マイクロ流体チップ及び細胞の培養方法
【課題】培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップを提供する。
【解決手段】ループ状に設けられた第１の細溝１１１及び第２の細溝１１２を表面に備える基板１と、開口２１ａ〜２２ｂを備え、基板１上に配置した際に第１の細溝１１１に対応する部分に培養流路１１及び第２の細溝１１２に対応する部分に薬液流路１２を形成するシート状の薄膜２と、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薄膜２を介して基板１上に配置した際に、培養液室３ａは薄膜２の開口を介して培養流路１１の一端１１ａ及び他端１１ｂと連通して培養流路１１と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室５ａは薄膜２の開口を介して薬液流路１２の一端１２ａ及び他端１２ｂと連通して薬液流路１２と閉鎖的な循環系を形成するリザーバ５とを有するマイクロ流体チップ１０。
【解決手段】ループ状に設けられた第１の細溝１１１及び第２の細溝１１２を表面に備える基板１と、開口２１ａ〜２２ｂを備え、基板１上に配置した際に第１の細溝１１１に対応する部分に培養流路１１及び第２の細溝１１２に対応する部分に薬液流路１２を形成するシート状の薄膜２と、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薄膜２を介して基板１上に配置した際に、培養液室３ａは薄膜２の開口を介して培養流路１１の一端１１ａ及び他端１１ｂと連通して培養流路１１と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室５ａは薄膜２の開口を介して薬液流路１２の一端１２ａ及び他端１２ｂと連通して薬液流路１２と閉鎖的な循環系を形成するリザーバ５とを有するマイクロ流体チップ１０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップ及び細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体チップによる微小流体下の細胞培養は、培地内物質の濃度勾配や流速の時間・空間的制御が容易であるため、生体医工学・生命科学のツールとして期待されている。とくに、ポリジメチルシロキサン(以下「ＰＤＭＳ」ともいう。)は、微細なパターンの再現性が高い、ソフトリソグラフィによるブロトタイビングが容易である、光学特性がよい、他の弾性透明樹脂に比べ毒性が少ない、容易に変形するため空気圧や外部のアクチュエータで駆動できるという利点があることから、マイクロ流体チップの材料として、多くの使用実績がある。
【０００３】
ところが、ＰＤＭＳには水分子と炭酸ガスの透過性がきわめて高いという性質があるため、ＰＤＭＳに封入された細胞培養用培地などの液体を「密封」するのは困難である。そのため、物理化学的性質を保つことが求められる細胞培養においては、ディッシュ等による通常の細胞培養と同様、保温を行い、かつ浸透圧変化とｐＨの変化を抑える必要がある。通常の細胞培養においては、保温・浸透圧制御・ｐＨ制御をそれぞれヒータ・加湿器・ＣＯ２ガス注入で行う、いわゆるＣＯ２インキュベータで行っている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
しかし、特許文献１に開示された方法は、対象を密閉系におく必要があるため、マイクロ流体システムの操作性・可搬性を損ない、設計・実装コストもかさむという問題があった。そのため、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２０４１８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、ループ状に設けられた第１の細溝及び第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板と、第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、基板上に配置した際に第１の細溝に対応する部分に培養流路及び第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜と、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、薄膜を介して基板上に配置した際に、培養液室は薄膜の開口を介して培養流路の一端及び他端と連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室は薄膜の開口を介して薬液流路の一端及び他端と連通して薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを要旨とする。
【０００８】
本発明の第２の態様は、ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板と、第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、基板上に配置した際に第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜と、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、薄膜を介して前記基板上に配置した際に、培養液室は薄膜の開口を介して培養流路の一端及び他端と連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室は透過膜と薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを要旨とする。
【０００９】
本発明の第３の態様は、上述のマイクロ流体チップを用意し、培養流路及び培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容し、薬液流路及び薬液室により形成された閉鎖的な循環系内に薬液を収容する工程と、培養流路と培養液室内で培養液を循環させる工程と、薬液室と薬液流路内で薬液を循環させる工程と、薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程とを含む細胞の培養方法を要旨とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの斜視図を示す。
【図２】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの組み立て図を示す。
【図３】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図４】点字デバイス流体駆動装置を作動させた際の点字部の昇降状態の概念図を示す。
【図５】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの断面図を示す。
【図６】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップの斜視図を示す。
【図７】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップの組み立て図を示す。
【図８】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図９】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図１０】本発明の第１の実施形態の変形例にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図１１】経過時間に対する温度変化を示す。
【図１２】経過時間に対する培地のｐＨ変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。尚、図中同一の機能又は類似の機能を有するものについては、同一又は類似の符号を付して説明を省略する。
【００１３】
［第１の実施形態］
図１は本発明の第１の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０の斜視図を示す。本発明者らは、鋭意研究の結果、マイクロ流体チップ１０において、図１に示すように、リザーバ５の内部を透過膜３により培養液室３ａと薬液室５ａに仕切り、培養液室３ａの周囲を薬液室５ａで取り囲む構造とし、薬液室５ａに加温した炭酸水素ナトリウム(重曹)水溶液を導入することで、細胞培養に適したインキュベーンョンをコンパクトに行うことを着想した。そして、導入された重曹水溶液がＰＤＭＳ製の透過膜３を介して培養液室３ａ中の培地が接触し、ＰＤＭＳ内を拡散した熱・ＣＯ２・水分子を受け取ることにより、培地の温度・ｐＨ・浸透圧が１系統で同時に調節されることを見出した。
【００１４】
[マイクロ流体チップ]
図２は本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップ１０の組み立て図を示す。図３は本発明の第１の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０を下からみた図を示す。図２に示すように、マイクロ流体チップ１０は、ループ状に設けられた第１の細溝１１１及び第１の細溝１１１の外周にループ状に設けられた第２の細溝１１２を表面に備える基板１と、第１の細溝１１１の一端１１１ａと他端１１１ｂに対応する部分及び第２の細溝１１２の一端１１２ａと他端１１２ｂに対応する部分にそれぞれ開口２１ａ、２１ｂ、２２ａ、２２ｂを備えるシート状の薄膜２と、キャップ状の透過膜３と、底面に開口部を備える直方体状で内部が空洞であるリザーバ５とを有する。
【００１５】
薄膜２を基板１上に配置すると、第１の細溝１１１に対応する部分及び第２の細溝１１２に対応する部分に、それぞれ図３に示されるような培養流路１１及び薬液流路１２が形成される。透過膜３は、培養液室３ａを内部に備え、培養流路１１の一端１１ａ及び他端１１ｂと培養液室３ａが連通するように薄膜２上に配置すると、培養流路１１と閉鎖的な循環系を形成する。リザーバ５は、透過膜３を内部に収容するように薄膜２を介して基板１上に配置すると、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薬液室５ａは薄膜２の開口２２ａ，２２ｂを介して薬液流路１２の一端及び他端と連通して薬液流路１２と閉鎖的な循環系を形成する。リザーバ５の上面に設けられた開口部５ｂから透過膜３の上面３ｂが露出するように、リザーバ５を薄膜２を介して基板１上に配置すると、開口部５ｂから透過膜３の上面３ｂが露出するため、上面３ｂから細胞や培養液を注入することができる。
【００１６】
図３に示すように、マイクロ流体チップ１０の下方から見た透過膜３の形状を円形状としたことで、培養液室３ａと薬液室５ａの透過膜３を介した接触面積が広がり、薬液が熱拡散により透過膜を介して薬液室５ａから培養液室３ａに移行しやすくなる。
【００１７】
マイクロ流体チップ１０を使用する際には、点字デバイス流体駆動装置５１が仮想線で示される位置に取り付けられる。例えば図４に示すように点字デバイス流体駆動装置５１を作動させて点字部５１ａ、５１ｂ、５１ｃを下降させて薄膜２を押し込み、点字部５１ａ、５１ｂ、５１ｃを上昇させ薄膜２を開放することを繰り返すことで培養流路１１中の培養液Ｌが押し流される。
【００１８】
培養流路１１の一部には図５に示すように、細胞が溜まる溝１１ｃが設けられている。またリザーバ５には表面から薬液室５ａまで貫通する、薬液を導入するための入口５ｃと、薬液の出口５ｄが設けられている。また入口５ｃ、出口５ｄには薬液を導入するための仮想線で示されるチューブ６１，６２が取り付けられる。かかるチューブは循環系を形成し、チューブ６１，６２の一部が熱源（図示せず）に接するように取り付けられる。
【００１９】
基板１は、細胞に対する毒性が少なく、微細な加工ができ、光学特性がよいものが好ましい。上記特性を有することより、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。
【００２０】
シート状の薄膜２は、細胞に対する毒性が少なく、光学特性がよく、後述の点字デバイス流体駆動装置５１を使用する観点からは弾性体であることが好ましい。具体的にはシート状のシラン樹脂やＰＤＭＳ等を用いることができる。
【００２１】
透過膜３は、薬液が熱拡散により透過膜３を介して薬液室５ａから培養液室３ａに移行可能なものが好ましい。なお、透過膜３は通気性であることがより好ましい。上述の特性を備えることより、透過膜３としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いることが好ましい。透過膜３の厚みは、１０〜２０００μｍであることが好ましい。薬液の熱拡散性を高める、ｐＨ等の制御の応答性を高めるためには、１０μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜１００μｍがより好ましい。
【００２２】
リザーバ５は、光学特性がよいものが好ましい。上記特性を有することより、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂や、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。
【００２３】
[細胞の培養方法]
上述のマイクロ流体チップ１０を用いた細胞の培養方法について説明する。
【００２４】
（イ）図１〜図３に示すマイクロ流体チップ１０を用意する。
【００２５】
（ロ）培養流路及び培養液室３ａにより形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容する。透過膜３の上面３ｂを介して培養液室３ａ内に培養液（培地）及び細胞を充填し、リザーバ５に設けられた入口５ｃを介して薬液室５ａにｐＨ及び浸透圧調整用の薬液例えば重曹水溶液等を充填する。
【００２６】
（ハ）培養流路と培養液室３ａ内で培養液を循環させる。また、薬液室５ａと薬液流路１２内でも薬液を循環させる。具体的には、図４に示すように点字デバイス流体駆動装置５１を作動させて培養流路１１中の培養液Ｌを押し流す。そして、培養液Ｌが図３に示すように培養流路１１からその一端１１ａを経由して培養液室３ａに入り、培養流路１１の他端１１ｂを介して培養流路１１に戻るように循環を繰り返す。培養液Ｌと共に培養液室３ａに注入された細胞Ｓは、培養液Ｌが培養流路１１と培養液室３ａ間で循環を繰り返す際に溝１１ｃに溜まる。薬液流路１２及び薬液室５ａ間においても上述と同様にして薬液を循環させる。
【００２７】
（ニ）薬液に接する熱源（図示せず）により薬液の温度を調整することにより透過膜３を介して薬液室５ａから培養液室３ａに熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する。マイクロ流体チップ１０の外部に取り付けた熱源により、薬液室５ａに薬液を導入する際に、予め薬液を加熱しておくことにより、温度を制御できる。
【００２８】
生命科学の進歩に伴い研究内容が多様化複雑化し、生命科学の枠を超え、生命科学以外の分野、例えば工学の分野との技術交流も盛んになってきている。ところが、生命科学の研究につきものの細胞の培養には、細心の注意と熟練の技術が必要とされたことより、細胞の培養が技術交流の妨げとなることが懸念されていた。しかし、本発明によれば、マイクロ流体チップ１０の構成が単純で取り扱いが容易であるため、細胞の培養が容易になる。またマイクロ流体チップ１０が小型なので培養中の細胞を搬送しやすく、しかも温度とｐＨを高い精度で制御できる。そのため、研究者間での細胞のやり取りが容易になることで、細胞の研究にかかわる技術の進歩が期待される。
【００２９】
点字デバイス流体駆動装置を用いた従来のマイクロ流体チップは、薄膜と、薄膜上に配置された基板とを備える。基板の第２の主面にはループ状に細溝が形成され、第２の主面と薄膜とが接するように基板を薄膜上に配置することで細溝に対応する箇所に培養流路が形成される。そして、基板の第２主面側下方から薄膜を介して培養流路上に点字デバイス流体駆動装置を配置し、点字デバイス流体駆動装置を稼動させることで、培養流路内に培養液が循環する。
【００３０】
ところが、基板の第２主面側下方から培養流路上に点字デバイス流体駆動装置を配置すると、点字デバイス流体駆動装置の厚み分だけワーキングディスタンスが長くなる。そのため、顕微鏡の焦点が合わせずらくなるため、マイクロ流体チップの下方から細胞の顕微鏡観察を行うことは困難であった。一方、第１の実施形態によれば、図１に示すように点字デバイス流体駆動装置５１が仮想線で示される基板１の第１主面側に取り付けられる。そのため、顕微鏡とマイクロ流体チップ間のワーキングディスタンスがなくなることで、マイクロ流体チップの下方から細胞の顕微鏡観察を行えるという作用効果を奏する。
【００３１】
［第２の実施形態］
以下、第２の実施形態について、第１の実施形態との相違点を中心に説明する。
【００３２】
図６は本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａの斜視図を示す。図７は本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａの組み立て図を示す。図８は本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａを下からみた図を示す。
【００３３】
図６に示すように、本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａは、ループ状に設けられた第１の細溝１１１を表面に備える基板１Ａと、第１の細溝１１１の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口１１１ａ，１１１ｂを備え、基板１Ａ上に配置した際に第１の細溝１１１に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜２Ａと、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薄膜２Ａを介して基板１Ａ上に配置した際に、培養液室３ａは薄膜２Ａの開口２１ａ，２１ｂを介して培養流路の一端１１１ａ及び他端１１１ｂと連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室５ａは透過膜３と薄膜２Ａにより仕切られた空間を形成するリザーバ５とを有する。
【００３４】
第１の実施形態においては、薬液をリザーバ５に設けたチューブ６１，６２を介してリザーバ５の外部に引き出し、チューブ６１，６２の一部に設けた熱源で薬液を加熱した。しかし第２の実施形態によれば、図６の仮想線で示されるように、薬液の熱源をリザーバ５の薬液室下方に配置して薬液の温度制御を行うことができる。薬液をチューブ６１，６２を介してリザーバ５の外部に引き出して加熱する必要がなくなることで、マイクロ流体チップ１０Ａをコンパクトにすることができる。マイクロ流体チップ１０Ａがコンパクトになることで、マイクロ流体チップ１０Ａの配置レイアウトが自由になりワークスペースが確保される。
【００３５】
第１の実施形態においては、基板１の培養流路の外側に薬液流路を設けた。しかし、第２の実施形態では、基板１Ａに薬液流路の細溝を設けないため、第２の実施形態の変形例として、例えば図９に示すような基板１Ｂに２本の培養流路用の細溝を設けたマイクロ流体チップ１０Ｂとすることができる。第２の実施形態の変形例によれば、１つのマイクロチップ内で同時に２以上（異種もしくは同種）の細胞を培養できるので、極めて近い環境条件で２以上の細胞の対比観察ができるという作用効果を奏する。なお、基板１Ｂに形成される細溝の数は、基板１Ｂの表面積や培養流路のレイアウト等から定まるものであり特に上限に制限はない。また細溝のレイアウトの仕方も自由であり、例えば一段に並べる他に、二段にして並べても構わない。
【００３６】
［その他の実施形態］
上記のように、本発明は第１、第２の実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【００３７】
第１の実施形態においては、使用する際に培養液室３ａに培養液を充填し薬液室５ａに薬液を充填するとしたが、細胞の培養作業の前から予め培養液室３ａと薬液室５ａのそれぞれに培養液と薬液を充填し保管しておいてもよい。細胞の培養の作業効率が向上するからである。
【００３８】
第１の実施形態においては、透過膜３の形状をキャップ状とし、図３のようにマイクロ流体チップ１０の下方から見た形状を円形状とした。しかし、培養液室３ａと薬液室５ａが透過膜３を介して接していればよく特に透過膜３の形状は限定されない。例えば図８に示すように、板状の透過膜３Ｘをリザーバ５の中心を通る線上に、リザーバ５の側壁にはめ込み式に取り付けて、リザーバ５内を２分割する形状としてもよい。なお、熱応答性が良好である点では図３のような形状にすることが好ましい。
【００３９】
このように、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例の記載を通じて、マイクロ流体チップ１０の製法と作用効果について説明する。
【００４１】
（マイクロ流体チップの製法）
以下の手法に従い、図１〜図３に示すマイクロ流体チップ１０を製法した。基板１は厚さ約３ｍｍ程度、薄膜２は厚さ約２００μｍ程度、リザーバ５は高さ約１０ｃｍ程度とした。
【００４２】
基板１は、代表幅３００μｍ、代表高さ３０μｍの流路を構成する溝の反転型(フォトリソグラフィで作製)にＰＤＭＳ前駆体(信越化学工業社製、製品名「KE-106」)を注入し、６５℃で１２時間硬化した後、離型することにより製造した。薄膜２は、シランコート剤(ハーベス(HARVES)社製、製品名「ハーベスHD-1101Z」)を塗布したスライドガラス(松浪硝子社製、製品名「S9111」)にＰＤＭＳ前駆体を４５０ｒｐｍで１０分間スピンコートし、その後、９５℃で１５分間硬化し、剥離・パンチで穴あけすることにより製造した。隔膜は、ボリカーボネート板を機械加工して作製した型にＰＤＭＳ前駆体を注入・硬化（６５℃；１２ｈ）・離型することにより形成した。プラズマ電流２０ｍＡで４５分間、真空中空気プラズマ処理した後、６５℃で５分間、圧接・加熱して各層を接合した。
【００４３】
（インキュベーション）
マイクロ流体チップ１０の培養液室３ａに外径１．５ｍｍのポリプロピレン（ＰＰ）チューブフィッティングを挿入し、シリンジを用いてＤＭＥＭ(Gibco 12800;３．７ｇ/1重曹と１０％ウシ胎児血清添加)を２００μｌ注入した。
【００４４】
薬液室５ａには、ポリプロピレンチューブフィッティングを介し、入口５ｃと出口５ｄの２か所に外径３．２ｍｍ、内径１．１５ｍｍのファーメドチューブを、入口５ｃにはさらに熱電対(ANBESMT製。製品名「KMG-200」)を接続した。
【００４５】
薬液室５ａの入口５ｃ側に、インラインヒータとして、ペルチェ素子付銅製水枕(Swiftech製、製品名「MCW60-T」)を接続した。
【００４６】
チューブの両端には重曹水用タンク(Swiftech製、「MCRES Micro Rev.2」)を接続し、チューブポンプ(東京理化器械製、製品名「MP-3」)を用い０．４Ｍ重曹水約１３５ｍｌを約１ｍｌ/ｍｉｎにて循環した。
【００４７】
ペルチエ素子と３Ｖの電圧源ならびに熱電対は、温度調節器(アズワン社製、製品名「TS-K」)に接続し、温度計測・制御を行った。
【００４８】
培養液室３ａの鉛直約２ｃｍ上方にライトガイドを配置し、波長切替光源(浜松ホトニクス社製、製品名「C7773」)からの光を導き、培養液室３ａに単波長光(５５８ｎｍ、４７９ｎｍ、４３２ｎｍ、３６５ｎｍ)を照射した。ライトガイド先端のマイクロ流体チップ１０をはさんで鉛直下方に、絞りを介してＣＣＤカメラ(オリンパス社製、製品名「DP12」)を配置し、培養液室３ａ中のフェノールレッド（ＰＲ）による吸収で減衰した透過光の画像を取得し、光量を画像のピクセル値として得た。１回のｐＨ測定につき４種類の波長の透過光量(Ｉ５５８、Ｉ４７９、Ｉ４３２、Ｉ３６５)を取得し、Ｉ５５８とＩ４７９、を、Ｉ４７９とＩ３６５から算出したベースラインで補正したものの対数比Ｒ(式（Ｉ）、式（ＩＩ）)を算出し、あらかじめ調製した既知ｐＨのリン酸緩衝液(４０ｍＭＰＲ含有)における測定結果から二重指数あてはめによりｐＨを推定した。
【００４９】
Ｒ＝log１０（Ｉ558-Ｉoff（558））／（I432−off（432））・・（式Ｉ）、
Ｉoff（λ）＝Ｉ365＋（Ｉ479−Ｉ355）／（479−365）×（λ―365）・・（式ＩＩ）、
図６に、本インキュベーション系において、マイクロ流体チップ１０の薬液室５ａの導入口における重曹水の温度を室温付近から上昇させた場合の応答の測定結果を示す。インラインヒータにより加熱された重曹水は、リザーバ５に到達する以前にチューブを通る間に無視できない位冷却されるにもかかわらず、本実施例においては、ヒータヘの8W程度の断続的電力印加（時定数２０分）により、チッブ内の重曹水温度を約１５分以内に３７℃付近（図中点線）に制御することができ、その後の温度変動も常に±０．２℃以内に収まった。
【００５０】
図７は、通常は１０％ＣＯ２環境下においてインキュベーションされる培地（ＤＭＥＭ）をｐＨ８にした状態で培養液室３ａに導入し、そのうえで、重曹水循環により３７℃に加湿したときの培地ｐＨの時間変化である。細胞の操作や微小流体チップなどへの導入操作などで、培地をＣＯ２インキュベータ外の開放系で操作するとｐＨが上昇する傾向があるが、本系では、上昇したｐＨの培地を約３０分程度で、生理的に妥当なｐＨ７.４付近（図中点線）まで押し下げ、かつ、少なくとも８時間はｐＨ=７.３土０．１を維持できることが示された。
【００５１】
本発明によれば、培地の温度とｐＨの制御が容易なことから、温度とｐＨの高い精度が求められる脳神経細胞などの培養に有用である。
【符号の説明】
【００５２】
１…基板、
２…薄膜、
３…透過膜、
３ａ…培養液室、
５…リザーバ、
５ａ…薬液室、
１１…培養流路、
１１１…第１の細溝、
１２…薬液流路、
１１２…第２の細溝、
１０…マイクロ流体チップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップ及び細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体チップによる微小流体下の細胞培養は、培地内物質の濃度勾配や流速の時間・空間的制御が容易であるため、生体医工学・生命科学のツールとして期待されている。とくに、ポリジメチルシロキサン(以下「ＰＤＭＳ」ともいう。)は、微細なパターンの再現性が高い、ソフトリソグラフィによるブロトタイビングが容易である、光学特性がよい、他の弾性透明樹脂に比べ毒性が少ない、容易に変形するため空気圧や外部のアクチュエータで駆動できるという利点があることから、マイクロ流体チップの材料として、多くの使用実績がある。
【０００３】
ところが、ＰＤＭＳには水分子と炭酸ガスの透過性がきわめて高いという性質があるため、ＰＤＭＳに封入された細胞培養用培地などの液体を「密封」するのは困難である。そのため、物理化学的性質を保つことが求められる細胞培養においては、ディッシュ等による通常の細胞培養と同様、保温を行い、かつ浸透圧変化とｐＨの変化を抑える必要がある。通常の細胞培養においては、保温・浸透圧制御・ｐＨ制御をそれぞれヒータ・加湿器・ＣＯ２ガス注入で行う、いわゆるＣＯ２インキュベータで行っている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
しかし、特許文献１に開示された方法は、対象を密閉系におく必要があるため、マイクロ流体システムの操作性・可搬性を損ない、設計・実装コストもかさむという問題があった。そのため、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２０４１８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、ループ状に設けられた第１の細溝及び第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板と、第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、基板上に配置した際に第１の細溝に対応する部分に培養流路及び第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜と、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、薄膜を介して基板上に配置した際に、培養液室は薄膜の開口を介して培養流路の一端及び他端と連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室は薄膜の開口を介して薬液流路の一端及び他端と連通して薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを要旨とする。
【０００８】
本発明の第２の態様は、ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板と、第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、基板上に配置した際に第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜と、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、薄膜を介して前記基板上に配置した際に、培養液室は薄膜の開口を介して培養流路の一端及び他端と連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室は透過膜と薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを要旨とする。
【０００９】
本発明の第３の態様は、上述のマイクロ流体チップを用意し、培養流路及び培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容し、薬液流路及び薬液室により形成された閉鎖的な循環系内に薬液を収容する工程と、培養流路と培養液室内で培養液を循環させる工程と、薬液室と薬液流路内で薬液を循環させる工程と、薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程とを含む細胞の培養方法を要旨とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培地の温度及びｐＨの調節が容易な小型のマイクロ流体チップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの斜視図を示す。
【図２】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの組み立て図を示す。
【図３】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図４】点字デバイス流体駆動装置を作動させた際の点字部の昇降状態の概念図を示す。
【図５】本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップの断面図を示す。
【図６】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップの斜視図を示す。
【図７】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップの組み立て図を示す。
【図８】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図９】本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図１０】本発明の第１の実施形態の変形例にかかるマイクロ流体チップを下からみた図を示す。
【図１１】経過時間に対する温度変化を示す。
【図１２】経過時間に対する培地のｐＨ変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。尚、図中同一の機能又は類似の機能を有するものについては、同一又は類似の符号を付して説明を省略する。
【００１３】
［第１の実施形態］
図１は本発明の第１の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０の斜視図を示す。本発明者らは、鋭意研究の結果、マイクロ流体チップ１０において、図１に示すように、リザーバ５の内部を透過膜３により培養液室３ａと薬液室５ａに仕切り、培養液室３ａの周囲を薬液室５ａで取り囲む構造とし、薬液室５ａに加温した炭酸水素ナトリウム(重曹)水溶液を導入することで、細胞培養に適したインキュベーンョンをコンパクトに行うことを着想した。そして、導入された重曹水溶液がＰＤＭＳ製の透過膜３を介して培養液室３ａ中の培地が接触し、ＰＤＭＳ内を拡散した熱・ＣＯ２・水分子を受け取ることにより、培地の温度・ｐＨ・浸透圧が１系統で同時に調節されることを見出した。
【００１４】
[マイクロ流体チップ]
図２は本発明の第１の実施形態にかかるマイクロ流体チップ１０の組み立て図を示す。図３は本発明の第１の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０を下からみた図を示す。図２に示すように、マイクロ流体チップ１０は、ループ状に設けられた第１の細溝１１１及び第１の細溝１１１の外周にループ状に設けられた第２の細溝１１２を表面に備える基板１と、第１の細溝１１１の一端１１１ａと他端１１１ｂに対応する部分及び第２の細溝１１２の一端１１２ａと他端１１２ｂに対応する部分にそれぞれ開口２１ａ、２１ｂ、２２ａ、２２ｂを備えるシート状の薄膜２と、キャップ状の透過膜３と、底面に開口部を備える直方体状で内部が空洞であるリザーバ５とを有する。
【００１５】
薄膜２を基板１上に配置すると、第１の細溝１１１に対応する部分及び第２の細溝１１２に対応する部分に、それぞれ図３に示されるような培養流路１１及び薬液流路１２が形成される。透過膜３は、培養液室３ａを内部に備え、培養流路１１の一端１１ａ及び他端１１ｂと培養液室３ａが連通するように薄膜２上に配置すると、培養流路１１と閉鎖的な循環系を形成する。リザーバ５は、透過膜３を内部に収容するように薄膜２を介して基板１上に配置すると、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薬液室５ａは薄膜２の開口２２ａ，２２ｂを介して薬液流路１２の一端及び他端と連通して薬液流路１２と閉鎖的な循環系を形成する。リザーバ５の上面に設けられた開口部５ｂから透過膜３の上面３ｂが露出するように、リザーバ５を薄膜２を介して基板１上に配置すると、開口部５ｂから透過膜３の上面３ｂが露出するため、上面３ｂから細胞や培養液を注入することができる。
【００１６】
図３に示すように、マイクロ流体チップ１０の下方から見た透過膜３の形状を円形状としたことで、培養液室３ａと薬液室５ａの透過膜３を介した接触面積が広がり、薬液が熱拡散により透過膜を介して薬液室５ａから培養液室３ａに移行しやすくなる。
【００１７】
マイクロ流体チップ１０を使用する際には、点字デバイス流体駆動装置５１が仮想線で示される位置に取り付けられる。例えば図４に示すように点字デバイス流体駆動装置５１を作動させて点字部５１ａ、５１ｂ、５１ｃを下降させて薄膜２を押し込み、点字部５１ａ、５１ｂ、５１ｃを上昇させ薄膜２を開放することを繰り返すことで培養流路１１中の培養液Ｌが押し流される。
【００１８】
培養流路１１の一部には図５に示すように、細胞が溜まる溝１１ｃが設けられている。またリザーバ５には表面から薬液室５ａまで貫通する、薬液を導入するための入口５ｃと、薬液の出口５ｄが設けられている。また入口５ｃ、出口５ｄには薬液を導入するための仮想線で示されるチューブ６１，６２が取り付けられる。かかるチューブは循環系を形成し、チューブ６１，６２の一部が熱源（図示せず）に接するように取り付けられる。
【００１９】
基板１は、細胞に対する毒性が少なく、微細な加工ができ、光学特性がよいものが好ましい。上記特性を有することより、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。
【００２０】
シート状の薄膜２は、細胞に対する毒性が少なく、光学特性がよく、後述の点字デバイス流体駆動装置５１を使用する観点からは弾性体であることが好ましい。具体的にはシート状のシラン樹脂やＰＤＭＳ等を用いることができる。
【００２１】
透過膜３は、薬液が熱拡散により透過膜３を介して薬液室５ａから培養液室３ａに移行可能なものが好ましい。なお、透過膜３は通気性であることがより好ましい。上述の特性を備えることより、透過膜３としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いることが好ましい。透過膜３の厚みは、１０〜２０００μｍであることが好ましい。薬液の熱拡散性を高める、ｐＨ等の制御の応答性を高めるためには、１０μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜１００μｍがより好ましい。
【００２２】
リザーバ５は、光学特性がよいものが好ましい。上記特性を有することより、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂や、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。
【００２３】
[細胞の培養方法]
上述のマイクロ流体チップ１０を用いた細胞の培養方法について説明する。
【００２４】
（イ）図１〜図３に示すマイクロ流体チップ１０を用意する。
【００２５】
（ロ）培養流路及び培養液室３ａにより形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容する。透過膜３の上面３ｂを介して培養液室３ａ内に培養液（培地）及び細胞を充填し、リザーバ５に設けられた入口５ｃを介して薬液室５ａにｐＨ及び浸透圧調整用の薬液例えば重曹水溶液等を充填する。
【００２６】
（ハ）培養流路と培養液室３ａ内で培養液を循環させる。また、薬液室５ａと薬液流路１２内でも薬液を循環させる。具体的には、図４に示すように点字デバイス流体駆動装置５１を作動させて培養流路１１中の培養液Ｌを押し流す。そして、培養液Ｌが図３に示すように培養流路１１からその一端１１ａを経由して培養液室３ａに入り、培養流路１１の他端１１ｂを介して培養流路１１に戻るように循環を繰り返す。培養液Ｌと共に培養液室３ａに注入された細胞Ｓは、培養液Ｌが培養流路１１と培養液室３ａ間で循環を繰り返す際に溝１１ｃに溜まる。薬液流路１２及び薬液室５ａ間においても上述と同様にして薬液を循環させる。
【００２７】
（ニ）薬液に接する熱源（図示せず）により薬液の温度を調整することにより透過膜３を介して薬液室５ａから培養液室３ａに熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する。マイクロ流体チップ１０の外部に取り付けた熱源により、薬液室５ａに薬液を導入する際に、予め薬液を加熱しておくことにより、温度を制御できる。
【００２８】
生命科学の進歩に伴い研究内容が多様化複雑化し、生命科学の枠を超え、生命科学以外の分野、例えば工学の分野との技術交流も盛んになってきている。ところが、生命科学の研究につきものの細胞の培養には、細心の注意と熟練の技術が必要とされたことより、細胞の培養が技術交流の妨げとなることが懸念されていた。しかし、本発明によれば、マイクロ流体チップ１０の構成が単純で取り扱いが容易であるため、細胞の培養が容易になる。またマイクロ流体チップ１０が小型なので培養中の細胞を搬送しやすく、しかも温度とｐＨを高い精度で制御できる。そのため、研究者間での細胞のやり取りが容易になることで、細胞の研究にかかわる技術の進歩が期待される。
【００２９】
点字デバイス流体駆動装置を用いた従来のマイクロ流体チップは、薄膜と、薄膜上に配置された基板とを備える。基板の第２の主面にはループ状に細溝が形成され、第２の主面と薄膜とが接するように基板を薄膜上に配置することで細溝に対応する箇所に培養流路が形成される。そして、基板の第２主面側下方から薄膜を介して培養流路上に点字デバイス流体駆動装置を配置し、点字デバイス流体駆動装置を稼動させることで、培養流路内に培養液が循環する。
【００３０】
ところが、基板の第２主面側下方から培養流路上に点字デバイス流体駆動装置を配置すると、点字デバイス流体駆動装置の厚み分だけワーキングディスタンスが長くなる。そのため、顕微鏡の焦点が合わせずらくなるため、マイクロ流体チップの下方から細胞の顕微鏡観察を行うことは困難であった。一方、第１の実施形態によれば、図１に示すように点字デバイス流体駆動装置５１が仮想線で示される基板１の第１主面側に取り付けられる。そのため、顕微鏡とマイクロ流体チップ間のワーキングディスタンスがなくなることで、マイクロ流体チップの下方から細胞の顕微鏡観察を行えるという作用効果を奏する。
【００３１】
［第２の実施形態］
以下、第２の実施形態について、第１の実施形態との相違点を中心に説明する。
【００３２】
図６は本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａの斜視図を示す。図７は本発明の第２の実施形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａの組み立て図を示す。図８は本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａを下からみた図を示す。
【００３３】
図６に示すように、本発明の第２の実施の形態にかかるマイクロ流体チップ１０Ａは、ループ状に設けられた第１の細溝１１１を表面に備える基板１Ａと、第１の細溝１１１の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口１１１ａ，１１１ｂを備え、基板１Ａ上に配置した際に第１の細溝１１１に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜２Ａと、透過膜３により内部が培養液室３ａと薬液室５ａに仕切られ、薄膜２Ａを介して基板１Ａ上に配置した際に、培養液室３ａは薄膜２Ａの開口２１ａ，２１ｂを介して培養流路の一端１１１ａ及び他端１１１ｂと連通して培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、薬液室５ａは透過膜３と薄膜２Ａにより仕切られた空間を形成するリザーバ５とを有する。
【００３４】
第１の実施形態においては、薬液をリザーバ５に設けたチューブ６１，６２を介してリザーバ５の外部に引き出し、チューブ６１，６２の一部に設けた熱源で薬液を加熱した。しかし第２の実施形態によれば、図６の仮想線で示されるように、薬液の熱源をリザーバ５の薬液室下方に配置して薬液の温度制御を行うことができる。薬液をチューブ６１，６２を介してリザーバ５の外部に引き出して加熱する必要がなくなることで、マイクロ流体チップ１０Ａをコンパクトにすることができる。マイクロ流体チップ１０Ａがコンパクトになることで、マイクロ流体チップ１０Ａの配置レイアウトが自由になりワークスペースが確保される。
【００３５】
第１の実施形態においては、基板１の培養流路の外側に薬液流路を設けた。しかし、第２の実施形態では、基板１Ａに薬液流路の細溝を設けないため、第２の実施形態の変形例として、例えば図９に示すような基板１Ｂに２本の培養流路用の細溝を設けたマイクロ流体チップ１０Ｂとすることができる。第２の実施形態の変形例によれば、１つのマイクロチップ内で同時に２以上（異種もしくは同種）の細胞を培養できるので、極めて近い環境条件で２以上の細胞の対比観察ができるという作用効果を奏する。なお、基板１Ｂに形成される細溝の数は、基板１Ｂの表面積や培養流路のレイアウト等から定まるものであり特に上限に制限はない。また細溝のレイアウトの仕方も自由であり、例えば一段に並べる他に、二段にして並べても構わない。
【００３６】
［その他の実施形態］
上記のように、本発明は第１、第２の実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【００３７】
第１の実施形態においては、使用する際に培養液室３ａに培養液を充填し薬液室５ａに薬液を充填するとしたが、細胞の培養作業の前から予め培養液室３ａと薬液室５ａのそれぞれに培養液と薬液を充填し保管しておいてもよい。細胞の培養の作業効率が向上するからである。
【００３８】
第１の実施形態においては、透過膜３の形状をキャップ状とし、図３のようにマイクロ流体チップ１０の下方から見た形状を円形状とした。しかし、培養液室３ａと薬液室５ａが透過膜３を介して接していればよく特に透過膜３の形状は限定されない。例えば図８に示すように、板状の透過膜３Ｘをリザーバ５の中心を通る線上に、リザーバ５の側壁にはめ込み式に取り付けて、リザーバ５内を２分割する形状としてもよい。なお、熱応答性が良好である点では図３のような形状にすることが好ましい。
【００３９】
このように、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例の記載を通じて、マイクロ流体チップ１０の製法と作用効果について説明する。
【００４１】
（マイクロ流体チップの製法）
以下の手法に従い、図１〜図３に示すマイクロ流体チップ１０を製法した。基板１は厚さ約３ｍｍ程度、薄膜２は厚さ約２００μｍ程度、リザーバ５は高さ約１０ｃｍ程度とした。
【００４２】
基板１は、代表幅３００μｍ、代表高さ３０μｍの流路を構成する溝の反転型(フォトリソグラフィで作製)にＰＤＭＳ前駆体(信越化学工業社製、製品名「KE-106」)を注入し、６５℃で１２時間硬化した後、離型することにより製造した。薄膜２は、シランコート剤(ハーベス(HARVES)社製、製品名「ハーベスHD-1101Z」)を塗布したスライドガラス(松浪硝子社製、製品名「S9111」)にＰＤＭＳ前駆体を４５０ｒｐｍで１０分間スピンコートし、その後、９５℃で１５分間硬化し、剥離・パンチで穴あけすることにより製造した。隔膜は、ボリカーボネート板を機械加工して作製した型にＰＤＭＳ前駆体を注入・硬化（６５℃；１２ｈ）・離型することにより形成した。プラズマ電流２０ｍＡで４５分間、真空中空気プラズマ処理した後、６５℃で５分間、圧接・加熱して各層を接合した。
【００４３】
（インキュベーション）
マイクロ流体チップ１０の培養液室３ａに外径１．５ｍｍのポリプロピレン（ＰＰ）チューブフィッティングを挿入し、シリンジを用いてＤＭＥＭ(Gibco 12800;３．７ｇ/1重曹と１０％ウシ胎児血清添加)を２００μｌ注入した。
【００４４】
薬液室５ａには、ポリプロピレンチューブフィッティングを介し、入口５ｃと出口５ｄの２か所に外径３．２ｍｍ、内径１．１５ｍｍのファーメドチューブを、入口５ｃにはさらに熱電対(ANBESMT製。製品名「KMG-200」)を接続した。
【００４５】
薬液室５ａの入口５ｃ側に、インラインヒータとして、ペルチェ素子付銅製水枕(Swiftech製、製品名「MCW60-T」)を接続した。
【００４６】
チューブの両端には重曹水用タンク(Swiftech製、「MCRES Micro Rev.2」)を接続し、チューブポンプ(東京理化器械製、製品名「MP-3」)を用い０．４Ｍ重曹水約１３５ｍｌを約１ｍｌ/ｍｉｎにて循環した。
【００４７】
ペルチエ素子と３Ｖの電圧源ならびに熱電対は、温度調節器(アズワン社製、製品名「TS-K」)に接続し、温度計測・制御を行った。
【００４８】
培養液室３ａの鉛直約２ｃｍ上方にライトガイドを配置し、波長切替光源(浜松ホトニクス社製、製品名「C7773」)からの光を導き、培養液室３ａに単波長光(５５８ｎｍ、４７９ｎｍ、４３２ｎｍ、３６５ｎｍ)を照射した。ライトガイド先端のマイクロ流体チップ１０をはさんで鉛直下方に、絞りを介してＣＣＤカメラ(オリンパス社製、製品名「DP12」)を配置し、培養液室３ａ中のフェノールレッド（ＰＲ）による吸収で減衰した透過光の画像を取得し、光量を画像のピクセル値として得た。１回のｐＨ測定につき４種類の波長の透過光量(Ｉ５５８、Ｉ４７９、Ｉ４３２、Ｉ３６５)を取得し、Ｉ５５８とＩ４７９、を、Ｉ４７９とＩ３６５から算出したベースラインで補正したものの対数比Ｒ(式（Ｉ）、式（ＩＩ）)を算出し、あらかじめ調製した既知ｐＨのリン酸緩衝液(４０ｍＭＰＲ含有)における測定結果から二重指数あてはめによりｐＨを推定した。
【００４９】
Ｒ＝log１０（Ｉ558-Ｉoff（558））／（I432−off（432））・・（式Ｉ）、
Ｉoff（λ）＝Ｉ365＋（Ｉ479−Ｉ355）／（479−365）×（λ―365）・・（式ＩＩ）、
図６に、本インキュベーション系において、マイクロ流体チップ１０の薬液室５ａの導入口における重曹水の温度を室温付近から上昇させた場合の応答の測定結果を示す。インラインヒータにより加熱された重曹水は、リザーバ５に到達する以前にチューブを通る間に無視できない位冷却されるにもかかわらず、本実施例においては、ヒータヘの8W程度の断続的電力印加（時定数２０分）により、チッブ内の重曹水温度を約１５分以内に３７℃付近（図中点線）に制御することができ、その後の温度変動も常に±０．２℃以内に収まった。
【００５０】
図７は、通常は１０％ＣＯ２環境下においてインキュベーションされる培地（ＤＭＥＭ）をｐＨ８にした状態で培養液室３ａに導入し、そのうえで、重曹水循環により３７℃に加湿したときの培地ｐＨの時間変化である。細胞の操作や微小流体チップなどへの導入操作などで、培地をＣＯ２インキュベータ外の開放系で操作するとｐＨが上昇する傾向があるが、本系では、上昇したｐＨの培地を約３０分程度で、生理的に妥当なｐＨ７.４付近（図中点線）まで押し下げ、かつ、少なくとも８時間はｐＨ=７.３土０．１を維持できることが示された。
【００５１】
本発明によれば、培地の温度とｐＨの制御が容易なことから、温度とｐＨの高い精度が求められる脳神経細胞などの培養に有用である。
【符号の説明】
【００５２】
１…基板、
２…薄膜、
３…透過膜、
３ａ…培養液室、
５…リザーバ、
５ａ…薬液室、
１１…培養流路、
１１１…第１の細溝、
１２…薬液流路、
１１２…第２の細溝、
１０…マイクロ流体チップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループ状に設けられた第１の細溝及び前記第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板と、
前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び前記第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路及び前記第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜と、
透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記薄膜の開口を介して前記薬液流路の一端及び他端と連通して前記薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバ
とを有することを特徴とするマイクロ流体チップ。
【請求項２】
ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板と、
前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜と、
透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記透過膜と前記薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバ
とを有することを特徴とするマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記透過膜は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記透過膜の厚みは、１０〜１０００μｍであることを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記培養液室に培養液、前記薬液室に前記流路内のｐＨ及び浸透圧調整用の薬液が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項６】
前記リザーバを避けるように、前記薄膜を介して前記第１の細溝上に配置された、点字デバイス流体駆動装置をさらに有することを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項７】
前記基板は、ループ状に設けられた第３の細溝を表面にさらに備え、
前記薄膜は、前記第３の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口をさらに備え、前記基板上に配置した際に前記第３の細溝に対応する部分に第２の培養流路を形成することを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項８】
ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板、前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記透過膜と前記薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを用意し、前記培養流路及び前記培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容する工程と、
前記培養流路と前記培養液室内で前記培養液を循環させる工程と、
前記薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程と
を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項９】
前記基板の前記リザーバの反対側表面に熱源を配置し、前記マイクロ流体チップを加熱することにより、前記薬液の温度を調整することを特徴とする請求項８記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
ループ状に設けられた第１の細溝及び前記第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板、前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び前記第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路及び前記第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記薄膜の開口を介して前記薬液流路の一端及び他端と連通して前記薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを用意し、前記培養流路及び前記培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容し、前記薬液流路及び前記薬液室により形成された閉鎖的な循環系内に薬液を収容する工程と、
前記培養流路と前記培養液室内で前記培養液を循環させる工程と、
前記薬液室と前記薬液流路内で前記薬液を循環させる工程と、
前記薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程と
を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項１】
ループ状に設けられた第１の細溝及び前記第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板と、
前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び前記第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路及び前記第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜と、
透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記薄膜の開口を介して前記薬液流路の一端及び他端と連通して前記薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバ
とを有することを特徴とするマイクロ流体チップ。
【請求項２】
ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板と、
前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜と、
透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記透過膜と前記薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバ
とを有することを特徴とするマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記透過膜は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記透過膜の厚みは、１０〜１０００μｍであることを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記培養液室に培養液、前記薬液室に前記流路内のｐＨ及び浸透圧調整用の薬液が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項６】
前記リザーバを避けるように、前記薄膜を介して前記第１の細溝上に配置された、点字デバイス流体駆動装置をさらに有することを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項７】
前記基板は、ループ状に設けられた第３の細溝を表面にさらに備え、
前記薄膜は、前記第３の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口をさらに備え、前記基板上に配置した際に前記第３の細溝に対応する部分に第２の培養流路を形成することを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項８】
ループ状に設けられた第１の細溝を表面に備える基板、前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路を形成するシート状の薄膜、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記透過膜と前記薄膜により仕切られた空間を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを用意し、前記培養流路及び前記培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容する工程と、
前記培養流路と前記培養液室内で前記培養液を循環させる工程と、
前記薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程と
を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項９】
前記基板の前記リザーバの反対側表面に熱源を配置し、前記マイクロ流体チップを加熱することにより、前記薬液の温度を調整することを特徴とする請求項８記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
ループ状に設けられた第１の細溝及び前記第１の細溝の外周にループ状に設けられた第２の細溝を表面に備える基板、前記第１の細溝の一端と他端に対応する部分及び前記第２の細溝の一端と他端に対応する部分にそれぞれ開口を備え、前記基板上に配置した際に前記第１の細溝に対応する部分に培養流路及び前記第２の細溝に対応する部分に薬液流路を形成するシート状の薄膜、透過膜により内部が培養液室と薬液室に仕切られ、前記薄膜を介して前記基板上に配置した際に、前記培養液室は前記薄膜の開口を介して前記培養流路の一端及び他端と連通して前記培養流路と閉鎖的な循環系を形成し、前記薬液室は前記薄膜の開口を介して前記薬液流路の一端及び他端と連通して前記薬液流路と閉鎖的な循環系を形成するリザーバとを有するマイクロ流体チップを用意し、前記培養流路及び前記培養液室により形成された閉鎖的な循環系内に細胞及び培養液を収容し、前記薬液流路及び前記薬液室により形成された閉鎖的な循環系内に薬液を収容する工程と、
前記培養流路と前記培養液室内で前記培養液を循環させる工程と、
前記薬液室と前記薬液流路内で前記薬液を循環させる工程と、
前記薬液の温度を調整することにより透過膜を介して薬液室から培養液室に熱拡散により薬液を供給して培養流路内のｐＨ及び温度を制御する工程と
を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−２０６０４５（Ｐ２０１１−２０６０４５Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３６１６７（Ｐ２０１１−３６１６７）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月１８日、社団法人日本生体医工学会 関東支部発行の「生体医工学シンポジウム２００９講演予稿集」に発表、平成２１年１２月１０日、社団法人日本生体医工学会発行の「生体医工学第４７巻 第６号」に発表
【出願人】（８００００００６８）学校法人東京電機大学 (112)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月１８日、社団法人日本生体医工学会 関東支部発行の「生体医工学シンポジウム２００９講演予稿集」に発表、平成２１年１２月１０日、社団法人日本生体医工学会発行の「生体医工学第４７巻 第６号」に発表
【出願人】（８００００００６８）学校法人東京電機大学 (112)
【Ｆターム（参考）】
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