輝度Ｊ０を算出する（ステップＳ３０８）。そして、初期露光時間Ｔｅ１にＣ１／Ｊ０を乗算する（ステップＳ３０９）。
【０１８６】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ３０９にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ３１０、Ｎｏ）、ステップＳ３０３に移行する。
【０１８７】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ３１０、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ３１１）。
【０１８８】
また、ステップＳ３０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ３０６、Ｎｏ）、ステップＳ３１２に移行し、ステップＳ３０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【０１８９】
比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ３１２、Ｎｏ）、吐出較正は、ステップＳ３０２にて設定した露光時間Ｔｅ１を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ３１６）。
【０１９０】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ３１２、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ３０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨ１＋ＪＬ１）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ３１３）。
【０１９１】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ３１３にて算出された露光時間（例えば、Ｔｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ３１４、Ｎｏ）、ステップＳ３０３に移行する。
【０１９２】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨ未満である場合（ステップＳ３１４、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ３１５）。
【０１９３】
このフローチャートによれば、任意のσの値に対して、飽和画素輝度Ｊ０を算出することができ、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【実施例４】
【０１９４】
ところで、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００は、複数の蛍光画像の撮影を０．５秒以内に行う。このことから、導入物質の吐出直後の状況を複数撮影すると、導入物質が広く拡散しないうちに複数の蛍光画像を取得することができる。
【０１９５】
そこで、以下の実施例４に示すマイクロインジェクション装置４００は、導入物質の吐出直後に、露光時間を変えながら複数の蛍光画像を取得し、取得した複数の蛍光画像から各最大画素輝度ＪＭＡＸを取得し、取得した各ＪＭＡＸの中から、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値を有するＪＭＡＸを選択し、選択したＪＭＡＸに対応する露光時間を最適な露光時間ＴｅＢとする。
【０１９６】
実施例４に示すマイクロインジェクション装置４００は、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１９７】
図１７は、実施例４に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図１７に示すマイクロインジェクション装置４００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１９８】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、蛍光画像選択部１０１ｇとを有する。
【０１９９】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、蛍光画像選択部１０１ｇを有していることである。以下、蛍光画像選択部１０１ｇが行う処理について説明する。
【０２００】
まず、吐出制御部１０１ｂが、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間をＴｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２に設定する。そして、最も長い初期露光時間をＴｅ４２、最も短い初期露光時間をＴｅ４０、Ｔｅ４０とＴｅ４２の間の初期露光時間をＴｅ４１とする。
【０２０１】
また、Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２の間は、１０倍以上の差分を設けるものとし、例えば、Ｔｅ４０を「０．００１秒」とした場合、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２はそれぞれ、０．０１秒、０．１秒とする。
【０２０２】
そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２で撮影された各蛍光画像を画像取得部１０１ｃから取得し、取得された３枚の蛍光画像の最大画素輝度をそれぞれ、ＪＭＡＸ４０、ＪＭＡＸ４１、ＪＭＡＸ４２とする。
【０２０３】
そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、上述した各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の最大画素輝度ＪＭＡＸを選択し、選択したＪＭＡＸをＪＭＡＸ４Ａとし、ＪＭＡＸ４Ａを露光時間制御部１０１ｄに出力する。
【０２０４】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸ４ＡがＪＬＯＷを超えている場合は、ＪＭＡＸ４Ａに対応する初期露光時間Ｔｅ４Ａを最適な露光時間ＴｅＢに決定する。
【０２０５】
例えば、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４０であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４０を最適な露光時間ＴｅＢとし、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４１であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４１を最適な露光時間ＴeＢとし、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４２であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４２を最適な露光時間ＴｅＢとする。
【０２０６】
続いて、取得したＪＭＡＸ４ＡがＪＬＯＷを超えていない場合（ＪＭＡＸ４Ａ＜ＪＬｏｗ）、露光時間制御部１０１ｄの処理ついて説明する。まず、露光時間制御部１０１ｄは、ＪＭＡＸ４Ａに対応する初期露光時間Ｔｅ４ＡにＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸ４Ａの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ４Ａ）を乗算し、乗算した値「Ｔｅ４ＡＡ」を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【０２０７】
例えば、ＪＭＡＸ４Ａ＝「５」、ＪＬＯＷ＝「１０」、ＪＨＩＧＨ＝「２０」、において、Ｃ１は「１５」となり、ＪＭＡＸ４Ａとの比率から、初期露光時間Ｔｅ４Ａを３倍した値が「Ｔｅ４ＡＡ」となる。
【０２０８】
その結果、露光時間「Ｔｅ４ＡＡ」で撮影した場合、ＪＭＡＸ４Ａは、「１５」となり、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値を有することになる。
【０２０９】
したがって、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満である場合（Ｔｅ４０Ａ＜ＴｅＨ１）、初期露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【０２１０】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが、上述した場合とは異なり、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えている場合（Ｔｅ４０Ａ＞ＴｅＨＩＧＨ）、吐出制御部１０１ｂは、基準露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新しないで、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する。
【０２１１】
次に、実施例４に示したマイクロインジェクション装置４００の処理について説明する。図１８は、実施例４に示すマイクロインジェクション装置の処理を説明するためのフローチャートである。
【０２１２】
まず、マイクロインジェクション装置４００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ４００）。
【０２１３】
そして、ステップＳ４００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ４０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６に順次設定する初期露光時間Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２を準備する（ステップＳ４０２）。
【０２１４】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸにより吐出命令を出力する（ステップＳ４０３）。
【０２１５】
その後、画像取得部１０１ｃが、初期露光時間Ｔｅ４０〜Ｔｅ４２まで、順次、高感度ＣＣＤカメラ１０６に設定しては、蛍光画像の取得を繰り返し（ステップＳ４０４）、取得した３枚の画像を蛍光画像選択部１０１ｇに出力する。そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、取得した各蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ４０５）。
【０２１６】
次に、蛍光画像選択部１０１ｇは、各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の画素輝度のＪＭＡＸを選択する（ステップＳ４０６、Ｎｏ）（ステップＳ４０７）。
【０２１７】
ここで、蛍光画像選択部１０１ｇが、ステップＳ４０５で、３枚の蛍光画像を取得し、各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の画素輝度のＪＭＡＸを選択できなかった場合（ステップＳ４０６、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして吐出較正を中断する（ステップＳ４０８）。
【０２１８】
次に、蛍光画像選択部１０１ｇにより選択されたＪＭＡＸは、露光時間制御部１０１ｄに出力され、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ４０９、Ｎｏ）は、ＪＭＡＸに対応する初期露光時間Ｔｅ４Ａを最適な露光時間ＴeＢに決定する（ステップＳ４１０）。
【０２１９】
一方、蛍光画像選択部１０１ｇにより選択されたＪＭＡＸが、ＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ４０９、Ｙｅｓ）は、ＪＭＡＸに対応する初期露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ４１１）。
【０２２０】
そして、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄより入力された露光時間（例えば、Ｔｅ４ＡＡ）が露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満である場合（ステップＳ４１２、Ｎｏ）、露光時間をＴｅ４ＡＡに更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う（ステップＳ４１３）。
【０２２１】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが、上述した場合とは異なり、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えている場合（ステップＳ４１２、Ｙｅｓ）、吐出制御部１０１ｂは、露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新しないで、吐出体積Ｖが較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する（ステップＳ４１８）。
【０２２２】
ステップＳ４１３後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ４１４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ４１５）。
【０２２３】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ４１５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ４１６、Ｙｅｓ）、ステップＳ４１３にて設定した露光時間Ｔｅ４ＡＡに一定倍率（例えば、０．８倍）を乗算する（ステップＳ４１７）。その後、ステップＳ４１３に移行する。
【０２２４】
一方、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ４１６、Ｎｏ）、ステップＳ４０９に移行する。
【０２２５】
このフローチャートによれば、３種類の露光時間には１００倍の範囲があることから、最初のテスト吐出時に、吐出体積が極端に大きい場合でも、飽和せず、かつ、適度な大きさの最大画素輝度を有する蛍光画像を取得することができ、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【符号の説明】
【０２２６】
５、１１、１２、１４、１５、１６、１７ グラフ
２０ 背景画像
２１、２３、２４ 蛍光画像
２２ 差分画像
３０、３１、３２、４０、４１、９０、９１、９２、９３ 輝度プロファイル
５０、１００、２００、３００、４００ マイクロインジェクション装置
５０ａ、１０３ キャピラリ針
５０ｂ 蛍光液滴
５０ｃ、１０４ シャーレ
５０ｄ 培地
５０ｅ、１０５ 顕微鏡
５０ｆ、１０７ 蛍光フィルタ
５０ｇ、１０６ 高感度ＣＣＤカメラ
５０ｈ 蛍光試薬
５０ｉ シャーレ底
１０１ 制御部
１０１ａ 記憶部
１０１ｂ 吐出制御部
１０１ｃ 画像取得部
１０１ｄ 露光時間制御部
１０１ｅ 飽和画素輝度算出部
１０１ｆ 閾値画素数比算出部
１０１ｇ 蛍光画像選択部
１０２ キャピラリ針操作部
１０８ 反射鏡
１０９ 励起フィルタ
１１０ 励起光源
１１１ 定数テーブル
５００、６００ ２次元正規分布
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロインジェクション装置に関する。例えば、露光時間を調整することで、キャピラリ針と導入物質の組み合わせに起因する吐出較正の較正許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大するマイクロインジェクション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子や蛋白質等の生体分子や化合物（以下、単に導入物質とする）を細胞内に注入する際、マイクロインジェクション装置が使用されている。マイクロインジェクション装置には、導入物質と導入される細胞の組合せが自由という長所がある。
【０００３】
このマイクロインジェクション装置の長所に鑑みて、例えば、遺伝子を導入物質とする
人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）の作成や、蛋白質を導入物質とする機能解析や、化合物を導入物質とする薬物開発などへの応用が期待されている。
【０００４】
マイクロインジェクション装置は、微細な中空のガラス針（以下、キャピラリ針とする）を有し、このキャピラリ針の中に導入物質を充填した後、細胞に突き刺し、細胞内に導入物質を吐出することにより細胞内に注入する。
【０００５】
そして、マイクロインジェクション装置には、上述した使用目的から導入物質を定量的に吐出することが求められ、この要望に関し、以下に示すような技術が知られている。
【０００６】
まず、マイクロインジェクション装置が細胞内に吐出する量をサブピコリットル単位で定量制御する技術として、導入物質が充填されたキャピラリ針に、調整した空気圧を印加し、所定量の導入物質を細胞内に吐出するという技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
また、導入物質を細胞内に吐出させるための圧力と、キャピラリ針への導入物質の逆流を防止する圧力を用いて、所定量の導入物質を細胞内に吐出する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
さらに、蛍光試薬を導入物質に混合して、蛍光試薬が示す輝度値のデータに基づいて、導入物質を吐出する体積を調整し、調整した体積を吐出することで定量的な吐出を実現するという技術が知られている（特許文献３参照）。この技術に関して、以下詳細に説明する。
【０００９】
この場合、導入物質が吐出される体積Ｖは、キャピラリ針先端部内径をＤ、導入物質の粘度をμ、キャピラリ針に印加される吐出圧力をＰｉ、吐出圧力の持続時間をＴｉとして、以下に示す式（１）で表される。
【数１】
【００１０】
式（１）より、体積Ｖは、使用するキャピラリ針先端部内径と導入物質の粘度をパラメータとして、吐出圧力と吐出時間の積（以下、吐出パラメータとする）に比例することになり、比例定数をηとすると、式（２）と表される。なお、ηを吐出係数とする。
【数２】
【００１１】
したがって、吐出係数ηが分かれば、各吐出パラメータに対応する体積Ｖを求めることができ、導入物質を定量的に吐出することが可能となる。以下、蛍光試薬を用い、上述した式（２）のηを決定する過程、すなわち、「吐出較正」について説明する。
【００１２】
吐出較正の事前ステップとして、蛍光試薬の体積Ｖと、蛍光試薬が示す蛍光強度Ｉの関係を以下の図１９に示すマイクロインジェクション装置５０を使用して求める。ただし、吐出較正の事前ステップでは、シャーレには培地の代わりに表面張力の小さなパラフィンオイルまたはシリコンオイルを満たして使用する。このマイクロインジェクション装置５０について説明した後、体積Ｖと蛍光強度Ｉの関係について説明する。
【００１３】
なお、体積Ｖの単位は「ｐｌ：ピコリットル」で表され、蛍光画像全画素の輝度値の総和として定義される蛍光強度Ｉの単位は画素輝度値として以下説明する。
【００１４】
図１９は、従来のマイクロインジェクション装置を用いて行う吐出較正の事前ステップを説明するための図である。図１９に示したマイクロインジェクション装置５０は、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬をパラフィンオイル中に吐出する。パラフィンオイル中に吐出された蛍光試薬は、表面張力の関係から球形の蛍光液滴５０ｂを形成する。
【００１５】
次に、蛍光フィルタ５０ｆにより、蛍光試薬から発せられる波長以外の波長の光を除去し、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇにより、蛍光液滴５０ｂの蛍光画像を取得し、液滴の直径を計測することで蛍光液滴５０ｂの体積Ｖを求める。
【００１６】
そして、上述の蛍光画像から蛍光強度Ｉを求め、蛍光試薬の体積Ｖとの相関関係が、以下の図２０に示すグラフ５から求まる。図２０は、蛍光強度と体積との関係を示す図である。
【００１７】
図２０に示したＸ軸を蛍光強度Ｉ、Ｙ軸を体積Ｖとするグラフ５より、蛍光強度Ｉと体積Ｖの式（３）における比例定数α（試薬定数とする）が求まり、吐出較正のための事前ステップが完了する。なお、本ステップは、蛍光試薬毎に１回実施すればよい。
【数３】
【００１８】
次に、細胞に所望の物質を導入するインジェクション作業の直前に、使用するキャピラリ針と導入物質の組合せで実施する吐出較正について説明する。図２１は、キャピラリ針と導入物質の組合せ毎に実施する吐出較正を説明するための図である。
【００１９】
図２１に示すように、キャピラリ針５０ａから、吐出パラメータの値を変えて、蛍光試薬５０ｈの吐出を複数回行う。
【００２０】
このように、吐出較正を行う際に、導入物質を複数回吐出することを「テスト吐出」とする。このテスト吐出時には、蛍光試薬５０ｈに関する蛍光試薬データを入力する。
【００２１】
蛍光試薬データは、事前ステップで求められている試薬定数α、試薬定数を求めたときの蛍光試薬の濃度ρ０、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇの露光時間Ｔe０などである。なお、ρ０を基準濃度、Ｔｅ０を基準露光時間とする。
【００２２】
続いて、図２１にて吐出した蛍光試薬５０ｈが示す蛍光強度の測定について説明する。この蛍光強度は吐出ごとに取得される蛍光画像に基づいて測定される。具体的に図を用いて以下説明する。
【００２３】
図２２は、蛍光強度の取得について説明するための図である。図２２に示した背景画像２０は、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬５０ｈが吐出される前の画像を示し、キャピラリ針５０ａから蛍光試薬５０ｈが吐出されると蛍光画像２１が取得される。
【００２４】
そして、背景画像２０と蛍光画像２１から差分画像２２を取得し、取得した差分画像２２における画素輝度Ｊｘｙの総和から蛍光強度Ｉを求める。この蛍光強度Ｉを算出する式を以下の式（４）に定める。
【数４】
【００２５】
そして、式（４）から求めた蛍光強度Ｉを使用して、吐出パラメータと蛍光強度の関係を求める。図２３は、吐出パラメータと蛍光強度の関係を説明するための図である。図２３のグラフのＸ軸は吐出パラメータＰｉ・Ｔｉ、Ｙ軸は蛍光強度Ｉである。
【００２６】
図２３に示されたグラフ１１より、蛍光強度Ｉと吐出パラメータＰｉ・Ｔｉの関係は、式（５）で表され、比例定数γが求まる。
【数５】
【００２７】
そして、式（３）と式（５）を組合せることで、上述した式（２）の吐出係数η＝αγが導かれ、吐出パラメータに対する体積Ｖが算出される。この吐出パラメータと体積Ｖの関係について説明する。図２４は吐出較正結果を示す図である。
【００２８】
図２４に示す吐出パラメータＰｉ・ＴｉをＸ軸、体積ＶをＹ軸にしたグラフ１２より、任意の吐出パラメータごとに体積Ｖが算出され、較正された吐出が可能となる。その結果、キャピラリ針５０ａから吐出される体積Ｖを任意に設定することができる。
【００２９】
なお、基準濃度ρ０と基準露光時間Ｔｅ０と式（２）の関係であるが、任意の濃度ρ、任意の露光時間Ｔｅの場合には、ρ０／ρと、Ｔｅ０／Ｔｅが示す各値に体積Ｖが比例することが一般的であるので、これらを右辺に乗じて計算すればよい。
【００３０】
続いて、これまで説明してきた吐出較正の流れについて説明する。図２５は、従来の吐出較正を示すフローチャートである。まず、実際に使用する蛍光試薬の濃度ρをマイクロインジェクション装置５０に入力する（ステップＳ５０）。
【００３１】
次に、あらかじめ求められ記憶されている蛍光試薬データをマイクロインジェクション装置５０が読込みを行う（ステップＳ５１）。そして、露光時間を所定のＴｅに設定する（ステップＳ５２）。
【００３２】
そして、吐出較正用の蛍光画像を取得し（ステップＳ５３）、取得した蛍光画像から各吐出パラメータに対応する体積Ｖを求める（ステップＳ５４）。そして、図２４に示したグラフ１２を一例とする吐出較正の結果を取得する（ステップＳ５５）。
【００３３】
次に、上述したステップＳ５３にて取得する蛍光画像と、取得した蛍光画像に含まれる輝度プロファイルについて説明する。図２６は、蛍光画像と輝度プロファイルを説明するための図である。
【００３４】
図２６に示した蛍光画像２３は、キャピラリ針５０ａと導入物質の組合せにより吐出体積Ｖが異なる場合に得られる蛍光画像の一例を示し、所定の露光時間Ｔｅで、撮影されたものとする。そして、蛍光画像２３から取得される輝度プロファイルが図示した輝度プロファイル３０〜３２になる。
【００３５】
輝度プロファイルとは、蛍光画像のＸ方向輝度分布（Ｙ座標は画面中央）で、図２６に示した例では、輝度プロファイル３０が最も大きな画素輝度を有し、輝度プロファイル３１、３２の順に画素輝度の最大値が小さくなる。
【００３６】
そして、図２６に示した輝度プロファイル３０〜３２が示す最大画素輝度は、図１９に示した高感度ＣＣＤカメラ５０ｇが示す上限Ｊｓ以下の値であり、蛍光画像２３から取得される最大画素輝度に基づいて、吐出較正が行われる。
【００３７】
なお、上限Ｊｓとは、高感度ＣＣＤカメラ５０ｇが撮影できる最大画素輝度を示し、上限Ｊｓを超えた画素輝度は、飽和領域となり、飽和領域内に示される最大画素輝度は計測することができず、この場合、吐出較正に必要な蛍光強度を取得することが困難になる。
【００３８】
なお、図２６に示した輝度プロファイル３０〜３２に示したように、蛍光画像の輝度分布は、蛍光試薬の培地中への拡散より、基本的には、ほぼ２次元正規分布となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３９】
【特許文献１】特開２００７−３００８６８号公報
【特許文献２】特開２００８−８６２４２号公報
【特許文献３】特開２００７−２８９０８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
しかしながら、上述した従来の技術では、キャピラリ針の内径の製造ばらつきや、導入物質の組み合わせを考慮した場合に、吐出較正の許容範囲が狭く、柔軟に較正することができないという問題があった。
【００４１】
具体的に図を用いて説明する。図２７は、課題を説明するための図である。図２７に示した輝度プロファイル４０は、吐出体積Ｖが極端に小さく、画素輝度と背景ノイズとのＳＮ比が悪く、蛍光強度Ｉを計測する際に計測誤差が増大してしまう。
【００４２】
また、輝度プロファイル４１は、吐出体積Ｖが極端に大きく、真の輝度プロファイルの最大値が上限Ｊｓを超える飽和領域内に示されている。この場合、蛍光強度Ｉを正しく計測することができず、輝度プロファイル４０の場合と同様に正確な吐出較正が困難になってしまう。
【００４３】
このように、輝度プロファイルが示す最大値が、上限Ｊｓ未満で、かつ背景ノイズの影響を受けない範囲内の値でなければ、正確な吐出較正を行うことが困難であった。
【００４４】
開示の技術は、上記に鑑みてなされたものであって、キャピラリ針と導入物質の組み合わせに起因する吐出較正の較正許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大するマイクロインジェクション装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
本願の開示するマイクロインジェクション装置は、細胞内に注入する目的物に蛍光試薬を混入し、前記蛍光試薬を予め決められた露光時間で撮影して蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、前記蛍光画像から、最大画素輝度の輝度値を取得し、当該輝度値が所定範囲内に含まれるか否かを判定する判定部と、前記輝度値が前記所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に応じて前記予め決められた露光時間を調整する露光時間調整部とを有することを要件とする。
【発明の効果】
【００４６】
このマイクロインジェクション装置によれば、露光時間を調整することで、蛍光画像から取得される最大画素輝度を所定の範囲内に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１の概要を説明するための図である。
【図２】図２は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図３】図３は、定数テーブルの一例を示す図である。
【図４】図４は、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図５】図５は、実施例１に係る露光時間制御部の処理を示すフローチャートである。
【図６】図６は、実施例１の効果を説明するための図である。
【図７】図７は、吐出体積が極端に大きい場合を説明するための図である。
【図８】図８は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図９】図９は、蛍光画像と２次元正規分布をなす輝度分布を説明するための図である。
【図１０】図１０は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係について説明するための図である。
【図１１】図１１は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、実施例３に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図１４】図１４は、閾値画素数比と輝度分布の関係を説明するための図である。
【図１５】図１５は、σを任意に設定したときの飽和画素輝度について説明するための図である。
【図１６】図１６は、実施例３に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、実施例４に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例４に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、従来のマイクロインジェクション装置を用いて行う吐出較正の事前ステップを説明するための図である。
【図２０】図２０は、蛍光強度と体積の関係を示す図である。
【図２１】図２１は、キャピラリ針と導入物質の組合せ毎に実施する吐出較正を説明するための図である。
【図２２】図２２は、蛍光強度の取得について説明するための図である。
【図２３】図２３は、吐出パラメータと蛍光強度の関係を説明するための図である。
【図２４】図２４は、吐出較正結果を説明するための図である。
【図２５】図２５は、従来の吐出較正を説明するフローチャートである。
【図２６】図２６は、蛍光画像と輝度プロファイルを説明するための図である。
【図２７】図２７は、課題を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下に、本願の開示するマイクロインジェクション装置の実施例を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施例によりこの発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
まず、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の概要について説明する。本実施例１に示すマイクロインジェクション装置は、吐出較正時に、露光時間の調整を行う。
【００５０】
そして、露光時間を調整することで、蛍光画像から取得される輝度プロファイルの最大画素輝度の値に対し、上限Ｊｓを超えない所定値（以下、ＪＨＩＧＨとする）から背景ノイズの影響を受けない所定値（以下、ＪＬＯＷとする）の範囲に調整する。
【００５１】
具体的に図を用いて説明する。図１は実施例１の概要を説明するための図である。図１に示したマイクロインジェクション装置１００は、蛍光画像から取得される輝度プロファイル９０の最大画素輝度の値（単に、ＪＭＡＸとする）が上限Ｊｓに飽和している場合は、取得したＪＭＡＸを上限Ｊｓ未満の値（例えば、ＪＡとする）に調整し、調整したＪＡが蛍光画像から取得されるように露光時間を調整する。
【００５２】
一方、ＪＭＡＸが、背景ノイズの影響を受ける値である場合は、ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷが示す範囲内の値を有するようにＪＭＡＸを調整する。そして、調整したＪＭＡＸ（例えば、「ＪＡ」とする）が、蛍光画像から取得されるように露光時間を調整する。
【００５３】
このように、マイクロインジェクション装置が、露光時間を調整することで、輝度プロファイルが示す最大画素輝度をＪＨＩＧＨとＪＬｏｗによって規定される範囲内の値に調整することで、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【００５４】
なお、図１に示した最大画素輝度ＪＡが取得される露光時間を「最適な露光時間」として以下説明する。
【００５５】
次に、図１に示したマイクロインジェクション装置について説明する、図２は、実施例１に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図２に示したマイクロインジェクション装置１００は、吐出較正時に、露光時間を適切に調整することで、吐出較正用のデータを正確に取得し、取得したデータに基づいて導入物質を細胞内に吐出する。
【００５６】
そして、マイクロインジェクション装置１００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【００５７】
制御部１０１は、従来技術にて説明した式（２）に基づいて、所望の吐出体積Ｖより吐出パラメータＰｉ・Ｔｉを計算し、所望の体積Ｖの導入物質を吐出するようにキャピラリ針操作部１０２に命令する処理部である。
【００５８】
さらに、本実施例に密接に関連する機能として、制御部１０１は、吐出する導入物質とキャピラリ針１０３に対して吐出較正する際に、蛍光画像を取得する。そして、取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを算出し、算出したＪＭＡＸに基づいて、露光時間を調整する。
【００５９】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄとを有する。
【００６０】
記憶部１０１ａは、蛍光試薬に関する固有のデータ（蛍光試薬の種類、試薬定数α、基準濃度ρ０、基準露光時間Ｔｅ０）、吐出圧力Ｐｉと吐出圧力持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸを有している。
【００６１】
さらに、記憶部１０１ａは、上述した各種データに加えて定数テーブル１１１を有する。図３は、定数テーブルのデータ構造の一例を示す図である。
【００６２】
図３に示した定数テーブル１１１には、調整目標の上限ＪＨＩＧＨ、および、下限ＪＬＯＷが記憶されている。また、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ、および、ＴｅＬＯＷが記憶されている。
【００６３】
また、上述したように、ＪＨＩＧＨは上限Ｊｓを超えない所定値とし、ＪＬＯＷは背景ノイズの影響を受けない所定値とする。
【００６４】
図２の説明に戻り、吐出制御部１０１ｂについて説明する。吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａに記憶されている各種データに基づき、吐出する体積を制御する処理部である。
【００６５】
また、吐出較正時に、吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の露光時間Ｔｅを初期露光時間Ｔｅ１に設定し、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸにより吐出命令を出力する。なお、吐出圧力と吐出時間の積を吐出パラメータとして以下説明する。
【００６６】
画像取得部１０１ｃは、吐出較正時に蛍光画像を取得し、取得した画像を露光時間制御部１０１ｄに出力する手段である。この蛍光画像とは、高感度ＣＣＤカメラ１０６が撮影する画像である。一例として、図２６に示した蛍光画像２３が挙げられる。
【００６７】
露光時間制御部１０１ｄは、画像取得部１０１ｃから取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを算出し、算出したＪＭＡＸが、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲にある場合には、ＪＭＡＸを撮影した時間を最適な露光時間ＴｅＢとして決定する。
【００６８】
具体的には、図３に示した定数テーブル１１１を用いて説明する。まず、露光時間制御部１０１ｄは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得する。そして、取得した蛍光画像から従来の技術を用いてＪＭＡＸを算出する。
【００６９】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、定数テーブル１１１に記憶されているＪＨＩＧＨとＪＬＯＷを取得し、算出したＪＭＡＸと比較する。露光時間制御部１０１ｄは、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていないと判定した場合（ＪＭＡＸ＜ＪＨＩＧＨ）は、ＪＭＡＸとＪＬＯＷの値の比較を行う。
【００７０】
この場合、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸとＪＬＯＷを比較して、ＪＭＡＸがＪＬＯＷ未満でない場合（ＪＭＡＸ＞ＪＬＯＷ）、初期露光時間Ｔｅ１を最適な露光時間ＴｅＢとして決定する。
【００７１】
一方、露光時間制御部１０１ｄは、定数テーブル１１１から取得したＪＨＩＧＨと算出したＪＭＡＸを比較した結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていると判定した場合（ＪＭＡＸ＞ＪＨＩＧＨ）、初期露光時間Ｔｅ１に一定倍率（例えば、０．６５倍）を乗算し、乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【００７２】
その後、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定する。Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（Ｔｅ２＞ＴｅＬＯＷ）、吐出制御部１０１ｂは、露光時間ＴｅをＴｅ２に更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【００７３】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（Ｔｅ２＜ＴｅＬＯＷ）、吐出制御部１０１ｂは、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新しないで、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして吐出較正を中断する。
【００７４】
また、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸとＪＬＯＷを比較して、ＪＭＡＸがＪＬＯＷ未満である場合（ＪＭＡＸ＜ＪＬＯＷ）、初期露光時間Ｔｅ１に、Ｃ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算し、乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【００７５】
例えば、ＪＭＡＸ＝「５」、ＪＬＯＷ＝「１０」、ＪＨＩＧＨ＝「２０」、において、Ｃ１は「１５」となり、ＪＭＡＸとの比率から、初期露光時間Ｔｅ１を３倍した値がＴｅ２となる。この場合、露光時間Ｔｅ２にて撮影した場合、ＪＭＡＸは、「１５」となり、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値を有することになる。
【００７６】
そして、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えているか否かを判定する。Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（Ｔｅ２＞ＴｅＨＩＧＨ）、吐出制御部１０１ｂは、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新しないで、吐出体積Ｖが較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する。
【００７７】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ２がＴｅＨＩＧＨ未満である場合（Ｔｅ２＜ＴｅＨＩＧＨ）、露光時間ＴｅをＴｅ２に更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【００７８】
このように、露光時間制御部１０１ｄは、算出したＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合には、ＪＭＡＸに対応する露光時間を０．６５倍し、ＪＬＯＷ未満である場合には、ＪＭＡＸに対応する露光時間にＣ１＝（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する。
【００７９】
また、算出したＪＭＡＸが、ＪＨＩＧＨ未満で、かつＪＬＯＷを超えている場合には、上述した処理は行わず、露光時間Ｔｅ１にて吐出を行う。このように、ＪＨＩＧＨ未満で、かつＪＬＯＷを超えているようなＪＭＡＸが取得できる蛍光画像を撮影する露光時間を最適な露光時間ＴｅＢとして以下説明する。
【００８０】
キャピラリ針操作部１０２は、吐出較正時には、制御部１０１から吐出較正の命令を受けて導入物質を吐出し、吐出較正後は、制御部１０１から出力されるデータに基づき、導入物質を吐出する。
【００８１】
キャピラリ針１０３は、キャピラリ針操作部１０２に取り付けられ、内部に充填されている導入物質を制御部１０１から出力されるデータに基づいて吐出される。
【００８２】
シャーレ１０４は、図２１に示した培地５０ｄを満たす容器を示し、顕微鏡１０５は、シャーレ上に拡散する導入物質を観察する装置である。
【００８３】
高感度ＣＣＤカメラ１０６は、映像素子を用いて光学的な画像を電子的な画像データに変換する装置であり、蛍光画像を撮影する。また、撮影時における露光時間は、制御部１０１によって制御される。
【００８４】
蛍光フィルタ１０７は、高感度ＣＣＤカメラ１０６により得られた蛍光画像から蛍光波長以外の波長の光を除去し、蛍光画像の映像素子上に結像させるフィルタである。
【００８５】
反射鏡１０８は、顕微鏡１０５が観察した状態を高感度ＣＣＤカメラ１０６へ向けて反射するための鏡であり、また、励起光源１１０から発せられる励起光をキャピラリ針１０３から吐出される導入物質に向けて反射する。
【００８６】
励起光源１１０は、蛍光物質を含む導入物質がキャピラリ針１０３の先端から吐出された際に、この導入物質に対して励起光を照射するための光源である。
【００８７】
次に、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００の処理について説明する。図４は、実施例１に示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートである。まず、実際に使用する蛍光試薬の濃度ρをマイクロインジェクション装置１００に入力する（ステップＳ９０）。
【００８８】
次に、あらかじめ求められ記憶されている蛍光試薬のデータをマイクロインジェクション装置１００が読込みを行う（ステップＳ９１）。そして、露光時間制御部１０１ｄが露光時間の調整を行う（ステップＳ９２）。
【００８９】
そして、ステップＳ１０２にて調整された露光時間が設定された後（ステップＳ９３）、吐出較正用のデータを取得する（ステップＳ９４）。その後、取得したデータに基づいて体積Ｖを計算する（ステップＳ９５）。そして、吐出較正の結果を取得する（ステップＳ９６）。
【００９０】
次に、実施例１で示した露光時間調整部１０１ｄの処理について説明する。図５は、実施例１に示す露光時間制御部の処理を示すフローチャートである。
【００９１】
マイクロインジェクション装置１００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ１００）。
【００９２】
そして、ステップＳ１００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ１０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ１０２）。
【００９３】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ１０３）。
【００９４】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ１０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ１０５）。
【００９５】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ１０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ１０６、Ｙｅｓ）、ステップＳ１０２にて設定した初期露光時間に一定倍率（例えば、０．６５倍）を乗算する（ステップＳ１０７）。
【００９６】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ１０７にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ１０８、Ｎｏ）、ステップＳ１０３に移行する。
【００９７】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ１０８、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ１０９）。
【００９８】
また、ステップＳ１０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ１０６、Ｎｏ）、ステップＳ１１０に移行し、ステップＳ１０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【００９９】
そして、比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ１１０、Ｎｏ）吐出制御部１０１ｂは、ステップＳ１０２にて設定した露光時間を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ１１４）。
【０１００】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ１１０、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ１０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ１１１）。
【０１０１】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ１１１にて算出された露光時間Ｔｅ２と、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを比較して、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ１１２、Ｎｏ）、ステップＳ１０３に移行する。
【０１０２】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ１１２、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ１１３）。
【０１０３】
このフローチャートによれば、露光時間制御部１０１ｄが、露光時間を調整することで、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【０１０４】
以上により、実施例１に示したマイクロインジェクション装置によれば、露光時間を調整することで、最大画素輝度をＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整することができる。具体的に図を用いて以下説明する。
【０１０５】
図６は、実施例１の効果を説明するための図である。図６の左側に示した例は、輝度プロファイルの最大値Ｊ０が上限Ｊｓを超えている場合で、最大画素輝度JＭＡＸは上限Ｊｓに等しくなっている。この場合、２回目のテスト吐出で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値に調整している。
【０１０６】
一方、図６の右側に示した例は、輝度プロファイルの最大画素輝度ＪＭＡＸが小さすぎて背景ノイズの影響を受けている。この場合も左側に示した場合と同様に２回目のテスト吐出で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値に調整している。
【実施例２】
【０１０７】
ところで、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００は、算出した最大画素輝度ＪＭＡＸが上限Ｊｓに等しくなる場合、１回のテスト吐出につき、０．６５倍の露光時間の引き下げを行っている。
【０１０８】
そのため、吐出体積が平均的なものより極端（例えば、１０倍以上）に大きいキャピラリ針の場合、１回のテスト吐出で０．６５倍の露光時間の引き下げしか行われない。
【０１０９】
このような場合、調整目標範囲内に最大画素輝度を調整するまでに５回以上のテスト吐出が必要となる。以下、具体的に図を用いて説明する。図７は、吐出体積が極端に大きい場合を説明するための図である。
【０１１０】
図７に示すように、１回目の輝度プロファイル９１の最大値Ｊ０が上限Ｊｓよりも極端に大きい場合において、２回目の吐出較正において０．６５倍しても、調整目標範囲内に最大画素輝度を有すことはない。
【０１１１】
結果として、調整目標の範囲内に到達するまでに５回以上のテスト吐出が必要となる。通常、吐出された導入物質が拡散して、蛍光画像全体にほぼ一様に分布するまでに待ち時間（約１０秒程度）が必要となることを考慮すると、テスト吐出を連続して５回行った場合、５回のテスト吐出には最低でも４０秒程度が必要となり、操作性や作業性を著しく損なってしまう。
【０１１２】
そこで、実施例２に示すマイクロインジェクション装置２００は、蛍光画像から図７に示した「飽和画素輝度Ｊ０」を算出する処理部を実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００に設けるものとする。
【０１１３】
なお、上述した「飽和画素輝度」とは、輝度プロファイルが示す最大値が、飽和領域に含まれている場合の真の最大画素輝度を示すものとし、これを「Ｊ０」として以下説明する。
【０１１４】
実施例２に示すマイクロインジェクション装置２００は、図２に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１１５】
図８は、実施例２に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図８に示したマイクロインジェクション装置２００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１１６】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、飽和画素輝度算出部１０１ｅとを有する。
【０１１７】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、飽和画素輝度の算出機能を有していることである。以下、飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１１８】
飽和画素輝度算出部１０１ｅは、蛍光画像から飽和している領域の画素数の画像全体の画素数に対する割合（飽和画素数比）を取得し、取得した画素数比に基づいて飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部である。
【０１１９】
まず、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素輝度Ｊ０を算出する際に使用する関数について説明する。一般に、蛍光画像が示す輝度の分布は２次元正規分布で表されることから、この関数を使用して、Ｊ０を算出するものとする。なお、蛍光画像が示す輝度の分布を単に「輝度分布」とする。
【０１２０】
図９は、蛍光画像と２次元正規分布をなす輝度分布を説明するための図である。図９には、２次元正規分布をとる輝度分布５００および対応する蛍光画像２４を示す。図の横軸はｘｙ座標、縦軸は画素輝度であり、輝度分布は、蛍光画像２４の縦と横のサイズを「１」とし、これを単位とした２次元正規分布：Ｊ０exp（−（ｘ２＋ｙ２）／σ２）として示している。σは分布の標準偏差であり、マイクロインジェクション装置２００の実験によれば、σ＝０．１程度である。
【０１２１】
図１０は、飽和画素数比と飽和画素輝度の関係について説明するための図である。図１０では、図９に示す２次元正規分布を極座標形式：Ｊ０ｅｘｐ（−ｒ２／σ２）で示している。
【０１２２】
ここで、Ｊｓは上限を示し、ｎｓ＝πrs2は、画像全体の画素数に対する飽和した領域の画素数の割合（以下、飽和画素数比とする）を示し、Ｊ０は上述したように飽和画素輝度を示す。なお、画素輝度は上限Ｊｓを１として規格化して示している。
【０１２３】
まず、図１０に示した２次元正規分布５００にて、導入物質に含まれる蛍光試薬の輝度分布が示される。そして、上限Ｊｓ以下の輝度分布（図１０の実線部）については計測できるが、上限Ｊｓを超える輝度分布（図９の点線部）については計測することができない。
【０１２４】
この場合、蛍光画像より、飽和画素数比ｎｓを算出すれば、以下に示す式（８）により、飽和画素輝度Ｊ０を求めることができる。
【０１２５】
まず、２次元正規分布５００が示す関数から、上限Ｊｓの輝度となる動径座標をｒｓとすると、以下の式（６）が得られる。
【数６】
【０１２６】
r≦ｒｓの領域が飽和領域であるから、飽和画素数比ｎｓをｒｓで表すと、以下の式（７）になる。
【数７】
【０１２７】
式（６）と式（７）より、飽和画素数比ｎｓと飽和画素輝度Ｊ０の関係が求められ、以下の式（８）が得られる。
【数８】
【０１２８】
例えば、Ｊｓ＝１、σ＝０．１とした場合、πσ２≒０．０３となり、式（８）に示した「Ｃ」の値は、Ｃ＝０．０３となる。この場合の計算結果を、Ｘ軸に飽和画素数比ｎｓ、Ｙ軸に飽和画素輝度Ｊ０をとり、図１１に示す。
【０１２９】
図１１に示したグラフ１４より、飽和画素輝度Ｊ０の対数の値は、飽和画素数比ｎｓに比例することが分かる。
【０１３０】
次に、図１１に示した関係を踏まえ、初期露光時間Ｔｅ１で蛍光画像を撮影し、蛍光画像から取得された最大画素輝度の値が上限Ｊｓであった場合を例に挙げ、飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１３１】
まず、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像から飽和領域の画素数比ｎｓを算出する。そして、算出したｎｓを式（８）に代入することで、飽和画素輝度Ｊ０を算出する。
【０１３２】
そして、初期露光時間Ｔｅ１に対して、Ｃ１／Ｊ０（ここで、Ｃ１＝(ＪＨＩＧＨ+ＪＬＯＷ)／２とする）を乗ずることにより、飽和画素輝度Ｊ０を調整目標範囲の中央レベルに調整する露光時間Ｔｅ２を算出し、露光時間制御部１０１ｄに出力する。
【０１３３】
その後、吐出制御部１０１ｂが、取得した露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合に、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新し、吐出を行う。
【０１３４】
この実施例２によれば、極端に大きな吐出体積の場合でも、２〜３回のテスト吐出により、最適な露光時間ＴｅＢを決定することができ、約２〜３倍の露光時間の調整時間の短縮が可能となる。
【０１３５】
次に、実施例２で示したマイクロインジェクション装置２００の処理について説明する。図１２は、実施例２で示したマイクロインジェクション装置２００の処理を説明するためのフローチャートである。
【０１３６】
まず、マイクロインジェクション装置２００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ２００）。
【０１３７】
そして、ステップＳ２００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ２０１）。その後、吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ２０２）。
【０１３８】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ２０３）。
【０１３９】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ２０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ２０５）。
【０１４０】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ２０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ２０６、Ｙｅｓ）、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素数比ｎｓを計算する（ステップＳ２０７）。
【０１４１】
その後、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、式（７）を用いて、飽和画素輝度Ｊ０を算出し、露光時間制御部１０１ｂに出力する（ステップＳ２０８）。
【０１４２】
そして、露光時間制御部１０１ｄが、初期露光時間Ｔｅ１にＣ１／Ｊ０を乗算した値Ｔｅ２を吐出制御部１０１ｂに出力する（ステップＳ２０９）。
【０１４３】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ２０９にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ２１０、Ｎｏ）、ステップＳ２０３に移行する。
【０１４４】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ２１０、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ２１１）。
【０１４５】
ステップＳ２０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ２０６、Ｎｏ）、ステップＳ２１２に移行し、ステップＳ２０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【０１４６】
比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ２１２、Ｎｏ）、吐出較正は、ステップＳ２０２にて設定した露光時間Ｔｅ２を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ２１６）。
【０１４７】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ２１２、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ２０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ２１３）。
【０１４８】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ２１３にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ２１４、Ｎｏ）、ステップＳ２０３に移行する。
【０１４９】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ２１４、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ２１５）。
【０１５０】
このフローチャートによれば、飽和画素輝度算出部１０１ｅが、飽和画素輝度Ｊ０を算出することで、吐出体積が極端に大きい場合でも、最小限の回数の露光時間の調整で、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【実施例３】
【０１５１】
ところで、実施例２に示したマイクロインジェクション装置２００は、蛍光画像の輝度分布の標準偏差σをあらかじめ調査して求めた一定値（例えば、０．１）としたが、蛍光試薬と混合する導入物質の種類によっては、σの値が異なる場合があり、この場合、飽和画素輝度算出部１０１ｅが算出する飽和画素輝度Ｊ０の算出精度が低下する。
【０１５２】
そこで、以下に示す実施例３では、飽和画素数比ｎｓに加えて、上限Ｊｓから一定割合だけ輝度を下げたレベルに閾値Ｊｔを設け、この閾値Ｊｔを超える輝度の画像全体の画素に対する比率ｎｔを算出する手段を設ける。なお、ｎｔを閾値画素数比とする。
【０１５３】
そして、実施例３に示すマイクロインジェクション装置３００は、蛍光画像から飽和画素数比ｎｓと上述した閾値画素数比ｎｔを算出し、算出したｎｓとｎｔとから飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部を実施例２に示したマイクロインジェクション装置２００に設けるものとする。
【０１５４】
なお、実施例２と同様に、「飽和画素輝度Ｊ０」とは、輝度プロファイルの最大値が、飽和領域に含まれている場合の真の最大画素輝度を示すものとし、これを「Ｊ０」として以下説明する。
【０１５５】
実施例３に示すマイクロインジェクション装置３００は、図２に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１５６】
図１３は、実施例３に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図１３に示したマイクロインジェクション装置３００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１５７】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、飽和画素輝度算出部１０１ｅと、閾値画素数比算出部１０１ｆを有する。
【０１５８】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、飽和画素輝度算出部１０１ｅと閾値画素数比算出部１０１ｆを有していることである。以下、飽和画素輝度算出部１０１ｅと閾値画素数比算出部１０１ｆが行う処理について説明する。
【０１５９】
閾値画素数比算出部１０１ｆは、蛍光画像より上述した閾値Ｊｔを超える輝度の画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力する。飽和輝度算出部は、蛍光画像より飽和画素数比ｎｓを算出し、飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔとより、飽和画素輝度Ｊ０を算出する処理部である。
【０１６０】
まず、上述したＪｔと、画素数比ｎｔの関係について説明し、その後、閾値画素数比算出部１０１ｆと飽和画素輝度算出部１０１ｅが行う処理について説明する。
【０１６１】
図１４は、閾値画素数比と輝度分布の関係について説明するための図である。ここで、図９と同様に、２次元正規分布をなす輝度分布６００を極座標形式で示す。図において、Ｊｓは撮像系の上限を示し、ｎｓは飽和画素数比を示し、Ｊ０は上述したように飽和画素輝度Ｊ０を示す。なお、画素輝度は上限Ｊｓを１として規格化して示している。
【０１６２】
Ｊｓ・Ｊｔは上限Ｊｓから所定割合（Ｊｔ）だけ画素輝度を下げた閾値を示し、ｎｔは画像全体の画素数に対するＪｓ・Ｊｔを超える領域の画素数の割合（以下、閾値画素数比とする）を示している。
【０１６３】
まず、図１４に示した２次元正規分布６００にて、導入物質に含まれる蛍光試薬の輝度分布が示される。そして、上限Ｊｓ以下の輝度分布（図１４の実線部）については計測できるが、上限Ｊｓを超える輝度分布（図１４の点線部）については計測することができない。
【０１６４】
この場合、蛍光画像より飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔを求めれば、以下の式（９）により、分布の標準偏差σが未知でも、飽和画素輝度Ｊ０を求めることができる。
【０１６５】
飽和画素数比ｎｓと飽和画素輝度Ｊ０の関係は、実施例２の場合と同様、式（８）で与えられる。
【０１６６】
次に、２次元正規分布６００が示す関数から、輝度が閾値Ｊｔ・Ｊｓを超える領域の画素数の画像全体の画素数に対する割合（閾値画素数比ｎｔ）を、同様な方法で求めると、以下の式（９）が得られる。
【数９】
【０１６７】
そして、式（８）と式（９）より、σを消去すると、最終的に、ｎｓ、ｎｔ、Ｊｔ、ＪｓよりＪ０が算出される式（１０）が得られる。
【数１０】
【０１６８】
Ｊｔ＝０．５とした場合を例に挙げて説明する。図１５は、σを任意に設定したときの飽和画素輝度について説明するための図である。
【０１６９】
図１５において、Ｘ軸は飽和画素数比ｎｓ、Ｙ軸は式（１０）により計算された飽和画素輝度Ｊ０である。このグラフ１５〜グラフ１７より、任意のσに対し、飽和画素輝度Ｊ０が求められることを示している。
【０１７０】
続いて、飽和画素輝度算出部１０１ｅおよび閾値画素数比算出部１０１ｆが行う処理を上述した計算式を踏まえて説明する。なお、初期露光時間はＴｅ１で蛍光画像を撮影し、蛍光画像から取得された最大画素輝度の値が上限Ｊｓであった場合を例にあげ説明する。また、記憶部１０１ａには、実施例１で示した各種データに加えて、Ｊｔ：０．５が記憶されているものとする。
【０１７１】
まず、閾値画素数比算出部１０１ｆは、画像取得部１０１ｃから蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像から閾値画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力する。次に、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、同じ蛍光画像から飽和画素数比ｎｓを算出し、ｎｓとｎｔとを用い式（１０）から飽和画素輝度Ｊ０を求める。
【０１７２】
そして、初期露光時間Ｔｅ１に対して、Ｃ１／Ｊ０（ここで、Ｃ１＝(ＪＨＩＧＨ+ＪＬＯＷ)／２とする）を乗ずることより。飽和画素輝度Ｊ０を調整目標範囲の中央レベルに調整する露光時間Ｔｅ２を取得する。
【０１７３】
その後、吐出制御部１０１ｂが取得した露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合に、初期露光時間Ｔｅ１をＴｅ２に更新し、再度、吐出を行う。
【０１７４】
この実施例によれば、飽和画素数比ｎｓと閾値画素数比ｎｔの値を求めることで、輝度分布の標準偏差σが未知の場合でも、飽和画素輝度Ｊ０を算出することが可能となる。
【０１７５】
なお、実施例２、実施例３では、輝度分布における、飽和画素数比や、閾値画素数比が示す値で飽和画素輝度を求めたが、代わりに、飽和領域の半径ｒｓ、閾値超過領域の半径ｒｔ、あるいは直径を指標として用いてもよい。
【０１７６】
例えば、半径ｒｓ、ｒｔを用いる場合、実施例２における飽和画素輝度Ｊ０は、以下の式（１１）を用いれば算出される。
【数１１】
【０１７７】
そして、半径ｒｓ、ｒｔを用いて、実施例３における飽和画素輝度Ｊ０を算出する場合、以下の式（１２）を用いれば算出される。
【数１２】
【０１７８】
この実施例３によれば、σの値が不明でも、最適な露光時間ＴｅＢを決定することがで、さらに、約２〜３倍の露光時間の調整時間の短縮が可能となる。
【０１７９】
次に、実施例３で示したマイクロインジェクション装置３００の処理について説明する。図１６は、実施例３で示すマイクロインジェクション装置の処理を示すフローチャートある。
【０１８０】
まず、マイクロインジェクション装置３００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ３００）。
【０１８１】
そして、ステップＳ３００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ３０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間Ｔｅ１を設定する（ステップＳ３０２）。
【０１８２】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸによる吐出命令を出力する（ステップＳ３０３）。
【０１８３】
その後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ３０４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ３０５）。
【０１８４】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ３０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ３０６、Ｙｅｓ）、閾値画素数比算出部１０１ｆが閾値画素数比ｎｔを算出し、飽和画素輝度算出部１０１ｅに出力される。また、飽和画素輝度算出部１０１ｅが飽和画素数比ｎｓを計算する（ステップＳ３０７）。
【０１８５】
その後、飽和画素輝度算出部１０１ｅは、式（１０）を用いて、飽和画素輝度Ｊ０を算出する（ステップＳ３０８）。そして、初期露光時間Ｔｅ１にＣ１／Ｊ０を乗算する（ステップＳ３０９）。
【０１８６】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ３０９にて算出された露光時間Ｔｅ２が、露光時間の下限ＴｅＬＯＷ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満でない場合（ステップＳ３１０、Ｎｏ）、ステップＳ３０３に移行する。
【０１８７】
一方、Ｔｅ２がＴｅＬＯＷ未満である場合（ステップＳ３１０、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして、エラー中断する（ステップＳ３１１）。
【０１８８】
また、ステップＳ３０６に示した比較結果より、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ３０６、Ｎｏ）、ステップＳ３１２に移行し、ステップＳ３０５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＬＯＷを比較する。
【０１８９】
比較結果より、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ３１２、Ｎｏ）、吐出較正は、ステップＳ３０２にて設定した露光時間Ｔｅ１を最適な露光時間ＴｅＢに決定する（ステップＳ３１６）。
【０１９０】
一方、ＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ３１２、Ｙｅｓ）、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ３０２にて設定した露光時間にＣ１=（ＪＨ１＋ＪＬ１）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ３１３）。
【０１９１】
そして、吐出制御部１０１ｂが、ステップＳ３１３にて算出された露光時間（例えば、Ｔｅ２が、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満か否かを判定し、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ３１４、Ｎｏ）、ステップＳ３０３に移行する。
【０１９２】
一方、Ｔｅ２がＴｅＨＩＧＨ未満である場合（ステップＳ３１４、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして、エラー中断する（ステップＳ３１５）。
【０１９３】
このフローチャートによれば、任意のσの値に対して、飽和画素輝度Ｊ０を算出することができ、最大画素輝度ＪＭＡＸをＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値に調整し、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【実施例４】
【０１９４】
ところで、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００は、複数の蛍光画像の撮影を０．５秒以内に行う。このことから、導入物質の吐出直後の状況を複数撮影すると、導入物質が広く拡散しないうちに複数の蛍光画像を取得することができる。
【０１９５】
そこで、以下の実施例４に示すマイクロインジェクション装置４００は、導入物質の吐出直後に、露光時間を変えながら複数の蛍光画像を取得し、取得した複数の蛍光画像から各最大画素輝度ＪＭＡＸを取得し、取得した各ＪＭＡＸの中から、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷによって規定される範囲の値を有するＪＭＡＸを選択し、選択したＪＭＡＸに対応する露光時間を最適な露光時間ＴｅＢとする。
【０１９６】
実施例４に示すマイクロインジェクション装置４００は、実施例１に示したマイクロインジェクション装置１００とほぼ同等の機能を有し、このマイクロインジェクション装置１００と同等の機能を有する機能部についての詳細な説明は省略する。
【０１９７】
図１７は、実施例４に係るマイクロインジェクション装置を示す図である。図１７に示すマイクロインジェクション装置４００は、制御部１０１と、キャピラリ針操作部１０２と、キャピラリ針１０３と、シャーレ１０４と、顕微鏡１０５と、高感度ＣＣＤカメラ１０６と、蛍光フィルタ１０７と、反射鏡１０８と、励起フィルタ１０９と、励起光源１１０とを有する。
【０１９８】
そして、制御部１０１は、記憶部１０１ａと、吐出制御部１０１ｂと、画像取得部１０１ｃと、露光時間制御部１０１ｄ、蛍光画像選択部１０１ｇとを有する。
【０１９９】
したがって、マイクロインジェクション装置１００との違いは、制御部１０１に、蛍光画像選択部１０１ｇを有していることである。以下、蛍光画像選択部１０１ｇが行う処理について説明する。
【０２００】
まず、吐出制御部１０１ｂが、高感度ＣＣＤカメラ１０６の初期露光時間をＴｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２に設定する。そして、最も長い初期露光時間をＴｅ４２、最も短い初期露光時間をＴｅ４０、Ｔｅ４０とＴｅ４２の間の初期露光時間をＴｅ４１とする。
【０２０１】
また、Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２の間は、１０倍以上の差分を設けるものとし、例えば、Ｔｅ４０を「０．００１秒」とした場合、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２はそれぞれ、０．０１秒、０．１秒とする。
【０２０２】
そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２で撮影された各蛍光画像を画像取得部１０１ｃから取得し、取得された３枚の蛍光画像の最大画素輝度をそれぞれ、ＪＭＡＸ４０、ＪＭＡＸ４１、ＪＭＡＸ４２とする。
【０２０３】
そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、上述した各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の最大画素輝度ＪＭＡＸを選択し、選択したＪＭＡＸをＪＭＡＸ４Ａとし、ＪＭＡＸ４Ａを露光時間制御部１０１ｄに出力する。
【０２０４】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸ４ＡがＪＬＯＷを超えている場合は、ＪＭＡＸ４Ａに対応する初期露光時間Ｔｅ４Ａを最適な露光時間ＴｅＢに決定する。
【０２０５】
例えば、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４０であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４０を最適な露光時間ＴｅＢとし、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４１であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４１を最適な露光時間ＴeＢとし、ＪＭＡＸ４Ａに対応する最大画素輝度がＪＭＡＸ４２であれば、Ｔｅ４Ａ＝Ｔｅ４２を最適な露光時間ＴｅＢとする。
【０２０６】
続いて、取得したＪＭＡＸ４ＡがＪＬＯＷを超えていない場合（ＪＭＡＸ４Ａ＜ＪＬｏｗ）、露光時間制御部１０１ｄの処理ついて説明する。まず、露光時間制御部１０１ｄは、ＪＭＡＸ４Ａに対応する初期露光時間Ｔｅ４ＡにＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸ４Ａの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ４Ａ）を乗算し、乗算した値「Ｔｅ４ＡＡ」を吐出制御部１０１ｂに出力する。
【０２０７】
例えば、ＪＭＡＸ４Ａ＝「５」、ＪＬＯＷ＝「１０」、ＪＨＩＧＨ＝「２０」、において、Ｃ１は「１５」となり、ＪＭＡＸ４Ａとの比率から、初期露光時間Ｔｅ４Ａを３倍した値が「Ｔｅ４ＡＡ」となる。
【０２０８】
その結果、露光時間「Ｔｅ４ＡＡ」で撮影した場合、ＪＭＡＸ４Ａは、「１５」となり、ＪＨＩＧＨとＪＬＯＷの範囲の値を有することになる。
【０２０９】
したがって、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満である場合（Ｔｅ４０Ａ＜ＴｅＨ１）、初期露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う。
【０２１０】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが、上述した場合とは異なり、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えている場合（Ｔｅ４０Ａ＞ＴｅＨＩＧＨ）、吐出制御部１０１ｂは、基準露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新しないで、吐出体積が較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する。
【０２１１】
次に、実施例４に示したマイクロインジェクション装置４００の処理について説明する。図１８は、実施例４に示すマイクロインジェクション装置の処理を説明するためのフローチャートである。
【０２１２】
まず、マイクロインジェクション装置４００に吐出圧力Ｐｉと吐出圧力の持続時間Ｔｉを組み合わせたデータや、吐出圧力の最大値ＰｉＭＡＸ、吐出圧力の持続時間の最大値ＴｉＭＡＸ等のデータが入力される（ステップＳ４００）。
【０２１３】
そして、ステップＳ４００にて入力された各種データが記憶部１０１ａに記憶される（ステップＳ４０１）。吐出制御部１０１ｂは、高感度ＣＣＤカメラ１０６に順次設定する初期露光時間Ｔｅ４０、Ｔｅ４１、Ｔｅ４２を準備する（ステップＳ４０２）。
【０２１４】
そして、吐出制御部１０１ｂは、記憶部１０１ａから吐出圧力ＰｉＭＡＸと吐出時間ＴｉＭＡＸを取得し、取得したＰｉＭＡＸとＴｉＭＡＸにより吐出命令を出力する（ステップＳ４０３）。
【０２１５】
その後、画像取得部１０１ｃが、初期露光時間Ｔｅ４０〜Ｔｅ４２まで、順次、高感度ＣＣＤカメラ１０６に設定しては、蛍光画像の取得を繰り返し（ステップＳ４０４）、取得した３枚の画像を蛍光画像選択部１０１ｇに出力する。そして、蛍光画像選択部１０１ｇは、取得した各蛍光画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ４０５）。
【０２１６】
次に、蛍光画像選択部１０１ｇは、各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の画素輝度のＪＭＡＸを選択する（ステップＳ４０６、Ｎｏ）（ステップＳ４０７）。
【０２１７】
ここで、蛍光画像選択部１０１ｇが、ステップＳ４０５で、３枚の蛍光画像を取得し、各ＪＭＡＸの中から調整目標の上限ＪＨＩＧＨを超えないもので最大の画素輝度のＪＭＡＸを選択できなかった場合（ステップＳ４０６、Ｙｅｓ）、吐出体積が較正許容範囲を上回っているとして吐出較正を中断する（ステップＳ４０８）。
【０２１８】
次に、蛍光画像選択部１０１ｇにより選択されたＪＭＡＸは、露光時間制御部１０１ｄに出力され、露光時間制御部１０１ｄは、取得したＪＭＡＸがＪＬＯＷを超えている場合（ステップＳ４０９、Ｎｏ）は、ＪＭＡＸに対応する初期露光時間Ｔｅ４Ａを最適な露光時間ＴeＢに決定する（ステップＳ４１０）。
【０２１９】
一方、蛍光画像選択部１０１ｇにより選択されたＪＭＡＸが、ＪＬＯＷを超えていない場合（ステップＳ４０９、Ｙｅｓ）は、ＪＭＡＸに対応する初期露光時間にＣ１=（ＪＨＩＧＨ＋ＪＬＯＷ）／２とＪＭＡＸの比率（Ｃ１／ＪＭＡＸ）を乗算する（ステップＳ４１１）。
【０２２０】
そして、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄより入力された露光時間（例えば、Ｔｅ４ＡＡ）が露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨ未満である場合（ステップＳ４１２、Ｎｏ）、露光時間をＴｅ４ＡＡに更新し、吐出命令をキャピラリ針操作部１０２に対して再び行う（ステップＳ４１３）。
【０２２１】
一方、吐出制御部１０１ｂは、露光時間制御部１０１ｄにより入力されたＴｅ４ＡＡが、上述した場合とは異なり、露光時間の上限ＴｅＨＩＧＨを越えている場合（ステップＳ４１２、Ｙｅｓ）、吐出制御部１０１ｂは、露光時間Ｔｅ４ＡをＴｅ４ＡＡに更新しないで、吐出体積Ｖが較正許容範囲を下回っているとして吐出較正を中断する（ステップＳ４１８）。
【０２２２】
ステップＳ４１３後、画像取得部１０１ｃが、蛍光画像を取得し（ステップＳ４１４）、露光時間制御部１０１ｄは、取得した画像から最大画素輝度ＪＭＡＸを取得する（ステップＳ４１５）。
【０２２３】
そして、露光時間制御部１０１ｄは、ステップＳ４１５にて取得したＪＭＡＸと記憶部１０１ａに記憶しているＪＨＩＧＨを比較し、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えている場合（ステップＳ４１６、Ｙｅｓ）、ステップＳ４１３にて設定した露光時間Ｔｅ４ＡＡに一定倍率（例えば、０．８倍）を乗算する（ステップＳ４１７）。その後、ステップＳ４１３に移行する。
【０２２４】
一方、ＪＭＡＸがＪＨＩＧＨを超えていない場合（ステップＳ４１６、Ｎｏ）、ステップＳ４０９に移行する。
【０２２５】
このフローチャートによれば、３種類の露光時間には１００倍の範囲があることから、最初のテスト吐出時に、吐出体積が極端に大きい場合でも、飽和せず、かつ、適度な大きさの最大画素輝度を有する蛍光画像を取得することができ、吐出較正の許容範囲を実用上問題のない程度まで拡大することができる。
【符号の説明】
【０２２６】
５、１１、１２、１４、１５、１６、１７ グラフ
２０ 背景画像
２１、２３、２４ 蛍光画像
２２ 差分画像
３０、３１、３２、４０、４１、９０、９１、９２、９３ 輝度プロファイル
５０、１００、２００、３００、４００ マイクロインジェクション装置
５０ａ、１０３ キャピラリ針
５０ｂ 蛍光液滴
５０ｃ、１０４ シャーレ
５０ｄ 培地
５０ｅ、１０５ 顕微鏡
５０ｆ、１０７ 蛍光フィルタ
５０ｇ、１０６ 高感度ＣＣＤカメラ
５０ｈ 蛍光試薬
５０ｉ シャーレ底
１０１ 制御部
１０１ａ 記憶部
１０１ｂ 吐出制御部
１０１ｃ 画像取得部
１０１ｄ 露光時間制御部
１０１ｅ 飽和画素輝度算出部
１０１ｆ 閾値画素数比算出部
１０１ｇ 蛍光画像選択部
１０２ キャピラリ針操作部
１０８ 反射鏡
１０９ 励起フィルタ
１１０ 励起光源
１１１ 定数テーブル
５００、６００ ２次元正規分布
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に注入する目的物に蛍光試薬を混入し、前記蛍光試薬を予め決められた露光時間で撮影して蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
前記蛍光画像から、最大画素輝度の輝度値を取得し、当該輝度値が所定範囲内に含まれるか否かを判定する判定部と、
前記輝度値が前記所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に応じて前記予め決められた露光時間を調整する露光時間調整部と
を有するマイクロインジェクション装置。
【請求項２】
前記蛍光画像全体に対する画像取得部の上限を超える領域の画素数の比率を算出し、算出した比率を用いて、真の最大輝度値を算出する輝度推定部を更に有し、前記露光時間調整部は、前記輝度推定部が算出した前記輝度値が前記所定範囲内に含まれるような露光時間に調整する請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項３】
前記輝度推定部は、前記比率と、前記比率を超えないような閾値を設定し、蛍光画像全体に対する前記閾値を超える領域の画素数の比率を更に算出し、算出した２種類の比率を用いて、前記真の最大輝度値を算出する請求項２に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項４】
前記蛍光画像取得部は、前記露光時間が異なる蛍光画像を複数取得し、取得した複数の蛍光画像から、前記所定範囲内の最大輝度値を含む蛍光画像を選定し、前記露光時間調整部は、選定された蛍光画像の最大輝度値に基づき前記露光時間を調整する請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項１】
細胞内に注入する目的物に蛍光試薬を混入し、前記蛍光試薬を予め決められた露光時間で撮影して蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
前記蛍光画像から、最大画素輝度の輝度値を取得し、当該輝度値が所定範囲内に含まれるか否かを判定する判定部と、
前記輝度値が前記所定範囲内に含まれない場合に、当該所定範囲内に輝度値が含まれるような露光時間を判定し、判定した露光時間に応じて前記予め決められた露光時間を調整する露光時間調整部と
を有するマイクロインジェクション装置。
【請求項２】
前記蛍光画像全体に対する画像取得部の上限を超える領域の画素数の比率を算出し、算出した比率を用いて、真の最大輝度値を算出する輝度推定部を更に有し、前記露光時間調整部は、前記輝度推定部が算出した前記輝度値が前記所定範囲内に含まれるような露光時間に調整する請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項３】
前記輝度推定部は、前記比率と、前記比率を超えないような閾値を設定し、蛍光画像全体に対する前記閾値を超える領域の画素数の比率を更に算出し、算出した２種類の比率を用いて、前記真の最大輝度値を算出する請求項２に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項４】
前記蛍光画像取得部は、前記露光時間が異なる蛍光画像を複数取得し、取得した複数の蛍光画像から、前記所定範囲内の最大輝度値を含む蛍光画像を選定し、前記露光時間調整部は、選定された蛍光画像の最大輝度値に基づき前記露光時間を調整する請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公開番号】特開２０１０−２３９９０４（Ｐ２０１０−２３９９０４Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９２４０７（Ｐ２００９−９２４０７）
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月６日（２００９．４．６）
【出願人】（０００００５２２３）富士通株式会社 (25,993)
【Ｆターム（参考）】
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