マイコプラズマ・ニューモニア検出用抗体
【課題】Mycoplasma pneumoniaeに属する微生物を特異的、かつ高感度に迅速に検出する方法、その検出に用いる検出用抗体，検出用試薬キット，及び検出に用いる検出用抗体の製造方法を提供する。
【解決手段】Mycoplasma pneumoniaeに属する微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体であって、該微生物に特異的に反応する抗体、この抗体を用いて検体中の該微生物を検出する方法、及びこの抗体を含む検出用試薬キット。リボソーム蛋白質としてはRibosomal Protein L7/L12蛋白質があり、肺炎の原因微生物の感染検出に用いられる。
【解決手段】Mycoplasma pneumoniaeに属する微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体であって、該微生物に特異的に反応する抗体、この抗体を用いて検体中の該微生物を検出する方法、及びこの抗体を含む検出用試薬キット。リボソーム蛋白質としてはRibosomal Protein L7/L12蛋白質があり、肺炎の原因微生物の感染検出に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的な肺炎の原因微生物であるマイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する微生物の検出に有用な抗体、該微生物の検出方法、該微生物の検出用試薬キット、及び該微生物検出用抗体の製造方法に関する。
【０００２】
本発明は、医薬品業界、特にMycoplasma pneumoniaeによって惹起される非定型肺炎の診断に重要であり、医薬品の産業上有用である。
【０００３】
本発明は、検体、例えば、のど綿棒、組織サンプル、体液、実験用の溶液および培養物から採取された検体中に含まれる微生物、Mycoplasma pneumoniaeを検出するのに有用である。
【背景技術】
【０００４】
微生物感染症の診断は、通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
【０００５】
感染症原因菌の検出は、一般に、原因菌の分離培養を経て、その生理学的、生化学的あるいは構造的な特性に基づきこれを同定する培養同定法、原因菌の遺伝子をPolymerase chain reaction(PCR)法または特異的核酸ハイブリダイゼーションにより増幅させて、これを検出する遺伝子的診断法および抗体と原因菌の抗原マーカーとの特異的反応を利用して原因菌を検出する免疫学的方法に分類される。
【０００６】
しかしながら、培養同定法または遺伝子的診断法を用いる場合には、結果を得るのに長時間を要する。従って、原因菌を短時間にしかも高感度で検出することができ、迅速かつ適切な患者の治療につながる免疫学的方法による診断が汎用されている。
【０００７】
従来免疫学的方法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
【０００８】
Mycoplasma pneumoniaeは肺炎、気管支炎および咽頭炎の一般的な原因菌である。小さな真菌様のグラム陰性菌であり、選択的にヒトの体内に侵入し、病気を引き起す。一般社会で集団的に発症する肺炎の約15-20%、および限定された集団内の肺炎の50%までがMycoplasma pneumoniaeによって引き起されると言われている(Ragnar Norrby 1999)。
【０００９】
この菌は非常に微小の培養し難い微生物であり、濃厚培地中で小さなコロニーを形成する。栄養冨化寒天培地中でのMycoplasma pneumoniaeの成長は非常に緩慢であり、培地中に菌体を同定するまでに少なくとも21日間を要する(Granato, Poe, et al. 1980)。ヒトの体内に起源を有するいくつかのマイコプラズマ種の微生物は同様の生化学的反応を起こす。一方、細胞壁がないため、明るい顕微鏡下での観察を一層困難なものとする（Knudson and MacLeod 1979）。従って、迅速に病原菌として検出する診断法としては、グラム染色法と培養法などを適用することができない。
【００１０】
Mycoplasma pneumoniae検出の遺伝子配列に用いられるDNAハイブリダイゼーション分析プローブは、Hymanら、Buckら及びBernet ら、(Hyman, Yogev et al. 1987; Bernet, Garret et al. 1993; Buck, O'Hara et al. 1993)等によって報告されている。Mycoplasma pneumoniaeリボソーマルRNA(rRNA)検出に用いられるプローブは、Tilton ら(Tilton, Dias et al. 1980)、 Yogev ら(Yogev, Halachmi et al. 1988)、 Gobel ら(Gobel, Geiser et al. 1987)、 Zivin とMonahan (EPO 305145)及び Gobeland とStanbridge (EPO250662)等に記載されている。Kai ら(Kai, Kamiya et al. 1987)及びJensen ら(Jensen, Sondergard-Andersen et al. 1993)等はMycoplasma pneumoniaeの16S rRNA配列のプライマーを記載している。ここに述べられた全てのプローブはMycoplasma pneumoniaeのDNAまたはMycoplasma pneumoniaeとMycoplasma genitaliumのDNAに対して設計されている。これらのプローブは比較的感度が高いので、ごく最近利用可能となった技術、例えば、PCR法を用いてこれらを捕捉する。PCR法は非常に感度が高く、しかもハイブリダイゼーションよりも短時間で行うことができる。しかしながら、培養Mycoplasma pneumoniae陰性の無症状の人や、病気が治癒した後のキャリアの人に陽性を示す、擬陽性の問題がしばしば存在する。
【００１１】
特開昭６３−２９８号公報は、約43キロダルトンのMycoplasma pneumoniaeの膜抗原蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法をベースとする免疫検出法が記載されている。しかしながら、上記抗体および当該抗体を用いる検出法は、特異性が低くMycoplasma pneumoniaeに対する種の特異的な診断のためには不十分であるという問題を有する。さらに、この診断法によると結果がでるまでに少なくとも５時間かかるという問題もある(Madsen et al. 1988).
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許No.5,552,279, Weisburg, et al., September3, 1996 「Mycoplasma pneumoniaeおよびMycoplasma genitalium検出用核酸プローブ」
【特許文献２】EPO 305145, Application No.88307793.5 Zivin and Monahan. March 1, 1989. Methods and probes for detecting nucleic acid.
【特許文献３】EPO 250662, Application No.86304919,3 Gobel and Stanbridge. January 7, 1988, Detection of Mycoplasma by DNA hybridization.
【特許文献４】特開昭63(1988)-298
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Bernet, C., M. Garret, et al., (1993) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用するMycoplasma pneumoniaeの検出」J Clin Microbiol 31(4), 1013-5
【非特許文献２】Buck, G. E., L. C. O′Hara, et al., (1993) 「DNA増殖による疑似臨床試料中のMycoplasma pneumoniaeの迅速かつ高感度の検出法」J Clin Microbiol 31(4), 1013-5
【非特許文献３】Gobel, U. B., A. Geiser, et al., (1987) 「Mycoplasma種間のリボソーマルRNA差別化可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ」
【非特許文献４】Granato, P. A., L. Poe, et al., (1980) 「Mycoplasma pneumoniae成長における改良New York City培地の利用に関する報告書」Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol (8), 50-3
【非特許文献５】Hyman, H. C., D. Yogev, et al., (1987) 「Mycoplasma pneumoniaeおよびMycoplasma genitaliumの検出・同定用DNAプローブ」
【非特許文献６】Jensen, J. S., J. Sondergard Andersen, et al., (1993) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用する疑似臨床サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの検出」J Med Microbiol 38(3), 166-70
【非特許文献７】Kai, M., S. Kamiya, et al., (1987) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用するMycoplasma pneumoniaeの迅速検出法」J Gen Microbiol 133(Pt7), 1969-74
【非特許文献８】Knudson, D. L. and R. MacLeod (1979) 「Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma salivarium-寒天中でのコロニー成長の電子顕微鏡写真」Sci Rep Res Inst Tohoku Univ [Med] 26(3-4), 71-91
【非特許文献９】Madsen RD, Weiner LB, McMillan JA, Saeed JA, North JA, Coates SR. (1988). Direct detection of Mycoplasma pneumoniae antigen in clinical specimens by a monoclonal antibody immunoblot assay Am J Clin Pathol 89(1):95-9
【非特許文献１０】Ragnar Norrby, S. (1999)「ノルディック諸国の代表的肺炎、その病因とフレロキサシンおよびドキシシクリンの比較臨床結果、Nordic Atypical Pneumoniae Study Group」 J Med Microbiol 48(12),1115-22
【非特許文献１１】Tilton, R. C., F. Dias, et al., (1980) 「臨床試料中のMycoplasma pneumoniae検出用DNAプーロブと培養」J Clin Microbiol 12(6), 748-52
【非特許文献１２】Yogev,D., D. Halachmi, et al. (1988) 「rRNA遺伝子プローブとゲノムDNA fingerprintsによるMycoplasma種およびMycoplasma株（mollicutes）の検出」J Clin Microbiol 26(11), 2266-9
【非特許文献１３】Chan ED, Kalayanamit T, Lynch DA, Tuder R, Arndt P, WinnR. Schwarz MI.「成人に重度の肺病気を引き起すMycoplasma pnenmoniae関連細気管支炎−文献レビュー」Chest., 1999; 115(4), 1188-94
【非特許文献１４】NCBIデータベース#NC#000912., Himmelreich, R., Hilbelt, H., Plagens, H., Pirkl, E., Li, B. C., and Herrmann, R.
【非特許文献１５】Cimolai N.「Mycoplasma pneumoniaeによる呼吸器感染症」Pediatr Rev., 1998 ; 19(10), 327-31
【非特許文献１６】Harlow, E., and D. Lane (1988)「抗体、実験室マニュアル」New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献１７】Shambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, (1989) 「モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版」Cold Spring Harbor Laboratory Press
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、Mycoplasma pneumoniaeに属する微生物を特異的、かつ高感度に迅速に検出する方法、その検出に用いる検出用抗体、検出用試薬キットを提供することを課題とする。さらに、本発明は、その検出に用いる検出用抗体の製造方法を提供することを課題とする。
【００１５】
本発明者等は、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化はきわめて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つとともに、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。さらに詳しくは、該蛋白質はアミノ酸配列の変化を経て、同一種間では全く構造が同じであり、種が異なる場合は構造の変化を伴なう種特異性を示す有用な蛋白質である。
【００１６】
本発明者らは全ての微生物細胞に同一機能の分子として存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種であるRibosomal Protein L7/L12蛋白質に着目した。Ribosomal Protein L7/L12蛋白質は分子量約13キロダルトンの蛋白質であり、蛋白質合成に必須のリボソーム蛋白質として存在することが知られている。特にMycoplasma pneumoniaeを含むいくつかの微生物ではRibosomal Protein L7/L12蛋白質の全アミノ酸配列が解析されている。
【００１７】
本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらず、その一部に各微生物固有の構造部分を持つことに着目し、このMycoplasma pneumoniae のRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物、細菌の種特異的でかつ全ての同一菌種内の血清型について検出が可能であることを見いだした。
【００１８】
本発明者等は、Mycoplasma pneumoniaeの該蛋白質に特異的な抗体が得られること、および該抗体を用いることによりMycoplasma pneumoniaeの特異的な検出が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１９】
本発明により、Mycoplasma pneumoniaeの Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体が見出され開発された。この抗体は新規であり、従来公知のいかなる抗体とも異なり、上記蛋白質と特異的に反応する性質を有する。
【００２０】
配列表において配列番号１及び２はMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子のDNA配列及び対応するアミノ酸配列である(NCBI database accession # NC 000912)。なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末端）およびカルボキシル基末端（以下、C末端）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ5′末端および3′末端である。クロスマッチテストのアミノ酸配列のアミノ酸は１文字略字で表している。また、クロスマッチテストにおける「+」の表記は、異なるアミノ酸であるが疎水性などの性質が類縁のアミノ酸であること、「 」のブランクは性質も含めて全く異なるアミノ酸であることを示す。また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えばMolecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Shambrook, J.ら(1989)を挙げることができる。
【００２１】
【表１】
本発明において“微生物”とは、Mycoplasma pneumoniaeを意味し、特に、呼吸器における病原性を有しマイコプラズマ感染症の原因菌として診断の意義の高い微生物をいう。
本発明において、″微生物と特異的に反応する抗体″とは、微生物の種あるいは属に特異的に反応する抗体をさすが、微生物感染症の診断においては微生物の種に特異的に反応する抗体が特に有用となる。
【００２２】
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指し、上記Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは5アミノ酸以上、特に好ましくは8アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。
このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはKLH(keyhole-limpet hemocyanin)やBSA(bovine serum albumin)といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでRibosomal Protein L7/L12蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。
【００２３】
また該蛋白質の全長または5残基以上、望ましくは8残基以上のアミノ酸配列をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)などとフュージョン蛋白質としたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。
【００２４】
成書（Antibodies ; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて培養した細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
【００２５】
本発明のマーカー抗原として用いることができるRibosomal Protein L7/L12に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるがこれらの方法に限定されるものではない。
ａ）Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性の少ない領域についてペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２６】
また、既知の該遺伝子の両端部位におけるDNA配列をプローブとしたPCR法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
【００２７】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｂ）Ribosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が菌種間で50〜60%相同であることにより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にしてPCR法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｃ）あるいはRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する5〜30アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製する。該抗体を用いたアフィニティカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製されたRibosomal Protein L7/L12蛋白質を取得することができる。
蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製したのち作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりRibosomal Protein L7/L12蛋白質の溶出画分を同定し精製蛋白質を得ることができる。得られた精製Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２８】
上記の方法ａ）、ｂ）およびｃ）によって得られた種々の微生物に特異的な本発明の抗体は種々の免疫学的分析法に用いることにより、目的とする微生物に特異的な各種の診断試薬およびキットを提供することができる。例えば、この抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もし〈は発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉(capture)抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００２９】
抗体を用いる微生物診断方法とは、ポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法を利用する診断方法を意味する。
【００３０】
また、特に抗体を用いる有用な微生物診断方法として特表平７−５０９５６５号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ(OIA, Optical Immunoassay)などが高感度な診断方法として有用である。
【００３１】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、TritonX-100、Tween-20をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられる。界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
【００３２】
また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００３３】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列及びDNA配列を配列表に示す。従って、この微生物の場合はRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列を、配列表に「クロスマッチ」と記した類似した微生物の同種の蛋白質と比較することが可能である。相同性の低いセグメントのペプチドを合成し、これに対するポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作成することは、微生物に対する特異性を有するものの選択を省略することを可能とする。
【００３４】
特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清をProtein Aカラム等で精製しIgG画分を取得したのち、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドによるアフィニティ精製を実施することが望ましい。
【００３５】
更に、当該微生物のRibosomal Protein L7/L12蛋白質のDNA配列からN末端とC末端の配列に基づいてPCRプライマーが作成された。
【００３６】
このPCRプライマーの相同性を利用して、ゲノムDNAを用いてPCR法によりDNA断片を増殖させ、これを抽出し、常法によりMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の断片を取得することができる。Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の全長はこれらの断片のDNA配列情報を分析することにより知ることができる。
【００３７】
取得したMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子は、例えばGSTなどとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、菌体破砕液をGSTを用いたアフィニティカラムで精製することにより、Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質とGSTのフュージョン蛋白質が得られる。
【００３８】
この蛋白質をそのまま、あるいはGST部分を切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマクローンを確立し、Mycoplasma pneumoniae菌体あるいは菌体破砕液またはMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
【００３９】
本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００４０】
また本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するいわゆる捕捉抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾していわゆる酵素標識抗体とすることにより、検出用抗体としても機能しうる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
Mycoplasma pneumoniaeからのRibosomal Protein L7/L12遺伝子のクローニングMycoplasma pneumoniae(ATCC15531, ATCCから分譲、購入)を、Mycoplasma Supplement(DIFCO,0836-68-9)を加えたPPLO寒天培地(DIFCO, 0412-17-3)上に適当量植菌したのち、CO2インキュベーター中で37℃、5% CO2条件で5時間培養した。生育したコロニーを最終的に5×109CFU/ml前後になるようにTE緩衝液（和光純薬工業製）に懸濁した。この懸濁液約1.5mlを微量遠心チューブに移し取り10,000 rpmで2分間遠心し、上澄み液を棄てた。沈殿部分を567μlのTE緩衝液に再懸濁した。さらに30μlの10%SDSと3μlの20mg/mlのProteinaseK溶液を加えて良く混合し、37℃で1時間インキュベートした。懸濁液を56℃で更に1時間インキュベートした。次に10%のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド/0.7M NaCl溶液を80μl加え、よく混合したのち65℃で10分間インキュベートした。同一体積の24:1のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を700μl加えよく攪拌した。
【００４３】
この溶液を微量遠心機で12,000rpm、5分間、4℃で遠心処理したのち、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに0.6倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってDNAの沈殿を形成した。白いDNA沈殿をガラス棒ですくって1mlの70%エタノール（-20℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。その後チューブを10,000rpmで5分間遠心し、上清を静かに除去した。1mlの70%エタノールを追加し、混合物を更に5分間遠心した。
【００４４】
再び上澄みを除去したのち沈殿を100μlのTE緩衝液に溶解しDNA溶液を得た。このゲノムDNA溶液の濃度をMolecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds. Shambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Cold Spring harbor Laboratory PressのE5, Spectrophotometric Determination of the Amount of DNA or RNAに従って定量した。
【００４５】
このゲノムDNAのうち10ngを用いてPCR(polymerase chain reaction)を行った。PCRはTaqポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR001A）を用いた。酵素に添付の緩衝液5μl、酵素に添付のdNTP混合物4μlおよび各200pmolのオリゴヌクレオチド（配列表配列番号：３および４に示すもの）を酵素に加えた。全体の容量が50μlとなるように精製水を加えた。
【００４６】
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、95℃1分、50℃2分、72℃3分を5サイクル行ったのち、95℃1分、60℃2分、72℃3分を25サイクル行った。このPCR生成物の一部を用いて、1.5%アガロースゲル中にて電気泳動を実施した。エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約400bpのcDNAが増幅されていることを確認した。制限酵素BamHIおよびXhoIを用いて切断後、1.5%アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約400bpのバンドを切り取った。このバンドをSuprec01（宝酒造株式会社製）で精製し、一般的なベクターであるpGEX-6P-1(Pharmacia社製)に挿入した。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりGST蛋白質とのフユージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
【００４７】
具体的にはベクターpGEX-6P-1と先のDNAとをそのモル比が1:3となるように混ぜ合わせて、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen社製)にてベクターにDNAを組み込んだ。DNAを組み込んだベクターpGEX-6P-1は大腸菌のワンショットコンピテントセルに遺伝子学的手法により導入し、ついで50μg/mlのアンピシリン（シグマ社）を含む半固体状の培養プレートであるLB L-ブロス寒天（宝酒造株式会社製）に接種した。プレートを37℃で12時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むL-ブロス培養液に接種した。37℃で8時間振とう培養・集菌後、Wizard Miniprepを用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。プラスミドは制限酵素BamHI/XhoIにて切断処理した。約370bpのDNAを切断することによってPCR生成物の挿入を確認した。挿入されたDNAの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。
【００４８】
挿入DNA断片の塩基配列の決定は、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。
【００４９】
シークエンスサンプルの調製はPRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて行った。先ず、9.5μlの反応液、4.0μlの0.8pmol/μlのT7プロモータープライマー(Gibco BRL)、および6.5μlの0.16μg/μlテンプレートDNAを0.5mlのマイクロチューブに加え、混合した。混合物を2層の100μl鉱油で覆ったのち、25サイクルPCR増幅処理を行った。ここで、1サイクルは、96℃での30秒間の処理、55℃での15秒間の処理、および60℃での4分間の処理からなる。生成物を4℃で5分間保持した。反応終了後、80μlの無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノールークロロホルム混合液で３回抽出した。10μlの3M酢酸ナトリウムpH5.2と300μlのエタノールを100μlの水層に加え、攪拌した。その後14,000rpm、室温で15分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を75%エタノールで洗浄後、真空下に2分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、4μlの10mMのEDTAを含むホルムアミドに溶解して90℃で2分間変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。
【００５０】
無差別に選択した5個のクローンのうち2個はPCRに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子配列と一致したDNA配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１及び２に示すような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにMicoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】
【００５１】
Mycoplasma pneumoniaeからのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をLB培地中で50ml、37℃、一昼夜培養した。500mlの2倍濃度のYT培地を37℃で1時間加熱した。1晩培養した大腸菌液50mlを500mlの前述の培地に入れた。一時間後、550μlの100mM イソプロピルβ-D(-)-チオガラクトピラノシド(IPTG)を導入し、4時間培養した。生成物を回収し、250mlの遠心チューブに移し、7000rpmで10分間遠心した。上澄みを棄てて50mM Tris緩衝液pH7.4、25% Sucroseを含むLysis緩衝液25mlずつに溶解した。さらに10% NP-40 1.25ml、1M MgCl2 125μlを加えてプラスチックチューブに移した。氷冷下、1分間の超音波処理を5回行った。その後、12,000rpmで15分間遠心し、上清を回収した。
【００５２】
次に、PBSでコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、20mM Tris緩衝液pH7.4、4.2mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール(DTT)を含む洗浄液でカラムを2ベッドボリューム分洗浄した。5mMのグルタチオンを含む50mMTris緩衝液pH9.6中で溶離処理をした。溶出画分の蛋白質含有量をピグメント結合法(Bradford法 ; BioRad Co.)で決定し、主画分を取得した。
【００５３】
得られた精製GSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約75%であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】
【００５４】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはMycoplasma pneumoniaeのGSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質抗原100μgを200μlのPBSに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを200μl加え混合した。エマルジョン化したのち200μlを腹腔内に注射した。 同じエマルジョン化抗原を2週間後、4週間後、および6週間後に腹腔内に注射した。2倍濃度のエマルジョン化抗原を10週間後および14週間後に腹腔内に注射した。最終の免疫化終了の3日後に脾臓を摘出し、細胞融合した。
【００５５】
無菌的に取り出したマウスの脾細胞108個に対し骨髄腫細胞2×107個をガラスチューブに取り良く混合したのち1500rpmで5分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
【００５６】
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、NS-1系の細胞株を用い10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養し、細胞融合の2週間前から0.13mMのアザグアニン、0.5μg/mlのMC-210、10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養後、さらに10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養したものを用いた。
【００５７】
37℃に保持したRPMI1640培養液50mlを混合細胞試料に加え、1,500rpmで遠心分離した。上澄み液を除去後、37℃に保持した50%ポリエチレングリコール1mlを加え、1分間攪拌した。37℃に保持したRPMI1640培養液10mlを加え、混合液を殺菌したピペットで約5分間吸引・排出する事により激しく攪拌した。
【００５８】
5分間1,000rpmで遠心分離し、上澄み液を除去したのち、細胞濃度が5×106/mlとなるように30ml HAT培養液を加えた。この混合物を均一になるまで攪拌し、0.1mlずつを96穴の培養プレートに注ぎ、37℃、7％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。HAT培地を、第1日、第1週、および第2週にそれぞれ0.1mlずつ加え、ELISA法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。
【００５９】
0.05%のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したGSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質およびGST蛋白質をそれぞれ10μg/ml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4℃で1晩吸着させた。
【００６０】
上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02%Tween20,PBS)で洗浄した。これに融合細胞の培養液100mlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ng/mlのペルオキシダーゼでラベルしたgoat anti-mouse IgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液(KPL社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
【００６１】
この結果、GSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質にのみ反応しGST蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
【００６２】
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し24穴プラスティックプレート中、HAT培地で培養した。
【００６３】
培養した融合培地を細胞数が約20個/mlになるようにHT培地で希釈し50μlを、HT培地に懸濁した6週齢のマウス胸腺細胞106個と96穴培養プレート中で混合した。混合後、7%CO2条件下、37℃で2週間培養した。
【００６４】
培養上澄み中の抗体活性を前述のELISA法にて同様に検定し、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマMPRB-1〜5の計5クローンを取得した。
【実施例４】
【００６５】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を検出するモノクローナル抗体の選択
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
【００６６】
具体的には、RPMI1640培地(10%FCS入り)を用いて継代培養した細胞をあらかじめ2週間前に0.5mlのプリスタンを腹腔内に注射したBlab/Cマウスの腹腔内に5×106個(PBS中)注射した。3週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
【００６７】
得られた抗体を含む溶液をProtein Aカラム(5ml, Pharmacia製)に吸収させ、3倍量のPBSで洗浄した。次いで、クエン酸緩衝液pH3で溶出した。抗体画分を回収し、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を取得した。この5株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてELISA法により評価した。
【００６８】
モノクローナル抗体の評価にはサンドウィッチ分析法を用いた。作成されたモノクローナル抗体をペルオキシダーゼに結合せしめることにより検出用の抗体として用いた。
酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードVI）を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73に述べられている方法に従って行った。ELISA反応においては市販の抗Mycoplasma pneumoniaeポリクローナル抗体(Biodesign社、ウサギ)を10μg/ml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4℃で1晩吸着させた。
【００６９】
上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02%Tween20, PBS)で洗浄した。これに各微生物の培養液に濃度0.3%となる量のTriton X-100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液100μlを加え、室温で2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度5μg/mlのペルオキシダーゼ標識抗Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液(KPL社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。450nmの吸光度を測定した。
【００７０】
酵素標識抗体としてハイブリドーマMPRB-1由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したMycoplasma pneumoniaeの全ての株を106個/mlの感度の感度で検出すると同時に他のHaemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Chlamydia pneumoniaeおよびNeisseria meningitides等の微生物について108個/mlの高濃度でも反応性を示さずRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでMycoplasma pneumoniae特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。この抗体はAMMP-1と名付けられた。表２はAMMP-1を用いた結果のみを示す。別の微生物と交差反応を示す他の抗体を使用した結果はここで言及しない。
【００７１】
【表２】
【実施例５】
【００７２】
Ribosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたMycoplasma pneumoniae Ribosomal Protein L7/L12蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得
実施例１に記載の方法により取得したMycoplasma pneumoniae Ribosomal Protein L7/L12蛋白質またはTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として使用した。100μgの抗原を含む生理食塩水約1.2mlをフロイントアジュバント1.5mlとともに乳化した。エマルジョンをSPF日本白色ウサギに皮下注射してウサギを免疫化した。2週間おきに5〜6回免疫し、抗体価を確認した。
【００７３】
抗体価の確認はELISA法により実施した。0.05%のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を10μg/ml濃度に希釈した液を100μlずつ96穴プレートに分注し4℃で1晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02% Tween20, PBS)で洗浄した。正常のウサギ血清および免疫化したウサギの抗血清を希釈して得られた溶液100μlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ng/mlのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。OPD溶液(Sigma社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。492nmの吸光度を測定した。
【００７４】
抗体価上昇を確認後、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、37℃で1時間放置後、4℃で一晩静置した。その後3000rpm5分間遠心し、上清を回収した。得られた抗血清は4℃で保存した。
【００７５】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。HiTrap NHS活性化カラム(1ml, Pharmacia社製)を用いた。カラムを1mM HClで置換後直ちにRibosomal Protein L7/L12蛋白質のPBS溶液(1mg/ml)を加えた。カラムを30分間静置後、ブロッキング試薬を加え、PBSで平衡化した。
【００７６】
このMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、Mycoplasma pneumoniaeのTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。この抗血清をPBSで5倍に希釈し、0.45μmのフィルターを通した後、流速0.5ml/minで Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後0.1Mグリシン緩衝液pH2.1でカラムから溶出し、直ちに1M Tris緩衝液pH9.0で中和した後、抗体価測定法と同様のELISA法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。
【００７７】
このようにして得られたポリクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているOIA法により評価した。
【００７８】
精製した抗体はOIA法の捕捉抗体として使用した。また検出抗体としては実施例４に記載したAMCT-1モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ(SigmaグレードVI)を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73に述べられている方法に従って行った。
【００７９】
OIA反応においては0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中の精製ポリクローナル抗体を10μg/ml濃度に0.1M HEPES緩衝液pH8.0で希釈した液を50μlずつシリコンウエハー上に添加し室温で30分反応させた後、蒸留水で洗浄し、サッカロース及びアルカリ処理カゼインを含むコーティング溶液でコーティング後、使用した。
【００８０】
上記操作で得られた各微生物の培養液に濃度0.5%となる量のTritonX-100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液15μlを上記シリコンウェハーの上に添加し、室温で10分間反応させた。次いで、20μg/mlペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を15μl加え、10分間反応させた。蒸留水で洗浄後、TMB溶液(KPL社製)を15μlずつ加え、混合物を室温にて5分間反応させた。生成物を蒸留水で洗浄し、酵素反応により生成した青色を肉眼で観察した。
【００８１】
この結果、表３に示すように、精製ポリクローナル抗体APMP-1を捕捉抗体として用いることにより、Mycoplasma pneumoniaeを108個/mlの感度で検知できること、および他の微生物の反応性は検知できないことが明らかである。このようにしてMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムにより、Mycoplasma pneumoniaeに特異的に反応するポリクローナル抗体を取得したことを確認した。
【００８２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によると微生物の進化の過程で機能的に保持された細胞内分子に対する抗体を用いて特定の種の微生物を特異的に検出できるだけでなく、同一種内における全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。
【００８４】
このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を用い、Mycoplasma pneumoniaeの検出を精度良く行うことができる。
また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行うことができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的な肺炎の原因微生物であるマイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する微生物の検出に有用な抗体、該微生物の検出方法、該微生物の検出用試薬キット、及び該微生物検出用抗体の製造方法に関する。
【０００２】
本発明は、医薬品業界、特にMycoplasma pneumoniaeによって惹起される非定型肺炎の診断に重要であり、医薬品の産業上有用である。
【０００３】
本発明は、検体、例えば、のど綿棒、組織サンプル、体液、実験用の溶液および培養物から採取された検体中に含まれる微生物、Mycoplasma pneumoniaeを検出するのに有用である。
【背景技術】
【０００４】
微生物感染症の診断は、通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
【０００５】
感染症原因菌の検出は、一般に、原因菌の分離培養を経て、その生理学的、生化学的あるいは構造的な特性に基づきこれを同定する培養同定法、原因菌の遺伝子をPolymerase chain reaction(PCR)法または特異的核酸ハイブリダイゼーションにより増幅させて、これを検出する遺伝子的診断法および抗体と原因菌の抗原マーカーとの特異的反応を利用して原因菌を検出する免疫学的方法に分類される。
【０００６】
しかしながら、培養同定法または遺伝子的診断法を用いる場合には、結果を得るのに長時間を要する。従って、原因菌を短時間にしかも高感度で検出することができ、迅速かつ適切な患者の治療につながる免疫学的方法による診断が汎用されている。
【０００７】
従来免疫学的方法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
【０００８】
Mycoplasma pneumoniaeは肺炎、気管支炎および咽頭炎の一般的な原因菌である。小さな真菌様のグラム陰性菌であり、選択的にヒトの体内に侵入し、病気を引き起す。一般社会で集団的に発症する肺炎の約15-20%、および限定された集団内の肺炎の50%までがMycoplasma pneumoniaeによって引き起されると言われている(Ragnar Norrby 1999)。
【０００９】
この菌は非常に微小の培養し難い微生物であり、濃厚培地中で小さなコロニーを形成する。栄養冨化寒天培地中でのMycoplasma pneumoniaeの成長は非常に緩慢であり、培地中に菌体を同定するまでに少なくとも21日間を要する(Granato, Poe, et al. 1980)。ヒトの体内に起源を有するいくつかのマイコプラズマ種の微生物は同様の生化学的反応を起こす。一方、細胞壁がないため、明るい顕微鏡下での観察を一層困難なものとする（Knudson and MacLeod 1979）。従って、迅速に病原菌として検出する診断法としては、グラム染色法と培養法などを適用することができない。
【００１０】
Mycoplasma pneumoniae検出の遺伝子配列に用いられるDNAハイブリダイゼーション分析プローブは、Hymanら、Buckら及びBernet ら、(Hyman, Yogev et al. 1987; Bernet, Garret et al. 1993; Buck, O'Hara et al. 1993)等によって報告されている。Mycoplasma pneumoniaeリボソーマルRNA(rRNA)検出に用いられるプローブは、Tilton ら(Tilton, Dias et al. 1980)、 Yogev ら(Yogev, Halachmi et al. 1988)、 Gobel ら(Gobel, Geiser et al. 1987)、 Zivin とMonahan (EPO 305145)及び Gobeland とStanbridge (EPO250662)等に記載されている。Kai ら(Kai, Kamiya et al. 1987)及びJensen ら(Jensen, Sondergard-Andersen et al. 1993)等はMycoplasma pneumoniaeの16S rRNA配列のプライマーを記載している。ここに述べられた全てのプローブはMycoplasma pneumoniaeのDNAまたはMycoplasma pneumoniaeとMycoplasma genitaliumのDNAに対して設計されている。これらのプローブは比較的感度が高いので、ごく最近利用可能となった技術、例えば、PCR法を用いてこれらを捕捉する。PCR法は非常に感度が高く、しかもハイブリダイゼーションよりも短時間で行うことができる。しかしながら、培養Mycoplasma pneumoniae陰性の無症状の人や、病気が治癒した後のキャリアの人に陽性を示す、擬陽性の問題がしばしば存在する。
【００１１】
特開昭６３−２９８号公報は、約43キロダルトンのMycoplasma pneumoniaeの膜抗原蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法をベースとする免疫検出法が記載されている。しかしながら、上記抗体および当該抗体を用いる検出法は、特異性が低くMycoplasma pneumoniaeに対する種の特異的な診断のためには不十分であるという問題を有する。さらに、この診断法によると結果がでるまでに少なくとも５時間かかるという問題もある(Madsen et al. 1988).
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許No.5,552,279, Weisburg, et al., September3, 1996 「Mycoplasma pneumoniaeおよびMycoplasma genitalium検出用核酸プローブ」
【特許文献２】EPO 305145, Application No.88307793.5 Zivin and Monahan. March 1, 1989. Methods and probes for detecting nucleic acid.
【特許文献３】EPO 250662, Application No.86304919,3 Gobel and Stanbridge. January 7, 1988, Detection of Mycoplasma by DNA hybridization.
【特許文献４】特開昭63(1988)-298
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Bernet, C., M. Garret, et al., (1993) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用するMycoplasma pneumoniaeの検出」J Clin Microbiol 31(4), 1013-5
【非特許文献２】Buck, G. E., L. C. O′Hara, et al., (1993) 「DNA増殖による疑似臨床試料中のMycoplasma pneumoniaeの迅速かつ高感度の検出法」J Clin Microbiol 31(4), 1013-5
【非特許文献３】Gobel, U. B., A. Geiser, et al., (1987) 「Mycoplasma種間のリボソーマルRNA差別化可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ」
【非特許文献４】Granato, P. A., L. Poe, et al., (1980) 「Mycoplasma pneumoniae成長における改良New York City培地の利用に関する報告書」Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol (8), 50-3
【非特許文献５】Hyman, H. C., D. Yogev, et al., (1987) 「Mycoplasma pneumoniaeおよびMycoplasma genitaliumの検出・同定用DNAプローブ」
【非特許文献６】Jensen, J. S., J. Sondergard Andersen, et al., (1993) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用する疑似臨床サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの検出」J Med Microbiol 38(3), 166-70
【非特許文献７】Kai, M., S. Kamiya, et al., (1987) 「ポリメラーゼ連鎖反応を利用するMycoplasma pneumoniaeの迅速検出法」J Gen Microbiol 133(Pt7), 1969-74
【非特許文献８】Knudson, D. L. and R. MacLeod (1979) 「Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma salivarium-寒天中でのコロニー成長の電子顕微鏡写真」Sci Rep Res Inst Tohoku Univ [Med] 26(3-4), 71-91
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【非特許文献１０】Ragnar Norrby, S. (1999)「ノルディック諸国の代表的肺炎、その病因とフレロキサシンおよびドキシシクリンの比較臨床結果、Nordic Atypical Pneumoniae Study Group」 J Med Microbiol 48(12),1115-22
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【発明の概要】
【００１４】
本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、Mycoplasma pneumoniaeに属する微生物を特異的、かつ高感度に迅速に検出する方法、その検出に用いる検出用抗体、検出用試薬キットを提供することを課題とする。さらに、本発明は、その検出に用いる検出用抗体の製造方法を提供することを課題とする。
【００１５】
本発明者等は、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化はきわめて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つとともに、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。さらに詳しくは、該蛋白質はアミノ酸配列の変化を経て、同一種間では全く構造が同じであり、種が異なる場合は構造の変化を伴なう種特異性を示す有用な蛋白質である。
【００１６】
本発明者らは全ての微生物細胞に同一機能の分子として存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種であるRibosomal Protein L7/L12蛋白質に着目した。Ribosomal Protein L7/L12蛋白質は分子量約13キロダルトンの蛋白質であり、蛋白質合成に必須のリボソーム蛋白質として存在することが知られている。特にMycoplasma pneumoniaeを含むいくつかの微生物ではRibosomal Protein L7/L12蛋白質の全アミノ酸配列が解析されている。
【００１７】
本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらず、その一部に各微生物固有の構造部分を持つことに着目し、このMycoplasma pneumoniae のRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物、細菌の種特異的でかつ全ての同一菌種内の血清型について検出が可能であることを見いだした。
【００１８】
本発明者等は、Mycoplasma pneumoniaeの該蛋白質に特異的な抗体が得られること、および該抗体を用いることによりMycoplasma pneumoniaeの特異的な検出が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１９】
本発明により、Mycoplasma pneumoniaeの Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体が見出され開発された。この抗体は新規であり、従来公知のいかなる抗体とも異なり、上記蛋白質と特異的に反応する性質を有する。
【００２０】
配列表において配列番号１及び２はMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子のDNA配列及び対応するアミノ酸配列である(NCBI database accession # NC 000912)。なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末端）およびカルボキシル基末端（以下、C末端）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ5′末端および3′末端である。クロスマッチテストのアミノ酸配列のアミノ酸は１文字略字で表している。また、クロスマッチテストにおける「+」の表記は、異なるアミノ酸であるが疎水性などの性質が類縁のアミノ酸であること、「 」のブランクは性質も含めて全く異なるアミノ酸であることを示す。また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えばMolecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Shambrook, J.ら(1989)を挙げることができる。
【００２１】
【表１】
本発明において“微生物”とは、Mycoplasma pneumoniaeを意味し、特に、呼吸器における病原性を有しマイコプラズマ感染症の原因菌として診断の意義の高い微生物をいう。
本発明において、″微生物と特異的に反応する抗体″とは、微生物の種あるいは属に特異的に反応する抗体をさすが、微生物感染症の診断においては微生物の種に特異的に反応する抗体が特に有用となる。
【００２２】
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指し、上記Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは5アミノ酸以上、特に好ましくは8アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。
このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはKLH(keyhole-limpet hemocyanin)やBSA(bovine serum albumin)といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでRibosomal Protein L7/L12蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。
【００２３】
また該蛋白質の全長または5残基以上、望ましくは8残基以上のアミノ酸配列をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)などとフュージョン蛋白質としたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。
【００２４】
成書（Antibodies ; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて培養した細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
【００２５】
本発明のマーカー抗原として用いることができるRibosomal Protein L7/L12に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるがこれらの方法に限定されるものではない。
ａ）Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性の少ない領域についてペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２６】
また、既知の該遺伝子の両端部位におけるDNA配列をプローブとしたPCR法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
【００２７】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｂ）Ribosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が菌種間で50〜60%相同であることにより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にしてPCR法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｃ）あるいはRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する5〜30アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製する。該抗体を用いたアフィニティカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製されたRibosomal Protein L7/L12蛋白質を取得することができる。
蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製したのち作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりRibosomal Protein L7/L12蛋白質の溶出画分を同定し精製蛋白質を得ることができる。得られた精製Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２８】
上記の方法ａ）、ｂ）およびｃ）によって得られた種々の微生物に特異的な本発明の抗体は種々の免疫学的分析法に用いることにより、目的とする微生物に特異的な各種の診断試薬およびキットを提供することができる。例えば、この抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もし〈は発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉(capture)抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００２９】
抗体を用いる微生物診断方法とは、ポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法を利用する診断方法を意味する。
【００３０】
また、特に抗体を用いる有用な微生物診断方法として特表平７−５０９５６５号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ(OIA, Optical Immunoassay)などが高感度な診断方法として有用である。
【００３１】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、TritonX-100、Tween-20をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられる。界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
【００３２】
また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００３３】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列及びDNA配列を配列表に示す。従って、この微生物の場合はRibosomal Protein L7/L12蛋白質のアミノ酸配列を、配列表に「クロスマッチ」と記した類似した微生物の同種の蛋白質と比較することが可能である。相同性の低いセグメントのペプチドを合成し、これに対するポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作成することは、微生物に対する特異性を有するものの選択を省略することを可能とする。
【００３４】
特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清をProtein Aカラム等で精製しIgG画分を取得したのち、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドによるアフィニティ精製を実施することが望ましい。
【００３５】
更に、当該微生物のRibosomal Protein L7/L12蛋白質のDNA配列からN末端とC末端の配列に基づいてPCRプライマーが作成された。
【００３６】
このPCRプライマーの相同性を利用して、ゲノムDNAを用いてPCR法によりDNA断片を増殖させ、これを抽出し、常法によりMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の断片を取得することができる。Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の全長はこれらの断片のDNA配列情報を分析することにより知ることができる。
【００３７】
取得したMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12遺伝子は、例えばGSTなどとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、菌体破砕液をGSTを用いたアフィニティカラムで精製することにより、Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質とGSTのフュージョン蛋白質が得られる。
【００３８】
この蛋白質をそのまま、あるいはGST部分を切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマクローンを確立し、Mycoplasma pneumoniae菌体あるいは菌体破砕液またはMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
【００３９】
本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００４０】
また本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するいわゆる捕捉抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾していわゆる酵素標識抗体とすることにより、検出用抗体としても機能しうる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
Mycoplasma pneumoniaeからのRibosomal Protein L7/L12遺伝子のクローニングMycoplasma pneumoniae(ATCC15531, ATCCから分譲、購入)を、Mycoplasma Supplement(DIFCO,0836-68-9)を加えたPPLO寒天培地(DIFCO, 0412-17-3)上に適当量植菌したのち、CO2インキュベーター中で37℃、5% CO2条件で5時間培養した。生育したコロニーを最終的に5×109CFU/ml前後になるようにTE緩衝液（和光純薬工業製）に懸濁した。この懸濁液約1.5mlを微量遠心チューブに移し取り10,000 rpmで2分間遠心し、上澄み液を棄てた。沈殿部分を567μlのTE緩衝液に再懸濁した。さらに30μlの10%SDSと3μlの20mg/mlのProteinaseK溶液を加えて良く混合し、37℃で1時間インキュベートした。懸濁液を56℃で更に1時間インキュベートした。次に10%のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド/0.7M NaCl溶液を80μl加え、よく混合したのち65℃で10分間インキュベートした。同一体積の24:1のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を700μl加えよく攪拌した。
【００４３】
この溶液を微量遠心機で12,000rpm、5分間、4℃で遠心処理したのち、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに0.6倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってDNAの沈殿を形成した。白いDNA沈殿をガラス棒ですくって1mlの70%エタノール（-20℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。その後チューブを10,000rpmで5分間遠心し、上清を静かに除去した。1mlの70%エタノールを追加し、混合物を更に5分間遠心した。
【００４４】
再び上澄みを除去したのち沈殿を100μlのTE緩衝液に溶解しDNA溶液を得た。このゲノムDNA溶液の濃度をMolecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds. Shambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Cold Spring harbor Laboratory PressのE5, Spectrophotometric Determination of the Amount of DNA or RNAに従って定量した。
【００４５】
このゲノムDNAのうち10ngを用いてPCR(polymerase chain reaction)を行った。PCRはTaqポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR001A）を用いた。酵素に添付の緩衝液5μl、酵素に添付のdNTP混合物4μlおよび各200pmolのオリゴヌクレオチド（配列表配列番号：３および４に示すもの）を酵素に加えた。全体の容量が50μlとなるように精製水を加えた。
【００４６】
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、95℃1分、50℃2分、72℃3分を5サイクル行ったのち、95℃1分、60℃2分、72℃3分を25サイクル行った。このPCR生成物の一部を用いて、1.5%アガロースゲル中にて電気泳動を実施した。エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約400bpのcDNAが増幅されていることを確認した。制限酵素BamHIおよびXhoIを用いて切断後、1.5%アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約400bpのバンドを切り取った。このバンドをSuprec01（宝酒造株式会社製）で精製し、一般的なベクターであるpGEX-6P-1(Pharmacia社製)に挿入した。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりGST蛋白質とのフユージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
【００４７】
具体的にはベクターpGEX-6P-1と先のDNAとをそのモル比が1:3となるように混ぜ合わせて、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen社製)にてベクターにDNAを組み込んだ。DNAを組み込んだベクターpGEX-6P-1は大腸菌のワンショットコンピテントセルに遺伝子学的手法により導入し、ついで50μg/mlのアンピシリン（シグマ社）を含む半固体状の培養プレートであるLB L-ブロス寒天（宝酒造株式会社製）に接種した。プレートを37℃で12時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むL-ブロス培養液に接種した。37℃で8時間振とう培養・集菌後、Wizard Miniprepを用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。プラスミドは制限酵素BamHI/XhoIにて切断処理した。約370bpのDNAを切断することによってPCR生成物の挿入を確認した。挿入されたDNAの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。
【００４８】
挿入DNA断片の塩基配列の決定は、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。
【００４９】
シークエンスサンプルの調製はPRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて行った。先ず、9.5μlの反応液、4.0μlの0.8pmol/μlのT7プロモータープライマー(Gibco BRL)、および6.5μlの0.16μg/μlテンプレートDNAを0.5mlのマイクロチューブに加え、混合した。混合物を2層の100μl鉱油で覆ったのち、25サイクルPCR増幅処理を行った。ここで、1サイクルは、96℃での30秒間の処理、55℃での15秒間の処理、および60℃での4分間の処理からなる。生成物を4℃で5分間保持した。反応終了後、80μlの無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノールークロロホルム混合液で３回抽出した。10μlの3M酢酸ナトリウムpH5.2と300μlのエタノールを100μlの水層に加え、攪拌した。その後14,000rpm、室温で15分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を75%エタノールで洗浄後、真空下に2分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、4μlの10mMのEDTAを含むホルムアミドに溶解して90℃で2分間変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。
【００５０】
無差別に選択した5個のクローンのうち2個はPCRに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子配列と一致したDNA配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１及び２に示すような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにMicoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】
【００５１】
Mycoplasma pneumoniaeからのRibosomal Protein L7/L12遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をLB培地中で50ml、37℃、一昼夜培養した。500mlの2倍濃度のYT培地を37℃で1時間加熱した。1晩培養した大腸菌液50mlを500mlの前述の培地に入れた。一時間後、550μlの100mM イソプロピルβ-D(-)-チオガラクトピラノシド(IPTG)を導入し、4時間培養した。生成物を回収し、250mlの遠心チューブに移し、7000rpmで10分間遠心した。上澄みを棄てて50mM Tris緩衝液pH7.4、25% Sucroseを含むLysis緩衝液25mlずつに溶解した。さらに10% NP-40 1.25ml、1M MgCl2 125μlを加えてプラスチックチューブに移した。氷冷下、1分間の超音波処理を5回行った。その後、12,000rpmで15分間遠心し、上清を回収した。
【００５２】
次に、PBSでコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、20mM Tris緩衝液pH7.4、4.2mM MgCl2、1mM ジチオスレイトール(DTT)を含む洗浄液でカラムを2ベッドボリューム分洗浄した。5mMのグルタチオンを含む50mMTris緩衝液pH9.6中で溶離処理をした。溶出画分の蛋白質含有量をピグメント結合法(Bradford法 ; BioRad Co.)で決定し、主画分を取得した。
【００５３】
得られた精製GSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約75%であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】
【００５４】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはMycoplasma pneumoniaeのGSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質抗原100μgを200μlのPBSに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを200μl加え混合した。エマルジョン化したのち200μlを腹腔内に注射した。 同じエマルジョン化抗原を2週間後、4週間後、および6週間後に腹腔内に注射した。2倍濃度のエマルジョン化抗原を10週間後および14週間後に腹腔内に注射した。最終の免疫化終了の3日後に脾臓を摘出し、細胞融合した。
【００５５】
無菌的に取り出したマウスの脾細胞108個に対し骨髄腫細胞2×107個をガラスチューブに取り良く混合したのち1500rpmで5分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
【００５６】
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、NS-1系の細胞株を用い10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養し、細胞融合の2週間前から0.13mMのアザグアニン、0.5μg/mlのMC-210、10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養後、さらに10%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養したものを用いた。
【００５７】
37℃に保持したRPMI1640培養液50mlを混合細胞試料に加え、1,500rpmで遠心分離した。上澄み液を除去後、37℃に保持した50%ポリエチレングリコール1mlを加え、1分間攪拌した。37℃に保持したRPMI1640培養液10mlを加え、混合液を殺菌したピペットで約5分間吸引・排出する事により激しく攪拌した。
【００５８】
5分間1,000rpmで遠心分離し、上澄み液を除去したのち、細胞濃度が5×106/mlとなるように30ml HAT培養液を加えた。この混合物を均一になるまで攪拌し、0.1mlずつを96穴の培養プレートに注ぎ、37℃、7％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。HAT培地を、第1日、第1週、および第2週にそれぞれ0.1mlずつ加え、ELISA法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。
【００５９】
0.05%のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したGSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質およびGST蛋白質をそれぞれ10μg/ml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4℃で1晩吸着させた。
【００６０】
上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02%Tween20,PBS)で洗浄した。これに融合細胞の培養液100mlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ng/mlのペルオキシダーゼでラベルしたgoat anti-mouse IgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液(KPL社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
【００６１】
この結果、GSTフュージョンRibosomal Protein L7/L12蛋白質にのみ反応しGST蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
【００６２】
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し24穴プラスティックプレート中、HAT培地で培養した。
【００６３】
培養した融合培地を細胞数が約20個/mlになるようにHT培地で希釈し50μlを、HT培地に懸濁した6週齢のマウス胸腺細胞106個と96穴培養プレート中で混合した。混合後、7%CO2条件下、37℃で2週間培養した。
【００６４】
培養上澄み中の抗体活性を前述のELISA法にて同様に検定し、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマMPRB-1〜5の計5クローンを取得した。
【実施例４】
【００６５】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を検出するモノクローナル抗体の選択
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
【００６６】
具体的には、RPMI1640培地(10%FCS入り)を用いて継代培養した細胞をあらかじめ2週間前に0.5mlのプリスタンを腹腔内に注射したBlab/Cマウスの腹腔内に5×106個(PBS中)注射した。3週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
【００６７】
得られた抗体を含む溶液をProtein Aカラム(5ml, Pharmacia製)に吸収させ、3倍量のPBSで洗浄した。次いで、クエン酸緩衝液pH3で溶出した。抗体画分を回収し、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を取得した。この5株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてELISA法により評価した。
【００６８】
モノクローナル抗体の評価にはサンドウィッチ分析法を用いた。作成されたモノクローナル抗体をペルオキシダーゼに結合せしめることにより検出用の抗体として用いた。
酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードVI）を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73に述べられている方法に従って行った。ELISA反応においては市販の抗Mycoplasma pneumoniaeポリクローナル抗体(Biodesign社、ウサギ)を10μg/ml濃度で希釈した液を100μlずつ96穴プレートに別々に分注し4℃で1晩吸着させた。
【００６９】
上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02%Tween20, PBS)で洗浄した。これに各微生物の培養液に濃度0.3%となる量のTriton X-100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液100μlを加え、室温で2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度5μg/mlのペルオキシダーゼ標識抗Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。TMB溶液(KPL社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。450nmの吸光度を測定した。
【００７０】
酵素標識抗体としてハイブリドーマMPRB-1由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したMycoplasma pneumoniaeの全ての株を106個/mlの感度の感度で検出すると同時に他のHaemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Chlamydia pneumoniaeおよびNeisseria meningitides等の微生物について108個/mlの高濃度でも反応性を示さずRibosomal Protein L7/L12蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでMycoplasma pneumoniae特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。この抗体はAMMP-1と名付けられた。表２はAMMP-1を用いた結果のみを示す。別の微生物と交差反応を示す他の抗体を使用した結果はここで言及しない。
【００７１】
【表２】
【実施例５】
【００７２】
Ribosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたMycoplasma pneumoniae Ribosomal Protein L7/L12蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得
実施例１に記載の方法により取得したMycoplasma pneumoniae Ribosomal Protein L7/L12蛋白質またはTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として使用した。100μgの抗原を含む生理食塩水約1.2mlをフロイントアジュバント1.5mlとともに乳化した。エマルジョンをSPF日本白色ウサギに皮下注射してウサギを免疫化した。2週間おきに5〜6回免疫し、抗体価を確認した。
【００７３】
抗体価の確認はELISA法により実施した。0.05%のアジ化ソーダ含むPBS中に溶解したMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を10μg/ml濃度に希釈した液を100μlずつ96穴プレートに分注し4℃で1晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液(PBS中)200μl添加し室温で1時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液(0.02% Tween20, PBS)で洗浄した。正常のウサギ血清および免疫化したウサギの抗血清を希釈して得られた溶液100μlを加え、室温にて2時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度50ng/mlのペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体溶液100μlを加え、室温にて1時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。OPD溶液(Sigma社製)を100μlずつ加え、混合物を室温にて20分間反応させた。着色したところで1Nの硫酸100μlを加えて反応を停止した。492nmの吸光度を測定した。
【００７４】
抗体価上昇を確認後、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、37℃で1時間放置後、4℃で一晩静置した。その後3000rpm5分間遠心し、上清を回収した。得られた抗血清は4℃で保存した。
【００７５】
Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。HiTrap NHS活性化カラム(1ml, Pharmacia社製)を用いた。カラムを1mM HClで置換後直ちにRibosomal Protein L7/L12蛋白質のPBS溶液(1mg/ml)を加えた。カラムを30分間静置後、ブロッキング試薬を加え、PBSで平衡化した。
【００７６】
このMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、Mycoplasma pneumoniaeのTriton X-100処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。この抗血清をPBSで5倍に希釈し、0.45μmのフィルターを通した後、流速0.5ml/minで Mycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後0.1Mグリシン緩衝液pH2.1でカラムから溶出し、直ちに1M Tris緩衝液pH9.0で中和した後、抗体価測定法と同様のELISA法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。
【００７７】
このようにして得られたポリクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているOIA法により評価した。
【００７８】
精製した抗体はOIA法の捕捉抗体として使用した。また検出抗体としては実施例４に記載したAMCT-1モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ(SigmaグレードVI)を用い結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用しAnalytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73に述べられている方法に従って行った。
【００７９】
OIA反応においては0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中の精製ポリクローナル抗体を10μg/ml濃度に0.1M HEPES緩衝液pH8.0で希釈した液を50μlずつシリコンウエハー上に添加し室温で30分反応させた後、蒸留水で洗浄し、サッカロース及びアルカリ処理カゼインを含むコーティング溶液でコーティング後、使用した。
【００８０】
上記操作で得られた各微生物の培養液に濃度0.5%となる量のTritonX-100を加え常温で5分間抽出することにより得られた抗原溶液15μlを上記シリコンウェハーの上に添加し、室温で10分間反応させた。次いで、20μg/mlペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を15μl加え、10分間反応させた。蒸留水で洗浄後、TMB溶液(KPL社製)を15μlずつ加え、混合物を室温にて5分間反応させた。生成物を蒸留水で洗浄し、酵素反応により生成した青色を肉眼で観察した。
【００８１】
この結果、表３に示すように、精製ポリクローナル抗体APMP-1を捕捉抗体として用いることにより、Mycoplasma pneumoniaeを108個/mlの感度で検知できること、および他の微生物の反応性は検知できないことが明らかである。このようにしてMycoplasma pneumoniaeのRibosomal Protein L7/L12蛋白質を固定化したアフィニティカラムにより、Mycoplasma pneumoniaeに特異的に反応するポリクローナル抗体を取得したことを確認した。
【００８２】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によると微生物の進化の過程で機能的に保持された細胞内分子に対する抗体を用いて特定の種の微生物を特異的に検出できるだけでなく、同一種内における全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。
【００８４】
このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ribosomal Protein L7/L12蛋白質に対する抗体を用い、Mycoplasma pneumoniaeの検出を精度良く行うことができる。
また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行うことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する微生物のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、該微生物のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該微生N.menigitides,N.lactamica,N.mucosa,N.sicca,H.influenzae,B.catarrharis,N.gonorrhoeae,E.coli,及びK.pneumoniaeからなる群に属する他の微生物と識別できるモノクローナル抗体。
【請求項２】
他の微生物との識別が、ＥＬＩＳＡ法により１０6個／ｍｌのマイコプラズマ・ニューモニア細胞抽出液を検出し、１０8個／ｍｌの他の微生物の細胞抽出液を検出しないことである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程を有することを特徴とする、マイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製方法。
（１）遺伝子操作手法によりあるいはマイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する細菌からの単離精製により得られた当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を免疫源として、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（２）上記（１）で得られたハイブリドーマから、さらに、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、当該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（３）上記（２）で得られたハイブリドーマから抗体を取得する工程
【請求項１】
マイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する微生物のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、該微生物のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該微生N.menigitides,N.lactamica,N.mucosa,N.sicca,H.influenzae,B.catarrharis,N.gonorrhoeae,E.coli,及びK.pneumoniaeからなる群に属する他の微生物と識別できるモノクローナル抗体。
【請求項２】
他の微生物との識別が、ＥＬＩＳＡ法により１０6個／ｍｌのマイコプラズマ・ニューモニア細胞抽出液を検出し、１０8個／ｍｌの他の微生物の細胞抽出液を検出しないことである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程を有することを特徴とする、マイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体の作製方法。
（１）遺伝子操作手法によりあるいはマイコプラズマ・ニューモニア（Mycoplasma pneumoniae）に属する細菌からの単離精製により得られた当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を免疫源として、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（２）上記（１）で得られたハイブリドーマから、さらに、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、当該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（３）上記（２）で得られたハイブリドーマから抗体を取得する工程
【公開番号】特開２０１２−６９６８（Ｐ２０１２−６９６８Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９６２０１（Ｐ２０１１−１９６２０１）
【出願日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【分割の表示】特願２００１−５５８０１４（Ｐ２００１−５５８０１４）の分割
【原出願日】平成１３年１月３１日（２００１．１．３１）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【分割の表示】特願２００１−５５８０１４（Ｐ２００１−５５８０１４）の分割
【原出願日】平成１３年１月３１日（２００１．１．３１）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
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