マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置
【課題】 十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置を提供すること。
【解決手段】 マイクロチャネル１２と、前記マイクロチャネル１２の途中に設けられた二つの接続部１３ａ及び１４ａで前記マイクロチャネル１２に接続されている流路１３及び１４と、を有し、二つの接続部１３ａ及び１４ａに対して前記マイクロチャネル１２の一方の端部側の、前記マイクロチャネル１２の内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていることを特徴とするマイクロチャネルチップ１０。
【解決手段】 マイクロチャネル１２と、前記マイクロチャネル１２の途中に設けられた二つの接続部１３ａ及び１４ａで前記マイクロチャネル１２に接続されている流路１３及び１４と、を有し、二つの接続部１３ａ及び１４ａに対して前記マイクロチャネル１２の一方の端部側の、前記マイクロチャネル１２の内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていることを特徴とするマイクロチャネルチップ１０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲食品中の微生物（細菌、真菌等）を検出するために、すべての生物中に存在するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を指標とし、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光を利用して検体中のＡＴＰ量を測定することが行われている。しかし、検体中には微生物中のＡＴＰ以外のＡＴＰ（以下、「バックグラウンドＡＴＰ」という。）が混入していることが多く、必ずしも高い精度で微生物を検出できるわけではなかった。
【０００３】
そのようなバックグラウンドＡＴＰを除去し、検体中の微生物の検出精度を高める方法として、下記特許文献１及び２では、検体中にＡＴＰ分解酵素（アデノシンリン酸デアミナーゼ又はルシフェラーゼ）を添加してバックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が提案されている。また、下記特許文献３では、半透膜からなるチューブにＡＴＰ分解酵素（アピラーゼ）を封入し、このチューブを検体溶液中に浸すことにより、バックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１１−５６３９３号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９１９７号公報
【特許文献３】特開２００３−２１０１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記特許文献１及び２の方法では、検体中にＡＴＰ分解酵素を添加してバックグラウンドＡＴＰを分解した後、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要があるので、操作が煩雑である。また、上記特許文献３の方法では、バックグラウンドＡＴＰがチューブ内に拡散する必要があるので、バックグラウンドＡＴＰの除去に長時間を要する。
【０００５】
ところで、飲食品中の微生物の検出は、微量の検体液（検体溶液又は液体検体）及び微量の試薬溶液を混合させることができる装置を用いて行うのが好ましい。このような装置としては、マイクロチャネルチップが適している。
【０００６】
そこで、本発明は、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、マイクロチャネルと、前記マイクロチャネルの途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロチャネルに接続されている流路と、を有し、前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方の端部側の、前記マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていることを特徴とするマイクロチャネルチップを提供する。
【０００８】
このようなマイクロチャネルチップでは、ＡＴＰ分解酵素が固定化されている側の、マイクロチャネルの端部から検体液（検体溶液又は液体検体）をマイクロチャネルに導入すると、まず、検体液のみがマイクロチャネルを流通し、バックグラウンドＡＴＰがＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬を、いずれかを先に、又は両方を同時に、一つ又は複数の流路からマイクロチャネルに導入すると、これらが検体液と混合される。そして、検体液中に微生物が存在する場合は、微生物中のＡＴＰがＡＴＰ抽出試薬によって抽出され、抽出されたＡＴＰがＡＴＰ検出試薬と反応して発光する。生じた光を検出することによって、検体中の微生物が検出される。
【０００９】
上記マイクロチャネルチップを用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰが分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００１０】
また、ＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定化されているので、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される接続部にＡＴＰ分解酵素が到達することがない。従って、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がなく、それだけ簡便な操作で短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００１１】
更に、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われることになる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）で発光反応が生じることになる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００１２】
更に、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００１３】
なお、本発明において、「酵素が固定化されている」とは、酵素が物理吸着、化学結合等により固体表面に結合しており、固体表面を水又は水溶液と接触させても、酵素が固体表面から脱離しないことをいう。
【００１４】
上記マイクロチャネルチップは、上記少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素の他に、更にＡＤＰ（アデノシン二リン酸）分解酵素が固定化されているか、または、上記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねることが好ましい。
【００１５】
すなわち、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出するには、ＡＴＰ増幅試薬によって微生物中のＡＴＰを増幅して検出するのが好ましい。しかし、ＡＴＰ増幅試薬によってＡＴＰを増幅する場合、ＡＤＰはＡＴＰ増幅反応の過程でＡＴＰに変換されて増幅されるので、検体液中に混入しているＡＤＰ（以下、「バックグラウンドＡＤＰ」という。）は、検体液とＡＴＰ増幅試薬とが混合される前に除去しておく必要がある。上記少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内壁面に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されているか、または、上記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねれば、ＡＴＰ増幅試薬を用いた場合にも、検体液とＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰが分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、ＡＴＰ検出試薬と同時か、又はそれより前に、ＡＴＰ増幅試薬を検体液と混合させることによって、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出することができる。なお、ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねれば、ＡＴＰ分解酵素及びＡＤＰ分解酵素を別々にマイクロチャネルに固定化する必要がなく、それだけマイクロチャネルチップの製造の際の作業が簡便になる。また、マイクロチャネルの内壁面に固定化するＡＴＰ分解酵素及びＡＤＰ分解酵素の量的比率を制御しやすい。
【００１６】
なお、本発明において、「ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねる」とは、ＡＴＰ分解酵素、すなわちＡＴＰ分解酵素活性を有する物質（例えば、タンパク質）が更にＡＤＰ分解酵素活性を有することを意味し、この物質においてＡＴＰ分解酵素活性部位及びＡＤＰ分解酵素活性部位が異なっていてもよい。
【００１７】
上記マイクロチャネルチップを用いて検体中の微生物を検出する場合、マイクロチャネル中の発光反応によって生じる光は光検出器により検出される。すなわち、本発明はまた、上記マイクロチャネルチップと、そのマイクロチャネル内で生じた光を検出する光検出器と、を備える微生物検出装置を提供する。
【００１８】
このような微生物検出装置は、上記マイクロチャネルチップを備えるので、十分に高い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の微生物を検出することを可能にする。
【００１９】
なお、ＡＴＰ抽出試薬とは、微生物を死滅させて微生物中のＡＴＰを抽出する試薬であり、例として、溶菌酵素（リゾチーム、キチナーゼ、キトサナーゼ等）、陽イオン界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル等）が挙げられる。ＡＴＰ抽出試薬中には、溶菌酵素等に加えて、例えば、非イオン性界面活性剤、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸等）又は糖類（スクロース、グルコース、フルクトース等）が含まれていてもよい。
【００２０】
ＡＴＰ検出試薬とは、ＡＴＰと反応して発光等を生じさせることにより、ＡＴＰを検出する試薬であり、例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン（Ｍｇ２＋等）からなる試薬が挙げられる。ＡＴＰは、酸素及び２価金属イオンの存在下でルシフェリン及びルシフェラーゼと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。
【００２１】
ＡＴＰ増幅試薬とは、ＡＴＰを増幅させる試薬であり、例えば、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬が挙げられる。ＡＴＰは、アデニル酸キナーゼの存在下でＡＭＰと反応して２分子のＡＤＰを生じ、この２分子のＡＤＰは、ポリリン酸キナーゼの存在下でポリリン酸と反応して２分子のＡＴＰを生じる。この反応を繰り返すことにより、ＡＴＰは増幅される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明においては、同一または同等の要素には同一符号を用いるものとし、重複する説明は省略する。
【００２４】
以下の本発明の実施形態の説明においては、ＡＴＰ増幅試薬としては、ＡＭＰ、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬を用いるものとする。また、ＡＭＰ及びポリリン酸からなる試薬を「ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）」といい、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬を「ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）」という。
【００２５】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０は、図１に示されているように、マイクロチャネル１２と、マイクロチャネル１２の途中に設けられた二つの接続部１３ａ及び１４ａでそれぞれマイクロチャネル１２に接続されている二つの流路１３及び１４と、を有する。また、図１には示されていないが、二つの接続部１３ａ及び１４ａに対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面には、ＡＴＰ分解酵素が固定化されている。
【００２６】
マイクロチャネル１２は、蛇行状に形成されている。マイクロチャネル１２の一方の端部には、検体液を収容するためのウェル１５が、他方の端部には、マイクロチャネル１２を流通した反応液を収容するためのウェル１８が設けられている。また、流路１３及び１４の端部にはそれぞれ、各種試薬溶液を収容するためのウェル１６及び１７が設けられている。以下、本発明の第１実施形態の説明においては、ウェル１６にＡＴＰ抽出試薬溶液が、ウェル１７にＡＴＰ検出試薬溶液が収容されているものとする。
【００２７】
マイクロチャネルチップ１０では、まず、ウェル１５に収容されている検体液をマイクロチャネル１２に導入すると、接続部１３ａまでは検体液のみがマイクロチャネル１２を流通する。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されているＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液が接続部１４ａまで流通する。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。最後に、ウェル１７に収容されているＡＴＰ検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ検出試薬溶液の混合液がウェル１８まで流通する。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。
【００２８】
マイクロチャネル１２のうちウェル１５と接続部１３ａとの間の部分は蛇行状に形成されていて十分に長いので、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、その部分の内壁面に固定化されたＡＴＰ分解酵素によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチャネル１２のうち接続部１３ａと接続部１４ａとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、微生物中のＡＴＰはＡＴＰ抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更に、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、発光反応によって生じた光は発光強度のピーク位置で確実に検出することができる。
【００２９】
マイクロチャネルチップ１０を用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰがほぼ完全に分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００３０】
また、マイクロチャネルチップ１０を用いれば、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がない。また、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）で発光反応が生じる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００３１】
更に、マイクロチャネルチップ１０を用いれば、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００３２】
図２は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図である。図３は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図１〜図３に示されているように、マイクロチャネルチップ１０は三層の基板１１ａ〜１１ｃを備え、マイクロチャネル１２及びウェル１５〜１８は、基板１１ａに形成されている。
【００３３】
基板１１ａ〜１１ｃは、透光性を有する材料で構成されていればよい。そのような材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の樹脂や、石英ガラス又はパイレックス（登録商標）ガラス等のガラスが挙げられる。
【００３４】
図３に示されているように、マイクロチャネル１２の断面の形状は、長辺が基板の表面に平行な長方形である。マイクロチャネル１２の幅及び深さは、好ましくは１ｍｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ〜５００μｍであり、更に好ましくは０．１μｍ〜１００μｍである。幅及び深さが１ｍｍを超えると、幅及び深さが１ｍｍ以下である場合に比べて、発光反応の際の検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが大きくなって、反応が遅くなり、また、発光量の測定結果の再現性が低くなる傾向がある。幅及び深さが０．１〜５００μｍであると、検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが小さくなって、反応が速くなり、また、測定結果の再現性が高くなる傾向が顕著である。幅及び深さが０．１〜１００μｍであると、上記の傾向が更に顕著である。なお、マイクロチャネルの幅とは、マイクロチャネルの延び方向に垂直で、基板の表面に平行な方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。また、マイクロチャネルの深さとは、基板の表面に垂直な方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。図３においては、マイクロチャネル１２の断面によって形成される長方形の長辺の長さが幅に、短辺の長さが深さに当たる。
【００３５】
マイクロチャネルチップ１０は、例えば、次のように製造することができる。
【００３６】
まず、シリコンウェハ上にレジストを塗布し、マイクロチャネル１２、流路１３、流路１４及びウェル１５〜１８に対応した形状にパターニング（露光、現像）した後、シリコンウェハの表面部分をエッチングする。こうしてシリコン表面にマイクロチャネル１２、流路１３、１４及びウェル１５〜１８に対応した凸部が形成される。
【００３７】
次に、上記レジストを除去し、未硬化のＰＤＭＳを塗布する。そして、ＰＤＭＳを硬化（１２５℃、２０分）させ、ＰＤＭＳを剥離することにより、マイクロチャネル１２、流路１３、１４及びウェル１５〜１８の形状を有するＰＤＭＳ硬化物が得られる。ＰＤＭＳ硬化物は、更に加工（穴あけ加工等）してもよい。
【００３８】
最後に、ガラスウェハ上に別の未硬化のＰＤＭＳを塗布し、仮硬化（５０℃、１０分）させる。仮硬化したＰＤＭＳの上に先のＰＤＭＳ硬化物を貼り合わせ、仮硬化したＰＤＭＳを硬化（１２５℃、２０分）する。
【００３９】
マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されるＡＴＰ分解酵素としては、アピラーゼ、アデノシンリン酸デアミナーゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。ＡＴＰ分解酵素はＡＤＰ分解酵素を兼ねていてもよく、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素としてはアピラーゼが挙げられる。
【００４０】
ＡＴＰ分解酵素の固定化は、例えば、次のように行うことができる。まず、マイクロチャネル１２に酵素溶液を流通させた後、開放部（ウェル）をすべてシールし、冷蔵庫内（約４℃）で約５時間放置する。次いで、マイクロチャネル１２にバッファーを流通させて、脱離しやすい酵素を取り除き、最後に、マイクロチャネル１２内部を空気で置換する。
【００４１】
酵素が固定化されたかどうか、及び固定化された酵素のＡＴＰ分解能を判定するには、例えば、マイクロチャネル１２にＡＴＰ溶液を流通させた後、ウェル１８に収容された反応済溶液を回収し、ここにルシフェリン及びルシフェラーゼを加えて、ルミテスターで発光量を測定すればよい。元のＡＴＰ溶液に比べて発光量が減少していれば、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていると判定することができる。また、発光量の減少量の大小によって、ＡＴＰ分解能を判定することができる。
【００４２】
図４は、第１実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。図５は、第１実施形態に係る微生物検出装置の、図４の矢印Ｖの向きに見た側面図である。
【００４３】
図４及び図５に示される微生物検出装置１００は、マイクロチャネルチップ１０と、マイクロチャネル１２内で生じた光を検出する光検出器２５（図４には示されていない）と、を備えている。更に、反射板１９と、チューブ２１ａ〜２３ａ（図４には示されていない）付きの蓋２１〜２３と、チューブ２１ａ〜２３ａに連結されたポンプ（図４及び図５には示されていない）とを備えている。ウェル１８は大気に開放されている。
【００４４】
光検出器２５は受光部２４を有し、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分、すなわち発光が生じる領域（以下、「発光領域」という。）に受光面２４ａが対向するように、マイクロチャネルチップ１０の一方の表面（基板１１ｃの表面）側に配置されている。また、反射板１９は、光反射面１９ａが受光部２４の受光面２４ａに対向するように、マイクロチャネルチップ１０に対して光検出器２５と反対の表面（基板１１ａの表面）側に配置されている。
【００４５】
また、蓋２１〜２３は、それぞれウェル１５〜１７を覆っている。蓋２１〜２３に取り付けられているチューブ２１ａ〜２３ａは、それぞれウェル１５〜１７とポンプ内部とを連通している。ウェル１５に収容されている液体は、ポンプで圧力を加えることによって、直接にマイクロチャネル１２に導入される。また、ウェル１６及び１７に収容されている液体は、ポンプで圧力を加えることによって、それぞれ流路１３及び１４を通じてマイクロチャネル１２に導入される。マイクロチャネル１２、流路１３及び１４を流通する液体の流通速度はそれぞれ、チューブ２１ａ〜２３ａに連結されているポンプで調節することができる。
【００４６】
図６〜図９は、マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。図６〜図９においては、微生物検出装置を、便宜上、マイクロチャネル１２の一部（実線で表した部分）が表面に現れるようにマイクロチャネルチップ１０の基板１１ａを一部切り欠いて図示している。図６〜図９における「Ｐ＝０」又は「Ｐ＝＋Ｐ１」等は、対応するウェルに収容されている液体に加えられた圧力が０又はＰ１等であることを表す。また、ドットの集合は液体を表す。なお、図６〜図９には、光検出器２５、反射板１９、蓋２１〜２３、チューブ２１ａ〜２３ａ及びポンプは示されていない。
【００４７】
微生物検出装置１００では、まず、ウェル１５に収容されている検体液にＰ１の圧力を加えて、検体液をマイクロチャネル１２に導入し、接続部１３ａまでマイクロチャネル１２を流通させる。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されているＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。検体液が接続部１３ａの少し手前（例えば、図６に示される位置）まで流通した時点で、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液にＰ２の圧力を加えて、ＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入し、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液を接続部１４ａまで流通させる。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。検体液が接続部１４ａの少し手前（例えば、図７に示される位置）まで流通した時点で、ウェル１７に収容されているＡＴＰ検出試薬溶液にＰ３の圧力を加えて、ＡＴＰ検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入し、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ検出試薬溶液の混合液をウェル１８まで流通させる。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。光を検出する際は、発光強度のピーク位置及びその前後で確実に光が検出されるように、すなわち、液体が図８に示される位置から図９に示される位置に至る過程、特に液体が蛇行部分を流通する過程で発光強度がピークを示すように、Ｐ１、Ｐ２又はＰ３を調節する。
【００４８】
微生物検出装置１００はマイクロチャネルチップ１０を備えているので、これを用いれば、十分に高い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の微生物を検出することができる。
【００４９】
また、微生物検出装置１００では、発光領域で生じた光のうち、受光面２４ａと反対側に向かう光も、反射面１９ａで反射されて受光面２４ａに入射する。また、発光領域のうち反射板１９及び受光部２４に挟まれた部分ではマイクロチャネル１２が蛇行状に密に形成されているので、受光面２４ａ及び反射面１９ａに向かう光の量は極めて多い。従って、極めて高い感度で微生物を検出することができる。
【００５０】
光検出器２５としては、光電子増倍管、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００５１】
反射板１９は、光を反射する材料で構成されていればよい。そのような材料としては、アルミニウム、ニッケル、チタン、クロム、金、銅、鉄等の金属が挙げられる。
【００５２】
（第２実施形態）
図１０は、第２実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第２実施形態に係るマイクロチャネルチップ２０は、図１０に示されるように、マイクロチャネル１２と、接続部１３ａ及び１４ａの間に設けられた接続部２６ａでマイクロチャネル１２に接続されている流路２６を更に有し、流路２６の端部に試薬溶液を収容するためのウェル２７が設けられている点で、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０と相違する。また、図１０には示されていないが、三つの接続部１３ａ、２６ａ及び１４ａに対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面、すなわちウェル１５と接続部１３ａとの間の、マイクロチャネル１２の内壁面に、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素が固定化されている点で、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０と相違する。
【００５３】
本発明の第２実施形態の説明においては、ウェル１６にＡＴＰ抽出試薬溶液が、ウェル２７にＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液が、ウェル１７にＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬（以下、ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬を「ＡＴＰ増幅−検出試薬」という。）の溶液が収容されているものとする。
【００５４】
なお、本発明のマイクロチャネルチップにおいて、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬の他に更にＡＴＰ増幅試薬を用いる場合、ＡＴＰ増幅試薬がＡＭＰ、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬であるとすると、ポリリン酸のみ、又はＡＭＰ及びポリリン酸と、ＡＴＰ増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とは別々にマイクロチャネルに導入されるのが好ましい。ポリリン酸のみ、又はＡＭＰ及びポリリン酸と、ＡＴＰ増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とが予め混合されていなければ、各種酵素（アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びルシフェラーゼ）に不純物として混入している可能性の高いＡＴＰが増幅されることがなく、本発明のマイクロチャネルチップを用いた検体中の微生物の検出をより高い精度で行うことができる。
【００５５】
マイクロチャネルチップ２０では、まず、ウェル１５に収容されている検体液をマイクロチャネル１２に導入すると、接続部１３ａまでは検体液のみがマイクロチャネル１２を流通する。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されている、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液が接続部２６ａまで流通する。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。次いで、ウェル２７に収容されているＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液を流路２６を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液の混合液が接続部１４ａまで流通する。この過程では、ＡＴＰ増幅試薬を構成する試薬のすべてがマイクロチャネル１２に導入されているわけではないので、抽出されたＡＴＰの増幅は起こらない。最後に、ウェル１７に収容されているＡＴＰ増幅−検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液及びＡＴＰ増幅−検出試薬溶液の混合液がウェル１８まで流通する。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは増幅されながら発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。
【００５６】
マイクロチャネル１２のうちウェル１５と接続部１３ａとの間の部分は蛇行状に形成されていて十分に長いので、検体液中のバックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰは、その部分の内壁面に固定化されている、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチャネル１２のうち接続部１３ａと接続部１４ａとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、微生物中のＡＴＰはＡＴＰ抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更に、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、抽出されたＡＴＰは十分に増幅され、また、発光反応によって生じた光は発光強度のピーク位置で確実に検出することができる。
【００５７】
マイクロチャネルチップ２０を用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）又はＡＴＰ増幅−検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰがほぼ完全に分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、ＡＴＰ増幅試薬がＡＴＰ検出試薬と同時か、又はそれより前に検体液と混合されるので、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出することができる。
【００５８】
また、マイクロチャネルチップ２０を用いれば、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がない。また、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われる。同様に、バックグラウンドＡＤＰの除去も短時間で行われる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅−検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）でＡＴＰ増幅反応及び発光反応が生じる。従って、十分に高い感度及び精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００５９】
更に、マイクロチャネルチップ２０を用いれば、検体液、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅−検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００６０】
ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素としては、アピラーゼが挙げられる。
【００６１】
（他の実施形態）
本発明の実施形態は、上記の第１実施形態及び第２実施形態に限定されるものではない。以下に他の実施形態を例示する。
【００６２】
マイクロチャネル１２の途中に設けられた少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面には、ＡＴＰ分解酵素の他に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されていてもよい。ここで、ＡＴＰ分解酵素は、ＡＤＰ分解酵素を兼ねていても兼ねていなくてもよい。ＡＤＰ分解酵素の固定化は、ＡＴＰ分解酵素の固定化と同様に行うことができる。
【００６３】
マイクロチャネル１２に接続されている流路の数は１又は４以上であってもよい。
【００６４】
流路の数が１である場合は、例えば、微生物中のＡＴＰを検出するための試薬としてＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬のみを用い、これらの試薬を一つの流路から同時にマイクロチャネル１２に導入すればよい。
【００６５】
流路の数が４である場合は、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）、ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬を四つの流路から別々にマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、まず、ＡＴＰ抽出試薬を最上流側の一つの流路から導入し、次いで、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）を二つの流路から導入し（いずれが先でもよい）、最後に、ＡＴＰ検出試薬を最下流側の一つの流路から導入する。また、いずれか一つ〜三つの流路を用いて、流路の数が１〜３の場合と同様に各種試薬をマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、試薬の導入に使用されない流路の端部、又はここに設けられたウェルは蓋等で密閉しておく。
【００６６】
流路の数が５以上である場合は、いずれか一つ〜四つの流路を用いて、流路の数が１〜４の場合と同様に各種試薬をマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、試薬の導入に使用されない流路の端部、又はここに設けられたウェルは蓋等で密閉しておく。
【００６７】
マイクロチャネルチップは、ウェルを有していなくてもよい。ウェルが設けられていないマイクロチャネル１２又は流路への検体液又は各種試薬溶液の導入は、シリンジ等で行うことができる。マイクロチャネル１２を流通した反応液を収容するためのウェル１８を有していない場合は、反応液を収容するための容器等をマイクロチャネル１２の下流側の端部に設けておけばよい。
【００６８】
図１１は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。マイクロチャネル１２に接続されている流路は、図１１の流路２８のように、基板１１ａの表面に垂直に形成されていてもよい。例えば、図１１の流路２８のように流路が基板１１ａの表面に開口している場合は、シリンジ等で各種試薬溶液を流路に注入することができる。
【００６９】
図１２及び図１３は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図１２に示されるように、マイクロチャネル１２は、三層の基板１１ｄ〜１１ｆのうちの中間層の基板１１ｅに形成されていてもよい。また、図１３に示されるように、マイクロチャネルチップは二層の基板１１ｇ及び１１ｈからなるものでもよく、マイクロチャネル１２を構成する溝は、二層の基板１１ｇ及び１１ｈの両方に形成されていてもよい。
【００７０】
マイクロチャネルの断面の形状は、正方形、台形、円形、半円形、楕円形等であってもよい。
【００７１】
マイクロチャネル１２及び流路には逆止弁が設けられていてもよい。逆止弁が設けられていると、液体の逆流を防いで、逆流によるトラブルを未然に防ぐことができる。
【００７２】
微生物検出装置においては、ウェル１５〜１７が大気に開放され、ウェル１８が蓋で覆われ、ポンプ内部に連通されていてもよい。この場合は、ポンプでウェル１８の内部を減圧することによって、液体をマイクロチャネル１２及び流路に流通させる。
【００７３】
微生物検出装置には恒温装置が設けられていてもよい。マイクロチャネル１２内で起こる反応は発熱又は吸熱を伴うため、反応温度を調節しないと、温度変化により反応が不安定になるおそれがある。また、温度が変化すると、液体が膨張して不要な気泡が発生し、マイクロチャネル１２の目詰まりが生じるおそれがある。恒温装置が設けられていれば、そのようなトラブルを未然に防ぐことができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
（実施例１）
図１４は、実施例１において用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。実施例１において用いられたマイクロチャネルチップ３０は、図１４に示されるように、蛇行状のマイクロチャネル３１（幅３３μｍ、深さ３８μｍ、長さ１６０ｍｍ）、及びその両端部に設けられた二つのウェル３２及び３３を有する。マイクロチャネルチップ３０は三層の基板からなり、基板２９ａ（外層）及び基板２９ｂ（中間層）は各々、ＰＤＭＳ基板であり、もう一方の外層（図１４には、示されていない。）はガラス基板である。マイクロチャネル３１、ウェル３２及び３３は、基板２９ａに形成されている。
【００７６】
アピラーゼ（Sigma社製、GradeVII）１．３４ｍｇ／ｍＬのバッファー（５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）溶液をウェル３２に注入し、この溶液をマイクロチャネル３１に流通させた後、４℃で５時間インキュベートした。次いで、バッファー（５０ｍＭTris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）のみをマイクロチャネル３１に流通させた。
【００７７】
次いで、ＡＴＰ１×１０−７Ｍのバッファー（５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）溶液をウェル３２に注入し、この溶液をマイクロチャネル３１に流通させた後、溶液１００μＬを回収し、これにルシフェリン及びルシフェラーゼを含有する試薬（ルシフェール２５０プラス、キッコーマン株式会社製）１００μＬを加えた。発光量（ＲＬＵ）をルミテスターで測定し、溶液中のＡＴＰ濃度を求めた。
【００７８】
図１５は、実施例１における反応時間（流通時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【００７９】
（比較例１）
アピラーゼ（Sigma社製、A6535）５０ユニット／ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液２００μＬを透析チューブ（三光純薬株式会社製、UC8-32-25）に封入した。
【００８０】
ＡＴＰのリン酸バッファー（ｐＨ ７．０）溶液中に上記透析チューブを１時間３０分浸漬した後、溶液１００μＬを回収し、実施例１と同様に溶液中のＡＴＰ濃度を求めた。
【００８１】
図１６は、比較例１における反応時間（浸漬時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【００８２】
図１５及び図１６から明らかなように、ＡＴＰ濃度が反応前の濃度の約１／１０に減少するのに、実施例１では１秒を要しなかったのに対して、比較例１では１．５時間を要した。すなわち、実施例１及び比較例１により、アピラーゼが固定化されたマイクロチャネルにＡＴＰ溶液を流通させると、極めて短時間に多量のＡＴＰが分解除去されることが確認された。
【００８３】
（実施例２）
図１〜図５に示される、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０及び微生物検出装置１００を用いた。基板１１ａ及び１１ｂとしてＰＤＭＳ基板を、基板１１ｃとしてガラス基板を用い、また、ＡＴＰ分解酵素としてアピラーゼを用いた。
【００８４】
検体液として大腸菌入りの１０ｎＭ ＡＴＰ溶液を、ＡＴＰ抽出試薬として０．０１％塩化ベンザルコニウムを、ＡＴＰ検出試薬としてルシフェラーゼ（０．２５ｍｇ／ｍＬ、和光純薬工業株式会社製）、Ｄ（−）−ルシフェリン（２．５ｍＭ、和光純薬工業株式会社製）及びＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１０ｍＭ）からなる試薬を用いて、上記マイクロチャネルチップ及び光検出器により発光量（ＣＰＳ）を測定した。
【００８５】
なお、検体液はウェル１５から３０μＬ／minで、ＡＴＰ抽出試薬はウェル１６から３０μＬ／minで、ＡＴＰ検出試薬はウェル１７から６０μＬ／minでマイクロチャネル１２に導入した。光検出器としては、光電子増倍管（Ｈ７１５５、浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。
【００８６】
（比較例２）
ＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定化されていない他はマイクロチャネルチップ１０及び微生物検出装置１００と同様の、マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置を用いて、実施例２と同様の操作を行った。
【００８７】
実施例２及び比較例２の結果を表１及び図１７に示す。図１７は、実施例２及び比較例２における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を示すグラフである。表１及び図１７から明らかなように、ＡＴＰ分解酵素が固定化されたマイクロチャネルチップを用いた場合は、検体液中の大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係が認められたのに対して、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていないマイクロチャネルチップを用いた場合は、大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係が認められなかった。すなわち、表１及び図１７は、ＡＴＰ分解酵素が固定化されたマイクロチャネルチップを用いれば、発光量を求めることによって検体液中の大腸菌濃度を十分に高い精度で求めることができることを示している。
【００８８】
【表１】
【００８９】
実施例２及び比較例２により、本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装置を用いれば、十分に高い精度で微生物を検出することができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装置は、飲食品中の微生物（細菌、真菌等）の検出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
【図２】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図である。
【図３】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図４】第１実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。
【図５】第１実施形態に係る微生物検出装置の、図４の矢印Ｖの向きに見た側面図である。
【図６】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図７】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図８】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図９】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図１０】第２実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
【図１１】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１２】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１３】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１４】実施例１において用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。
【図１５】実施例１における反応時間（流通時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【図１６】比較例１における反応時間（浸漬時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例２及び比較例２における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９２】
１０…マイクロチャネルチップ、１１ａ〜１１ｈ…基板、１２…マイクロチャネル、１３，１４…流路、１３ａ，１４ａ…接続部、１５〜１８…ウェル、１００…微生物検出装置、１９…反射板、１９ａ…反射面、２１〜２３…蓋、２１ａ〜２３ａ…チューブ、２４…受光部、２４ａ…受光面、２５…光検出器、２０…マイクロチャネルチップ、２６…流路、２６ａ…接続部、２７…ウェル、２８…流路、３０…マイクロチャネルチップ、２９ａ，２９ｂ…基板、３１…マイクロチャネル、３２，３３…ウェル。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲食品中の微生物（細菌、真菌等）を検出するために、すべての生物中に存在するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を指標とし、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光を利用して検体中のＡＴＰ量を測定することが行われている。しかし、検体中には微生物中のＡＴＰ以外のＡＴＰ（以下、「バックグラウンドＡＴＰ」という。）が混入していることが多く、必ずしも高い精度で微生物を検出できるわけではなかった。
【０００３】
そのようなバックグラウンドＡＴＰを除去し、検体中の微生物の検出精度を高める方法として、下記特許文献１及び２では、検体中にＡＴＰ分解酵素（アデノシンリン酸デアミナーゼ又はルシフェラーゼ）を添加してバックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が提案されている。また、下記特許文献３では、半透膜からなるチューブにＡＴＰ分解酵素（アピラーゼ）を封入し、このチューブを検体溶液中に浸すことにより、バックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１１−５６３９３号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９１９７号公報
【特許文献３】特開２００３−２１０１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記特許文献１及び２の方法では、検体中にＡＴＰ分解酵素を添加してバックグラウンドＡＴＰを分解した後、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要があるので、操作が煩雑である。また、上記特許文献３の方法では、バックグラウンドＡＴＰがチューブ内に拡散する必要があるので、バックグラウンドＡＴＰの除去に長時間を要する。
【０００５】
ところで、飲食品中の微生物の検出は、微量の検体液（検体溶液又は液体検体）及び微量の試薬溶液を混合させることができる装置を用いて行うのが好ましい。このような装置としては、マイクロチャネルチップが適している。
【０００６】
そこで、本発明は、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、マイクロチャネルと、前記マイクロチャネルの途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロチャネルに接続されている流路と、を有し、前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方の端部側の、前記マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていることを特徴とするマイクロチャネルチップを提供する。
【０００８】
このようなマイクロチャネルチップでは、ＡＴＰ分解酵素が固定化されている側の、マイクロチャネルの端部から検体液（検体溶液又は液体検体）をマイクロチャネルに導入すると、まず、検体液のみがマイクロチャネルを流通し、バックグラウンドＡＴＰがＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬を、いずれかを先に、又は両方を同時に、一つ又は複数の流路からマイクロチャネルに導入すると、これらが検体液と混合される。そして、検体液中に微生物が存在する場合は、微生物中のＡＴＰがＡＴＰ抽出試薬によって抽出され、抽出されたＡＴＰがＡＴＰ検出試薬と反応して発光する。生じた光を検出することによって、検体中の微生物が検出される。
【０００９】
上記マイクロチャネルチップを用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰが分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００１０】
また、ＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定化されているので、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される接続部にＡＴＰ分解酵素が到達することがない。従って、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がなく、それだけ簡便な操作で短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００１１】
更に、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われることになる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）で発光反応が生じることになる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００１２】
更に、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００１３】
なお、本発明において、「酵素が固定化されている」とは、酵素が物理吸着、化学結合等により固体表面に結合しており、固体表面を水又は水溶液と接触させても、酵素が固体表面から脱離しないことをいう。
【００１４】
上記マイクロチャネルチップは、上記少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素の他に、更にＡＤＰ（アデノシン二リン酸）分解酵素が固定化されているか、または、上記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねることが好ましい。
【００１５】
すなわち、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出するには、ＡＴＰ増幅試薬によって微生物中のＡＴＰを増幅して検出するのが好ましい。しかし、ＡＴＰ増幅試薬によってＡＴＰを増幅する場合、ＡＤＰはＡＴＰ増幅反応の過程でＡＴＰに変換されて増幅されるので、検体液中に混入しているＡＤＰ（以下、「バックグラウンドＡＤＰ」という。）は、検体液とＡＴＰ増幅試薬とが混合される前に除去しておく必要がある。上記少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネルの一方の端部側の、マイクロチャネルの内壁面に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されているか、または、上記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねれば、ＡＴＰ増幅試薬を用いた場合にも、検体液とＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰが分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、ＡＴＰ検出試薬と同時か、又はそれより前に、ＡＴＰ増幅試薬を検体液と混合させることによって、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出することができる。なお、ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねれば、ＡＴＰ分解酵素及びＡＤＰ分解酵素を別々にマイクロチャネルに固定化する必要がなく、それだけマイクロチャネルチップの製造の際の作業が簡便になる。また、マイクロチャネルの内壁面に固定化するＡＴＰ分解酵素及びＡＤＰ分解酵素の量的比率を制御しやすい。
【００１６】
なお、本発明において、「ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねる」とは、ＡＴＰ分解酵素、すなわちＡＴＰ分解酵素活性を有する物質（例えば、タンパク質）が更にＡＤＰ分解酵素活性を有することを意味し、この物質においてＡＴＰ分解酵素活性部位及びＡＤＰ分解酵素活性部位が異なっていてもよい。
【００１７】
上記マイクロチャネルチップを用いて検体中の微生物を検出する場合、マイクロチャネル中の発光反応によって生じる光は光検出器により検出される。すなわち、本発明はまた、上記マイクロチャネルチップと、そのマイクロチャネル内で生じた光を検出する光検出器と、を備える微生物検出装置を提供する。
【００１８】
このような微生物検出装置は、上記マイクロチャネルチップを備えるので、十分に高い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の微生物を検出することを可能にする。
【００１９】
なお、ＡＴＰ抽出試薬とは、微生物を死滅させて微生物中のＡＴＰを抽出する試薬であり、例として、溶菌酵素（リゾチーム、キチナーゼ、キトサナーゼ等）、陽イオン界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル等）が挙げられる。ＡＴＰ抽出試薬中には、溶菌酵素等に加えて、例えば、非イオン性界面活性剤、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸等）又は糖類（スクロース、グルコース、フルクトース等）が含まれていてもよい。
【００２０】
ＡＴＰ検出試薬とは、ＡＴＰと反応して発光等を生じさせることにより、ＡＴＰを検出する試薬であり、例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価金属イオン（Ｍｇ２＋等）からなる試薬が挙げられる。ＡＴＰは、酸素及び２価金属イオンの存在下でルシフェリン及びルシフェラーゼと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。
【００２１】
ＡＴＰ増幅試薬とは、ＡＴＰを増幅させる試薬であり、例えば、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬が挙げられる。ＡＴＰは、アデニル酸キナーゼの存在下でＡＭＰと反応して２分子のＡＤＰを生じ、この２分子のＡＤＰは、ポリリン酸キナーゼの存在下でポリリン酸と反応して２分子のＡＴＰを生じる。この反応を繰り返すことにより、ＡＴＰは増幅される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、十分に高い精度で、かつ簡便な操作で短時間に検体中の微生物（細菌、真菌等）を検出することを可能にするマイクロチャネルチップ、及びこれを用いた微生物検出装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明においては、同一または同等の要素には同一符号を用いるものとし、重複する説明は省略する。
【００２４】
以下の本発明の実施形態の説明においては、ＡＴＰ増幅試薬としては、ＡＭＰ、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬を用いるものとする。また、ＡＭＰ及びポリリン酸からなる試薬を「ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）」といい、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬を「ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）」という。
【００２５】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０は、図１に示されているように、マイクロチャネル１２と、マイクロチャネル１２の途中に設けられた二つの接続部１３ａ及び１４ａでそれぞれマイクロチャネル１２に接続されている二つの流路１３及び１４と、を有する。また、図１には示されていないが、二つの接続部１３ａ及び１４ａに対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面には、ＡＴＰ分解酵素が固定化されている。
【００２６】
マイクロチャネル１２は、蛇行状に形成されている。マイクロチャネル１２の一方の端部には、検体液を収容するためのウェル１５が、他方の端部には、マイクロチャネル１２を流通した反応液を収容するためのウェル１８が設けられている。また、流路１３及び１４の端部にはそれぞれ、各種試薬溶液を収容するためのウェル１６及び１７が設けられている。以下、本発明の第１実施形態の説明においては、ウェル１６にＡＴＰ抽出試薬溶液が、ウェル１７にＡＴＰ検出試薬溶液が収容されているものとする。
【００２７】
マイクロチャネルチップ１０では、まず、ウェル１５に収容されている検体液をマイクロチャネル１２に導入すると、接続部１３ａまでは検体液のみがマイクロチャネル１２を流通する。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されているＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液が接続部１４ａまで流通する。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。最後に、ウェル１７に収容されているＡＴＰ検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ検出試薬溶液の混合液がウェル１８まで流通する。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。
【００２８】
マイクロチャネル１２のうちウェル１５と接続部１３ａとの間の部分は蛇行状に形成されていて十分に長いので、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、その部分の内壁面に固定化されたＡＴＰ分解酵素によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチャネル１２のうち接続部１３ａと接続部１４ａとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、微生物中のＡＴＰはＡＴＰ抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更に、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、発光反応によって生じた光は発光強度のピーク位置で確実に検出することができる。
【００２９】
マイクロチャネルチップ１０を用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬又はＡＴＰ検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰがほぼ完全に分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。
【００３０】
また、マイクロチャネルチップ１０を用いれば、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がない。また、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）で発光反応が生じる。従って、十分に高い精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００３１】
更に、マイクロチャネルチップ１０を用いれば、検体液、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００３２】
図２は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図である。図３は、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図１〜図３に示されているように、マイクロチャネルチップ１０は三層の基板１１ａ〜１１ｃを備え、マイクロチャネル１２及びウェル１５〜１８は、基板１１ａに形成されている。
【００３３】
基板１１ａ〜１１ｃは、透光性を有する材料で構成されていればよい。そのような材料としては、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイミド、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の樹脂や、石英ガラス又はパイレックス（登録商標）ガラス等のガラスが挙げられる。
【００３４】
図３に示されているように、マイクロチャネル１２の断面の形状は、長辺が基板の表面に平行な長方形である。マイクロチャネル１２の幅及び深さは、好ましくは１ｍｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ〜５００μｍであり、更に好ましくは０．１μｍ〜１００μｍである。幅及び深さが１ｍｍを超えると、幅及び深さが１ｍｍ以下である場合に比べて、発光反応の際の検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが大きくなって、反応が遅くなり、また、発光量の測定結果の再現性が低くなる傾向がある。幅及び深さが０．１〜５００μｍであると、検体液と各種試薬との混合状態のバラツキが小さくなって、反応が速くなり、また、測定結果の再現性が高くなる傾向が顕著である。幅及び深さが０．１〜１００μｍであると、上記の傾向が更に顕著である。なお、マイクロチャネルの幅とは、マイクロチャネルの延び方向に垂直で、基板の表面に平行な方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。また、マイクロチャネルの深さとは、基板の表面に垂直な方向の、マイクロチャネルの長さの最大値のことである。図３においては、マイクロチャネル１２の断面によって形成される長方形の長辺の長さが幅に、短辺の長さが深さに当たる。
【００３５】
マイクロチャネルチップ１０は、例えば、次のように製造することができる。
【００３６】
まず、シリコンウェハ上にレジストを塗布し、マイクロチャネル１２、流路１３、流路１４及びウェル１５〜１８に対応した形状にパターニング（露光、現像）した後、シリコンウェハの表面部分をエッチングする。こうしてシリコン表面にマイクロチャネル１２、流路１３、１４及びウェル１５〜１８に対応した凸部が形成される。
【００３７】
次に、上記レジストを除去し、未硬化のＰＤＭＳを塗布する。そして、ＰＤＭＳを硬化（１２５℃、２０分）させ、ＰＤＭＳを剥離することにより、マイクロチャネル１２、流路１３、１４及びウェル１５〜１８の形状を有するＰＤＭＳ硬化物が得られる。ＰＤＭＳ硬化物は、更に加工（穴あけ加工等）してもよい。
【００３８】
最後に、ガラスウェハ上に別の未硬化のＰＤＭＳを塗布し、仮硬化（５０℃、１０分）させる。仮硬化したＰＤＭＳの上に先のＰＤＭＳ硬化物を貼り合わせ、仮硬化したＰＤＭＳを硬化（１２５℃、２０分）する。
【００３９】
マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されるＡＴＰ分解酵素としては、アピラーゼ、アデノシンリン酸デアミナーゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。ＡＴＰ分解酵素はＡＤＰ分解酵素を兼ねていてもよく、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素としてはアピラーゼが挙げられる。
【００４０】
ＡＴＰ分解酵素の固定化は、例えば、次のように行うことができる。まず、マイクロチャネル１２に酵素溶液を流通させた後、開放部（ウェル）をすべてシールし、冷蔵庫内（約４℃）で約５時間放置する。次いで、マイクロチャネル１２にバッファーを流通させて、脱離しやすい酵素を取り除き、最後に、マイクロチャネル１２内部を空気で置換する。
【００４１】
酵素が固定化されたかどうか、及び固定化された酵素のＡＴＰ分解能を判定するには、例えば、マイクロチャネル１２にＡＴＰ溶液を流通させた後、ウェル１８に収容された反応済溶液を回収し、ここにルシフェリン及びルシフェラーゼを加えて、ルミテスターで発光量を測定すればよい。元のＡＴＰ溶液に比べて発光量が減少していれば、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていると判定することができる。また、発光量の減少量の大小によって、ＡＴＰ分解能を判定することができる。
【００４２】
図４は、第１実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。図５は、第１実施形態に係る微生物検出装置の、図４の矢印Ｖの向きに見た側面図である。
【００４３】
図４及び図５に示される微生物検出装置１００は、マイクロチャネルチップ１０と、マイクロチャネル１２内で生じた光を検出する光検出器２５（図４には示されていない）と、を備えている。更に、反射板１９と、チューブ２１ａ〜２３ａ（図４には示されていない）付きの蓋２１〜２３と、チューブ２１ａ〜２３ａに連結されたポンプ（図４及び図５には示されていない）とを備えている。ウェル１８は大気に開放されている。
【００４４】
光検出器２５は受光部２４を有し、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分、すなわち発光が生じる領域（以下、「発光領域」という。）に受光面２４ａが対向するように、マイクロチャネルチップ１０の一方の表面（基板１１ｃの表面）側に配置されている。また、反射板１９は、光反射面１９ａが受光部２４の受光面２４ａに対向するように、マイクロチャネルチップ１０に対して光検出器２５と反対の表面（基板１１ａの表面）側に配置されている。
【００４５】
また、蓋２１〜２３は、それぞれウェル１５〜１７を覆っている。蓋２１〜２３に取り付けられているチューブ２１ａ〜２３ａは、それぞれウェル１５〜１７とポンプ内部とを連通している。ウェル１５に収容されている液体は、ポンプで圧力を加えることによって、直接にマイクロチャネル１２に導入される。また、ウェル１６及び１７に収容されている液体は、ポンプで圧力を加えることによって、それぞれ流路１３及び１４を通じてマイクロチャネル１２に導入される。マイクロチャネル１２、流路１３及び１４を流通する液体の流通速度はそれぞれ、チューブ２１ａ〜２３ａに連結されているポンプで調節することができる。
【００４６】
図６〜図９は、マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。図６〜図９においては、微生物検出装置を、便宜上、マイクロチャネル１２の一部（実線で表した部分）が表面に現れるようにマイクロチャネルチップ１０の基板１１ａを一部切り欠いて図示している。図６〜図９における「Ｐ＝０」又は「Ｐ＝＋Ｐ１」等は、対応するウェルに収容されている液体に加えられた圧力が０又はＰ１等であることを表す。また、ドットの集合は液体を表す。なお、図６〜図９には、光検出器２５、反射板１９、蓋２１〜２３、チューブ２１ａ〜２３ａ及びポンプは示されていない。
【００４７】
微生物検出装置１００では、まず、ウェル１５に収容されている検体液にＰ１の圧力を加えて、検体液をマイクロチャネル１２に導入し、接続部１３ａまでマイクロチャネル１２を流通させる。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されているＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。検体液が接続部１３ａの少し手前（例えば、図６に示される位置）まで流通した時点で、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液にＰ２の圧力を加えて、ＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入し、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液を接続部１４ａまで流通させる。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。検体液が接続部１４ａの少し手前（例えば、図７に示される位置）まで流通した時点で、ウェル１７に収容されているＡＴＰ検出試薬溶液にＰ３の圧力を加えて、ＡＴＰ検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入し、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ検出試薬溶液の混合液をウェル１８まで流通させる。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。光を検出する際は、発光強度のピーク位置及びその前後で確実に光が検出されるように、すなわち、液体が図８に示される位置から図９に示される位置に至る過程、特に液体が蛇行部分を流通する過程で発光強度がピークを示すように、Ｐ１、Ｐ２又はＰ３を調節する。
【００４８】
微生物検出装置１００はマイクロチャネルチップ１０を備えているので、これを用いれば、十分に高い精度及び感度で、かつ簡便な操作で短時間に、再現性よく検体中の微生物を検出することができる。
【００４９】
また、微生物検出装置１００では、発光領域で生じた光のうち、受光面２４ａと反対側に向かう光も、反射面１９ａで反射されて受光面２４ａに入射する。また、発光領域のうち反射板１９及び受光部２４に挟まれた部分ではマイクロチャネル１２が蛇行状に密に形成されているので、受光面２４ａ及び反射面１９ａに向かう光の量は極めて多い。従って、極めて高い感度で微生物を検出することができる。
【００５０】
光検出器２５としては、光電子増倍管、ルミノメーター、ゲルマニウムフォトダイオード、ガリウムヒ素フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００５１】
反射板１９は、光を反射する材料で構成されていればよい。そのような材料としては、アルミニウム、ニッケル、チタン、クロム、金、銅、鉄等の金属が挙げられる。
【００５２】
（第２実施形態）
図１０は、第２実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。第２実施形態に係るマイクロチャネルチップ２０は、図１０に示されるように、マイクロチャネル１２と、接続部１３ａ及び１４ａの間に設けられた接続部２６ａでマイクロチャネル１２に接続されている流路２６を更に有し、流路２６の端部に試薬溶液を収容するためのウェル２７が設けられている点で、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０と相違する。また、図１０には示されていないが、三つの接続部１３ａ、２６ａ及び１４ａに対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面、すなわちウェル１５と接続部１３ａとの間の、マイクロチャネル１２の内壁面に、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素が固定化されている点で、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０と相違する。
【００５３】
本発明の第２実施形態の説明においては、ウェル１６にＡＴＰ抽出試薬溶液が、ウェル２７にＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液が、ウェル１７にＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬（以下、ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬を「ＡＴＰ増幅−検出試薬」という。）の溶液が収容されているものとする。
【００５４】
なお、本発明のマイクロチャネルチップにおいて、ＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬の他に更にＡＴＰ増幅試薬を用いる場合、ＡＴＰ増幅試薬がＡＭＰ、ポリリン酸、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼからなる試薬であるとすると、ポリリン酸のみ、又はＡＭＰ及びポリリン酸と、ＡＴＰ増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とは別々にマイクロチャネルに導入されるのが好ましい。ポリリン酸のみ、又はＡＭＰ及びポリリン酸と、ＡＴＰ増幅試薬を構成するそれ以外の試薬とが予め混合されていなければ、各種酵素（アデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びルシフェラーゼ）に不純物として混入している可能性の高いＡＴＰが増幅されることがなく、本発明のマイクロチャネルチップを用いた検体中の微生物の検出をより高い精度で行うことができる。
【００５５】
マイクロチャネルチップ２０では、まず、ウェル１５に収容されている検体液をマイクロチャネル１２に導入すると、接続部１３ａまでは検体液のみがマイクロチャネル１２を流通する。この過程で、検体液中のバックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰは、マイクロチャネル１２の内壁面に固定化されている、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素によって分解除去される。次いで、ウェル１６に収容されているＡＴＰ抽出試薬溶液を流路１３を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液及びＡＴＰ抽出試薬溶液の混合液が接続部２６ａまで流通する。この過程で、微生物中のＡＴＰが抽出される。次いで、ウェル２７に収容されているＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液を流路２６を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液及びＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液の混合液が接続部１４ａまで流通する。この過程では、ＡＴＰ増幅試薬を構成する試薬のすべてがマイクロチャネル１２に導入されているわけではないので、抽出されたＡＴＰの増幅は起こらない。最後に、ウェル１７に収容されているＡＴＰ増幅−検出試薬溶液を流路１４を通じてマイクロチャネル１２に導入すると、検体液、ＡＴＰ抽出試薬溶液、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）溶液及びＡＴＰ増幅−検出試薬溶液の混合液がウェル１８まで流通する。この過程で、先に抽出されたＡＴＰは増幅されながら発光反応を起こし、発光する。この光を検出することによって、検体中の微生物を検出することができる。
【００５６】
マイクロチャネル１２のうちウェル１５と接続部１３ａとの間の部分は蛇行状に形成されていて十分に長いので、検体液中のバックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰは、その部分の内壁面に固定化されている、ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素によってほぼ完全に分解除去される。また、マイクロチャネル１２のうち接続部１３ａと接続部１４ａとの間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、微生物中のＡＴＰはＡＴＰ抽出試薬によってほぼ完全に抽出される。更に、マイクロチャネル１２のうち接続部１４ａとウェル１８との間の部分も蛇行状に形成されていて十分に長いので、抽出されたＡＴＰは十分に増幅され、また、発光反応によって生じた光は発光強度のピーク位置で確実に検出することができる。
【００５７】
マイクロチャネルチップ２０を用いれば、検体液とＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）又はＡＴＰ増幅−検出試薬とが混合される前に、バックグラウンドＡＴＰ及びバックグラウンドＡＤＰがほぼ完全に分解除去されるので、微生物中のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。また、ＡＴＰ増幅試薬がＡＴＰ検出試薬と同時か、又はそれより前に検体液と混合されるので、微生物中のＡＴＰをより高い感度で検出することができる。
【００５８】
また、マイクロチャネルチップ２０を用いれば、微生物中のＡＴＰの検出のためにＡＴＰ分解酵素を失活させる必要がない。また、バックグラウンドＡＴＰ及びＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルという極めて狭い空間で接触するため、ＡＴＰ分解反応が速く、バックグラウンドＡＴＰの除去が短時間で行われる。同様に、バックグラウンドＡＤＰの除去も短時間で行われる。また、検体液、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅−検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合されるため、短時間（数秒）でＡＴＰ増幅反応及び発光反応が生じる。従って、十分に高い感度及び精度で、かつ短時間に微生物中のＡＴＰを検出することができる。
【００５９】
更に、マイクロチャネルチップ２０を用いれば、検体液、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅−検出試薬がマイクロチャネルという極めて狭い空間で混合され、検体液と試薬との混合状態のバラツキが小さいので、ＡＴＰ量測定結果の再現性を高めることができる。
【００６０】
ＡＤＰ分解酵素を兼ねるＡＴＰ分解酵素としては、アピラーゼが挙げられる。
【００６１】
（他の実施形態）
本発明の実施形態は、上記の第１実施形態及び第２実施形態に限定されるものではない。以下に他の実施形態を例示する。
【００６２】
マイクロチャネル１２の途中に設けられた少なくとも一つの接続部に対してマイクロチャネル１２の一方の端部側の、マイクロチャネル１２の内壁面には、ＡＴＰ分解酵素の他に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されていてもよい。ここで、ＡＴＰ分解酵素は、ＡＤＰ分解酵素を兼ねていても兼ねていなくてもよい。ＡＤＰ分解酵素の固定化は、ＡＴＰ分解酵素の固定化と同様に行うことができる。
【００６３】
マイクロチャネル１２に接続されている流路の数は１又は４以上であってもよい。
【００６４】
流路の数が１である場合は、例えば、微生物中のＡＴＰを検出するための試薬としてＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ検出試薬のみを用い、これらの試薬を一つの流路から同時にマイクロチャネル１２に導入すればよい。
【００６５】
流路の数が４である場合は、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）、ＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）及びＡＴＰ検出試薬を四つの流路から別々にマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、まず、ＡＴＰ抽出試薬を最上流側の一つの流路から導入し、次いで、ＡＴＰ増幅試薬（Ｉ）及びＡＴＰ増幅試薬（ＩＩ）を二つの流路から導入し（いずれが先でもよい）、最後に、ＡＴＰ検出試薬を最下流側の一つの流路から導入する。また、いずれか一つ〜三つの流路を用いて、流路の数が１〜３の場合と同様に各種試薬をマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、試薬の導入に使用されない流路の端部、又はここに設けられたウェルは蓋等で密閉しておく。
【００６６】
流路の数が５以上である場合は、いずれか一つ〜四つの流路を用いて、流路の数が１〜４の場合と同様に各種試薬をマイクロチャネル１２に導入することができる。この場合、試薬の導入に使用されない流路の端部、又はここに設けられたウェルは蓋等で密閉しておく。
【００６７】
マイクロチャネルチップは、ウェルを有していなくてもよい。ウェルが設けられていないマイクロチャネル１２又は流路への検体液又は各種試薬溶液の導入は、シリンジ等で行うことができる。マイクロチャネル１２を流通した反応液を収容するためのウェル１８を有していない場合は、反応液を収容するための容器等をマイクロチャネル１２の下流側の端部に設けておけばよい。
【００６８】
図１１は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。マイクロチャネル１２に接続されている流路は、図１１の流路２８のように、基板１１ａの表面に垂直に形成されていてもよい。例えば、図１１の流路２８のように流路が基板１１ａの表面に開口している場合は、シリンジ等で各種試薬溶液を流路に注入することができる。
【００６９】
図１２及び図１３は、他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。図１２に示されるように、マイクロチャネル１２は、三層の基板１１ｄ〜１１ｆのうちの中間層の基板１１ｅに形成されていてもよい。また、図１３に示されるように、マイクロチャネルチップは二層の基板１１ｇ及び１１ｈからなるものでもよく、マイクロチャネル１２を構成する溝は、二層の基板１１ｇ及び１１ｈの両方に形成されていてもよい。
【００７０】
マイクロチャネルの断面の形状は、正方形、台形、円形、半円形、楕円形等であってもよい。
【００７１】
マイクロチャネル１２及び流路には逆止弁が設けられていてもよい。逆止弁が設けられていると、液体の逆流を防いで、逆流によるトラブルを未然に防ぐことができる。
【００７２】
微生物検出装置においては、ウェル１５〜１７が大気に開放され、ウェル１８が蓋で覆われ、ポンプ内部に連通されていてもよい。この場合は、ポンプでウェル１８の内部を減圧することによって、液体をマイクロチャネル１２及び流路に流通させる。
【００７３】
微生物検出装置には恒温装置が設けられていてもよい。マイクロチャネル１２内で起こる反応は発熱又は吸熱を伴うため、反応温度を調節しないと、温度変化により反応が不安定になるおそれがある。また、温度が変化すると、液体が膨張して不要な気泡が発生し、マイクロチャネル１２の目詰まりが生じるおそれがある。恒温装置が設けられていれば、そのようなトラブルを未然に防ぐことができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
（実施例１）
図１４は、実施例１において用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。実施例１において用いられたマイクロチャネルチップ３０は、図１４に示されるように、蛇行状のマイクロチャネル３１（幅３３μｍ、深さ３８μｍ、長さ１６０ｍｍ）、及びその両端部に設けられた二つのウェル３２及び３３を有する。マイクロチャネルチップ３０は三層の基板からなり、基板２９ａ（外層）及び基板２９ｂ（中間層）は各々、ＰＤＭＳ基板であり、もう一方の外層（図１４には、示されていない。）はガラス基板である。マイクロチャネル３１、ウェル３２及び３３は、基板２９ａに形成されている。
【００７６】
アピラーゼ（Sigma社製、GradeVII）１．３４ｍｇ／ｍＬのバッファー（５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）溶液をウェル３２に注入し、この溶液をマイクロチャネル３１に流通させた後、４℃で５時間インキュベートした。次いで、バッファー（５０ｍＭTris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）のみをマイクロチャネル３１に流通させた。
【００７７】
次いで、ＡＴＰ１×１０−７Ｍのバッファー（５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．４）溶液をウェル３２に注入し、この溶液をマイクロチャネル３１に流通させた後、溶液１００μＬを回収し、これにルシフェリン及びルシフェラーゼを含有する試薬（ルシフェール２５０プラス、キッコーマン株式会社製）１００μＬを加えた。発光量（ＲＬＵ）をルミテスターで測定し、溶液中のＡＴＰ濃度を求めた。
【００７８】
図１５は、実施例１における反応時間（流通時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【００７９】
（比較例１）
アピラーゼ（Sigma社製、A6535）５０ユニット／ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液２００μＬを透析チューブ（三光純薬株式会社製、UC8-32-25）に封入した。
【００８０】
ＡＴＰのリン酸バッファー（ｐＨ ７．０）溶液中に上記透析チューブを１時間３０分浸漬した後、溶液１００μＬを回収し、実施例１と同様に溶液中のＡＴＰ濃度を求めた。
【００８１】
図１６は、比較例１における反応時間（浸漬時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【００８２】
図１５及び図１６から明らかなように、ＡＴＰ濃度が反応前の濃度の約１／１０に減少するのに、実施例１では１秒を要しなかったのに対して、比較例１では１．５時間を要した。すなわち、実施例１及び比較例１により、アピラーゼが固定化されたマイクロチャネルにＡＴＰ溶液を流通させると、極めて短時間に多量のＡＴＰが分解除去されることが確認された。
【００８３】
（実施例２）
図１〜図５に示される、第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０及び微生物検出装置１００を用いた。基板１１ａ及び１１ｂとしてＰＤＭＳ基板を、基板１１ｃとしてガラス基板を用い、また、ＡＴＰ分解酵素としてアピラーゼを用いた。
【００８４】
検体液として大腸菌入りの１０ｎＭ ＡＴＰ溶液を、ＡＴＰ抽出試薬として０．０１％塩化ベンザルコニウムを、ＡＴＰ検出試薬としてルシフェラーゼ（０．２５ｍｇ／ｍＬ、和光純薬工業株式会社製）、Ｄ（−）−ルシフェリン（２．５ｍＭ、和光純薬工業株式会社製）及びＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１０ｍＭ）からなる試薬を用いて、上記マイクロチャネルチップ及び光検出器により発光量（ＣＰＳ）を測定した。
【００８５】
なお、検体液はウェル１５から３０μＬ／minで、ＡＴＰ抽出試薬はウェル１６から３０μＬ／minで、ＡＴＰ検出試薬はウェル１７から６０μＬ／minでマイクロチャネル１２に導入した。光検出器としては、光電子増倍管（Ｈ７１５５、浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。
【００８６】
（比較例２）
ＡＴＰ分解酵素がマイクロチャネルの内壁面に固定化されていない他はマイクロチャネルチップ１０及び微生物検出装置１００と同様の、マイクロチャネルチップ及び微生物検出装置を用いて、実施例２と同様の操作を行った。
【００８７】
実施例２及び比較例２の結果を表１及び図１７に示す。図１７は、実施例２及び比較例２における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を示すグラフである。表１及び図１７から明らかなように、ＡＴＰ分解酵素が固定化されたマイクロチャネルチップを用いた場合は、検体液中の大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係が認められたのに対して、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていないマイクロチャネルチップを用いた場合は、大腸菌濃度と発光量との間に明確な対応関係が認められなかった。すなわち、表１及び図１７は、ＡＴＰ分解酵素が固定化されたマイクロチャネルチップを用いれば、発光量を求めることによって検体液中の大腸菌濃度を十分に高い精度で求めることができることを示している。
【００８８】
【表１】
【００８９】
実施例２及び比較例２により、本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装置を用いれば、十分に高い精度で微生物を検出することができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のマイクロチャネルチップ及び微生物検出装置は、飲食品中の微生物（細菌、真菌等）の検出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
【図２】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図である。
【図３】第１実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図４】第１実施形態に係る微生物検出装置の平面図である。
【図５】第１実施形態に係る微生物検出装置の、図４の矢印Ｖの向きに見た側面図である。
【図６】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図７】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図８】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図９】マイクロチャネルに液体が流通している一時点の、第１実施形態に係る微生物検出装置の一部切欠き平面図である。
【図１０】第２実施形態に係るマイクロチャネルチップの平面図である。
【図１１】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に平行で、基板の表面に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１２】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１３】他の実施形態に係るマイクロチャネルチップの、マイクロチャネルの延び方向に垂直な平面で切断した部分断面図である。
【図１４】実施例１において用いられたマイクロチャネルチップの平面図である。
【図１５】実施例１における反応時間（流通時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【図１６】比較例１における反応時間（浸漬時間）とＡＴＰ濃度との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例２及び比較例２における、検体液中の大腸菌濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９２】
１０…マイクロチャネルチップ、１１ａ〜１１ｈ…基板、１２…マイクロチャネル、１３，１４…流路、１３ａ，１４ａ…接続部、１５〜１８…ウェル、１００…微生物検出装置、１９…反射板、１９ａ…反射面、２１〜２３…蓋、２１ａ〜２３ａ…チューブ、２４…受光部、２４ａ…受光面、２５…光検出器、２０…マイクロチャネルチップ、２６…流路、２６ａ…接続部、２７…ウェル、２８…流路、３０…マイクロチャネルチップ、２９ａ，２９ｂ…基板、３１…マイクロチャネル、３２，３３…ウェル。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャネルと、
前記マイクロチャネルの途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロチャネルに接続されている流路と、を有し、
前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方の端部側の、前記マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていること
を特徴とするマイクロチャネルチップ。
【請求項２】
前記マイクロチャネルの前記内壁面に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されていること
を特徴とする請求項１記載のマイクロチャネルチップ。
【請求項３】
前記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねること
を特徴とする請求項１記載のマイクロチャネルチップ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロチャネルチップと、
前記マイクロチャネル内で生じた光を検出する光検出器と、を備えること
を特徴とする微生物検出装置。
【請求項１】
マイクロチャネルと、
前記マイクロチャネルの途中に設けられた少なくとも一つの接続部で前記マイクロチャネルに接続されている流路と、を有し、
前記少なくとも一つの接続部に対して前記マイクロチャネルの一方の端部側の、前記マイクロチャネルの内壁面に、ＡＴＰ分解酵素が固定化されていること
を特徴とするマイクロチャネルチップ。
【請求項２】
前記マイクロチャネルの前記内壁面に、更にＡＤＰ分解酵素が固定化されていること
を特徴とする請求項１記載のマイクロチャネルチップ。
【請求項３】
前記ＡＴＰ分解酵素がＡＤＰ分解酵素を兼ねること
を特徴とする請求項１記載のマイクロチャネルチップ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロチャネルチップと、
前記マイクロチャネル内で生じた光を検出する光検出器と、を備えること
を特徴とする微生物検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−２１１９６７（Ｐ２００８−２１１９６７Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１７２８８３（Ｐ２００５−１７２８８３）
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【出願人】（５０２２０５１４５）株式会社物産ナノテク研究所 (101)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【出願人】（５０２２０５１４５）株式会社物産ナノテク研究所 (101)
【Ｆターム（参考）】
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